Universit de la Mditerrane Facult des Sciences de Luminy DEUG Sciences de la Vie

Anne Universitaire 2003-2004

Module " Transformations dnergie : Optique & Microscopie" Premire session (Janvier 2004) Dure de lpreuve : 3 heures Pas de documents autoriss Question de cours Quel est le principe de la microscopie par fluorescence de type confocal ? Exercice On dsire prparer 10 l dune solution de fluorophores individuels sur une lamelle de 22 par 22 mm. On utilise un objectif x100 douverture numrique N.A. = 1.4, une source lumineuse de longueur donde = 514 nm, et la solution mre est 2 M. Quelle dilution doit-on employer pour quils soient spars dune distance suprieure la limite de rsolution ? (Rappel : selon le critre de Raileigh, dmin = 1.22 / 2.N.A.) Dans quel sens le calcul volue-t-il si lon tient compte dune possible agrgation des fluorophores ?

Corrig Cours : voir poly. Exercice : dmin = 1.22*514 / 2*1.4 = 224 nm. Nombre de fluorophores avant dilution : N = c x V x N a = 2 10-6 x 10-5 x 6 1023 = 1.2 1013 (Na : nombre dAvogadro) Nombre aprs dilution : N d = N / D, o D est la dilution recherche. Si les fluorophores sont rpartis de faon homogne sur la lamelle, alors S = Nd x d2 = N x d2 /D = 222 = 484 mm2 , avec d : distance moyenne entre fluorophores d > dmin si et seulement si D > Dmin , Soit Dmin = N x dmin 2 / S = [1.2 1013 x (224 10-9 )2 ] / 484 10-6 1240 Pour une dilution suprieure ou gale 1240, les fluorophores seront en moyenne loigns dune distance suprieure la limite de rsolution ; ils pourront donc tre observs au microscope de faon individuelle. Si les fluorophores sont en parti agrgs, leur nombre apparent diminue, et la distance moyenne les sparant augmente. On pourra donc conserver une rpartition correspondant la distance critique de la limite de rsolution avec des dilutions moindres (D < Dmin ) : il y aura dans ce cas un nombre plus important de fluorophores sur la lamelle, mais certains seront regroups au sein dagrgats.