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Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas


Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas


Profa. Elisabete José Vicente
bevicent@usp.br
3091.7350

2004
MICROBIOLOGIA

NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA

¾ É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de


mangas compridas e estar abotoado;
¾ Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório;
¾ O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido
longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material
necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para
anotações;
¾ Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas,
ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o
técnico responsável pela aula prática;
¾ Descarte de material:
a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios,
existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias;
b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada;
c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as
bancadas;
d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes.

¾ Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes


¾ Terminados os trabalhos práticos:
a) Esterilizar alças e fios de platina;
b) Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas;
c) Desligar lâmpadas e microscópios;
d) Limpar microscópios e cobri-los com a capa;
e) Tirar o avental e guardar;
f) Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

3
Módulo I
Introdução à microbiologia

4
Módulo I ......................................................................................................................... 4
Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4
Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7
Técnica de semeadura ............................................................................................... 7
Objetivo .................................................................................................................... 10
Material ..................................................................................................................... 10
Procedimento e Resultados...................................................................................... 10
Questionário ............................................................................................................. 11
PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12
Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12
Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13
A técnica ................................................................................................................... 15
Objetivo .................................................................................................................... 16
Material ..................................................................................................................... 16
Procedimento:........................................................................................................... 16
Resultados:............................................................................................................... 18
Questionário ............................................................................................................. 18
PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19
Objetivo .................................................................................................................... 19
Materiais ................................................................................................................... 19
Procedimento e resultados ....................................................................................... 19
A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19
B. Visualização de fungos......................................................................................... 20
PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21
Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21
Curvas de crescimento ............................................................................................. 22
Objetivo .................................................................................................................... 25
Material ..................................................................................................................... 25
Procedimento............................................................................................................ 25
Resultados................................................................................................................ 25
Questionário ............................................................................................................. 25
PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA
SUSPENSÃO................................................................................................................... 26
Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26
Problema: ................................................................................................................. 27

5
Verificação de entendimento: ................................................................................... 28
PRÁTICA 6 - AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ..................... 29
Anti-sépticos e desinfetantes .................................................................................... 29
Objetivos................................................................................................................... 31
Material ..................................................................................................................... 31
Procedimento............................................................................................................ 32
Resultados................................................................................................................ 32
Questionário ............................................................................................................. 32
PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA ...................................................................................... 32
Teoria ....................................................................................................................... 32
Objetivo .................................................................................................................... 33
Materiais ................................................................................................................... 33
Procedimento............................................................................................................ 33
Questionário ............................................................................................................. 34
PRÁTICA 8 - PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. ............... 35
Introdução................................................................................................................. 35
Objetivo .................................................................................................................... 35
Material ..................................................................................................................... 35
Procedimento............................................................................................................ 35
Resultados................................................................................................................ 35
Questionário ............................................................................................................. 35
PRÁTICA 9 - CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS............................................................... 36
Introdução................................................................................................................. 36
Objetivo .................................................................................................................... 37
Material ..................................................................................................................... 37
Procedimento............................................................................................................ 38
Resultados................................................................................................................ 39
PRÁTICA 10 - POSTULADO DE KOCH.......................................................................... 40
Abordagem clássica ................................................................................................. 40

6
PRÁTICA 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA

Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador


como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas.

TÉCNICA DE SEMEADURA

Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo
mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos
presentes no ambiente, e evitar acidentes laboratoriais.
1. Flambagem da alça ou fio de platina:
Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de
qualquer operação de semeadura. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte
inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. A posição correta para
a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de
trabalho (Figura 1). Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen.
Para retirar o material, seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura, esfriar
previamente a alça. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na
tampa da placa de petri;

Figura 1- Posição correta para a flambagem da alça

2. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a

7
boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de
algodão). Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo, da mão que está
segurando a alça ( Figura 2). Após a retirada do material com a alça, flambar
novamente a boca do tubo e colocar a tampa. Não pousar os tampões sobre a
bancada!!! Flambar a alça após o uso;

Figura 2 – Removendo o tampão de algodão

3. As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas, são


oferecidas embrulhadas em papel (às vezes, dentro de um cilindro metálico).
Para uso, torcer o papel na região central da pipeta, retirar primeiramente o papel
da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta).
Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador.
Uma vez utilizada, a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo
solução desinfetante.

4. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar
contaminação com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser
incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo.

5. Na semeadura usando placas de Petri, após flambar a alça até o rubro, e


introduzi-la na cultura de bactéria, semear na placa de Petri (fig.3).

8
Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias

6. Após a primeira estria, flambar novamente a alça, girar a placa cerca de 30˚ e
puxar nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa
técnica é conhecida também por esgotamento.
7. As placas serão incubadas a 37˚C por 24h, e depois guardadas a 4˚C até a
próxima aula.

Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de


colônias

1Não esqueça!!!!!!
Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo, ou
num pedaço do ágar sem cultura), antes de colocar a alça em contato com a cultura,
lembre-se: ela está muito QUENTE!!!
Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma, sempre invertida.

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OBJETIVO
Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli, e obter
colônias isoladas

MATERIAL
¾ alça de platina;
¾ tubo de ensaio com meio completo líquido
¾ placa de Petri com meio completo sólido;
¾ tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli.

PROCEDIMENTO E RESULTADOS
Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo, não esquecendo de
ilustrar os resultados obtidos

A) SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO

B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SÓLIDO

10
C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS

QUESTIONÁRIO

1. Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferência?


2. Por que deve-se manter sempre que possível a placa de Petri com meio sólido
invertida?
3. Qual a finalidade de se fazer várias estrias, na semeadura em placa, contendo
meio sólido?

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PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM

FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS

A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios


preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame
microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame
microscópico após coloração que, além de facilitar sua observação, permite a
visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser corado, o microrganismo
deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem
na chama.
Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. Um desse
íons, o que dá a cor, é chamado de radical cromóforo. Então, os corantes conhecidos
como básicos tem a cor do seu íon positivo, enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon
negativo. A célula bacteriana é negativamente carregada, portanto atrai corantes
básicos. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta, azul de metileno e
safranina .
Existem inúmeros métodos para coloração. A introdução de colorações, no estudo
dos microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro
razões principais:

¾ Permitem uma visualização melhor das células, já que nas preparações


sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos
arranjos;
¾ Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares;
¾ Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e
¾ Podem, eventualmente, identificar alguns grupos.

Quanto aos tipos de coloração temos:

1) Coloração simples - cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das
células mais visíveis.

2) Coloração diferencial - nessa coloração o corante reage diferentemente com

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diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são
exemplos de colorações diferenciais.

3) Coloração especial - são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas
dos microrganismos como esporos, flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas.

No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por
aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são
chamadas mordentes, e é o caso do iodo na coloração de Gram. Uma outra função do
mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a
coloração.

PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE


GRAM

Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans


Christian Joachim Gram, em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um
esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, iodo, etanol-
acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em
Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das
amostras analisadas.
A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da
parede celular, mas sim com sua estrutura física, o que confere a característica de
positividade ao Gram.
A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos
de células igualmente. Essa maneira de reagir diferentemente, frente ao Gram, é em
razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias.
Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV)
mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo),
enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo).
Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que
as Gram(-) (Fig. 5).

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Parede celular constituída de uma camada
grossa de peptídeoglicano

Gram positiva
Membrana plasmática

Complexo de membrana externa, com inclusões


de lipopoliproteínas e lipossacarídeos

Parede celular constituída de uma camada


fina de peptídeoglicano

Membrana plasmática
Gram negativa

Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas

Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo
penetram facilmente, e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CV-
Iodo, que é maior que a molécula de CV que penetrou. Por causa do seu tamanho o
complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células
permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta.
Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é
lavado através da camada fina de peptideoglicano, que não consegue reter o complexo.
Estas células são então contracoradas pelo segundo corante, a Safranina ou Fucsina e
aparecem vermelhas.
Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana, mas não deve
nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. É importante ressaltar que a
coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil, quando corretamente
realizada e interpretada.

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A TÉCNICA

O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana


crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de
tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-
negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma
coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em
seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona
(1:1 v:v). O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias
Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, decorando as células. Por
outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-
positivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano, tornando-as impermeáveis
ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da
descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção
do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A
retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e
químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade
e integridade.
Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Ao
microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as
Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias Gram-positivas,
células velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos,
tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou
todas as células coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco é
importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o
tratamento com etanol-acetona for omitido.
O corante cristal violeta pode ser substituído, com os mesmos resultados, pelo
azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina.
A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que
por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanol-
acetona pode ser substituído por álcool 95%.

O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com


que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). Paralelamente,
devem ser capazes de distinguir formas e arranjos.

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OBJETIVO
Coloração de microrganismos provenientes de meios, sólido e líquido, pelo método
de Gram.

MATERIAL
¾ alça de platina;
¾ lâmina de vidro;
¾ placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido;
¾ tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído;
¾ cristal violeta a 1%;
¾ lugol;
¾ solução diferenciadora;
¾ fucsina básica;

PROCEDIMENTO:

A. PREPARO DO ESFREGAÇO

Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido


1) Flambar a alça corretamente
2) Esfriá-la nas paredes do tubo
3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça.
4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca.
5) Espalhar o material sobre a lâmina, procurando obter um esfregaço fino.
6) Secar à tempetatura ambiente.
7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen, passando a lâmina algumas vêzes
pela chama.
OBS. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo.
8) Realizar a coloração.

Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido


1) Colocar com a própria alça, já flambada, uma gota de água de torneira no centro da
lâmina de vidro.
2) Flambar novamente a alça

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3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri, ou no meio sólido numa região sem colônia.
4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano.
5) Homogeneizar este material com a gota de água, cuidando para obter uma suspensão
pouco densa e sem grumos.
6) Secar a lâmina por exposição ao ar.
7) Fixar o esfregaço.

B. COLORAÇÃO
1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. ATENÇÃO PARA NÃO
COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!!
2) Lavar rapidamente em água corrente;
3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto;
4) Lavar rapidamente em água corrente;
5) Lavar uma ou duas vezes, rapidamente, com a solução diferenciadora: álcool ou acetona;
6) Lavar rapidamente em água corrente;
7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos;
8) Lavar novamente em água corrente;
9) Secar a lâmina, tomando o cuidado de não remover o esfregaço;
10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

1Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram.


¾ A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada, devendo ser filtrada para a
remoção de precipitados.
¾ A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Ela deve ser efetuada
rapidamente. Porém, não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada.
¾ Os esfregaços não devem ser muito espessos, pois são mais difíceis de descorar e de
permitir observações.
¾ Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração, com
bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. Evitar estas
culturas!

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RESULTADOS:

___________________ ____________________

__________________ ___________________

QUESTIONÁRIO

1. Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram


positivas e Gram negativas?
2. Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram, podendo
inclusive levar a erros?

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PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA
MICROBIANA

OBJETIVO
Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por
microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos .

MATERIAIS
¾ Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes e
dois tipos de fungos);
¾ Microscópio ótico;

PROCEDIMENTO E RESULTADOS
Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de
cada uma das bactérias apresentadas. Repita o procedimento para os fungos
apresentados.

A. Visualização de bactérias:

b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus

c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis

d) Bacilos Gram - : Pseudomonas aeruginosa

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e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes

B. Visualização de fungos
Filamentosos

Leveduras

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PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO

CRESCIMENTO BACTERIANO

O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do


número de suas células ou o aumento de sua massa. Nos organismos unicelulares, o
crescimento pode ser entendido como:
¾ aumento de tamanho de uma célula individual;
¾ aumento da massa de uma célula individual;
¾ aumento do número de células de uma população;
¾ aumento da massa total de uma população.
O aumento em tamanho de uma célula bacteriana conduz à divisão celular e
conseqüente aumento do número de indivíduos na população, seja em ambientes
naturais (in vivo) ou em culturas de laboratório (in vitro).
Do ponto de vista bioquímico, cada célula bacteriana é uma unidade catalítica.
Quando uma bactéria se divide, cada novo indivíduo pode catalisar a biossíntese de
material celular adicional. Assim, o número de unidades catalíticas (células) aumenta
com o tempo e, como conseqüência, biomassa é sintetizada em uma taxa progressiva na
população em crescimento.
Uma característica importante do crescimento bacteriano é o fato de que a maioria
das espécies de bactérias é capaz de crescer em taxas bastante rápidas. O tempo de
geração refere-se ao tempo requerido para uma célula bacteriana duplicar seu DNA e
dividir-se. Sob condições ótimas de crescimento, muitas espécies bacterianas
apresentam um tempo de geração médio de 20 minutos, ou seja, a cada 20 minutos uma
nova geração de indivíduos é produzida.
Em uma população composta por milhares de bactérias em crescimento ativo,
pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada
nova geração (e.g., a cada 20 minutos) a população dobra de tamanho. Este tipo de
crescimento populacional é denominado de crescimento exponencial ou logarítmico, no
qual o número de indivíduos dobra a cada geração.
A maior vantagem de um tempo de reprodução tão rápido é que as bactérias
podem evoluir muito rapidamente e esta e a razão do seu sucesso no mundo vivo. A
evolução ocorre através de mutações genéticas que produzem variações na
descendência de um organismo e o ambiente determina que mutações são vantajosas
no sentido de aumentar suas chances de sobrevivência e de sucesso reprodutivo
(adaptação). Devido aos tempos de geração muito curtos, as bactérias podem testar

21
bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo.
Portanto, o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu
grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua
composição: condições nutricionais, temperatura, pH, osmolaridade, oxigênio e luz. As
distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem
crescer. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento
atinge uma taxa ótima.
Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la, como cultura
pura, em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e
físicas, tais como fontes de nutrientes, osmolaridade, pH, presença ou ausência de
oxigênio e temperatura de incubação.
O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do
aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de
crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população
(método de determinação do número de unidades formadoras de colônia). Não há
método perfeito; ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. A escolha
do método depende da situação particular que se apresente.

CURVAS DE CRESCIMENTO

Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano é a


obtenção de curvas de crescimento. Estas são representações gráficas do aumento do
número de indivíduos em um determinado período de tempo.
Em condições experimentais, quando se inocula uma população bacteriana em
um frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado), o
crescimento dessa população passa por quatro fases características, dependendo do
ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. Essas
quatro fases estão representadas na Figura 6.

Figura 6 – Curva de crescimento bacteriano padrão em sistema fechado

22
Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente; o metabolismo celular está
direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas
condições ambientais encontradas pelas células. O número de indivíduos não aumenta
nesta fase, podendo até mesmo decrescer. A duração dessa fase depende das
condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. A fase lag
será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior
ou se a população for constituído de bactérias esporuladas.
Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população
dobra a cada geração. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente
em um sistema fechado. Após um determinado período de crescimento exponencial, as
condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais,
acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. A taxa de crescimento da
população diminui e segue-se a fase estacionária.
Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido
às condições limitantes do meio. As células continuam metabolizando e se dividindo, mas
parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de
morte celular, o que mantém constante o número de células viáveis na população. A
curva de crescimento atinge um platô. A duração da fase estacionária depende do
balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando
inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais
tornarem-se progressivamente desfavoráveis.
Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de
morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. O número de células viáveis entra em
declínio progressivo até a completa extinção da população.

Para a construção de uma curva de crescimento bacteriano, mede-se o aumento


da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio líquido através de
medidas da densidade óptica da cultura. Alíquotas da cultura em crescimento são
retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbância da cultura
contra um comprimento de onda de 600 nm. Para tal utiliza-se um espectrofotômetro
onde o branco é o meio de cultura utilizado, ausente de inóculo.
Cada medida obtida corresponde à densidade óptica (DO) da cultura em um dado
momento do crescimento. A absorbância aumenta proporcionalmente ao aumento do
número de células (biomassa) na população. Desta forma pode-se construir um gráfico
representativo do progresso do crescimento, relacionando-se a DO pelo tempo.

23
Só são confiáveis medidas de DO até 2.0. Acima disto as leituras perdem a
confiabilidade. Se a leitura de uma amostra for maior que 2.0 deve-se fazer uma diluição
10-1 dessa amostra e registrar sua DO. Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se
multiplicar a DO obtida por 10.

Quadro 1. Vantagens e desvantagens do método de medidas da densidade óptica


Vantagens Desvantagens e limitações
¾ simplicidade da metodologia; ¾ não é possível a estimativa do
número de células/ml da população;
¾ medidas prontamente obtidas: o ¾ células inviáveis, fragmentos de
resultado do experimento é conhecido ao seu células mortas e material difundido no
final; meio de cultura interferem na obtenção
de resultados ;
¾ possibilita o reconhecimento do padrão ¾ só se obtêm leituras acuradas da
de crescimento da população bacteriana em DO até o valor de 2.0, acima disto as
estudo (as diferentes fases do crescimento leituras perdem a confiabilidade;
bacteriano podem ser visualizadas em
gráfico);
¾ pode-se estabelecer comparações do
padrão de crescimento de diferentes
populações bacterianas;
¾ pode-se estabelecer comparações do
padrão de crescimento sob diferentes
condições ambientais;
¾ células bacterianas agrupadas após a
divisão celular não prejudicam os resultados;
¾ reduzida quantidade de material
utilizado;
¾ a introdução de erros experimentais
pelo operador é menor;
¾ o experimento não é cansativo,
reduzindo a introdução de erros experimentais
por parte do operador;

24
OBJETIVO
Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de E. coli
através de medidas de densidade óptica.

MATERIAL
¾ Cultura bacteriana pura;
¾ Espectofotômetro;
¾ Solução salina;
¾ Pipetas;
¾ Tubos de ensaio;

PROCEDIMENTO
Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais, os demais
pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos.

RESULTADOS
A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos.(Não se esqueça
de identificar os eixos, e suas unidades!!!)
B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico.

QUESTIONÁRIO
1. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do
crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta.

25
PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA
SUSPENSÃO

ESTIMATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS

A estimativa do número de células viáveis comumente é feita através de diluições


seriadas de uma cultura bacteriana, em solução salina, seguido da semeadura de uma
alíquota de cada diluição em placas de Petri contendo meio bacteriológico sólido. Esta
técnica baseia-se na hipótese de que, no espalhamento, células bacterianas individuais
ocuparão posições separadas na superfície do meio de maneira que cada uma dê
origem a uma colônia bacteriana isolada. As colônias crescendo no meio de cultura
podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador.
Como cada colônia supostamente originou-se da multiplicação um único indivíduo,
o resultado da contagem das colônias multiplicado pela quantidade de diluições decimais
é a estimativa do número de bactérias presentes em um ml da cultura original. A célula
individual que originou uma colônia é denominada de "Unidade Formadora de Colônia"
ou UFC.
Esse procedimento é repetido em diferentes intervalos de tempo e com os
resultados pode-se construir um gráfico representando o progresso do crescimento

Quadro 2. Vantagens e desvantagens do método da contagem de células viáveis


Vantagens Desvantagens e limitações
¾ permite uma estimativa do número ¾ detecta somente as células viáveis e
de células viáveis/ml da população que se repliquem, ou seja, aquelas
capazes de formarem colônias; muitos
indivíduos viáveis podem não se replicar,
prejudicando o cálculo
¾ possibilita o reconhecimento do ¾ se as células da bactéria estudada
padrão de crescimento da população mantém-se agrupadas após a divisão
bacteriana em estudo (as diferentes fases celular (cada colônia em meio sólido seria
do crescimento bacteriano podem ser formada por mais de uma célula)
visualizadas em um gráfico)

¾ pode-se estabelecer comparações ¾ se as diluições não forem


do padrão de crescimento de diferentes homogeneizadas adequadamente
populações bacterianas
¾ pode-se estabelecer comparações ¾ se um número muito pequeno ou
do padrão de crescimento sob diferentes muito grande de colônias for usado na
condições ambientais contagem
¾ se o operador não fizer o
espalhamento rapidamente e de forma

26
adequada.
¾ células inviáveis, fragmentos de ¾ a cada diluição um erro experimental
células mortas e material difundido no meio é introduzido pela instrumentação e pelo
de cultura não interferem na obtenção de experimentador
resultados ¾ este método detecta apenas um
número muito reduzido de células, o que
prejudica a estimativa
¾ a grande quantidade de material
utilizado

¾ a acuracidade dos resultados está


diretamente relacionada à quantidade de
material (principalmente placas de Petri)

¾ a limitação de material impõe um


aumento do erro experimental
¾ o resultado do experimento é só
conhecido após o crescimento das colônias
isoladas nas placas de Petri

A) BACTERIANA
A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de
determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias).

PROBLEMA:
1. Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+). Você fez
um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada. VOCE
PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE,
QUE FAZER?

2. Mas digamos que você precisa ou deseja conhecer o nível de contaminação e


que a bactéria contaminante seja lac-. Neste caso você poderá:
0,1ml (diluição 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e _________lac-
0,1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e _________lac-
0,1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e _________lac-
0,1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e _________lac-

3. Qual é a concentração de E. coli número de (UFC/ml da cultura original)?


(X)_________

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4. Qual é a concentração da bactéria lac- contaminante (UFC/ml da cultura
original)? ( Y) _________
Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________

B) DE LEVEDURAS
Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨

VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO:
Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática. Você
saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos?

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PRÁTICA 6 - AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE

ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES

HISTÓRIA
O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito, em relação aos
processos de embalsamento, inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do
corpo à ressurreição. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas, tais como
óleos voláteis, resinas oleosas, vinhos, vinagres, mel, mura, bálsamo, além do fato de os
vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento
de feridas e, consequentemente, evitando a infecção.
A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância
desodorante e anti-séptica, sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto
à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia.
Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de
agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos. Coube a Lister, em
1865, a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens, compressas cirúrgicas,
instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas.

CONCEITOS GERAIS
Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros
microrganismos infectantes. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou
germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas.
Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo, mas inibe sua
velocidade de crescimento. Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções
locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. As
substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção
bacteriana. A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e
irritação tecidual indesejáveis. O aumento da concentração de um agente anti-séptico
pode irritar e talvez, até matar o tecido normal do hospedeiro. Bem como as células
bacterianas, interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na
cicatrização de feridas.
A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de
tempo de reação, número de microrganismos, concentração da droga e temperatura.

USOS TERAPÊUTICOS DE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES


Vários fatores podem influenciar na eficácia e/ou eficiência dos procedimentos ou
agentes microbianos. Tais como:
¾ O microorganismo, seu número e sua suscetibilidade;
¾ O agente microbiano e sua respectiva concentração;
¾ O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano;
¾ A presença ou não de uma limpeza mecânica prévia;
¾ A prévia remoção ou não de detritos e impurezas da superfície ou tecidos
através do uso de sabões ou detergentes;
¾ A presença ou não de resistência bacteriana ao agente antimicrobiano.

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ÁLCALIS
Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. O mecanismo
de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. Um pH maior do que 9 inibirá a
maioria das bactérias.

ÁLCOOIS
Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes, anti-sépticos e desinfetantes.
São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes.
São potentes bactericidas contra micobactérias, Gram positivas, Gram negativas,
fungos patogênicos, muitos vírus e não em esporos. A presença de água é fundamental
para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e
matéria orgânica.
Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em
relação a outros agentes germicidas, de terem ação rápida, de apresentarem baixo custo
e praticamente serem atóxicos.
As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida, baixa penetrabilidade,
desidratantes, não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de
ferimentos abertos.

SURFACTANTES
É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa.
Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão, pela borracha e
materiais porosos, diminuindo assim, a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana.
Com base na posição hidrofóbica da molécula, há três tipos:
¾ Aniônicos : Os sabões são os mais importantes. São antibacterianos contra
microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes;
¾ Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais. Apesar
de possuírem efeitos limitados sobre os vírus, eles são eficientes contra
bactérias Gram positivas e Gram negativas, mas em geral, os detergentes
catiônicos não possuem ação virucida, fungicida ou esporocida, Vantagens:
Não são em geral irritantes para a pele e tecidos, baixa toxicidade, são
inodoros, podem ser usados em soluções com água e álcool.
Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões), não
agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando
em contato prolongado com a pele, mucosas e trato respiratório.

¾ Não-iônicos.

HALOGÊNIOS
Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo
protoplasma. As atividades em soluções livres de matéria orgânica são, em ordem
decrescente: 1º. Cloro, 2º. Bromo, 3º. Iodo. Já, na presença de matéria orgânica o mais
ativo é o Iodo.

METAIS PESADOS

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Derivados do mercúrio
Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. A
sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática
essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos
orgânicos e inorgânicos. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos
orgânicos. O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece
imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente.

Compostos de Prata
Produzem efeitos cáusticos, adstringentes, antibacterianos pela ação do íon de
prata livre e produz desnaturação de proteínas. Os preparados de Prata coloidal não são
corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. A prata metálica precipita
as proteínas e produz efeito irritante.

AGENTES OXIDANTES
São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas
Gram+ e Gram-. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos,
mas não destroem esporos bacterianos. Liberam Oxigênio que se combina com a
matéria orgânica se tornando inativos.
A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar
em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase.
Quando é distribuído sobre ferida com exsudato, a sua efervescência vai remover o pus
e restos celulares e confere atividade germicida limitada. É valioso para limpar e
desodorizar o tecido infectado.
O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica.
As soluções possuem uma grande ação antibacteriana.

OBJETIVOS
Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano.

MATERIAL

¾ 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido
com 5% sangue desfibrinado de carneiro;
¾ 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis;
¾ 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados, ou + 3 zaragatoas
estéreis;
¾ sabão, álcool iodado, mertiolate, anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral
disponíveis 1 para cada grupo, podendo haver repetições);
¾ Alça de Platina , bico de Bunsen;
¾ Microscópio óptico, bateria de Gram, lâminas;

31
PROCEDIMENTO
1. Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente
sobre as costas de uma das mãos. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de
diâmetro;

2. Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio Ágar sangue;

3. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar


nas costas da outra mão, numa área de mesmo diâmetro da primeira;

4. Esperar 4 minutos para que haja ação do anti-séptico e passar na área


desinfectada um terceiro cotonete umedecido com solução fisiológica. Tomar
cuidado para não atingir a região não desinfectada;

5. Espalhar o conteúdo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo


ágar-sangue;

6. Marcar na placa o anti-séptico utilizado e o número do grupo que realizou o


experimento;

7. Incubar a placa por 24h, em estufa a 37°C.

RESULTADOS
Na quinta-feira:
1. Observar os resultados e anotar.
2. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias
após coloração de Gram. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!)

QUESTIONÁRIO
1. Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que
usaria um desinfetante.
2. Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes.Nesta lista
deve conter o principal composto ativo, o nome comercial, e o uso .
PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA

TEORIA
Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade
de bactérias aos antimicrobianos. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a

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atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias
resistentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como
sensível, intermediário ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (minimun
inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration).
1- Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de
diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou
líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. Após incubação determina-se MIC
e/ou MBC.
2- Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste
qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na
superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. A droga se difunde no
ágar e produz inibição do agente sensível, formando um halo de inibição que deve ser
medido e comparado com tabelas padronizadas. Para a garantia desta técnica, alguns
fatores são essenciais:
− Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza
por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas;
− Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias,
devendo-se realizar a coloração de Gram. A densidade do inóculo deve
corresponder a turbidez 0,5 na escala padrão de turbidez (Escala de Mac-
Farland).

OBJETIVO
Analisar pelo método de difusão a ressitência de E. coli a alguns antibióticos.

MATERIAIS
¾ “Swab” estéril;
¾ cultura líquida fresca de Eschirichia coli;
¾ placas de Petri, com meio Mueller-Hinton sólido;
¾ discos de papel com antibióticos;
¾ pinças;
¾ régua.
PROCEDIMENTO

1. Introduzir nas culturas um “swab” estéril, retirar o excesso de líquido comprimindo


a ponta do “swab” nas paredes do tubo;

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2. Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa
placa de Petri (meio Mueller-Hinton). Espalhar bem, de modo a obter um “tapete”
de bactérias em toda a superfície do meio sólido;

3. Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos);

4. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar


pinças);

5. Incubar em estufa a 37ºC , por 16 a 24 horas;

6. Medir os halos formados (em mm), registrar os dados obtidos e relacionar com a
tabela abaixo:

Bactéria Discos com antibióticos


Oxacilina Carbemicilina Kanamicina Rifampicina Sulfonamida Estreptomicina
OX CB K RIF SUL EST
(1µg/mL) (100µg/mL) (30µg/mL) (30µg/mL) (300µg/mL) (10µg/mL)
Escherichia coli
Leituras
(mm)
Resultados
Padrões R< 10 R< 13 R< 12 R< 16 R< 12 R< 11
S> 13 S> 17 S> 15 S> 20 S> 17 S> 15

Relate os resultados obtidos e interprete comentando.


QUESTIONÁRIO
1. O que é antibiograma e para que serve?
2. Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação?
3. Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático?
4. Dos antibióticos testados na experiência acima qual seria o mais indicado para o
tratamento da infecção causada pela linhagem E. coli testada? Por que?
5. Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria
Gram-negativa?

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PRÁTICA 8 - PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS.

INTRODUÇÃO
Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de
microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos.
Um importante exemplo deste processo é o alho.
A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos
ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos.

OBJETIVO
Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais.

MATERIAL
¾ Placas de ágar Sabouraud;
¾ Alho e cebola;
¾ Cotonetes;
¾ Graal e pistilo;
¾ Discos de papel de filtro;
¾ Culturas: Staphylococcus sp e E. coli.

PROCEDIMENTO
1. Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo;
2. Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na
cultura;
3. Macerar o alho e a cebola, separadamente, em graal,
4. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a
superfície do meio semeado;
5. Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição.

RESULTADOS
Descreva as observações feitas ao final da incubação.

QUESTIONÁRIO
Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . Pode ser algum já relatado na
literatura ou algum de conhecimento popular.

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PRÁTICA 9 - CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS

INTRODUÇÃO

A conjugação bacteriana, descoberta por Lederberg e Tatum (1946) é o processo


“sexual"de transferência de genes de uma bactéria doadora para outra receptora. Esta
célula doadora é diferenciada durante a conjugação pela presença de um apêndice na
sua superfície chamado de pili F.
Para que uma linhagem bacteriana seja doadora, ela deve conter um plasmídio
conjugativo (elemento extra-cromossômico). O processo de conjugação foi descoberto
em E. coli K12 e o elemento extra-cromossômico responsável foi chamado de fator F (de
fertilidade) ou plasmídio F.
Há dois tipos de plasmídios conjugativos: os plasmídios auto-transmissíveis e os
mobilizáveis.
Os autotransmissíveis carregam um conjunto de genes, os genes tra, cujos
produtos promovem a transferência deste plasmídio para uma célula aceptora. Os genes
tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo, especifica proteínas
envolvidas não só na interação superficial (contacto) entre as células doadora e
aceptora, bem como, na formação dos poros na membrana. O outro grupo, refere-se aos
genes mob, os quais especificam proteínas envolvidas na mobilização do DNA. A
transferência do DNA é iniciada pela ação de um gene mob que tem a atividade em
romper (nicking) em uma única fita da molécula do DNA, em um sítio específico,
chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hélice. Como resultado, somente
uma fita, pode ser transferida para a célula aceptora e a outra fita permanece na célula
doadora. Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar. Concluindo, os
produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos, ainda que os
produtos dos genes tra promovem o contacto das células doadora-aceptora e promovem
um contexto físico (formação dos poros) para esta transferência.
Por outro lado, os plasmídios mobilizáveis codificam, somente um dos conjuntos
das funções encontradas nos plasmídios auto-transmissíveis para concluir a
transferência. Contudo, o plasmídio mobilizável deve conter um ori T. Como a interação
mob-oriT é específica, o sítio de oriT deve ser compatível com as funcões mob
presentes nas células doadoras, para que o plasmídio possa ser transferido. Um
exemplo de plasmídio mobilizável é o plasmído natural ColE1 ou colicinogênico que
codifica as atividades dos genes mob e seu oriT.
Experimentos genéticos demonstraram que todas as três classes de funcões de

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conjugação, tra, mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre
bactérias e bactérias e leveduras. Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas
de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E. coli.
Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem
permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano
(chamados de estado integrado). No primeiro caso, a linhagem bacteriana é chamada de
F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas
sequências chamadas de elementos IS). Neste estado, o fator F media a transferência
do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. Raramente, o cromossomo inteiro da
célula Hfr é transferido.
As células F+ após contato com as células F-, transferem em alta frequência
para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F, tornando-a F+. Por outro lado, a
linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano, transfere,
sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. Raramente, o
cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. O fator F também é raramente
transferido.
Após a descoberta do fator F, outros plasmídios conjugativos foram sendo
descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência
de resistência). Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas
antibacterianas e não integram-se, normalmente no cromossomo bacteriano. Alguns
plasmídios não promovem conjugação, mas podem ser mobilizados por outros
plasmídios conjugativos.

OBJETIVO
Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere
resistência a tetraciclina, para a Escherichia coli K12 .

MATERIAL
¾ Tubos de ensaio ;
¾ Placas com meio sólido;
¾
Linhagens
a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac- , Tetr ). Hospeda um
plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ).
b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ , Nalr). O fenótipo de resistência
ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal.

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Antibióticos
a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml
b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml
PROCEDIMENTO

1° Dia
1. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4,0ml de meio
TSB. Incubar à temperatura de 37°C por uma noite.
2°Dia
1. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1,0ml de TSB ou LB as seguintes
culturas:
¾ 1,0 ml da linhagem S. typhimurium MG031 (doadora) e
¾ 1,0 ml da linhagem E. coli K12 (receptora)

2. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitação à temperatura de 37°C.

3. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio sólido:

3.1 Célula doadora: S. typhimurium MG031


¾ 0,1ml (sem diluição) em meio MacConkey-Nal
¾ 0,1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey -Tc
¾ 0,1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Tc
¾ 0,1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Tc

3.2 Célula receptora: E. coli K12


¾ 0,1ml (sem diluição) em meio YT-Nal-Tc
¾ 0,1ml (diluição 10-4 ) em meio MacConkey -Nal
¾ 0,1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Nal
¾ 0,1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Nal

3.3 Mistura de conjugação (Transconjugantes):


¾ 0,1ml (sem diluição) em meio MacConkey -Nal-Tc
¾ 0,1ml (diluição 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc
¾ 0,1ml (diluição 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc

4. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite).

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RESULTADOS
3°Dia
Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação. A freqüência é
determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células
receptoras.

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PRÁTICA 10 - POSTULADO DE KOCH

Como provar que um microrganismo é responsável por uma doença?


A resposta clássica é um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e
posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia, Epidemiologia e da
Genética Molecular.

ABORDAGEM CLÁSSICA
Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava
deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um
microrganismo em particular e uma doença.
1. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença; a bactéria ou
seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença;
2. A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em
culturas puras;
3. A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal
experimental deve produzir os sintomas da doença;
4. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos
intencionalmente infectados.
Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias
causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose. Estes se constituíram nas
primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças
infecciosas.
Estes postulados apresentam, contudo, uma série de limitações devido ao precário
conhecimento, ao tempo de Koch, dos mecanismos que regem a infectividade
bacteriana.
1. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das
bactérias e independente do hospedeiro. Na realidade, a susceptibilidade do hospedeiro
é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria:
¾ Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por
quimioterapia anti-câncer, tratamento com corticosteróides, infecção por HIV ou
diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção
em pessoas sadias;
¾ A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da
sub-população usada como ponto de referência.
2. O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno. Há algumas

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doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo
meio adequando não é, ainda, disponível:
¾ Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e
Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase, respectivamente.
Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a
eliminação da bactéria do tecido infectado. Há também, uma resposta imunológica
dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias
observadas nas lesões provocadas pela doença;
¾ A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as
de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de
bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças.
3. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie
bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma
determinada doença.
¾ diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam
consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas;
¾ os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e
há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens
(infecções polimicrobianas);
¾ os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma
doença parece mais uma exceção do que uma regra;
¾ o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator
de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio.
4. O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano
ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença.
¾ Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única
alternativa é a utilização de um modelo animal, se houver um disponível;
¾ Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam
sintomas diferentes daqueles observados em humanos.

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