Martens Lisbel,Novoa Lorena,Sanchez Pilar,Veja Christian. Asesor: Dr. Mauro Quiñones Taller de Biotecnología Vegetal.

Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Ricardo Palma.

INDUCCION DE CALLO IN VITRO DE Daucus carota L. (ZANAHORIA)

RESUMEN
Uno de los problemas en los cultivos de Daucus carota es que objeta mucho tiempo, inversión y áreas de cultivo, ocasionando consecuentemente la merma económica. Debido a esto, la demanda en la agricultura moderna ha llevado a la utilización de técnicas biotecnológicas que ayudan a evitar la susceptibilidad a las enfermedades y mejorar la productividad de las plantas, que resulta un método más eficiente, económico y rentable. Una de estas técnicas es el cultivo a partir del callo. El callo es un tejido cicatril de división celular desdiferenciado y desorganizado, donde cada una de sus células es totipotente, es decir capaz de crecer, dividirse y dar lugar a una planta. En el presente trabajo se utilizó explantes de Daucus carota, sembrados en el medio MS (Murashigue – Skoog) como medio de cultivo nutricional para obtener crecimiento de tejido calloso.

INTRODUCCION Uno de los problemas
en los cultivos de Daucus carota es que objeta mucho tiempo, inversión y áreas de cultivo, ocasionando consecuentemente la merma económica. Además presenta una susceptibilidad al ser afectada por diversas enfermedades, entre ellas la “podredumbre negra” causada por Stemphylium radicinum “hongo ascomiceto”, que causa oscurecimiento y muerte de las hojas y destrucción de la raíz; plagas como pulgón, gusanos grises, nematodos, etc. Debido a esto, la demanda en la agricultura moderna ha llevado a la utilización de técnicas biotecnológicas que ayudan a evitar la susceptibilidad a las enfermedades y mejorar la productividad de las plantas, que resulta un método más eficiente, económico y rentable. (OMS, 2005 y Sumpsi, J., 1982). Una de estas técnicas es el cultivo a partir del callo. El callo es un proceso de desdiferenciación celular formado por la proliferación desordenada de células que da origen a una masa amorfa de tejido; es un proceso para obtener células germinativas de la planta seleccionada. (Quiñones, M., 2008); donde la respuesta embriogénica del callo depende del genotipo de planta. (Linz, 1984) En el presente trabajo se obtendrá tejido calloso en cultivo in Vitro de Daucus carota siguiendo el procedimiento descrito por Quiñones, M., 2008.

MATERIALES Y METODOS
Obtención de la planta La planta Daucus carota (Zanahoria) fue comprada en el supermercado wong, y trasladada al laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Ricardo Palma en bolsa ziploc. Preparación de medio de cultivo Para preparar el medio MS se separo una alicota y se agregaron los carbohidratos. Luego se enriqueció el medio con 2,4D (diclorofenoxiacético) y se midió el pH, el cual fue 5.5 – 6.5. Luego, se adiciono el gel rite y fue llevado al microondas para obtener el medio líquido. Se procedió a servir en tubos de ensayo y fueron sellados con papel aluminio. Por último se auto clavaron a 121C. Esterilización del material biológico Los explantes obtenidos del cambium de Daucus carota (Zanahoria) se colocaron en un beacker y fueron lavados con detergente, con ayuda de un cepillo y agua de caño. Luego se enjuago con agua destilada y seguidamente fueron sumergidos en alcohol 96% por 40 segundos. Los explantes fueron sumergidos en cloruro de mercurio (HgCl2 0.1%) por 10 minutos. Una vez transcurrido el tiempo indicado, el material biológico fue enjuagado en agua esterilizada 5 veces con un intervalo de 5 minutos por enjuague.

se libero la yema con ayuda del bisturí y pinza de las células muertas que cubren el explante. Semana. Luego se sello el cuello del tubo con papel aluminio y se incubo a una temperatura de 27º C.in vitro. tanto del medio de cultivo enriquecido con 2. debido al crecimiento desorganizado del callo. de consistencia seca y granulosa (Fig.1).4D. Figure 2: Dos semanas y se evidencia la desdiferenciacion del explante de D. se sembraron 8 tubos. En la cuarta y quinta semana (Fig.en la segunda semana de cultivo. formacion de callo. De morfologia heterogenea. sin tocar el medio de cultivo.carota en medio de cultivo MS. Los explantes estuvieron incubados en un cuarto climatizado con temperatura de 25Co. presento proceso de formación de callo en las dos terceras partes de su estructura no sumergida. Figure 1: Explante de Daucus carota con contaminacion (2da semana). y division constante del tejido calloso. Monitoreo de la formación del callo El monitoreo se llevo a cabo cada 7 días para evidenciar si hubo formación de tejido calloso. observados en un periodo de cinco semanas. posteriormente fueron cambiando de color debido a la contaminacion. mostrando ciertos tubos una fenolizacion y por lo tanto un color oscuro del medio y del explante. El proceso de desdiferenciacion se llevo a cabo en condiciones de oscuridad durante las cinco semanas de observacion. es decir el 88% de nuestras muestras fueron contaminadas.4D. probablemente microbiana o micotica o de fenolizacion. Mostrando asi un alto indice de contaminacion de los explantes. 1987).3). como de los explantes. Figure 3: 3ra. La formación de tejido calloso despues de tres semanas de cultivo exhibio un crecimiento lento sobre la superficie del medio y el color fue cambiando de naranja a claro blanquecino. Con ayuda de la pinza se introdujo el callo en forma aséptica en los tubos con medio de cultivo. De los cuales 7 tubos evidenciaron contaminacion durante el transcurso de las cinco semanas(Fig. Los explantes sembrados presentaban un color naranja en la primera semana. lo cual afecto el desarrollo de la callogenesis.del explante de Daucus carota en un medio de cultivo MS.4 y 5) se sigue evidenciando la totipotencialidad. El unico tubo con desdiferenciacion. La auxina 2. Con ayuda de una cámara digital se tomaron fotos. por lo tanto solo el 12% de nuestra muestra fue viable. (Fig. Solo un tubo presento desdiferenciacion y formacion de callo del explante de Daucus carota.2) RESULTADOS Los explantes de Daucus carota fueron cultivados en un medio de cultivo MS enriquecido con 2.Tratamiento del explante e introducción en el medio de cultivo En la cámara flujo laminar los explantes ya esterilizados se transfirieron a una placa Pietri estéril y se aíslo la parte nuclear del explante. Contaminación micótica .4D.4D tiene la capacidad para inducir procesos de diferenciación por lo que es necesaria para la formación del callo (Barba. en medio de cultivo MS enriquecido con 2.

11 (1): 183-185 p.4-D. A. 2. Springer – Verlag 179-248 p. Figure 4: 4ta Semana. (1967). En consecuencia hay que remover la auxina o usarla en concentraciones más bajas (Halperin 1964). Plant Propagation through Tissue Cultures. WINKLER.carota. Vol. porque son compuestos altamente tóxicos y que no son fácilmente removibles del explante (Linz Re. Bot. la maduración de los embriones y la germinación no ocurren en la presencia de 2. el cual brinda el estimulo de la iniciación de la embriogenesis somática en el callo. Plant. otros presentando una despigmentación coloreando el medio MS. 20 (4): 862869 p. REINERT J. En: Reinert J. Ann Rev. Protoplasma 70:49–60 p 8. REINERT J. Plant and Cell Physiology. & Maretzki. como también se vieron afectados por la contaminación por hongos ambientales . Effects of Auxin and Kinetin on the Development and Differentiation of Potato Tissue Cultured in vitro. General Viticulture. y Bajal YPS. LIDER. 1980. K. Dtsch. The utilization of sugar and starch as carbon sources by sugarcane cell suspension cultures. KATSURA N. & Ohira. 3. Univ. Untersuchungen iiber die morphogenese und gewebekulturen. MURASHIGE T. en la actualidad se ha generalizado el uso de etanol (70% v/v) y el hipoclorito de sodio de 1% al 3% contenidos en productos de uso domestico.Tener una asepsia adecuada para evitar el ingreso de hongos ambientales. la sacarosa se utiliza en concentraciones de 2% y 3% hasta 12% demostrado por (Wheterell 1984). (1979).Se obtuvo una muestra de tejido calloso aproximadamente entre la 4ta. (1974).Se sugiere determinar la concentración de sacarosa adecuada en el medio de cultivo para la inducción en menor tiempo. KLIEWER. BACKZ-HUSEMANN D.carota. TAGAWA T. Press. DISCUCION Uno de los pasos importantes para la obtención del callo es la esterilización del explante. Applied and fundamental aspects of plant cell. NARAYANASWAMY S. .5ta semana de todas las muestras que se realizaron ya que el resto de los explantes presentaron una coloración más oscura a causa de la fenolizacion . como el acido cítrico. (1958). Ojima.).). (eds.. N. Cal. CONCLUSIONES: . 71-15 p. 4. Jarret RL. The exudation and characterization . Ber. BIBLIOGRAFIA 1. COOK. 5. J. acido ascórbico. K. L. Embryo formation by isolated single cells from tissue cultures of Daucus carota. A. Se necesita la presencia de una auxina para la iniciación de un callo embriogénico. con menor frecuencia hipoclorito de calcio y cloruro de mercurio. (1977). OKAWAZA Y..4-D. J. crecimiento en la formacion de callo de D. Plant Physiol 25:135-165 p. Ges. Es posible aumentar el potencial embriogénico de los callos de zanahoria exponiéndolos a niveles altos de sacarosa o de manitol. multiple granulacion. tissue and organ culture. 1970. Regeneration of plants from tissue culture. Sin embargo.Para evitar la fenolizacion es requerida la utilización de antioxidantes en el medio. usualmente se emplea el 2. Physiol. de callo de D. 7. Figure 5: 5ta Semana. 1974. 6. . Nickell.

). Bioactivity and Applications. 21 (8): 1151-1161 p 9. PÉREZ. OROSCO. SAIMOTO. Academic Press 71-111 p.).K. 1995. wheat and potato regenerated from cell cultures after in vitro selection for disease resistance. BANTHORPE V.. 15. Universidad Nacional de Colombia. AMMIRATO P V. BUENO.. 20. (1994). En: Vasil. H. A. NICKELL G. 10. Genetics. Natural Products Report. LITZ RE. 12. Departamento de Agronomía. pp. 80: 359. 27. RECHINGER. vol.E. 11. OJITO. I. Facultad de Ciencias Agrarias -Universidad Nacional de Rosario. (2002) Obtención de flavonoides a partir del cultivo en suspensión de células vegetales de Matricaria recutita. Academic Press 175-194 p. Gürel. Plant Cell. C. INDUCCIÓN DE CALLO A PARTIR DE PLANTAS . E. Organogenesis in vitro.. PV Ammirato. L. Chemistry. M. En: Vasil. SAKURAI A. 2002. (2006). JARRET RL. Perspectives in plant cell and tissue culture. Turk J Bot 13. Perspectives in plant cell and tissue culture. Chem. (1980). F. Establishment of Cell Suspension Cultures and Plant Regeneration in Sugar Beet (Beta vulgaris L. Regeneración de plantas en el cultivo de tejidos: embriogénesis somática y organogénesis. Vanegas P. 43. nº3. y TORRES. 143172 p. Y Yamada (eds). O.. (1987).of iron-solubilizing compounds in a rice cell suspension culture.) con los bioestimulantes cubanos Biostan y Liplant. 21. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas Universidad Nacional de Rosario. (1980).. S. Gaz. Washington: American. Gürel. E. L. Control of Morphogenesis by Inherent and Exogenously applied factors in thin cell layers. TRAN THANH VAN K. FUJIOKA. E. (ed... DA Evans. (2006) Callogenesis y regreneracion In vitro de arroz (Oryza sativa L. Colima Ponce M. Argentina. Appl. 1990. H. M. 310 – 34. 22. Bot.K. Escuela de Química.. En: Handbook of Plant Cell Culture. 1991. Tissue and Organ Culture. Universidad Agraria de La Habana Cultivos Tropicales. Plant and Cell Physiology. Theor. Physiological and Biochemical aspects. Abh. (ed. Z. 14.). Del Villar-Martínez A. 1999. Inducción de Callos Embriogénicos en Raíces de Soja (Glycine max). WENZEL.. I. G. Untersuchungen uber die Grezen der Teilbarketi in Pfianzenzenreich. Zool. Structural. WR Sharp. Brassinosteroids. Universidad Eafit. pag 31-36. Fundamentos y aplicaciones.. Ramos Viveros V. Cuba 16. GODOY. & Kaya. Nutrition and differentiation in tissue cultures of sugar cane a monocotyledon. New York 1: 82-123 p. 18. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. FERNÁNDEZ. Fukui. Medellín –Colombia. García Chavarría M. (2004). 24. Society. vol 41(1): 17-21 p. VALERA. . Vol. An envelope-shaped film culture vessel for plant cell suspension cultures and metabolite production without agitation. 6571. 17. THORPE TA. y FOROUGHIWEHR. 1893. Secondary Metabolism in Plant Tissue Culture: Scope and Limitations. 23. (1983). Planta 89:299302 p.A. sede Medellín. Macmillan Publishing Co.365. 19. B. 303-328 p. & Tanaka. S. Establecimiento de un cultivo de células en suspensión de Eucalyptus cinerea. Escuela de Geociencias. (1993). BARBA R. Progeny test of barley.

CULTIVADAS EN INVERNADERO DE Tagetes erecta. de Biotecnología.. 26. (2006). Dpto. LECHUGA. ALAYÓN. P. C..J. Inducción del callo en la planta Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl. Obtención de callos por cultivo in vitro de pulpa de manzana cv 'Anna': Detección de actividad de Alfa-L arabinofuranosidasa.. Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. CRUZ. MEXICO DF .. 25. 2007. J. F. Universidad Nacional del Noreste. L. BUENDÍA. UAM. productora de edulcorantes. OROZCO. ORIZA. En: Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del IPN.