Química de la leche, Pruebas de Proteínas y Análisis de Aminoácidos

Universidad de Costa Rica Estudiante Manrique Cubero Morales

Facultad de Ciencias Carne A41775
Escuela de Química Profesores Lic. Graciela Artavia
Sección de Química Orgánica Dr. Víctor Hugo Soto
Laboratorio de Química Orgánica II QU0255 Asistente Yulia Yuts

Se realizaron pruebas para el contenido de componentes y el estudio de propiedades de

estos componentes a varios tipos de leche (Caso particular: En Polvo Descremada y Liquida
Descremada). Los carbohidratos (Lactosa), grasa (Fosfolipidos) y proteínas (Caseína) de la
leche fueron separados según un esquema de separación para obtener de ellos un
porcentaje de rendimiento y caracterización. Además se llevaron a cabo diferentes pruebas
de caracterización de proteínas, tales como las Pruebas de Biuret, Xantoproteica, Millon,
para Azufre. Estas pruebas se le aplicaron a la caseína extraída en la práctica. Por otra parte
se obtuvo ácido múcico a partir de la leche, posterior a un tratamiento con ácido acético y
ácido nítrico.

Introducción ácidos nucleicos. Estas últimas son más

Las proteínas son macromoléculas
formadas por cadenas de alrededor de 20
diferentes aminoácidos, unidos entre sí por
medio de enlaces peptídicos y se
encuentran como mezclas complejas en
los tejidos orgánicos. Su separación en
fracciones con características moleculares
definidas ha permitido alcanzar un enorme
conocimiento sobre sus funciones y
estructuras.1
Estas macromoléculas poseen
propiedades y características que las
diferencian unas de otras y por medio de
dichas propiedades, pueden ser separadas
y aisladas de sus fuentes.2
Las proteínas se clasifican en dos tipos
principales según su composición: en
proteínas simples y conjugadas. Las
proteínas simples forman aminoácidos
cuando se hidrolizan, en cambio las
proteínas conjugadas producen
aminoácidos, carbohidratos, grasas o
comunes que las proteínas simples.3
Otra manera de clasificar las proteínas es
según su forma tridimensional, en
proteínas globulares o fibrosas. Las
proteínas globulares son aquellas que
tienden a agregarse en formas
esferoidales y no establecen interacciones
intermoleculares como son los puentes de
hidrógeno, siendo solubles en agua. Por
ejemplo la hemoglobina y la insulina.4
Las proteínas fibrosas consisten en
cadenas de polipéptidos, arregladas en
largos filamentos. Son insolubles en agua
y muy resistentes. Sirven para construir
materiales estructurales como los
tendones, uñas, músculos; por ejemplo la
queratina y el colágeno.4
La leche contiene vitaminas, minerales,
proteínas, carbohidratos y lípidos. Los
únicos elementos importantes de los que
carece la leche son el hierro y la vitamina
C (Figura 1). 5

1
McMurry, J. Química Orgánica. 6ª ed., International Thomson:
México. 2004. pp. 1009-1012.
2 5
Morrison, R. T.; Boyd, R. N. Química Orgánica. 5ª ed., Pearson
Educación: México. 1998. pp. 1342-1343.
3
Wade, L. J. Jr. Química Orgánica. 5ª ed., Pearson Educación:
Madrid. 2004. pp. 1151-1155.
4
Weininger, S. J.; Stermitz, F. R. Química General. Editorial
Reverté: Barcelona, España. 1988. pp. 901-944.
Ribadeau-Dumas, B; Grappin, R. Milk protein analysis. Le Lait.
1989. pp. 357-416.

1
En la leche hay tres clases de proteínas:
caseína, lactoalbúminas y lactoglobulinas
(todas globulares). La caseína es una
proteína conjugada de la leche del tipo
fosfoproteína que se separa de la leche
por acidificación y forma una masa blanca.
Las fosfoproteínas son un grupo de
proteínas que están químicamente unidas
a una sustancia que contiene ácido
fosfórico. En la caseína la mayoría de los
grupos fosfato están unidos por los grupos
hidroxilo de los aminoácidos serina y
treonina. La caseína en la leche se
encuentra en forma de caseinato de calcio.
La caseína representa cerca del 77% al
82% de las proteínas presentes en la leche
y el 2,7% en composición de la leche
líquida.5
Figura 1. Componentes de la leche.
La propiedad característica de la caseína
es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la
leche es 6,6 aproximadamente, estando a
ese pH la caseína cargada negativamente
y solubilizada como sal cálcica. Si se
añade ácido a la leche, la carga negativa
de la superficie de la micela se neutraliza
(los grupos fosfato se protonan) y la
proteína neutra precipita.6
El alto número de residuos de prolina en la
caseína causa un especial plegamiento en
la cadena de proteína e inhibe la formación
de una fuerte y ordenada estructura
secundaria. La caseína no contiene
puentes di sulfuro. De igual manera la falta
de estructura secundaria es importante
para la estabilidad de la caseína frente a la
desnaturalización por calor.6
La carencia de estructura terciaria facilita
la situación al exterior de los residuos
hidrofóbicos lo que facilita la unión entre
unidades proteicas y la convierte en
prácticamente insoluble en agua. En
cambio es fácilmente dispersable en álcalis
diluidas y en soluciones salinas tales como
oxalato sódico y acetato sódico.6
La función biológica de las micelas de
caseína (Figura 2) es transportar grandes
cantidades de calcio y fósforo altamente
insoluble en forma líquida a los lactantes y
formar un coagulo en el estómago para
favorecer una nutrición eficiente. Además
de caseína, Ca y P, la micela formada
también contiene citrato, iones, lipasa,
enzimas plasmáticas y suero. Estas
micelas ocupan del 6-12% del volumen
total de la leche.7
Figura 2. Estructura de la micela de la
caseína.
6
Miller, D. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio.
Limusa Wiley: México. 2001. pp. 33-38.
7
Universidad Pablo de Olavide. Práctica 3: Extracción de la
Caseína y determinación del Punto Isoeléctrico. Sevilla, España.
http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbio
mol/Practica3FQB.pdf. Visitado el 20 de oct del 2010 a las 20
horas.
2
Las proteínas que aparecen en el Resultados
sobrenadante cuando se precipita la
caseína en medio ácido son proteínas Cuadro I. Síntesis del Ácido Múcico a partir de
HO

globulares, hidrofílicas y solubles en agua Leche y ácido nítrico.

OH OH OH O

O O HO
O HO HNO3

así como susceptibles de

OH OH
2
HO
HO OH OH O OH OH
7
desnaturalización por calor.
La caseína se emplea en la industria para
la fabricación de pinturas especiales y en Reactivos Productos
Formula C12H22O11 HNO3 Formula C6H10O8
el apresto de tejidos, la clarificación de Limitant Equivalente
Si No 2
vinos, la elaboración de preparados e s
Masa de Masa
farmacéuticos y la fabricación de plásticos. muestra 4,80 --- esperada
288,78
mg
(g) (g)
Volumen Mol 1,37
Parte Experimental (mL)
100 mL(*) 12 mL
esperados mmol
Mol de 687,1 Masa
687,1 μmol 160 mg
Para esta practica de laboratorio, no se reactivo μmol medida (g)
Masa de Masa de
hizo uso de ningún tipo de equipo especial. reactivo 235,2 mg
43,3
producto 160 mg
mg
Los reactivos utilizados fueron (g) (g)
Concentr Mol de
proporcionados por la Proveeduría de la ación --- 5,0 producto
761,4
μmol
Escuela, y no se realizaron purificaciones (mol/L)
(*) Tomando en cuenta que la Porcentaje
de ninguno de ellos antes de la práctica en porción diaria es de 250 mL con un de
55,40
mención. valor de 12 g de carbohidratos. Por rendimiento
consiguiente para 100 mL = 4,80 g (%)
Se siguió el procedimiento descrito por
Pérez y Lamoureux en su “Manual de
Practicas para laboratorio, para el curso de Cuadro II. Masas y porcentajes de recuperación
Química Orgánica I”. de otros compuestos aislados en el laboratorio.
Se extrajo de la leche ácido múcico por Masa
Masa
Porcentaje
Compuesto Recuperada de
tratamiento de la lactosa obtenida con (g)
Esperada (g)
rendimiento
ácido nítrico. También se aisló la lactosa Lactosa 0,16 2,10 7,72%
Grasa 0,91 0,04 227%
por medio de la reacción del HOAC con la
Caseína 2,10 2,10 100%
caseína y se purifico; asi como se
separaron los componentes de la leche
para caracterizarlos. Los ensayos Cuadro III. Resultados de las pruebas de
realizados fueron: las Pruebas de Biuret, caracterización aplicadas a la muestra de caseína
Xantoproteica, Millon, para Azufre. aislada.
Prueba Resultado/Observaciones
Biuret Positivo; azul-morado
Lactosa
Xantoproteica Positivo; Coloración amarilla
IR (fase KBr) (cm-1) 3379; 2900; 2394; Millon Positivo; Precipitado rojo
1426; 1116; 1094; 1035; 899; 876; 778. Azufre Positivo; Precipitado negro
1
H NMR: (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 5.23
(d); 4.80 (s); 4.45 (d); 3.30 (t); 3.50 – 4.0 Discusión
(m).
Dentro del esquema de separación de la
Acido Mucico leche (Figura 3) el primer paso es la
IR (fase KBr) (cm-1) 3293; 2633; 1720; separación de las proteínas y grasas de
1420; 1294; 1117; 1059; 919; 861; 799; los carbohidratos (lactosa). Primeramente
668. se disuelve la leche en agua y se calienta
a 40 °C. Después se agrega poco a poco
ácido acético al 10% para acidificar la
leche en polvo, y alcanzar el punto
3
 (Caseína)Ca2+ +
isoeléctrico del caseinato de calcio (pI =
4.6).
Como en toda proteína, al alcanzarse el
punto isoeléctrico existe una igualdad de
cargas por lo que es una molécula neutra y
se hace insoluble en disolventes polares,
induciendo la precipitación. Al precipitar la
caseína y otras proteínas, se forma un
aglomerado blanco apolar fácilmente
filtrable. En este aglomerado van
adsorbidas las moléculas de grasa por lo
que con solo la adición de ácido acético se
separan estos dos componentes. En la
mezcla ácida restante quedan disueltas
trazas de proteínas y la lactosa.
Para separar los triglicéridos y otras grasas
de la leche del sólido de la caseína se
agrega éter etílico para que disuelva los
triglicéridos y todos los demás
componentes apolares de la mezcla. En
este momento es necesario agitar bien
porque la caseína tiene adsorbidas las
moléculas de grasa y al estar como un
aglomerado semisólido es difícil poder
asegurar la extracción completa de las
grasas. En este punto ya se separaron la
caseína (sólida) y las grasas (disueltas en
éter etílico). La acetona se emplea como
disolvente de la reacción.
Figura 3. Esquema de separación de los
componentes de la leche
HOAc Caseína + CaOAc
En la separación de los componentes de la
leche, el procedimiento que resulto mas
fácil fue el de la obtención de la caseína
(en forma de caseinato de calcio), debido a
que se encuentra en una gran cantidad.
Figura 4. Reacción del ácido acético con
el caseinato de calcio para la formación de
caseína sólida.
A este sólido obtenido, correspondiente a
la caseína, se le aplicaron una serie de
pruebas para determinar la naturaleza de
los grupos funcionales presentes en la
misma, el análisis correspondiente es el
siguiente:
El reactivo de Biuret está formado por una
solución de sulfato de cobre en medio
alcalino, este reconoce el enlace peptídico
de las proteínas mediante la formación de
un complejo de coordinación entre los
iones Cu2+ y los pares de electrones no
compartidos del nitrógeno que forma parte
de los enlaces peptídicos, lo que produce
una coloración violeta.
Según la intensidad del color del complejo
formado, se puede estimar el número de
enlaces peptídicos que hay en la proteína.
Para sustancia con numerosos enlaces
peptídicos se esperaría un complejo
morado intenso, indicando que estas
proteínas contienes muchos enlaces
peptídicos, es decir, son cadenas
polipéptidos muy largas. Para la caseína
extraída, el complejo obtenido fue de color
celeste/morado claro, debido a que esta
proteína no contiene muchos enlaces
peptídicos.
Esta prueba no es exclusiva para
identificar péptidos, sino que forma
complejos con otros compuestos
nitrogenados.
A pesar de lo anterior, las aplicaciones de
este método no solo van en el ámbito de la
mera identificación visual de los enlaces
peptídicos, también es posible utilizar
Biuret para cuantificar la cantidad de
4
 proteína presente en una determinada va a depender de la cantidad de residuos
matriz. Otros métodos para cuantificar esto fenólicos presentes en la proteína, entre
podrían ser la determinación de nitrógeno más fenoles haya, el precipitado será cada
por Kjeldahl o la titulación con vez más rojo.
formaldehído.8 Las pruebas Xantoproteica y de Millón
PRUEBA DE BIURET
están muy relacionadas entre sí, mientras
PROTEÍNA
CuSO4
NaOH
COMPLEJO
VIOLETA
con una se determina la presencia de
PRUEBA X ANTOPROT EIC A residuos aromáticos, en la otra determina
HNO3
PROTEÍNA COLORACIÓN
NARANJA si tales compuestos aromáticos son
PRUEBA DE M ILLON fenólicos o no.
HNO3
PROTEÍNA
Hg(NO3)2
COLORACIÓN
ROJA La presencia de azufre en las proteínas se
PRUEBA PARA AZUFRE determina por medio de la prueba para
S CH2 HN
Azufre. En dicha prueba se rompe el
S CH C
enlace disulfuro con NaOH y luego se
NH CH2 HN O
precipita el azufre con el acetato de plomo,
1. NaOH
PbS
C CH 2. Pb(OAc)2

O NH
Figura 5. Reacciones de pruebas de
identificación cualitativa para las proteínas.
La prueba Xantoproteica reconoce los
grupos aromáticos presentes en las
proteínas, o sea, aquellas proteínas que
contengan tanto tirosina como fenilalanina,
con el cual el ácido nítrico forma
compuestos nitrados amarillos-
anaranjados, la intensidad del color
depende de la cantidad de grupos
aromáticos presentes en la molécula.
La prueba de Millón identifica residuos
fenólicos en las proteínas, es decir,
aquellas proteínas que contengan tirosina.
Las proteínas que dan prueba positiva ante
este reactivo, se precipitan por acción de
los ácidos inorgánicos fuertes del mismo
(HNO3, Hg(NO3)2 y HgNO3), dando un
precipitado blanco que gradualmente se
vuelve rojo, al calentar.
Al igual que en las pruebas anteriores, la
coloración del precipitado de esta prueba
8
Revilla, A. Tecnologías de las Leche: Procesamiento,
manufactura y análisis. 2da Ed. CIDIA. San José, Costa Rica.
pp. 7 – 40.
dicho precipitado es de color negro (PbS).
La síntesis de ácido múcico, cabe
destacar, depende directamente de la
cantidad de lactosa presente en la
reacción (Cuadro I), se producen 2
equivalentes del mismo al reaccionar la
lactosa con el ácido nítrico. Se obtuvo un
sólido amarillento, lo cual difiere de lo
esperado (Sólido cristalino blancuzco),
esto puede deberse a otros componentes
de la leche no tomados en consideración
(Ver Figura 1).
Se podría determinar de manera mas
eficiente la cantidad precisa de cuanto
ácido múcico mediante la determinación de
la cantidad precisa de lactosa presente en
una muestra, esto podría lograrse al utilizar
métodos analíticos como polarimetría,
cromatografía o valoraciones con ácido
pícrico o tricoloroamina.
En este caso particular se utilizó leche
descremada, que difiere en la leche normal
debido a que es eliminada una gran
mayoría de su contenido graso, en la
mayoría de los casos se utilizan
procedimientos de separación que
involucran el hecho básico de la diferencia
de gravedad especifica entre la grasa y el
resto del producto lácteo. Actualmente
también se utilizan medio mecánicos de
centrífuga para realizar esta separación. El
uso de este tipo de leche es muy factible
porque reduce el procedimiento
enormemente, las extracciones con
5
éter/acetona son reducidas En esta práctica no se determinó la pureza
significativamente debido a lo anterior. de la caseína extraída, aunque basándose
También puede ser una razón para que en los resultados, el producto obtenido
otras sustancias liposolubles pueda que contenía otras sustancias aparte de la
hayan permanecido en el sólido graso final caseína.
y por ello el porcentaje de recuperación A pesar de todas las limitaciones, las
excediera lo esperado. pruebas de identificación de las proteínas
En el caso del análisis con espectroscopia dieron los resultados esperados.
1
H-RMN, las señales entre 3.5 – 4.0 ppm
corresponden a los múltiples protones de
los grupos OH ligados a las estructura
molecular de la lactosa. La señal a 3.3
ppm corresponde a los hidrógenos α al
puente glucosídico en el componente
correspondiente a la galactosa. La señal a
4.5 ppm corresponde al hidrogeno en
posición 2 del componente galactosa. A
4,8 aparece una señal correspondiente al
agua. En 5,23 ppm aparece una señal
correspondiente al hidrogeno α al enlace
glucosídico en el componente glucosa.

Conclusiones

La leche es un complemento alimenticio

muy importante por su alto contenido de
aminoácidos esenciales, vitaminas,
minerales, carbohidratos y grasas. La
caseína es uno de los componentes
mayoritarios en la leche, junto con las
grasas, el agua y la lactosa. La
composición de la leche varía de acuerdo
al mamífero que la sintetice.
La leche puede separarse en sus
componentes principales de una manera
muy sencilla, al adicionarse HOAc, en
conjunto con otros reactivos orgánicos
comunes. Una mezcla de varios
componentes puede ser separada por
medios simples tan sólo controlando el pH
y luego la polaridad/proticidad de los
disolventes utilizados, de manera que
ciertos compuestos precipiten y otros no,
obteniendo así una mezcla fácilmente
separable por medio de filtración,
decantación, centrifugación o una
combinación de estas.