Introducción a la Biología

Facultad de Cs.Exactas y Naturales

Universidad Nacional de Mar del Plata

MICROSCOPIO COMPUESTO
NORMAS BÁSICAS PARA EL CUIDADO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

Al ser el microscopio un aparato de precisión y de precio elevado, es muy

conveniente asegurarle un buen rendimiento y una larga duración mediante toda una
serie de normas y cuidados:

• NO ENCHUFAR EL MICROSCOPIO A LA LÍNEA TRIFÁSICA.

• Para transportar el microscopio se recomienda utilizar siempre las dos manos,

sujetándolo por el brazo con una mano y sosteniéndolo del pie con la palma de la
otra mano.

• Se debe desplazar en posición vertical para evitar la caída del ocular y/o del espejo o
fuente de luz.

• En la mayoría de los microscopios el brazo debe quedar hacia el observador. Debe

apoyarse correctamente el aparato hacia el centro de la mesada.

• Seleccionar al inicio de la observación, el objetivo de menor aumento.

• Cambiar en forma gradual los objetivos.

• Finalizada la observación, volver a ubicar el objetivo de menor aumento.

• Al efectuar el primer enfoque, el objetivo debe estar bien cerca de la preparación sin
llegar a tocarla. Se coloca en esta posición mirando lateralmente el microscopio. El
desplazamiento del tubo óptico para enfocar, se efectuará de abajo hacia arriba.

• Se evitará siempre tocar la preparación con la lente frontal de los objetivos.

• En algunos microscopios el desplazamiento del condensador tiene un tope, mientras

que en otros no, por lo que al ascenderlo hay que cuidar de no tocar el portaobjetos.

• Cuando se utiliza un microscopio monocular es recomendable mantener los dos ojos

abiertos para evitar el cansancio visual.

• Mover siempre suave y lentamente cualquier pieza del microscopio

• Utilice papel de seda fino especial o gamuza para lentes.

• Evite tocar las lentes con los dedos.

• La parte inferior del portaobjetos debe estar siempre seca al situarlo sobre la platina.

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• Después de utilizar el microscopio debe guardarse aislado del polvo y la humedad

con una funda de plástico o en su caja correspondiente, con la puerta cerrada.

CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONAMIENTO DEL MICROSCOPIO

¿CÓMO SE FORMA LA IMAGEN?

Algunos principios físicos...

La posición y tamaño de la imagen de un objeto formada por una lente delgada,

puede hallarse por un método gráfico sencillo.
Este método consiste en determinar el punto de intersección, después de
atravesar la lente, de unos cuantos rayos, (llamados rayos principales), que divergen
desde un punto determinado del objeto que no esta sobre el eje, como el punto Q de la
siguiente figura .

9 Un rayo paralelo al eje, después de la refracción por la lente, pasa por el segundo
foco de una lente convergente.

9 Un rayo que pasa por el centro de curvatura de la lente no es desviado

apreciablemente (si la lente es delgada).

9 Un rayo que pasa (o se dirige hacia) el primer foco emerge paralelo al eje.

P F F’

Q’

La mayor parte de los sistemas ópticos comprenden más de una superficie

reflectante o refractante. La imagen formada por la primer superficie sirve de objeto a la
segunda y así sucesivamente.

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Imagen de un objeto situado a una distancia mayor al foco.

(f = R / 2, R es el radio de curvatura de la lente)

imagen
Foco 2

objeto
Foco 1

Imagen de un objeto situado a una distancia menor al foco.

Foco 2

Imagen Objeto

Ahora volvemos a lo que nos interesa...

El objetivo del microscopio actúa como una cámara fotográfica. Cuando un

objeto se sitúa más allá del foco de su lente, se produce una imagen ampliada, real e
invertida.

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El ocular actúa como una lupa que observa la imagen que ha formado el
objetivo, construyendo una nueva imagen mucho más ampliada, virtual y derecha con
relación a aquella, pero invertida con relación al objeto examinado.
Así, la imagen del microscopio compuesto resulta de la combinación de las
provocadas por una lente (objetivo) que actúa como una cámara fotográfica, y otra
(ocular) que actúa como una lupa que observa la imagen formada por la primera.
En las figuras anteriores pudimos observar, de manera muy simplificada, que la
imagen aumentada, producida por el objetivo, es tomada por el ocular (como si fuera un
objeto) y es magnificada nuevamente. Por lo tanto, la imagen definitiva (que es
invertida respecto de la original) resulta el producto entre el aumento del objetivo por el
aumento del ocular. En consecuencia, los mayores aumentos que pueden conseguirse
con el microscopio óptico son de 1000-1500 x. Esto significa que una estructura que
mide un micrón puede observarse como si tuvieran 1 o 1,5 milímetros. Sin embargo,
¿por qué existe una limitación en la amplificación que puede brindar un sistema de
lentes? El principal problema radica en que la capacidad de aumentar una imagen no es
la única propiedad a tener en cuenta para una buena observación.

2. ¿Cuál es la otra propiedad importante para lograr una buena imagen?

En el microscopio distinguimos un sistema óptico destinado a la iluminación y

obtención de una imagen muy aumentada del objeto examinado, y un sistema mecánico
(o montura), cuya finalidad es la de sustentar convenientemente los elementos ópticos y
los preparados que se examinan.

¾ La parte óptica fundamental del microscopio está formada por dos sistemas
centrados de lentes de aumento o convergentes: el objetivo y el ocular, y por el
aparato de iluminación, que facilita y mejora la observación microscópica.

♦ El objetivo está compuesto por un sistema centrado de lentes convergentes.

Existen distintos tipos de objetivos, que se diferencian por las características de
su composición, o por la manera de utilizarse:

• Objetivos a seco:

En éstos, el aire se interpone entre su lente y el preparado. Los objetivos más

comúnmente utilizados son de 4, 10, 40 y 45 X.

• Objetivos a inmersión:

Se distinguen de los anteriores porque entre la lente y el preparado se debe

interponer un medio transparente con un índice de refracción (n) superior al del aire
(n=1), y semejante al del vidrio (n=1.5), que permite aprovechar un mayor número de
rayos refractados por el preparado para la formación de la imagen. El medio utilizado es
un aceite de inmersión, como por ejemplo el aceite de cedro. La distancia al preparado
utilizando estos objetivos es muy pequeña y suelen tener un muelle protector para evitar
roturas.

♦ El ocular recibe la imagen dada por el objetivo. Está compuesta por dos lentes:
la inferior o colectora, y la superior, o lente ocular.

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♦ El aparato de iluminación, situado debajo de la platina, está formado por:

• Espejo: cuando existe, posee una cara plana y otra cóncava destinadas a
proyectar el haz de rayos que iluminará el objeto, dirigiéndolos hacia arriba del eje
óptico. Los microscopios con luz incorporada generalmente no poseen espejo.

• Condensador :está constituido por un sistema de lentes convergentes que

proyecta sobre el preparado en forma de un amplio cono el haz de luz que lo
atraviesa. Concentra los rayos luminosos procedentes de la fuente de luz sobre la
preparación.

• Diafragma: dispuesto debajo del condensador, sirve para graduar la

cantidad de rayos luminosos que llegan al objeto.

• Filtros de luz: son placas de vidrio coloreadas que dejan pasar las
radiaciones de longitud de onda más convenientes para la más adecuada observación
(κ=400-500 nm), absorbiendo las restantes.

ALGUNOS CONCEPTOS IMPORTANTES EN MICROSCOPÍA

Aumento:

Es la proporción entre el tamaño de la imagen observada al microscopio y el

tamaño real del objeto. El aumento total puede calcularse como el producto del aumento
del ocular por el del objetivo.

Distancia frontal:

Es la distancia ente el objeto observado y la lente del objetivo cuando el

preparado se encuentra enfocado correctamente. Es inversamente proporcional al
aumento, es decir, que a medida que se utilizan objetivos de mayor aumento disminuye
la distancia frontal y por lo tanto aumenta el riesgo de romper el preparado.

Profundidad de campo o de foco o poder de penetración:

Es el espesor del preparado que se observa con nitidez, es decir, profundidad de

planos que están en foco en un momento dado. Con aumentos medianos o grandes, al
mover el tornillo micrométrico, podemos observar sólo pequeños espesores con nitidez,
mientras que por encima y por debajo de esta zona la imagen se desvanece.
La profundidad de foco guarda relación inversa con el aumento: es tanto menor
cuanto mayor es el aumento de la lente. Con inmersión en aceite, la profundidad de
campo es muy escasa (menor que 1 µm).

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Campo observado:

Es la porción del preparado incluida en la imagen. Se representa por el diámetro

de la parte de la preparación que se está observando (área del campo). El tamaño del
campo observado es inversamente proporcional al aumento total del microscopio, y por
esta razón las lentes de pequeño aumento son útiles para rastrear la preparación. Si
cambiamos de un objetivo a otro de mayor aumento, observaremos una imagen más
aumentada pero que incluirá sólo una parte de lo que observábamos con el objetivo
menor.

Poder de resolución:

Es la capacidad de las lentes de distinguir o resolver (mostrar separados) con

nitidez dos puntos situados muy próximos entre sí. Se expresa como la distancia mínima
que permite dar una imagen bien definida de dos puntos, en vez de verlos como uno
solo.
Cuanto mayor es el poder de resolución (PR), menor es la distancia que separa
dos puntos entre sí sin que estos se confundan. En consecuencia, cuanto mayor sea el
poder resolutivo del objetivo, más finos serán los detalles de la preparación que puedan
distinguirse.

Límite de resolución:

Es la distancia mínima que debe existir ente dos puntos del objeto para que
puedan visualizarse separados. En los microscopios ópticos, el límite de resolución no
es, en general, inferior a 0.2 µm.

Apertura numérica:

Es una medida de la capacidad del microscopio de agrupar las refracciones de la

luz producidas por los finos detalles del objeto, debido a que determina el tamaño del
haz de luz que es captado por el objetivo luego de haber pasado a través del objeto. Es
una característica propia de cada objetivo, es por esto que forma parte de las
inscripciones grabadas en los objetivos.

3. Observando los distintos elementos del microscopio ubique los que

corresponden a la parte óptica. Reconozca los objetivos secos y de inmersión.
4. ¿De qué partes del microscopio depende la correcta iluminación de la
preparación ?
5. ¿A qué partes del microscopio debe dirigirse la luz de la lámpara? ¿Por qué?
6. ¿Qué se puede colocar en el portafiltros y qué utilidad tiene?
7. ¿Cómo varía la iluminación al abrir o cerrar el diafragma?
8. ¿Qué función tienen el espejo, el filtro, el diafragma y el condensador en la
iluminación?

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Tome un portaobjetos limpio y seco por sus bordes. Coloque una gota de agua
en el centro del portaobjetos. Corte una pequeña letra de diario y ubíquela encima de la
gota de agua. Cubra el preparado con un cubreobjetos. Coloque el portaobjetos sobre la
platina. Esta preparación se conoce como MONTAJE HÚMEDO. Observe a menor
aumento, cuidando que el objetivo no toque el preparado. Mueva lentamente el tornillo
micrométrico y observe las modificaciones en la imagen. En función a lo observado,
podrá responder a las siguientes preguntas:

9. Escriba e interprete las inscripciones que llevan cada grupo de lentes. Preste
especial atención al objetivo de INMERSION. ESTE OBJETIVO REQUIERE
DE ACEITE DE INMERSION PARA SU UTILIZACION. NO INTENTE
OBSERVAR MATERIAL SIN TOMAR LOS RECAUDOS NECESARIOS.

10. ¿Cuáles son las características que tiene la imagen final del microscopio
compuesto? Al desplazar el portaobjetos, ¿en qué sentido se mueve la imagen?

11. ¿Qué combinaciones de aumentos (del ocular, del objetivo y total) pueden
hacerse con el microscopio del que se dispone?

12. ¿Por qué es conveniente centrar en el campo de observación el objeto que nos
interesa ver de la preparación si queremos observarlo a gran aumento?

13. Analice las 4 imágenes que aparecen a continuación. Ellas responden a un

mismo objeto visualizado mediante cuatro instrumentos diferentes. Indique las
características de las distintas imágenes. ¿Cuál le parece el instrumento más
eficiente? Fundamente su respuesta.

14. Observación de una preparación: resuma global, ordenada y brevemente todos

los pasos, desde el principio hasta el final, que se han efectuado para observar
un preparado correctamente. Dibuje lo observado y coloque referencias.

¿CÓMO SE PREPARA EL MATERIAL PARA SU OBSERVACIÓN BAJO EL

MICROSCOPIO?

Existen diversas técnicas de preparación del material para su observación bajo el

instrumental óptico. Fundamentalmente, se requiere que los portas y cubreobjetos se
encuentren perfectamente limpios, preferentemente enjuagados con alcohol fino y
secos. La preparación del material se debe realizar sobre una superficie limpia y plana.
En caso de realizar cortes, éstos deben ser sumamente delgados como para permitir el

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paso de la luz a través del material. Además del montaje húmedo existen dos técnicas
especiales para realizar el montaje del material: SQUASH o aplastado y FROTIS o
extendido.

¾ SQUASH : consiste en la disgregación de la muestra mediante el aplastamiento del

material entre el porta y cubreobjetos. Para realizarlo se siguen los siguientes pasos:

• Se disgrega el material con la ayuda de pinzas y alfileres o agujas. Si se requiere, se

lo somete a coloración durante el tiempo necesario.

• Se cubre el material con un cubreobjetos.

• Se apoya el portaobjetos sobre una superficie dura y

completamente plana.

• Se coloca sobre el cubreobjetos un papel secante o un

papel de filtro doblado y se aplasta con el dedo pulgar
sin deslizar ni rotar el cubreobjetos.

• Se debe operar con precaución pero con firmeza para evitar la rotura del material.

¾ FROTIS : consiste en esparcir el material generalmente líquido o semilíquido de

modo que quede distribuido uniformemente en una delgada capa. Para ello se utiliza
otro portaobjetos de borde muy parejo que se desliza sobre el primero desde un
extremo al opuesto. Se procede del siguiente modo:

• Se coloca una gota de material sobre

un extremo del portaobjetos limpio y seco .

• Se apoya sobre la gota un borde del

otro portaobjetos formando un
ángulo agudo.

• Cuando la gota se extienda por

capilaridad a todo el ancho del
portaobjetos, se desliza hacia el otro
extremo con un movimiento suave,
rápido y uniforme.

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Realice un frotis y un squash con el material brindado en el trabajo práctico.

¿Cuáles son las ventajas y qué limitaciones presenta el

microscopio óptico en la observación de estructuras biológicas?

¾ CON EL MICROSCOPIO ÓPTICO SE PUEDEN OBSERVAR:

• La forma general de la mayoría de las células procariontes

• La forma general de las células eucariontes
• Algunas organelas eucariontes: núcleo, nucleólos, cromosomas,
mitocondrias, cloroplastos, flagelos, cilias, centriolos, vacuolas, pared
celular. Estas estructuras se identifican con claridad utilizando alguna
técnica accesoria con preparación de la muestra.

¾ NO PUEDEN OBSERVARSE CON EL MICROSCOPIO ÓPTICO:

• Las bacterias más pequeñas

• La estructura interna de las células procariontes
• La estructura de las organelas eucariontes
• La membrana plasmática
• Los conjuntos membranosos como los retículos endoplásmicos y el
aparato de Golgi, aunque su ubicación en la célula puede ser revelada
mediante ciertas técnicas
• Los ribosomas

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ESTEREOMICROSCOPIO O LUPA BINOCULAR

El estereomicroscopio consta realmente de dos microscopios completos, cada
uno con su objetivo y ocular en los que, al no coincidir sus ejes ópticos, las imágenes
formadas en los oculares son distintas (lo mismo que ocurre con la visión ocular), por
lo que vemos una imagen de tres dimensiones.
No debe confundirse este aparato óptico con los microscopios binoculares, ya
que en éstos la imagen formada en un único objetivo es desdoblada en dos imágenes
idénticas por un prisma situado entre el objetivo y los dos oculares.
Puede apreciarse que la lupa posee un par de oculares, cada uno de los cuales se

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enfoca independientemente del otro, con el fin de proveer una imagen nítida para ambos
ojos. Nótese que éste es un instrumento de baja magnificación.

NORMAS BÁSICAS PARA EL CUIDADO Y MANEJO DE LA LUPA

BINOCULAR

La mayoría de las normas de cuidado, limpieza y transporte, recomendadas para

el microscopio compuesto deben tenerse también en cuenta al utilizar la lupa binocular.
Además se tendrán presentes las siguientes normas:

• Moviendo los tubos oculares se busca la distancia interpupilar adecuada para cada
observador, de manera de obtener una imagen en tres dimensiones.

• Enfoque primeramente con el ocular fijo y luego ajuste el foco de la imagen

tridimensional con el ocular de foco ajustable.

• Debe colocarse en la platina una placa de contraste, de un color tal que realce la
observación.

• El tornillo de sujeción debe estar suficientemente apretado para evitar la caída del
brazo de la lupa

CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONAMIENTO DE LA LUPA

BINOCULAR

1. ¿Cómo es la distancia de trabajo en relación con la del microscopio óptico?

2. ¿Por qué no existe tornillo micrométrico? ¿Cómo es la profundidad del
campo?
3. ¿Al desplazar un objeto observado, en qué sentido se mueve la imagen final?
4. ¿Cuáles son las características de la imagen final?
5. ¿Qué finalidad tiene el ocular ajustable?
6. Observe bajo lupa el material brindado. Esquematice lo observado y
coloque referencias e indique el aumento obtenido.

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OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES

El estudio de estructuras in vivo es normalmente muy difícil, ya que sus

componentes, con raras excepciones, son incoloros y transparentes. El microscopio de
contraste de fase permite el estudio de muchas estructuras celulares in vivo.
Generalmente se utiliza en combinación con las técnicas de cultivo de células y tejidos,
y también para el examen de células recientemente removidas de animales vivos, o
también material fijado, pero sin colorear.
La velocidad con que la luz atraviesa un cuerpo transparente depende de la
cantidad de material presente y determina el índice de refracción de este cuerpo.
Dado que las diversas estructuras celulares tienen un índice de refracción
diferente, causas diversos atrasos en las ondas luminosas que las atraviesan, dando
origen a diferencias de fase entre las zonas luminosas emergentes, pero esas diferencias
no son visibles.
En el microscopio de contraste de fase existen dispositivos especiales que
transforman estas diferencias de fase en diferencias de amplitud, produciendo en
consecuencia diferencias de intensidad luminosa, para las cuales la retina es sensible.

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MICROSCOPIO DE POLARIZACIÓN

Cuando la luz atraviesa ciertas sustancias o estructuras, sufre una división de tal
orden que de un solo rayo luminoso a la entrada, resultan dos rayos llamados
polarizados.
Tal capacidad se debe a que esas sustancias poseen una ordenación interna y
periódica de sus átomos. Sea o no aparente esta ordenación, se dice que tales cuerpos
tienen estado cristalino. Por el contrario, las sustancias que no pertenecen a este grupo
se llaman amorfas.
La velocidad a la que se propaga la luz en estos cuerpos amorfos, también
llamados isótropos o monorrefringentes, es siempre igual, independientemente de la
dirección que siga dentro de ellos. Así, el cuerpo tienen un único índice de refracción.
En los cuerpos cristalinos, o anisótropos o birrefringentes, la velocidad de la luz
varía según la dirección de propagación, lo que da lugar al fenómeno conocido con el
nombre de doble refracción. De un único rayo luminoso resultan dos rayos refractados,
que son polarizados rectilíneamente; esto es, la dirección de la vibración de la luz pasa
a seguir una dirección determinada.
El microscopio de polarización emplea un prisma que deja pasar solamente la
luz polarizada rectilíneamente, eliminando otros rayos por reflexión total. Este
instrumento óptico está compuesto de una platina rotatoria, a la que se le añaden dos
polarizadores: uno ubicado debajo de la platina (polarizador) y el otro, encima de ella,
junto al ocular analizador).
Polarizador y analizador están colocados de tal manera que sus secciones
principales están cruzadas, o sea, se cortan perpendicularmente. En estas condiciones el
observador no ve ninguna luz en el ocular.
Cuando se coloca en la platina un cuerpo amorfo, esta situación no se altera
porque la luz no sufre modificación. Lo contrario ocurre cuando observamos un cuerpo
cristalino o birrefringente. Entonces, y según la orientación de ese cuerpo en la platina,
la luz brilla con mayor o menor intensidad. El microscopio de polarización sirve,
entonces, para distinguir las sustancias monorrefringentes de las birrefringentes.
Además, permite conocer la ordenación interna de las sustancias birrefringentes, su
orientación a escala submicroscópica.

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
BREVE RESEÑA HISTÓRICA DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Desde el año 1660 a la actualidad el microscopio óptico ha sido pilar

fundamental en el conocimiento de lo invisible. Aunque su poder de resolución aumentó
a través del tiempo, con la mejora de la calidad de las lentes, su factor limitante fue la
longitud de onda de la luz. En 1873, Ernst Abbe había predicho :"Quizá en el futuro se
conozca alguna fuerza que permita a través de diferentes caminos sobrepasar los límites
que ahora nos parecen insalvables. Creo que los instrumentos que nos asistirán algún día
no tendrán nada en común, salvo sus nombres". Realmente su predicción se cumplió ya
que los equipos actuales permiten acceder al mundo molecular y atómico, tan lejano
para los investigadores de aquellos tiempos.

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Fue gracias al descubrimiento de los principios físicos que llegaron a ser la

base teórica de la microscopía electrónica, que se avanzó a pasos agigantados en el
conocimiento de lo muy pequeño. Dos desarrollos esenciales condujeron a la
construcción del microscopio electrónico (ME). Primero la teoría de De Broglie (1924)
que indica que a un electrón en movimiento puede asignarse una longitud de onda muy
corta. La segunda demostración de Busch (1926) que un campo electrostático adecuado
podría ser usado como verdadera lente para un rayo electrónico y así producir una
imagen agrandada.
Un hecho destacable con el desarrollo del ME fue que mientras el
microscopio de luz u óptico (MO) alcanzó su perfección de más de 2 siglos de
desarrollo, el ME alcanzó un nivel comparable en el espacio corto de 2 décadas.
Una enorme expansión de nuestro conocimiento de la ultraestructura de la
materia ha tenido lugar gracias al ME. Ambos, instrumento y técnicas se han vuelto casi
de rutina, lo que ha permitido la respuesta a muchos problemas fundamentales de
significado biológico y médico.

EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Vamos a referirnos a las características del ME que lo diferencian de la

microscopía de luz y que permite mejorar el límite de resolución de este último. Se
logran haces de electrones con una longitud de onda de 0.05 nm, cuyo poder de
resolución es de 0,2 nm mientras que la longitud de onda de la luz visible oscila
alrededor de 500 nm y su poder de resolución es de 0.2 µm. La resolución en un ME
depende de la condición del potencial acelerador.

Por lo tanto la gran diferencia radica en reemplazar el haz de luz fotónica

por un haz de electrones que se genera en el cañón electrónico, donde un filamento de
tungsteno en forma de V y con propiedades de termoemisión, al calentárselo con un
voltaje de calentamiento del cátodo produce el haz de electrones. El filamento
constituye el cátodo y está rodeado por un cilindro abierto (cilindro de Wehnelt) que
contribuye a producir un haz más pequeño pero de igual intensidad. El ánodo es un
disco abierto en la base del cilindro de Wehnelt conectado a tierra (con potencial cero).
Los electrones generados son acelerados por un voltaje de aceleración negativo entre el
cátodo y el ánodo de 1000 KV (fuente de alta tensión); el ánodo atrae los electrones, los
saca fuera evitando la acumulación en el filamento, genera una fuente puntual de
electrones y además es enfocante.

El haz de electrones se genera en una columna con un alto vacío a fin de

evitar la dispersión de los electrones al chocar con las partículas de la atmósfera. El alto
vacío se logra en general mediante una bomba difusora apoyada por una bomba
mecánica. La columna tiene un lugar donde introducir el especimen en una precámara;
la misma se pre-vacía antes de ser comunicada con la columna para introducir el
especimen que consiste en una grilla de unos 4 mm de diámetro de cobre o níquel de
200 o 300 mesh, donde se recogen los cortes del material biológico, los cuales deben ser
lo suficientemente finos (60 nm). Una cámara fotográfica se ubica debajo de la pantalla,
por lo general en alto vacío y que se comunica con la columna al levantarse la pantalla y
abrirse un shunt.

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El sistema óptico del ME consiste en bobinas electromagnéticas; las lentes

condensadoras concentran el haz sobre el especimen y permiten también regular la
intensidad de luz. La lente objetivo forma la primera imagen aumentada de la porción
iluminada del especimen en un plano que luego se puede volver a aumentar por las
lentes proyectoras. Las lentes objetivas y proyectoras juntas magnifican la imagen sobre
una pantalla fluorescente o cuando ésta se levanta sobre una placa fotográfica. La lente
objetivo es la más crítica porque de ella depende el poder de resolución. Las lentes
intermedias y proyectoras se usan en condiciones tales que los errores de la lente no
interfieren seriamente con la imagen, usando aperturas angulares tan pequeñas que la
aberraciones son escasas.

En la microscopía electrónica de transmisión (MET), los electrones que

atraviesan la muestra son los que van a impactar en la pantalla para dar la imagen, a
diferencia de la microscopía de scanning (o barrido) (MES o MEB), en la que no son
los electrones transmitidos los que dan la imagen sino los electrones secundarios que
son refractados en la superficie del material biológico. Pero la diferencia con la MO es
que en ésta la imagen se forma porque el material absorbe la luz, proceso intensificado
por las tinciones del especimen, lo que resulta en diferencias visibles en diversas partes
de la imagen. En el ME en cambio, la porción de electrones absorbido por el material
biológico es infinitésima. La formación de la imagen no se basa en la absorción de
electrones sino que se basa en la pérdida de electrones del haz por el scattering (o
dispersión) en distintos puntos del preparado. La imagen se forma en blanco y negro
correspondiendo el negro a las zonas con alta densidad de material capaz de dispersar
electrones; el blanco corresponde a los electrones que no fueron desviados y atraviesan
el espécimen y constituyen el background. Existen escalas de grises.

Podemos resumir las diferencias entre el MO y el ME :

1) Las lentes magnéticas no tienen distancias focales fijas como las lentes
ópticas. La distancia focal es dependiente de la intensidad de campo,
cambiando la corriente que pasa a través de la bobina.

2) En el ME no es necesario cambiar la lente de Objetivo o las proyectoras

cuando se desean distintas magnificaciones. Esto se logra variando la
distancia focal de la proyectora, en tanto que la magnificación del
objetivo es siempre fija.

3) El modo de formar la imagen es diferente en los 2 microscopios. En el

MO se forma por absorción diferente de la luz, en tanto que en el ME la
pérdida de electrones por dispersión en puntos individuales del
espécimen resulta en variaciones de la intensidad de la imagen
(contraste).

Resulta claro por qué es necesario cortes muy finos. A tal fin el material
biológico debe estar incluido en resinas especiales para vacío y con una rigidez
suficiente para poder seccionarlo tan finamente en un ultramicrótomo con cuchillas de

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vidrio o de diamante. Dichas resinas son hidrofóbicas y requieren una deshidratación

previa con solventes como acetona. Tratamientos tan drásticos hacen indispensables una
adecuada fijación del material biológico que asegure la correcta preservación de la
ultraestructura.
Para ello el material debe ser procesado de manera específica y rigurosa.
Este procesamiento incluye fijaciones, deshidrataciones, inclusiones, cortes
ultradelgados, tinciones o contrastados.

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