Rôle du laboratoire de bactériologie

dans le diagnostic des IOA

du prélèvement … aux techniques moléculaires

Frédéric LAURENT

Laboratoire de Bactériologie - Hôpital de la Croix Rousse

CNR des Staphylocoques
INSERM 851 – Equipe "Pathogénie des Staphylocoques"
 Trois acteurs majeurs
dans la prise en charge bactériologique des IOA

Chirurgien orthopédiste / Pédiatre/ Rhumatologue

Evacuer / Nettoyer
Prélever

Microbiologiste
Détecter
Identifier
Mesurer la sensibilité aux antibiotiques

Antibiothérapeute
Interpréter
Choisir de l’antibiothérapie optimale
 Points critiques pour le microbiologiste

• Gestion des prélèvements

• Conditions / Délais de cultures

• Détection et identification de variants ou de souches

différentes

• Interprétation et rendu clair et cohérent des résultats qui

puissent aider à la décision thérapeutique
 Difficultés rencontrées avec les IOA par le bactériologiste

• Bactéries IOA = +/- bactéries de la flore cutanée Contamination

ou pas ?
• Infections plurimicrobiennes

• Bactéries fragiles Gestion des prélèvements +++

• Bactéries physiologiquement peu actives Cultures longues

• Antibiothérapie préalable au prélèvement Milieux riches
Multiplicité des milieux

• Bactéries cachées
– intracellulaires Traitement adéquat des prélèvements
– biofilm

• Bactéries normale (IOA aiguë) Expression phénotypique variée

vs bactéries stressées (IOA chronique)
 Gestion des prélèvements
Eviter toute contamination Bactéries IOA = +/- bactéries de la flore cutanée

. nature du prélèvement
. fistule, trajet de fistule = Se et Sp médiocre
. biopsies tissulaires, pus, tissus per-op, liquide articulaire, synoviale, … +++

. post-prélèvement
. pots ou tubes secs stériles / seringue sans aiguilles et closes
. Hotte PSM, gants stériles, matériel stérile et ou à usage unique

Ensemencer dans les meilleurs délais Bactéries fragiles

. transport rapide (<4 heures) / Portagerm® ou équivalent / ensemencement au bloc ?

. prévenir si arrivée tardive au laboratoire
 Gestion des prélèvements
Sélectionner les prélèvements … pour IOA sur prothèse
ni trop ... ni trop peu

- ↑ risque contamination
- pb gestion au laboratoire
. 15 minutes/prelts/technicienne
. matériel pour broyage
. identification/localisation
- taux positifs = critère d’interprétation
Spe
1+ / 5 à 7 prelts 26%
2+ / 5 à 7 prelts 53%
3+ / 5 à 7 prelts 85% Altweg, JSJB, 2003

+ identification du patient, du service, du prescripteur, du prélèvement

 Examen direct
Permettre éventuellement une orientation diagnostic rapide

. présence de bactéries et morphologie (sensibilité faible)

Gram, Ziehl, auramine
. présence d’une réaction cellulaire signant une infection
coloration MGG : PNN, macrophages
Numération des éléments et formule pour liquide articulaire

Liquide articulaire sans prothèse

< 1 000 GB 5 000 - 60 000 GB/mm3 100 000 GB

< 20% PNN 50% PNN 60-80% PNN > 90%PNN > 90% PNN

Arthrose PR Cristaux Réactionnelle Cristaux Infection

Chlamydia, Yersinia,
Trauma Lupus Salmonelle, Shigelle,
Infection
Campylo, Neisseria,
Lyme
Algodystrophie Psoriasis ………
PCR

Mécanique Inflammatoire +/- septique Septique

Mathews, Ann. Rheum Dis., 2007

 Examen direct
Permettre éventuellement une orientation diagnostic rapide

. présence de bactéries (sensibilité faible) et morphologie

Gram, Ziehl , auramine
. présence d’une réaction cellulaire signant une infection
MGG (PNN, macrophages)
Numération des éléments et formule pour liquide articulaire

Liquide articuliare avec prothèse

Infection sur PTG Sensibilité Spécificité

GB > 1700 / mm3 94% 88%

PNN > 65% 97% 98%

** Trampuz, Am J Med , 2004

sensibilité = vrais (+), spécificité = vrais (-)
 Mise en culture
Présence de bactéries ? Lesquelles ? Quels sont les antibiotiques actifs ?
 Mise en culture
Présence de bactéries ? Lesquelles ? Quels sont les antibiotiques actifs ?

Bactéries IOA = +/- biofilm / intracellulaire

X 2940
4h 8h 24 h
2h
Début de fabrication La surface du matériel Des bactéries
Fixation des S. aureus est recouverte par émergent du biofilm,
du "slime "
sur des irrégularités à une couche épaisse libres et prêtes à se
la surface du matériel de "slime" fixer ailleurs

Olson,
Olson, et al.
al. J. Biomed Mater Res 1988
 Mise en culture
Bactéries IOA = +/- biofilm / intracellulaire

COCCI

X 2940

Cocci au fond d'une cassure d'une couche épaisse de biofilm d'un séquestre infecté

Evans et al., Clin Orthop. 1998, 243-249

 Mise en culture
Bactéries IOA = +/- biofilm / intracellulaire

X 1000

Bactéries (points noirs) internalisées dans les ostéocytes entourés par des
lamelles osseuses.

(Internalization of S. aureus by osteoblasts in a patient with long term recurrent

osteomyelitis JBJS 2005)
 Mise en culture

Bactéries IOA = biofilm / intracellulaire

donc des bactéries cachées, engluées et adhérentes

des bactéries stressées
des bactéries physiologiquement peu actives

Bactéries IOA = très diverses

donc des bactéries aérobies

des bactéries anaérobies
des bactéries à croissance rapide / lente
des bactéries classiques / des bactéries exigeantes/non cultivables
 Mise en culture

Recommandation Référentiel de Microbiologie REMIC 2007

– Broyage avant ensemencement

(merci de nous adresser des morceaux pas trop gros !!!)
. mortier/pilon, broyeur à billes, …
. sonication (Trampuz, 2007 NEJM)

– Cultures . prolongées au moins 10 jours

. en aérobiose et anaérobiose
. sur géloses riches
sang et chocolat isovitalex / J1-J10
. en bouillons d’enrichissement
J10 à J21
repiquage systématique des bouillons même si clairs +++
. en bouillons d’hémoculture pour liquides articulaires

+ recherche de mycobactéries pas systématique mais y penser (surtout si négatif)

 Mise en culture

• Gélose Sang aérobie + gélose chocolat CO2 (lecture à J2)

• Gélose Sang anaérobie + gélose chocolat CO2 (lecture à J10)
• Bouillon liquide (lecture jusqu’à J21)
+ repiquage sytématique:
. gélose sang anaérobie + gélose chocolat lecture CO2
. lecture 48h
 Diagnostic bactériologique
Infections aiguës à espèces classiques
Bactéries " normales " S. aureus

• facile
• ED +
• réaction cellulaire ++
• culture rapide

Infections chroniques J10

J2
Bactéries "stressées"
• ED –
• Peu de PNN
• culture lente >> 48 heures
• populations d'aspects différents
• perturbation de l'activité des ATB
• antibiogrammes différents Staphylocoques à coagulase
négative
Interprétatation des cultures

J2

J10
 Interprétation des cultures

J2

J10

ou culture uniquement en bouillon liquide

(sachant qu’un seul cocci ou un seul bacille suffit à positiver)
 Interprétation des cultures

Polymorphisme
Polymicrobisme
Contamination
????

Aide : caractères biochimiques (galerie), génétique éventt

 Interprétation des cultures
Infection polymicrobienne (>15% des cas)

• Rare (1 colonie)
Staphylococcus aureus
culture positive en 24h

• Quelques colonies de
Staphylocoque à coagulase
négative à J4

• Nombreuses petites colonies

de P. acnes à J10
 Interprétation des cultures
Souches
Variation phénotypique Témoin
de la morphologie et de la résistance
d ’un même S. aureus
Péni R

Genta S Genta R

Peflo S Peflo R Peflo I

Rif S Rif I Rif R

Fosfo S Fosfo I Fosfo S

2 morphologies 1 morphologie 2 morphologies

Electrophorèse Champs pulsés

 Interprétation des cultures
Variants microcolonies ou SCV "Small Colony Variants"
Faciles à méconnaître :
• décrits pour beaucoup d’espèces bactériennes (os, mucoviscidose)
• croissance lente et culture retardée
• colonies de petite taille
• perte pigmentation, perte d’hémolyse
• auxotrophisme (Hémine, Thymidine, ménadione...)
• métabolisme de l ’ATP profondément perturbé
• forme de résistance des bactéries ?
 Variants microcolonies ou SCV

SCV
Même souche (génétiquement)
En bas : normale
En haut SCV

Particularités des micro-colonies in vitro:

. adhérence +++
. tps de génération (doublement) x 10
. perte de l ’activité bactéricide de certains ATB
. persistance des bactéries dans des niches
cellulaires protectrices (Cellules endothéliales
des vaisseaux, ostéoblastes, …)….
. peu de réaction inflammatoire locale
. à l’origine d’échec thérapeutique
 Infection polymicrobienne
Infection chronique depuis 8 ans, PTH 4 changée fois

Cotyle et synoviale gauche

(4 prélèvements):
• S. aureus : Péni R, S à tout
• S. epidermidis multi R

Fémur gauche (4 prélèvements)

• S. aureus : Péni R, S à tout
• S. epidermidis : 3 antibiogrammes différents
(oxa S/R, Genta S/R, Ery S/R, Fosfo S/R, Pef S/R, Rif S/R)
• S. warneri : 2 antibiogrammes différents
 Culture et identification
• Isoler tous les aspects avec au moins:
– identification et antibiogramme sur les colonies différentes
– sur au moins deux prélèvements différents (si possible)
Staphylocoques :
. recherche systématique du gène mecA (meti-R) ? (recommandations
CA-SFM)
. CMI Vanco et Teico systématique ?

• Rendu des résultats avec

– pour chaque prélevement + :
• Nombre de milieux + et lesquels
• nombre de colonies / milieu
• Antibiogramme(s)
– synthèse type "Anapath"
Que faire des prélèvements restés stériles ?

10 à 50 % des IOA selon les séries et les contextes

épidémio-cliniques

• patient sous antibiotique (arrêt minimum 15 j)

• prélèvement mal fait
• transport trop long
• culture inadéquate
• bactérie trop fragile
• espèce particulière et/ou méconnue ou non cultivable
• mycobactérie

Comment améliorer le diagnostic ?

Un exemple : ostéo-arthrite de l’enfant et Kingella kingae

190 prélèvements
89 des 104 prélèvements culture
négative
Culture
<4 ans >4 ans
Positif : 86 Negatif : 104
PCR spécifique PCR Universel
K. kingae 16SrDNA

S. aureus 38 1+ Gélose sang

K. kingae 25 12+ Flacon Hémoc ana
S. Pyogenes 4 24+ Flacon Hémoc aéro 60 -
29 +
S. Agalactiae 3
S. Pneumoniae 6
H. influenzae 2 29 K. Kingae 8 + 52 -
Others 8
N. meningitidis W13 (1)
S. pyogenes (1)
S. constellatus (1)
Bilan Kingella kingae S. aureus (1)
Culture gélose 1/190 Streptococcus spp. (1)
Culture gélose + flacon hémoculture 25/190 Enterobacteria (2)
Culture gélose + flacon hémoculture + PCR 54/190 Pseudomonas spp. (1)
 Nouveaux outils
travail encore possible pour l’optimisation de conditions de
culture (flacon d’hémoculture) et délais de mise en culture

biologie moléculaire
¾ rapidité, sensibilité potentielle à optimiser +

¾ pas de miracle mais prometteur

¾ encore en phase d’évaluation

¾ nécessité de coordonner des études prospectives

d’évaluation
. de la PCR universelle
. des PCR spécifiques
. des schémas diagnostiques optimisés
stratifiés par groupe patients
pour l’instant : à réserver quand culture – et suspicion ++
 Conclusion

• Points clés
– gestion des prélèvements
– conditions de cultures
– travail délicat et difficultés rencontrées
– résultats échellonnés parfois longs à obtenir

• Nouveaux outils
– amélioration des cultures
– outils moléculaires
 Remerciements

• Anne-Marie FREYDIERE (CBE, HCL)

• Sylvestre TIGAUD
Laboratoire bactériologie
• Chantal ROURE-SOBAS
CBN, HCL
• Hélène SALORD
• Olivia RAULIN
et … l’ensemble des techniciennes du laboratoire de la Croix Rousse

• Bactériologistes du CBE et CBL des HCL