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Unité de Formation et de Recherche
En Sciences de La Santé
U.F.R. – S.D.S.
Cellule
Noyau cellulaire
Chromosome
…AATCTTGCCGGGTTCCCG…
…AATCGCCGTCCGATTCCGTCACGC…
…TTAGAACGGCCCAAGGGC…
….TTAGCGGCAGGCTAAGGCAGTGCG…
NOTES DU COURS:
1
Le Serment éthique pour les chercheurs en sciences de la
vie, adapté et inspiré du Serment d'Hippocrate médical,
(Science Vol. 286, 19 Nov. 1999, p.1475).
« Je jure d'être fidèle à l'éthique du respect des personnes et des vies humai-
nes et de contribuer au développement de la connaissance et à la plus large
diffusion du savoir.
J'interviendrai pour défendre, s'il m'en est donné l'occasion, l'ensemble de ces
règles.
Que les hommes et mes confrères m'accordent leur estime si je suis fidèle à
mes promesses.
2
Pages
SERMENT POUR LES CHERCHEURS EN SCIENCES DE LA VIE 02
INTRODUCTION 05
PREMIERE PARTIE:
LES OUTILS DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE 07
CHAPITRE I : 08
TECHNIQUES D’EXTRACTION, DE CONTRÔLE DE PURETE
ET DE QUANTIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES,
I. Enzymes de restriction 24
II. L’électrophorèse sur gel 30
III. Les enzymes utiles en génie génétique: 31
I - Les mutagenèses 51
II. Mise en évidence des effets de la modification 56
III. Transfert de l’ADN modifié 57
3
DEUXIEME PARTIE : APPLICTION DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE :
LE GENIE GENETIQUE 59
CHAPITRE VII:
LES TECHNIQUES DU GENIE GENETIQUE APPLIQUEES AUX VEGETAUX 71
I. – Le plasmide Ti 71
II – Le Terminator 73
III – Application des techniques du génie génétique à l’agriculture 77
CHAPITRE VIII :
LES TECHNIQUES DU GENIE GENETIQUE APPLIQUEES AUX ANIMAUX 82
I – Les insectes transgéniques 82
II – Les animaux transgéniques 83
CHAPITRE X :
LES TECHNIQUES DU GENIE GENETIQUE APPLIQUEES
DANS LA RECHERCHE SUR LE VIH/SIDA 98
I – Structure du VIH 98
II - Les nouvelles molécules antivirales en développement: 99
III. Vers l’espoir d’obtenir un jour un vaccin anti-VIH. 100
IV. Le génie génétique et la lutte contre le VIH. 101
4
BIBLIOGRAPHIE 120
INTRODUCTION
Le transfert transitoire ou stable d’un DNA étranger dans une cellule proca-
ryote ou eucaryote s’opère grâce à des vecteurs naturels et à de nouveaux vecteurs
issus des constructions: plasmides, bactériophages, virus, cosmides etc. Ces tech-
niques doivent permettre une meilleure compréhension génétique et fonctionnelle
des organismes vivants.
• d’identifier et d’isoler,
• de modifier et de transférer,
• de cloner et d’amplifier,
• de contrôler l’expression d’un gène ou d’un transgène dans
le matériel biologique.
Il s’agit donc d’un outil, aux applications très variées qui permet d’intervenir
avec une grande précision sur le patrimoine génétique de tous les organisme vi-
vants.
Cette technique permet d’identifier un gène spécifique parmi les 30.000 gè-
nes environ que compte l’être humain, de l’amplifier afin qu’il soit plus facile d’accès,
de le découper et de l’isoler ensuite des autres molécules d’ADN. Le gène isolé
peut, à la fin, être réinséré dans une molécule d’ADN d’origine différente, ce qui
permet de transférer de l’information génétique d’une cellule vers une autre dans
laquelle il pourra diriger la production d’une protéine particulière, dont il code et dé-
termine la structure (Projet Séquençage génome humain février 2001).
5
l’industrie agroalimentaire, dans l’amélioration génétique des espèces animales et
végétales.
• En médecine: le but du génie génétique est la prédiction, le diagnostic des
maladies héréditaires et leur soin à travers la thérapie génique et la pharmacogéné-
tique. La thérapie génique somatique qui est différente de la thérapie génique ger-
minale, consiste à transférer certains gènes dans les cellules du patient pour
prévenir l’apparition d’une maladie ou en ralentir l’évolution. Ce type de
génothérapie suscite de très grands espoirs.
6
PREMIÈRE PARTIE :
LES OUTILS
DE LA BIOLOGIE
MOLECULAIRE
7
CHAPITRE I :
TECHNIQUES D’EXTRACTION, DE CONTRÔLE DE PURETE
ET DE QUANTIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES,
Toutes les méthodes biochimiques qui permettent d’extraire l’ADN dans les
différents tissus peuvent être utilisées en fonction des espèces, et en tenant compte
de la structure anatomique des cellules. Nous prendrons comme exemple, les cellu-
les eucaryotes humaines, en l’occurrence les cellules sanguines qui sont très ac-
cessibles compte tenu de la moralité et du bénéfice du doute.
Pour ce qui concerne le génome humain comme pour tous les mammifères,
les leucocytes sanguins constituent une source simple de DNA pour les études de
biologie moléculaire.
Ils sont ensuite traités par un mélange de détergent, comme le SDS (Sodium
DodécylSulfate) qui permet de désagréger les membranes cellulaires et de libérer
les contenus cytoplasmiques et nucléaires. En biochimie classique et pour d’autres
applications, il faut d’abord séparer les noyaux du contenu cytoplasmique et de ces
organites cellulaires. Un traitement par la protéinase K (une protéase) permet de
libérer le DNA nucléaire en digérant les histones qui lui sont associées dans les
chromosomes eucaryotes.
L'élimination des protéines non digérées et des lipides se réalise par des pré-
cipitions et des extractions sélectives. Le mélange phénol-chloroforme permet de
dénaturer les protéines car non miscible à l’eau et de densité supérieure à cette der-
nière. Les acides nucléiques n'y sont pas non plus solubles et restent dans le sur-
nageant aqueux.
8
Pour les tissus, il est conseiller de les désagréger par les techniques couran-
tes de biochimie comme le broyage ou les ultrasons. Une congélation préalable
permet de transformer les tissus en une masse solide qui se prête alors à un
concassage par les techniques courantes de broyage. L’extraction et la purification
suivent alors le même protocole.
L’ADN récupéré sous forme de fibres peut être conservé sous la forme solide
pendant des temps très longs. Il peut aussi être re-dissout dans un tampon stérile de
force ionique moyenne contenant de l'EDTA et dont le pH est compris entre 7 et 8
9
4. Extraction des ARN
Les ARN sont plus difficiles à étudier parce qu’ils sont très sensibles aux ri-
bonucléases (RNase A) qui sont très actives et présentes même sur les doigts du
manipulateur. Elles peuvent résister à un traitement à 90°C pendant une heure. Il
faut donc des conditions de stérilité parfaite pour travailler avec ces acides
nucléiques.
Pour l’extraction, les tissus ou les cellules sont homogénéisés dans un tam-
pon acétate contenant :
- Un détergent puissant (SDS ou sarcosyl)
- Un agent dissociant (thiocyanate ou guanidine)
- Un agent réducteur (DTT ou 2-mercaptoéthanol)
Le maximum d'absorption des acides nucléiques se situe à 260 nm. Les pro-
téines, principaux contaminant des préparations absorbent aussi à 260 nm, mais
avec maximum d'absorption qui se situe vers 280 nm à cause des acides aminés
aromatiques. Le rapport R= A260nm / A280nm constitue alors un bon moyen pour appré-
cier une éventuelle contamination de la préparation d'ADN par les protéines ou par
les RNA.
Une contamination par les ARN se traduit par une augmentation du rapport R.
Les ARN étant en simple brin, le coefficient moyen d’absorption d’un nucléotide est
supérieur à celui du même nucléotide dans la double hélice à cause de
l’hypochromisme.
*R = A260nm/A280nm
* ADN pur: 1,8 < R < 2
* ADN contaminé par les protéines: R < 1,7
* ADN contaminé par les ARN: R>2
10
-Un épaulement à 230 nm indique une contamination par les glucides.
-En absence d'impuretés l'absorbance de la solution d’ADN à 320 nm doit
être autour de zéro.
Figure I.4 : Spectre d’absorption de l’ADN
III: QUANTIFICATION DE L'ADN
11
CHAPITRE II : LES VECTEURS : PLASMIDES, PHAGES, COSMIDES,
YAC, BAC, VIRUS
1. Les plasmides.
a : Définition :
La cellule hôte la plus utilisée est Escherichia coli. Les plasmides naturels dits
de première génération ont été utilisés dans le passé comme vecteur de clonage,
mais les plasmides utilisés actuellement sont modifiés et sont donc des chimères
obtenues par des recombinaisons de différents plasmides naturels et de DNA viral.
Ils sont petits de taille pour permettre l'insertion d'une importante quantité d'ADN
exogène tout en maintenant une bonne efficacité de transformation. Ils possèdent :
12
c : Deux vecteurs plasmidiques : pBR 322 et pUC18
Cette préparation est alors utilisée pour transformer les bactéries et sélec-
tionner les colonies résistantes à l'ampicilline. Ces dernières doivent avoir été
transformés avec succès par une molécule de plasmide recombinante.
Parmi les colonies AmpR, seules celles qui s'avèrent sensibles à la tétracy-
cline contiennent une insertion, en d'autres termes, seules les colonies ampR tetS
contiennent de l'ADN recombinant (ADN du plasmide et ADN inséré). L’insertion de
l’ADN étranger dans pBR322 est détectée par l’inactivation du gène de résistance
(tetR), indiqué par le phénotype tetS (sensible).
L'insertion d’un vecteur dans pUC est détecté par l'inactivation de la fonction
galactosidase du gène Z', qui se traduit par l'incapacité de la cellule hôte à convertir
le substrat artificiel X-Galactoside en un colorant bleu (X= paranitrophénol).
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Vecteurs Taille en Nombres de Marqueur phénoty- Quelques sites
bp copies par cel- pique uniques
lule de restriction
pBR322 4363 15 à 20 Tétracycline EcoR I, Hind III, Pvu
Ampicilline II,
Nde I, Afl III
pPUC18 686 ≈ 500 Ampicilline Lac Z' 13 sites de restric-
tion
sur un polylinker
Les plasmides de 3ème génération : Ces plasmides ont été construits pour facili-
ter le travail de sous clonage et pour une sélection des clones recombinants.
14
La famille pSP . Ils sont plus petits que pBR322 (entre 2900 et 3000 bp).
Ces plasmides possèdent : un polylinker, le gène de résistance AmpR et le promo-
teur de la RNA polymérase du phage SP6 qui provient de Salmonella. typhimurium
immédiatement adjacent au polylinker. Ces types de plasmides offrent un avantage,
car ils permettent de transcrire en ARN la séquence d’ADN qui a été insérée dans le
polylinker.
15
La précipitation différentielle de l'ADN plasmidique par le polyéthylène gly-
col (PEG ) permet aussi d'éliminer les petits fragments d'ADN et d'ARN non précipi-
tés et d’obtenir des plasmides de pureté appréciable.
La chromatographie d'échange d'ions, dans les conditions appropriées de
force ionique et de pH, permet également à l'ADN plasmidique d’être absorbé sélec-
tivement.
II- L'ADN PHAGIQUE
Les bactériophages ou phages sont des particules virales qui infectent les
bactéries. Leur multiplication est rapide et le nombre de copies par cellule bacté-
rienne est très important. Figure II. 5.
Lorsque l’ADN du phage pénètre dans une bactérie, deux types de réponses
peuvent se produire :
Deux types de phages qui infectent Escherichia coli sont d'usage fréquent en
génie génétique: le phage λ et le phage M13.
1- Le phage Lambda λ
16
Les "deux bras" restants sont ensuite ligaturés avec l'ADN du donneur di-
géré par les mêmes enzymes de restriction.
Les molécules d’ADN ainsi obtenues peuvent être introduites dans E. coli
par la transformation ou être encapsidées in vitro dans les têtes d’un bactériophage.
Figure II. 8
Le génome du phage λ :
Le phage λgt 11 est utilisé dans la stratégie de l’insertion pour cloner les
cDNA dont la longueur varie de 6 à 8 kb. Il sert de vecteur d’expression car la sé-
quence insérée pourra être exprimée dans la bactérie sous forme de protéine, per-
mettant la recherche du recombinant désiré à l’aide d’un anticorps dirigé contre la
protéine synthétisée.
Le phage λ ZAP II est une forme améliorée du précédent qui permet de vi-
sualiser l’expression du DNA inséré. La sélection des recombinants se fait en analy-
sant la coloration bleue ou blanche, lorsque la culture est réalisée sur un milieu
contenant le substrat X-gal et l’IPTG.
17
Ces deux phages sont très proches du phage λ classique. Ils en diffèrent par
la présence d’un polylinker aux deux extrémités de la zone de DNA qui sera délété
pour être remplacé par le DNA à cloner. Les deux phages ne diffèrent que par
l’orientation du polylinker. On peut y introduire des fragments de 15 à 20 kb. Ils
constituent des phages de choix pour la constitution des banques génomiques.
L'ADN phagique (+) peut être extrait à partir des virions de manière analogue à
l'ADN du phage λ.. La forme réplicative (RF) bicaténaire peut aussi être extraite de
la cellule de la même manière que l’ADN d’un plasmide.
18
- L’addition d’un polylinker pour faciliter l’insertion des séquences de DNA
- L’addition d’un gène lacZ pour permettre la sélection des recombinants (sys-
tème des bactéries bleues et blanches en présence d’IPTG et de X-gal).
6. : Infection
1. Les cosmides
Les cosmides sont des vecteurs hybrides constitués d’un plasmide classique auquel
ont été ajoutées les séquences COS du phage λ. Leur ADN peut se répliquer au
niveau de la cellule hôte comme celui d'un plasmide ou être encapsidé comme celui
d'un phage pour faire une infection. Les cosmides peuvent contenir des insertions
d’ADN environ trois fois plus longs que ceux portés par les phages λ (45 kb). Ceci
est dû à ce que la majeure partie de la structure du phage a été déletée tandis que
les séquences signaux responsables de l'encapsidation subsistent (les sites COS).
Figure II.10
2. Les YAC
Le YAC ou chromosome artificiel de levure (Yeast Artificial Chromosome).
Les YAC permettent de cloner de 150 à 1 000 kb de fragments d’ADN. Le génome
de la levure Saccharomyces cerevisiae est constitué de 16 chromosomes de taille
comprise entre 250 et 2 000 kb. Chez la levure, trois régions chromosomiques sont
importantes pour sa réplication. Les séquences télomériques (Tel), centromériques
(CEN), et une séquence ARS (Autonomous Replicating Sequence).
19
On a donc construit des chromosomes artificiels contenant ces régions es-
sentielles et du DNA que l’on désire cloner. La taille du DNA cloné peut donc attein-
dre de 1 000 à 2 000 kb. Les YAC n'exigent que les cellules de levures comme hô-
tes. On peut cependant introduire dans l’ADN cloné des séquence bactérienne pour
la sélection.
Figure II.11
3 . les PAC
PAC : Chromosomes artificiels dérivés du phage P1
(PAC, P1-derived artificial chromosomes)
Mise au point dans les années 1990 un vecteur dérivé du bactériophage P1. Le vec-
teur pCYPAC1 permet de cloner des fragments qui ont une taille de 130 à 150 kb
avec une efficacité qui est intermédiaire entre celle des cosmides et celle des YACs
(1,5x10+5 colonies/µg insert). Figure II.12
4. Les BAC
Figure II.13
Les BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ont pour base le facteur sexuel F de 7 kb
de Escherichia coli. Ce facteur peut contenir de grands fragments d'ADN d'E. coli
sous la forme de dérivés F'. De manière similaire, les BAC peuvent incorporer des
inserts d'ADN étranger pouvant atteindre 300 kb. Le plasmide F porte des gènes qui
sont essentiels pour réguler sa propre réplication et pour contrôler aussi le nombre
de copies du plasmide F. Le plasmide F a aussi la capacité de s'intégrer dans le
chromosome bactérien et de s'en exciser. Un plasmide qui a cette capacité est ap-
pelé un épisome.
Les gènes oriS et repE régissent la réplication unidirectionnelle du plasmide tandis
que les gènes parA et parB maintiennent le nombre de copies de celui-ci à 1 à 2
copies par cellule.
Le vecteur pBeloBAC11 porte ces gènes essentiels ainsi qu'un gène de résistance
au chloramphénicol et la portion lacZa du gène b-galactosidase avec 2 sites de
restriction HindIII et BamHI qui permettent le clonage de fragments d'ADN étranger
Le facteur de fertilité F est utilisé lors de la conjugaison bactérienne.
- Les bactéries qui le possèdent dans leur cytoplasme sont dites F(+)
- celles qui ne l'ont pas dans leur cytoplasme sont dites F(-)
- Celles qui l'ont intégré dans leur chromosome sont dites Hfr
- Celles qui l'ont perdue, après l'avoir intégré dans leur chromosome sont F'.
Conclusion
Les plasmides sont très utilisés pour le génie génétique. Ils acceptent des fragments
de taille moyenne (jusqu'à 10 kb), par exemple des sous-fragments de l'insert d'un
phage ou d'un cosmide recombinant. La taille des fragments d'ADN étranger qui
peuvent être acceptés par le bactériophage lambda (10 à 20 kb), les cosmides (35 à
45 kb), les PAC (130 à 150 kb), les BAC (160 à 200 kb) et les YAC (250 à 1.500 kb)
en font les vecteurs de choix pour construire et amplifier des banques d'ADN géno-
mique. Les BAC et les PAC sont devenus les vecteurs principaux pour le séquen-
çage du génome humain. Les ADNc (voir plus loin) sont clonés dans des plasmides
ou des phages d'insertion.
20
Chapitre III: ENZYME DE RESTRICTION, ÉLECTROPHORÈSE,
CARTE DE RESTRICTION
I. ENZYMES DE RESTRICTION
1. Définition et origine
Les enzymes de restriction sont des endonucléases qui coupent d’une ma-
nière définie et reproductible l’ADN double-brin quelle que soit son origine. Elles ont
permis de caractériser un génome entier en une série de fragments reproductibles.
Les gènes ou fragments de gènes deviennent ainsi des entités physiques isolables
et non plus de l’information noyée dans la masse du contenu génomique. Ces en-
zymes ont été mis en évidence par le phénomène de la lysogénie.
CH3
↓ ↓ |
5’G AATT C3’ 5’G *AATT C3’
3’C TTAA G5’ 3’C TTAA* G5’
↑ | ↑
CH3
21
Il existe 3 types d'enzymes de restriction qui diffèrent les unes des autres, par
la localisation de leur activité catalytique.
Enzyme de type I: Ayant reconnu la séquence cible, l'enzyme se déplace
sur l'DNA et coupe de manière aléatoire mille à quatre mille bases plus loin (Sys-
tème de boucles d’ADN ?).
Enzyme de type II: L'enzyme coupe l'ADN au niveau de la séquence re-
connue.
Enzyme de type III : L'enzyme reconnaît la séquence cible et coupe la mo-
lécule de DNA 20 à 25 bases plus loin.
En 1973, Smith et Nathan ont proposé une nomenclature qui est définitive-
ment adoptée. Chaque endonucléase a un nom de code déterminé selon les princi-
pes suivants :
Exemple : EcoR 1:
E = Escherichia
Co = espèce Coli
R = Souche RY13
I = 1ère endonucléase isolée
a: Caractéristique de l'hydrolyse.
22
b: Sites de restriction
Les coupures à bouts francs (blunt ends ou flush ends). L’enzyme coupe
exactement au même niveau sur les deux brins de la séquence reconnue soit au
niveau de l’axe ou du centre de symétrie.
↓Hae III
5' GGCC 3' → 5'GG + CC 3'
3' CCGG 5' → 3'CC + GG 5'
↑
Ces types de coupes sont utilisées lorsqu’on désire faire un tailing (allonge-
ment de l’extrémité 3’OH) ou un marquage pour un séquençage.
5’ G/AATTC → 5’ G 3’ + 5’AATTC 3’
3’ CTTAA/G 5’ → 3’ CTTAA 5’ + 3’G 5’
Coupure décalée du coté 3’: Ce type de coupure génère des extrémités 3’OH
débordantes ou sortantes. Exemple : les coupures par Pst I :
23
5’ CTGCA/G 3’ → 5’ CTGCA 3’ + 5’ G 3’
3’ G/ACGTC 5’ → 3’ G + 3’ ACGTC 5’
Les coupures franches ; L’enzyme coupe les deux brins de l’ADN au niveau
du centre ou de l’axe de symétrie. On obtient des extrémités franches (blund ends)
qui n’ont pas un grand intérêt en génie génétique sauf pour réaliser des « taillings à
l’extrémité 3’OH). Exemple : Hae III :
5’ GG/CC 3’ → 5’ GG + 5’CC 3’
3’ CC/GG 5’ → 3’ CC + 3’GG 5’
EcoRI 5’...G/AATTC...3’
3’...CTTAA/G...5’
Providencia stuarti PstI 5’...CTGCA/G...3’
3’...GA/CGTC...5’
Microcoleus MstII 5’...CC/TNAGG...3’
3’...GGANT/CC...5’
Nocardia otitidis-caviarum NotI 5’...GC/GGCCGC...3’
3’...CGCCG/GCG...5’
Deux enzymes compatibles ont des sites de restriction différents mais don-
nent naissance aux mêmes extrémités cohésives. C'est le cas de BamH I et Sau3AI
qui donnent les même extrémités cohésives car le site de reconnaissance de
Sau3A1 est contenu dans celui de BamH 1.
24
NNNCCTAG/G NNNCTAG/NNN
Ainsi, BamH I donne les mêmes extrémités cohésives que Sau3A I avec qui
elle est compatible.
L'hydrolyse d'un ADN par une endonucléase de restriction conduit à une série
de fragments dits de restriction dont le nombre est fonction du nombre de sites de
restriction présent sur cet ADN. La longueur des fragments est déterminée par la
distance séparant les séquences de restrictions reconnues par cette endonucléase.
On obtient pour un ADN donné, toujours le même nombre de fragments qui donne
ce que l’on appelle RFLP (pour longueur des fragments de restriction polymorphi-
ques ou Restriction Fragments Lengh Polymorphism en Anglais). Une molécule
d'ADN déterminée, donne toujours les mêmes fragments et cette série de fragment
constitue une empreinte caractéristique de l'ADN hydrolysé. On parle alors de carte
d'identité moléculaire.
E Gγ Αγ ψβ δ β
H inc II XmnI Hind III TaqI HindIII PvuII Hinc II Hinf I Rsa I AvaII HinfI HpaI BamH I
Haplotype HbS
Bénin - - - - - + - + - - + + - +
Bantou - - + + - + - - - + + + + +
Sénégal - + + + - + + + + - + + + +
Arabo Ind. + + + + - + + + - + + - + -
Cameroun - - + + + + - + + - + - + -
25
Une carte de restriction est une séquence de sites de restriction séparés par
des distances précises sur l'ADN et mesurée en paire de bases (bp). Diverses tech-
niques permettent d'obtenir de telles cartes. Elles passent toutes par une digestion
de l'ADN à analyser par une enzyme de restriction suivie d’une électrophorèse pour
la séparation des fragments et la détermination de leurs tailles.
L'analyse par double digestion est obtenue quand l'ADN est digérée sépa-
rément par 2 enzymes différentes A et B. On obtient un certain nombre de fragments
pour chaque enzyme. Ces fragments sont ensuite analysés par électrophorèse sur
gel d’agarose. Chaque fragment produit par l’enzyme A est d’abord élué du gel et
digéré ensuite par l’enzyme B et inversement. La confrontation des différents résul-
tats permet de situer les sites de coupure les uns par rapports aux autres sur la sé-
quence nucléotidique.
Figure III.3 Exercice et corrigé: Détermination des sites de coupure de deux enzy-
mes de restriction A et B sur un fragment d’ADN .
- L’enzyme A coupe et donne deux fragments : 2 Kb et 8 Kb
- L’enzyme B coupe et donne deux fragments : 3 Kb et 7 Kb
- Les enzymes A et B coupent et donnent trois fragments 2 Kb, 3Kb et 5 Kb
Déterminez les sites de coupures :
10 Kb d ADN
2 Kb A 8 Kb
7 Kb 3 Kb
B
2 Kb 5 Kb 3 Kb
A B
26
II. L’ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL
Figure III.4.
1 - Suivi de la migration .
Les échantillons d'ADN, avant d'être déposés dans les puits, sont mélangés
avec une solution de charge qui contient :
un alourdisseur (glycérol ou saccharose ) pour entraïner l'ADN au fond du
puits
des marqueurs de mobilité (colorants visibles : bleu de bromophénol et xy-
lène cyanol)
Des marqueurs de taille pour l’identification (dans le puits de référence)
un agent dénaturant comme le SDS ou l’urée pour arrêter les réactions en-
zymatiques suivant la nature du gel.
On étalonne les gels avec des marqueurs de taille. Un marqueur de taille est
un mélange de fragments d'ADN linéaire bicaténaires dont les tailles sont connues.
il existe deux type de marqueurs de tailles :
27
l'échelle d'ADN de 1 Kb de GIBCO BRL. Les différents fragments sont formés
de 1 à 12 répétitions d'un même segment de 1018 bp.
3. Révélation :
Les bandes d'ADN sur un gel de polyacrylamide ou d'agarose ne sont pas vi-
sibles si l'ADN n'est pas marqué ou coloré.
1. La DNA polymérase I.
Cette enzyme extraite d’Escherichia Coli intervient dans les activités de répa-
ration du chromosome bactérien par le phénomène de nick translation. Elle est uti-
lisée sous sa forme de «fragment de Klenow» qui est dépourvu de l’activité exonu-
cléasique (5’→3’) par suite d’un traitement protéasique pour:
Déterminer les séquences nucléotidiques d’un ADN par la méthode de
Sanger.
Pour convertir les bouts cohésifs en bouts francs
Pour le marquage des DNA
Pour la construction de sondes ou de vecteurs à partir d’un ADN simple ou
double brin.
2. La T4 DNA polymérase.
L’enzyme est produite par les bactéries E. Coli infestées par le bactériophage
T4. Elle possède les mêmes propriétés que le fragment de Klenow et possède les
mêmes utilisation en biologie moléculaire.
3. La Taq polymérase
28
ves (proof reading = activité exonucléasique 3’→5’) et de ce fait introduisent
beaucoup d’erreurs au cours de la réplication.
4. La transcriptase inverse.
La transcriptase inverse est un enzyme produite par les rétros virus qui per-
met de recopier un ARN en un DNA. Elle possède aussi une activité RNAase H qui
permet de dégrader le RNA dans un hybride ADN-ARN. Elle est utilisée chaque fois
qu’il est nécessaire de transformer un ARN en un ADN.
Pour la construction des banques de cDNA
Pour détermination des séquences nucléotidiques par la méthode
de Sanger
Pour la PCR sur les RNA messagers (R-PCR).
5. La terminal transférase
6. La polynucléotide phosphorylase
n XDP → (XMP)n + n Pi
7. La poly A polymérase
29
Enzyme eucaryote, elle catalyse l’addition d’une queue polyrA à l’extrémité
3’OH des ARN messagers eucaryotes. Son substrat est spécifiquement l’ATP. Elle
possède donc les mêmes utilisations que la polynucléotide phosphorylase et la ter-
minal transférase.
Les ARN polymérases de tous les organismes transcrivent l’un des deux brins
de la double hélice de l’ADN en un ARN simple brin. La synthèse s’effectue sans
amorce à partir du promoteur (site de fixation et d’initiation de l’enzyme) et nécessite
toujours les ribonucléotides triphosphates et du Mg2+ comme cofacteur, dans le sens
5’→3’.
Ce sont les polymérases des procaryotes qui sont le plus souvent utilisées en
biologie moléculaire car elle possèdent des promoteurs très spécifiques qui permet-
tent de conditionner et de révéler l’expression des gènes recombinés dans une cel-
lule transfectée.
Les plus utilisées sont: la polymérase de SP6 extraite de Salmonella typhimu-
rium LT2, la T7 RNA polymérase extraite d’E. coli infesté par le phage T7 et la T3
RNA polymérase extraite aussi de E. coli infesté par le phage T3. Ces polymérases
permettent:
la synthèse de sondes hautement marqués soit par un nucléotide radioactif
soit par un nucléotide biotinylé (marquage froid);
la détermination de la séquence d’un ADN cloné dans un vecteur possé-
dant, devant le DNA cloné, l’un quelconque des promoteurs SP6, T7 ou T3;
les études sur les différents RNA résultant de la transcription d’un DNA
cloné.
Ces polymérases permettent aussi de produire, à partir d’un gène cloné, les
quantités de RNA suffisantes pour les études de structure, de régulations et des in-
teractions RNA-DNA, RNA-protéines.
9. Les Ligases
La DNA ligase d’E. Coli. Les ligases assurent la formation d’une liaison
phosphodiester entre une extrémité 3’OH et une extrémité 5’phosphate de deux nu-
cléotides déjà incorporés dans un acide nucléique. L’enzyme d’E. coli n’agit que si
les deux DNA sont associés par des extrémités cohésives ou dans le cas d’une cas-
sure sur un seul brin. Cette enzyme utilise le NAD+ comme cofacteur. Elle est donc
utilisée pour la soudure des extrémités cohésives lors de la construction des vec-
teurs.
La T4 ligase. Extraite d’E. coli infestée par le phage T4, elle joue le même
rôle que la ligase de E. coli. Cependant, elle présente un avantage sur cette der-
nière car elle utilise l’ATP au lieu du NAD+ comme source d’énergie, ce qui lui per-
met de relier les extrémités cohésives, mais aussi les extrémités à bouts francs en
présence d’éthylène glycol.
La RNA ligase. Extraite d’E. Coli infesté par le phage T4, elle réalise la liga-
tion entre deux RNA en créant entre eux une liaison phosphodiester entre l’extrémité
3’OH libre et l’extrémité 5’phosphate libre de l’autre molécule. Elle utilise aussi l’ATP
30
qui est hydrolysé et AMP et en pyrophosphate. Elle permet donc soit un marquage
des ARN, soit la construction de liaisons inter ou intra - RNA (RNA mixtes).
La RNase H : Elle détruit le RNA dans les hybrides DNA-RNA. Elle permet
donc la détection des hybrides DNA-RNA et la destruction de l’ARN dans un hybride
après une transcription inverse pour la synthèse du second brin de cDNA.
31
CHAPITRE IV: CLONAGE ET ÉTUDE DE L’ADN CLONÉ.
I - LE CLONAGE
Le principe du clonage n'est pas très compliqué en soit. Dans le cas de Dolly
(la première brebis clonée), on a prélevé une cellule dans le pis d'une brebis de race
Finn Set à face blanche. On a prélevé également un ovule sur une autre brebis. Sur
cet ovule, on a enlevé le noyau qui contient le matériel génétique. Pourquoi un
ovule? Pour qu'il devienne éventuellement un embryon.
32
II - LES BANQUES GÉNOMIQUES
log ( 1-P )
N =- --------------
log ( 1-1 / n)
Tableau IV.1 : Nombre de clones (en milliers) que doit contenir une banque gé-
nomique pour être représentative d’un génome.
33
• Toutes les bactéries qui portent une chimère se multiplieront et donneront
des clones.
Figure IV.1: Schéma pour la réalisation pratique d’une banque génomique à partir
de phages.
3. Amplification de la banque
Lorsque la banque n’est pas d’usage unique, mais doit servir à plusieurs clo-
nages successifs, il convient de l’amplifier, c’est à dire, d’augmenter le nombre de
copies de chaque fragment inséré. L’amplification n’est réalisable que lorsqu’on tra-
vaille avec des phages. Avec les cosmides et les YAC, ou les BAC, les pertes de
séquences sont très rapides et on est alors obligé de refaire la banque chaque fois.
L’ADN complémentaire (ADNc) est la copie sous forme d’ADN d’un ARN mes-
sager (ARNm). Un banque de cDNA doit contenir au moins une copie de tous les
ARNm présents dans la cellule. Ces banques sont essentiellement tissulaires puis-
qu’une cellule d’un tissu donné ne possède pas tous les ARN messagers de
l’individu, mais ceux dont l’état de différentiation cellulaire permet la transcription. Le
processus de formation de l’ADNc comprend deux étapes:
34
5’ GGGAUCACUUGCGCAGCGCAUGCU(AAAAAAAAAA)n 3’ queue poly(A)
On utilise les queues poly rA pour purifier l’ARNm en écartant les autres types
d’ARN. Sur une colonne chromatographique, les oligo-désoxythymidine (dT) sont
liés à la cellulose ou à l’agarose par des liaisons covalentes. On fait alors passer
l’ARN cellulaire dans la colonne. Seuls les ARNm qui possèdent les queues poly rA
seront retenus sur la colonne par hybridation par les oligo-thymidilates. Les autres
ARN sont éliminés par un lavage avec le tampon. Les ARNm sont ensuite « élués »
par un agent dissociant. La figure III.3 résume les principales étapes de la purifica-
tion des ARN messagers eucaryotes ayant une queue poly-rA.
Figure IV.2 : Les principales étapes de la purification des ARN messagers eucaryo-
tes ayant une queue poly-rA en utilisant la chromatographie d’affinité.
Cette étape est toujours réalisée grâce à la transcriptase reverse isolée d’un
rétrovirus. Plusieurs techniques sont utilisées pour la préparation de l’ADNc :
la transcriptase reverse :
35
3’ ? 5’. On peut alors utiliser la T4 DNA polymérase pour parfaire la synthèse au ni-
veau des extrémités. Figure IV.4
36
Cette technique ne peut se réaliser que sur une banque d’expression puis-
qu’elle vise à révéler le produit d’expression d’un gène cloné. Il faut pour cela dispo-
ser d’un anticorps, de préférence polyclonal dirigé contre le produit du gène. Le
complexe antigène-anticorps est révélé par un autre complexe protéique possédant
soit une activité enzymatique dont les produits sont colorés ( -galactosidase), soit
marqué à l’iode 125.
4. Le séquençage :
37
Séquence détectée sur le gel Lecture Ordre T C G A Lecture
3 →-5’ des 3’→5’
taches
32
PTGCACTTGAACGCATGCT 18 T
32
P- TGCACTTGAACGCATGC 18 17 C
32
P- TGCACTTGAACGCATG 17 16 G
32
P- TGCACTTGAACGCAT 16 15 T
32
P- TGCACTTGAACGCA 15 14 A
32
P- TGCACTTGAACGC 14 13 C
32
P- TGCACTTGAACG 13 12 G
32
P- TGCACTTGAAC 12 11 C
32
P- TGCACTTGAA 11 10 A
32
P- TGCACTTGA 10 9 A
32
P- TGCACTTG 9 8 G
32
P- TGCACTT 8 7 T
32
P- TGCACT 7 6 T
32
P- TGCAC 6 5 C
32
P- TGCA 5 4 A
32
P- TGC 4 3 C
32
P- TG 3 2 G
32
P- T 2 1 T
32
P- 1 0
5’-TGCACTTGAACGCATGCT-3’
38
5. Analyse du génome et de ses modifications: Le Southern blot
39
• La détection des recombinaisons : L’échange entre chromosomes homo-
logues au cours de la méiose est la recombinaison. Dans certains cas, il est possi-
ble de mettre en évidence ces recombinaisons par cette technique.
Figure IV.11
6. La PCR
Définition:
Æ Processus:
• l’ADN à amplifier
• 2 amorces: sens et anti sens
• tampon de réaction (Buffer)
• MgCl2
• dNTP
• Taq polymérase
• L’appareil thermocycleur pour PCR
• H2O bi-distillée et stérile
40
7. Étude des polymorphismes : RFLP, VNTR, SSTR, SSCP
Les RFLP (restriction frament length polymorphism) sont des variations de séquence
de l’ADN révélées par des modifications de la carte de restriction. L’ADN est soumis
à une digestion par une ou plusieurs enzymes de restriction suivie d’un Southern
blot. En d’autres termes : l’hydrolyse d’un ADN par une endonucléase conduit à une
série de fragments, appelés fragments de restriction. La longueur des fragments est
déterminée par la distance séparant les séquences spécifiques reconnues par cette
endonucléase. Nous avons les RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
Une molécule d’ADN donnée coupée par une enzyme de restriction donnée produit
toujours les mêmes fragments : cette série de fragments fournit une empreinte ca-
ractéristique de l’ADN hydrolysé, on parle de carte d’identité moléculaire.
Nous avons aussi les polymorphismes de répétition : ce sont les minisatelites
ou VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) Les VNTR sont des séquences
particulières. Elles sont répétitives, dispersées et très polymorphes. Elles ont sou-
vent 11 à 16 bp (GGAGGTGGGCAGGA [A/G] G. Elles permettent la réalisation de
l’empreinte genetique (ADN finger printing)
Les microsatelites de type (CA)n sont plus fréquent et les mieux caractérisés :
les SSTR (Short Sequences of Tandem Repeats). Ils sont favorisé par des crossing
over inégales lors de la méiose. La chorée de Hungtington qui est une maladie neu-
rodégénérative est provoquée par des crossing-over inégaux. La technique des
SSTR permettent d’établir des polymorphismes à plus de 99,99%. Cette technique
est utilisée dans les tribunaux pour découvrir le coupable, pour déterminer la pater-
nité ou la maternité et elle est désormais utilisé dans la pharmacogénétique.
La mise en évidence des mutations ponctuelles utilise le système de l’analyse
des polymorphisme de conformation de l’ADN simple-brin : SSCP (single Strand
Conformation Polymorphism). La structure secondaire que prend un segment de
l’ADN simple-brin est fonction de sa séquence. Une mutation ponctuelle au sein de
cette séquence modifie la structure secondaire pour qu’il en résulte une modification
de la migration en électrophorèse. Cette propriété permet de mettre en évidence la
présence d’une mutation ponctuelle.
Processus :
- La séquence où l’on souhaite rechercher une mutation est amplifiée
par PCR.
- Cette séquence ne doit pas dépasser 300 à 500 bp.
- L’ADN est marqué par un iso-radioactif au cours de l’amplification.
On peut introduire un nucléotide α32P dCTP ou alors utiliser des pri-
mers marqués.
41
Migration sur un gel d’acrylamide non dénaturant
Par exemple, on a la séquence suivante avec une mutation C à A
Normal
Normal Muté Muté
42
més dans des cellules isolées dans différentes conditions (exemple : cellules norma-
les comparées aux cellules tumorales) ou soumises à différents traitements (défini-
tion du profil d’action d’une drogue). Les puces ADN sont un outil de choix dans la
recherche et la caractérisation de nouvelles molécules à visée thérapeutique.
Principe :
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
xxxx B
xxxx E
xxxx H
xxxx J
xxxx L
Prenons cette puce sur laquelle sont fixés des octamères de séquences che-
vauchantes différentes et ordonnées. Supposons que nous ayons un ADN de 12 bp
et hybridons-le à cette puce. Dans cet exemple nous avons cinq hybridations de
séquences.
Par exemple, si les ADN fixes sur les cases ci-après ont la séquence décrite :
B9 : C A G C C A A T
43
E4 : A G C C A A T A
H12: G C C A A T A C
J1 : C C A A T A C G
L12 : C A A T A C G A
C A G C C A A T A C G A
Figure IV.14
Le support utilisé pour fixer les oligonucléotides peut être une plaque de silice. La
synthèse des oligonucléotides se fait in situ : réactions chimiques avec adresse spé-
cifique sur le verre. Ces puces sont très petites, environ 1,6 cm2 avec un espace
entre les sondes d’environ 50 µm (65.000 sondes fixées).On peut encore diminuer
leur taille. Ainsi, des puces, avec espacement des sondes de 20 µm, permettent de
fixer plusieurs centaines de milliers de sondes, ont été fabriquées. Les industriels
espèrent pouvoir réaliser des puces de 1 µm et pourquoi pas, comme dans
l’industrie informatique, des puces de 0,3 µm !
Secteurs d’application :
• Expression de gènes,
• Pharmacogénétique ou pharmacogénomie.
44
CHAPITRE V: MUTAGENÈSE IN VITRO, EXPRESSION
DES GÈNES EUCARYOTES DANS LES BACTÉRIES.
La fin des années 1970 et le début des années 1980 ont vu se développer
des techniques qui permettent de modifier des paires de bases bien spécifiques
donc de créer différents types de mutations ponctuelles, de délétions et d’insertions
dans des fragments d’ADN cloné. Les fragments d’ADN ou les gènes ainsi modifiés
peuvent ensuite être réintroduits dans l’organisme d’origine pour observer les effets
des mutations sur le phénotype ou sur la régulation de l’expression génétique.
I - LES MUTAGENÈSES
45
2. Mutagenèse par insertion:
Les substitutions des bases peuvent être introduites dans un segment d’ADN
cloné dans un plasmide, après y avoir créé de courtes régions mono-caténaires.
Ces régions mono-caténaires sont alors utilisées pour substituer des paires de ba-
ses ou pour introduire des nucléotides supplémentaires:
∗ soit par une digestion partielle à l’aide de l’exonucléase III (qui a une action
exonucléasique 3 à 5 ) après une coupure par une enzyme de restriction. On aura
donc des bouts 5’ débordants.
Exemple : Pour créer donc un mutant contenant une substitution de base par une
désamination de la cytosine.
Figure V.1 : Mutagenèse, substitutions de nucléotides
à Avec une enzyme de restriction donnée comme Hind II, on ouvre dans
l’ADN un site de restriction: un smal.
à Le site est traité avec l’ADN polymérase I modifiée (appelée fragment de
Klenow). En présence de dTTP, ce fragment enzymatique agit comme une exonu-
cléase en effectuant une digestion simple brin 3’à5’ jusqu’à ce qu’il rencontre un
résidu T.
à L’addition du bisulfite provoque une désamination des résidus cytosines
(C) des brins exposés pour donner de l’uracile (U).
à Après élimination du bisulfite, la molécule de DNA est réparée par
l’addition des quatre dNTP et du fragment de Klenow de la DNA polymérase.
à Le résultat est une substitution d’une paire de bases G-C par une paire A-T.
46
b - La mutagenèse dirigée au moyen d’oligonucléotides:
Les exemples que nous venons de voir possédaient un site de restriction pro-
pice aux bords de la région à modifier. Mais comment créer une mutation dans une
séquence qui ne bénéficie pas de cette situation favorable ? Pour résoudre ce pro-
blème, Michael Smith a inventé la méthode qui utilise des petits oligonucléotides de
synthèse d’une taille de 15 à 25 bases.
1. Le gène que l’on désire muter est cloné de préférence dans un vecteur dé-
rivé d’un phage dont le génome est une molécule d’ADN monocaténaire, comme le
phage M13.
5. Les deux brins de l’ADN obtenu sont séparés par simple chauffage suivi
d’un refroidissement rapide et transférés par transformation dans E. coli où il seront
répliqués in vivo et produiront finalement un grand nombre d’exemplaires de la sé-
quence mutée que l’on désire (50% pour la séquence mutée et autant de copies de
l’ADN sauvage 50%).
47
c - La mutagenèse insertionnelle ciblée par recombinaison homologue
Pour réaliser la même opération sur des gènes non sélectionnables (gènes
de régulation), Mansour a élaboré un système de double sélection : le procédé de
sélection positive et négative dont le principe est le suivant :
48
Figure V.3 : La mutagenèse insertionnelle ciblée par recombinaison homologue
A B C D E F
Gène ciblé
C D NEO D F tk
Construction
C D NEO D E tk A C D E F
Intégration
aléatoire
A B C D E F
Gène ciblé
C D NEO D E tk
Construction
A B C D NEO D E F
Recombinaison
homologue
49
Figure V.3 : La mutagenèse insertionnelle ciblée par recombinaison homologue
• La création d'une mutation artificielle peut être obtenue dans un gène par le
jeu des amplifications à partir d'amorces modifiées.
L’effet des modifications est de suivre l’expression d’un gène soit par une
augmentation ou une diminution de la production d’une protéine soit d’étudier les
modifications structurale de la protéine produite. Dans le cas des changements phé-
notypiques le résultat est visuel, mais dans les autres cas, il faut avoir recours soit à
des gènes reporteurs, soit à des promoteurs inductibles.
La séquence de DNA modifiée est couplée à un gène reporteur que la cellule
d’expression ne possède pas et dont le produit est facilement analysable. Les gènes
50
les plus courants sont : le gène de la Chloramphénicol-acétyl transférase (CAT), de
la β-glucuronidase ‘( -Glu), de la β-galactosidase ( -Gal) et de la luciférine. (CF
Photocopies)
Le transfert de l’ADN libre dans les cellules s’effectue par transfection avec
différentes techniques suivant le type cellulaire :
La transfection par le phosphate de calcium fait intervenir une internalisation
du complexe DNA-calcium par phagocytose
La transfection par le complexe DEAE dextran est également une internalisa-
tion par phagocytose
L’électroporation utilise l’effet d’une tension électrique sur des cellules en
suspension qui provoque la formation transitoire de pores permettant au DNA de
pénétrer dans la cellule.
Le DNA peut aussi être introduit par des projections de micro-particules enro-
bées de DNA surtout pour les plantes.
Le DNA peut aussi être introduit dans les cellules par micro-injection surtout
dans le cas des ovocytes fécondés.
La transfert de matériel génétique utilise aussi les vecteurs viraux, rétroviraux
et les plasmides que l’on appelle alors des vecteurs navettes.
51
DEUXIÈME PARTIE :
APPLICATION
DE LA BIOLOGIE
MOLECULAIRE :
LE GÉNIE GENETIQUE
52
CHAPITRE VI: LES TECHNIQUES DU GENIE GENETIQUE APPLIQUEES
AUX MICRO-ORGANISMES
Les génomes eucaryotes sont beaucoup plus complexes que les génomes
bactériens et phagiques C’est pourquoi les techniques de manipulation de l’ADN
doivent être adaptées aux différents génomes. Les exemples ci-dessous donnent
une idée de la taille du génome de quelques espèces :
• Plasmides à 2 à 5 kb
• Bactériophage à 4,8 kb
• Bactériophage M13 à 6,4 kb
• E. coli à 4 Mb
• La levure (Saccharomyces cerevisiae) à 4 Mb
• Neurospora crassa à 27 Mb
• C. elegans à 100 Mb
• Drosophila melanogaster à 165 Mb
• Homo sapiens à 3000 Mb
L’introduction de cet ADN dans une cellule peut s’effectuer par une série de
manipulation diverses : par l’électroporation, la micro-injection, les liposomes, la co-
précipitation par le phosphate de calcium, par la transformation, par infection virale,
ou par un bombardement avec des micro-projectiles de tungstène enrobés d’ADN
dans le cas des cellules végétales.
53
La construction d’organismes transgéniques constitue un bond en avant pour
la recherche en génie génétique. Une des méthodes les plus importantes consiste
en l’utilisation de gènes indicateurs qui permettent de mesurer l’activité d’un gène
spécifique dans le tissu où il s’exprime normalement, malgré l’absence d’un phéno-
type facilement détectable. La région qui contrôle l’expression du gène en question
(promoteur) est alors rattachée à la région codante d’un gène dont l’activité est faci-
lement mesurable et qui constitue alors le gène indicateur. Chaque fois que le gène
étudié est exprimé, le gène indicateur signale sa présence par son activité indica-
trice dans la cellule ou dans les tissus concernés.
2. Intérêt de la transgenèse
54
tion palliative. Le porc, physiologiquement proche de l’homme est à l’heure actuelle
le meilleur candidat, d’autant plus que très peu de maladies sont transmissibles du
porc à l’homme. Pour éviter le rejet d’organes porcins transplantés chez l’homme,
les gènes humains des protéines régulatrices du complément sont transférés au
porc. Les c urs et les reins de porcs transgéniques obtenus en Grande Bretagne,
aux Etats Unis et en Australie survivent pendant plusieurs semaines quand ils sont
greffées à des primates.
55
Le vecteur utilisé dans cet exemple est le phage T7. Au début de l’infection,
l’ARN polymérase du phage T7 transcrit les gènes précoces à partir d’un promoteur
dit précoce du phage T7. En fin d’infection, la bactérie synthétise des quantités
énormes des produits des gènes dits tardifs du phage T7 (les protéines de la cap-
side et de la queue). A ce moment, les gènes de la bactérie hôte ne sont plus trans-
crits. Par conséquent seules les protéines du phage sont encore synthétisées. Cette
possibilité est utilisée pour produire de grande quantité des protéines d’intérêt
comme le facteur VIII de la coagulation sanguine qui est défectueux chez les hé-
mophiles.
56
Le schéma de la figure IV.8 donne le protocole de construction pour la syn-
thèse de l’hormone de croissance humaine dans E. coli :
(a) : Dans la première construction, la séquence signal humaine de l’insuline est éli-
minée pour permettre l’expression de la protéine dans les cellules bactériennes. Il
en résulte une méthionine à l’extrémité N-terminal qu’il faut enlever pour avoir la pro-
téine active.
(b) : Dans cette construction, une séquence signal bactérienne est ajoutée pour fa-
voriser la sécrétion du produit de traduction dans l’espace périplasmique. Dans ce
cas, il n’y a plus de méthionine supplémentaire et le produit excrété est de l’hormone
de croissance pure.
Il est alors possible d’introduire des gènes étrangers dans la levure pour en
étudier l’effet sur le phénotype, puis de re-transférer le plasmide dans Escherichia
coli pour manipuler le gène de la levure, pourvu qu’il contienne une origine de répli-
cation bactérienne et un marqueur sélectionnable dans la bactérie. Ces vecteurs
navettes que sont les chromosome artificiels de levure (YAC) sont extrêmement in-
dispensables pour le clonage de grands fragments de génome humain. Comme
exemple :
• le gène qui code pour le facteur VIII de la coagulation sanguine est long de
190 kb
• le gène responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne fait 1000 kb.
57
Chaque année, le virus de l’hépatite B infecte plusieurs centaines de milliers
de personnes dans le monde. On estime qu’aux Etats-Unis, il y a 150 000 infections
par l’hépatite B chaque année. 16 à 19 % de la population du Burkina Faso sont
aussi atteints par l’infection à l’hépatite B. Le virus de l’hépatite B (HBV) qui infecte
le foie, provoque des lésions et dans certains cas des cancers. La particule virale
est recouverte d’un antigène de surface : HbsAg. Cette protéine se retrouve dans le
sang des personnes infectées sous la forme de gros agrégats protéiques.
58
jectable, développée par Rhône-Poulenc-Rorer, peuvent fournir un nouveau moyen
de lutter contre les bactéries pathogènes.
FMN reductase
PIIA sybthase
Figure VI.4
59
PIIB en PIIA. Industriellement parlant, il était souhaitable d'obtenir uniquement le
composé PIIA.
Afin d’obtenir une composition totalement soluble, les chercheurs ont introduit
dans une souche de S. pristinaespiralis, par génie génétique, les gènes snaA et
snaB de S. pristinaespiralis codant la PIIA synthétase (enzyme responsable de la
conversion de PIIB en PIIA). La souche de S. pristinaespiralis, nouvellement cons-
truite, est capable de réaliser complètement cette conversion et ne synthétise que le
dérivé PIIA. L'idée de base était que la surexpression de gènes snaA et snaB de S.
pristinaespiralis codant la PIIA synthétase (enzyme responsable de la conversion de
PIIB en PIIA) permettrait une conversion totale. Cette surexpression pouvait être
obtenue en réintroduisant ces gènes sous contrôle d'un promoteur fort dans une
souche de S. pristinaespiralis. L'équipe de Rhône-Poulenc-Rorer a isolé et caracté-
risé les gènes en question.
Processus :
2 – clonage de deux gènes snaA et snaB sous contrôle d'un promoteur de transcrip-
tion fort (ermE promoter) dans des vecteurs intégratifs dérivés de pSAM2
4 - La souche ainsi construite est stable dans les conditions industrielles et synthé-
tise de la pristinamycine qu’on extrait et qu’on purifie en vue d’une utilisation théra-
peutique.
5 - Ces résultats montrent que les vecteurs employés sont maintenus de façon sta-
ble en l'absence de pression de sélection, et qu'ils permettent d'éviter les problèmes
d'instabilité structurelle ou ségrégationnelle souvent rencontrés avec des vecteurs
réplicatifs chez Streptomyces. Ils montrent également que la quantité de PIIA syn-
thétase était bien le seul facteur limitant la conversion totale de PIIA en PIIB et qu'il
est possible de réaliser cette conversion sans affecter le niveau total de production.
Référence :
- Sezonov G., Blanc V., Bamas-Jacques N., Friedmann A., Pernodet J.-L. et Guérineau M., 1997.
Complete conversion of antibiotic precursor to pristinamycin IIA by overexpression of Streptomyces
pristinaespiralis biosynthetic genes. Nature Biotechnology, 15, 349-353, 1997.
60
VII – PRODUCTION DES ALIMENTS FERMENTÉS PAR DES
MICRO-ORGANISMES TRANSGÉNIQUES
1. La production de fromage
La présure est une enzyme produite par la caillette des veaux qui coupe la
caséine pour provoquer la coagulation du lait. La production du lait caillé constitue
la première étape dans la production du fromage. Il faut beaucoup de présure pour
la fabrication du fromage alors que sa production par les veaux n’est pas suffisante.
En appliquant la technique de l’ADN recombinant aux bactéries lactiques ou
aux levures, on a pu améliorer la qualité des aliments fermentés. Pour cela, on a
cloné le gène de la présure de veau dans un vecteur d’expression qu’est Saccharo-
myces cerevisiae qui produit alors de la présure de levure. On peut également utili-
ser une bactérie lactique en fonction de son métabolisme et de la rentabilité.
2. La production de la bière
Le moût du malt (comme de mil rouge) est un mélange de mono, di, tri poly-
saccharides et de dextrines qui proviennent de l’hydrolyse de l’amidon par les amy-
lases. Saccharomyces cerevisiae peut faire fermenter tous les polysaccharides sauf
les dextrines qui constituent cependant 22% des hydrates de carbone des céréales
utilisées (orge, seigle, riz, maïs, mil…) pour la production de la bière. Pour améliorer
le goût et la limpidité de la bière, on peut procéder comme suit :
61
CHAPITRE VII: LE GENIE GENETIQUE APPLIQUE AUX VEGETAUX
I . LE PLASMIDE TI:
des gènes qui codent pour des hormones de croissance végétales et sont
responsables de la tumorisation des cellules de la plante,
des gènes qui codent pour des enzymes qui conduisent les cellules tumo-
rales à synthétiser des substances appelées opines (nopaline et octopine).
Les gènes qui contrôlent la synthèse des hormones et des opines (nos, ocs)
sont exprimés dans la plante à partir de séquences régulatrices eucaryotes. Par
contre, ceux qui contrôlent la synthèse des enzymes de dégradation des opines
(noc, occ) se trouvent dans la bactérie sous le contrôle de séquences régulatrices
procaryotiques.
62
2. Utilisation du plasmide Ti comme vecteur en génie génétique.
En principe, tout fragment d’ADN cloné au sein de l’ADN-T peut comme lui
s’insérer de façon stable dans le génome de la plante qui le reçoit. Le plasmide Ti
est très grand pour les manipulations. Il faut donc construire des dérivés plus petits
qui contiennent l’essentiel de l’ADN-T et l’ADN d’intérêt. On peut construire un plas-
mide intermédiaire par le processus suivant :
63
L’enzyme luciférase catalyse la réaction d’une substance appelée lucifé-
rine avec ATP. Cette réaction s’accompagne d’une émission de lumière et c’est ce
qui explique la luminescence de la luciole en vol.
Une plante de tabac transgénique par exemple qui exprime le gène de la
luciférase s’illumine dans l’obscurité si on la badigeonne avec une solution de lucifé-
rine.
Le gène de la luciférase peut donc être utilisé comme indicateur pour étu-
dier, au cours du développement, la régulation de l’expression de l’un ou l’autre
gène de la plante ou de l’ADN intégré.
Protéine régulatrice
Répresseur
64
GENE II :
- Le gène III produit une toxine qui est létale pour l’embryon. Ce gène est sous
le contrôle d’un promoteur tardif qui est activé seulement durant le dévelop-
pement de la graine, lors de la croissance de l’embryon. Entre le promoteur
tardif et le gène III se trouve l’ADN « blocker » qui favorise, s’il est excisé, la
transcription et l’expression du gène toxine, produisant la toxine qui tue
l’embryon rendant ainsi stérile les nouvelles semences pour la reproduction.
GENE III :
- L’inducteur chimique est répandu sur les semis par les compagnies de se-
mences comme Monsanto et Syngeta afin d’activer le gènes II et le gène III.
Une fois ces gènes activés dans ces semences, nous pouvons avoir la pro-
duction mais pas le reproduction.
Processus d’activation du gène terminator dans les semences de vente aux agri-
culteurs :
65
Inducteur
Graine
Gène répresseur
GENE I :
Protéine régulatrice
Le répresseur se délie
GENE II :
Binding site
gène de la toxine
GENE III :
Promoteur tardif
blocker
Synthèse de la toxine qui tue l’embryon
66
GENE I :
Protéine régulatrice
Répresseur
GENE II :
Binding site
gène de la toxine
GENE III :
Promoteur tardif
blocker Pas de production de la toxine
67
III . L’APPLICATION DU GÉNIE GÉNÉTIQUE À L’AGRICULTURE:
1: L’enzyme luciférase :
2. Le maïs transgénique
Chaque année les agriculteurs du monde entier perdent 1/10 de leurs récol-
tes de maïs à cause des insectes nuisibles. Le maïs transgénique contient dans son
génome un gène qui code pour une protéine que détestent les insectes et qui en
principe ne doit pas causer de nuisances à l’homme. Cette variété augmente donc le
rendement en éliminant le facteur insecte.
68
Les virus des plantes représentent un sérieux problème pour l’agriculture car
leurs infections entraînent une diminution de la croissance des plants, du rendement
des récoltes et de leur qualité. Le virus de la mosaïque du tabac (TMV) infecte les
plants de tabac. Une plante transgénique qui exprime la protéine du manteau (coat
Protein : CP) du TMV résiste aux infections par ce virus. La plante transgénique est
déjà produite aux Etats-Unis.
Figure VII.7: production de la protéine CP
Chaque année des milliards de dollars de récoltes sont perdues à cause des
insectes. Les armes les plus utilisées pour lutter contre les insectes sont « les in-
secticides et les pesticides » qui posent actuellement de graves problèmes de
pollution à l’environnement.
69
Le gène nif (nitrogen-fixation apparatus) permet à la bactérie Rhizobium des
légumineuse de fixer directement l’azote moléculaire pour donner des sels
d’ammonium (Nitrate, Nitrite, Ammonium). Ce sera le gène d’intérêt.
Le gène nif est inséré dans le plasmide Ti de la bactérie Agrobacterium tume-
faciens
La plante d’intérêt est alors transformée par ce plasmide
Les cellules tumorales de la plante transformée sont prélevées et cultivées in
vitro puis transférées sur différents terrains sous serre.
Les plants capables de pousser rapidement sans un apport d’engrais sont
ceux capables de fixer l’azote moléculaire
Un gène marqueur permet de sélectionner les plants ayant intégré le plas-
mide avec le gène nif.
9. La production de la taumatine
La taumatine est un aliment très sucré et même plus doux que le saccharose.
elle est produite par une plante : « Thaumatococcus danielli » qui pousse en Afrique
occidentale. Ce peptide, composé de 207 acides aminés constitue une source im-
portante pour l’apport en acides aminés dans l’alimentation en plus de sa saveur.
Elle est actuellement produite par des bactéries suivant le protocole ci-après :
Il a été construit une molécule chimère ayant des séquences des plasmides
pCI62-8, pBS42, pCI72 et qui porte le gène « tau ».
Cette construction chimère est utilisée pour transformer Bacillus subtilis.
Bacillus subtilis transformé synthétise la taumatine.
Une extraction, suivie d’une purification donne de la taumatine pure
70
CHAPITRE VIII: LE GENIE GENETIQUE APPLIQUE AUX ANIMAUX
• les éléments du type copia : Il existe au moins sept (7) familles d’éléments
de type copia dont la longueur varie de 5 à 8,5 kb. Les membres de ces différentes
familles sont au nombre de 10 à 100 exemplaires par génome. Les éléments de type
copia contiennent deux longues séquences terminales en répétition directe et de
courtes séquences répétées de manière inverse et imparfaite.
• les éléments à rabat ou type FB (pour fold-back) : Ces éléments sont
longs de quelque centaines à quelques milliers de paires de bases. Ils contiennent
tous de longues extrémités en répétition inverse. L’élément peut se rabattre sur lui-
même lors des expériences de renaturation thermique d’ou son nom de rabat. Ce
type d’élément provoque des réarrangements chromosomiques lors de son insertion
et de son excision.
• les éléments P : D’une longueur égale à environ 2,90 kb, Ils portent à leurs
extrémités une séquence répétée inversée de 31 paires de bases. La partie centrale
possède trois cadres ouverts de lecture et peut coder pour au moins trois protéines
dont la transposase et le répresseur de la transposase.
Les éléments P sont des transposons qui sont capables de changer de locali-
sation dans le génome. L’élément P peut donc être facilement utilisé en génie géné-
tique. Ils codent pour une enzyme nommé « transposase », responsable des dépla-
cements de cet ADN dans tout le génome. Ils peuvent donc être utilisés pour :
71
a - On injecte dans un embryon de drosophile l’ADN d’un plasmide bactérien
qui contient un élément P dans lequel on a cloné un gène ry+ de la drosophile (ce
gène donne la coloration rose de l’ il) mais ayant subi une délétion partielle. Cet
élément P modifié ne peut plus se transposer à cause de la délétion.
Les mouches issues de cet embryon ont toujours le phénotype ry-, mais dans
leur descendance, on retrouve une grande proportion d’individu ry+. Le gène ry+
nouvellement acquis montre une hérédité mendélienne et stable, ce qui suggère
qu’il est bien localisé sur un chromosome. L’hybridation in situ montre que le gène
ry+ (P modifié) et l’élément P normal se retrouvent en différentes positions sur diffé-
rents chromosomes et non à la position normale du locus rosy. Le transposon nor-
mal P a donc fourni la transposase pour permettre l’insertion du transposon anormal
contenant le gène ry+.
Figure. VIII.1
On peut actuellement insérer n’importe quel gène dans la souris afin d’obtenir
l’expression génique de ce transgène. Dans cette transgenèse, la souris qui intègre
par exemple le gène de l’hormone de croissance humaine (GH) acquiert une masse
énorme double ou triple par rapport à ses s urs jumelles. Ce type de démarche
peut être appliqué à tous les mammifères pour accroître leur rendement en poids et
donc en intérêt économique.
72
Les organismes transgéniques peuvent être produits par l’injection de vec-
teurs dans des ufs fécondés et réimplantés dans les femelles. Au cours de
l’embryogenèse l’ADN exogène se fraie son chemin jusqu’aux cellules germinales et
se comporte désormais comme un gène endogène. Il passe donc à la descendance
comme un gène nucléaire normal.
Beaucoup d’études récentes ont montré que certaines races bovines résistent
bien à l’infection par le trypanosome. Ce type de résistance, appelée « trypano-
tolérance », se rencontre dans les populations bovines d’espèce Bos taurus, locali-
sée en Afrique occidentale. La race N’Dama, caractérisée par de longues cornes et
une absence de bosse en est un exemple.
Ce type de bovin domestique et d’autres animaux sauvages comme le « buf-
fle » qui ont vécu en Afrique depuis plus de 5 000 ans a.C. ont développé des résis-
tances contre les attaques du trypanosome et sont par conséquent adaptés au mi-
lieu infesté par le parasite.
73
L’espèce bovine comme Bos indicus qui est actuellement très répandue en
Afrique, est arrivée dans ce continent avec l’invasion arabe vers les années 660 p.C.
Elle n’est pas « trypano-résistante »
Stratégie I. :
Identifier le gène qui confère la résistance aux trypanosomes chez les bo-
vins de la race D’Dama
Cloner ce gène dans un vecteur
Transférer le vecteur dans des cellules bovines de l’espèce Bos indicus
pour leur conférer la trypano-tolérance.
Stratégie II :
4 – Le porc transgénique
74
Pour pallier le manque d'organes: xénotransplantation avec le porc.
Le problème majeur qui empêche la réalisation des xénogreffes d'organes aujour-
d'hui est l'existence du rejet hyper aigu qui survient entre les espèces animales phy-
logéniquement distantes. En effet, il serait tout à fait possible de réaliser des xéno-
greffes d'organes à partir de primates supérieurs (chimpanzés) mais cette possibilité
semble peu réalisable car ces espèces animales sont protégées et représentent une
source incontrôlable de transmission de virus à l'homme (Ebola, SIV…) La protéine
DAF (Decay Accelerating Factor) neutralise le complément des primates et favorise
les greffes d’organes.Tandis que dans les greffes allogéniques on utilise surtout
les médicaments immunosuppresseurs comme la cyclosporine pour lutter contre le
phénomène de rejet.
Figure VIII.3 : LE PORC TRANSGéNIQUE.
75
CHAPITRE IX:
CLONAGE DES MAMMIFÈRES, PARTHÉNOGENÈSE, CELLULES SOUCHES
EMBRYONNAIRES (EMBRYONIC STEM CELLS) ET THÉRAPIE GÉNIQUE.
Un clone de mammifère est une copie génétique d'un organisme entier. Dolly
(première brebis clonée en Angleterre), est un clone de sa mère, ou de ses gènes.
Comme les brebis, les hommes vont-ils eux aussi passer à la "photocopieuse
La technique du clonage est relativement simple dans son principe. Dans le
cas de la brebis Dolly, on a prélevé une cellule dans le pis d'une brebis de race Finn
Set à face blanche. On a prélevé également un ovule sur une autre brebis et on lui a
enlevé le noyau qui contient le bagage génétique. Pourquoi un ovule? Pour qu'il de-
vienne éventuellement un embryon. À l'aide d'un choc électrique, on a fusionné in
vitro la cellule du pis qui contient tous ses gènes et l'ovule vidée de tout matériel
héréditaire.
C'est la raison pour laquelle Dolly n'aura pour tout bagage génétique que ce-
lui que contenait la cellule du pis. L'ovule ainsi " électrisé " se divise et le processus
de vie s'enclenche. Après s'être divisée un nombre suffisant de fois, l'embryon
(stade blastula) est placée dans l'utérus d'une brebis porteuse. Dolly est née de
cette technique, identique en tous points à la brebis qui a fourni la cellule du pis.
76
II. LES CELLULES ES (EMBRIONIC STEM CELLS)
OU CELLULES EMBRYONNAIRES PLURIPOTENTES).
Le 6 novembre 1998, le New York Times titrait : « Des scientifiques isolent les cellu-
les à l origine de la vie ». En effet, en fin 1998, deux équipes de recherches différentes
découvraient presque simultanément avec des méthodes distinctes les cellules souches
embryonnaires, « Embryonic Stem » (ES). L’une travaillait sur des blastocystes des
embryons précoces de moins de sept jours () et l’autre équipe sur des cellules germina-
les primitives ovogonies et spermatogonies (). Chacune de ces cellules ES a la potentiali-
té de devenir n'importe quel tissu du corps humain: c ur, muscles, sang, os, cheveux,
nerfs (). D'où leur mystère, leur importance biomédicale et la fascination des biologistes.
Ce sera une technique de photocopie magique pour reproduire un individu à volonté et
en plus, ce système offrira un fond inestimable de pièces de rechange d’organes
humains !
Une cellule souche est une cellule indifférenciée qui reste capable de se divi-
ser de façon autonome tout au long de la vie, assurant le renouvellement des cellu-
les d’un individu. La division d’une cellule souche produit deux nouvelles cellules :
une cellule souche de « réserve » et une cellule s’engageant dans un processus de
différenciation qui la conduira à remplir une fonction précise.
Tous les êtres vivants pluricellulaires possèdent des cellules souches. Elles
sont à l’origine de tous les tissus et en assurent le renouvellement (remplacement
des cellules disparaissant par vieillissement ou par lésion). Les cellules souches
sont à l’origine de la régénération des membres chez certains animaux (lézards, tri-
tons, etc.). Chez les plantes, elles favorisent le processus du bouturage. Ainsi à
partir d’une seule cellule peut être créée une plante entière.
77
2 - Les cellules souches pluripotentes : Précisons tout de suite quelque chose
d’absolument essentiel qui doit être en permanence dans l’esprit : les cellules sou-
ches pluripotentes qui constituent la masse interne sont destinées à former tous les
tissus de l’organisme mais ne peuvent à elles seules aboutir à la formation d’un indi-
vidu complet car elles ont perdu, à ce stade, la faculté de produire le trophoblaste,
précurseur du placenta. Le placenta a pour fonction de nourrir l’embryon et de le
protéger de tout rejet par le système immunitaire. Les cellules de la masse cellulaire
interne, bien que pouvant donner toutes les cellules de l’organisme, sont incapa-
bles, si on les réimplante dans un utérus, de donner un embryon puis un f tus. Cer-
tes, ces cellules pluripotentes ne peuvent pas évoluer pour former une person-
nes mais de multiples questions se posent : comment peut-on les obtenir tout en
respectant les règles d’éthique ? Peut-on les utiliser dans les recherches du clonage
thérapeutique ?
3 - Les cellules souches multipotentes : Elles sont des cellules souches capables
de donner naissance à un ou plusieurs groupes de cellules ayant une fonction par-
ticulière. Par exemple, les cellules souches présentes dans la moelle osseuse pro-
duisent les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes. Elles jouent un
rôle essentiel en assurant le renouvellement des cellules. Elles sont appelées aussi
cellules souches adultes ou cellules souches somatiques. Les cellules souches
adultes peuvent être extraites de la plupart des tissus, y compris du cerveau et de la
moelle épinière. Cependant, elles sont rares et par conséquent très difficiles à
identifier (une cellule souche pour dix ou quinze mille autres cellules dans la moelle
osseuse. La moelle osseuse et le sang du cordon ombilical sont particulièrement
riches en cellules souches adultes. Les cellules souches du sang de cordon
ombilical peuvent être prélevées à la naissance et conservées pour un usage
ultérieur (un tel service est proposé par certaines fondations aux Etats-Unis). Les
cellules souches issues de la moelle ou du cordon peuvent être utilisées pour une
thérapie cellulaire bénéficiant à l’individu ou à ses frères et s urs.
4 - Les cellules souches unipotentes : elles ne donnent qu’un seul type de cellu-
les différenciées (peau, foie, muqueuse intestinale, testicule…). Dans certains orga-
nes, tels que le c ur et le pancréas, les chercheurs n’ont pas encore découvert de
cellules souches ; par conséquent ils pensent que ces organes n’ont aucune possi-
bilité de régénération en cas de lésion.
78
base du corps et de la spécification des cellules et des territoires devant donner les
différents organes.
A l’échelle de la cellule, il existe différents niveaux de contrôle du développe-
ment : prolifération cellulaire, migrations, engagement dans une voie de différencia-
tion. Le développement embryonnaire étant un processus continu et progressif, les
différents gènes impliqués ne peuvent être considérés isolément ; au contraire, leur
séquence spatio-temporelle d’expression est largement hiérarchisée et interdépen-
dante. La multiplication cellulaire, régulée par les oncogènes et les facteurs de
croissance, les migrations cellulaires et l’engagement d’une cellule dans une voie de
différentiation constituent en effet des choix de développement non indépendants.
Ils peuvent par ailleurs être autonomes-cellulaires, c’est-à-dire ne dépendre que de
l’information contenue dans la cellule considérée ou être non autonomes, c’est-à-
dire permis par des interactions avec les cellules voisines.
79
dans l’établissement des polarités et dans la régulation du cycle cellulaire.
Des données récentes attribuent à l'ARN maternel oct-3 un rôle dans la première
division de l’ uf et au PDGF-alpha (platelet-derived growth factor) codé par un ARN
maternel un effet autocrine activateur de la division cellulaire.
a – le clonage
- Le clonage par transfert de noyau
Transfert du noyau d une cellule d un sujet donné dans un oocyte humain énu-
cléé, suivi d’un développement embryonnaire jusqu’au stade de blastocyste et de
l’utilisation des cellules de la masse cellulaire interne (ICM), en vue d’obtenir les ES
et, à partir d’elles, les cellules différenciées souhaitées. La technique de transfert
nucléaire, dérivée d'expériences menées chez les batraciens dans les années 60
consiste d'abord à retirer la métaphase II et le premier globule polaire d'un ovocyte II
maturé. Ensuite, une cellule diploïde est insérée dans la zone pellucide, à côté de
l'ovocyte énucléé. Un choc électrique est appliqué. Il engendre à la fois la fusion
des deux membranes plasmiques et l'activation de l'ovocyte. Le noyau de la cellule
diploïde se retrouve ainsi au sein du cytoplasme ovocytaire. A ce stade, on parle de
zygote ou d'embryon reconstitué, ou encore d'équivalent d’une cellule. L'embryon
reconstitué entame son clivage et, au stade 8-16 cellules chez le bovin, le noyau
transféré prend le contrôle du développement. Au stade blastocyste, l'embryon est
transféré en mère porteuse. L'affinement de la technique a permis à une équipe
écossaise de produire des agneaux en utilisant le noyau de cellules f tales (fibro-
blastes) et même de cellules mammaires d'une brebis adulte. Ces résultats mon-
trent qu'au moins certains types de cellules conservent intact leur potentiel nucléaire
de différenciation malgré leur état de cellule différenciée. Notons cependant que le
taux de succès est, à l'heure actuelle, inversement proportionnel à l'état de différen-
ciation de la cellule diploïde donneuse de noyau. De plus, l’analyse des télomères
des clones obtenus semble montrer que l’ADN des cellules diploïdes donneuses de
80
noyau n’est pas “ rajeuni ” par le transfert nucléaire. Ceci signifie qu‘un clone serait
constitué de cellules dont l’âge correspond à celui de l’organisme d’origine. La
conséquence serait un vieillissement prématuré de ces clones.
Transfert du noyau d une cellule d un sujet donné vers un oocyte d un autre
animal. Un éventuel succès devrait conduire - comme on le suppose - au dévelop-
pement d’un embryon humain, qu’on pourrait utiliser comme dans le cas précédent.
Cette autre technique, développée également par Willadsen, est fondée sur
une observation faite chez l'embryon de souris par Mulnard. Ce dernier a décrit que
les premiers blastomères d'un stade 4 cellules qui subissent leur 3ème mitose four-
nissent par la suite la masse cellulaire interne du futur blastocyste. Les derniers
blastomères du stade 4 cellules qui se divisent donnent le trophectoderme. En as-
sociant un blastomère isolé d'un stade 8 cellules d'une souche A avec un blasto-
mère isolé d'un stade 4 cellules d'une souche B, Willadsen a effectivement montré
que l'agneau obtenu après transfert en mère porteuse était constitué de cellules
descendantes du blastomère de stade 8 cellules. En reconstituant 8 embryons chi-
mériques en associant par paire les cellules d'un embryon 8 cellules de souche A et
de deux embryons 4 cellules de souche B, il obtint un maximum de 5 agneaux de
phénotype A. Comme tous les agneaux d'un groupe proviennent d'un blastomère
d'un même stade 8 cellules, ils constituent un clone.
81
Cette technique est également très délicate et n'a jamais été utilisée pour la
production de clones en série. Elle a cependant permis de préciser que le premier
processus de différenciation cellulaire, l'apparition du trophectoderme, débute au
stade 4-8 cellules, bien avant la cavitation.
III - LA PARTHÉNOGENÈSE:
IV - LA THÉRAPIE GÉNIQUE:
De nos jours, plus de trois mille types de maladies héréditaires ont été identi-
fiées. Chaque année, la population mondiale paie un lourd tribut à cause de ces ma-
ladies génétiques cause de mortalité infantile ou de déficience caractérisée.
¢ Dans le monde actuel on estime à cent millions (100 000 000), les person-
nes qui sont atteintes de la mutation du gène qui code pour la glucose-6-phosphate
déshydrogénase qui conduit au favisme
¢ Environ deux cent cinquante millions (250 000 000) de personnes souffrent
de plusieurs types d’anémies liées aux mutations génétiques
¢ Dans les pays développés, le tiers des hospitalisations en pédiatrie sont
liées aux désordres génétiques.
¢ La mucoviscidose, cause de la fibrose cystique, touche environ un enfant
sur 2 500 dans la population caucasienne. Quatre pour cent (4%) de cette popula-
tion portent le gène muté de la mucoviscidose (FC).
¢ En Afrique et en Amérique, la drépanocytose tue à elle seule près de cent
mille enfants noirs par an sans compter les pathologies génétiques multi-factorielles
et cystogéniques
¢ Au Burkina Faso, environ 30% de la population présentent une mutation de
la chaine ß de l’hémoglobine (ßS ou ßC). Près de 5% des enfants sont atteints de la
drépanocytose sous ces diverses formes pathologiques (Hb SS ou Hb SC).
82
L’objectif de la thérapie génique germinale consiste à introduire des cellules
transgéniques dans la lignée germinale et donc dans l’individu entier. Cela doit per-
mettre non seulement de corriger l’individu traité, mais aussi de lui faire produire des
gamètes porteurs du génotype corrigé qui seront transmis à la descendance. La cor-
rection doit se faire dans une cellule germinale ou de l’embryon précoce ou les cel-
lules sont totipotentes
De nos jours, de nombreux essais géniques se font chez les animaux dans le
but de les transposer un jour chez l’homme. Dans le cas des souris, 10 à 30% des
ufs manipulés donnent des souris vivantes. 40% de ces souris ont reçu le gène
d’intérêt injecté. Le problème à résoudre est que l’ADN injecté s’intègre au hasard,
parfois de manière ectopique dans les chromosomes.
De nos jours, aucune thérapie génique germinale n’a encore été entreprise
chez l’homme. La plupart des fragments d’ADN s’intègrent de façon ectopique dans
tout le génome, ce qui constitue un sérieux handicap pour la thérapie humaine, non
83
seulement à cause des possibles interruptions des gènes, mais aussi parce que
l’allèle muté sera toujours présent dans le génome et pourra ségréguer du transgène
dans les générations futures. Il faudrait mettre au point un système de ciblage grâce
auquel le transgène de type sauvage se substitue au gène défectueux par une re-
combinaison en faisant intervenir un double crossing-over.
Figure IX.3 :La micro-injection du gène dans les cellules embryonnaires
2. La génothérapie somatique
Les figures qui suivent illustrent quelques exemples de thérapie somatique dans
différents mammifères
¢ Ils peuvent provoquer des inversions, des délétions, des mutations chez
l’individu traité.
¢ Ils peuvent aussi rencontrer un autre virus dans l’individu traité, se recom-
biner avec ce dernier et devenir pathogènes
¢ Il se pose également le problème de l’immunogénicité de l’organisme (non
reconnaissance du soi).
Figure IX.4 : Thérapie génique somatique : Utilisation de rétrovirus pour un transfert de
gène
84
3. Vers la génothérapie avec de l'ADN médicament.
On peut aussi fabriquer des leurres pour le virus comme la protéine CD4 so-
luble comportant un signal de rétention intracellulaire pour piéger la protéine gp120
du virus ou même un leurre du RNA viral comportant une pseudo séquence TAR.
Une autre approche consiste à éliminer le virus de la cellule infestée par une
toxine protéique (toxine diphtérique, ricine) dont le gène est placé dans une cons-
truction qui en assure l’expression conditionnelle. Il s’agit dans ce cas d’une bombe
à retardement que le virus active lui même (Une protéine régulatrice TAT).
85
CHAPITRE X :
LES TECHNIQUES DE LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE APPLIQUÉES DANS LA
RECHERCHE THERAPEUTIQUE DU VIH/SIDA
I – STRUCTURE DU VIH
Il a été isolé pour la première fois à l’Institut Pasteur de Paris en 1983. Le VIH-1 est
répandu dans le monde entier tandis que le VIH-2 est essentiellement localisé en Afri-
que. En Afrique subsaharienne on peut trouver chez le même individu une co-
infection : le VIH-1 et le VIH-2 ensemble.
Figure X.2 : Origine du VIH
86
env (enveloppe) code pour des glycoprotéines (gp110 et gp41 issues de
gp 160). La gp 110 est une partie de l'enveloppe responsable de l'interaction avec la
membrane de la cellule cible au niveau du récepteur CD4, permettant la pénétration
du virus. Une autre propriété de l'enveloppe (gp41) est de pouvoir induire la fusion
cellulaire (syncitium) qui est un des éléments cytopathogènes du VIH.
Figure X.3 :gène gag, pol, env
2.- Les INTI et les INNTI sont des inhibiteurs de la transcriptase inverse
Des essais cliniques ont été réalisés sur de nouveaux inhibiteurs de la trans-
criptase reverse : Inhibiteur Nucléosidique de la Transcriptase Inverse (INTI) et Inhi-
biteur Non Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse (INNTI). Les premiers essais
ont montré des résultats intéressants en terme d'efficacité sur la charge virale ou sur
des virus présentant des mutations.
87
4 – classification de quelques molécules antivirales :
Nucléosides : Rétrovir (AZT), Videx (ddI), Hivid (ddC), Epivir (3TC), Zérit (D4T),
Combivir (AZT + 3TC), Ziagen (abacavir).
La majorité des résultats obtenus depuis deux ans soulignent l'intérêt de stra-
tégies vaccinales utilisant des combinaisons d'antigènes de plus en plus complexes,
afin de stimuler les différentes composantes du système immunitaire. Un des pro-
blèmes posés par l'obtention vaccinale de réponses immunitaires contre le VIH est
que ces réponses doivent être dirigées contre des souches de virus très variables.
88
sées pour les vaccins (Lemoine FM et al,1999). Certains vaccins sous-unitaires VIH
induisent cependant une protection chez des chimpanzés et des macaques (Le-
moine FM et al,1999). Ils sont utilisés chez l'homme en rappel (boost), après l'injec-
tion d'un vaccin recombinant vivant (prime, d'où le concept de «prime-boost»).
Ce sont des virus VIH, ou SIV chez le singe, toujours infectieux mais dont le
pouvoir pathogène est diminué. Cette approche, généralement considérée comme
trop dangereuse chez l'homme, suscite beaucoup d'intérêt depuis que plusieurs di-
zaines de médecins américains ont annoncé qu'ils se portaient volontaires pour un
essai de vaccination par un VIH atténué (Lemoine FM et al,1999).
C'est avec des vaccins vivants recombinants (un virus inoffensif auquel on a
ajouté des gènes du VIH) que les essais chez l'homme sont le plus avancés, puis-
qu'un essai de phase II vient de commencer aux États-Unis chez 420 volontaires,
avec une préparation de Pasteur-Mérieux-Connaught. Les vaccins recombinants
utilisent la vaccine ou le canarypox (virus de la variole du canari) exprimant des pro-
téines du VIH. Les premiers vaccins recombinants exprimaient seulement une pro-
téine d'enveloppe. Les préparations actuelles sont porteuses de gènes de plusieurs
protéines d'enveloppe et de protéines internes.
6. ADN nu
89
Au-delà de ces vaccins en perspectives et ces nouveaux médicaments, dont
certains seront prochainement disponibles, les recherches continuent également
dans la direction de la thérapie génique.
On injecte au malade un virus porteur du gène que l'on veut modifier. Ce virus
va s'intégrer au niveau de l'ADN des cellules et insérer le transgène. Les cellules
acquièrent ainsi les nouvelles propriétés conférées par ce gène, par exemple, en
produisant une toxine contre le virus du SIDA.
On injecte au malade des cellules humaines, par exemple, des cellules immu-
nitaires comme les lymphocytes CD4, qui ont été génétiquement modifiées par la
méthode décrite ci-dessus en laboratoire. Ces cellules chimères agissent comme un
médicament en luttant contre la maladie. Elles sont désormais capables de résister
au virus du SIDA et peuvent apporter au malade une immunité contre les infections.
a - L'immunisation intracellulaire :
Tandis que la vaccination protège les sujets non infectés de l'infection, l'im-
munisation intracellulaire confère une protection contre un virus à l'échelon cellulaire
chez des sujets infectés. Le principe est simple : il s'agit de modifier la structure gé-
nétique des cellules cibles du VIH (les lymphocytes CD4) afin que celles-ci soient
90
protégées du virus. Plusieurs techniques sont utilisées. La cellules modifiée se met
alors à produire des mutants « transdominants » de protéines virales, des « leurres
ARN » qui miment l’ARN viral, des « molécules antisens » de séquences nucléotidi-
ques. Tous ces éléments générés par la biotechnologie peuvent tromper le VIH ou le
bloquer ou alors rivaliser avec lui dans la recherche des substrats. L'intérêt de l'im-
munisation intracellulaire est qu'elle bloque bien la réplication du virus à l'intérieur
de la cellule.
Certaines protéines sécrétées naturellement par les lymphocytes ont des pro-
priétés anti-VIH. L'opération consiste à introduire dans l'organisme un gène qui va
produire une quantité élevée de ces protéines. Ce gène peut être implanté de ma-
nière ectopique dans les hépatocytes, via un virus modifié qui est capable d'implan-
ter le transgène. Les chercheurs peuvent aussi utiliser d’autres méthodes comme
"cultiver" des cellules modifiées génétiquement, des fibroblastes de souris, les en-
tourer d'une membrane inerte de collagène pour qu'elles soient "invisibles" par le
système de défense immunitaire du patient, puis les transférer chez le patient atteint
par le VIH. Ces cellules enveloppées et protégées se mettent alors à produire les
protéines anti-VIH (Moullier P, et al. 1993).
d - La pharmacomodulation génétique :
e - L'immunothérapie génétique :
91
duction dans l'organisme de cellules génétiquement modifiées, des cellules dendriti-
ques (DC) ou autres qui sont capables de "mimer" le virus du SIDA pour activer une
réponse du système de défense immunitaire de l'organisme. En effet, les DC sont
capables d'apprêter les protéines sous forme de peptides antigéniques et de les pré-
senter soit aux lymphocytes T CD4+ par le complexe majeur d'histocompatibilité de
classe II (CMH II), soit aux lymphocytes T CD8+ via le CMH I (Lemoine FM et al.
1999). Lors de l'infection par le VIH, l'organisme n'est pas capable de se défendre
tout seul car le virus n'est pas reconnaissable suffisamment longtemps pour que des
anticorps efficaces puissent être produits. L'immunothérapie génétique permet de
présenter aux lymphocytes des "morceaux du virus" facilement reconnaissables pour
que, en s'attaquant à ces "morceaux", les lymphocytes détruisent les virus. Il s'agit
là, bel et bien, d'une sorte de "vaccination" avec des cellules génétiquement modi-
fiées.
Immunogénétique Reverse
Nous avons :
- la génétique directe:
du phénotype, à partir de la configuration de la protéine, on remonte au gène qui a
spécifiée cette séquence peptidique.
- la génétique reverse:
De l’ADN, du gènes spécifique on cherche à découvrir la protéine codée, synthéti-
sée.
* Les défis d’élaboration des épitopes CTL du VIH spécifique par la technique de
l’immunogénétique reverse:
- variabilité génétique du VIH,
- polymorphismes alléliques des populations ciblées,
92
1) La variabilité génétique du VIH,
2) La base génétique humaine de la distribution des allèles du système HLA de la
population ciblée
Nous trouvons des donnés sur la variabilité génétiques et la distribution des allèles
du systèmes HLA des populations de l’Afrique de l’Ouest dans le dépôt du Gene
Bank. Connaissance des fréquences des allèles du système HLA de classe I et de
classe II au sein des populations ciblées ( Burkina Faso).
A - Historique :
En 1902 Archibald Garrod, médecin anglais appliquait pour la première fois
les lois de Grégoire Mendel à la transmission des maladies héréditaires de l’homme.
Il émit comme hypothèse selon laquelle les facteurs héréditaires (les gènes) contrô-
leraient certaines réactions métaboliques. Successivement il théorisait la nature in-
dividuelle (due à la variabilité et à la spécificité chimique des processus
métaboliques) de toutes les réponses de l’organisme au regard des éléments
étrangers, les agents pathologiques, les aliments ou les médicaments.
Au moment où les recherches fondamentales explicitaient les mécanismes
biochimiques et genetico-moléculaires associés aux pathologies héréditaires, Linus
Pauling en 1949 démontrait que l’anémie falciforme, la drépanocytose, « sick cell »
est une maladie due à une anomalie structurale de la molécule de l’hémoglobine.
Par la suite les chercheurs démontrèrent que cette anomalie structurelle protéique
correspondait à une altération de l’information génétique codée dans l’ADN. C’est à
ce moment qu’ils découvrirent aussi les premiers exemples d’hérédité de certaines
réactions anormales aux médicaments. Le premier exemple est la réaction d’anémie
hémolytique inattendue des soldats américains d’origine africaine, après la prise de
la primaquine, un médicament antimalarique. L’étude moléculaire permit de décou-
vrir chez les personnes qui ne tolèrent pas la primaquine le déficit enzymatique de la
G6PD (Glucose 6 phosphate déshydrogénase). L’étude fondamentale génétique de
93
la susceptibilité individuelle à réagir de manière anormale avec des conséquences
destructives après l’absorption de médicaments, fut appelée, en 1959, pharmacogé-
nétique.
A partir des années 70, les études de pharmacogénétique commencèrent à
montrer que la variabilité individuelle dans le métabolisme des médicaments peut
dépendre non seulement de variations d’un seul gène avec ses allèles mais aussi
de l’interaction de plusieurs gènes mutés dans l’organisme. C’est ainsi qu’à partir
des année 90, les chercheurs émirent le concept de pharmacogénomique pour ex-
pliquer la variabilité individuelle dans la réponse aux médicaments utilisant des
techniques qui permettent d’évaluer l’expression et l’action de plusieurs gènes.
1 - Rechercher les gènes qui codent pour les enzymes de transformation des médi-
caments.
2 - Élaborer des tests qui montrent que le patient qui doit prendre tel médicament
possède les enzymes de transformation nécessaires.
3 - Tester directement l'activité des enzymes de transformation des médicaments :
des tests devraient se développer de plus en plus pour étudier, à l'avance, la façon
dont chaque individu va transformer puis éliminer tel ou tel médicament.
4 - Déterminer les doses de médicaments à utiliser chez les enfants ou les person-
nes âgées. En effet, la synthèse des enzymes de transformation des médicaments et
leur activité évoluent en fonction de l'âge. Certaines de ces enzymes ne sont pas
encore "matures" chez des enfants ; par contre, chez les personnes âgées, certai-
nes enzymes peuvent avoir une activité réduite.
5 - Identifier pour tous les nouveaux médicaments, les enzymes de transformation
impliquées. La pharmacogénétique représente donc aujourd'hui une composante
importante dans le développement d'un nouveau médicament.
94
C - Pharmacogénétique : Les liens entre les enzymes de transformation
des médicaments et les cancers ?
Afin de mieux combiner les médicaments les uns avec les autres, les personnes
sous traitement peuvent prendre plusieurs médicaments en même temps, pour trai-
ter différentes maladies. Parfois, certaines enzymes de transformation modifient plu-
sieurs médicaments et il peut alors se poser des problèmes de compétition,
d’inhibition ou d’interaction médicamenteuse. Il est important de connaître quels sont
les médicaments qui interagissent les uns avec les autres pour éviter de les combi-
ner.
95
cellules cibles.
* On peut encore citer des enzymes de détoxication (appelées transférases) qui sont
présentes en quantité variable d'une personne à l'autre. Elles agissent principale-
ment en rendant solubles certaines substances chimiques pour qu'elles soient en-
suite éliminées par le foie et/ou les reins.
96
Les études au niveau des jumeaux comparent les réactions à l’intérieur des
groupes de jumeaux homozygotes et des jumeaux hétérozygotes. Les jumeaux ho-
mozygotes tendent à avoir un profil pharmacogénétique très similaires par rapport à
un type de médicament ; tandis que les jumeaux hétérozygotes présentent des va-
riations énormes comparables aux individus consanguins. Au niveau des jumeaux,
le paramètre qui détermine la pharmacocinétique d’un médicament déterminé, la
demie-vie plasmatique et la contribution de l’hérédité est le coefficient de l’Hérédité
qui s’exprime par l’équation :
h2 = (Vd-Vm)
-----------
Vd
La valeur de h peut varier entre 0 (dans le cas où la contribution génétique est insuf-
fisante ou nulle) à un (dans le cas où l’influence génétique est déterminante).
Dans le cas de la dicoumarole, la phénylbutazone, l’halothane et la nortriptyline, le
coefficient d’hérédité varie entre 0,88 et 0,98.
Exemples de désordres pharmacogénétiques :
97
de l’insuline Activité antidiabétique
Réduction de la synthèse 6-mercaptopurine azathio- Absence
du HGPRT prine Activité antitumorale
Activité immunosupressive
Les désordres pharmacogénétiques peuvent être classés selon la base des caracté-
ristiques cliniques des réponses idiosyncrasiques et aux altérations génétiques qui
sont à leur origine. Selon ce critère, les réactions idiosyncrasiques peuvent consis-
ter dans l’apparition des effets toxiques ou imprévisibles, ou alors en un manque
d’effet thérapeutique attendu.
La pharmacogénétique est la discipline qui décrit les réponses inusuelles aux
médicaments (idiosyncrasie) sur la base de mécanismes héréditaires. Les variations
interindividuelles de la réponse aux médicaments sont d'observation fréquente, cer-
tains malades ne répondant pas à des doses habituelles, voire élevées, de médica-
ments, tandis que d'autres présentent des accidents de surdosage. De nombreux
facteurs sont connus pour retentir sur la susceptibilité individuelle ; sans compter de
l'observance et des variations liées à l'observateur, ils peuvent être en rapport avec
le malade lui-même (facteurs intrinsèques) : âge, pathologie(s), statut hormonal,
compétence immunologique, génotype, enzymes, ou dépendre de conditions exté-
rieures (facteurs extrinsèques) : variations nycthémérales, facteurs environnemen-
taux, état nutritionnel, consommation d'alcool ou de tabac, stress, activité physique,
en représentent des exemples. Enfin lors d'administrations concomitantes, les inte-
ractions médicamenteuses constituent un dernier volet. La connaissance de ces fac-
teurs de variation peut aider à corriger un schéma posologique pour l'adapter à cha-
que sujet afin d’éviter les phénomènes toxiques et imprévisibles.
1 - Au niveau de la résorption
2 - Au niveau de la métabolisation
98
le mode autosomique récessif. Pour une posologie standard les risques d'apparition
d'effets indésirables par surdosage, en particulier neurologiques, sont plus élevés
chez les acétylateurs lents ; mais en revanche chez les acétylateurs rapides la pro-
duction plus importante, in situ, d'un métabolite hépatotoxique majorerait le risque
d'hépatite.
Isoniazidémie à la 3è H + 0,6
--------------------------------------
Dose administrée (mg/kg/j)
Fréq.
24
Leats (r/r)
20
16
12
99
0
0 2 4 6 8 10 12
100
P450 II D6 ; en particulier ce polymorphisme est observé pour les bêta-bloquants,
les antiarythmiques, les neuroleptiques, la plupart des antidépresseurs tricycliques
et les inhibiteurs de la recapture de la sérotonine. Ce test a servi dans de nombreu-
ses études visant à rechercher une susceptibilité particulière à des médicaments ou
des toxiques pouvant servir de support à l'apparition d'effets indésirables ou de cer-
taines pathologies d'étiologie mal connues. Différents autres tests se sont dévelop-
pés, tests au dextrométhorphan, à la sparteïne, à la caféine pour explorer cette
même voie métabolique. Mais il existe également d'autres polymorphismes d'oxyda-
tion indépendants de la voie suivie par la débrisoquine.
101
vité est impliquée dans le métabolisme de la l-dopa et de l'α-méthyldopa. Des inhibi-
teurs de la COMT sont à l'étude dans le traitement de la maladie de Parkinson.
102
sence du G6PD et en présence d'un oxydant, l'hémoglobine est dénaturée et préci-
pite sous la forme de corps de Heinz. Les hématies fragilisées sont exposées au
risque de crise hémolytique. Les deux principaux variants (G6PDA- et G6PDA+) af-
fectent les Noirs Américains, les populations Méditerranéennes et les africains où
l'hémolyse est la plus sévère. Il est à noter que l'activité de la G6PD est toujours
faible chez le nouveau-né, le rendant sensible au risque hémolytique. Ce déficit ne
s'exprime qu'en présence d'un xéno biotique oxydant qui peut être un aliment (fève)
ou un médicament. La transmission est liée au sexe.
Les porteurs hétérozygotes sont plus résistants à l'infection par Plasmodium falcipa-
rum, ce qui expliquerait la conservation du gène dans la population.
Nitofuranes : Sulfones:
nitrofurantoine diaminodimetylsulfone
nitrofurasone thiazolsulfone
Sulfamides: Autres:
sulfacetamide, bleu de méthylène
103
sulfamotoxazole acide ascorbique
sulfanilamide, sulfapiridine phenylhydrazine
probénécide
104
Des modifications de l'affinité d'un récepteur peuvent également expliquer
une variabilité de l'action de certaines molécules et en particulier rendre compte de
la résistance à un médicament.
105
les différents tests de phénotypages disponsibles représentent une aide spécialisée
à la thérapeutique. Ces notions s'intègrent au développement du médicament ; les
essais cliniques de phase I et II s'efforcent de maîtriser ces facteurs de variation.
BIBLIOGRAPHIE ET REFERENCES
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agroalimentaire, Office Parlementaire des choix scientifiques et technologiques, Assemblée Natio-
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