Actividad uresica en productos de soja.

Propuesta de un nuevo mtodo

M.C. Olguin, M.I. Zingale, G.C. Revelant, M.E. Vignale Facultad de Ciencias Bioqumicas y Farmacuticas. U.N.R. Suipacha - Argentina. RESUMEN Actividad uresica en productos de soja. Propuesta de un nuevo mtodo La evaluacin de la actividad uresica residual en productos de soja es habitualmente empleada como indicador de la eficacia del tratamiento de inhibicin practicado. El propsito de este trabajo consisti en realizar una comparacin entre el mtodo propuesto por la AACC (22-90), basado en medir diferencias de pH y una tcnica en la que se mide la actividad uresica por su accin hidroltica de la urea y posterior dosaje del amonio producido mediante la reaccin de Berthelot. Se utilizaron los dos mtodos para procesar 20 muestras de harina de porotos de soja sin tratar y con diferentes tratamientos trmicos de inactivacin. El nuevo mtodo correlaciona satisfactoriamente con el de la AACC, r = 0,9416, (p < 0.0001), asimismo, presenta mayor especificidad ya que mide la concentracin del producto de la reaccin y ofrece una respuesta ms amplificada que el incremento de pH. Palabras clave: Harinas de soja, antinutrientes, actividad uresica.

5. ANTIMETABOLITOS Y TOXINAS EN ALIMENTOS

El valor nutricional de un alimento depende en gran medida de la calidad de los ingredientes utilizados, la cual se mide en funcin de su capacidad de promover el crecimiento y mantener en buen estado a los organismos. En este sentido, el origen y/o el tratamiento previo a que se someten los materiales influir sobre su calidad, en funcin de la disponibilidad de nutrientes para usarse en las funciones metablicas del animal, o tambin, el contenido de factores txicos endgenos caractersticos de cada material, particularmente aquellos de origen vegetal, que funcionan como antinutrientes afectando negativamente al organismo. En este sentido, existen varias tcnicas que permiten conocer la disponibilidad de un nutriente determinado, principalmente aminocidos, as como tambin, determinar el contenido de sustancias txicas a fin de eliminarlas o desechar el material. En este documento se incluyen los mtodos para anlisis de los antinutrientes ms comunes encontrados en las protenas vegetales.

5.1. Mtodo Rpido Potenciomtrico para Medir Actividad Uresica en Harina de Soya
Este mtodo determina la ureasa residual en harina de soya y sus derivados de acuerdo al mtodo Caskey-Knapp (1944) modificado por AACC (1969) y Qum. Leticia Comar (Nutrimentos del Sureste, Mrida, Yucatn, Mxico). El resultado esta dado en unidades de pH proporcionales a la actividad uresica. Los valores aceptables oscilan entre 0.05 y 0.5; valores menores indican sobrecocimiento y mayores falta de cocimiento. Reactivos

Solucin bufer de fosfatos 0.05M. Disuelva 3.403g de fosfato de potasio monobsico g.r. (KH2PO4) en 100ml de agua destilada recin hervida. Disuelva 4.355g de fosfato de potasio dibsico g.r. (K2HPO4) en 100ml de agua destilada. Combine ambas soluciones, adicione 10ml de indicador rojo de fenol al 0.1% y afore a 1000ml con agua destilada. Ajuste el pH a 7.0 con un cido o base fuerte antes de usarse. En refrigeracin tiene una vida til de 90 das. Solucin bufer de urea. Disuelva 15g de urea g.r. en 500ml de sol. bufer de fosfatos. Ajuste el pH a 7.0 como en el caso anterior. Indicador rojo de fenol al 0.1%. Disuelva 0.1g de rojo fenol en 15ml de sol. de hidrxido de sodio 0.02N y afore a 100ml.

Materiales y Equipo

Bao mara con agitacin, precisin 0.5C. Medidor de pH con electrodo de vidrio y calomel adecuado para medir muestras de 5ml, precisin de 0.02 unidades de pH y compensacin de temperatura. Tubos de ensaye, 20 150mm con tapn de hule Vasos de precipitado de 10ml

Procedimiento 1. Pese 0.2g de harina de soya finamente molida (sin sobrecalentar) por duplicado y colocar en tubos de ensaye (A y B); adicione al tubo A 10ml de la solucin bufer de urea. Tape, agite e incube en bao mara por 30 min a 30 0.5C. 2. Despus de 5 min, adicione al tubo B 10ml de sol. bufer de fosfatos, tape, agite y coloque en el bao mara. 3. Agitar cada uno de los tubos cada 5 minutos (seis agitaciones en 30 min). 4. Retire el tubo A del bao mara, decante el sobrenadante en un vaso de pp de 10ml y mida el pH dentro de un perodo menor a 3 min. Repita el procedimiento con el tubo B 5 minutos despus del A. 5. Calcule el ndice de actividad uresica como unidades de pH resultantes de la diferencia de las lecturas del tubo A menos el tubo B y determine la calidad de la muestra segn la tabla de ejemplo incluida: IAU= pH tubo A (muestra + bufer urea) - pH tubo B (muestra + bufer fosfatos)
Grado de cocimiento Cruda Subcocida Cocido adecuado Cocido adecuado Sobrecocida Unidades de pH 1.9 0.80 0.30 0.08 0.03 pH tubo A 8.80 7.60 7.10 6.98 6.93 pH tubo B 6.90 6.80 6.80 6.90 6.90 Color Rojo Rosa Rosa Rosa tenue Ambar

FIGURA 24 Determinacin de actividad uresica en harina de soya y sus derivados.

5.2. Gosipol Libre en Harina de Semilla de Algodn

Este antinutriente es caracterstico de la harina de algodn, siendo necesario determinar su contenido debido a sus efectos adversos sobre los organismos alimentados con la semilla, aun cuando los peces aparentemente resisten mayores concentraciones del alcaloide debido al elevado contenido proteico de su dieta. En este documento se describen dos mtodos, el primero para harinas normales y el segundo para harinas que han sido tratadas qumicamente y contienen dianilinogosipol.

Reactivos:

Acetona acuosa, 7 partes de acetona en 3 partes de agua destilada (v/v). Solucin de Acetona acuosa - Anilina. En 700 ml de acetona y 300 ml de agua, adicione 0.5ml de anilina purificada. Prepare diariamente. Solucin acuosa de alcohol isoproplico, 8 partes de alcohol isoproplico + 2 partes de agua destilada (v/v). Anilina purificada. Destile anilina grado reactivo sobre una pequea cantidad de polvo de zinc, descartando el primero y ltimo 10% del destilado. Almacene refrigerada en un frasco mbar de vidrio. Estable por varios meses. Solucin estndar de Gosipol: a. Disuelva 25 mg de gosipol puro en acetona libre de anilina y transfiera a un matraz aforado de 250 ml, usando 100 ml de acetona. Adicione 75 ml de agua destilada, afore con acetona y mezcle. b. Tome 50 ml de la solucin (a), adicione 100 ml de acetona pura, 60 ml de agua destilada, mezcle y diluya a 250 ml con acetona pura. La solucin (b) contiene 0.02 mg de gosipol/ml y es estable por 24 h en oscuridad.

Materiales y Equipo

Agitador mecnico. Espectrofotmetro Matraces erlenmayer de 250 ml Matraces Volumtricos de 25 y 250 ml Bao mara

Procedimiento Muela la muestra para que pase la malla de 1 mm, cuidando de no sobrecalentarla. Tome aproximadamente 1 g de la muestra y agrguele 25 ml de acetona pura. Agite por unos minutos, filtre y divida el filtrado en dos. A una porcin, adicinele una lenteja de Hidrxido de Sodio y caliente en bao mara por unos minutos. Un extracto ligeramente amarillo que no cambia de color con el Hidrxido indica que la harina no ha sido tratada, proceda con el mtodo 1. Si se obtiene un color rojo-anaranjado profundo, indica la presencia de dianilinogosispol y requiere del mtodo 2. Mtodo 1 Pese 0.51 g de muestra, dependiendo de la cantidad de gosipol esperada, en un matraz erlenmayer y adicione 2 3 perlas de vidrio. Agregue 50 ml de solucin de acetona acuosa, tape el matraz y agite por una hora. Filtre, deseche los primeros mililitros de filtrado y luego tome dos alcuotas iguales (210 ml, dependiendo del contenido de gosipol esperado) y pselas a matraces volumtricos de 25 ml. Diluya una de las alcuotas, afore a volumen con alcohol isoproplico acuoso (solucin a), mientras la otra alcuota (solucin b). Adicinele 2 ml de anilina purificada, caliente en bao mara (90100C) por 30 min. junto con un blanco conteniendo 2 ml de anilina y un volumen de solucin acuosa de acetona igual a la alcuota. Retire la solucin b y el blanco, adicione suficiente alcohol isoproplico acuoso para efectuar solucin homognea, y enfra a temperatura ambiente en un bao con agua. Afore con alcohol isoproplico acuoso. Lea las muestras a una absorvancia de 400 nm en el espectrofotmetro. Ajuste el instrumento a 0 absorvancia con alcohol isoproplico acuoso y determine la

absorvancia de la solucin (a) y el blanco de reactivo. Si el blanco est abajo de 0.022 de absorvancia contine con el anlisis, de lo contrario repita el anlisis usando anilina recin destilada. Determine la absorvancia de la solucin (b) con el blanco de reactivo ajuste a 0 absorvancia. Calcule la absorvancia corregida de la alcuota: absorvancia de la solucin (b) menos absorvancia de la solucin (a). Determine los mg de gosipol libre presentes en la solucin de la muestra usando la curva de calibracin. Mtodo 2. Pese 1 g de muestra en un matraz erlenmayer, agregue 50 ml de acetona acuosa, agite y filtre como el anterior. Agregue alcuotas duplicadas del filtrado (de 2 a 5 ml, dependiendo de la cantidad esperada de gosipol libre) a matraces volumtricos de 25 ml. Afore una de las alcuotas (solucin a) con el alcohol isoproplico acuoso y djelo reposar 30 minutos antes de leerlo en el espectrofotmetro. Afore la otra alcuota (solucin b) como en el procedimiento (1), determine las absorvancias de las soluciones a y b como el procedimiento anterior y calcule el contenido aparente de gosipol de ambas soluciones usando la curva de calibracin. Preparacin de la Curva de Calibracin. Tome alcuotas duplicadas de 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 y 10 ml de estndar de gosipol 0.02 mg/ml y colquelas en matraces volumtricos de 25 ml. Diluya una serie (solucin A) aforando con alcohol isoproplico acuoso y determine la absorvancia como en el anterior. A la otra serie (solucin b) adicinele 2 ml de anilina purificada y proceda como anteriormente. Prepare un blanco de reactivos usando 2 ml de anilina y 10 ml de acetona acuosa, calentada junto con el estndar. Determine absorvancias como en el procedimiento (1) y calcule la densidad ptica corregida para cada solucin estndar: Absorvancia Corregida = (Abs. solucin b - Abs. solucin a) Trace la curva estndar, graficando absorvancia corregida contra concentracin de gosipol en 25 ml. Calule % de gosipol libre en harinas normales. Gosipol libre % = 5G/WV Donde: G= Lectura en la Grfica W= Peso de la muestra V= Volumen de la alcuota usada. Para harinas qumicamente tratadas. Gosipol libre % = 5(B - A)/WV Donde: A = mg Gosipol libre aparente en alcuota (a) B= mg Gosipol libre aparente en alcuota (b)

FIGURA 25 Determinacin de gosipol libre en harinas de semilla de algodn.

5.3. Determinacin de Tioglucsidos

El mtodo descrito proporciona el contenido aproximado de tioglucsidos pero no determina tioglucsidos e isocianatos individuales. Reactivos y Aparatos

Solucin Cloruro de Bario 5% Matraces volumtricos de 600 ml Bao de vapor

Procedimiento 1. A 10 g de harina (desengrasada por extraccin Soxhlet) adicinele 250 ml de agua destilada, hidrolice a 54C por 1 h y caliente a ebullicin por 2 h., manteniendo el volumen constante. 2. Filtre, reteniendo el filtrado y lave el residuo tres veces con 50 ml de agua caliente, agregando el lquido al filtrado inicial y afore a 600 ml.

3. Precipite el sulfato de bario por calentamiento y adicionando un exceso de solucin de Cloruro de bario. Djelo en un bao de vapor por algunas horas y filtre. 4. Calcine en una mufla y pese el precipitado. Calcule el contenido aproximado de tioglucsido como: % Tiogl= (M. wt. tioglucsido Peso de BaSO4) 100/M.wt. BaSO4 Peso Muestra

FIGURA 26 Determinacin de tioglucsidos en ingredientes alimenticios.

5.4. Anlisis de Aflatoxinas

El mtodo que se incluye es adecuado para materiales como harina de cacahuate, harina de copra y harina de palma kernel; para detalles del mtodo, as como para procedimientos alternativos, refirase a Methods of Aflatoxin Analysis por B.D. Jones (1972), Report No. G70, Tropical Products Institute, London. Reactivos:

Cloroformo (G.R.) Eter etlico (G.R.) Mezcla cloroformo/metanol (95/5 v/v) Celita, tierra de diatomeas Gel de slica G (Merck) Estndares Cualitativos. Permiten distinguir marcas de aflatoxina de otras manchas fluorescentes que puedan estar presentes. Se puede usar con este propsito harina de cacahuate conteniendo aflatoxina B obtenible en el Inst. de Productos Tropicales de Londres.

Materiales y Equipo

Placas para cromatografa de capa fina 20 20 cm. Lmparas UV pico de emisin a 365 Botellas de boca ancha de 250 ml Micropipetas Agitador Rotoevaporador

Procedimiento 1. Pese 10 mg del material en un frasco de boca ancha y mzclelo con 10 ml de agua (si se usa material con alto nivel de grasa, ser necesaria una extraccin previa con soxhlet). Adicione 100 ml de cloroformo y agite por 30 min. 2. Filtre el extracto a travs de la celita, tome 20 ml del filtrado y llvelo a 25 ml (solucin a). Tome otros 20 ml del filtrado y concntrelos a 5 ml (solucin b). 3. Prepare placas de cromatografa agitando 100 g de gel de slica G con 220 ml de agua por 20 min y aplicando la mezcla a las placas con el aparato apropiado, con un grosor de 509. Djela reposar por 1 hora y seque a 100C. 4. Coloque gotas de 10 y 20 l de solucin b y 15 y 10l de solucin a en la placa, junto con una gota de estndar cualitativo, en una lnea a 2 cm del fondo de la placa y al menos a 2 cm de cada lado. Realice la aplicacin bajo luz tenue. 5. Revele la placa en ter etlico a una altura de 12 cm, djela secar en luz tenue y luego vulvala a revelar en mezcla de cloroformo/metanol hasta una altura de 10 cm desde la lnea basal. 6. Examine la placa en un cuarto obscuro a 30 cm de la fuente de UV. La presencia de una mancha azul fluorescente a Rf 0.50.55 indica aflatoxina B (asegrese de que la mancha del estndar se encuentre tambin en ese rango). la presencia de una segunda mancha a Rf 0.45 0.5 indica aflatoxina G.

La toxicidad de una muestra puede ser clasificada en trminos de aflatoxinas B y G de acuerdo con la tabla siguiente: TABLA COMPARATIVA PARA DETERMINAR TOXICIDAD DE AFLATOXINAS B Y G
Conc. de Aflatoxina (mg/kg) Volumen aplicado (ml) No fluoresencia c/fluoresencia 5 (sol. A) 10 (sol. A) 10 (sol. B) 20 (sol. B) <1000 <500 <100 <50 >1000 5001000 100500 50100 Toxicidad de fluorescencia observada Muy alta Alta Media Baja

Tomado de Harris, 1980

FIGURA 27 Determinacin cromatogrfica de aflatoxinas en ingredientes alimenticios.

5.5. Mtodo Colorimtrico para la Determinacin de Mimosina (Matsumoto y Sherman, 1951).

La mimosina es un aminocido libre muy comn en algunas leguminosas, incluyendo a Leucaena leucocephala y L. glauca, consideradas excelentes fuentes de protena para la alimentacin animal. Su presencia limita el uso de las hojas y semillas en la alimentacin de monogstricos, ya que afecta la funcin de la tiroides, provocando reduccin del crecimiento. Reactivos

Solucin de Mimosina, 0.1% en HCl 0.1N (mimosina de L. glauca recristalizada) Solucin de Cloruro frrico al 0.5% en HCl 0.1N Carbn Activado. Acido Clorhdrico 0.1N.

Materiales y Equipo

Colormetro (usar espectrofotmetro 535 nm) Klett-Summerson con Filtro No. 54. Matraz Kitazato. Tubos de ensaye. Crisol de Filtracin. Vasos de precipitado de 250 ml. Vasos de precipitado de 150 ml. Matraz Volumtrico de 250 ml. Matraz Volumtrico de 100 ml.

Procedimiento Extraccin: Coloque 1.25 g de hoja seca de leucaena en un Vaso de precipitado de 250 ml y digiera con 100 ml de HCl 0.1N por hora con agitacin constante, deje enfriar y transfiera todo a un matraz volumtrico de 250 ml, agite bien y deje reposar hasta que los slidos se asienten en el fondo. Clarificacin: Transfiera 10 ml de sobrenadante a un V.P. de 150 ml con 30 mg de Carbn. Agregue agua para llevar el volumen a 25 ml, cbralo con un vidrio de reloj y caliente a ebullicin por 15 min., deje enfriar y filtre con vaco en el crisol de filtracin; el filtrado es colectado en un tubo colocado en el matraz kitazato. Enjuague el vaso de precipitado y el material en el crisol con 10 ml de HCl 0.1N dividido en tres porciones. Enjuague finalmente el crisol con 5 pequeas porciones de agua. Determinacin Colorimtrica: Transfiera el lquido obtenido a un matraz volumtrico de 100 ml, agregue 4 ml de solucin de cloruro frrico al 0.5% en HCl 0.1N y afore con agua. El pH deber ser entre 1.5 y 2.5. Lea en el Colormetro y calcule la cantidad de mimosina en una curva de calibracin. Curva de Calibracin: Disuelva 0.1046 g de mimosina pura en HCl 0.1N y afore a 100 ml con el cido. La solucin contiene 0.1% de mimosina. Coloque 1 ml de solucin de mimosina en un matraz volumtrico de 100 ml y adicione 10 ml de HCl 0.1N y 4 ml de la solucin de cloruro frrico al 0.5% y afore con agua. Lea la intensidad del color en el Colormetro (espectro 535 nm). Use agua destilada como referencia y repita el procedimiento usando 2,3,4 y 5 ml de solucin de mimosina. Se obtiene una lnea al graficar la lectura del Colormetro contra la concentracin.

FIGURA 28 Determinacin colorimtrica de mimosina.

5.6. Mtodo Colorimtrico para la Determinacin de Canavanina (Archibald, 1946)

Las semillas y hojas de leguminosas y en particular las de canavalia (Canavalia ensiformis) y sesbania (Sesbania spp.) contienen cantidades variables del aminocido libre canavanina, el cual es txico para animales monogstricos. El mtodo permite determinar la cantidad del antinutriente en ingredientes alimenticios. Reactivos

Buffer fosfato 1 M, pH 7.2. Mezcle 34.5 g de NaH2PO4.H2O con 130.6g de K2PO4 y ajuste el volumen a 1 litro Solucin de nitroprusiato de sodio al 2%. Se debe usar solucin recin preparada. Es estable por una semana cuando se almacena en obscuridad a 04C. Perxido de hidrgeno (30% H2O2) Solucin de carbonato de potasio al 20%

Solucin stock de canavanina. 2.5mg de canavanina/ml. Almacenar en hielo seco Solucin estndar de canavanina. Lleve 1 ml de la solucin stock a 10 ml con agua Reactivo de acuoprusiato. Mezcle 0.5ml de la solucin de carbonato al 20% y 0.4 ml de H2O2 con 10ml de la solucin de nitroprusiato. Deje reposar por 30 min a temperatura ambiente (2025C). Deber prepararse diariamente. El uso de cantidades mayores de perxido disminuye el color obtenido con la canavanina.

Materiales y Equipo

Tubos de ensaye Colormetro Espectrofotmetro

Procedimiento 1. Ponga en un tubo de ensaye una muestra de 1 ml de extracto de la muestra, conteniendo 00.25 mg de canavanina, se le adicionan 0.5 ml de buffer fosfato y 0.5 ml de reactivo de acuoprusiato. Maneje de la misma manera blancos conteniendo 0.2, 0.5, 0.8, y 1 ml de solucin madre diluida y llevados a 1 ml con agua, as como tambin un blanco de reactivos con 1 ml de agua, tratados con el fosfato y acuoprusiato. 2. Mezcle vigorosamente y guarde los tubos en un gabinete obscuro; se desarrollar una coloracin rojiza en presencia de canavanina. 3. Despus de 2 horas lea en un colormetro o espectrofotmetro. En este ltimo, ajuste a una longitud de onda de 520 nm y el blanco a una densidad ptica de cero. Puede usar cubetas del espectrofotmetro para desarrollar el color; si usa cubetas de ms de 2 ml, puede adicionarles hasta 10 ml de agua despus de las 2 horas de incubacin para desarrollo del color. Clculos Se grafica la densidad ptica de cada estndar contra su cantidad correspondiente de canavanina y el contenido de canavanina de las muestras se calcula a partir de la curva.

FIGURA 29 Determinacin colorimtrica de canavanina en ingredientes alimenticios.

5.7. Determinacin de Acido Cianhdrico

El cido cianhdrico se encuentra de manera natural en diferentes materiales como son la semilla de lino, harina de yuca y algunas semillas de leguminosas. Este mtodo permite determinar el cido libre o en forma de glucsido, para lo cual, la muestra se suspende en agua, se libera el cido mediante enzimas y se separa por destilacin para colectarse en una solucin de nitrato de plata acidificada. Reactivos

Antiespumante (Silicona) Acido ntrico (d= 1.42g/ml) Solucin de amonio: Prepare diluyendo un volumen de hidrxido de amonio (d=0.88 g/ml) en dos volmenes de agua. Sulfato frrico amoniacal, solucin saturada Suspensin de almendras dulces. Triture 20 almendras dulces blanqueadas en 100 ml de agua a 3740C. Asegrese de que no existe cido cianhdrico en 10 ml de la suspensin usando papel de picrato de sodio o corriendo un blanco testigo como se describe ms adelante Solucin de acetato de sodio, neutral a la fenoftalena: 10g de acetato de sodio anhidro en 100 ml de agua destilada. Solucin 0.02N de tiocianato de amonio Solucin 0.02N de nitrato de plata.

Materiales y Equipo

Estufa regulada a 3738C Aparato para destilacin de vapor Matraz de fondo plano de 1000 ml con tapn esmerilado Bao de aceite Bureta graduada a 0.05 ml

Procedimiento Pese con exactitud de 0.005g aproximadamente 20g de la muestra preparada, colquela en un matraz de fondo plano de 1000 ml, adicione 50 ml de agua y 10 ml de suspensin de almendras dulces. Tape el matraz y pngalo en la estufa durante 16 horas a 3738C. Enfre a temperatura ambiente, adicione 80 ml de agua, 10 ml de solucin de acetato de sodio y una gota de antiespumante. Conecte el matraz al aparato de destilacin y colquelo en el bao de aceite previamente ajustado a una temperatura ligeramente superior a 100C; destile 200 300 ml de lquido pasando una corriente de vapor a travs del matraz y calentando suavemente el bao de vapor. Colecte el destilado en un matraz erlenmayer protegido de la luz conteniendo exactamente 50ml de solucin de nitrato de plata 0.02N y 1ml de cido ntrico. Asegrese de que la extensin del condensador est sumergida en la solucin de nitrato de plata. Transfiera el contenido del matraz erlenmayer a un matraz aforado de 500 ml y llvelo al volumen con agua, mezcle y filtre. Remueva 250 ml del filtrado, adicione aproximadamente 1 ml de sulfato frrico amoniacal y titule el exceso de nitrato de plata con la solucin de tiocianato de amonio. Si se desea, se puede correr un blanco siguiendo el mismo procedimiento con 10ml de suspensin de almendras dulces omitiendo la muestra.

Expresin de resultados Si el blanco indica que la solucin de nitrato de plata ha sido consumida, reste su valor del volumen consumido por la destilacin de la muestra. 1 ml de 0.02N AgNO3 0.54mg de HCN. Exprese el resultado como porcentaje de la muestra. NOTA: Si la muestra (ej. frijoles) contiene una elevada cantidad de azufre, se formar un precipitado negro de sulfato de plata, el cual se filtra junto con el depsito de cianuro de plata. La formacin de este precipitado consume solucin de nitrato de plata y su efecto debe ser eliminado para el clculo de contenido de HCN, para lo cual, trate el depsito sobre el papel filtro con 50ml de amonaco a fin de disolver el cianuro de plata. Lave el residuo en amonaco diluido y determine su contenido de plata. Convierta el valor a ml de solucin 0.02N de solucin de nitrato de plata y rsteselo al volumen de solucin de nitrato de plata consumida por el destilado de la muestra.

FIGURA 30 Determinacin de cido cianhdrico en ingredientes alimenticios.

5.8 Taninos en Plantas y Forrajes. (Krishna y Ranjhan, 1980)

Los taninos son glucsidos de polipptidos solubles en agua presentes en muchas plantas, con un sabor agrio astringente, confiere sabor y olor indeseable a los alimentos. Afectan la utilizacin de las protenas debido a que ligan a la lisina, hacindola indisponible para animales monogstricos. Reactivos

Solucin 0.1N de cido oxlico. 1 ml = 0.006235 g de cido quercitnico 0.0008g 02 absorbido Solucin de permanganato de potasio. Disuelva 1.333g de KMnO4 en un litro de agua y estandarice contra el cido oxlico. Solucin ndigo. Disuelva 6g de indigotin disulfonato de sodio en 500ml de agua mediante calentamiento, enfra y adicione 50ml de cido sulfrico. Diluya a 1 litro y filtre.

Procedimiento 1. Extraiga 2g de muestra durante 20 horas con ter anhidro. Hierva el residuo por 2 horas con 300ml de agua, enfre, diluya a 500 ml y filtre. 2. Mida 25 ml de la infusin dentro de una cpsula de porcelana de 2 litros, adicione 20ml de la solucin de ndigo y 750ml de agua. Adicione la solucin estndar de permanganato, 1 ml a la vez, hasta que cambie el color azul a verde, luego agregue otras gotas hasta que se torne de color amarillo dorado. 3. De manera similar, titule una mezcla de 20ml de solucin de ndigo y 750ml de agua. Multiplique la diferencia entre las titulaciones por el factor deseado para obtener cido quercitnico u oxgeno absorbido.

FIGURA 31 Mtodo simple para la determinacin de taninos en ingredientes alimenticios

5.9. Mtodo Simple para la Determinacin de Acido Ftico (Wheeler y Ferrel, 1971).
El cido ftico se puede encontrar en algunas semillas como ajonjol, trigo, arroz, avena, sorgo, cebada, etc. Su presencia puede provocar deficiencias de fsforo en monogstricos por ligar y formar fitatos indigeribles que hacen indisponible ese elemento; afecta tambin la disponibilidad de calcio, magnesio o el fierro con los que forma el complejo fitina. Reactivos

Solucin de cido tricloroactico (ATA) al 3% Solucin concentrada de FeCl3 Solucin de sulfato de sodio al 3% en ATA Solucin 1.5N de hidrxido de sodio Solucin 3.2N de HNO3 Solucin 1.5M de KSCN Solucin FeCl3 - ATA que contenga 2 mg de Fe2 en sol 3% ATA

Materiales y equipo

Matraz erlenmayer de 125 ml Tubos cnicos para centrfuga Matraz volumtrico de 100 ml Bao mara Agitador mecnico Espectrofotmetro Centrfuga de laboratorio Embudos Papel filtro Whatman 2

Procedimiento 1. Coloque en un matraz erlemayer de 125 ml una muestra finamente molida (40 mallas), estimada para contener de 5 a 50 mg de fitato-P. Extraiga durante 30 min con 50 ml de solucin al 3% de ATA bajo agitacin constante. 2. Centrifuge la suspensin y transfiera una alcuota de 10 ml del sobrenadante a un tubo de centrfuga cnico. Agrguele 4 ml de la solucin de FeCl3 preparada para contener 2 mg de Fe2 soplando rpidamente la pipeta. 3. Caliente durante 45 min el tubo con la muestra en un bao mara a 90100C. Si el sobrenadante no est claro despus de 30 min adicione 1 2 gotas de la sol. al 3% de sulfato de sodio en ATA y contine con el calentamiento. Centrifuge por 1015 min y decante con cuidado el sobrenadante. Lave dos veces el precipitado con 2025 ml de solucin de ATA al 3% dispersndolo bien y calentndolo en agua a ebullicin por 510 min y centrifuge. Finalmente repita una vez el lavado con agua. 4. Disperse el precipitado en un poco de agua destilada, adicione 3 ml de la solucin 1.5N de NaOH y mezcle. Lleve el volumen a aproximadamente 30 ml con agua destilada y caliente en agua a ebullicin durante 30 minutos. Filtre en caliente (cuantitativamente) con un papel de retencin moderada (Whatman 2 SyS 597). 5. Lave el precipitado con 6070 ml de agua destilada caliente y deseche el filtrado. Si se desea hacer determinacin de fsforo se puede usar el filtrado.

Disuelva el precipitado en el papel con 40 ml de la solucin 3.2N de HNO3 pasndolo a un matraz volumtrico de 100 ml. Lave varias veces el papel con agua destilada colectndola en el matraz. Enfre la muestra a temperatura ambiente y afore con agua destilada. 6. Transfiera una alcuota de 5 ml a un matraz volumtrico de 100 ml y diluya a aproximadamente 70 ml. Agregue 20 ml de la solucin 1.5M de KSCN y afore con agua destilada. Lea de inmediato (dentro de un lapso de 1 min) en el espectrofotmetro a 480 nm. 7. Corra un blanco de reactivos con cada muestra. Calcule el contenido de fierro a partir de un estndar de Fe(NO3)3 corrido al mismo tiempo o mediante una curva estndar preparada con anterioridad. Clculos Calcule el fitato-P a partir de los resultados de fierro, asumiendo una tasa molecular de 4:6 fierro:fsforo

FIGURA 32

Mtodo simple para la determinacin de cido ftico en ingredientes alimenticios.

5.10. Determinacin de Saponinas en Vegetales y Alimentos (Fenwick y Oakenfull, 1983)

Las saponinas se pueden encontrar en una gran variedad de plantas incluyendo la alfalfa, soya y semillas de leguminosas, habindose demostrado un efecto negativo sobre el crecimiento de monogstricos. Es un antinutriente estable al calor. Reactivos

Acetona G.R. Metanol Solucin n-butanol-metanol-amonaco concentrado (3.5:1:2.5) Solucin estndar de saponina purificada en metanol Solucin de cido sulfrico en metanol (100 ml por litro)

Materiales y equipo

Extractor soxhlet Rotoevaporador Densitmetro con graficador Planmetro Desecador Placa de gel de slica para cromatografa (Kieselgel 60 F-254 Merck)

Procedimiento Muela finamente la muestra y squela a peso constante. Pese alrededor de 40 g y colquela a reflujo con acetona en el extractor soxhlet por al menos 24 horas para remover lpidos, pigmentos, etc. Cambie el solvente por metanol y contine la extraccin por al menos otras 24 horas. Deje enfriar el extracto metanlico y llvelo a 250 ml con metanol. En este punto hay una modificacin al mtodo propuesta por Miriam Monforte (CICY, Mrida, Yucatn, Mxico). En lugar de llevarlo a 250 ml como sugiere el mtodo original, es ms recomendable concentrar la muestra, lo que permite cuantificar cantidades muy pequeas de saponina, para lo cual, pase el extracto metanlico a un rotoevaporador y concentre a sequedad. Resuspenda el residuo con un mnimo de metanol y pselo a un vial previamente pesado; si no se va a usar de inmediato, seque con nitrgeno y gurdelo en desecador. Pese el vial con la muestra seca y calcule el peso del residuo. Para utilizar la muestra, resuspenda con una cantidad conocida de metanol (alrededor de 1 ml). Cromatografa cualitativa en capa fina Coloque puntos del extracto sobre una placa de gel de slica y revlelos con una solucin n-butanol-etanol-amonaco concentrado (3.5:1:2.5). Se pueden aplicar tres diferentes mtodos para identificar las manchas de saponina: (1) asperson con cido actico-anisaldeido; (2) tratamiento con nitrato de plata seguido de hidrxido de sodio y (3) tratamiento con una suspensin de eritrocitos en buffer isotnico. Para mayores detalles consulte a Fenwick y Oakenfull (1981).

Cromatografa cuantitativa en capa fina Coloque series de puntos con volmenes conocidos del extracto y de una solucin estndar de saponina sobre las placas de cromatografa. Los puntos deben ser colocados de tal manera que cada punto de extracto vaya al lado de los de estndar de saponina. Revele las placas de la misma manera que en el apartado anterior y las manchas deben ser visualizadas mediante la asperson de una solucin de cido sulfrico en metanol, seguida de calentamiento a 110C por 30 min. Mida la intensidad de las manchas de saponina por medio de un densitmetro y calcule las reas de los picos en el graficador con un planmetro. los resultados son expresados como la relacin (R) de las reas de los picos de la muestra desconocida con respecto a la del estndar. Se ha determinado que la concentracin de saponina en la muestra (en g) es proporcional al cuadrado de las reas relativas (R2). Grafique R2 contra el volumen de la gota de extracto metanlico colocada en la placa. La pendiente de la lnea (calculada por el mtodo de cuadrados mnimos), divido entre la pendiente de una lnea obtenida de una curva patrn, dar la concentracin de la saponina en el extracto y de esa manera, el contenido de saponina en la muestra. El mtodo puede tener un error experimental acumulado de 20%.

FIGURA 33 Determinacin de saponinas en ingredientes alimenticios.