Universidade Federal do Par Programa de Ps-Graduao em Neurocincias Defesa de Dissertao de Mestrado

Impacto do Isolamento Social no Curso

Temporal da Doena Prion em Modelo Murino.

Amanda de Oliveira Ferreira

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 O temor do Senhor o princpio da sabedoria e de toda cincia. Provrbios do Rei Salomo, captulo 1, verso 7.

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Agradecimentos... Como agradecer a realizao de um sonho? H muitas pessoas que fazem parte dessa conquista e seria impossvel enumer-las todas. Acima de tudo, agradeo a Deus por ter me criado e por ter sonhado como seria cada minuto da minha vida. Ele o sentido da minha existncia. Agradeo a meus pais, pelo esforo, amor e dedicao que me dedicam incondicionalmente. Agradeo aos amigos, especialmente: aos de infncia (Manuela e Luciana), da juventude (Renata, Renan, Lyfson, Rebeca, Josu), da amada faculdade de Psicologia (Jacqueline e Fbio), aos professores e psiclogos (Edson Frazo, Mauro Barreto, Denise Scaff, La Salles e Emanuel Tourinho). Sem vocs, no teria chegado at aqui, seja pelo apoio emocional ou pela inestimvel contribuio que trouxeram para minha prtica e conhecimentos profissionais. Agradeo grandemente ao querido professor Cristovam Diniz, que me recebeu e me orientou sempre com muito bom humor, respeito e algo que realmente me cativou: acreditou no meu potencial (ainda latente) e me conduziu por caminhos que eu nem sabia que poderia andar. Obrigada por ter sido meu orientador. Agradeo aos colegas do Laboratrio de Neuropatologia e Infeco, pelo apoio constante e de grande valor, em especial, aos amigos Juliana Paes, Aline Andrade, Renatinha e Roseane Borner. Finalizo no esmo ponto onde comecei: sou grata ao meu Deus, pois Ele fiel pra terminar a boa obra que comeou em mim. Tenho certeza que essa vitria apenas uma de muitas que Ele me reservou.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM NEUROCINCIAS E BIOLOGIA CELULAR REA DE CONCENTRAO: NEUROCINCIAS.

AMANDA DE OLIVEIRA FERREIRA

ISOLAMENTO SOCIAL ANTECIPA A INSTALAO DAS ALTERAES COMPORTAMENTAIS EM MODELO MURINO DE DOENA PRION

Belm Par Julho/2009

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM NEUROCINCIAS E BIOLOGIA CELULAR REA DE CONCENTRAO: NEUROCINCIAS.

DISSERTAO DE MESTRADO

Amanda de Oliveira Ferreira

Este exemplar corresponde redao final da dissertao defendida por Amanda de Oliveira Ferreira e aprovada pela comisso julgadora.

Aprovada em: 15/07/2009

Orientador: Prof. Dr. Cristovam W. Picano Diniz.

Examinador: Prof. Dr. Juarez A. S. Quaresma.

Examinador: Prof. Dr. Rommel M. R. Burbano

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FERREIRA-OLIVEIRA, A. ISOLAMENTO SOCIAL ANTECIPA A INSTALAO DAS ALTERAES

COMPORTAMENTAIS EM MODELO MURINO DE DOENA PRION. Amanda de Oliveira Ferreira. Belm, Par, UFPA/ICB, 2009.

Dissertao: Mestre em Neurocincias.

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RESUMO

O objetivo do presente trabalho avaliar o impacto do isolamento social sobre a instalao da Doena Prion em modelo murino da variedade Albina Sua. Camundongos isolados (IS) ou agrupados (GR) foram infectados com o agente ME7 ou com homogenado de crebro normal (NBH). O consumo de glicose, a remoo e estocagem de comida e a temperatura anal foram medidos duas vezes por semana, entre a 1 e a 17 semana ps-inoculao (PI). Grooming, Labirinto em Cruz Elevado (LCE), Campo Aberto (CA) e Peso corporal foram mensurados antes da inoculao e na 17 semana PI. Em todos os testes estatsticos (ANOVA, um critrio, Bonferroni a priori) o nvel de significncia foi p<0.05. Burrowing: o grupo ME7-IS apresentou reduo desse comportamento (16 semana PI) mais precocemente que o ME7 -GR (17 semana PI). Consumo de glicose: na 17 PI os sujeitos IS, principalmente o grupo ME7 -IS, reduziram o consumo de glicose quando comparados aos sujeitos GR (NBH e ME7) que mantiveram consumo igual at a 17 semana. Grooming: o grupo ME7-IS apresentou menor freqncia de grooming que os demais (p<0.01). Campo Aberto: os sujeitos GR apresentaram menor atividade que os sujeitos IS antes da inoculao e na 17 semana PI, quando os indivduos ME7-IS demonstraram maior atividade locomotora do que os demais grupos (p<0.01). LCE: os animais isolados apresentaram comportamentos semelhantes aos associados ansiedade, na 3 semana na de isolamento, enquanto que, na 17 semana PI, esses mesmos sujeitos pareciam estar se aproximando do espectro de comportamento semelhante depresso. Alm disso, o grupo ME7-IS apresentou alterao no LCE enquanto que o ME7-GR no teve seu comportamento alterado nesse teste. Burrowing, grooming, consumo de glicose, LCE e peso corporal sugerem uma influncia aditiva do isolamento social nas mudanas comportamentais da Doena Prion. Os grupos ME7 (GR e IS) apresentaram reduo do nmero de redes perineuronais e microgliose, tanto na regio de CA1 como no septum, na 17 semana PI. No encontramos diferena estatstica significante nos achados neuropatolgicos entre os grupos ME7-GR e ME7-IS. Em concluso o isolamento social promove alteraes comportamentais mais precoces e seus efeitos parecem agravar os sintomas da fase precoce da doena. Permanecem por ser investigados os mecanismos moleculares associados a tais alteraes. Palavras-chave: Doena Prion, Isolamento Social, Comportamento, Neurodegenerao Crnica, Camundongo suo albino.

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I. INTRODUO

1. Doenas Neurodegenerativas Crnicas Associadas ao Envelhecimento 1.1 Envelhecimento Normal e Envelhecimento Patolgico.

O envelhecimento normal apresenta inmeras transformaes bioqumicas, morfolgicas, fisiolgicas e psicolgicas (MOI, 2004). Dentre elas, podemos citar a perda de funes biolgicas; a diminuio da fertilidade; o aumento da mortalidade; e o aparecimento de dificuldades cognitivas. Tais modificaes implicam em perda gradual da capacidade de adaptao ao meio ambiente e conseqente diminuio da capacidade de sobrevivncia. O envelhecimento influenciado por fatores como educao, estilo de vida, estresse, alimentao e exerccios fsicos (MOI, 2004). Em geral, o envelhecimento normal no traz danos que interferem abruptamente nas atividades dirias do idoso (CHARCHAT-FICHMAN et al., 2005). Por outro lado, o envelhecimento patolgico possui limites conceituais tnues. Atualmente, muitas caractersticas outrora atribudas idade, so consideradas parte de um quadro de demncia leve no-reconhecida (COREY-BLOOM et al., 1995). Apesar de

observamos uma queda das funes cognitivas gerais no idoso, no normal que as mesmas decresam consideravelmente (ALMEIDA e NITRINI, 1998). O termo demncia designa o declnio progressivo e global das funes cognitivas, interferindo nas atividades sociais e ocupacionais do indivduo e afetando obrigatoriamente a memria (ALMEIDA, 1997; CARAMELLI e BARBOSA, 2002). A demncia uma das maiores causas de morbidade entre idosos e sua prevalncia est entre 2% e 25% dos pacientes com mais de 65 anos (FRATIGLIONI e AMADUCI, 1990). A maioria das doenas crnicas que acometem o indivduo idoso tem a idade como principal fator de risco (ALMEIDA e NITRINI, 1998). 1.2 Neurodegenerao crnica no idoso: o Mal de Alzheimer como a doena do sculo.

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A Doena de Alzheimer tem apresentao clnica e patolgica bem definida (MARINHO et al, 1997), afetando pelo menos 5% dos indivduos com mais de 65 anos e 20% daqueles acima de 80 anos (JORM e JACOMB, 1989), representando a forma mais comum de demncia (TUPPO e ARIAS, 2005). Clinicamente, o indicador mais notvel na Doena de Alzheimer a perda progressiva da memria, alm do prejuzo na linguagem, na capacidade cognitiva, laborativa e social (TEIXEIRA e CARAMELLI, 2006). Nos estgios mais avanados da doena, observam-se alteraes comportamentais significativas, a saber: sintomas depressivos (apatia, desinteresse, desmotivao); sintomas ansiosos (ansiedade generalizada, fobias, perturbaes obsessivocompulsivas); comportamentos agressivos; desinibio sexual e idias delirantes (ABREU et al., 2005). Os primeiros dados sobre a neuropatologia do Alzheimer remontam a 1906, quando o mdico alemo Alois Alzheimer (1864-1915) observou em uma autpsia leses cerebrais at ento desconhecidas: atrofia neuronal, presena de placas e fibras retorcidas em diferentes regies do encfalo (ALMEIDA, 1997). Atualmente, sabe-se que as placas senis so depsitos extracelulares da protena -amilide (Figura 1) e que os emaranhados neurofibrilares so estruturas intraneuronais compostas pela protena tau (Figura 2) (TUPPO e ARIAS, 2005).
Placas -amilide

Neurnio APP

-amilide

Interior celular

Enzimas

Figura1: Agregao da protena -amilide; (APP) protena precursora amilide. Adaptado de: www.boston.com /yourlife/health/special /alzheimers.

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Em condies normais, a protena tau est associada estabilizao dos microtbulos axonais (Figura 2); no Alzheimer ela encontrada nas placas senis e nos emaranhados neurofibrilares (SHIN et al., 1989). O depsito da protena -amilide - derivada da protena precursora amilide (APP) - nas placas senis um dos carimbos oficiais da Doena de Alzheimer (RAMREZ et al., 2005).

Neurnio

Axnio

Microtbulos

Emaranhados neurofibrilares

Tau

Figura 2: A hiperfosforilao da protena tau ocasiona a desintegrao dos microtbulos axonais e a formao dos emaranhados neurofibrilares. Adaptado de: www.boston.com/yourlife/health/special /alzheimers.

O Alzheimer tambm se caracteriza pela perda sinptica, morte neuronal e astrogliose reativa (LEONARD, 2007). As alteraes cerebrais ocorrem especialmente no crtex cerebral e no hipocampo. A etiologia da doena permanece obscura, mas h vrios estudos indicando a importncia de fenmenos inflamatrios (EIKELENBOOM et al., 2002; TUPPO e ARIAS, 2005; ROGERS e LUE, 2001; DICKSON, 1997). EIKELENBOOM et al (2002) destaca quatro evidncias que relacionam o acmulo fibrilar de -amilide a eventos inflamatrios: diversos fatores inflamatrios j foram identificados em crebros com Alzheimer (citocinas e protenas pr-inflamatrias); as placas

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amilides so caracterizadas pela presena de microglia ativada; a ausncia de clulas T e de imunoglobinas indicam que respostas imunes clssicas no esto envolvidas; e no h indcios de que sejam requeridos leuccitos nas repostas inflamatrias do Alzheimer. A neuroinflamao difere da inflamao perifrica, pois alm da ausncia de clulas T, imunoglobinas e leuccitos, no esto presentes sinais inflamatrios caractersticos, como rubor, calor e dor (EIKELENBOOM et al., 2002). Ademais, as clulas neurais se defendem de eventos inflamatrios e patognicos atravs de um estratagema singular: a barreira hemato-enceflica, ausente no sistema vascular perifrico (TUPPO e ARIAS, 2005). Os componentes celulares mais importantes no desenvolvimento das respostas inflamatrias da Doena de Alzheimer so as microglias, os astrcitos e os neurnios, os quais esto envolvidos em processos fundamentais como a homeostase e o funcionamento cerebral (TUPPO e ARIAS, 2005). O Sistema Nervoso Central (SNC) possui um mecanismo endgeno imunoprotetor que coordenado pelas microglias, as quais proveem suporte e proteo aos neurnios (TUPPO e ARIAS, 2005). Dependendo das condies nas quais h ativao microglial, essas clulas podem exercer efeitos neuroprotetores ou neurotxicos (RAMREZ et al., 2005). A microglia ativada nos locais de depsito da protena -amilide, agrupando-se, em seguida, ao redor desses

agregados amilides (TUPPO e ARIAS, 2005). Essa exposio microglial -amilide estimula a secreo de fatores pr-inflamatrios, como as interleucinas (IL-6 e IL-1) e o Fator de

Necrose Tumoral (TNF ) (ROGERS e LUE, 2001). A -amilide pode, ainda, viabilizar a circulao de macrfagos perifricos atravs da barreira hemato-enceflica, aumentando as chances de um evento inflamatrio (TUPPO e ARIAS, 2005). Os astrcitos so as clulas encontradas em maiores quantidades no crebro (TUPPO e ARIAS, 2005). Sabe-se que eles esto envolvidos na conexo dos tecidos e nas funes esquelticas cerebrais, mantendo a integridade funcional das sinapses (TUPPO e ARIAS, 2005). Quando ocorre uma injria neural, os astrcitos participam do processo de cura, formando uma

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cicatriz glial na leso (TUPPO e ARIAS, 2005). Sabe-se pouco sobre o papel dos astrcitos na inflamao da Doena de Alzheimer; no entanto, astrcitos reativos foram associados s placas senis e secreo de molculas pr-inflamatrias (DICKSON, 1997). Alguns dados sugerem que os astrcitos esto envolvidos na sntese ou na fagocitose da -amilide (KURT et al., 1999). Na Doena Prion e no Mal de Alzheimer, os astrcitos parecem ir alm das aes benficas identificadas nas leses agudas, contribuindo para o aumento do dano tecidual e para a evoluo destas doenas (MRAKA e GRIFiN, 2001). Essas aes parecem estar associadas a superexpresso da protena S100B, um mensageiro qumico intercelular em astrcitos ativados (SHENG et al, 1994). Foram descritas dezenove protenas da famlia S100, as quais so encontradas em diversos tecidos e esto envolvidas na regulao intracelular de clcio associado mltiplas funes dependentes do clcio, tais como: fosforilao de protenas; atividades enzimticas; proliferao e diferenciao celular; construo e reparo do citoesqueleto; e homeostase do clcio (DONATO, 1999). O tipo S100B o mais abundante nas clulas da glia do SNC, contribuindo para o crescimento de neuritos, a sobrevivncia de subpopulaes neuronais (durante o

desenvolvimento e aps injrias), alm de estimular a proliferao e hipertrofia de astrcitos (GRIFiN et al, 1995; SHASHOUA et al, 1984). Os astrcitos ativados so componentes indissociveis das placas amilides na Doena de Alzheimer, localizando-se na periferia dessas placas e envolvendo os depsitos amilides (MANDYBUR e CHUIRAZZI, 1990). Esses astrcitos ativados tambm podem ser observados nos estgios iniciais da Doena, antes mesmo da formao de placas, quando o depsito amilide ainda difuso (MRAK et al, 1996). Sabe-se que pacientes com leve distrbio cognitivo, nos primeiros sinais do Mal de Alzheimer, mostram um aumento expressivo do nmero de astrcitos associado a um reduzido nmero de placas; enquanto que, nos estgios mais tardios, o nmero de astrcitos associados placas est diminudo, sugerindo que a astrocitose reativa parece contribuir principalmente para a patologia dos estgios iniciais (PIKE et al, 1995).

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Assim como as microglias e os astrcitos, os neurnios tambm secretam substncias inflamatrias, como IL-1, IL-6 e TNF . Esses produtos conduzem os neurnios a um aumento da toxicidade e morte (TUPPO e ARIAS, 2005).

1.3 A Doena Prion como modelo de Neurodegenerao Crnica

A Encefalopatia Espongiforme Bovina e sua variante humana, a Doena CreutzfeldtJakob, so conhecidas como encefalopatias espongiformes transmissveis ou Doenas Prion (FOURNIER e GRIGORIEV, 2001). Essas desordens neurolgicas so fatais e esto associadas a mudanas conformacionais anormais de protenas celulares: a protena celular prion (PrP c), rica em -hlices, convertida em protena prion scrapie (PrPsc), que contm folhas -pregueadas

(PRUSINER, 1998). Essa a principal diferena estrutural entre as duas formas de prion, visto que a seqncia de aminocidos idntica (SAKAGUCHI, 2007). A PrPc uma glicoprotena da membrana celular expressa em altas concentraes no SNC, especialmente nos neurnios (PRUSINER et al., 1998). A protena prion no possui cido nuclico, replicando-se atravs da converso autocataltica da PrPc em PrPsc (Figura 3) (PRUSINER, 1989). Em condies normais, a PrPc fundamental na emisso de prolongamentos neuronais e na comunicao entre as clulas nervosas (MARTINS et al., 1997).
Passo 1: c PrP normal (em verde)

PrP

PrPsc
Passo 2: Prons invasores estimulam a converso de sc PrP em PrP

Ncleo

Passo 3: O neurnio no consegue destruir o prion aberrante e morre

Passo 4: Os prions migram para outras clulas e recomeam o ciclo

Figura 3: Esquema do processo patolgico da converso da protena prion normal (PrP c) em sua forma aberrante (PrPsc). Adaptado de: http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255prot

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O aparecimento da protena infecciosa no organismo pode ocorrer, entre outros fatores, por hereditariedade, uso de material cirrgico contaminado ou consumo de carne de animais infectados. O acmulo de molculas alteradas nos neurnios provoca a morte dessas clulas, o que pode prejudicar a coordenao motora e a memria (MARTINS et al., 1997). O processo neuropatolgico do prion requer a participao tanto da protena normal quanto da anormal (FOURNIER e GRIGORIEV, 2001). Como exposto na Figura 3, a PrPsc invade o neurnio sadio e fora a PrPc a assumir sua forma patognica. A conformao da PrPsc inflexvel, o que a torna resistente degradao enzimtica e permite que ela se acumule e destrua a clula nervosa. Assim como a Doena de Alzheimer tem como principal caracterstica neuropatolgica o acmulo do peptdeo -amilide, a Doena Prion reconhecida pelo depsito difuso, perivacuolar ou em forma de placas, da protena prion. As placas senis dos pacientes com Alzheimer comumente contm depsitos de PrPc (SCHWARZE-EICKER et al, 2005). Apesar do papel funcional do acmulo de PrPc ainda ser desconhecido, dados sugerem que essa protena promove a formao de placas e que parece ser mediada pelo aumento da agregao do peptdeo -amilide (SCHWARZE-EICKER et al., 2005). Estas duas patologias tambm apresentam em comum ativao microglial e a ao de fatores pr-inflamatrios (EIKELENBOOM, 2002). Em contrapartida, apenas na Doena de Alzheimer vemos a presena prvia de baixas concentraes de -amilide, mais uma evidncia de que processos neuroinflamatrios esto envolvidos (EIKELENBOOM, 2002). Ademais, a ativao microglial exerce um feedback positivo, regulando a sntese de APP e a fibrilao da -amilide, mantendo, assim, a cadeia de eventos que conduzem a neurodegenerao no Alzheimer.

1.4 Doenas Neurodegenerativas Crnicas, Depresso e Ansiedade.

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A associao entre os estados de humor e alteraes biolgicas em humanos remonta a Hipcrates, que acreditava que a melancolia estaria associada a um excesso de bile negra. Charles Darwin foi o primeiro cientista a realizar um estudo cientfico das emoes em animais, no livro A expresso das emoes no homem e nos animais. Nas ltimas dcadas, as pesquisas genticas, moleculares e de neuroimagem tm provido contribuies substanciais sobre os mecanismos neurais subjacentes aos estados afetivos. 1.4.1 Estresse, Depresso e Ansiedade.

O estresse um fator importante para o desenvolvimento de alteraes de humor (MCARTHUR e BORSINI, 2006). Em situaes aversivas, a ativao do eixo hipotlamopituitria-adrenal uma das primeiras respostas fisiolgicas, sendo que a manuteno dessa ativao resulta em altos nveis de glucocorticides, seguida de perda neuronal (LEONARD, 2007; DUMAN, 2004). O estresse crnico tambm afeta o sistema imunolgico e o funcionamento dos neurotransmissores (DUMAN, 2004). A reao ao estresse pode resultar em conseqncias comportamentais e psicolgicas, como a depresso e a ansiedade (NESSE, 1999; FAVA e KENDLER, 2000). As causas que podem levar um indivduo a estados alterados de humor so inmeras. Biologicamente, podemos citar predisposio gentica; funcionamento alterado de

neurotransmissores ou de seus receptores; leses cerebrais; presena de outras condies patolgicas que envolvam circuitos neurais relacionados s emoes (TENG et al., 2005; ROZENTHAL et al., 2004). Quanto s condies ambientais, podemos citar perdas, frustraes, mudanas abruptas, histrico de abandono familiar, dentre muitos (ROZENTHAL et al, 2004). importante frisar que, no tangente ao contexto psicossocial, indivduos diferentes manifestam sintomas depressivos ou ansiosos por motivos distintos, o que depende da capacidade ou possibilidade do mesmo de lidar com as situaes aversivas cotidianas.

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Muitas vezes, uma condio gentica pr-existente manifesta-se aps a exposio do paciente a uma situao traumtica. Segundo CRYAN e HOLMES (2005) a exposio a traumas e a situaes de estresse so os principais fatores predisponentes para o aparecimento da Depresso Maior 1. Ademais, pessoas que enfrentam mudanas abruptas de ambiente ou na forma como so tratadas pelos seus pares apresentam aumento da ansiedade; baixa auto-estima; sentimentos de solido e sintomas depressivos (DEUSSING, 2006). Os sintomas depressivos e ansiosos so heterogneos, manifestando-se em aspectos comportamentais, psicolgicos, fisiolgicos e neurofisiolgicos, como exposto no quadro abaixo (Quadro 1).

Sintomas

Depresso Mudanas no apetite Insnia ou sono excessivo Aumento ou diminuio da atividade motora Perda de peso Anedonia (diminuio do interesse por atividades prazerosas) Dificuldade de concentrao e de planejamento Sentimento de culpa Ideaes suicidas

Ansiedade Inquietao Fadiga Irritabilidade Distrbios do sono Comportamentos compulsivos Excesso de preocupao Pensamentos obsessivos Dificuldade de concentrao Sentimento de perda de controle Lembranas recorrentes de eventos traumticos Taquicardia Rubor Sudorese

Comportamentais (DSM IV, 1994)

Psicolgicos (DSM IV, 1994)

Queda da temperatura Fisiolgicos (OVERSTREET et al, Perda de peso 1994; WILLNER, 1997)

Neuropatolgicos (ROZENTHAL, 2004; LEMAIRE et al, 2000; CONNOR e DAVIDSON, 1998; DEACON et al,2002)

Queda do metabolismo cerebral Alteraes nos sistemas Funcionamento alterado da serotoninrgicos, gabargicos e amdala, hipocampo e crtex frontal noradrenrgicos Queda da neurognese hipocampal Leses hipocampais Queda da expresso de fatores Queda da expresso de fatores neurotrficos neurotrficos

Quadro 1: Quadro dos principais sintomas presentes na ansiedade e na depresso.

1

O conceito de depresso maior inclui os sintomas depressivos como um todo, dos mais leves aos mais severos (DSM-IV, 1994).

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Segundo DEUSSING (2006), a depresso uma patologia de alta prevalncia, atingindo cerca de 20% da populao mundial. Sua caracterstica essencial o humor triste por um perodo prolongado, levando a perda do interesse nas atividades cotidianas (DEUSSING, 2006). Diante da prevalncia e do potencial incapacitante da doena, h um grande esforo das entidades governamentais em desenvolver novas formas de tratamento. Os antidepressivos atuais so eficazes em 65% dos casos e requerem uma administrao continuada (semanas ou meses) (HUNSBERGER et al., 2007). Assim, vrias pesquisas enfocam o esclarecimento das bases neurobiolgicas da depresso, buscando caminhos alternativos de tratamento. Uma possibilidade o estudo dos efeitos do exerccio fsico, que tem mostrado aes antidepressivas em modelos animais (CRYAN e HOLMES, 2005; HUNSBERGER et al., 2007). Paralelamente, problemas cardacos, obesidade, diabetes, ansiedade e demncias, tm sido associados ocorrncia de eventos estressores e Depresso Maior (LEONARD, 2007). O estado ansioso pode ser definido como um desprazer emocional diante de uma situao de perigo ou escassez controlado e modulado por mltiplas regies do Sistema Nervoso Central, incluindo amdala, crtex, ncleo tegmentar ventral, hipotlamo, septum e hipocampo (CLEMENT e CHAPOUTHIER, 1998; FENDT e FANSELOW, 1999; HANDLEY, 1995). Diferentemente da depresso, a ansiedade uma reposta natural e adaptativa a situaes de perigo. O quadro patolgico caracteriza-se por um medo persistente, excessivo, aparentemente infundado ou desproporcional, que interfere significativamente nas atividades cotidianas (CONNOR e DAVIDSON, 1998). Indivduos expostos a estresse peridico podem desenvolver comportamentos de supervigilncia, na tentativa de evitar os efeitos indesejveis da situao ansiognica, mesmo na ausncia dela. A diviso da ansiedade em seis subtipos torna visvel a complexidade comportamental da doena: ansiedade generalizada, transtorno do pnico, fobia especfica, fobia social, transtorno obsessivo-compulsivo e estresse ps-traumtico (DSM IV, 1994).

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H controvrsias quanto relao entre ansiedade e depresso: trata-se de um transtorno misto ou de patologias distintas que, eventualmente, ocorrem em comorbidade? De qualquer forma, ambas so as condies psiquitricas mais prevalentes; as taxas de comorbidade so altas, pois cerca de 85% dos pacientes deprimidos apresentam sintomas ansiosos (RIHMER et al., 2001).

1.4.2 Eventos inflamatrios, demncias e distrbios do humor.

LYKETOS e OLIN (2002) relatam que a incidncia de depresso em pacientes com Alzheimer de, aproximadamente, 50%. Estudos epidemiolgicos indicam que sintomas depressivos, como perda de interesse e de energia, podem estar presentes nos estgios iniciais do Alzheimer (GEERLINGS et al, 2000). Ultimamente, as pesquisas tm concedido espao ao papel do sistema imunolgico e endcrino na depresso (LEONARD, 2007; BRAMBILLA, 2000). Nesse sentido, LEONARD (2007) relatou uma srie de citocinas que provocam mudanas imunolgicas tanto nas demncias (particularmente, no Alzheimer) quanto na depresso: citocinas pr-inflamatrias (IL-1, IL-6, TNF) e citocinas antiinflamatrias (IL-4, IL-10, IL-13 e Fator Transformador do Crescimento Tumoral-). De acordo com o autor, o aumento de protenas pr-inflamatrias tambm encontrado em pacientes com sintomas de fadiga e insnia, comuns na ansiedade. Ainda segundo LEONARD (2007) a perda neuronal resultante das demncias e do estresse pode estar relacionada s mudanas crnicas inflamatrias estimuladas pela ativao de macrfagos no sangue e de microglias no crebro. Quanto s mudanas neurodegenerativas, LEONARD (2007) comenta que elas esto associadas ao aumento de citocinas pr-inflamatrias e a outros mediadores inflamatrios. A ativao microglial por essas citocinas, juntamente com a apoptose astrocitria, resulta em degenerao neuronal. Em suma, o aumento da

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neurodegenerao, a queda da neuroproteo e do reparo neuronal so comuns ao estresse e ao Alzheimer (LEONARD, 2007).

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II. Os Modelos Animais de Depresso e Ansiedade.

Historicamente, o estudo das emoes a partir de modelos animais tem buscado responder a trs questes: quais sistemas neurais esto envolvidos nas emoes; como esses sistemas funcionam quando alterados por psicopatologias; e como essas condies patolgicas podem ser modeladas (CRYAN e HOLMES, 2005). As semelhanas neurofuncionais entre os vertebrados, especialmente os experimentais. Por dcadas os estudos com ratos foram privilegiados, principalmente pelo desempenho desses roedores em testes cognitivos e pela possibilidade do uso de tcnicas invasivas, envolvendo o sacrifcio dos animais para estudos de correlao neuropatolgica. Entretanto, com o desenvolvimento das pesquisas genticas e com o avano do conhecimento sobre as bases neurais do comportamento, tornou-se possvel o uso de animais menores, como os camundongos, de manipulao mais fcil e custo menor (CRYAN e HOLMES, 2005). Podemos dividir os modelos experimentais de depresso e ansiedade em quatro grupos: genticos; neuroqumicos; relacionados a leses cerebrais; e indutores de estresse. mamferos, possibilitaram o desenvolvimento de diversas tcnicas

2.1 Modelos genticos.

No experimento de OVERSTREET et al (1994), os pesquisadores aumentaram a sensibilidade dos roedores ao 8-OH-DPAT (8-hidroxi-DPAT-hidrobromida). Sabe-se que os receptores de serotonina esto envolvidos na patofisiologia da depresso e da ansiedade, alm de participarem da regulao da temperatura corporal. O 8-OH-DPAT reduz a temperatura, induzindo hipotermia. Camundongos sensveis ao DPAT e, portanto, mais propensos queda de temperatura, apresentaram maior tempo de imobilidade no Teste do Nado Forado (conhecido como FST, da expresso inglesa Forced Swim Test) e comportaram-se de forma ansiosa em testes de interao social. 57

LACHMAN et al (1992) criou roedores geneticamente mais propensos a desenvolverem o Desamparo Aprendido. Esses animais mostraram queda no desempenho quando testados para memria espacial e regulao alterada dos receptores de serotonina. WEISS et al (1998), por sua vez, criaram ratos com diferentes desempenhos no FST (um grupo mais sensvel ao teste e outro controle) que recebiam choques na cauda antes de executarem a tarefa. O primeiro grupo apresentou menos tentativa de escape no FST e maior tempo de flutuao em relao aos controles. O comportamento induzido por estresse apresentado pelos roedores foi revertido pelo tratamento crnico com diferentes antidepressivos. YOSHIKAWA et al (2002) objetivou determinar, por mapeamento gentico, os genes que estariam envolvidos na resposta de imobilidade no Teste de Suspenso da Cauda (conhecido como TST, referente expresso inglesa Tail Suspension Test) e no FST. As linhagens estudadas foram a F2, C57BL/6 e C3H/He. Foram encontrados 5 loci que afetam a imobilidade no FST e 4 no TST. Por fim, KROMER et al (2005) observaram que roedores treinados para desenvolver comportamentos ansiosos no Labirinto em Cruz Elevado (LCE) so mais ansiosos em diversos outros testes de ansiedade e apresentam tempo de imobilidade maior no FST e no TST.

2.2 Modelos neuroqumicos.

Podemos elencar os estudos com monoaminas (KALIA, 2005); psicofrmacos (HUNSBERGER et al, 2007; RUSSO-NEUSTADT et al., 2006; SCACCIANOCE et al., 2005; HOCK et al., 2000; DUMAN e MONTEGGIA, 2006); e fatores neurotrficos (HUNSBERGER et al., 2007; RUSSO-NEUSTADT et al., 2006). As monoaminas so representadas por neurnios oriundos de pequenos ncleos no tronco cerebral e no mesencfalo, os quais se difundem pelo crtex e pelo sistema lmbico (KALIA, 2005). O primeiro modelo de funcionamento alterado das monoaminas utilizou a reserpina, droga que causa depleo ou inativao da norepinefrina [NE], induzindo estados depressivos ou

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sedativos. Esses efeitos so reversveis quando so administrados antidepressivos tricclicos [TCA] ou inibidores da monoaminoxidase [MAOI] (MCARTHUR e BORSINI, 2006). A descoberta de que drogas que potencializam a NE tambm tm efeito antidepressivo indicou uma relao entre o funcionamento monoaminrgico e o humor (KALIA, 2005). No mesmo sentido, pacientes deprimidos apresentam elevados nveis de receptores de serotonina [5 HT] e menor quantidade de 5-HT no sangue, na urina e no lquido cefalorraquidiano (KALIA, 2005). Os antidepressivos agem nos sistemas: noradrenrgico, aumentando a atividade cardaca e a presso em ratos (DeGRAAF et al, 1985), porm antagonizando a clonidina (induz hipotermia) (VON VOIGTLANDER et al., 1978); serotoninrgico, revertendo a ao da paracloramfetamina, a qual induz hipertermia e depleo de 5-HT (VON VOIGTLANDER et al., 1978);

dopaminrgico, diminuindo a ao hipotrmica da apomorfina (MAJ et al., 1974). Os receptores benzodiazepnicos (BZD) e o cido gama-butrico (GABA) esto presentes difusamente no Sistema Nervoso Central, afetando diversos sistemas funcionais. Entretanto, os sistemas neuronais envolvidos na regulao da ansiedade so particularmente os ncleos lateral e baso-lateral da amgdala, os quais so ricos em receptores BZD (GRAEFF, 1997; RIBEIRO e KAPCZINSK, 2000). A noradrenalina tem sido relacionada tambm com experincias intrusivas. Na resposta aguda ao estresse, h um aumento importante de noradrenalina na fenda sinptica, resultando num aumento da resposta monosinptica evocada (KATZ et al, 1996). Finalmente, o estresse aumenta a liberao e o metabolismo da dopamina no crtex pr-frontal, uma rea envolvida na produo de respostas ao estresse (CHARNEY et al., 1993). Nos ltimos anos, os pesquisadores tm submetido os animais a modelos que alteram especificamente os marcadores neurais desejados, aplicando, posteriormente, antidepressivos ou ansiolticos especficos.

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Paralelamente, HUNSBERGER et al (2007) discute que a ao dos antidepressivos possivelmente envolve a regulao de fatores neurotrficos. Esses fatores participam de funes fundamentais sade neuronal: sobrevivncia, diferenciao, suporte, manuteno e aumento da atividade do neurnio e so afetados pelo estresse (HUNSBERGER et al, 2007; RUSSONEUSTADT et al, 2006). O Fator Neurotrfico de Crescimento cerebral (BDNF) o mais encontrado no crebro, especialmente no hipocampo. Estudos indicam que o BDNF reduzido em roedores submetidos a modelos animais de depresso e em pacientes com Alzheimer; em contrapartida, estimulado pelo exerccio fsico (HUNSBERGER et al, 2007; RUSSO-NEUSTADT et al, 2006; SCACCIANOCE et al, 2005; HOCK et al, 2000; DUMAN e MONTEGGIA, 2006). Infuses intraventriculares de IGF-1 (Fator de Crescimento Insulnico) e VEGF (Fator de Crescimento Vascular Endotelial) produzem aes antidepressivas no Teste do Nado Forado e no Desamparo Aprendido (NEWTON et al, 2003).

2.3 Modelos relacionados a leses cerebrais.

Considerando-se que a depresso altera o funcionamento cerebral, de suma importncia avaliar o impacto causado pelas leses neuronais em modelos animais de depresso. A regio mais estudada o bulbo olfatrio. Leses nessa regio prejudicam as conexes do eixo hipotlamo-sistema lmbico, causando, portanto, mudanas neurofisiolgicas e comportamentais (SONG e LEONARD, 2005). Essas mudanas so comparveis aos sintomas da depresso, pois ratos bulbectomizados apresentam: aumento da explorao e da hiperatividade no teste do Campo Aberto; dficits no ritmo circadiano e em atividades cognitivas; nveis elevados de glucocorticides; queda da ingesto de glicose e do comportamento sexual; e anedonia (HARKIN et al., 2003; MONLEON et al., 1995). Segundos esses autores, tais alteraes no seriam causadas simplesmente pela perda olfativa, mas por modificaes nas sinapses e na densidade de regies como o hipocampo e a amgdala.

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2.4 Modelos indutores de estresse.

A maioria dos modelos de depresso e ansiedade utiliza a exposio do animal a situaes estressantes. No primeiro caso, observa-se uma incapacidade do mesmo de enfrentar situaes aversivas; enquanto que, no tocante ansiedade, os roedores tendem a exacerbar seu comportamento natural de evitar/esquivar-se de situaes aversivas. O Teste do Nado Forado (FST) e o Teste de Suspenso da Cauda (TST) baseiam-se na premissa de que um roedor submetido a uma situao aversiva e incontrolvel empreender tentativas de escape at, finalmente, permanecer imvel. Enquanto no FST o roedor encontra-se imerso em um cilindro com gua, no TST ele preso pela cauda verticalmente. A validade destes testes consiste no fato de diversos antidepressivos diminurem o tempo de imobilidade do animal (CRYAN e HOLMES, 2005). A imobilidade apresentada nestes testes interpretada como uma falha em persistir na fuga de uma contingncia aversiva. Comparativamente, em pacientes deprimidos, h uma inabilidade de lidar com o estresse (CRYAN e HOLMES, 2005). O FST e o TST so sensveis a vrios fatores que influenciam ou so alterados em humanos deprimidos, como predisposio gentica, anedonia, exposio prvia a eventos estressores e alteraes no sono (CRYAN e HOLMES, 2005). Para CRYAN et al (2005), ambos os testes possuem a vantagem de ser facilmente aplicados, requerem pouco tempo (5-6 min) e ainda, de responderem a um amplo espectro de antidepressivos. Apesar das semelhanas, CRYAN et al (2005) apontam algumas diferenas entre o FST e o TST: o tempo de imobilidade do animal varia bastante; as doses eficazes de antidepressivos so distintas; o primeiro pode induzir hipotermia, enquanto o segundo induz hipertermia; a alternao entre agitao motora imobilidade visvel somente a partir do 3 minuto no FST. O modelo do Desamparo Aprendido baseia-se na observao de dficits de tentativas de escape em roedores que recebem choques incontrolveis. Os efeitos do Desamparo Aprendido permanecem apenas 2-3 dias aps o termino das sesses de choque; no entanto, quando os

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animais so expostos a estressores crnicos moderados, os sintomas permanecem por semanas, sendo revertidos por fluoxetina e imipramina (CRYAN et al., 2002). Outro modelo de depresso muito utilizado o Estresse Crnico Moderado (CMS). WILLNER (1997) comenta que, ao desenvolver este modelo, planejava simular a depresso tanto na sintomatologia quanto na cronicidade. O CMS induz anedonia nos roedores, a qual caracteriza-se por uma queda da capacidade de buscar situaes que antes da depresso eram consideradas prazerosas. Os estressores propostos por WILLNER (1997) so: iluminao noturna; perodos de privao de gua ou comida; mudanas de companheiro da gaiola. Os testes comportamentais mais comumente utilizados para medir o grau de ansiedade e atividade locomotora so, respectivamente, o Labirinto em Cruz Elevado (LCE) e o Campo Aberto (CA), que exploram a averso natural dos roedores a espaos abertos e a tendncia natural explorao de ambientes ou objetos novos sem risco aparente (ASANO, 1986; HANDLEY e MITHANI, 1984; HEGMANN e DEFRIES, 1968; LISTER, 1987; MONTGOMERY, 1955; PELLOW et al, 1985; RODGERS e JOHNSON, 1997; TREIT et al, 1993). O LCE usado para investigar as bases biolgicas da emoo e suas correlaes com memria, aprendizado, sndromes de dependncia e abstinncia, assim como vrias formas de sndromes ansiosas (PELLOW et al, 1985). No teste do LCE, os animais ficam livres para explorar o ambiente, que dividido em dois braos abertos, dois braos fechados e uma plataforma central, observando-se uma preferncia natural dos roedores pelos braos fechados, que evitam as reas abertas, sendo esse um indicador de ansiedade natural (HANDLEY e MITHANI, 1984) O teste de Campo Aberto comum na anlise de comportamentos ansiosos, atividade motora ou sedao (PRUT e BELZUNG, 2003). A ansiedade medida pelo teste parece ser ativada por dois fatores: a separao do indivduo de seu grupo social na hora do teste, e a agorafobia produzida pela exposio do animal arena, que desenhada para ser aberta e maior do que o ambiente natural que ele costuma habitar. A ansiedade gerada por esse tipo de

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paradigma s se instala em espcies gregrias e que exibem medo em espaos abertos, nos quais so forados a entrar (PRUT e BELZUNG, 2003). Apesar da grande disponibilidade de modelos animais, necessrio estar atento a alguns critrios de validao dos testes. Os mais aceitos so os propostos por MCKINNEY e BUNNEY (1969): os sintomas ou manifestaes apresentadas pelos animais devem ter razes anlogas patologia em humanos; as mudanas comportamentais precisam ser objetivamente observveis; a produo de mudanas comportamentais reversveis pelos mesmos tratamentos efetivos em humanos; e os resultados devem ser reproduzveis entre diferentes laboratrios.

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3. Plasticidade na Formao Hipocampal

A capacidade do Sistema Nervoso, especialmente dos neurnios, de adaptar-se s diferentes situaes vivenciadas pelos indivduos conhecida como neuroplasticidade. Esse fenmeno imprescindvel ao funcionamento neural e est presente desde leses irreversveis at os processos de aprendizagem (LENT, 2004). A fase mais plstica do Sistema Nervoso durante o desenvolvimento ontogentico, no qual o organismo est altamente suscetvel s modificaes ambientais e s informaes genticas (LENT, 2004).

3.1 O hipocampo

O hipocampo composto por duas reas principais: o corno de Amon (tambm chamado de hipocampo propriamente dito) e o giro denteado (LENT, 2004). Em seces coronais, o corno de Amon divide-se em quatro campos, de acordo com a morfologia dos neurnios piramidais, chamados de CA1, CA2, CA3 e CA4 (Figura 5) (DUVERNOY, 1998). Quanto s conexes hipocampais, as fibras perfurantes so aferentes externos ao hipocampo e fazem sinapse com as clulas granulares do giro denteado. Os axnios das clulas granulares, por sua vez, estabelecem sinapses com os dendritos das clulas piramidais e se estendem at a regio de CA3. Por fim, as clulas piramidais podem seguir dois caminhos: projetar seus axnios para fora do hipocampo ou enviar os colaterais de Schaffer regio CA1, onde fazem sinapses com os dendritos de outras clulas piramidais, cujos axnios projetam para fora do hipocampo (LENT, 2004). Segundo FRITSCHY et al., (1998), as clulas granulares e as glutamatrgicas piramidais representam 90% do hipocampo, enquanto que interneurnios produtores de GABA correspondem a 10%.

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Colaterais de Schaffer

Fibras perfurantes

Fibras musgosas

Figura 4. As fibras Colaterais de Schaffer conectam a regio CA3 a CA1, representando o circuito neural no qual ocorre a LTP. A regio de CA3 comunica-se com o giro denteado atravs das fibras musgosas. As fibras perfurantes so provenientes do crtex entorrinal e conduzem informaes sensoriais ao giro denteado. Na camada de neurnios piramidais (CA1) encontramos o estrato oriens. O giro denteado divide-se em camadas: molecular, granular e polimrfica (ou hilo). Figura adaptada encontrada em www.sciencephtolibrary.com.

Leses em diferentes subcampos hipocampais ocasionam respostas fisiolgicas e comportamentais distintas; isso porque h diferenas na conectividade aferente e eferente ao longo do eixo longitudinal do hipocampo, dividindo-o em uma poro dorsal e uma poro ventral, ambas funcionalmente distintas (CAMPBELL e MACQUEEN, 2003; SAHAY e HEN, 2007). SAHAY e HEN (2007) esclarecem que a parte dorsal do giro denteado recebe projees do crtex entorrinal, o que concede a essa rea participao no processamento de informaes sensoriais visuais e espaciais. Assim, leses no hipocampo dorsal afetam a aprendizagem espacial e a memria. Acerca do hipocampo ventral, os autores supracitados explicam que, alm do envio de projees axonais para o crtex pr-frontal, essa regio possui forte conexo com a amgdala, o ncleo acumbens, os terminais estriados e com o eixo hipotlamo-adrenal-hipofisrio. Classes especficas de interneurnios e fibras musgosas so mais freqentes no hilo ventral; ambos so 65

modulados por vias dopaminrgicas, serotoninrgicas e noradrenrgicas, circuitos conhecidos pela influncia nos estados de humor. Injrias no hipocampo ventral ocasionam alteraes nos comportamentos relacionados s emoes (CAMPBELL e MACQUEEN, 2003; SAHAY e HEN, 2007). O hipocampo a principal regio de acmulo da protena prion (FOURNIER e GRIGORIEV, 2001). A injeo intrahipocampal dessa protena altera caractersticas comportamentais (GUENTHER et al., 2001), neurolgicas (JEFFREY et al., 1995) e eletrofisiolgicas (JOHNSTON et al., 1998). Dentre os tipos de prion estudados em camundongos, o ME7 conhecido pela ao patolgica no hipocampo e no tlamo, ocasionando perda sinptica e alteraes comportamentais (SCHWARZE-EICKER et al., 2005).

3.2 A plasticidade sinptica no hipocampo

A primeira teoria conectando memria e plasticidade surgiu nos anos 40, quando o psiclogo Donald Hebb props que a transmisso de informao entre dois neurnios seria facilitada ou fortalecida se houvesse sincronia entre o disparo do primeiro e do segundo neurnio. A comprovao dessa teoria s foi possvel anos mais tarde, quando Bliss e Terje Lomo aplicaram uma estimulao repetitiva nas fibras colaterais de Schaffer e verificaram um aumento significativo na atividade eltrica das clulas piramidais de CA1. Mesmo aps a interrupo da eletroestimulao, o potencial ps-sinptico excitatrio mantinha-se por horas ou dias. O LTP (Potenciao de Longa Durao) um exemplo de plasticidade sinptica especfico, pois s ocorre entre os colaterais de Schaffer (neurnio pr-sinptico) e as clulas piramidais de CA1 (neurnio ps-sinptico). Assim como no condicionamento clssico, o LTP uma induo associativa, pois s ocorrer se a estimulao for suficientemente forte para

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despolarizar os colaterais de Schaffer e aumentar a eficcia sinptica entre os neurnios envolvidos (MORRIS e FREY, 1997). A LTP o modelo mais estudado de plasticidade sinptica e foi primeiramente identificado no hipocampo; estudos indicam que tanto o hipocampo quanto a amgdala sofrem modificaes sinpticas durante a aprendizagem (WHITLOCK et al., 2006). O hipocampo ocupa um papel central no estudo da plasticidade sinptica, especialmente em relao ao armazenamento das informaes. O padro laminar de neurnios e os caminhos neuronais existentes possibilitam que o hipocampo armazene eventos sinpticos por perodos virtualmente ilimitados in vivo (NEVES et al., 2008).

3.3 Prion e Plasticidade Sinptica

O modelo murino da Doena Prion resulta em perda sinptica, mudanas na plasticidade sinptica e degradao das redes perineuronais. A reduo da plasticidade sinptica (LTP) ocorre no hipocampo ventral, acompanhada de dificuldade em testes comportamentais que envolvem a atividade hipocampal (FRANKLIN et al, 2008). A expresso da LTP hipocampal depende da integridade de uma regio especfica da matriz extracelular, a chamada rede perineuronal, a qual formada por clulas gliais, neurnios e sinapses (FRANKLIN et al, 2008). No crtex cerebral, as redes perineuronais associam-se a interneurnios inibitrios gabargicos positivos para parvalbumina; no hipocampo, esto dentro ou prximos camada piramidal do hipocampo propriamente dito, subculo e pr-subculo, mas tambm nos neurofilamentos de CA2 e CA3 (FRANKLIN et al, 2008). Modelos experimentais que no possuem alguns componentes das redes perineuronais (tenascina e brevican) mostram reduo na LTP (BRAKEBUSCH et al., 2002). Ademais, a perda de redes perineuronais em modelos humanos e experimentais de Doena de Creutzfeldt-Jakob precede a degenerao neuronal (GUENTCHEV et al., 1998).

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Estudos genticos com roedores sugerem que a ausncia de PrP c prejudica tanto a funo quanto a plasticidade sinptica. Sabemos que a presena dessa protena essencial para o desenvolvimento da Doena Prion, mas a sua ausncia altera a LTP (BRANDNER et al., 1996). Se o PrP tem uma papel crtico na LTP, podemos esperar que o seu acmulo anormal diminua a funo sinptica no hipocampo (JOHNSTON et al., 1998). A matriz extracelular (ME) do tecido nervoso formada por uma complexa rede de protenas e carboidratos secretados tanto por neurnios quanto por clulas gliais e difere da ME de outros tecidos por suas propriedades bioqumicas, composio molecular e complexidade de funo (JOHN et al, 2006; RAUCH, 1997; RUOSLAHTI, 1996). Uma das principais especializaes da ME no SNC so as Redes Perineuronais presentes em alguns neurnios (GOLGI, 1989). Essas redes so compostos agregados de macromolculas de proteoglicanos (MIYATAL et al, 2005), formadas por protenas da membrana plasmtica associadas cadeias longas de dissacardeos

(glicosaminoglicanos). A composio das redes perineuronais pode diferir dependendo do tipo neuronal, regio cerebral ou mesmo espcie animal a ser considerada (BANDTLOW E ZIMMERMANN, 2000). No que concerne ao papel funcional das redes perineuronais, recentemente levantou -se as seguintes hipteses: molculas-guia para axnios em crescimento; concentradoras de fatores de crescimento em microambiente ao redor de certos neurnios; manuteno das relaes intercelulares e estabilizao das sinapses formadas; e integrao dos inputs sinpticos e propriedades eltricas da membrana (BENEYTO et al, 1999; BRUCKNER et al, 2006; CELIO et al, 1998; HENDRY et al, 1988; MULLIGAN et al, 1989; VIGGIANO, 2000). A perda de redes perineuronais coincide com a ativao microglial e com a reduo da plasticidade sinptica na Doena Prion (Franklin et al., 2008b).

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4. Neurognese, Astrognese, Depresso e Ansiedade.

H pouco tempo acreditava-se que o Sistema Nervoso no possua a capacidade de gerar novos neurnios, uma vez que, aps a embriognese, as clulas progenitoras neurais seriam incapazes de dividir-se (SCORZA et al, 2005). Desde a dcada de 90, entretanto, inmeras pesquisas constataram a existncia de trs reas no crebro mamfero geradoras de clulas nervosas: a zona subventricular, o giro denteado do hipocampo e o bulbo olfatrio (Figura 5) (SCHARFMAN e REN, 2007). Segundo esses autores, a neurognese parece ocorrer para fins bastante especficos, possuindo, assim, limitaes. Em condies neuropatolgicas, por exemplo, h liberao de fatores neurotrficos e conseqente migrao de novos neurnios para a regio lesada. Em seguida, h um decrscimo da taxa dessas clulas. A sobrevivncia desses neurnios pode sofrer influncia da aprendizagem e do enriquecimento do ambiente (SCHARFMAN e REN, 2007). O hipocampo possui conexes com outras reas cerebrais - crtex pr-frontal, crtex cingulado e amgdala - tambm conhecidas por possurem relaes com comportamentos afetivos. Seguindo esse raciocnio, parece possvel que alteraes na neurognese hipocampal contribuam para os sintomas apresentados nas sndromes depressivas e ansiosas (DUMAN,

Figura 5. Localizao de clulas progenitoras mitoticamente ativas no SNC adulto. Fonte: SCORZA et al, 2005.

2004).

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Especialmente em razo dos efeitos positivos dos antidepressivos na neurognese hipocampal, essa regio tem sido o principal alvo de estudos neuropatolgicos sobre os distrbios do humor (CAMPBELL e MACQUEEN, 2003). Apesar de no ser o nico responsvel pela complexa gama de sintomas emocionais, o hipocampo parece desempenhar um papel patofisiolgico central. No campo das pesquisas com antidepressivos, em modelos que utilizam o FST (Teste do Nado Forado), os efeitos da fluoxetina so permeados pela neurognese (AIRAN et al, 2007). Em humanos, os medicamentos antidepressivos demoram algumas semanas para fazer efeito, o que pode estar relacionado ao tempo de maturao de novos neurnios no giro denteado (SAHAY e REN, 2007). Estudos recentes de neuroimagem mostram que a magnitude da reduo hipocampal est diretamente ligada gravidade do estresse; tratamentos antidepressivos/ansiolticos reduzem os efeitos dessa atrofia (DUMAN, 2004). De forma anloga, histria prvia do paciente, histrico familiar e presena de outras doenas podem contribuir para a alterao do volume hipocampal (CAMPBELL e MACQUEEN, 2003). Essas alteraes podem ser causadas pela remodelao de elementos celulares chave, envolvendo retrao de dendritos e perda de clulas gliais (CAMPBELL e MACQUEEN, 2003). BECKER e WOJTOWICZ (2006) sugerem que a conexo entre hipocampo e neurognese est fundamenta basicamente em duas evidncias. Primeiro, o estresse largamente conhecido por seu papel contributivo na patognese da depresso maior e, em conjunto com outros fatores predisponentes, pode ocasionar dficit na gnese neuronal. Em segundo, tratamentos benficos para os sintomas depressivos estimulam a neurognese, como exerccio, ECT (Eletro Convulso Terapia) e enriquecimento ambiental. Estudos com animais que sofreram estresse indicam reduo da expresso dos receptores GABA A, aumento da ansiedade, alm de reduo na neurognese (CALDJI et al., 2000, 2003,

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2004). Os efeitos inibitrios do estresse esto mais relacionados proliferao do que a maturao, sobrevivncia ou diferenciao neuronal (KARTEN et al., 2005). H poucos estudos sobre a relao entre os astrcitos e a ansiedade. Sabe-se que a astrogliose no giro cingulado pode causar comportamentos ansiosos em roedores, o que pode levar a mudanas na transmisso sinptica e a efeitos ansiognicos (NARITA et al., 2006). A presena de astrcitos no crtex cingulado (microinjetados em roedores de dois meses) ou a liberao de molculas por estas clulas esto implicadas, de alguma forma, na ansiedade (NARITA et al., 2006). Os processos prprios do envelhecimento promovem astrogliose atravs da disfuno no receptor gama-opiide no crtex frontal, incluindo o crtex cingulado. Isso pode levar a distrbios emocionais, como aumento da ansiedade e da depresso (NARITA et al., 2006).

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5. Neuromorfologia quantitativa.

Embora haja um conjunto notvel de estudos dedicados a revelar aspectos morfolgicos, fisiolgicos e comportamentais associados formao hipocampal do camundongo, tanto em condies normais como em alteradas, no h esforo sistemtico para investigar o nmero de elementos celulares que compem quela regio, empregando estimativas sem vis (BONTHIUS et al, 2004; BUCKMASTER et al, 2002; FABRICIUS et al, 2008; LONG et al,1998A; LONG et al, 1998B; LORENZI AND REEVES, 2006; MOUTON et al, 2002; SEVERI et al, 2005; WIRENFELDT et al, 2003). Quando se fala de estimativas sem vis no contexto da contagem de elementos de interesse em uma dada regio, estamos nos referindo a um captulo da estatstica espacial denominada estereologia, que permite a realizao de anlises quantitativas de estruturas tridimensionais, a partir da reconstruo serial de estruturas bidimensionais (WEIBEL, 1989). Dado que neste trabalho estima-se o nmero de clulas empregando o fracionador ptico, interessante rever, ainda que superficialmente, suas bases conceituais. A regra geral em anlises qualitativas encontrar palavras descritivas tais como menores, maiores, mais largas, menos freqentes, mais freqentes, diferente, similar, ausncia ou presena que em geral so suficientes para os propsitos investigados (SCHMITZ e HOF, 2005). Entretanto, outros estudos que geram anlises quantitativas e expressam valores numricos sobre contagem de clulas, densidades, reas e volumes apresentam resultados controversos que se devem suposies prvias acerca do tecido, da geometria das clulas e de suas distribuies no plano da seco (GEINISMAN et al, 1995; MAYHEW e GUNDERSEN, 1996). Esses estudos quantitativos eventualmente introduzem vieses de amostragem e/ou erros sistemticos, cuja magnitude impossvel de ser apreciada, qualquer que seja a resoluo da anlise: ptica (Gardella et al., 2003; Howard and Reed, 2005; Mandarim-de-Lacerda, 2003;

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Mayhew and Gundersen, 1996), confocal (KUBINOVA e JANACEK, 2001; PETERSON, 1999) ou eletrnica (FIALA e HARRIS, 2001; NYENGAARD e GUNDERSEN, 2006). A anlise microscpica, em qualquer nvel, uma ferramenta analtica poderosa para se descrever formas normais e anormais de tecidos biolgicos, particularmente se for possvel gerar nmeros a partir de seces histolgicas. Entretanto necessrio considerar que, se um microscpio utilizado para analisar a estrutura de interesse, inevitvel, na maioria dos experimentos, que apenas uma pequena frao da rea de interesse original ser de fato analisada em detalhe (HOWARD e REED, 2005; SCHMITZ e HOF, 2005). Para contornar tais vises, empregam-se tcnicas estereolgicas que estimam o nmero total dos objetos contidos em uma dada regio de interesse atravs de coleta de informao aleatria e sistemtica, multiplicando-se o nmero de elementos de interesse registrados pelos valores de probabilidade da amostra (WEST, 2002). O termo sem vis utilizado para definir sistemas de amostragem que so independentes das propriedades do tecido, onde as dimenses da sonda (caixa de contagem) e os parmetros amostrais a ela associados (nmero e intervalo entre elas) so definidos a priori, desprezando-se a coleta de dados acerca do tamanho, forma e orientao espacial da rea a ser investigada (GLASER e GLASER, 2000). Assim, os nmeros estimados a partir da amostragem podem ser expressos em valores relativos ou absolutos indicando volume, nmero, conectividade, distribuio espacial e tamanho das estruturas biolgicas, sem conhecimento prvio da geometria das clulas ou do tecido a ser investigado e.g. (GLASER e GLASER, 2000; SCHMITZ e HOF, 2005; WEST, 2002). Dentre todos os procedimentos utilizados para estimar o nmero total de objetos de interesse dentro de uma determinada regio ou camada, o fracionador ptico o que tem sido usado com mais freqncia, pois combina as propriedades da sonda tri-dimensional para contagem dos elementos de interesse (o dissector ptico) com o sistema de amostragem sistemtica e aleatria (o fracionador), removendo vieses amostrais e pressuposies (WEST et

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al, 1991). Essa metodologia foi adotada no presente trabalho e sua utilizao para fins prticos descrita a seguir.

5.1. O fracionador ptico em ao

Para estimar o nmero de clulas dentro de um volume especfico, usando investigao estereolgica sem vis, a estereologia utiliza caixas de contagem virtuais (sondas estereolgicas) aplicadas a uma srie ordenada de seces histolgicas obtidas das regies de interesse. possvel seccionar opticamente as seces histolgicas usando objetivas de grande abertura numrica para produzir imagens de baixa profundidade de foco. O plano de foco (ou seco ptica) pode ser deslocado, atravs de distncias conhecidas, ao longo da espessura da seco, produzindo planos de foco contnuos atravs dos quais a contagem feita de acordo com as regras de contagem do dissector escolhido. Na prtica, o que acontece a incluso na contagem de objetos novos que entram em foco (ou saem de foco) enquanto descemos ou subimos dentro da caixa de contagem de volume conhecido. A combinao do dissector ptico com o fracionador de amostras, conhecida na literatura como fracionador ptico (WEST et al, 1991), tem numerosas vantagens prticas, sendo a principal o fato de no ser afetado pela retrao do tecido e no requerer definies rigorosas de fronteiras estruturais, que podem ser feitas em objetivas de baixo aumento. O fracionador ptico envolve a contagem de objetos utilizando sondas de dissectores pticos em uma amostra sistemtica uniforme que constitui uma frao conhecida do volume da regio em anlise. Na prtica, isso feito atravs de amostragem sistemtica de uma frao conhecida da espessura da seco, tsf (iniciais de thickness sample fraction), de uma frao conhecida da rea seccional asf (iniciais de area sample fraction) e de uma frao conhecida do nmero de seces que incluem a regio de interesse, ssf (iniciais de section sample fraction).

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Cada anlise estereolgica comea com o delineamento da regio de interesse em uma srie de seces escolhidas de forma randmica e sistemtica (HOWARD e REED, 2005). Para analisar sistematicamente e registrar a ocorrncia dos objetos de interesse, necessrio mudar para uma objetiva de grande aumento (60x) com elevada abertura numrica e reduzida profundidade de foco (SCHMITZ E HOF, 2005). Utilizando essa metodologia no possvel contar todas as clulas dentro da regio de interesse. Para contornar esse dilema e obter estimativas confiveis (que se aproximam do real) a partir de uma diminuta frao amostral, necessria a utilizao de coleta sistemtica e aleatria de dados, incluindo a terceira dimenso. Essa alternativa assegura a estimativa adequada do nmero total de clulas dentro da rea de interesse, a partir do nmero de clulas detectadas em cada caixa de contagem da amostra e da probabilidade amostral (SCHMITZ E HOF, 2005). Entretanto, mesmo com todos esses cuidados, a incerteza nas estimativas ainda permanece e decorrente de outras fontes de erro possveis, como aquelas introduzidos pelos pressupostos do operador acerca dos grupos experimentais, pelas alteraes induzidas nas seces pelo processamento do tecido, pela ambigidade no reconhecimento de reas ou dos objetos de interesse. Para minimizar esse tipo de incerteza necessrio executar uma srie de procedimentos controle, como ensaios duplo-cegos, escolhas adequadas no tipo de processamento tecidual incluindo fixao, plano de corte, imunohistoqumicas seletivas, garantindo a cada passo que todas as regies da estrutura tenham a mesma probabilidade de contribuir para a amostra, reduzindo a ambigidade no reconhecimento dos limites da regio assim como dos objetos da contagem. A partir de critrios arquitetnicos, hodolgicos e de marcadores seletivos, possvel caracterizar sem ambigidades as reas e os objetos de interesse com arquitetonia clssica utilizando tcnicas consagradas (como o Nissil); imunohistoqumica e histoqumicas especficas. Para caracterizao de reas ou ncleos funcionais especficos no sistema nervoso, uma srie de critrios so aplicados e foram resumidos em cinco principais abordagens

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experimentais: estudos arquitetnicos, padro de conexes, mapeamento topogrfico, anlise eletrofisiolgica de propriedades de neurnios isolados e dficits comportamentais aps leses seletivas reprodutveis (PHILLIPS et al., 1984).

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6. O Modelo Murino de Doena Prion.

Os efeitos da protena prion anormal so estudados em vrios mamferos, entre eles ovelhas, gatos, bovinos, cabras e roedores (BRUCE, 2003). As primeiras pesquisas sobre o prion investigaram as caractersticas biolgicas elementares e descobriram que a doena transmissvel e que possui diferentes espcies, as quais possuem tempos de incubao e cursos neuropatolgicos diferenciados. Em seguida, os estudos concentraram-se no isolamento e na caracterizao bioqumica da protena PrPsc (TELLING, 2000; BRANDNER et al., 2000). Nos ltimos anos, animais geneticamente modificados tm sido utilizados para a caracterizao gentica da protena anormal e para o estudo dos efeitos dos tipos de prion em diferentes espcies de mamferos. Nesse sentido, a confirmao do papel essencial da protena prion normal no desenvolvimento da Doena Prion provm de pesquisas com ratos que sofreram ablao do gene PrP e que se mostraram resistentes ao prion e incapazes de reproduzir as protenas infecciosas (PRUSINER, 1998; BRANDNER et al., 2000). A microinjeo hipocampal de homogenado cerebral infectado com o agente ME7 (uma espcie de prion estudada em murinos) produz neurodegenerao progressiva (GUENTHER et al., 2001). Apesar dos sinais clnicos s aparecerem vinte semanas aps a inoculao, mudanas no desempenho cognitivo e locomotor so visveis antes disso, sendo que o curso total do ME7 gira em torno de 24 semanas (BETMOUNI et al., 1999; DEACON et al., 2001). Em relao a outras espcies de prion, o ME7 atinge principalmente o hipocampo, possibilitando o estudo de alteraes na memria dos roedores infectados (GUENTHER et al., 2001). O critrio usado para o comeo dos sinais clnicos a deteco de mudanas na atividade locomotora, que aparece poucas semanas antes da morte (HUNTER et al., 1986). Diversos testes so realizados na tentativa de caracterizar os prejuzos cognitivos causados pelo ME7. A tela invertida requer que o camundongo exera fora com as quatro patas juntas. A barra horizontal, alm de avaliar a fora nas patas, tambm detecta dficits na coordenao (GUENTHER et al.,

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2001). As mudanas comportamentais precoces no modelo murino de prion est associado ativao microglial, ativao de astrcitos e deposio de PrPsc no sistema lmbico (CUNNINGHAM et al, 2003). O burrowing um teste simples e de curta durao muito sensvel aos efeitos precoces do da doena induzida pelo agente ME7 (DEACON et al, 2001). A inibio do burrowing ocorre quando a atividade no Campo Aberto aumenta; assim, esse decrscimo no devido a uma depresso motora geral (GUENTHER et al, 2001). Mudanas no comportamento espontneo (aumento da atividade locomotora, queda no burrowing e no consumo de glicose) precedem tanto o prejuzo nas tarefas que requerem coordenao e fora motora quanto os sinais clnicos mais severos (DEACON et al, 2001; GUENTHER et al, 2001). A espcie C57BL/6J bastante estudada na Doena Prion; nessa variedade de camundongo, a deposio do PrPsc causa morte por apoptose, a qual precedida por alteraes sinpticas e dendrticas (GIESE et al., 1995; LUCASSEN et al., 1995; CUNNINGHAM et al, 2003). Essa morte ocorre nos ltimos estgios da doena (GUENTHER et al., 2001). Anlises com microscopia eletrnica mostram perda de sinapses no estrato radiado do hipocampo em 98 dias (CUNNINGHAM et al, 2003). Diante do exposto e da literatura revisada at o momento, consideramos importante estudar a influncia de eventos estressores prvios no curso temporal da Doena Prion pelos seguintes motivos: 1. J sabemos que o hipocampo uma regio de vital importncia para o estudo da Doena Prion e de eventos estressores. Desse modo, plausvel supormos que a combinao dessas condies patolgicas, em modelos animais, resulte em mudanas hipocampais significativas. 2. H poucos estudos sobre o agente ME7 na variedade sua albina. 3. No obstante os efeitos significativos do estresse no organismo, no existem trabalhos na literatura que investiguem a influncia de eventos estressores prvios no desenvolvimento da Doena Prion.

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4. No h dados, na variedade sua albina, acerca de possveis alteraes comportamentais na temperatura corporal, no consumo de glicose, ganho de peso e no testes do Labirinto em Cruz Elevado; apesar destas alteraes serem bem documentadas em outras espcies de roedores, nas fases iniciais e intermedirias da Doena Prion. 5. Os comportamentos relacionados ao grooming (autolimpeza) ainda no foram investigados nos roedores injetados com o agente ME7, apesar de ser um indicativo inato do funcionamento geral timo do SNC. 6. O avano na caracterizao dos eventos comportamentais e neuropatolgicos iniciais provocados pela Doena Prion e possivelmente alterados por um evento estressor prolongado relevante para o um melhor entendimento da evoluo desta doena e mesmo para o desenvolvimento de possveis mecanismos de interveno teraputica. Nesse sentido, o presente trabalho pretende investigar qual a contribuio do isolamento social para as alteraes comportamentais precoces observadas na doena prion, assim como as possveis alteraes relacionadas matriz extracelular (reduo de redes perineuronais) e resposta inflamatria (ativao microglial) previamente descritas nessa variedade.

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II. OBJETIVOS

Geral. Avaliar o impacto do isolamento social sobre a fase inicial da Doena Prion atravs de alguns ensaios comportamentais relacionados e anlise estereolgica da resposta inflamatria microglial e das redes perineuronais empregando o fracionador ptico.

Especficos. 1. Verificar, ao longo das semanas de isolamento e aps a injeo do agente ME7, possveis mudanas comportamentais nos seguintes aspectos: 1.1. Atividade exploratria: Campo Aberto e Labirinto em Cruz Elevado; 1.2. Comportamentos naturais da espcie: grooming, consumo de glicose, burrowing; 1.3. Respostas inatas: temperatura corporal, peso corporal; 1.4. Comportamento diante de uma situao aversiva: Teste de Suspenso da Cauda.

2. Descrever possveis mudanas neuropatolgicas no hipocampo (regio de CA1) e no septum a partir dos seguintes ensaios neuropatolgicos: 2.2. Contagem de microglias; 2.3. Alterao da ocorrncia e distribuio das redes perineuronais.

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III. MTODOS
1. Formao dos grupos experimentais

Foram utilizadas 40 fmeas de camundongos da variedade albina sua, com oito semanas de idade, originrios da colnia do Instituto Evandro Chagas (Par Brasil) e manipulados segundo os "Principles of Laboratory Animal Care" (NIH). O primeiro passo foi dividir os 40 camundongos em dois grupos: Agrupados (20) divididos em quatro gaiolas, com cinco camundongos cada; Isolados (20) - uma gaiola para cada animal, sendo que, em nenhum momento, esses animais isolados mantiveram contato entre si. Aps trs semanas, os dois grupos (Agrupados e Isolados) passaram por testes experimentais e receberam a injeo com NBH (homogenado de crebro normal) ou com ME7 (agente da Doena Prion). A partir da injeo, os animais Agrupados subdividiram-se em NBHGrupo (n=10) e ME7-Grupo (n=10); e os Isolados em NBH-Isolados (n=10) e ME7-Isolados (n=10). O esquema abaixo ilustra a diviso dos grupos experimentais:

AGRUPADOS (n=20)

(n=20)

ISOLADOS

Aps a injeo com NBH ou ME7 NBH-GRUPO (n=10) ME7-GRUPO (n=10) NBH-ISOLADOS (n=10) ME7-ISOLADOS (n=10)

Figura 6. Formao dos grupos experimentais antes e aps a inoculao com NBH ou ME7.

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Tanto os animais Agrupados (Figura 7A) quanto Isolados (Figura 7B) foram mantidos em gaiolas-padro de plstico (32cm x 39cm x 16.5cm), com livre acesso a gua e comida, em uma temperatura mdia de 22C, e ciclo claro-escuro de 12 horas (incio s 7h, trmino s 19h).

Figura 7. (A) Camundongos em grupo; (B) camundongo isolado na gaiola-padro.

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2. Induo da doena (injeo no hipocampo)

Na 12 semana de idade os animais foram anestesiados com 2,2,2 tribromoetanol (0.2ml/g I.P.) e fixados em aparelho estereotxico (Insight Equipamentos Ltda.). Aps a tricotomia, o crnio foi exposto atravs de uma inciso no escalpo e, com o auxlio de uma broca, foram feitas duas aberturas para permitir a infuso bilateral de 1l do Homogenado (10% p/v em PBS estril) de Crebro de Camundongo Normal (NBH, n=20) ou do agente da Doena Prion (ME7, n=20). As injees forram feitas com uma seringa de Hamilton de 1.0l no hipocampo dorsal, segundo as seguintes coordenadas estereotxicas, adotando-se o bregma como ponto de referncia: +1.3mm da linha interaural, 2.0mm da linha mdia, e 2.0mm da superfcie do crnio, que correspondem CA1 do hipocampo dorsal (PAXINOS e FRANKLIN, 2001). Aps a infuso da suspenso, a agulha foi mantida no local por 3 minutos para evitar o refluxo da soluo, aps os quais era retirada lentamente. O escalpo era, ento, suturado e o camundongo posto em uma gaiola para recuperao. Terminado o procedimento cirrgico, os animais retornaram s suas gaiolas e foram transportados para o Instituto Evandro Chagas (Belm-PA), onde permaneceram at o trmino dos experimentos.

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3. Ensaios comportamentais

Entre a 1 e a 17 semana ps-injeo, os camundongos foram submetidos, duas vezes por semana, aos seguintes testes comportamentais: burrowing, medida de temperatura corporal e ingesto de glicose. Os testes de Campo Aberto, Labirinto em Cruz Elevado, Testes de Suspenso da Cauda, Grooming e Peso foram realizados em dois momentos: no perodo pr-inoculao e na 17 semana ps-inoculao.

3.1.1 Burrowing. O burrowing uma palavra inglesa que se refere ao comportamento tpico de certos roedores de remover e estocar comida a partir de uma toca. A toca simulada por um tubo de PVC de 20cm de comprimento por 7,2cm de dimetro. O burrowing um teste desenvolvido recentemente e sabe-se que os protocolos mais eficazes so aqueles em que o teste feito em 2 horas ou durante o ciclo escuro (CUNNINGHAM et al, 2003). Optamos pela primeira opo em virtude do testes de consumo de glicose ser realizado durante a noite. Os camundongos eram colocados individualmente em gaiolas de 100x50x100cm (Figura 8), previamente equipadas com os tubos de PVC, contendo 150g de rao e posicionados a 3cm da base, na parte superior direita da gaiola, para evitar que os pletes cassem acidentalmente (GUENTHER et al., 2001). Os animais tinham livre acesso gua. A quantidade de rao deixada nos tubos era pesada no dia seguinte. O teste era realizado, em mdia, das 16h s 18h.

Figura 8. Gaiola e tubos de PVC utilizados no teste do burrowing.

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3.1.2 Temperatura. Aps o trmino do burrowing, os animais permaneciam na gaiola de 100x50x100cm e a temperatura anal era medida utilizando-se um termmetro digital (InfraRed Thermometer TD-960), posicionado a 2cm da regio anal do camundongo (Figura 9). Essa medida era realizada pelo mesmo experimentador, em horrio definido (19h), para evitar diferenas na manipulao do camundongo e a interferncia de luminosidade e temperaturas variadas. O ambiente era silencioso e a manipulao cuidadosa, a fim de evitar estresse adicional aos animais, visto que a medida da temperatura em si j consiste em um evento estressor (HEYDEN et al, 1997; COUDEREAU et al., 1996).

Figura 9. Procedimento realizado para a medida da temperatura anal.

3.1.3 Consumo de glicose. Para termos acesso aos nveis basais de consumo de glicose dos camundongos (Figura 10A), a ingesto desta soluo foi auferida durante quatorze dias, antes da induo da Doena Prion. Depois da inoculao, da 1 a 17 semana de tratamento, a soluo de glicose (5% - Soluo Glicosada Madrevita) era disponibilizada, em recipientes plsticos individuais de 25ml (Figura 10B), logo aps a medida da temperatura anal. A quantidade ingerida pelos animais era conferida no dia seguinte.

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Figura 10. Camundongo isolado em gaiola-padro para a medio do consumo de glicose (A). Solues de glicose e recipientes plsticos utilizados (B).

Os testes relatados abaixo foram realizados uma semana antes da induo da Doena Prion e na 17 semana de tratamento.

3.1.4 Labirinto em Cruz Elevado. O LCE constitudo por dois braos abertos e dois fechados (30cm x 5cm) colocados em posies opostas, e uma plataforma central (5cm x 5cm) (LISTER, 1987). Os braos fechados possuem paredes de 15 cm de altura, enquanto que nos braos abertos no h paredes. As plataformas de passeio do LCE distanciam-se 45 cm do cho (Figura 11). O protocolo usado para este teste foi o mesmo utilizado por CAROLA et al. (2002). O teste foi realizado em dois dias, sendo que cada animal explorava o ambiente por 5 minutos a cada dia. O teste iniciava-se sempre que o animal era colocado na plataforma central do LCE e solto com a face virada para um dos braos abertos. As imagens de cada treino foram capturadas por uma cmera de vdeo instalada a 1 m de altura do LCE e conectada a um computador, com o objetivo de armazenar os testes para posterior anlise. Os testes eram analisados com o auxlio do programa Any Maze (Stoelting). Ao fim de cada treino, o LCE era limpo com lcool a 10%. Os parmetros analisados nos braos abertos e fechados foram: tempo de permanncia,

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distncia percorrida e nmero de entradas. Esses parmetros foram contados somente quando o animal colocava as quatro patas nas reas correspondentes aos braos ou ao centro do LCE (CRUZ et al., 1994; LISTER, 1987; RODGERS E JOHSON, 1995).

Figura 11. Labirinto em Cruz Elevado.

3.1.5 Campo Aberto. Para a realizao deste teste utilizamos o protocolo descrito em CAROLA et al (2002). A tarefa de explorao foi realizada em uma caixa de 30x30x40 cm, feita em compensado (Figura 12). O piso foi dividido em nove quadrantes de 10cm x 10cm. Um metro acima do Campo Aberto (CA) havia uma cmera de vdeo conectada a um computador, de modo a filmar e armazenar as sesses de amostragem e avaliao, para posteriores anlises. Este teste durou trs dias consecutivos e consistiu em colocar o camundongo, atravs de sua cauda, no centro do CA como ponto de partida. Nos dois primeiros dias de testes os animais foram expostos ao CA por 1 min (habituao ao aparato) e no 3 dia exploraram o ambiente durante 5 min. Ao fim de cada sesso de explorao os animais eram retirados do CA, devolvidos s suas gaiolas e o aparelho era limpo com uma soluo de etanol a 75%. O nmero de quadrantes explorados foi o parmetro analisado como medida para a atividade exploratria.

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Figura 12. Teste do Campo Aberto.

3.1.6 Grooming. O groomimg uma palavra inglesa que se refere a uma srie de comportamentos inatos de limpeza observados na maioria das espcies, sendo um repertrio comportamental particularmente importante em roedores (BERRIDGE e ALDRIDGE, 2000). O aparato utilizado neste teste o mesmo do Campo Aberto. A partir das imagens capturadas no terceiro dia de treino no Campo Aberto, observou-se a freqncia dos comportamentos referentes ao grooming, que so: lamber as patas; passar as patas no focinho e na cabea; movimentos semicirculares no topo da cabea e atrs da orelha; lamber e arranhar o corpo; lamber a cauda e a regio genital (KALUEFF e TUOHIMAA, 2004, 2005).

3.1.7 Teste de Suspenso da Cauda. O aparato usado para este teste foi uma caixa com 36cm(altura) x 30cm(largura) x 20cm(profundidade). O interior da caixa foi forrado com papel preto para contrastar com as paredes do aparato e como os sujeitos albinos (Figura 13). Uma cmera de vdeo foi posicionada diante da caixa, a 70 cm de distncia. O topo do aparato continha um orifcio por onde era suspensa e presa a cauda do animal, a qual era envolta por um pedao de gaze para evitar escoriaes. O comportamento foi analisado durante 5 minutos (JUSZCZAK et al., 2006; LAD et al., 2007). A anlise do vdeo foi feita com o auxlio do

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programa Any Maze (Stoelting) e o parmetro avaliado foi o tempo e a freqncia de imobilidade.

Figura 13. Teste de Suspenso da Cauda

3.1.8 Peso corporal. O peso corporal dos sujeitos foi medido em dois momentos: antes da injeo de NBH ou ME7 e antes da perfuso (17 semana ps-inoculao).

Figura 14. Pesagem dos camundongos.

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4. Ensaios neuropatolgicos

4.1 Perfuso e microtomia.

Com o encerramento dos testes comportamentais (semanais e agudos), os animais foram pesados para receber uma dose do anestsico (avertina, 0,08mg/ 5g de peso) por via intraperitoneal. Assim que verificado o efeito do anestsico, fez-se uma ampla toracotomia e iniciou-se a perfuso, por via transcardaca, com soluo salina (0,9%, com 1ml/L de heparina sdica - Liquemine, Roche), durante 10 minutos. Em seguida, a soluo salina foi substituda pela soluo fixadora de paraformaldedo (PFA, 4%, pH 7.2-7.4) em soluo tampo fosfato (PB) 0,2M, por 30 minutos. Posteriormente, iniciou-se a craniotomia: os encfalos foram removidos aps a dissecao de pele, do tecido subcutneo e msculos e posterior retirada da dura-mter e seco dos nervos cranianos. O encfalo ficou imerso em PFA 4% a 4C, durante a noite e, ento, conservado em PFA 2%. O tecido foi seccionado no plano horizontal com o auxlio de um vibrtomo (Srie 1000 Pelco Internacional) na espessura de 70m. Uma a cada cinco seces foi utilizada para detectar protena cida fibrilar glial (GFAP), microglias (Lectina Esculentum) e redes perineuronais (Lectina Floribunda).

4.2 Processamento de tecidos para histoqumica

4.2.1 Lectina Esculentum: A proliferao e ativao da microglia foram avaliadas usando histoqumica para lectina de tomate Lycopersicon esculentumBiotinilada. Esta tcnica marca receptores de acar presentes nas microglias ativadas.

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As seces foram incubadas em soluo de Perxido de Hidrognio (H202) + Metanol por vinte minutos e lavadas duas vezes em tampo fosfato salina (PBS-T 5%) com intervalos de cinco minutos, sendo, em seguida, imersas PBS-T por vinte minutos. Seguiu-se a incubao em Lectina Biotinilada (3l sol estoque + 1ml PBS) por 12 horas. Os cortes foram lavados trs vezes em PBS (com intervalo de dois minutos) antes e aps a incubao em soluo ABC (complexo Biotina Avidina) por 1 hora. Por fim, os cortes foram reagidos em soluo GND (0,5mg/ml de DAB + 1,2mg/ml Nquel) e lavados trs vezes em PB 0,1M (com intervalos de cinco minutos). As seces reagidas foram montadas em lminas gelatinizadas para posterior anlise estereolgica.

4.2.2 Lectina Floribunda: A alterao da ocorrncia e distribuio das redes perineuronais foi avaliada usando a marcao de proteoglicanos da matriz extracelular atravs da lectina Wisteria floribunda. A histoqumica com a lectina Wisteria floribunda empregada no presente trabalho marca os terminais de acar (glicosaminoglicanos) ligados aos proteoglicanos da matriz extracelular. As seces foram incubadas em soluo de cido Brico (70 C) por 1 hora e lavadas trs vezes em tampo TRIS salina triton (TBST-Tris 5%) com intervalos de cinco minutos. Em seguida, as seces foram imersas em soluo de Perxido de Hidrognio (H202) + Metanol por vinte minutos; lavadas duas vezes em TBST. A seguir, realizou-se a incubao em Lectina Floribunda (3 l sol estoque + 1ml PBS) por 12 horas. Antes e aps serem incubadas em soluo ABC (complexo Biotina Avidina) por 1 hora, as seces foram lavadas trs vezes em tampo Tris (0,1M pH 7,4) com intervalo de dois minutos. Aps a imerso em tampo acetato (0,1 M) por cinco minutos, os cortes foram reagidos em soluo GND (0,5mg/ml de DAB + 1,2mg/ml Nquel). As seces reagidas foram montadas em lminas gelatinizadas para posterior anlise estereolgica.

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 4.3 Colorao com Nissil

As seces processadas por histoqumica foram montadas para avaliao microscpica e posteriormente contracoradas para Nissl. A colorao de Nissl utiliza o cresil violeta tingindo ncleos e nuclolos com a colorao violeta. Neurnios e glia so corados indistintamente pela tcnica de Nissl. Para preparar a soluo de colorao preciso aquecer o cresil violeta em banho-maria a 40C, agitando-a por 5 minutos; filtrar a soluo final em papel filtro; e acrescentar o cido actico at que o pH da soluo esteja entre 3 e 3,5.

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5. Anlise estereolgica.

As anlises estereolgicas foram realizadas no Laboratrio de Neuroanatomia Funcional atravs do programa StereoInvestigator (MicroBrightField, Williston, VT, USA). O uso desse software integrado a um microscpio ptico Nikon, de alta resoluo, com placa motorizada para os eixos x, y e z, possibilitou que os dados das coordenadas tridimensionais e a implementao dos mtodos e frmulas estereolgicas fossem aplicados. O nmero total de redes perineuronais e microglias presentes na regio CA1 e do septum foi estimado segundo o mtodo do fracionador ptico em combinao com o princpio do dissector ptico, e segundo regras que minimizam os vieses de contagem celular (HOWARD e REED, 2005). Foram analisadas, pelo menos, cinco seces por animal, sendo o intervalo entre elas de 5 seces. Os limites de CA1 e do septum (de apenas um dos hemisfrios, escolhido aleatoriamente) foram facilmente identificados e delineados, a partir da imagem de uma objetiva de baixo aumento (3.2x) e possveis reajustes empregados na objetiva de 10x. Uma vez delimitada a rea de interesse, a mesma dividida em quadrantes (matriz ou gride), sendo que em cada um deles posicionada apenas uma caixa de contagem. As dimenses das caixas de contagem e da matriz de contagem esto descritas na tabela abaixo.

Objeto de interesse

Caixa de

Matriz de

Espessura da caixa (m) 20 10 20 13

Seces contadas 5 5 3 3

contagem (m) Contagem (m) Redes Perineuronais CA1 Microglias Redes Perineuronais 120x120 45x45 70x70 40x40 120x120 80x80 120x120 120x120

Septum

Microglias

Tabela 1: Parmetros estereolgicos utilizados na contagem de redes perineuronais e microglias em CA1 e no septum.

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Tais medidas particulares diferiram por tcnica de marcao em funo da necessidade de, sempre que possvel, obter um coeficiente de erro igual ou menor que 0.05 e manter um nmero mnimo de 30 caixas contadas por seco (considerando-se as diferenas de tamanho e distribuio, conforme o tipo celular marcado). A imunorreatividade seletiva, associada a caractersticas morfolgicas, foram os critrios adotados na contagem, que foi realizada em uma objetiva de grande aumento (60x), com exceo da contagem de redes perineuronais, que foi feita em uma objetiva de 40x. O processamento histolgico (microtomia, desidratao, imunohistoqumica, etc.) pode resultar em variaes de espessura dentro do mesmo corte. Para corrigir esse erro, a cada caixa de contagem mensurou-se a espessura do tecido e o bloco de contagem foi posicionado no centro da espessura total do tecido. A disposio do bloco de contagem no centro no comprometeu a visualizao e foco da clula, visto que o protocolo adotado resultou num padro de marcao satisfatrio.

5.1 Caracterizao das reas e dos objetos de interesse.

Nossas reas de interesse nas anlises estereolgicas foram o hipocampo (mais especificamente, CA1) e o septum. A figura 15 ilustra a fotomicrografia do hipocampo e do giro denteado, detalhando a laminao e os limites arquitetnicos.
B

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Figura 15. Fotomicrografia ilustrando o giro denteado (GD) e o hipocampo dorsal da fmea adulta do camundongo da variedade sua albina marcados com o anticorpo NEU-N (A) e com lectina Wisteria floribunda biotinilada (B). Legenda: (Or) Oriens; (Pir) Piramidal; (Rad) Radiatum; (Lac Mol) Lacunosum Molecular; (Mol) Molecular; (Gr) Granular; (Po) Camada Polimrfica. Escala: (A) 500m, (B) 250m.

No presente trabalho dois critrios foram suficientes para caracterizao do hipocampo (CA1, CA2, CA3) e do septum: os padres arquitetnicos e de conexes. No que concerne ao padro arquitetnico, empregou-se imunohistoqumica seletiva para identificao de neurnios empregando anticorpos dirigidos contra a protena nuclear NeuN e histoqumica seletiva empregando a lectina Wisteria floribunda para marcao de proteoglicanos da matriz extracelular e melhor definio dos limites de CA1, CA2 e CA3 e dos ncleos septais, preenchendo o critrio de definio inambgua da rea e dos objetos de interesse. NeuN uma protena nuclear especfica de neurnios, encontrada no ncleo e parte do citoplasma da vasta maioria de tipos neuronais do sistema nervoso dos vertebrados. Por conta da especificidade de sua expresso ele tem sido referido como um marcador universal do fentipo neuronal maduro (ps-mittico) e usado para distinguir neurnios de clulas da glia, assim como de outras clulas que no expressam NeuN (DARLINGTON et al, 2008; KUMAR e BUCKMASTER, 2007). Assim, anticorpos monoclonais dirigidos contra a protena NeuN do ncleo neuronal, marcam seletivamente o ncleo e parte do citoplasma de neurnios maduros em todas as regies neurais at ento estudadas (AMBROGINI et al, 2004; DARLINGTON et al, 2008; EDGAR AND ROSENBLUM, 2008; MAGAVI et al, 2000). Na formao hipocampal do camundongo em particular, objeto de interesse do presente trabalho, uma srie extensa de estudos confirma essa observao tanto em animais saudveis quanto em doentes (BRANDT et al, 2003; KEMPERMANN et al, 2003; TAKAHASHI et al, 2008; VON BOHLEN e HALBACH, 2007). O anticorpo monoclonal empregado no presente trabalho (MAB377, Chemicon, Tremecula, CA), dirigido contra o

95

epitopo murino de NeuN, reage positivamente em uma variedade de espcies, sugerindo que conservado por todas elas e isso inclui pssaros, outros roedores e humanos (KUMAR e BUCKMASTER, 2007). O limite arquitetnico entre as regies CA1, CA2 e CA3 podem ser identificados co m relativa facilidade por imunomarcao com anticorpo para NEU-N em funo da variao do empacotamento e do tamanho dos neurnios marcados em cada regio (Figura 15A). Os corpos celulares marcados em CA3 parecem maiores e distribudos de forma menos empacotada do que os de CA1 e CA2. As clulas da camada piramidal de CA2 so mais dispersas espacialmente que as de CA1, observando-se um estreitamento desta camada no limite entre CA1 e CA2. Essa distino anatmica entre CA1 e CA2 melhor observada na histoqumica para Wisteria floribunda (Figura 15B). Paralelamente, as caractersticas da distribuio dos terminais de glicosaminoglicanos da matriz extracelular foram utilizadas tambm como um indicador de transformaes neuropatolgicas que afetam as redes perineuronais da matriz associadas doena neurodegenerativa crnica. Essa escolha se deveu ao fato de que dados da literatura mostram que tanto os neurnios quanto as prprias redes que os envolvem, so afetados na Doena de Alzheimer e na Doena Prion; alm disso, a integridade dessas redes perineuronais relevante para preservao dos mecanismos de memria e aprendizado, promovendo neuroprotetor contra excitotoxicidade, estresse oxidativo (MORAWSKI et al., 2004) e formao de placas neurofibrilares (BRUCKNER et al, 1999; HARTIG et al., 2001). Alm das redes perineuronais, nossos objetos de interesse nas anlises estereolgicas foram as microglias ativadas, seletivamente marcadas por histoqumica com lectina de tomate (Lycopersicum esculentum) para a microglia ativada, de modo a acompanhar sua plasticidade fenotpica em forma e nmero que acompanham a neurodegenerao (BOUCSEIN et al., 2000; KANNAN et al., 2007; STREIT, 2000)

96

A regio septal, por sua vez, foi definida como aquela delimitada entre a linha mdia, a comissura anterior e ncleo anterior do bulbo olfatrio, em sua poro mais ventral, enquanto que, em sua poro mais dorsal, compreendida entre a linha mdia, o corpo caloso e a fmbria. A identificao das redes perineuronais atravs da Wisteria floribunda biotinilada permitiu, portanto, a definio clara dos campos hipocampais, e do septum medial e lateral assim como a distino entre os dois tipos de redes. Tomados os resultados em conjunto foi possvel caracterizar com preciso os limites das reas e identificar-se sem ambigidades os objetos de interesse.

97

6. Anlise Estatstica

A estimativa do nmero total de clulas dentro da regio de interesse foi obtida atravs do mtodo do fracionador ptico, multiplicando-se o nmero de clulas contadas dentro de cada bloco pelos valores de probabilidade da amostra. Esses valores dependem: 1) do nmero de seces investigadas comparadas com o nmero total de seces que contem a regio de interesse (section sampling fraction); 2) da rea dos blocos de contagem comparada com a rea da matriz de contagem (area sampling fraction); e 3) a altura do bloco de contagem comparada com a mdia da espessura da seco aps os procedimentos histolgicos (thickness sampling fraction). N = Q * 1/ssf * 1/asf * 1/tsf

Onde, N nmero total de clulas Q nmero de clulas contados ssf section sampling fraction = seces contadas/total de seces asf area sampling fraction = rea bloco/rea matriz (x,y) tsf tissue sampling fraction = altura bloco/espessura da seco. Comparando o coeficiente de erro verdadeiro para grandes amostras com o calculado por diferentes mtodos, encontrou-se que o coeficiente de Scheaffer o que mais se aproxima do erro verdadeiro (GLASER e WILSON, 1998). Assim, no presente trabalho, deu-se preferncia ao fracionador ptico como mtodo estereolgico e ao coeficiente de Scheaffer como instrumento de medida do erro intrnseco metodologia. Utilizando esse coeficiente, definiu -se que a grade e as dimenses da caixa de contagem seriam adequadas quando a relao entre o coeficiente de erro e o coeficiente de variao fosse menor do que 0.5.

98

Outro parmetro que se estimou de forma sistemtica foi o coeficiente de variao biolgica, definido como: CVB 2 = CV2 CE2 (CE, coeficiente de erro; CV coeficiente de variao; CVB, coeficiente de variao biolgica), expresso em valor percentual do coeficiente de variao, estabelecendo-se que sua contribuio precisa ser sempre maior do que 50% para que se minimize os erros intrnsecos do processo amostral. A anlise estatstica paramtrica avaliou o grau de significncia dos resultados dos testes comportamentais atravs da anlise de varincia (ANOVA, um critrio) seguido do teste de Bonferroni a priori, aceitando-se como significantes as diferenas entre grupos com intervalo de confiana mnimo de 95% (p<0,05). O software Bioestat 5.0 foi empregado em todos os testes estatsticos. A seguir (Quadro 2) vemos um esquema ilustrativo da metodologia e dos procedimentos experimentais.

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Seleo de 40 camundongos da variedade Sua albina com 8 semanas de idade

Diviso dos grupos: Agrupados (n=20) Isolados (n=20)

Isolados: trs semanas de isolamento Agrupados: cinco por gaiola Aferio dos nveis basais de consumo de glicose 1 a 3 semana de isolamento social

1 fase

Testes comportamentais: Campo Aberto, Labirinto em Cruz, Peso corporal 3 semana de isolamento

Subdiviso dos grupos: Agrupados NBH-GR e ME7-GR Isolados NBH-IS e ME7-IS Inoculao com NBH ou ME7

Testes (2x por semana): consumo de glicose, burrowing e medida e da temperatura anal. 1 a 17 semana ps-inoculao

2 fase

Testes comportamentais: Campo Aberto, Labirinto em Cruz, TST, Grooming e Peso corporal. 17 semana ps-inoculao

Perfuso, fixao, microtomia, tcnicas de histoqumica

Anlises estereolgicas em CA1 e no septum: redes perineuronais e microglias ativadas

3 fase

Quadro 2: Esquema ilustrativo da metodologia e dos procedimentos experimentais.

IV. RESULTADOS.

74

1. Ensaios Comportamentais.

Os testes de Consumo de Glicose, Burrowing e Temperatura foram aplicados duas vezes por semana, da 1 a 17 semana ps-inoculao; enquanto que os testes Campo Aberto, Labirinto em Cruz Elevado, Grooming, Teste de Suspenso da Cauda e Peso corporal foram realizados antes e depois da inoculao com a Doena Prion (17 semana).

1.1 Consumo de glicose

25

20

qtde. ingerida (ml)

15

10

0 3 5 7 9 11 13 15 17 semanas ps-inoculao NBH-GR ME7-GR NBH-IS ME7-IS

Figura 16. Mdia da quantidade de glicose consumida ao longo das semanas ps-inoculao com NBH ou ME7. Os ME7-IS consumiram menor quantidade de glicose que os demais grupos (NBH-Grupo, ME7-Grupo e NBHIsolados). ANOVA um critrio, Bonferroni, p<0.01.

CONSUMO DE GLICOSE 17 SEMANA PS-INOCULAO Mdia Aritmtica (ml) NBH-GR = 18.4 ME7-GR = 15.66 NBH-IS = 11.62 ME7-IS = 8.30 Desvio Padro 5.27 2.96 4.87 6.31 Grupos NBH-GR e NBH-IS NBH-GR e ME7-IS ME7-GR e ME7-IS NBH-IS e ME7-IS Significncia (Anova, Bonferroni)* p<0.025 p<0.01 p<0.01 p<0.05

75

Tabela 2: Dados estatsticos relativos ao consumo de glicose na 17 semana ps-inoculao. *Apenas as diferenas significativas.

A figura 16 mostra que no houve diferena no consumo de glicose entre animais em grupo (NBH-GR e ME7-GR) e isolados (NBH-IS e ME7-IS), exceto na 17 semana PI. Da 3 a 9 semana PI os grupos NBH-GR e ME7-GR ingeriram, em mdia, 11ml da soluo glicosada; na 13 houve uma queda dessa mdia para 5ml, o que no representa um dado significativo, pois na semana seguinte, os camundongos retornaram para os nveis iniciais de consumo, apresentando uma tendncia crescente da ingesto de glicose. Os sujeitos isolados (NBH-IS e ME7-IS), por sua vez, exibiram nveis de consumo similares at a 17 semana PI, nas qual os ME7-IS (MA=8.30, Erro Padro=1.99) ingeriram menor quantidade de glicose que os NBH-IS (MA=12, EP=1.72, p<0.05). Na 17 semana os animais ME7-IS tambm se diferenciaram dos NBH-GR (MA=18; EP=1.67, p<0.01) e dos ME7-GR (MA=16; DP=0.99, p<0.01).

76

1.2 Remoo e estoque de rao (burrowing)

180 150

qtde. removida

120 90 60 30 0 5 7 9 11 13 5 16 17 semanas ps-inoculao NBH ME7 NBH+IS ME7+IS

Figura 17. Quantidade de rao removida ao longo das semanas ps-inoculao com ME7 e NBH. Legenda: Diferena entre os animais NBH-Isolados e ME7-Isolados (ANOVA, Bonferroni, p<0.01); Os sujeitos ME7 (GR e IS) removeram menor quantidade de rao que os NBH (GR e IS). ANOVA um critrio, Bonferroni, p<0.01.

BURROWING 16 SEMANA PS-INOCULAO Mdia Aritmtica (gramas) NBH-GR = 119 ME7-GR = 90 NBH-IS = 148 ME7-IS = 66 45 61 4.5 60 BURROWING 17 SEMANA PS-INOCULAO Mdia Aritmtica (gramas) NBH-GR = 135 ME7-GR = 80 NBH-IS = 135 ME7-IS = 24 35 59 22 32 NBH-GR e ME7-GR NBH-GR e ME7-IS ME7-GR e NBH-IS ME7-GR e ME7-IS NBH-IS e ME7-IS Desvio Padro Grupos Significncia (Anova, Bonferroni)* p<0.01 p<0.01 p<0.01 p<0.01 p<0.01 NBH-GR e ME7-IS ME7-GR e NBH-IS NBH-IS e ME7-IS Desvio Padro Grupos* Significncia (Anova, Bonferroni)* p<0.01 p<0.01 p<0.01

Tabela 3: Quantidade de rao removida na 16 e na 17 semana ps-inoculao. *Apenas os dados estatisticamente significativos.

77

Nas primeiras 15 semanas, no encontramos diferena entre os grupos experimentais quanto ao burrowing (Figura 17). Na 16 semana, observamos que os animais ME7-IS (MA=66, EP=10) se distinguem dos NBH-IS (MA=148, EP=8), apresentando uma queda brusca na quantidade de rao removida (p<0.01) que persiste na semana seguinte. Na 17 semana os sujeitos ME7-GR (MA=87.51, EP= 20) removeram menos rao que os NBH-GR (MA=145.60, EP=11, p<0.01) e os NBH-IS (MA=135, EP=7.95, p<0.01). O grupo ME7IS distinguiu-se dos demais grupos, apresentando maior queda no burrowing na 17 semana PI (MA=24, EP=10.40, p<0.01). Observamos que, enquanto os ME7-IS distinguiram-se dos NBH-IS na 16 semana, os ME7GR s apresentaram queda no burrowing, em relao aos NBH-GR, na 17 semana PI.

1.3 Temperatura corporal

controles ME7 38 37 36 semanas ps-inoculao isolados Isolados+ME7

78
Figura 18. Temperatura retal dos animais da 5 a 17 semana ps-inoculao. Legenda: Diferena entre os sujeitos em grupo (NBH-GR e ME7-GR) e os sujeitos isolados (NBH-IS e ME7-IS). ANOVA, Bonferroni, p<0.01.

 C 35 34 33 32 5 7 9 11 13 15 16 17

TEMPERATURA ANAL Semana Mdia Aritmtica (C) NBH-GR ME7-GR NBH-IS 5 7 9 11 13 15 16 17 34.1 34.2 34.3 34.8 34.0 34.5 33.7 34.6 34.1 34.2 34.0 35.4 33.9 35.3 33.7 34.8 34.2 35.2 35.5 34.9 35.8 35.8 35.6 36.4 ME7-IS 34.4 35.1 35.3 35.0 35.9 35.8 36.0 36.9 Desvio Padro NBH-GR ME7-GR NBH-IS 0.36 0.18 0.35 0.55 0.5078 0.22 0.28 0.34 0.25 0.21 0.35 0.64 0.45 0.48 0.71 0.73 0.09 0.11 0.05 0.087 0.097 0.12 0.17 0.18 ME7-IS 0.15 0.09 0.09 0.17 0.13 0.11 0.10 0.15 ns p<0.01 p<0.01 ns p<0.01 p<0.01 p<0.01 p<0.01 Significncia*

Tabela 4: Dados estatsticos da medida da temperatura anal dos sujeitos em grupo (NBH-GR e ME7-GR) e isolados (NBH-IS e ME7-IS). *Comparao dos animais em grupo (NBH-GR e ME7-GR) e isolados (NBH-IS e ME7-IS) em cada semana ps-inoculao (Anova, um critrio, Bonferroni).

Na 7, 9, 13, 15, 16 e 17 os animais isolados apresentam temperaturas mais elevadas em relao aos animais em grupo (Anova, Bonferroni, p<0.01), sem, contudo, distinguirem-se entre si (NBH-IS e ME7-IS), o que, provavelmente, representa uma resposta hipertrmica ao estresse

79

provocado pelo isolamento. A queda da temperatura dos NBH-IS e ME7-IS na 11 semana constitui um fenmeno isolado, pois no se mantm nas semanas posteriores (Figura 18). Ao longo das semanas ps-inoculao, os animais em grupo (NBH-GR e ME7-GR) mantm um padro, permanecendo prximos aos nveis basais das primeiras semanas, enquanto que os isolados exibem uma elevao gradual da temperatura retal, aproximando-se dos 37C na 17 semana PI.

Os testes comportamentais seguintes foram realizados em dois momentos: antes na injeo com ME7 ou NBH e na 17 semana ps-inoculao. Os animais do perodo pr-inoculao so: Agrupados (cinco por gaiola) e Isolados (um por gaiola, isolados h trs semanas). Aps a

80

inoculao, os sujeitos Agrupados dividiram-se em NBH-GR e ME7-GR, enquanto que os Isolados dividiram-se em NBH-IS e ME7-IS.

1.4 Campo Aberto (CA)

24 20

distancia (m)

16 12 8 4 0

Agrupados

Isolados

NBH-GR

ME7-GR

NBH+Isol

ME7+Isol

Pr-inoculao

17 semana ps-injeo

Fig. 19 Comportamento Exploratrio no Teste do Campo Aberto (CA). : ME7-IS percorreram maior distncia no CA em relao aos demais grupos (ANOVA, um critrio, Bonferroni, p<0.05 e p<0.01).

TESTE DO CAMPO ABERTO - DISTNCIA Mdia Aritmtica Agrupados = 8.64 Isolados = 12.43 NBH-GR = 11.67 ME7-GR = 14.87 NBH-IS = 12.66 ME7-IS = 18.87 Desvio Padro 3.82 4.18 4.31 7.39 2.77 6.05 Grupos* Agrupados e Isolados Agrupados e ME7-GR Agrupados e ME7-IS Isolados e ME7-IS NBH-GR e ME7-IS ME7-GR e ME7-IS NBH-IS e ME7-IS Significncia (Anova, Bonferroni)* p<0.01 p<0.01 p<0.01 p<0.01 p<0.01 p<0.05 p<0.01

Tabela 5: Dados estatsticos do Teste do Campo Aberto. *Apenas os dados estatisticamente significativos.

Observamos que os Agrupados (MA=8.64, EP=0.85) e os Isolados (MA=12.43, DP=0.93) apresentaram desempenho distinto no Campo Aberto no perodo pr-inoculao (p<0.01), no qual os

81

Isolados encontravam-se na 3 semana de isolamento. Isso mostra-nos que o modelo de estresse induzido por isolamento social induz alteraes comportamentais j na 3 semana de isolamento. A distncia percorrida pelos animais Agrupados (pr-inoculao) no foi alterada significativamente nos animais NBH-Grupo (17 semana). Entretanto, os sujeitos ME7-Grupo percorreram uma distncia maior na 17 semana (MA=14.88, EP=2.46) que os Agrupados (p<0.01). No encontramos diferena, quanto distncia percorrida, entre os grupos NBH-GR e ME7-GR. Os animais NBH-IS no se distinguiram dos grupos Isolados e Agrupados. Os ME7-IS percorreram a maior distncia no CA (MA=18.87, EP=2.14, p<0.05), distinguindo-se tanto dos grupos do perodo pr-inoculao (Agrupados e Isolados) quanto dos grupos da 17 semana (NBHGR, ME7-GR e NBH-IS). Percebemos que a agitao psicomotora dos sujeitos Isolados (pr-inoculao) potencializada nos ME7-IS (MA=18.82, EP=2.14, p<0.01), indicando uma sobreposio dos efeitos do isolamento e das alteraes comportamentais da Doena Prion.

82

1.5 Labirinto em Cruz Elevado (LCE)

A B

Distancia percorrida no Brao Aberto 1,6

ADistancia percorrida no Brao Fechado

12 10

distancia (m)

1,2 0,8 0,4 0

8 6 4 2 0

Controles Isolados Agrupados Isolados

NBH NBH-GR

ME7 ME7-GR NBH+IS ME7+IS NBH-IS ME7-IS

Controles Isolados Agrupados Isolados

NBH NBH-GR

ME7 ME7-GR NBH+IS ME7+IS NBH-IS ME7-IS

Figura 20 (A, B): Distncia percorrida no Brao Aberto (A) e no Brao Fechado (B) do LCE. B: * Os Isolados percorreram menor distncia no Brao Fechado em relao aos demais grupos (Anova, Bonferroni, p<0.01). LCE DISTNCIA PERCORRIDA NO BRAO ABERTO Mdia Aritmtica Agrupados = 0.77 Isolados = 0.15 NBH-GR = 0.35 ME7-GR = 0.70 NBH-IS = 0.88 ME7-IS = 0.13 Desvio Padro 0.56 0.16 0.54 0.79 0.92 0.21 Grupos* Agrupados e Isolados Agrupados e NBH-GR Agrupados e ME7-IS Isolados e ME7-GR Isolados e NBH-IS NBH-GR e NBH-IS ME7-GR e ME7-IS NBH-IS e ME7-IS Significncia (Anova, Bonferroni)* p<0.01 p<0.05 p<0.01 p<0.01 p<0.01 p<0.05 p<0.05 p<0.01

Tabela 6: Dados estatsticos relativos distncia percorrida no Brao Aberto do LCE. *Apenas os dados estatisticamente significativos.

A figura 20A mostra a distncia percorrida no Brao Aberto (BA) do LCE. Na semana prinoculao, vemos que os camundongos Isolados (MA=0.15, EP=0.03) percorreram uma distncia menor que os Agrupados (MA=0.77, EP=0.13, p<0.01), os ME7-GR (MA=0.70, EP=0.25, p<0.01) e os NBH-IS (MA=0.88, EP=0.30, p<0.01). Na 17 semana, o grupo ME7-IS (MA=0.18, EP=0.08) percorreu uma distncia bem menor que o NBH-IS (p<0.01), sendo que no houve diferena entre o NBH-GR e ME7-GR. A distncia 83

percorrida no Brao Fechado (BF) est exposta na figura 20B, onde os animais Isolados da semana pr-inoculao distinguiram-se dos demais grupos percorrendo a menor distncia (MA=3.5, EP=0.22, p<0.01).

A
Entradas no Brao Aberto

B
Entradas do Brao Fechado 40

40 35

35

n de entradas

n de entradas

30 25 20 15 10 5 0

30 25 20 15 10 5 0 Conroles Isolados NBH Agrupados Isolados NBH-GR ME7 ME7-GR NBH-IS NBH-IS ME7-IS ME7-IS

Agrupados

Isolados

NBH-GR

ME7-GR NBH-IS

ME7-IS

Figura 21 (A e B): Entradas no BA (A) e no BF (B) do Labirinto em Cruz Elevado. (C): *Agrupados entrou mais vezes no BA que os demais grupos (p<0.025); (D): # Diferente do ME7-GR, NBH-IS e ME7-IS (p<0.05); Diferente dos grupos da 17 semana PI (Anova, Bonferroni, p<0.025).

Quanto ao nmero de entradas no BA (figura 21A), os animais Agrupados (MA=21.55, EP=2.7) distinguiram-se de todos os grupos, apresentando a maior freqncia de entradas no Brao Aberto do LCE (p<0.025). Na 17 semana, os animais NBH-GR (MA=13.2, EP=3.62) e ME7-GR (MA=6.71, EP=2.49) apresentaram queda no nmero de entradas no BA em relao a semana pr-inoculao (Agrupados, p<0.025). Os sujeitos NBH-IS (MA=5.62, EP=1.30) e ME7-IS (MA=11.7, EP=2.80) no se distinguiram dos Isolados (pr-inoculao). Os camundongos NBH-GR (MA=10.22, EP=3.62) no se distinguiram dos NBH-IS (MA=5.62, EP=1.30).

84

Observamos, ento, que os sujeitos NBH-GR e ME7-GR entraram menos no BA que seus controles do perodo pr-inoculao (Agrupados), o que no foi observado nos NBH-IS e ME7-IS em relao aos Isolados. No Brao Fechado (BF) (figura 21B) encontramos maior freqncia de entrada dos Agrupados (MA=29.2, EP=2.15) em relao ao ME7-GR (MA=19.28, EP=3.5), NBH-IS (MA=21.37, EP=3.47) e ME7-IS (MA=20.1, EP=2.75). Os sujeitos Isolados entraram mais no BF que os NBH-GR (MA=25.4, EP=3.63, p<0.025), os ME7-GR (p<0.01), os NBH-IS (p<0.01) e os ME7-IS (p<0.01). Em suma, os ME7-GR entraram menos no BF que os Agrupados, os sujeitos NBH-IS e ME7IS reduziram a freqncia de entrada no BF em relao aos Isolados e, na 17 semana PI, os grupos experimentais no se distinguiram no Brao Fechado.

Tem po no Brao Aberto

1 00

#
80

60

40

20

Agrupados

Co ntro les

Experimentais

Isolados

NBH-GR

NB H

ME7-GR

M E7

NB H+IS

NBH-IS

M E7+IS

ME7-IS

Figura 22E: Tempo no Brao Aberto. # Os Agrupados so diferentes de todos os grupos, com exceo do ME7-IS; Diferena significativa em relao aos Isolados, ME7-GR e aos NBH-IS. Anova, Bonferroni, p<0.01.

85

A figura 22 mostra que os animais Agrupados (MA=72.42, EP=10.19) passaram mais tempo no BA (p<0.01) que os Isolados (MA=24.18, EP=4.0), os NBH-GR (MA=35.2, EP=7.06), os ME7GR (MA=12.81, EP=6.9) e os NBH-IS (MA=13.5, EP=6.2). Os sujeitos NBH-IS mantiveram a tendncia vista nos Isolados (semana pr-inoculao) de permanecer pouco tempo no BA, diferente do observado no ME7-IS, o qual aumentou significativamente seu tempo no BA (p<0.01), distinguindo-se tambm dos ME7-GR (p<0.01) e dos NBH-IS (p<0.01). Os grupos experimentais no diferiram quanto ao tempo de permanncia no Brao Fechado (BF). Tomando os dados em conjunto, percebemos que apesar da figura 20A mostrar que a distncia percorrida pelos ME7-IS no Brao Aberto menor, os grficos 21A e 22 apontam, respectivamente, que esses animais entraram mais e permaneceram mais tempo no BA. Supomos que esses animais entraram mais no BA, mas percorreram uma distncia menor neste brao porque estavam imveis. Temos, ento, uma inverso da tendncia natural de evitar o Brao Aberto; essa inverso pode estar vinculada somao do isolamento a Doena Prion.

86

1.6 Grooming.

Grooming

frequncia de grooming

16

12 8

4 0 NBH NBH-GR ME7 ME7-GR NBH IS NBH-IS ME7 IS ME7-IS

17 semana ps-inoculao

Figura 23. Freqncia dos comportamentos relacionados ao grooming. Legenda: Diferena entre os grupos ME7-GR e NBH-IS (ANOVA, um critrio, Bonferroni, p<0.025); ME7-IS realizaram menos grooming que os demais grupos (ANOVA, um critrio, p<0.01).

GROOMING 17 SEMANA PI Mdia Aritmtica NBH-GR = 9.6 ME7-GR = 7.6 NBH-IS = 10.8 ME7-IS = 3.5 Desvio Padro 3.2 1.5 2.2 2.6 Grupos* NBH-GR e ME7-IS ME7-GR e NBH-IS ME7-GR e ME7-IS NBH-IS e ME7-IS Significncia (Anova, Bonferroni)* p<0.025 p<0.01 p<0.01 p<0.01

Tabela 7: Comportamentos relacionados ao grooming observados na 17 semana ps-inoculao. * Apenas as correlaes significativas.

A figura 23 mostra que os NBH-GR no se distinguiram dos ME7-GR e dos NBH-IS quanto freqncia dos comportamentos relacionados ao grooming. Os sujeitos NBH-IS (MA=10.8, EP=0.9) realizaram mais grooming que os ME7-GR (MA=7.6, EP=0.7, p<0.025) e os ME7-IS (MA=3.5, EP=1.1, p<0.01). Os sujeitos ME7-IS apresentaram a menor freqncia de grooming, diferenciando-se de todos os grupos (p<0.01): NBHGR (MA=9.6, EP=1.3), ME7-GR, NBH-IS e ME7-IS.

87

Resumidamente, os ME7-IS apresentaram comportamento oposto (queda no grooming) ao observado nos NBH-IS e realizaram menos grooming que os ME7-GR.

1.7 Teste de Suspenso da Cauda.

O tempo de imobilidade e a freqncia de episdios imveis do TST no sofreram influncia significativa da infeco com prion e do isolamento, quando avaliado na 17 semana ps-inoculao.

1.8 Peso corporal.

Ganho de peso entre a 1 e a 17 semana ps-inoculao 60

ganho de peso (%)

50 40 30 20 10 0 NBH ME7 NBH-IS ME7-IS

Fig. 24 Percentual de ganho de peso entre o perodo pr-inoculao e a 17 semana ps-inoculao. * Diferena em relao aos demais grupos. Anova um critrio, Bonferroni, p<0.05.

GANHO DE PESO (%). Mdia Aritmtica NBH-GR = 57.66% ME7-GR = 58.11 % NBH-IS = 52.5 % ME7-IS = 54.6 % Desvio Padro 2.30 3.40 1.77 2.11 Grupos* NBH-GR e NBH-IS NBH-GR e ME7-IS ME7-GR e NBH-IS ME7-GR e ME7-IS NBH-IS e ME7-IS Significncia (Anova, Bonferroni)* p<0.01 p<0.01 p<0.01 p<0.025 p<0.05

Tabela 8: Percentual de ganho de peso entre a 1 e a 17 semana PI. * Apenas as correlaes significativas.

88

No tocante ao ganho de peso (Figura 24) entre a pr-injeo e a 17 semana PI, os sujeitos em grupo (NBH-GR e ME7-GR) no se distinguiram. Os animais NBH-IS apresentaram menor ganho de peso que os NBH-GR (MA=57.66, EP=0.74, p<0.01), os ME7-GR (MA=58.11, EP=1.13, p<0.01) e os ME7-IS (MA=54.6, EP=0.67, p<0.05). Por fim, os ME7-IS apresentaram menor ganho de peso que os NBH-GR (p<0.01) e ME7-GR (p<0.025), e maior peso que os NBH-IS (p<0.01). Em sntese, vemos que os sujeitos isolados (NBH-IS e ME7-IS) tiveram um percentual de ganho de peso menor que os sujeitos agrupados (NBH-GR e ME7-GR), enquanto que os ME7-IS demonstraram maior percentual de ganho de peso que o grupos NBH-IS.

89

2. Achados Neuropatolgicos

Aps o trmino dos testes comportamentais, na 17 semana ps-inoculao, os animais foram perfundidos, o tecido cerebral seccionado e seletivamente marcado para posterior identificao e contagem de redes perineuronais, microglias ativadas e astrcitos nas regies de CA1 e septum.

2.1 Anlise qualitativa

2.1.1 Redes Perineuronais

Na Figura 25 so ilustradas as alteraes da matriz extracelular em CA1 e na regio septal, 17 semanas aps a injeo do agente ME7. Os animais ME7 (GR e IS) apresentaram queda no nmero de redes perineuronais tanto em CA1 quanto no septum. Essas alteraes das redes perineuronais da matriz extracelular parecem restritas s mesmas regies onde se detectou a ativao da microglia e de astrcitos reativos e a reduo observada nas redes foi tanto mais intensa quanto maior a freqncia de microglias ativadas e astrcitos reativos (Figuras 22 e 23). O nmero de redes encontradas no septum e em CA1 foram semelhantes, tanto para os grupos injetados com NBH (GR e IS) quanto para aqueles injetados com ME7 (GR e IS). No encontramos diferena no nmero de redes perineuronais em ter os sujeitos ME7-GR e ME7-IS, nem entre os NBH-GR e NBH-IS, em ambas as regies investigadas. Entretanto, os sujeitos ME7IS apresentaram maior queda de redes na regio septal, enquanto que os Isolados demonstraram queda maior em CA1.

90

SEPTUM

CA1

NBH-GR

ME7-GR

NBH-IS

ME7-IS

91

Figura 25. Fotomicrografia de baixo aumento de seces marcadas com lectina Wisteria Floribunda nas regies de CA1 e do septum. Os sujeitos inoculados com ME7 apresentaram reduo de redes perineuronais tanto em CA1 quanto no septum. Escala: 250 m.

Na figura 26, temos os tipos de redes encontrados nas regies de interesse: tipo 1, corpo celular e prolongamentos neurais bem definidos; enquanto que as redes tipo 2 possuem uma marcao nuclear mais rarefeita e pouca definio dos prolongamentos.

Figura 26. Fotomicrografia em mdio (A) e grande aumento (B) para ilustrar a extenso e os tipos de redes perineuronais em seco do crebro de um animal sadio. Notar a extenso da rede envolvendo o soma (seta preta) e ramos dendrticos (seta branca) de neurnios hipocampais de CA3 (B) e a distino entre os tipos I e II de redes perineuronais (A). Escalas: (A) 25 m; (B) 10 m.

92

 2.1.2 Ativao Microglial. CA1 SEPTUM

NBH-IS

ME7-GR

ME7-IS

Figura 27: Fotomicrografia de seces reagidas por

histoqumica

para

lecitina

Lycopersicum

esculentum

biotinilada, contracoradas pelo Nissl para deteco de microglias ativadas em CA1 e no septum medial na 17

93

semana PI. Escalas: baixo aumento: 250m; grande aumento: 25m.

A Figura 27 ilustra a ativao microglial em CA1 e no septum. Notamos que, em ambas as regies, esta ativao bastante intensa nos sujeitos inoculados com o agente ME7, tanto em grupo quanto isolados. Vemos tambm que os sujeitos do grupo NBH apresentam apenas marcao de vasos, sem a presena de microglias ativadas. As microglias que porventura foram encontradas representam microglias no ativadas e, portanto, no so teis para serem comparadas com os achados de ativao microglial nos grupos ME7 (GR e IS). Na 17 semana PI, no encontramos diferena entre os sujeitos ME7-GR e ME7-IS, tanto em CA1 quanto no septum. A ativao microglial, em ambos os grupos, foi maior na regio septal do que na regio de CA1.

94

2.2 Anlise Quantitativa.

2.2.1 Redes perineuronais. Em CA1, utilizamos os seguintes parmetros estereolgicos.

Sujeitos a (caixa) ( m) NBH-1 NBH-2 120 x 120 NBH-6 NBH-3 ME7-4 ME7-5 120 x 120 ME7-6 ME7-7 NBH-1 NBH-3 120 x 120 NBH-4 NBH-5 ME7-1 ME7-5 120 x 120 ME7-6 ME7-7 A (X, Y) ( m) 120 x 120 asf tsf 0.91 0.004 0.81 0.03 0.89 0.05 0.77 0.02 0.78 0.04 0.93 0.06 0.95 0.01 0.89 0.03 0.95 0.04 0.86 0.03 0.78 0.08 0.77 0.02 0.82 0.08 0.89 0.02 0.94 0.01 0.82 0.04 ssf n de caixas 213 298 237 213 146 151 134 142 215 206 237 225 146 151 134 142 n de seces 5 Q 421 315 422 352 154 273 174 152 400 331 389 421 154 273 174 152

NBH
Grupo

1/5

ME7 Grupo

120 x 120

1/5

NBH Isolado ME7 Isolado

120 x 120

1/5

120 x 120

1/5

Tabela 9: Parmetros experimentais e resultados da contagem de redes perineuronais na regio septal ( Q). a (dimenses da caixa de contagem), A (dimensoes da matriz de contagem), asf (rea bloco/rea matriz), tsf (altura bloco/espessura da seco), ssf (seces contadas/total de seces).

ESTIMATIVAS INDIVIDUAIS UNILATERAIS: REDES PERINEURONAIS EM CA1

Sujeitos NBH-1 NBH-2 NBH-6 NBH-3
Mdia

NBH
Grupo

Espessura da seco 24.4 0.18 26.6 1.32 22.9 0.45 23.3 0.67 24.4 0.55 27.8 0.12 20.1 0.27 22.4 0.22 22.4 0.34 23.2 0.06 22.3 0.58 23.4 0.33 21.7 0.48 20.1 0.28 21.6 0.52 20.5 0.11

N 4819 4106 4472 4934 4617 881 1374 1035 872 1040 5137 5664 4915 4020 4634 852 802 997 947 900

ME7 Grupo

ME7-4 ME7-5 ME7-6 ME7-7

Mdia

NBH-1 NBH-3 NBH NBH-4 Isolado NBH-5

Mdia
ME7-1 ME7 ME7-5 Isolado ME7-6 ME7-7

Mdia

Coef. de Desvio CV= CE Erro (CE) Padro (DP/Mdia) 0.06 0.06 366 0.006 0.0036 0.06 0.06 0.06 0.09 234 0.051 0.0081 0.09 0.09 0.08 0.09 0.06 685 0.022 0.0036 0.07 0.06 0.06 0.06 0.6 88 0.0096 0.0064 0.8 0.1 0.09 0,08

CE/ CV

CVB

CVB (% de CV)

0.6

0.0024

40%

0.15 0.043

84%

0,163 0.02

83.6%

0,66 0.0032

33%

95

Tabela 10: Estimativa individual unilateral do nmero de redes perineuronais (N) com o Coeficiente de Erro (CE) na regio septal nos quatro grupos experimentais. CV (coeficiente de variao), CVB (coeficiente de variao biolgica), CVB= CV - CE.

No septum utilizamos os parmetros estreolgicos a seguir.

Sujeitos a (caixa) ( m) NBH-1 70 x 70 NBH-2 NBH-5 NBH-3 ME7-4 70 x 70 ME7-5 ME7-6 ME7-7 NBH-1 70 x 70 NBH-3 NBH-4 NBH-5 ME7-1 70 x 70 ME7-5 ME7-6 ME7-7 A (X, Y) ( m) 120 x 120 asf 0.87 0,34 0.88 0.85 0.89 0.91 0,34 0.91 0.95 0.89 0.69 0,34 0.71 0.83 0.81 0.72 0,34 0.83 0.98 0.89 tsf 0.03 0.01 0.09 0.002 0.004 0.03 0.01 0.02 0.04 0.01 0.06 0.003 0.04 0.01 0.02 0.06 ssf n de caixas 163 147 188 165 154 112 144 103 92 97 70 81 92 103 71 92 n de seces 3 Q 349 356 275 255 102 149 206 81 303 352 292 341 154 164 135 154

NBH
Grupo

1/5

ME7 Grupo

120 x 120

1/5

NBH Isolado ME7 Isolado

120 x 120

1/5

120 x 120

1/5

Tabela 11: Parmetros experimentais e resultados da contagem de redes perineuronais na regio septal.

ESTIMATIVAS INDIVIDUAIS UNILATERAIS: REDES PERINEURONAIS NA REGIO SEPTAL

Sujeitos NBH-1 NBH-2 NBH-5 NBH-3
Mdia

NBH
Grupo

Espessura da seco 23.2 0.08 22.7 0.27 23.6 0.27 22.5 0.07

N 5931 5936 4254 4851 5243 1643 2404 4060 1357 2366 6026 6334 5486 6198 6011 2867 2702 3128 2867 2956

ME7-4 21.94 0.09 ME7-5 22.48 0.58 ME7 ME7-6 22.19 0.85 Grupo ME7-7 21.0 0.10 Mdia 21.90 0.32 NBH-1 27.1 0.06 NBH-3 24.5 0.51 NBH NBH-4 25.6 0.23 Isolado NBH-5 24.7 0.37

Mdia
ME7-1 ME7 ME7-5 Isolado ME7-6 ME7-7 25.3 0.25 22.4 0.46 31.5 0.18 25.3 0.57

Mdia

Coef. de Erro (CE) 0.08 0.06 0.07 0.07 0.07 0.10 0.1 0.07 0.1 0.09 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.07 0.06 0.06

Desvio CV= CE Padro (DP/Mdia)

CE/ CV

CVB

CVB (% de CV)

833

0.025

0.0049

0.19 0.02

80%

1212

0.26

0.0081

0.031 0.25

96%

372

0.04

0.0036

0.09 0.036

90%

209

0.005

0.0036

0.72 0.0014

28%

96

Tabela 12: Estimativas individuais unilaterais quanto s redes perineuronais no septum.

No grfico (Figura 28) abaixo, observamos o nmero de redes perineuronais em CA1 e na regio septal.

6000 4617 5000 4000 3000 2000 1000 0 NBH-GR ME7-GR 1041

4934

6000

5243

6011

*
2366

*
2891

5000 4000 3000

900

2000 1000 0

NBH-IS

ME7-IS

NBH-GR

ME7-GR

NBH-IS

ME7-IS

Figura 28: Nmero de redes perineuronais na em CA1 (barras cinzas) regio septal (barras pretas). *Os sujeitos dos grupos NBH (GR e IS) se distinguiram dos sujeitos inoculados com ME7 (GR e IS). Anova, um critrio, Bonferroni, p<0.01.

Em CA1 (barras cinzas), os sujeitos NBH-GR (MA=4617, EP=64.9) apresentaram maior nmero de redes perineuronais que os ME7-GR (MA=1041, DP=29.2, p<0.01). No encontramos diferena entre os grupos NBH-GR e NBH-IS, nem entre os ME7-GR e ME7-IS. Os camundongos NBH-IS (MA=4934, EP=44.3), por sua vez, possuem mais redes que os ME7-IS (MA=900, EP=87.9, p<0.01). Na regio septal, os sujeitos NBH-GR (MA=5243, EP=416.8) e NBH-IS (MA=6.011, EP=186) no se diferenciaram, sendo o mesmo observado entre os ME7-GR (MA=2.366, EP=606.3) e os ME7-IS (MA=2.891, EP= 87.9). Os ME7-GR e os ME7-IS possuem menor nmero de redes em relao aos NBH-GR (p<0.01) e os NBH-IS (p<0.01), respectivamente. Vemos, ento, que tanto em CA1 quanto no septum, os grupos ME7 (GR e IS) possuem menos redes perineuronais que os NBH (GR e IS) e que o septum concentra maior nmero dessas redes que a regio de CA1. 97

 2.2.2 Microglias ativadas em CA1 e septum.

Para a contagem de microglias em CA1, utilizamos os parmetros estereolgicos abaixo.

PARMETROS ESTREOLGICOS: MICROGLIAS ATIVADAS EM CA1 Sujeitos a (caixa) A (X, Y) ( m) ( m) ME7-7 45 x 45 80 x 80 ME7-10 ME7-3 ME7-9 NBH-5 45 x 45 80 x 80 NBH-1 NBH-3 NBH-6 ME7-2 45 x 45 80 x 80 ME7-1 ME7-3 ME7-4 asf tsf ssf n de caixas 112 116 127 110 119 135 127 120 100 106 116 109 n de seces 5 Q 267 262 448 294 121 113 105 80 310 385 418 436

ME7 Grupo

NBH Isolado

ME7 Isolado

0.89 0.02 0,32 0.77 0.03 0.78 0.02 0.93 0.02 0.79 0.05 0,32 0.71 0.07 0.81 0.08 0.86 0.01 0.91 0.04 0,32 0.97 0.03 0.89 0.01 0.76 0.07

1/5

1/5

1/5

Tabela 13: Parmetros experimentais e resultados da contagem de microglias em CA1.

ESTIMATIVAS INDIVIDUAIS UNILATERAIS: MICROGLIAS EM CA1 Espessura da seco ME7-7 14.62 0.35 ME7-10 17.15 0.83 ME7 ME7-3 16.88 0.42 Grupo ME7-9 20.34 0.35
Mdia

Sujeitos

N 10974 8705 14763 9967 11102 3404 2978 3366 2412 3040 9754 12658 12199 14997 12402

NBH-5 NBH-1 NBH NBH-3 Isolado NBH-6

17.25 0.18 17.8 0.46 16.7 0.70 20.3 0.22 20 0.36 20.8 0.37 18.5 0.59 21.8 0.55

Mdia
ME7-2 ME7-1 ME7 ME7-3 Isolado ME7-4

Mdia

Coef. de Desvio CV= CE CE/ CVB CVB Erro (CE) Padro (DP/Mdia) CV (% de CV) 0.07 0.06 0.05 0.003 0.06 0.047 94% 0.05 2611 0.06 0.06 0.06 0.07 0.02 0.0049 0.24 0.015 75% 0.06 460 0.08 0.07 0.05 0.04 0.02 0.0016 0.08 0.018 90% 0.04 2148 0.04 0.04

Tabela 14: Estimativa individual unilateral quanto ativao microglial na regio de CA1 nos quatro grupos experimentais.

98

Quanto ao septum, os parmetros e resultados estereolgicos esto descritos abaixo.

PARMETROS ESTREOLGICOS: MICROGLIAS ATIVADAS NO SEPTUM Sujeitos a (caixa) A (X, Y) ( m) ( m) ME7-3 40 x 40 80 x 80 ME7-6 ME7-9 ME7-10 NBH-3 40 x 40 80 x 80 NBH-4 NBH-5 NBH-1 ME7-1 40 x 40 80 x 80 ME7-3 ME7-2 ME7-4 asf 0.70 0,25 0.80 0.63 0.74 0.51 0,25 0.64 0.59 0.81 0.67 0,25 0.69 0.73 0.85 tsf 0.03 0.02 0.08 0.02 0.01 0.08 0.07 0.05 0.05 0.03 0.06 0.08 ssf n de caixas 119 115 101 108 90 76 79 62 85 83 108 91 n de seces 3 Q 385 437 233 371 41 61 70 80 291 178 274 262

ME7 Grupo

1/5

NBH Isolado

1/5

ME7 Isolado

1/5

Tabela 15: Parmetros experimentais e resultados da contagem de microglias no septum.

ESTIMATIVAS INDIVIDUAIS UNILATERAIS: MICROGLIAS NO SEPTUM Sujeitos ME7-3 ME7-6 ME7 ME7-9 Grupo ME7-10
Mdia

Espessura da seco 19.14 0.91 19.54 0.75 22.0 2.51 17.84 0.35

N 24.512 29.596 16.797 22.175 23.405 6.728 4.770 4.189 2.754 4.610 22428 20319 11789 17789 18.081

NBH-1 19.63 0.87 NBH-3 17.35 0.18 NBH NBH-4 17.6 0.46 Isolado NBH-5 21.2 0.21

Mdia
ME7-1 ME7-3 ME7 ME7-2 Isolado ME7-4 18.25 0.28 19.8 0.56 17.7 0.80 22.3 0.31

Mdia

Coef. de Erro (CE) 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.10 0.06 0.1 0.08 0.04 0.06 0.07 0.06 0.06

Desvio CV= CE Padro (DP/Mdia)

CE/CV CVB

CVB (% de CV)

5279

0.050

0.005

0.98

0.045

90%

1647

0.1279

0.0064

0.05

0.121

95%

4603

0.064

0.0036

0.06

0.06

88%

Tabela 16: estimativa individual unilateral do nmero microglias (n) com o coeficiente de erro (ce), regio septal, nos quatro grupos experimentais. CV (coeficiente de variao), CVB (coeficiente de variao biolgica), CVB= CV - CB.

99

Comparativamente, a ativao microglial dos grupos experimentais da 17 semana PI apresentou-se da seguinte forma, em CA1 e no septum (Figura 29):

A
30000 25000 20000 15000 10000 5000 0
30000 25000 20000 15000 10000 5000 0

ME7-GR

ME7

ME7-IS

ME7-IS

ME7 ME7-GR

ME7-IS ME7-IS

Figura 29. Nmero de microglias em CA1 (A) e na regio septal (B). Os sujeitos NBH-IS (CA1 e septum) apresentaram menor nmero de microglias que os ME7-GR e ME7-IS (CA1 e septum). Notamos maior quantidade de microglias na regio septal. ANOVA, um critrio, Bonferroni, p<0.01.

Tanto em CA1 quanto septum (Figura 29B) no encontramos diferena entre os ME7 (GR e IS). A contagem de microglia ativada dos sujeitos NBH-GR e NBH-IS, embora no ilustrada no presente trabalho em funo de seu pequeno nmero, um bom indicador de que esses animais, no desenvolveram resposta inflamatria crnica aps a injeo dos homogenados cerebrais normais, em oposio aos animais ME7 que demonstraram intensa ativao microglial.

100

Tendo observado as alteraes provocadas pelo agente ME7, interessante compararmos, em CA1 (Figura 30) e no septum (Figura 31), como se apresenta a relao entre o nmero de redes perineuronais e de microglias.

6000 5000 4000

12500 12000 11500

3000 11000 2000 1000 0 NBH NBH-IS ME7 ME7-IS 10500 10000

Redes

Microglias

Figura 30: Comparao entre o nmero de redes perineuronais e a ativao microglial em CA1.

Na Figura 30 observamos, na regio de CA1, a comparao entre a diminuio do nmero de redes perineuronais em relao progresso do nmero de microglias, 17 semanas aps a inoculao com o agente ME7. Notar que os sujeitos inoculados com ME7 (GR e IS), apresentaram queda do nmero de redes em relao aos seus controles NBH (GR e IS, respectivamente). Paralelamente, os grupos ME7-GR e ME7-IS apresentaram aumento do nmero de microglias, visto que os grupos NBH (GR e IS) no apresentam microglias ativadas em nmero significativo. Assim, embora no possamos afirmar com segurana que a ativao microglial induz a queda no numero de redes, claramente existe uma correlao inversa entre esses elementos.

Microglias

Redes

101

De modo geral, considerando os resultados dos grupos ME7 (GR e IS), percebemos que a reduo observada nas redes foi tanto mais intensa quanto maior a freqncia de microglias ativadas. Por fim, a Figura 31 mostra a relao entre o nmero de redes e de microglias no septum.

7000 6000

25000

20000 5000 4000 3000 2000 5000 1000 0 NBH Redes NBH-IS ME7 Microglia ME7-IS 0

10000

Figura 31: Comparao entre o numero de redes perineuronais e de microglias na regio septal, 17 semanas aps a inoculao com ME7.

Observamos na Figura 31 que o grupo que apresenta maior ativao microglial (ME7 GR, MA=23.407, EP=2639) apresenta tambm menor nmero de redes perineuronais (MA=2.366, EP=606). Os sujeitos ME7-IS (MA=18.082, EP), que demonstram uma ativao microglial menor que os ME7-GR, tambm demonstram reduzido nmero de redes (MA=2891, EP=2.301). Observamos maior reduo do nmero de redes perineuronais quando o nmero de microglias ativadas cresce no apenas em CA1 mas tambm na regio do septum (Figuras 30 e 31). Apesar de no termos encontrado diferena entre os grupos ME7 (GR e IS) nos dados absolutos, podemos observar que em termos percentuais a taxa de reduo de redes no hipocampo 102

Microglias

15000

Redes

 maior do que no septum. O nmero de microglias ativadas cresceu 407% nos ME7-IS em CA1 em relao ao grupo NBH-IS e o nmero de redes reduziu em torno de 73% nos ME7-GR e 83% nos ME7-IS. Notar que, nessa regio, observamos maior queda percentual de redes perineuronais nos ME7-IS em relao ao ME7-GR. Na regio septal, o aumento de microglias ativadas foi de 392% no grupo ME7-IS em comparao aos NBH-IS. A quantidade de redes perineuronais diminuiu 55% nos ME7-GR e 51% nos ME7-IS. Tal como em CA1, vemos o aumento da microgliose associado perda de redes perineuronais na regio septal. Tomando os dados em conjunto, observamos que o aumento da ativao microglial acompanhado de queda no nmero de redes perineuronais, revelando uma relao inversamente proporcional. A anlise comparada da taxa de reduo em funo do nmero de microglias utilizando o mtodo de regresso para diferentes ajustes de curva revelou que enquanto nos animais em grupo, a taxa de reduo segue uma funo geomtrica, nos animais isolados, essa mesma taxa revela uma correlao linear. Isso significa que para essa janela temporal, o isolamento parece alterar a relao entre as alteraes da matriz extracelular e a resposta inflamatria na doena prion em fases iniciais.

103

V. DISCUSSO

No presente trabalho objetivamos investigar as principais alteraes comportamentais e neuropatolgicas induzidas pela Doena Prion em camundongos albinos suos infectados com o agente ME7, comparando animais mantidos em grupo com animais isolados. Nossos achados revelaram que a atividade de burrowing, grooming, consumo de glicose, LCE e peso corporal alteram-se de forma aditiva por conta do isolamento social. Os achados neuropatolgicos confirmaram resultados anteriores apresentando reduo do nmero de redes perineuronais e microgliose, tanto na regio de CA1 como no septum, na 17 semana PI no indicando em termos absolutos diferenas significativas em relao aos animais em grupo.

Achados comportamentais.

Poucos estudos tm investigado o efeito em longo prazo de um estressor severo. A maioria dos trabalhos utiliza exposies repetidas a um certo estressor ou observa o comportamento do animal aps uma situao aversiva aguda (JONG et al, 2005). Alm disso, apesar dos efeitos prejudiciais do estresse imunidade e ao funcionamento em geral do organismo, no h estudos acerca da possvel influncia de eventos estressores no desenvolvimento da Doena Prion. Diversos trabalhos demonstram que a Doena Prion caracterizada por alteraes comportamentais significativas em roedores, as quais precedem as mudanas neuropatolgicas (BETMOUNI et al, 1999; DEACON et al, 2001; GUENTHER et al, 2001). Nesse sentido, nossa bateria de testes examinou comportamentos espontneos (burrowing, consumo de glicose e grooming), motores e cognitivos (Labirinto em Cruz Elevado e Campo Aberto), diante de

104

uma situao estressora (Teste de Suspenso da Cauda) e respostas inatas (peso corporal e temperatura anal).

II. Consumo de glicose A perda do interesse em atividades prazerosas e em recompensas (anedonia) um sintoma muito comum na depresso, seja em humanos ou em modelos animais (CRYAN et al, 2002). Uma das formas mais utilizadas para acessar essa varivel em modelos experimentais a observao de alteraes na ingesto de solues aucaradas (CRYAN e HOLMES, 2005; CRYAN et al, 2002), sendo que a preferncia pelo soro glicosado no parece ser influenciada nem pela concentrao do acar nem pela presena ou ausncia de um segundo recipiente com gua (WILLNER, 1997). No presente trabalho, apenas na 17 semana ps-inoculao observamos diferena, quanto ao consumo de glicose, entre os grupos experimentais. A dificuldade de distinguir os sujeitos isolados (NBH-IS e ME7-IS) dos sujeitos em grupo (NBH-GR e ME7-GR) nas primeiras 16 semanas sugere que o modelo do isolamento social no induziu queda da ingesto de glicose. De fato, nossos achados confirmam que esse modelo induz comportamentos mais relacionados ansiedade (BLANCHARD et al, 2001;

MAISONNETTE et al, 1993). No h trabalhos prvios que descrevam a ingesto de glicose em camundongos da variedade albina Sua injetados com o agente ME7. No entanto, estudos na variedade C57BL6J (C57), mostram queda na ingesto desta soluo em torno da 12 semana PI (CUNNINGHAM et al, 2005; CUNNINGHAM et al, 2003; GUENTHER et al, 2001). Os circuitos neurais envolvidos na preferncia por glicose ainda so pouco conhecidos, mas sabe-se que, provavelmente, no so decorrentes de alteraes hipocampais (DEACON et al, 2002). Alguns trabalhos sugerem a importncia de leses no tlamo gustatrio (REILLY e TRIFUNOVIC, 2000), mas no estudos sistemticos que revelem 105

evidencias consistentes de que haja ativao microglial nessa regio. Nesse sentido, nossos dados qualitativos sugerem maior ativao microglial no tlamo do que nas regies de CA1 e do septum, na 17 semana PI, indicando que as estruturas talmicas so bastante alteradas pela Doena Prion, na variedade albina Sua. Por falta de estudos conclusivos, ainda no se sabe se a queda na preferncia por glicose observada na Doena Prion estaria relacionada a dificuldades gustativas ou a perda do interesse em recompensas. Se considerarmos a intensa ativao microglial encontrada no tlamo dos nossos sujeitos inoculados com ME7, a primeira hiptese parece mais provvel.. O isolamento tambm parece ter influncia no consumo de glicose, a partir da 17 semana PI, pois os sujeitos isolados (NBH-IS e ME7-IS) ingeriram menor quantidade desta soluo do que os animais em grupo (NBH-GR e ME7-GR). Assim, 17 semanas aps a inoculao, comeam a surgir indcios de anedonia, cuja evoluo permanece por ser investigada.

Burrowing (remoo e estocagem de rao) Em roedores sadios, a atividade de remoo e estocagem de comida intensa e regular, observando-se a remoo de grande quantidade de rao em apenas 2 horas, contrariamente ao observado em animais injetados com o agente ME7, que apresentam um declnio brusco desta atividade (DEACON et al, 2001). As vantagens do burrowing so diversas: um teste simples e barato, no invasivo, bastante sensvel aos efeitos comportamentais iniciais da Doena Prion (DEACON et al, 2001). Em nossos experimentos, os sujeitos ME7-Isolados apresentaram declnio

significativo no burrowing na 16 semana, enquanto os ME7-GR somente na 17 semana. Em camundongos da variedade C57Bl6, as mudanas no burrowing aparecem em torno da 12 semana (CUNNINGHAM et al, 2003; 2005). Os experimentos de BORNER

106

(2009) apontam que a queda no burrowing provocada pelo ME7 so mais tardias

no

camundongo albino suo, entre a 16 e 17 semana ps-inoculao. Nossos achados, alm de confirmarem essa alterao mais tardia do burrowing na variedade albina Sua, indicam que os sujeitos isolados injetados com ME7 apresentam declnio, nesse teste, uma semana antes do que os sujeitos doentes mantidos em grupo. Assim, nossos dados sugerem que o isolamento social antecipa as alteraes no burrowing observadas na Doena Prion. A queda no burrowing no devido a uma depresso motora geral, pois em testes de atividade exploratria, como o Campo Aberto, esses roedores apresentam hiperatividade locomotora (CUNNINGHAM et al, 2003 e 2005). A remoo/estocagem de comida um comportamento natural dos roedores muito sensvel a eventos que perturbem o funcionamento global do Sistema Nervoso Central (GUENTHER et al, 2001). O declnio da remoo e estocagem de rao parece estar associada alteraes neuropatolgicas de circuitos que envolvem o hipocampo (DEACON et al., 2002). Esses circuitos hipocampais, junto com suas aferncias e eferncias, parecem desempenhar papel importante no processamento de estmulos externos ligados motivao inata; programas motores associados comportamentos naturais de cada espcie; assim como s relaes espaciais do ambiente durante o comportamento exploratrio (DEACON et al., 2005). Em humanos, a apatia e a perda de interesse so comuns nos estgios iniciais da doena de Creutzfeldt-Jacob (SPENCER et al, 2002), assim como incapacidade para lidar com tarefas rotineiras freqente na Doena de Alzheimer (REISBERG et al, 2001).

Temperatura anal Eventos estressores, sejam fsicos ou psicolgicos, provocam mudanas fisiolgicas que perturbam a homeostase, afetando o sistema imunolgico, o sistema nervoso e funcionamento normal do corpo (BOWERS et al, 2008). Situaes extremas de estresse provocam aumento da temperatura corporal (BOWERS et al, 2008; WILLNER, 1997). 107

Ademais, o aumento da temperatura corporal um sintoma bastante comum em modelos de ansiedade, de forma que diversos estudos utilizam esse critrio para caracterizar alteraes fisiolgicas implcitas ao estado semelhante ao ansioso (HEYDEN et al, 1997; OVERSTREET et al, 1994). Ao longo das semanas ps-injeo os animais isolados (NBH-IS e ME7-IS) apresentaram temperatura mais elevada que os mantidos em grupo (NBH-GR e ME7-GR). Esse achado se alinha hiptese do presente trabalho de que esses animais apresentam comportamentos mais relacionados ansiedade, pelo menos no perodo observado. Os sujeitos NBH-IS e ME7-IS no se distinguiram uns dos outros, enquanto que os ME7-GR apresentaram temperatura mais elevada do que os NBH-GR na 11 e 15 semana PI. No relacionamos esta elevao trmica dos sujeitos ME7-GR Doena Prion, pois a mesma parece induzir queda de temperatura (CUNNINGHAM et al, 2002). Assim dentro dos limites temporais analisados, nossos dados apontam que, pelo menos at a 17 semana, a Doena Prion no altera a temperatura anal dos roedores da variedade Sua albina.

Teste do Campo Aberto No perodo pr-injeo, os animais Isolados apresentaram um aumento significativo da atividade exploratria no Campo Aberto em relao aos Agrupados. Como a nica diferena entre os dois grupos foi o isolamento, fica claro que o potencial ansiognico desta varivel j est presente na 3 semana de isolamento. Estudos prvios demonstram que o simples afastamento do roedor do seu grupo provoca comportamentos semelhantes aos observados na ansiedade (BLANCHARD et al, 2001; MAISONNETTE et al, 1993). Na 17 semana PI, esse comportamento semelhante ao ansioso persiste nos sujeitos NBH-IS e exacerbado nos ME7-IS. Na variedade C57BL6J, os sujeitos injetados com o agente ME7 aumentam a atividade exploratria, no CA, na 16 semana PI (CUNNINGHAM et al, 2005; GUENTHER et al, 108

2001). J os camundongos da variedade Sua albina apresentam essas alteraes somente a partir da 20 semana PI (BORNER, 2009), o que confirma nossos achados, pois os sujeitos NBH-GR e ME7-GR no se distinguiram, quanto explorao do Campo Aberto, na 17 semana. Durante um perodo curto (4 semanas) tanto a variedade C57Bl6 (entre a 16 a 20) quanto a Sua albina (entre a 20 a 24 ), infectadas pelo agente ME7, apresentam marcada hiperatividade em relao aos camundongos do grupo controle. Entretanto, a origem fisiopatolgica desse aumento da atividade locomotora, que se restringe ao perodo intermedirio da doena, ainda no est esclarecida. O grupo ME7-IS, entretanto, apresentou intensa hiperatividade no Campo Aberto, apontando uma somao dos efeitos provocados pela Doena Prion e pelo modelo de isolamento social. Na Doena Prion, parece que a insero dos animais doentes em um novo ambiente dispara ciclos mais longos de atividade exploratria quando comparados aos controles, que normalmente a diminuem com a habituao ao ambiente (BORNER, 2009). No mesmo sentido, trabalhos anteriores relatam que o isolamento social tambm aumenta a atividade exploratria no Campo Aberto e em ambientes novos (JONG et al, 2005; HALL et al, 1996 e 1997). Tomando esses dados em conjunto, parece provvel que a sobreposio das alteraes provocadas pelo agente ME7 e pelo isolamento exacerbaram o comportamento exploratrio dos ME7-IS, antecipando para a 17 semana as alteraes no Campo Aberto que s so observadas, no camundongo albino, na 20 semana PI. Observando-se a performance do grupo ME7-IS nos testes comportamentais discutidos at o momento, vemos que as alteraes no Campo Aberto so subseqentes queda no burrowing e no consumo de glicose (tabela 18). Isso observado tanto na variedade C57Bl6J (CUNNINGHAM et al, 2005) quanto na variedade Sua albina (BORNER, 2009).

109

Tabela comparativa: espcie inoculada, isolamento social e testes comportamentais.

Camundongo inoculado com agente ME7 C57BL6J

(CUNNINGHAM et al, 2005) Suo Albino 24 semanas PI (BORNER, 2009) Suo Albino em grupo (17 semanas PI) Suo Albino isolado (17 semanas PI)

Consumo de glicose

Burrowing

Hiperatividade no CA

12 S.P.I.

12 S.P.I.

16 S.P.I.

No foi auferido

16/17 S.P.I.

20 S.P.I.

17 S.P.I.

17 S.P.I.

----

17 S.P.I.

16 S.P.I.

17 S.P.I.

Tabela 18: Comparao entre a espcie inoculada com agente ME7, influncia do isolamento social, e os testes do consumo de glicose, burrowing e Campo Aberto. (S.P.I.) semanas ps-inoculao. (---) No encontramos hiperatividade no Campo Aberto nos sujeitos ME7-GR.

Labirinto em Cruz Elevado Diversos estressores afetam a performance no Labirinto em Cruz Elevado (DUCOTTET e BELZUNG, 2004). Nossos dados apontam que nosso modelo de isolamento social, na 3 semana ps-isolamento, altera o comportamento, no LCE, dos roedores isolados e, na 17 semana PI, altera a performance dos sujeitos isolados inoculados com o agente ME7. Os sujeitos Isolados, na 3 semana de isolamento (perodo pr-inoculao), apresentaram comportamentos semelhantes ao ansioso, pois: percorreram menor distncia no Brao Aberto (BA); entraram menos e passaram menor tempo neste brao que os Agrupados, o que est de acordo como o observado, em ratos, por KOIKE et al (2009). Quanto mais intensa a ansiedade menor ser a preferncia pelo brao aberto, pois explor-lo gera medo e ansiedade, levando o animal a esconder-se no Braos Fechado do LCE (HANDLEY e MITHANI, 1984; PELLOW e FILE, 1986).

110

Na espcie C57 inoculada com ME7, alteraes no LCE so subseqentes hiperatividade no Campo Aberto (TRVIA, 2008). No albino Suo o fato de no termos encontrado alteraes no LCE nos sujeitos ME7-GR da 17 semana PI, coerente com achados prvios que demonstraram que a hiperatividade da variedade Sua albina, no CA, s ocorre a partir da 20 semana PI (BORNER, 2009). Por outro lado, os sujeitos ME7-Isolados comportaram-se de forma mais complexa. Na semana pr-inoculao, esse grupo apresentou o comportamento associado ansiedade de percorrer menor distancia, entrar menos e passar menor tempo no Brao Aberto. Na 17 semana PI percorreram menor distancia no BA, porm aumentaram o nmero de entradas e o tempo neste brao, sugerindo diminuio da averso pelo BA. Esse aumento de permanncia no Brao Aberto tambm foi observado na variedade C57 inoculada com o agente ME7 (TRVIA, 2008). Ademais, o fato dos sujeitos ME7-IS passarem maior tempo, porm percorrerem menor distncia no BA, sugere que os mesmos diminuem a sua mobilidade nesse brao. Enquanto que no perodo pr-inoculao (3 semana de isolamento) esses animais evitaram o Brao Aberto, na 17 semana PI, permaneceram mais tempo imveis no BA, distanciando-se dos comportamentos relacionados ansiedade e, aparentemente, aproximando-se do espectro do que seria esperado em comportamento semelhante depresso, que tende a induzir imobilidade em diversos testes (CRYAN e HOLMES, 2005; CRYAN et al, 2002).

Grooming (comportamentos relacionados a autolimpeza) Notamos que, na 17 semana PI, o isolamento no influenciou os comportamentos relacionados ao grooming dos sujeitos NBH-IS, pois eles no se distinguiram dos NBH-GR. No temos dados referentes ao grooming na 3 semana de isolamento (perodo prinoculao), porm, dado que nossos testes comportamentais apontam, claramente, para uma

111

conduta semelhante ansiedade neste perodo, provvel que os sujeitos Isolados apresentassem maior freqncia no grooming, conforme o esperado em modelos de estresse que induzem respostas prximas ansiedade ( KALUEFF e TUOHIMAA, 2004). Os ME7-GR, por sua vez, no se distinguiram dos NBH-GR, porm os ME7-IS apresentaram queda na freqncia do grooming em relao ao grupo NBH-IS. No h trabalhos prvios sobre o grooming em roedores injetados com ME7. Como encontramos queda na freqncia deste comportamento nos ME7-IS, mas no nos ME7-GR, o grooming parece ser mais um indicativo de que as alteraes comportamentais provocadas pela Doena Prion e manifestam mais precocemente nos animais isolados injetados com ME7. Afinal, o grooming, assim como o burrowing, um comportamento inato que depende do timo funcionamento global do SNC, funcionamento este que alterado pela Doena Prion (CUNNINGHAM et al, 2003). Esta hiptese parece ser confirmada em nossos achados nos sujeitos ME7-IS, pois eles apresentaram freqncia no grooming 65% menor que a observada nos NBH-IS. A queda no grooming um dos efeitos mais observados em animais que apresentam comportamentos semelhantes depresso ( KALUEFF e TUOHIMAA, 2004). Novamente, vemos a antecipao de alteraes comportamentais da Doena Prion em funo do isolamento social.

Teste de Suspenso da Cauda No encontramos diferenas nas variveis imobilidade e freqncia no Teste de Suspenso da Cauda nos grupos experimentais da 17 semana PI. Este teste um indicativo bastante valioso para se verificar a habilidade do animal em empreender tentativas de escape em uma situao extremamente aversiva (CRYAN et al, 2005). Apesar de no termos dados prvios sobre o comportamento de animais injetados com ME7 no Teste de Suspenso da Cauda, podemos construir algumas hipteses. Primeiramente, notamos que a Doena Prion (ME7-GR) no influenciou a performance no TST na janela 112

temporal estudada. Como o teste do LCE, que tambm possui um carter aversivo, no sofreu alterao pela Doena, na 17 semana PI, parece razovel que ainda no sejam detectadas alteraes no TST. Em segundo lugar, os sujeitos isolados (NBH-IS e ME7-IS) no apresentaram o comportamento semelhante depresso de permanecer mais tempo imveis no TST. Isso pode indicar que, se os animais ME7-IS esto se aproximando de um modelo de depresso, a janela temporal observada ainda no induz respostas robustas e permanentes detectveis no TST com padres comuns ao estado depressivo em modelos animais (CRYAN et al, 2005; RIPOLL et al, 2003). Outra possibilidade de que o TST talvez seja um teste extremamente aversivo mesmo para os camundongos em grupo, impossibilitando a distino daqueles dos isolados as custas de um possvel comportamento extremo dos animais mantidos em grupo.

113

Peso corporal

Por fim, observamos que os sujeitos isolados (NBH-IS e ME7-IS) da 17 semana tiveram menor ganho de peso que os sujeitos em grupo (NBH-GR e ME7-GR). O aumento do peso corporal nos sujeitos do grupo ME7-IS observado concomitantemente queda na ingesto de glicose e ao aumento da atividade exploratria no Campo Aberto (todos referentes 17 semana PI). Tais resultados tambm foram encontrados por GUENTHER et al (2001) na variedade C57 infectada com ME7, s que por volta da 12 semana PI. Para estes autores, h uma relao ainda no esclarecida entre estes trs testes. De qualquer forma, estes pesquisadores argumentam que o ganho de peso dos animais injetados com ME7 no pode ser relacionado a Diabetes (decorrente da ingesto semanal de glicose), pois no foram encontradas diferenas na concentrao de acar na urina dos roedores C57. Em nossos experimentos, vemos que o isolamento induziu menor ganho de peso. Em longo prazo, a reduo do ganho de peso um dos efeitos mais consistentes do isolamento social (JONG et al, 2005). Paralelamente, os sujeitos ME7-IS apresentaram aumento significativo de peso em relao aos NBH-IS, o que no foi observado nos ME7-GR. Como os resultados de GUENTHER et al (2001) indicam que, nos estgios iniciais da Doena Prion, os camundongos C57 injetados com ME7 apresentam ganho de peso em relao a seus controles, parece que o isolamento social antecipou a manifestao desta alterao comportamental. importante frisar que nos estgios mais tardios da Doena, observa-se perda gradativa de peso corporal (CUNNINGHAM et al, 2005). Na tabela 19, temos uma viso geral do comportamento dos animais inoculados com o agente ME7 em nossos testes comportamentais, comparando sujeitos isolados com agrupados e com os dados relatados para espcie C57.

114

Alteraes comportamentais nas espcies Sua Albina e C57 inoculadas com ME7*
ME7-GR ME7-IS Sua Albina** C57***

Diminuio do Consumo de glicose

17

17

SD

12

Diminuio do Burrowing

17

16

16/17

12

Hiperatividade no Campo Aberto

----

17

20

16

Aumento do Tempo no Brao Aberto do LCE

----

17

SD

17

Diminuio do Grooming

----

17

SD

SD

Alteraes no TST

----

----

SD

SD

Ganho de peso

----

17

SD

13

Tabela 19: Comparao dos achados comportamentais com os j descritos para as variedades Sua Albina e C57BL6J. * Dados em semanas ps-inoculao com ME7; ** BORNER (2009); *** CUNNINGHAM et al, 2003, 2005; GUENTHER, 2001; (SD): no h dados acerca destes testes; (----): no foram encontradas alteraes na 17 semana PI.

Considerando-se os testes especficos para alteraes provocadas por estresse de (consumo de glicose, LCE, groomimg e peso corporal) notamos que o isolamento social induziu comportamentos relacionados ansiedade, na 3 semana de isolamento, enquanto que, na 17 semana PI, os sujeitos isolados parecem estar se distanciando desses comportamentos e se aproximando de uma conduta semelhante observada em modelos animais de depresso. Notamos tambm que os sujeitos isolados inoculados com ME7 apresentaram alteraes comportamentais iniciais da Doena Prion (queda no burrowing, hiperatividade no Campo Aberto, maior tempo no BA do LCE, queda no grooming e alteraes no ganho de peso) mais precocemente do que aqueles injetados com ME7 mantidos em grupo. 115

Sabe-se que indivduos em grupo demonstram maior proteo contra injrias no sistema imunolgico e contra os efeitos adversos do estresse, alm de serem mais saudveis e longevos (HOGAN et al, 2002; COHEN, 1988). Diversos estudos apontam que o estresse crnico (longa durao) um modelo animal de depresso que induz, entre diversos efeitos, queda na ingesto de solues aucaradas, queda nos comportamentos relacionados ao groomimg e perda de peso em roedores ( KALUEFF e TUOHIMAA, 2004; RETANAMRQUEZ et al, 2003; KEENEY et al, 1999; BERTON et al, 1998; KOOLHAAS et al, 1997; KUDRYAVTSEVA et al, 1991).

116

Achados Neuropatolgicos A maioria dos estudos sobre a Doena Prion enfoca as alteraes neuropatolgicas que ocorrem nos estgios finais. No entanto, de suma importncia investigar tais modificaes nas fases iniciais da Doena, identificando as regies cerebrais mais afetadas e avanando no entendimento dos componentes celulares e moleculares envolvidos. Essa investigao vem sendo feita na variedade C57BL6J (CUNNINGHAM et al, 2001, 2002, 2003, 2005) e, mais recentemente, na variedade Sua albina (BORNER, 2009). A microgliose e a astrocitose no camundongo so os primeiros sinais que caracterizam o quadro neuropatolgico da Doena Prion; a vacuolizao consiste no terceiro sinal, aparecendo mais tardiamente com tais alteraes ocorreendo, preferencialmente, no sistema lmbico (BORNER, 2009). As alteraes neuropatolgicas da Doena Prion diferem, quanto ao tempo de aparecimento e s reas mais atingidas, nas espcies C57 e Sua albina: na primeira, so mais precoces (12 semana PI) e em maior proporo em CA1, no tlamo e no septum; enquanto que na segunda variedade, so mais tardias (15 semana PI) e as regies mais afetadas, nos estgios iniciais, so o septum, a camada polimrfica do giro denteado e o tlamo. Esses achados definem um perodo de incubao mais longo para a Doena Prion induzida pelo agente ME7 na variedade Sua albina. No C57, as primeiras alteraes quanto ativao microglial e reduo nas redes perineuronais (dendrticas e somticas) so observadas na 8 semana ps-inoculao. A partir de ento (na 12, 16 e 20 semana PI) essas modificaes hipocampais tornam-se progressivamente mais intensas, aparecendo prejuzos na plasticidade sinptica, presena de placas amilides e marcao difusa da neurpila para protena PrP SC em diversas regies: Cornos de Amon, giro denteado, subculum e crtex entorrinal (FRANKLIN et al, 2008).

117

Em nossos achados, observamos que 17 semanas aps a inoculao com o agente ME7, houve reduo no nmero de redes perineuronais e aumento da microgliose. Isso est de acordo com os resultados de BORNER (2009) que encontrou essas alteraes a partir da 15 semana PI, nas regies de CA1, septum e giro denteado (camada polimrfica). No observamos diferena entre os grupos ME7-GR e ME7-IS no presente trabalho. A comparao percentual das estimativas do nmero de redes perineuronais da regio de CA1 do sujeitos ME7 demonstrou maior queda do nmero de redes do que a regio septal. Sabe-se que o agente ME7 provoca no C57Bl6J reduo severa do nmero de sinapses em CA1 mais precocemente do que em outros modelos murinos da Doena Prion (CUNNINGHAM et al, 2003b). Como a integridade das redes perineuronais essencial para a ocorrncia dos potenciais de longa durao hipocampais, a degradao dessas redes pode contribuir diretamente para alteraes da plasticidade sinptica. No entanto essas alteraes da plasticidade sinptica continuam por ser investigadas na variedade albina Sua. Como a quantificao dos achados neuropatolgicos na variedade C57Bl6J no empregou mtodos estereolgicos, difcil comparar os resultados daquela variedade com a do presente trabalho. Alternativamente, se os achados quantitativos na variedade C57Bl6J estiverem corretos, possvel que no camundongo Suo albino haja um ou mais eventos neuropatolgico iniciais promovendo a maior degradao proporcional das redes em CA1 quando comparadas com a degradao septal. A microgliose um evento bastante citado em reas cerebrais afetadas por processos neurodegenerativos e disfunes a eles associadas, representando um indicador sensvel da ocorrncia subseqente de morte neuronal e modificaes homeostticas (CUNNINGHAM, 2005; KREUTZBERG, 1996; et al, 2002). Nos estgios iniciais da Doena Prion, os fentipos mais presentes so microglias ramificadas e em basto, enquanto que, na fase terminal, o fentipo amebide, tpico dos fagcitos, parece ser mais freqente e geralmente co-existe com

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outros fentipos menos alterados (WIERZBA-BOBROWICZ et al., 2002). possvel tambm identificar outras formas microgliais que parecem no se enquadrar claramente em nenhum desses fentipos, coexistindo nas diferentes janelas temporais e sugerindo a ocorrncia de um contnuo morfolgico entre os tipos bem definidos (BORNER, 2009). BORNER (2009) relata intensa microgliose a partir da 15 semana PI, a qual aumenta na 18 semana PI e mais expressiva no septum. Em nossos experimentos, o septum tambm foi a regio mais afetada no grupo ME7-GR. A intensa microgliose encontrada no septum parece indicar que essa regio uma das primeiras afetadas pela Doena Prion, tanto no C57 (CUNNINGHAM et al, 2003) quanto na variedade Sua albina (BORNER, 2009). Sabe-se que conectando o septum ao hipocampo, h uma via celular colinrgica, cuja disfuno parece estar envolvida com prejuzos cognitivos e distrbios do humor (DAVIES e MALONEY, 1976), alm de hiperatividade locomotora no Campo Aberto (LEAVITT et al, 1994). Apesar da possibilidade de alteraes comportamentais iniciais da Doena Prion estarem relacionadas a danos na via septohipocampal (CUNNINGHAM, 2005) no h estudos sobre morte neuronal septal no C57 assim como no h indcios dessa degenerao na variedade Sua albina, 18 semanas aps a inoculao com o agente ME7 (BORNER, 2009). possvel que essa degenerao neuronal seja mais tardia, assim como aquela observada no hipocampo (CA1), a partir da 19 semana na variedade C57Bl6J (Cunningham et al., 2003). No entanto, no condio necessria para que se instalem alteraes comportamentais a presena de morte neuronal sendo suficiente o estabelecimento de disfunes sinpticas para que isso ocorra (CUNNIGHAM et al., 2003). A relao entre ativao microglial e morte neuronal talmica durante a progresso da Doena se restringe a ensaios qualitativos. Em funo da diversidade funcional do tlamo, provvel que seu comprometimento ocasione dficits sensoriais especficos (s custas dos ncleos ventrais posteriores) motores (ncleos ventrais anteriores e laterais), levando

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parestesias, dor, dormncia, tremor e ataxia, comumente relatadas na doena humana (MACLEOD et al., 2002). De fato, o aspecto qualitativo da regio talmica dos nossos animais dos grupos ME7 sugere intensa ativao microglial. Estudos posteriores sobre as possveis alteraes talmicas induzidas pela Doena Prion seriam de grande relevncia no entendimento da neuropatologia. Ensaios preliminares a partir de correlaes quantitativas entre as alteraes da matriz extracelular e a microgliose, sugerem que o isolamento altera a relao entre esses dois elementos mudando a curva de regresso do formato geomtrico (animais em grupo) para regresso linear (animais isolados). No se sabe entretanto como essas variveis iro se comportar ao longo da progresso da doena. A correlao estereolgica sem vis entre a queda no nmero de redes perineuronais e o aumento de ativao microglial um instrumento til para o entendimento dos mecanismos neurotxicos subjacentes Doena Prion (BLOCK et al, 2007). importante frisar que o Mal de Alzheimer uma das primeiras doenas neurodegenerativas a ser associada com os efeitos txicos da ativao microglial (BLOCK et al, 2007; XIANG et al, 2006; YANKNER, 1989). De fato, a superativao microglial um evento patolgico que precede a destruio da neurpila em pacientes com a doena de Alzheimer (CAGNIN et al, 2001), inclusive sendo possvel a identificao de placas beta-amilides antes mesmo do aparecimento dos sintomas (MCGEER et al., 1987). Por fim, apesar de numerosos experimentos sobre alteraes comportamentais, poucos estudos mostram modificaes bioqumicas provocadas pelo isolamento social e no h pesquisas que empreguem o mtodo estereolgico sobre possveis alteraes cerebrais induzidas por este modelo de estresse. Assim, no temos dados previamente publicados que permitam comparar nossos achados neuropatolgicos. Nesse sentido o presente trabalho inaugura uma nova linha de investigao no mbito da quantificao das alteraes neuropatolgicas na doena prion.

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Sabe-se que o isolamento social reduz os nveis de Fator Neurotrfico Cerebral (BDNF) no hipocampo, substncia que protege os neurnios dos efeitos prejudiciais do estresse e parece estar envolvida na neurognese hipocampal (ROCERI et al, 2004). H outros fatores neurotrficos alterados pelo estresse, como o Fator de Crescimento Vascular (VGF), Fator de Crescimento Neural (NGF) e Neurotrofina 3 (NT-3) (DUMAN e MONTEGGIA, 2006). Alm da queda desses fatores importantes para a sobrevivncia neuronal e o funcionamento global do SNC, o estresse aumenta a liberao de inmeras citocinas prinflamatrias, conforme discutido na introduo deste trabalho. No entanto, os resultados relatados quanto a estas alteraes cerebrais divergem bastante de acordo com o tipo de modelo de estresse, o tempo de exposio ao estressor; a prpria aplicao de testes que, por si s, j aversiva, alm de outras condies patolgicas associadas (DUMAN e MONTEGGIA, 2006; CAMPBELL e MACQUEEN, 2004). Nossos achados comportamentais demonstram, de forma clara, que o modelo de isolamento social interferiu significativamente no comportamento dos sujeitos, tanto na 3 semana de isolamento quanto na 17 ps-inoculao quando o agente ME7 soma seus efeitos aos impostos pelo isolamento. Tomados em conjunto os dados revelam que as alteraes comportamentais iniciais da Doena Prion manifestam-se mais precocemente nos camundongos isolados. Permanece por ser investigado se as alteraes neuropatolgicas tambm no se manifestam mais precocemente dado que no estudo de BORNER (2009), os sujeitos inoculados com ME7 e mantidos em grupo as revelaram em mdia na 15 semana psinoculao. Nos achados comportamentais, os sujeitos isolados se distinguiram por revelar sintomas mais precocemente do que os camundongos agrupados ainda que no se tenham encontrado diferenas quantitativas nos achados neuropatolgicos. Uma interpretao simples

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e direta para esse fato seria que o aparecimento concorrente de alteraes neuropatolgicas se d em fase mais precoce nos animais isolados, hiptese essa que permanece em aberto. Outra alternativa seria a de que o hipocampo ventral, seria de forma seletiva mais alterado do que o hipocampo dorsal hiptese a ser confirmada por quantificaes

neuropatolgicas regionais fora do escopo do presente trabalho. Essa hiptese seria coerente com o fato de que hipocampo ventral est mais relacionado a desordens do humor que o dorsal (CAMPBELL E MACQUEEN, 2004). Seria interessante igualmente investigar a neurognese hipocampal regional nos animais isolados, a partir de anlises estereolgicas sem vis. Uma outra alternativa seria a de que as regies de CA1 e do septum poderiam no ser as mais afetadas pelo isolamento social abrindo a possibilidade de investigarmos seletivamente os ncleos talmicos alterados previamente descritos tanto na variedade C57BlJ e Sua albina. Achamos relevante ento, a investigao da regio talmica, pela intensa microgliose sugerida pela anlise qualitativa, assim como do giro denteado, por ter revelado maior comprometimento do que a regio de CA1 (BORNER, 2009, CUNNIGHAM, 2005).

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CONSIDERAES TCNICAS

Os Limites das Anlises Quantitativas pelo Fracionador ptico.

Em nosso trabalho utilizamos a investigao estereolgica sem vis para estimarmos as alteraes neuropatolgicas influenciadas pela Doena Prion. Apesar das inmeras vantagens desse mtodo, discutidas na Introduo deste trabalho, os resultados das anlise estereolgicas so apenas uma estimativa aproximada do nmero real de um dado objeto de interesse (CRUZ-ORIVE, 1994; SCHMITZ, 1998). Ainda assim, tais estimativas so muito mais confiveis, estatisticamente, e bem menos dispendiosas para o pesquisador do que as estimativas realizadas a partir da anlise de densidade e volume (SCHMITZ e HOF, 2000). Como o Coeficiente de Erro de Scheaffer representa a variao devida incerteza metodolgica intrnseca, prefervel que sua contribuio para a variao total seja a mnima possvel (CE 2/CV2<0.5). Em geral, a relao CE2 /CV2 manteve-se abaixo de 0.5, minimizando a probabilidade de erros procedimentais durante as contagens. Nas excees observadas, em particular, a regra geral no til para avaliar erros metodolgicos intrnsecos ao sistema de amostragem, j que o coeficiente de variao biolgica e o coeficiente de erro so muito pequenos, perdendo o sentido aplicar a regra geral (SLOMIANKA e WEST, 2005). A outra maneira que se empregou para se avaliar os erros relacionados escolha da matriz amostral foi o clculo da variao biolgica, expresso em valor percentual do coeficiente de variao. Considera-se que o coeficiente de erro adequado sempre que ele contribui menos do que a variao biolgica para o coeficiente global de variao. Em geral, a relao previamente descrita (CE2/CV2<0.05) acompanha esse parmetro, havendo igualmente excees que confirmam a regra.

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Para evitar ambigidades e reduzir a possibilidade de inserir vises amostrais nas regies e objetos de interesse, adotamos tcnicas de marcao especficas e contracolorao com Nissl, alm de estimativas independentes (sem conhecimento prvio do grupo experimental ao qual o animal pertencia) em vrios ensaios estereolgicos, aumentando a confiabilidade dos dados analisados.

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VI. CONCLUSES

O presente trabalho, a partir do estudo das alteraes comportamentais e neuropatolgicas induzidas pela Doena Prion, comparou camundongos da variedade Sua albina, mantidos em grupo ou isolados, e posteriormente inoculados com ME7. Nossos achados nos levaram as seguintes concluses, at ento no descritas na literatura: As alteraes comportamentais iniciais tpicas da Doena Prion (queda no burrowing, hiperatividade no Campo Aberto, maior tempo no Brao Aberto do LCE) ocorreram, pelo menos, uma semana antes nos sujeitos ME7-Isolados. O consumo de glicose reduzido na Doena Prion na 17 semana PI, tanto nos sujeitos em grupo quanto nos isolados. A temperatura anal dos sujeitos isolados mais elevada que a dos sujeitos em grupo. Essa medida no foi afetada, at a 17 semana PI, pela Doena Prion. Na 17 semana PI, no h alterao do comportamento no LCE, nos sujeitos do grupo ME7-GR; tampouco, h alterao nos comportamentos relacionados ao grooming e no peso corporal. Tomados em conjunto, os testes comportamentais revelam uma somao dos efeitos do isolamento social aos efeitos da Doena Prion, conduzindo os sujeitos ME7 -Isolados a apresentarem alteraes comportamentais mais precocemente do que os ME7 em grupo. O isolamento social induziu comportamentos mais relacionados ansiedade at a 16 semana PI e a partir da 17 o comportamento dos animais isolados parece estar se aproximando do espectro compatvel com depresso. O isolamento social no alterou o nmero de redes perineuronais e de microglias ativadas em relao aos sujeitos com ME7 mantidos em grupo, na 17 semana PI.

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VIII. ANEXO

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