UNIVERSIDADALASPERUANAS

FacultaddeMedicinaHumanayCienciasdelaSalud EscuelaAcadmicoProfesionaldeTecnologaMdica readeLaboratorioClnicoyAnatomaPatolgica TEMA:

CROMATOGRAFA
DOCENTE: Lic.ClovisAguinaga INTEGRANTES: CrdovaRamrez,CarmenVioletaCd:2010211199 VicuaUbillus,JanetDelPilarCd:2010211192 ASIGNATURA:QUMICA

AodelCentenariodeMachuPicchuparael Mundo
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INTRODUCCION

El presente trabajo trata sobre definiciones, tipos y trminos en cromatografa, mtodo muy utilizado en separacin de un analito o varios analitos que contienen en una muestra. Este mtodo es muy empleado para identificar o cuantificar analitos muy empleado en la industria farmacutica, industria alimentaria, cosmtica, en investigacin de medicina forense, entre otros..

Ningn otro mtodo de separacin es tan potente y de aplicacin tan general como la cromatografa.

CROMATOGRAFIA

1.-DEFINICION

El termino cromatografa deriva del griego cromo = color, grafico = escrito. Descubiertas por el botnico MICHEL TSWETT quien separo pigmentos de planta en columnas de oxido de calcio. Segn define la IUPAC, la cromatografa es un mtodo, usado primariamente para la separacin de los componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, (fase estacionaria) mientras la otra se mueve (fase mvil), ver figura 1.

ESQUEMA CROMATOGRAFICO

Fig. 1

1.1 OBJETIVO DE LA CROMATOGRAFIA.- El objetivo principal de un estudio cromatografa es lograr la separacin de todos los componentes en una muestra, para ello es necesario jugar con una serie de factores cromatograficos, es por ello que es necesario conocer como estn relacionados los diferentes factores experimentales con las ecuaciones cromatograficas.

1.2.- MODALIDADES DE CROMATOGRAFIA. A pesar de evitar las definiciones, es claro que las clasificaciones permiten un estudio mas ordenado de tpicos. As, clasificamos las modalidades cromatograficas en funcin de varios parmetros. -La naturaleza de la fase mvil.- Si la fase mvil es un gas la modalidad cromatografica se denomina gaseosa (GC) y si es un liquido, cromatografa liquida (LC) a este ultimo grupo pertenecen la cromatografa en capa delgada (TLC) la cromatografa liquida en columna abierta, y la cromatografa liquida de alta performance (HPLC vase fig. 4), cromatografa en papel. A pesar de las diferencias entre las distintas modalidades, los principios que gobiernan la separacin son los mismos en todos los casos. La cromatografa gaseosa se emplea para separar mezclas que contienen compuestos orgnicos voltiles pero suele presentar grandes dificultades si las sustancias analizar no son voltiles, si descomponen a altas temperaturas o poseen alto peso molecular. Se ha estimado que solo un 20% de las sustancias orgnicas conocidas pueden separarse por GC sin tratamiento previo. La diferencia fundamental entre HPLC y GC se encuentra en el tipo de detectores y en la influencia de la fase mvil. En GC es muy simple encontrar detectores que diferencien la muestra de la fase mvil (un gas inerte) esto no es tan simple en HPLC, ya que la fase
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mvil no solo no es inerte si no que en su masa en sensiblemente superior. Por ese motivo cualquier dispositivo que mida una propiedad fsica del soluto (conductividad trmica, ionizacin en una llama, captura de electrones) es apropiado como detector de GC pero resulta de difcil aplicacin en HPLC (aunque llegaron a comercializarse algunos dispositivos de ionizacin de llama, aparentemente con poco xito) . En HPLC es necesario encontrar dispositivos que diferencien el soluto en solucin de la fase mvil. Los mas difundidos son los detectores UV y en menor proporcin los de fluorescencia, el de ndice de refraccin y el electroqumico. La otra diferencia fundamental entre la GC y la HPLC se refiere ala influencia de la fase mvil en la separacin. En la GC la fase mvil es un simple carrier (transportador) del soluto y prcticamente o influye en la separacin. El tipo de gas a utilizar se selecciona nicamente en funcin del detector a emplear. Por el contrario en HPLC la fase mvil es el parmetro fundamental que gobierna la separacin en consecuencia en GC se necesitan muchas columnas para abarcar el rango de separaciones posibles, mientras que en HPLC con una sola columna es posible separa sustancias polares, inicas, ionizables, y no polares simplemente modificando la composicin de la fase mvil. Si bien la resolucin puede ser mayor con los materiales actuales de HPLC, la eficiencia global es mayor en GC dado que la menor viscosidad d la fase mvil, un gas permite usar columnas mucho mas largas. Sin embrago la selectividad aportada por la amplia variedad de solventes aptos para ser empleadas como fase mvil en HPLC le otorga mucho mayor versatilidad. La mayor deuda de la HPLC con el analista es, tal ves, la existencia de un detector altamente sensible y universal.

-La naturaleza de la fase estacionaria.- Si la fase estacionaria es un slido y la fase mvil es un lquido la cromatografa se denomina cromatografa lquido - solida (LSC). Anlogamente existir una cromatografa liquida - liquida (LLC), gas liquido (GLC) y gas slido (GC).
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-El fenmeno que ocurre dentro de la columna.- As, la cromatografa puede clasificarse en modalidades de afinidad y por tamao molecular. Entre las primeras se encuentra la cromatografa en fase normal, en fase ligada, y la de intercambio inico. Entre las segundas se encuentra la GPC y GFC. En las modalidades de afinidades el analito interacta directa o indirectamente, a travs del solvente, con la fase estacionaria, mientras que en las separaciones por tamao molecular no existen (al menos tericamente) ninguna interaccin con la fase estacionaria. -La cantidad de muestra aplicada.- Si la cromatografa seleccionada para una separacin no destruye la muestra (TLC, HPLC o columna abierta) es posible es posible recuperar el analito separado de su matriz ala salida de la columna. Aumentando la cantidad de muestra es posible obtener desde ug hasta kilogramos de una sustancia pura en una sola corrida. Evidentemente las escalas de trabajo son diferentes, pero las bases que gobiernan a la separacin son exactamente las mismas. As es posible definir la cromatografa analtica en el rango de pg. hasta ug. un rango semipreparativo que abarca desde los ug hasta los gramos y un rango preparativo, que comprende las separaciones de analitos mayores que el gramo.

2.- CLASIFICACION DE LAS TECNICAS CROMATOGRAFICAS

2.1.-LA CROMATOGRAFIA EN PAPEL. Es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar anlisis cualitativos ya que pese a no ser una tcnica muy potente no requiere de ningn tipo de equipamiento. La fase estacionaria est constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeas gotas de la solucin y evaporando el disolvente. Luego
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el disolvente empleado como fase mvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase mvil en el fondo. Despus de unos minutos cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se vern las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografa eficaz: la eleccin del disolvente y la del papel de filtro. Dentro de la cromatografa en papel tenemos: - La Cromatografa en papel descendente.- En done la fase mvil fluye hacia abajo en la hoja cromatografica. El equipo esencial para este tipo de cromatografa comprende de lo siguiente: Una cmara hermtica al vapor provista de entradas para agregar el disolvente o para liberar la presin interna. Preferentemente, la cmara se construye de vidrio, acero inoxidable o porcelana y esta diseada de manera que se pueda observar el progreso de la corrida cromatografica sin abrir la cmara. -La cromatografa en papel ascendente.- El borde inferior de la hoja (o tira) se sumerge en la fase mvil para permitir que la fase mvil ascienda en la hoja cromatografica por capilaridad. El equipo esencial es el mismo que en la cromatografa descendente.

2.2.- CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC). La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme, de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. Los requisitos son un absorbente, placas, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensin, otro para aplicar la capa de absorbente, y una cmara (cuba) en la que se desarrollen las placas cubiertas.

La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares.
Cromatografa capa fina

Fase Mvil
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2.3.- CROMATOGRAFIA EN COLUMNA. Se emplea para la separacin de mezclas o purificacin de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de slice o almina dentro de una columna. La eleccin del disolvente es crucial para una buena separacin. Dicho disolvente pasa a travs de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicacin de presin (cromatografa flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de sta un poco de algodn o lana de vidrio, para evitar que la silica o la almina queden retenidas en la columna y que el disolvente se enrasa hasta el nivel del soporte. A continuacin se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogindose por lo general en tubos de ensayo. Una columna de cromatografa es un tubo de vidrio relleno con una sustancia slida de propiedades adsorbentes constituida por pequeas partculas: gel de slice y almina son las ms usadas, vase fig.3. Este relleno es lo que se conoce en cromatografa como la fase estacionaria. A travs de la columna se har pasar una corriente de un disolvente o mezcla de disolventes denominada eluyente y/o fase mvil. La mezcla de compuestos a separar se disuelve en una pequea cantidad de disolvente y se coloca sobre el adsorbente, en la parte superior de la columna, quedando adsorbida por el mismo. A continuacin se pasa un flujo de eluyente a travs de la columna. Los compuestos constituyentes de la mezcla son arrastrados por el eluyente a su paso, hacindoles avanzar a lo largo de la columna. Sin embargo, no todos los compuestos avanzan a la misma velocidad, y esta es precisamente la clave de la cromatografa. Algunos compuestos se ven ms fuertemente retenidos por el adsorbente (fase estacionaria) y por lo tanto avanzarn ms despacio. Por el contrario, otros apenas son retenidos y avanzarn a mayor velocidad.
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CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

2.4.-CROMATOGRAFIA DE GASES (CG). La Fase Mvil es un Gas (llamado Gas Portador o Acarreador) y la Fase Estacionaria puede ser un slido (Cromatografa Gas-Slido) o una Pelcula de lquido de alto punto de ebullicin (Generalmente Polietiln-Glicol o Silicn) recubriendo un slido inerte (Cromatografa Gas-Lquido). Diagrama de un Cromatgrafo de Gases(CG). Los compuestos que se pueden separar por cromatografa de gases deben ser Voltiles y Trmicamente Estables. Ilustracin en donde se visualizan los tipos de Cromatografa ms comunes.

Cromatografa de gases (Gas-Lquido Distribucin de un componente entre una fase mvil gaseosa y una lquida inmovilizado sobre la superficie de un slido inerte. Componentes bsicos - Gas portador segn detector (He, Ar, N2, CO2, H2)

- Sistema de inyeccin de muestra - Columnas

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2.5.-CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA PRESION (HPLC). A veces llamada Cromatografa de lquidos de alta resolucin, es una tcnica de separacin basada en una fase estacionaria slida y una fase mvil liquida. Las separaciones se logran por procesos de particin. Adsorcin o intercambio inico, segn el tipo de fase estacionaria empleada. El HPLC tiene ventajas distintivas sobre la cromatografa de gases para el anlisis de compuestos orgnicos. Los compuestos se van a analizar se disuelven en un disolvente adecuado y la mayora de las separaciones tienen lugar a una temperatura ambiente. Entre ellas tenemos:

- Cromatografa Liquido Liquido (LLC) o de particin. En esta modalidad, las molculas de soluto se distribuyen entre dos lquidos: uno es en fase mvil, y el otro en fase estacionaria, que se encuentra homogneamente dispersa en un soporte slido, finamente dividido. El desarrollo de este mtodo le vali a Martn y Singe la obtencin del premio Nbel de qumica de 1952. Sin embargo, varios, inconveniente, especialmente derivados del tipo de fijacin de la fase estacionaria al soporte (meramente mecnica) se sumaron para que este mtodo haya sido totalmente desplazado. Estos inconvenientes se deba la necesidad de pre saturar la fase mvil con fase estacionaria, la necesidad de disolver la muestra en fase mvil saturado con fase estacionaria, la imposibilidad de efectuar gradientes de elucin, de programar caudales o temperatura para evitar el desprendimiento de fase estacionaria, etc. De todos modos las columnas distaban mucho de ser estables y los resultados reproducibles al nivel que hoy se pretende. - Cromatografa de Fase Ligada (BPC). Las virtudes de la LLC eran claras, tanto como sus limitaciones. Por ello resulta tambin razonable pensar que reemplazando el tipo de unin de la fase estacionaria a su soporte hacindola perdurable por medio de una unin qumica covalente, el xito del material
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estara asegurado. As, prcticamente el 90% de las separaciones cromatograficas modernas se efectan sobre material qumicamente modificado, el cual permite optar segn el reactivo empleado para su fabricacin, entre materiales altamente hidrofbicos o altamente hidrofilicos, con un amplio rango de polaridad y de selectividad: octadecilo, octilo, hexilo, butilo, etilo, ciano, diol, fenilo, amino, nitro, amonio, amonio cuaternario, restos sulfnico, etc. -Cromatografa de Intercambio Inico (IEC). En este caso se emplean rellenos en los cuales la partcula esta constituido por un polmero o por silica gel, en cada caso unida a un grupo funcional anionico o cationico (tpicamente sulfnico para el intercambio de cationes amonio cuaternario para el intercambio de aniones). La seleccin del tipo grupo funcional permite escoger entre intercambiadores dbiles y fuertes.

-Cromatografa de Exclusin de Tamao (SEC). Esta modalidad emplea materiales de porosidad controlada que funcionan con un filtro o tamiz y clasifica las molculas de la muestra segn un orden decreciente de tamao molecular (las molculas mas grandes son la s primeras en eluir, y las pequeas son las ultimas). Si se dispone de estndares apropiados, de peso molecular adecuado (protenas para el anlisis de protenas, dextrano para el ensayo de dextranos, etc.), puede evaluarse el peso molecular de un compuesto desconocido, o bien la distribucin de pesos moleculares de un polmero sinttico.

GLOSARIO
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Fase estacionaria.- Puede ser un slido un lquido retenido sobre un slido o un gel. La fase estacionaria puede estar extendida como una capa o distribuida como una pelcula, etc. Fase mvil.- Puede ser liquida o gaseosa. Es el medio q va a transportar sobre la fase estacionaria los analitos. Analito.- Es la substancia que se va a separar durante la cromatografa. Cromatografa analtica.- Se emplea para determinar la existencia y posiblemente tambin la concentracin de un analito en una muestra. Fase enlazada.- Es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partculas de soporte o a las paredes internas de la columna. Cromatograma.- Es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso de separacin ptima, los diferentes picos o manchas del Cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada.

En el eje X se representa el tiempo de retencin, y en el eje Y una seal (obtenida, por ejemplo, a partir de un espectrofotmetro, un espectrmetro de masas o cualquier otro de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos existentes en la muestra. En el caso de un sistema ptimo, la seal es proporcional a la concentracin del analito especfico separado.

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Cromatgrafo.- Es el equipo que permite una separacin sofisticada. Por ejemplo, un cromatgrafo de gases o un cromatgrafo de lquidos. Tiempo de retencin.- Es el tiempo caracterstico que tarda un analito particular en pasar a travs del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo las condiciones fijadas. Muestra.- Es la materia que va a ser analizada en la cromatografa. Puede consistir en un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla es tratada en el curso del anlisis, la fase o fases que contienen los analitos de inters es llamada igualmente muestra mientras el resto de sustancias cuya separacin no resulta de inters es llamado residuo. Soluto. Es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado. Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra, y especialmente la fase lquida mvil en cromatografa de lquidos.

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BIBLIOGRAFIA

-Introduccin al HPLC Aplicacin y Prctica: Oscar Alberto Quattrocchi.

-Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica. USP Edicin 33

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INDICE Introduccin pg. 1, Cromatografa 1.-Definicin..pg. 2 1.1 Objetivos de la cromatografa.pg. 3 1.2 Modalidades de la cromatografa. -La naturaleza de la fase mvil -La naturaleza de la fase estacionaria pg. 4 -El fenmeno que ocurre dentro de la columna.pg. 5 -Cantidad de muestra aplicada 2.-Clasificacin de las tcnicas cromatograficas 2.1 Cromatografa en papel -Cromatografa en papel descendente.pg. 6 -Cromatografa en papel ascendente 2.2 Cromatografa en capa fina......pg. 7 2.3 Cromatografa en columna...pg. 8 2.4 Cromatografa de gases...pg. 10 2.5 Cromatografa de lquidos de alta presin HPLC.pg. 11 - Cromatografa de liquido lquido (LLC) - Cromatografa fase ligada (BPC) -Cromatografa de intercambio inico...pg. 12 -Cromatografa de exclusin de tamao (SEC) Glosario..pg. 13

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Bibliografa..pg. 15 ndice...pg.16.

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