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Martens Lisbel,Novoa Lorena,Sanchez Pilar,Veja Christian. Asesor: Dr. Mauro Quiñones Taller de Biotecnología Vegetal.

Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Ricardo Palma.

INDUCCION DE CALLO IN VITRO DE Daucus carota L. (ZANAHORIA)

RESUMEN
Uno de los problemas en los cultivos de Daucus carota es que objeta mucho tiempo, inversión y áreas de cultivo, ocasionando consecuentemente la merma económica. Debido a esto, la demanda en la agricultura moderna ha llevado a la utilización de técnicas biotecnológicas que ayudan a evitar la susceptibilidad a las enfermedades y mejorar la productividad de las plantas, que resulta un método más eficiente, económico y rentable. Una de estas técnicas es el cultivo a partir del callo. El callo es un tejido cicatril de división celular desdiferenciado y desorganizado, donde cada una de sus células es totipotente, es decir capaz de crecer, dividirse y dar lugar a una planta. En el presente trabajo se utilizó explantes de Daucus carota, sembrados en el medio MS (Murashigue – Skoog) como medio de cultivo nutricional para obtener crecimiento de tejido calloso.

INTRODUCCION Uno de los problemas
en los cultivos de Daucus carota es que objeta mucho tiempo, inversión y áreas de cultivo, ocasionando consecuentemente la merma económica. Además presenta una susceptibilidad al ser afectada por diversas enfermedades, entre ellas la “podredumbre negra” causada por Stemphylium radicinum “hongo ascomiceto”, que causa oscurecimiento y muerte de las hojas y destrucción de la raíz; plagas como pulgón, gusanos grises, nematodos, etc. Debido a esto, la demanda en la agricultura moderna ha llevado a la utilización de técnicas biotecnológicas que ayudan a evitar la susceptibilidad a las enfermedades y mejorar la productividad de las plantas, que resulta un método más eficiente, económico y rentable. (OMS, 2005 y Sumpsi, J., 1982). Una de estas técnicas es el cultivo a partir del callo. El callo es un proceso de desdiferenciación celular formado por la proliferación desordenada de células que da origen a una masa amorfa de tejido; es un proceso para obtener células germinativas de la planta seleccionada. (Quiñones, M., 2008); donde la respuesta embriogénica del callo depende del genotipo de planta. (Linz, 1984) En el presente trabajo se obtendrá tejido calloso en cultivo in Vitro de Daucus carota siguiendo el procedimiento descrito por Quiñones, M., 2008.

MATERIALES Y METODOS
Obtención de la planta La planta Daucus carota (Zanahoria) fue comprada en el supermercado wong, y trasladada al laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Ricardo Palma en bolsa ziploc. Preparación de medio de cultivo Para preparar el medio MS se separo una alicota y se agregaron los carbohidratos. Luego se enriqueció el medio con 2,4D (diclorofenoxiacético) y se midió el pH, el cual fue 5.5 – 6.5. Luego, se adiciono el gel rite y fue llevado al microondas para obtener el medio líquido. Se procedió a servir en tubos de ensayo y fueron sellados con papel aluminio. Por último se auto clavaron a 121C. Esterilización del material biológico Los explantes obtenidos del cambium de Daucus carota (Zanahoria) se colocaron en un beacker y fueron lavados con detergente, con ayuda de un cepillo y agua de caño. Luego se enjuago con agua destilada y seguidamente fueron sumergidos en alcohol 96% por 40 segundos. Los explantes fueron sumergidos en cloruro de mercurio (HgCl2 0.1%) por 10 minutos. Una vez transcurrido el tiempo indicado, el material biológico fue enjuagado en agua esterilizada 5 veces con un intervalo de 5 minutos por enjuague.

y division constante del tejido calloso. como de los explantes. Con ayuda de la pinza se introdujo el callo en forma aséptica en los tubos con medio de cultivo. debido al crecimiento desorganizado del callo.in vitro. Figure 2: Dos semanas y se evidencia la desdiferenciacion del explante de D.del explante de Daucus carota en un medio de cultivo MS. Luego se sello el cuello del tubo con papel aluminio y se incubo a una temperatura de 27º C.4 y 5) se sigue evidenciando la totipotencialidad.4D. (Fig.en la segunda semana de cultivo. Solo un tubo presento desdiferenciacion y formacion de callo del explante de Daucus carota. La auxina 2. Mostrando asi un alto indice de contaminacion de los explantes.4D. Monitoreo de la formación del callo El monitoreo se llevo a cabo cada 7 días para evidenciar si hubo formación de tejido calloso. Los explantes sembrados presentaban un color naranja en la primera semana. Con ayuda de una cámara digital se tomaron fotos. en medio de cultivo MS enriquecido con 2. se libero la yema con ayuda del bisturí y pinza de las células muertas que cubren el explante. sin tocar el medio de cultivo. El unico tubo con desdiferenciacion. 1987).4D.4D tiene la capacidad para inducir procesos de diferenciación por lo que es necesaria para la formación del callo (Barba. De los cuales 7 tubos evidenciaron contaminacion durante el transcurso de las cinco semanas(Fig. Contaminación micótica . El proceso de desdiferenciacion se llevo a cabo en condiciones de oscuridad durante las cinco semanas de observacion. formacion de callo.carota en medio de cultivo MS. tanto del medio de cultivo enriquecido con 2. probablemente microbiana o micotica o de fenolizacion. Figure 3: 3ra. La formación de tejido calloso despues de tres semanas de cultivo exhibio un crecimiento lento sobre la superficie del medio y el color fue cambiando de naranja a claro blanquecino.2) RESULTADOS Los explantes de Daucus carota fueron cultivados en un medio de cultivo MS enriquecido con 2. es decir el 88% de nuestras muestras fueron contaminadas. Semana. por lo tanto solo el 12% de nuestra muestra fue viable. de consistencia seca y granulosa (Fig. mostrando ciertos tubos una fenolizacion y por lo tanto un color oscuro del medio y del explante.3). se sembraron 8 tubos. lo cual afecto el desarrollo de la callogenesis. observados en un periodo de cinco semanas. posteriormente fueron cambiando de color debido a la contaminacion.Tratamiento del explante e introducción en el medio de cultivo En la cámara flujo laminar los explantes ya esterilizados se transfirieron a una placa Pietri estéril y se aíslo la parte nuclear del explante. En la cuarta y quinta semana (Fig. De morfologia heterogenea.1). Los explantes estuvieron incubados en un cuarto climatizado con temperatura de 25Co. Figure 1: Explante de Daucus carota con contaminacion (2da semana). presento proceso de formación de callo en las dos terceras partes de su estructura no sumergida.

carota. Figure 5: 5ta Semana. Ges. A.Se sugiere determinar la concentración de sacarosa adecuada en el medio de cultivo para la inducción en menor tiempo. Ber. 3. General Viticulture. Ojima.4-D. J. (1979). 11 (1): 183-185 p. con menor frecuencia hipoclorito de calcio y cloruro de mercurio. (eds. multiple granulacion. acido ascórbico.5ta semana de todas las muestras que se realizaron ya que el resto de los explantes presentaron una coloración más oscura a causa de la fenolizacion . Plant Physiol 25:135-165 p. Bot. otros presentando una despigmentación coloreando el medio MS. Sin embargo.). N. OKAWAZA Y. The utilization of sugar and starch as carbon sources by sugarcane cell suspension cultures. como también se vieron afectados por la contaminación por hongos ambientales . 2.. Se necesita la presencia de una auxina para la iniciación de un callo embriogénico. Effects of Auxin and Kinetin on the Development and Differentiation of Potato Tissue Cultured in vitro. REINERT J. Nickell. .4-D. crecimiento en la formacion de callo de D. 6. 1970. porque son compuestos altamente tóxicos y que no son fácilmente removibles del explante (Linz Re. (1977). Dtsch.carota. Protoplasma 70:49–60 p 8. y Bajal YPS. NARAYANASWAMY S. (1958). The exudation and characterization . WINKLER. 7. (1974). Univ. CONCLUSIONES: . DISCUCION Uno de los pasos importantes para la obtención del callo es la esterilización del explante. como el acido cítrico. Springer – Verlag 179-248 p. en la actualidad se ha generalizado el uso de etanol (70% v/v) y el hipoclorito de sodio de 1% al 3% contenidos en productos de uso domestico.Para evitar la fenolizacion es requerida la utilización de antioxidantes en el medio. Applied and fundamental aspects of plant cell. tissue and organ culture. Untersuchungen iiber die morphogenese und gewebekulturen. K. REINERT J. Plant and Cell Physiology. En: Reinert J.. Jarret RL. Vol. . Regeneration of plants from tissue culture. Physiol. Es posible aumentar el potencial embriogénico de los callos de zanahoria exponiéndolos a niveles altos de sacarosa o de manitol. K. 20 (4): 862869 p. COOK. KATSURA N. 4. & Maretzki. Figure 4: 4ta Semana. L. J. BACKZ-HUSEMANN D. BIBLIOGRAFIA 1. 1980. En consecuencia hay que remover la auxina o usarla en concentraciones más bajas (Halperin 1964). Press. Ann Rev. la sacarosa se utiliza en concentraciones de 2% y 3% hasta 12% demostrado por (Wheterell 1984). Cal. el cual brinda el estimulo de la iniciación de la embriogenesis somática en el callo. Plant Propagation through Tissue Cultures.Se obtuvo una muestra de tejido calloso aproximadamente entre la 4ta. la maduración de los embriones y la germinación no ocurren en la presencia de 2. 5. usualmente se emplea el 2.Tener una asepsia adecuada para evitar el ingreso de hongos ambientales. KLIEWER. 71-15 p. A. & Ohira. MURASHIGE T. (1967). TAGAWA T. 1974. Embryo formation by isolated single cells from tissue cultures of Daucus carota. de callo de D. LIDER.). Plant.

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