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Département de Biologie
Exposé sur
1
République Algérienne Démocratique et Populaire
Département de Biologie
Exposé sur
2
ANNEE UNIVERSITAIRE 2009/2010
Sommaire
Introduction……………………………………………………………...………………………………...6
2.3.2. Dosage total des composés phénoliques par le réactif de Folin Ciocalteu……....... 23
- La technique au butanol-HCl…...…………………………………...……………………………25
- La technique à la vanilline…………………………………………………………………………. 25
3
- Précipitation des tannins condensés par le formaldéhyde…...………………………...…….26
- Par la rhodadine...…………………………………………………………………………………….27
- La technique au NaNO2/HCl………………………………...…………………………….….…….29
2.3.2.2. Les séparations par CHLP et par électrophorèse capillaire et les couplages
CHLP/UV et CHLP/spectrométrie de masse…………………………………………..……34
Conclusion………………………………………………………………………………………………..35
Références bibliographiques…………………………..……………………………………..…….…36
4
Liste des figures
5
Introduction
Une des originalités majeures des végétaux, réside dans leur capacité à produire des
substances naturelles très diversifiées. En effet, à coté des métabolites primaires
classiques (glucides, protides, lipides, acides nucléiques), ils accumulent fréquemment
des métabolites dits secondaires dont la fonction physiologique n’est pas toujours
évidente, mais qui représentent une source importante de molécules utilisables par
l’homme dans des domaines aussi différents que la pharmacologie ou l’agroalimentaire.
Plusieurs ouvrages ont été consacrés ces quarante dernières années aux méthodes
d’analyse de ces composés phénoliques, permettant de mettre en évidence à la fois les
principales techniques modernes utilisées et les principaux résultats quant au dosage,
caractérisation et identification de ces composés. Ces nombreuses techniques ont permis
de confirmer et de préciser l’importance des composés phénoliques dans certaines
technologies liées aux activités humaines, dans les domaines industriels, de
l’environnement et de la santé humaine.
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Dans ce présent document, nous traiterons essentiellement les principales méthodes
d’étude les fréquemment utilisées, à savoir, les techniques de dosage, d’identification et
de caractérisation des composés phénoliques d’origine végétale.
Dans la nature, la synthèse du noyau aromatique est le fait des seuls végétaux et micro-
organismes. Les organismes animaux sont en effet presque toujours tributaires, soit de
leur alimentation, soit d’une symbiose, pour élaborer les métabolites qui leur sont
indispensables (Bruneton, 1993) et qui comportent cet élément structural (aminoacides,
vitamines, pigments, toxines…etc.).
- par la complexité du squelette de base (allant d’un simple C6 à des formes très
polymérisés),
7
- et enfin par les liaisons possibles de ces molécules de bases avec d’autres molécules
(glucides, lipides, protéines, autres métabolites, secondaires pouvant être ou non des
composées phénoliques…).
Il est impossible de rendre compte d’une manière exhaustive dans un espace restreint de
la complexité des différents composés phénoliques présents chez les végétaux. Nous nous
intéressons donc essentiellement à la structure chimique des flavonoïdes et des tannins.
1.1.Les flavonoïdes
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Figure.2 : Squelette moléculaire de base des flavonoïdes avec la numérotation classique
(Stalikas, 2007).
C’est la structure de l’hétérocycle central et son degré d’oxydation (figure.3) qui
permettent de distinguer les différentes classes des flavonoïdes.
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Figure.3 : Les principales classes de flavonoïdes. Un (ou deux) exemple(s) précis a été
donné dans chacun des cas (Macheix et al., 2005).
Le cas extrême d’oxydation de l’hétérocycle central correspond aux anthocyanidines
(figure.3), toujours présentes en milieu acide sous forme d’un cation de couleur rouge, dit
cation flavylium. Au contraire, dans le cas des flavanes (flavane-3-ols comme la
catéchine ; flavane-3,4-diols quelquefois dénommés leucoanthocyanes car ils peuvent
donner des anthocyanes rouge sous l’action d’un acide), le cycle central est fortement
réduit (Vermerris and Nicholson, 2006).
On trouve des situations intermédiaires chez les flavanones, les flavones, les flavonols et
d’autres groupes. Exceptionnellement, le noyau central de la molécule peut ne pas être
totalement cyclisés, cas des chalcones et molécules voisines (figure.3), ou se présenter
sous forme d’un cycle ne présentant que cinq sommets, cas des aurones de couleur
généralement jaune vif (Macheix et al., 2005).
A l’intérieur de chacune des classes, les variations autour du squelette chimique de base
en C15 portant principalement sur trois points (Macheix et al., 2005):
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A. Au contraire, chez les anthocyanes, en plus de la position 3, c’est préférentiellement
la position 5 qui est glycosylée (Grotewold, 2006).
Tableau.2 : les principales anthocyanidines des végétaux (Macheix et al., 2005).
La nature des sucres se liant aux flavonoïdes est variée, allant de la plupart des oses
(glucose, galactose, arabinose, rhamnose…) à des disaccharides ou de formes plus
complexes. Pour la seule quercétine, on connaît au moins sept dérivés en position 3 et au
total plus de 80 formes glycosylées. Des cas extrêmes montrent jusqu'à 5 positions de
glycosylations sur le même squelette de flavonoïde, y compris sur le cycle B (Grotewold,
2006).
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anthocyanes acylés puissent s’associer entre elles, ce qui permet à la fois leur stabilisation
dans l’eau et une forte augmentation de leur couleur (Brouillard et al., 1997).
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1.2. Les tannins
Historiquement, l’importance des drogues à tannins est liée à leurs propriétés tannantes,
c'est-à-dire à la propriété qu’ils ont de transformer la peau fraiche en un matériau
imputrescibles : le cuir. La résultante du tannage est l’établissement de liaisons entre les
fibres de collagène de la peau, ce qui confère à cette dernière une résistance à l’eau, à la
chaleur et à l’abrasion (Bruneton, 1993).
Cette aptitude des tannins à se combiner aux macromolécules explique qu’ils précipitent la
cellulose, les pectines, les protéines ; elle explique également leur astringence, cette âpreté
caractéristique : en précipitant les glycoprotéines que contient la salive, les tannins font
perdre à celle-ci son pouvoir lubrifiant (Bruneton, 1993).
Selon la nature des constituants impliqués et selon le type de condensation, les tannins sont
des composés plus en moins complexes pouvant encore présenter une hydrosolubilité
suffisante pour être présents dans la vacuole.
Il est classique de distinguer deux grands groupes de tannins différents à la fois par leur
réactivité chimique et par leur composition (Bruneton, 1993): les tannins hydrolysables et les
tannins condensés.
Ils sont abondants chez les dicotylédones et certains arbres en sont des sources industrielles :
tannins de chêne, châtaigner, tannins de Chine ou de Turquie extraits respectivement d’un
arbuste du genre Rhus ou de Quercus tinctoria (Quideau, 2009).
Ils sont d’abord caractérisés par le fait qu’ils peuvent être dégradés par hydrolyse chimique
(alcaline ou acide) ou enzymatique (Quideau, 2009). Ils libèrent alors une partie non
phénolique (souvent du glucose ou de l’acide quinique) et une partie phénolique qui peut être
de l’acide gallique (cas des gallotannins comme le tannin de chine, quelque fois appelé acide
tannique), soit un dimère de ce même acide, l’acide éllagique (cas des tannins ellagiques ou
ellagitannins comme ceux du châtaigner).
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1.2.2. Les tannins condensés
Ainsi, par traitement acide à chaud, ils se transforment en pigments rouges et, pour cette
raison, les formes dimères ou oligomères sont dénommées proanthocyanidines. Les
proanthocyanidines dimères présentent déjà une affinité pour les protéines et des
propriétés tannantes, mais ces deux paramètres augmentent avec la taille moléculaire des
polymères qui sont formés par adjonction de nouveaux monomères aux dimères initiaux
(Macheix et al., 2005).
L’enchainement des différentes unités constitutives se fait soit de manière linéaire grâce à
des liaisons C-C, soit par des ramifications grâce à des liaisons C-O-C conduisant à des
structures de plus en plus complexes qui restent cependant solubles dans l’eau des
vacuoles (figure.6).
Les tannins condensés sont très abondants dans certains organes végétaux, consommés ou
utilisés par l‘homme, par exemple de nombreux fruits (pomme, prune, fraise…) et des
boissons fermentés ou non (thé, cidre…). Dans tous les cas, la matière première végétale
de part, les traitements technologiques et les conditions de conservation du produit
influencent fortement la capacité tannante donc ses propriétés organoleptiques (Macheix
et
al.
,
2005).
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Figure.5 : Deux exemples de tannins hydrolysables (Macheix et al., 2005).
15
2. Méthodes d’étude des composés phénoliques
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2.2. Méthodes d’extraction des composés phénoliques
L’objectif de l’extraction est de libérer les composés phénoliques présents dans des
structures vacuolaires par rupture du tissu végétal et par diffusion. La présence d’un ou de
plusieurs cycles benzéniques hydroxylés chez tous les composés phénoliques est
responsable de certaines propriétés communes utilisées pour les extraire à partir du
matériel végétal. Cependant, il faut noter que ces propriétés peuvent s’exprimer
différemment selon la complexité de la molécule concernée, et le nombre de groupement
hydroxyles portés par chacun des cycles benzéniques.
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La plupart des phénols simples présents dans la vacuole peuvent aisément être extraits par
des alcools comme le méthanol, éthanol, et l’acétone (figure.7). Cependant, les acides
phénoliques extrêmement polaires (acide benzoïque, cinnamique) peuvent ne pas être
entièrement extraits par ces solvants organiques pures, des mixtures d’alcool-eau ou
acétone-eau sont recommandées. Les solvants les plus apolaires (dichlorométhane,
chloroforme, hexane, benzène) conviennent à l’extraction des composés superflus non
polaires (les huiles et la chlorophylle), ou de certains flavonoïdes apolaires, par exemple
ceux liés aux stérols, ou ceux présents dans les exsudats de bourgeons ou sur les tissus
externes foliaires (Vermerris and Nicholson, 2006).
Comme les polyphénols sont facilement oxydables, il est recommandé de travailler à une
température de 0 à 4˚C, et d’assurer une protection en ajoutant un agent réducteur (acide
ascorbique ou métabisulfite de soduim) au milieu d’extraction. L’adjonction d’un
inhibiteur des glucosidases, enzymes pouvant encore fonctionner en milieu alcoolique ou
acétonique, permet par ailleurs d’éviter l’hydrolyse d’hétérosides phénoliques fragiles
lors de l’extraction (Macheix et al., 2005).
Dans les cas extrêmes comme celui de la lignine, l’extraction n’est possible qu’après
dégradation oxydative (par exemple sous l’effet du peroxyde d’hydrogène) qui va
entrainer une dépolymérisation et une solubilisation progressive. Il est alors bien évident
que les analyses ne portent plus sur les composés natifs, mais sur leurs produits de
dégradation (Macheix et al., 2005).
Après l’élimination de l’alcool par évaporation sous vide, il est ensuite nécessaire de
purifier l’extrait global ainsi obtenu, d’abord en éliminant les pigments chlorophylliens et
caroténoïdes (extraction à l’éther de pétrole), puis en extrayant les composés phénoliques
avec un solvant de polarité intermédiaire comme l’acétate d’éthyle. La plupart des
phénols se retrouvent alors ce solvant, qu’il est ensuite aisé d’éliminer sous vide afin de
transférer finalement dans le méthanol, la fraction phénolique correctement purifiée.
Cette fraction sera ensuite utilisée pour des analyses qualitatives et quantitatives
(Vermerris and Nicholson, 2006).
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Ainsi, bien que le schéma général des différentes étapes d’extraction, de caractérisation,
et de dosage (figure.7) soit valable pour la majorité des composés phénoliques, il devra
quelque fois être modifié pour être mieux adapté à leur nature chimique, leur solubilité, et
leur degré de liaison avec d’autres constituants végétaux.
Si en règle générale, les hétérosides sont hydrosolubles et solubles dans les alcools, bon
nombre d’entre eux ont une hypersolubilité plutôt faible (rutoside, hespéridoside…). Les
génines sont, pour la plupart, solubles dans les solvants organiques apolaires ;
lorsqu’elles ont en moins un groupe phénolique libre, elles se dissolvent dans les
solutions d’hydroxydes alcalins (Grotewold, 2006).
Les flavonoïdes lipophiles des tissus superficiels (Bruneton, 1993) des feuilles (ou des
frondes) sont directement extraits par des solvants moyennement polaires
(dichlorométhane…) ; il conviendra de les séparer ensuite des cires et des graisses
extraites simultanément (on peut certes laver au méthane mais la sélectivité de ce solvant
n’est pas absolue).
Les hétérosides peuvent être extraits, le plus souvent à chaud, par de l’acétone ou par des
alcools (éthanol, méthanol) additionnés d’eau (20 à 50% selon la drogue est fraiche ou
sèche). Il est possible de procéder ensuite à une évaporation sous vide et, lorsque le
milieu ne contient plus que de l’eau, de mettre en œuvre une série d’extractions liquide-
liquide par des solvants non miscibles à l’eau : par de l’éther de pétrole qui élimine
chlorophylle et lipides ; par du diéthylether qui extrait les génines libres ; par de l’acétate
d’éthyle qui entraine la majorité des hétérosides. Les sucres libres restent dans la phase
aqueuse avec, le cas échéant, les hétérosides les plus polaires (Markham and Bloor,
1998).
Les anthocyanosides sont solubles dans l’eau et les alcools, insolubles dans les solvants
organiques apolaires. L’extraction est, classiquement, réalisée par un alcool (méthanol,
éthanol) additionné d’une faible quantité (0.1-1%) d’acide chlorhydrique. Pour éviter
l’estérification du carboxyle libre des anthocyanidines acylés par un diacide, et surtout
pour empêcher leur désacylation, il convient d’utiliser préférentiellement d’autres acides
(acétique, tartrique…) et d’opérer à basse température. Les solutions d’anthocyanidines
sont très instables et ne peuvent être conservés que sous atmosphère inerte, au froid et à
l’abri de la lumière (Grotewold, 2006).
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2.2.2. Solubilité et extraction des tannins
Les tannins se dissolvent dans l’eau sous forme de solutions colloïdales, mais leur
solubilité varie selon le degré de polymérisation. Ils sont solubles dans les alcools et
acétone. Les solutions aqueuses ont une stabilité variable selon la structure, généralement
modérée. Ainsi, lors de extraction par de l’eau bouillante (exemple dans les conditions
d’une décoction) un tannin comme la géraniine est décomposé en 30 minutes en acide
gallique, acide ellagique, et corilagine (=1-galloyl 3,5- acide hexahydroxydiphénique
glucose).
Les formes dimères et oligomères des esters galliques et HHDP du glucose sont
également assez instables. Comme tous les phénols les tannins réagissent avec le chlorure
ferrique ; ils sont précipités de leurs solutions aqueuses par les sels de métaux lourds et
par la gélatine (Bruneton, 1993).
L’extraction des tanins est, en règle générale, réalisée par un mélange d’eau et d’acétone
(on évite le méthanol qui provoque la méthanolyse des depsides galliques). Un rendement
optimal est obtenu avec les tissus frais ou conservés par congélation ou lyophilisation car,
dans les drogues sèches, une partie des tannins est irréversiblement combinée à d’autres
polymères. Après élimination de l’acétone par distillation, la solution aqueuse est
débarrassées des pigments et des lipides par un solvant (ex : dichlorométhane). Une
extraction de cette solution aqueuse par l’acétate d’éthyle permet de séparer les
proanthocyanidols dimères et la plupart des tannins galliques. Les proanthocyanidols
polymères et les tannins galliques de masse moléculaire élevée restent dans la phase
aqueuse (Bruneton, 1993).
Plusieurs ouvrages ont été consacrés aux méthodes d’analyse des composés phénoliques
des végétaux. Chaque groupe important de composé phénolique, y compris ceux des
tannins, y est traité par un spécialiste, ce qui a permis de mettre en évidence à la fois les
principales techniques modernes utilisées et les principaux résultats quant à l’analyse et
au dosage de ces composés. La quasi-totalité des publications scientifiques concernant les
composés phénoliques font appel à une ou plusieurs de ces techniques, et il est tout a fait
impossible de les rappeler ici dans le détail.
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2.3.1. Caractérisation et dosage des composés phénoliques par leurs spectres
d’absorption en ultra violet ou en lumière visible
Le dosage des composés phénoliques utilise très fréquemment leur spectre d’absorption,
soit dans le visible pour les anthocyanes, soit dans l’UV pour la plupart des autres
composés, en choisissant pour chacun d’eux la longueur d’onde d’absorption maximale
(Geirer, 1985). C’est sur ce principe que fonctionnent la plupart des détecteurs qui
équipent les appareils de chromatographie, qu’il s’agisse de chromatographie classique
sur colonne ou de chromatographie liquide à hautes performance. La concentration du
composé phénolique en solution est déduite en utilisant la loi classique de Beer-Lambert
qui lie cette concentration C en mol/L à densité optique DO mesurée sur le spectre
d’absorption :
DO = C d
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Figure.8 : Spectres d’absorption de l’acide chlorogénique, de la (+)-catéchine et de la
quercétine en lumière UV (Macheix et al., 2005).
Pour un squelette chimique donné, par exemple celui des flavonoïdes, les variations des
spectres d’absorption sont en fonction des modifications chimiques : hydroxylation,
méthylation, glycosylation, et condensation avec d’autres molécules, phénoliques ou non.
De plus, les caractéristiques physicochimiques du milieu sont également des causes de
modifications profondes des spectres d’absorptions : pH, teneurs en métaux, interférence
avec d’autres composés (Grotewold, 2006).
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2.3.2. Dosage total des composés phénoliques
Folin et Denis ont rapporté sur une méthode colorimétrique de détection des acides
aminés tyrosines dans des hydrolysats de protéines (Folin and Denis, 1915). Cette
technique repose sur la réduction du mélange phosphotungstiate (WO42-)-
phosphomolybdate (MoO4 2-) par les groupements hydroxyle phénoliques des tyrosines,
conduisant à la formation de complexes colorés bleu que l’on peut alors doser par
colorimétrie en utilisant le spectrophotomètre.
Cette méthode a été modifiée par Folin et Ciocalteu. La modification consiste par
l’addition du sulfate de lithium et de brome au réactif phosphotungstate
phosphomolybdate à la fin de la période d’ébullition, suivie par un refroidissement et une
dilution. L’addition du lithium prévient la formation du précipité qui peut interférer dans
la quantification de l’intensité de la coloration (Folin and Ciocalteu, 1927).
Le réactif qui en résulte, dénommé ainsi Folin-Ciocalteu, est utilisé pour déterminer la
quantité des tyrosines et tryptophanes présente dans les hydrolysats de protéines, mais
également celle des phénols dans une large gamme de sources. Le protocol de cette
méthode est comme suit (Vermerris and Nicholson, 2006) :
1. Diluer un aliquote d’échantillon 10:1 avec l’eau (9 parts d’eau pour une part
d’échantillon). Ceci n’est pas nécessaire si la quantité de phénols est faible.
2. Ajouter 2 ml de la préparation fraiche 2% (w/v) du carbonate de sodium (anhydre) à
0.1 ml de l’extrait (dilué si nécessaire).
3. Mixer vigoureusement au Vortex.
4. Laisser 5 min à part.
5. Pendant le mélange au Vortex ajouter 0.1 ml d’une dilution 1:1 du réactif de Folin-
Ciocalteu.
6. Laisser l’échantillon au minimum 30 minutes, sans pour autant dépasser une heure.
7. Lire l’absorbance au spectrophotomètre à 750 nm.
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La méthode colorimétrique basée sur le protocole développé par Folin et Ciocalteu
permet de déterminer la concentration des composés phénoliques solubles, tel que les
anthocyanidines, ainsi que celle des composés phénoliques complexes tel que les tannins
condensés et hydrolysables (Vermerris and Nicholson, 2006).
Cette méthode est très sensible mais malheureusement peu spécifique, car beaucoup
d’autres composés réducteurs peuvent interférer, en particulier l’acide ascorbique. Il est
donc vivement recommandé de ne l’utiliser que sur des extraits suffisamment purifiés, et
de réaliser des témoins négatifs (Vermerris and Nicholson, 2006), par exemple à l’aide
d’un deuxième dosage après avoir enlevé les phénols de l’extrait (par adsorption sur du
polyvinylpyrrolidonne insoluble). Par différence, on peut avoir alors une bonne
approximation de la teneur de l’extrait en phénols que l'on exprime alors à un composé de
référence (par exemple en équivalents d’acide chlorogénique, ou gallique).
La valeur obtenue n’en est pas pour autant très satisfaisante, car elle reste très globale et
ne donne aucune indication sur les différents composés présents dans l’échantillon, en
sachant que chacun d’entre eux peut réagir de manière différente dans la réaction colorée
(Macheix et al., 2005 ; Grotewold , 2006).
Dans les quelques rares cas où un composé phénolique est très fortement majoritaire dans
un matériel végétal donné (par exemple l’acide chlorogénique du tubercule de pomme de
terre, les acides hydoxycinnamiques des feuilles de pécher, les anthocyanidines du raisin
rouge), on peut avoir une estimation approximative et rapide de la teneur du matériel à
partir du spectre d’absorption (en UV ou dans le visible) de l’extrait global. Mais, en
dehors de ces exceptions, il est impossible de tirer des conclusions qualitatives et
quantitatives précises de la seule étude du spectre d’absorption d’un extrait global de
végétal (Macheix et al., 2005).
La teneur totale en flavonoïdes des extraits végétaux peut être estimée par la méthode du
trichloride d’aluminium (AlCl3). La quercétine est utilisée comme composé de référence
afin de réaliser la courbe d’étalonnage (Vermerris and Nicholson, 2006). 10 mg de
quercétine sont dissoutes dans 80% d’éthanol et diluée en 25, 50 et 100 μg/ml. Les
solutions standards diluées (0.5 ml) sont séparément mélangés avec 1.5 ml de 95%
éthanol, 0.1 ml de 10% trichloride d’aluminium, 0.1 ml de 1M d’acétate de potassium et
2.8 ml de l’eau distillé.
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2.3.4. Dosage des tannins
La technique au butanol-HCl
Cette technique est une méthode colorimétrique qui implique le clivage oxydatif des
proanthocyanidines au sulfate ferreux. Au 0.5 ml de l’extrait aqueux de la plante est
ajouté 5ml de la solution acide du sulfate ferreux (77 mg de FeSO 4.7H2O dissoute dans
500 ml de 2:3 HCl/n-butanol). Les tubes sont couverts et placer dans un bain marie à
95°C pour 15 min. L’absorbance est déterminé à 530 nm.
La technique à la vanilline
Cette technique est une méthode colorimétrique alternative qui repose sur des réactions
avec la vanilline sous des conditions acides. 2 ml d’aliquote de la solution de vanilline
fraichement préparés (1g/100 ml) dans 70% d’acide sulfurique sont ajoutées à 1 ml de
l’extrait aqueux de la plante. Le mélange est incubé 20°C au bain marie et après
exactement 15 min. L’absorbance est déterminée à 500 nm.
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Cette troisième technique a pour but de précipiter les proanthocyanidines de l’extrait par
le formaldéhyde. En premier lieu, la quantité totale des composés phénoliques est
déterminée en utilisant le réactif Folin-Ciocalteu décrit auparavant. Un demi d’équivalent
molaire du phloroglucinol est ajouté à tous les équivalents d’acide gallique de l’extrait. 2
ml du mélange de l’extrait végétal/phloroglucinol sont ajoutées à 1 ml de la solution 2:5
HCl /H2O, et à 1 ml de la solution aqueuse du formaldéhyde (13 ml de 37% du
formaldéhyde dilué dans 100 ml d’eau).
Après une incubation d’une nuit à température ambiante, les composés phénoliques non
précipités sont estimés dans le surnageant par la méthode Folin-Ciocalteu. Le précipité
contient les proanthocyanidines et une quantité inconnue du phloroglucinol, qui peut
toujours être précipité quantitativement (Vermerris and Nicholson, 2006).
Par la rhodanine
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Malgré les changements réalisés par Bate-Smith du protocole original, la sensibilité au
temps et à la température de la technique à l’iodate, aussi bien que la réactivité croisée
avec les éllagitannins, ont un impact négatif sur la reproductibilité de la méthode. Inoue
et Hagerman ont développé la méthode à la Rhodanine (2-thio-4-ketothiazolidine) qui
réagie avec les groupements hydroxyle vicinales des acides galliques pour produire à la
fin un complexe rouge détecté spectrophotométriquement à 520 nm (figure.9).
Cette réaction est spécifique à l’acide gallique, et peut être ainsi utilisée pour la
détection des gallotannins. Ceci requière une hydrolyse des gallotannins avant la réaction
à la rhodanine. Les tannins sont extraits à partir des plantes dans 1 ml 70% (w/v)
d’acétone/eau par 100 mg de matière sèche via la centrifugeuse à 4°C. L’extrait est
ensuite filtré. Le filtrat contenant les tannins est recueilli dans une ampoule à verre. Le
reste ou l’agrégat sur le filtre est alors lavé avec 5 mL 2N d’acide sulfurique, puis ajouté
à l’ampoule. Celle ci est fermée hermétiquement et congelée, puis chauffée à 100°C
pendant 26 h pour pouvoir d’hydrolyser les gallotannins (Inoue and Hagerman, 1988).
Le contenu de l’ampoule est dilué dans l’eau pour un volume final de 50 ml. 1 ml de
l’échantillon est utilisé pour la technique. Dans cette fraction 1.5 ml de 0.667% (w/v)
rhodanine/méthanol est ajouté. Après exactement 5 minutes, 1 ml de 0.5N KOH est
ajoutée. L’eau est ensuite ajoutée après 2.5 minutes pour un volume final de 25 ml.
L’absorbance est déterminée à 520 nm après 5 à 10 minutes d’incubation. Le standard est
produit par la réaction de l’acide gallique dans 0.2N d’acide sulfurique avec la solution de
rhodanine (Vermerris and Nicholson, 2006).
Hagerman et Butler ont soutenus que cette technique est plus appropriée que celle
d’iodate de potassium pour la détermination des tannins hydrolysables, bien qu’il fût
admis que la technique à la rhodanine est sensible à n’importe quel ester d’acide gallique,
incluant ceux des composés non tanniques (Hagerman and Butler, 1989).
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libère des unités d’HHDP, qui formeront spontanément des acides ellagiques. La
quantification des acides ellagiques reflèterait donc, la quantité des ellagtannins présente
dans l’échantillon (Vermerris and Nicholson, 2006).
La concentration de l’acide ellagique peut être déterminée via une réaction d’oxydation
avec l’acide nitreux. Il existe deux méthodes qui ont été décrites respectivement par Bate-
Smith, et par Wilson et Hagerman (Bate-Smith, 1977 ; Wilson and Hagerman, 1990).
Les ellagitannins peuvent être isolés des plantes par l’extraction de tissus lyophilisés et
broyés dans de l’acide sulfurique 2N (5-10 mg de l’échantillon/ml d’acide), suivit par une
congélation dans la neige carbonique/bain contenant du 2-propanol, fermé
hermétiquement, puis chauffé à 100°C pendant 10 heures dans des ampoules à verre.
Après hydrolyse, les ampoules sont mises à température ambiante, ouvertes, refroidies
dans un bain glacé pendant 10 minutes, puis filtrés a travers une membrane à filtre. Le
reste sur le filtre (contenant l’acide ellagique) est ensuite lavé par plusieurs volumes d’un
solvant de lavage bien frais (acétone/H2O/HC1 concentré 70:30:1 v/v/v) et séché à l’air.
Lorsque le reste est séché, l’échantillon et le filtrat sont transférés dans un tube à essai et
dissous dans 10 ml de pyridine. Le matériel non dissous est enlevé pour une seconde
filtration. Les échantillons sont filtrés à travers un filtre à fibre de verre soutenu par un
deuxième filtre à verre pour éliminer les agrégats insolubles. Le filtrat final est analysé
pour détecter l’acide ellagique (Wilson and Hagerman, 1990).
Scalbert et al, ont résumés la méthode de Bate-Smith: dans un tube fermé avec un
bouchon à vise au téflon, 0.2 ml de l’extrait aqueux de plante (1 ml si n’est pas
extrêmement concentré) sont mélangés à 1.8 ml de 1:1 méthanol/eau (1 ml de 9:1
méthanol/eau si l’échantillon n’est pas concentré) et 0.16 ml d’acide acétique aqueux 6%
(v/v). Le nitrogène bouillonne dans la solution pendant quelque secondes, après
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lesquelles le tube est fermé et incubé à 25°C au bain marie pendant 100 minutes (Scalbert
et al., 1989).
La technique au NaNO2/HCl
1) Elle est insensible à l’acide gallique, qui peut surestimer la quantité des
ellagitannins.
2) Elle est plus sensible et beaucoup plus pratique, car l’oxygène n’interfère pas dans
la réaction.
Un volume de 0.1 ml d’HCl concentré est ensuite ajouté, et le mélange est amené à 30°C.
Après qu’un volume de 0.1 ml de NaNO2 1% (w/v) est ajouté, le mélange est rapidement
remuer, et l’absorbance est aussitôt après lu à 538 nm (A538, t 0). Le produit rouge se
décompose lorsque l’échantillon est incubé plus que le temps nécessaire. Après 36
minutes à 30°C, le produit rouge atteint le maximum de concentration, et l’absorbance
(A538, t36) est ainsi enregistrée (Wilson and Hagerman, 1990).
Cette technique est basée sur la formation de NO+ électrophile (figure.11), qui peur réagir
avec les résidus d’acides ellagique (A) sur deux sites, l’un via une réaction de substitution
(B), et l’autre par une addition qui produit un nitrosyle dienone (C). Ce composé peut se
décomposé pour former la quinine oxime (D), qui sous des conditions alcalines forme le
produit final rouge (E).
29
Figure.11 : Formation du chromophore rouge (E) par la réaction de l’acide ellagique
avec l’électrophile NO+ (Vermerris and Nicholson, 2006).
30
de ces composés phénoliques, une variété de méthodes de séparation et d’identification
existe.
Avant l’introduction de la chromatographie liquide à haute performance (CLHP), les
séparations chromatographiques sur papier, sur couches minces ou sur colonnes avaient
été largement développées pour l’analyse des composés phénoliques, ainsi que les
séparations par électrophorèse sur papier (Markham and Bloor, 1998). Ces techniques
gardent encore un certain intérêt pour réaliser une première approche qualitative
concernant un matériel végétal inconnu. La combinaison de trois paramètres permet en
effet de multiples séparations (Macheix et al., 2005) :
- d’une part celles du (ou des) groupement(s) phénolique(s) porté(s) par le cycle
benzénique : caractère d’acide très faible conduisant à des phénolates, absorption et
fluorescence en lumière ultraviolette permettant un repérage aisé sur les
chromatogrammes, oxydation aisée et complexation avec des métaux (Fe3+, Al3+…),
permettant également une bonne révélation (réactif de Neu, AlCl 3, et nitrate
d’argent…). Le réactif de Benedikt permet quant à lui de mettre en évidence les o-
diphénols (composés présentant deux fonctions phénols adjacentes).
- D’une part celles liées au cycle benzénique, souvent associées à des réactions colorées
permettant de visualiser les composés phénoliques : réaction de nitrosation en
présence du nitrite de Na, formation de sel de diazonium, réaction de condensation
avec les aldéhydes. Dans ce dernier cas, la vanilline en milieu chlorhydrique réagit
avec le noyau A de certains flavanes pour donner des dérivés de couleur rouge utilisés
pour la révélation ou le dosage de ces composés. Il en est de même du 4-
diméthylaminocinnamaldéhyde (DMACA) qui donne une couleur bleu intense avec
les flavanols simples et bleu verts avec les formes polymérisées.
31
détaillée par des techniques instrumentales, au raison de ses grandes capacités de
traitement des échantillons (Stalikas, 2007).
Les principaux éléments d'une séparation chromatographique sur couche mince sont:
• la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable,
fermé par un couvercle étanche.
• la phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou d'un autre
adsorbant est fixée sur une plaque de verre à l'aide d'un liant comme le sulfate de calcium
hydraté, l'amidon ou un polymère organique.
• l'échantillon : environ un microlitre (μl) de solution diluée (2 à 5 %) du mélange à
analyser, déposé en un point repère situé au-dessus de la surface de l'éluant.
• l'éluant : un solvant pur ou un mélange : il migre lentement le long de la plaque en
entraînant les composants de l'échantillon.
La CCM permet un contrôle aisé et rapide de la pureté d'un composé organique lorsque
les conditions opératoires sont connues, Si l'analyse, réalisée avec divers solvants et
différents adsorbants, révèle la présence d'une seule substance, on peut alors considérer
que cet échantillon est probablement pur. De plus, étant donné que la chromatographie
sur couche mince indique le nombre de composants d'un mélange, on peut l'employer
pour suivre la progression d'une réaction. La chromatographie sur couche mince est
également la technique habituellement employée pour rechercher le meilleur solvant,
avant d'entreprendre une séparation par chromatographie sur colonne.
Dans la plupart des cas, CCM des composés phénoliques utilise de la silice comme phase
stationnaire et la plaque est développée avec une combinaison du 2-(diphénylboryloxy)
éthylamine et polyéthylène glycol ou avec du AlCl 3. La détection est essentiellement
accomplie en utilisant la lumière UV à 350-365 nm ou 250–260 nm (Macheix et al.,
2005).
32
Caractérisation des flavonoïdes
Si plusieurs réactions colorées permettent de mettre en évidence génines et hétérosides
dans les extraits bruts, l’étude préliminaire de ces extraits par une analyse en CCM peut
se faire (Bruneton, 1993):
Les tannins galliques donnent une coloration rose avec l’iodate de potassium (l’acide
gallique libre est coloré en orange par ce réactif). Les tannins ellagiques sont colorés par
l’acide nitreux en milieu acétique (d’abord rose, la coloration vire au pourpre puis en
bleu) et les tannins sont colorés en rouge par la vanilline chlorhydrique (Bruneton, 1993).
33
2.3.2.2. Les séparations par CHLP et par électrophorèse capillaire et les couplages
CHLP/UV et CHLP/spectrométrie de masse
Les séparations sont basées sur les polarités respectives des phases stationnaires utilisées,
du solvant d’élution et des composés phénoliques concernés, en particulier leur degré
d’hydroxylation, de glycosylation et de méthylation. A partir de ces principes généraux,
deux approches analytiques sont possibles (Macheix et al., 2005) :
- D’une part, la chromatographie de composés phénoliques non polaires sur une phase
stationnaire de silice avec élution par un solvant apolaire de composition constante
(par exemple le mélange héptane-éthanol),
- d’autre part, ce qui est le plus utilisé dans le monde des composés phénoliques, la
fixation de ces composés sur une phase dite inversée (par exemple de la silice sur la
quelle on a préalablement greffé des chaines aliphatiques apolaires) suivie de leur
élution par un mélange de solvants (fréquemment eau/acide acétique/acétonitrile ou
eau/méthanol) dont on fait varier la composition donc la polarité avec le temps de
l’analyse.
Les composés élués sont généralement repérés en sortie de colonne par leur absorption en
lumière visible pour les anthocyanes (vers 520nm) et en ultraviolet (280, 325 ou 360nm)
pour tous les autres phénols ; ils apparaissent alors sous forme de pics sur les
chromatogrammes (figure.13).
La surface de chacun des pics est proportionnelle à la concentration du composé, qui est
alors dosé à la longueur d’onde choisie pour l’analyse par référence à des composés
témoins obtenus commercialement ou à partir d’analyses antérieures.
34
Figure.13 : Séparation des anthocyanes de raisins par chromatographie liquide à haute
performance :
Les pics 1 à 4 correspondent respectivement aux 3-glucosides de la delphidine, de la
pétunidine, de la péonidine et de la malvidine. Les pics 5 et 6 sont ceux de la
malvidine 3-glucoside acylée avec l’acide acétique et l’acide p-coumarique
respectivement (Wulf and Nagel, 1978).
35
par CHLP et trouve de très belles applications dans la séparation des nombreux
glycosides des flavonoïdes (Markham and Bloor, 1998).
Conclusion
Bien que les grandes lignes concernant la nature des principales classes de composés
phénoliques et les voies majeurs de biosynthèse aient été connues dès la fin des années
36
1960-1970, des avancés spectaculaires ont été obtenues depuis cette période grâce à
l’amélioration des techniques dans des domaines variés.
Les progrès des techniques analytiques et des approches moléculaires ont aujourd’hui
permis de confirmer et de préciser la diversité et l’importance de ces composés
phénoliques végétales. Ils constituent des éléments essentiels dans les interactions des
plantes avec leurs environnements biologiques et physique (relations avec les bactéries,
les champignons, les insectes, résistance aux UV), mais participent aussi fortement aux
critères de qualité (couleur, astringence, amertume…) qui orientent le choix de l’homme
dans la consommation et l’utilisation de végétaux et des produits qui en dérivent par
transformation.
Références bibliographiques
37
Brouillard R, Figueiredo P, Elhabiri M, and Dangles O ; 1997. Molecular interactions
of phenolic compounds in relation to the colour of fruit and vegetables. Phytochemistery
of Fruit and Vegetables, Clarendon Press, Oxford p29-49.
Bruneton J ; 1993. Pharmacognosie phytochimie plantes médicinales. TEC et DOC,
Lavoisier p211-338.
Chebil L, Humeau C, Falcimaigne A, Engasser JM, and Ghoul M ; 2006. Enzymatic
acylation of flavonoids. Process Biochemistry 41: 2237–2251
Folin O and Denis W ; 1915. A colorimetric method for the determination of phenols
(and phenol derivatives) in urine. J Biol Chem 22 : 305-308.
Folin O, and Ciocalteu V ; 1927. Tyrosine and tryptophan determinations in proteins. J
Biol Chem 73 : 627-650.
Geirer H ; 1985. The identification of phenolic compound by colour reactions. In : the
biochemistry of plants phenolics. Lea PJ eds, Claredon press, Oxford p45-56.
Gonzalez E, Fougerousse A, and Brouillard R ; 2001. Two diacylated malvidin
glycosides from Petunia Hybrida flowers. Phytochemistry 58 : 1257-1262.
Grotewold E, 2006. The Science of Flavonoids. Springer p1- 269.
Hagerman A, and Butler LG ; 1989. Choosing appropriate methods and standards for
assaying tannin. J Chem Ecol 15 : 1795-1810.
Harborne JB ; 1988. The flavonoids advanced in reaserche since 1980, Chapman and
Hall, New York p621.
Harborne JB ; 1989. Plant phenolics. Methods in plant biochemistry. Academic press,
London 1 : 522.
Haslam E ; 1965. Galloyl esrers in the Aceraceae. Phytochemistry 4 : 495-498.
Heim EK, Tagliaferro AR, and Bobilya DJ ; 2002. Flavonoid antioxidants : chemistry,
metabolism and structure-activity relationships. J Nutr Bioch 13 : 572-584.
Hendrich AB ; 2006. Flavonoid-membrane interactions : possible consequence for
biological effects of some polyphenolic compounds. Acta pharma Sinica 27 : 27-40.
Huang DJ, Lin CD, Chen HJ, and Lin YH ; 2004. Antioxidant and antiprolifirative
activities of sweet potato (Ipomoea batatas) constituants. Bot Bull Acad Sin 45 : 179-186.
Inoue KH, and Hagerman A ; 1988. Determination of gallotannin with rhodanine. Anal
Biochem 169 : 363-369.
Lamaison JLC and Carnet A ; 1990. Teneurs en principaux flavoinoides des fleurs de
Crataegeus mongyna Jacq et de Crataegeus laevigata (Poiret D.C) en fonction de la
végétation. Pharm Acta Helv 65 : 315-320.
38
Macheix JJ, Christian JA, and Allemand J ; 2005. Les composés phénoliques des
végétaux. Un exemple de métabolites secondaires d’importance économique. Collection
biologie, presses polytechniques et universitaires, Romandes p1-192.
Markham K, and Bloor S ; 1998. Analysis and identification of flavonoids in praxtice.
In : Flavonoids in health and disease. Rice-Evans C, Packer L eds, New York p1-34.
Moller B, and Herrmann K ; 1982. Analysis of quinic acid esters of hydroxycinnamic
acids in plant material by caplillary gas chromatography and high performance liquid
chromatography. J Chromatogr 241 : 371-379.
Pietta P, Gardana C, and Pietta A ; 2003. Flavonoids in herbs. In : Flavonoids in health
and disease. Rice-Evans C, Packer L eds, New York p43-69.
Quideau S ; 2009. Chemistry and Biology of an underestimated class of bioactive plant
polyphenols Ellagitannins. World Scientific Publishing p1-367.
Sakakibara H, Honda Y, Nakagawa S, Ashida H, and Kanazawa K ; 2003.
Simultaneous determination of all polyphenols in vegetables, fruit, and teas. J Agric
Food Chem 51: 571-581.
Scalbert A, Monties B, and Janin G ; 1989. Tannins in wood: comparison of different
estimation methods. J Agric Food Chem 37 : 1324-1329.
Stalikas CD ; 2007. Extraction, separation, and detection methods for phenolic acids and
flavonoids. J Sep Sci 30 : 3268 – 3295.
Swinny E, and Markham K ; 2003. Application of flavonoid analysis and identification
techniques: isoflavones (phytoestrogens) and 3-deoxyanthocyanins. In: Flavonoids in
health and disease. Rice-Evans C, Packer L eds, New York p97-122.
Vermerris W and Nicholson R ; 2006. Phenolic compound biochemistry. Springer p7-
15.
Wilson TC, and Hagerman AE ; 1990. Quantitative determination of ellagic acid. J
Agric Food Chem 38 : 1678-1683.
Wulf LW, and Nagel CW ; 1978. High pressure liquid chromatographic separation of
anthocyanins of Vitis vinifera. Ann J Enol Vitic 29 : 42-49.
39