UNIVERSIDAD DE TALCA

FACULTAD DE CS. DE LA SALUD

DPTO. BIOQUÍMICA CLÍNICA E INMUNOHEMATOLOGÍA

BIOQUIMICA CLINICA I

CÁTEDRA- TALLER
CONTROL DE ERRORES
EN ESPECTROFOTOMETRÍA

PROF. T.M. MSc. ELBA LEIVA MADARIAGA

Relación entre el porcentaje
de transmitancia (%T) y la
%T concentración

Concentración
 LEYES DE LA
ESPECTROFOTOMERIA
Io ε
c It Lambert-Bourguer-Bunsen-Roscoe-Beer

( Lambert-Beer)
b

Io = Intensidad de la luz incidente

It = Intensidad de la luz transmitida
b = espesor del medio
ε = coef. de absorción molar (cte. para cada solución a una solución de 1
molar)
c= concentración de la solución
It = Io*10-εbc
Transmitancia = It/Io
Absorbancia = -logT

Entonces:
Abs = -log (10-εbc)

Abs = ε*b*c
Errores en Espectrofotometría

Escala de absorbancia y porcentaje de

transmitancia
Ab
2.0 1.0 .80.70 .60 .50 .40 . 30 .20 .10 0
%
T 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
100
 ERROR EN LA ABSORBANCIA EN FUNCIÓN DEL
PORCENTAJE DE TRANSMITANCIA.

Variación en Porcentaje de error

%T Absorbancia absorbancia en la medida de
absorbancia

4 1 1.398 0.22 15.8

10 1 1.000 0.041 8.60
25 1 0.602 0.035 5.79
35 1 0.456 0.025 5.44
50 1 0.301 0.017 5.78
70 1 0.155 0.012 8.03
90 1 0.046 0.0097 21.2
Rayo de luz monocromática
que muestra el ancho de
banda espectral
A
Intensidad

B C

D E
Longitud de onda
INTERFERENCIAS ESPECTRALES

60
Absorbanci

40

20
Oxihemoglobina
a

0
400
500 600 700
Longitud de onda (nm)
Espectro parcial de la oxihemoglobina
(HbO2)
 Curva estándar para medir proteínas totales
por reacción de Biuret: A540 v/s concentración.
Líneas continua, A540 para un estandar de proteínas de
50 g/L; línea punteada, A540 para el mismo estándar que
además contiene hemoglobina.

1.2
Absorbancia (540

1.0

0.8
Hemoglobina
0.6 estándar 50 g/L
0.4
nm)

0.2

0 25 50 75 100
Proteínas totales (g/L)
 CORRECIÓN DE LA
INTERFERNCIA ESPECTRAL
 Blancos de
muestras
 Mediciones

cinética
 PROPIEDADES FOTOMÉTRICAS

 EXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDA

 EXACTITUD FOTOMÉTRICA

 LINEALIDAD FOTOMÉTRICA

 PRECISIÓN FOTOMÉTRICA

 PRESENCIA DE LUZ PARÁSITA

 ESTABILIDAD FOTOMÉTRICA: DERIVA Y

RUIDO
 CONTROL DE EXACTITUD DE LA LONGITUD
DE ONDA
• Es necesario calibrar la longitud de onda como mínimo
una vez al mes:

METODOS PRIMARIOS

a.- Uso de filtro de Didimio: se puede usar en espectrofotometros

que tengan un ancho de banda espectral de 20 nm, este tiene la
máxima absorbancia a 585 nm.

b.- Uso de filtro de Oxido de Olmio: se puede usar en espectrofotometros

que tengan un ancho de banda espectral de 2-8 nm, y se obtiene la máxima
absorbancia a 360 nm.

METODOS SECUNDARIOS

Utilización de Punto Isosbéstico

 EXACTITUD FOTOMETRICA

Solución de 50 mg/l Dicromato de Potasio en Ácido

sulfúrico 0.01 N Absorbancia a 350 nm debe ser 0.535
Tolerancia de la medición 2 %

Dicromato de Potasio:
Calidad máxima normalizado del National Bureau of
Standar, secado overnight a 110ªC y enfriado a
temperatura ambiente en un desecador. Otras soluciones
usadas son :
SOLUCIÓN DE SULFATO DE COBRE:
SOLUCIÓN DE SULFATO DE AMONIO Y COBALTO
SOLUCIÓN DE CROMATO DE POTASIO
 EXACTITUD FOTOMÉTRICA

1.- DISOLUCIÓN DE SULFATO DE COBRE: 20,0 g

CuSO4 x 5 H2O + 10 ml de H2SO4 concentrado aforado a
1000 ml, dan una disolución con las siguientes longitudes
de onda.
400 nm 0,002
600 nm 0,068
650 nm 0,224
700 nm 0,527

2. DISOLUCIÓN DE SULFATO DE AMONIO Y COBALTO:

14,481 g de CoSO4 NH4 SO4 x 6 H2O + 10 ml de H2SO4
concentrado aforados a 1000 ml con agua de pureza
analítica, dan una disolución con las siguientes
absorbancias en las longitudes de ondas específicas.
400 nm 0,012
450 nm 0,077
500 nm 0,163
550 nm 0,077
 EXACTITUD FOTOMÉTRICA
(UV)

3.- DISOLUCIÓN DE CROMATO DE POTASIO: 40 mg

de KCrO4 en 1000 ml de KOH 0,05 N (3,3 g/L), dan
una disolución con las siguientes absorbancias en
las longitudes de onda específicas.

340 nm 0,316
375 nm 0,991
400 nm 0,396
450 nm 0,033
 LINEALIDAD FOTOMÉTRICA
SOLUCIONES DE DISTINTA
CONCENTRACIÓN CUYAS ABSORBANCIAS
ABARQUEN EL RANGO DE TRABAJO A CADA
LONGITUD DE ONDA

 UV . DICROMATO DE POTASIO EN MEDIO

ÁCIDO
 405 nm: p-NITROFENOL EN MEDIO
ALCALINO
 510 nm: NITRATO DE COBALTO EN MEDIO
ÁCIDO
 PRESENCIA DE LUZ PARÁSITA

 340nm: SOLUCIÓN DE NITRITO DE

SODIO

LECTURA DE ABSORBANCIA O % DE T

 LÍMITE DE ACEPTABILIDAD :% DE T < 1

%
 PRECISIÓN FOTOMÉTRICA
ESTUDIO A 650 nm CON SULFATO DE COBRE EN
MEDIO ÁCIDO.

1O MEDIDAS DE LA ABS. DE ALÍCUOTAS DE LA

MISMA SOLUCIÓN.
CÁLCULO DE LA PRECISIÓN DE LAS LECTURAS DE

ABSORBANCIA
LÍMITE DE ACEPTABILIDAD: CV< 1 %
SERIE DISTRIBUCIÓN NORMAL

88,2
95,5
99,7

3DE 2DE 1DE X 1DE 2DE 3DE

Curva de Gauss
 ANÁLISIS DE LOS
n
DATOS
x= x i
n

DE = (xi -x)2 Desviación

estándar
n -1

S2 = ( xi - x)2 Varianza
n-1

CV = DE - 100 Coeficiente de
Variación
x
 Distribuciones de
Frecuencia

Frecuencia

Valores
Distribución de frecuencia de los resultados de una muestra
por dos métodos diferentes, 1 y 2. Ambos métodos son de
igual precisión ( ) pero con promedios diferente una de
otra (x1 = x2).
1 2
Frecuencia

x1 = x2

x1 x2
 ESTABILIDAD FOTOMÉTRICA

 340nm: SOLUCIÓN DE DICROMATO DE

POTASIO EN MEDIO ÁCIDO

- ESTUDIO DE LA DERIVA Y RUIDO FOTOMÉTRICOS

- CÁLCULO DE LA PENDIENTE Y DE LA DISPERSIÓN
DE LA RECTA ABS/TIEMPO

 LIMITE DE ACEPTABILIDAD: ( DERIVA +RUIDO < 1 % )

 Deriva y Ruido

Absorbancia
Absorbancia

Tiempo
Tiempo bajo deriva y alto ruido
bajo ruido y baja deriva

Absorbancia
Absorbancia

Tiempo
Tiempo alta deriva y alto ruido
alta deriva y bajo ruido
 Error constante y proporcional
(Westgard J, de Vos D, Hunt M, et al: Am J Med Technol 1978;44:290)

30
Error constante
Sin error
20 Error proporcional

10

10 20 30
Medido por métodos comparativos
A continuación se presenta una serie de datos al medir diferentes
concentraciones de una sustancia determinada por un método de referencia
( IDEAL, teóricamente sin errores) en el eje X y por otra metodología en el
eje Y.
De acuerdo a los siguientes datos y observando el gráfico Ud. debe encontrar
para cada uno de ellos la ecuación de la recta que los identifica, e interpretar su
resultado.

Tecnica de referencia Error ………………… Error……………………..

X / Y X / Y X /Y
0 / 0 0 / 3 0 /0
10 / 8 10 / 11 20 / 12