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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOS

QCB.EH ROSARIO SALAZAR RIOJAS


SERVICIO DE HEMATOLOGIA
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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOS

1. El color y los colorantes HEMATOLOGICOS

2. El color y las estructuras celulares 3. Problemas TECNICOS en las tinciones


4. Casos de morfologa

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Qu es un COLOR?

Es la longitud de onda del espectro de LUZ VISIBLE que absorbe y refleja un cuerpo Espectro de la luz visible:
380 nm........Violeta 780 nm..........Rojo
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Un cuerpo es BLANCO cuando refleja todas las longitudes de onda Un cuerpo NEGRO absorbe todas las longitudes de onda

Un cuerpo ROJO absorbe todas las longitudes de onda menos las rojas

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BASOFILO NEUTROFILO

Qu es un COLORANTE?

Un colorante es una sustancia con capacidad de transmitir un color a un sustrato Debe penetrar e interactuar con las estructuras moleculares de las clulas
HEMATIES PLAQUETAS 5

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Las estructuras celulares que vamos a teir deben ser tratadas previamente, mediante la FIJACION
La FIJACION es un proceso fsicoqumico que inmoviliza determinadas estructuras celulares, y que permite que puedan ser posteriormente coloreadas sin ser arrastradas en el proceso
EOSINOFILOS 6

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Durante la FIJACION se producen varios fenmenos:

Se coagulan las protenas celulares conservando su arquitectura Pueden perderse algunas sustancias no esenciales para la interpretacin citomorfolgica; los alcoholes disuelven las grasas
Las extensiones sanguneas se pueden fijar con calor seco, alcoholes, formaldehdo, acetona, etc. El mejor fijador para morfologa es el metanol (alcohol metlico)

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QUE PRETENDEMOS CON LAS TINCIONES? 1. Identificar las clulas 2. Identificar sus estructuras internas Densidad de la cromatina Presencia de nuclolos Citoplasma: Caractersticas
Granulacin
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CELULA PLASMATICA (LINFOCITO B): A LA IZQUIERDA IMAGEN AL MICROSCOPIO ELECTRONICO Y A LA DERECHA UN ESQUEMA DE LA MISMA 9

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MITOCONDRIAS

NUCLEO

APARATO DE GOLGI

RETICULO ENDOPLASMICO CON RIBOSOMAS

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NUCLEO

CONTIENE ADN Y PROTEINAS ESPECIFICAS SU MAYOR O MENOR DENSIDAD, EQUIVALENTE A MAS O MENOS MADUREZ, SE TRADUCE POR UNA COLORACIN +/ INTENSA LA PRESENCIA DE NUCLEOLOS (ACUMULACION DE ARN PROPIA DE CELULAS INMADURAS) SE VE COMO UNA ZONA CLARA RODEADA DE UN HALO MAS INTENSO

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RETICULO ENDOPLASMICO RUGOSO ES EL LUGAR DONDE SE SINTETIZAN LAS PROTEINAS DE LAS CELULAS ES MUY RICO EN ARN (RIBOSOMAS) CUYO CARACTER ACIDO ATRAE A LOS COLORANTES BASICOS

A VECES MUESTRA DILATACIONES QUE AL MICROSCOPIO PARECEN PEQUEAS VACUOLAS


SU PRODUCCION SE ENVIA AL APARATO DE GOLGI, Y DE ESTE AL EXTERIOR

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ESTRUCTURAS GRANULARES MITOCONDRIAS LISOSOMAS CENTRIOLOS GRANULOS DE GLUCOGENO VACUOLAS OTRAS SE OBSERVAN CON EL MICROSCOPIO OPTICO COMO GRANULOS, MAS O MENOS GRANDES, QUE ADQUIEREN DISTINTA COLORACION SEGUN SU CONTENIDO

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QU COLOR TRANSMITE UN COLORANTE?
NEUTROFILO

1. El suyo propio

2. Un color distinto: metacromasia


3. Ms de un color: alocromasia
BASOFILO

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COMO TRANSMITE EL COLOR?

Coloracin = impregnacin del sustrato Reaccin qumica = citoqumica

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MECANISMO USUAL DE COLORACION

ATRACCION ELECTROSTATICA

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Coloracin: Afinidad de carga elctrica del colorante por el sustrato celular

Directa: Se produce una unin electro polar entre colorante y sustrato Indirecta: El colorante necesita una pieza de unin intermedia, a la que se denomina mordiente
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Los mordientes suelen ser metales: aluminio, molibdeno, cromo, vanadio, etc Colorante Mordiente Sustrato

El conjunto colorante + mordiente se denomina laca Ejemplo: Tanto la Hematoxilina como el Rojo Nuclear emplean el Aluminio como mordiente
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Coloracin progresiva
Se aade al sustrato celular el colorante muy diluido (por ej. al 1%), y se deja durante tiempos diferentes en distintas muestras. Se observa la tincin de distintas estructuras de manera progresiva

Coloracin regresiva
Partiendo del colorante muy concentrado, se enjuagan gradualmente las muestras (diferenciacin) hasta lograr la mejor visualizacin de determinadas estructuras celulares
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METACROMASIA
Fenmeno tintorial en el que un colorante determinado tie a un sustrato celular en un color diferente al propio

AZUL DE TOLUIDINA Tie de color ROSA los grnulos de los basfilos

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METACROMASIA
Los grnulos de los BASOFILOS contienen mucopolisacridos cidos con grupos sulfatos [-] a menos de 5 unos de otros
Las molculas de Azul de Toluidina (intensamente bsicas +) se unen apretadamente configurando una tonalidad final rosada (fenmeno de basofilia)

BASOFILO 21

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PARTES DE UN COLORANTE
GRUPO CROMOFORO: son grupos de tomos en resonancia (e- en vibracin) que predisponen a la molcula a ser colorante
FRACCION CROMOGENA: constituyen la mayor parte de la molcula, a la que da color (peso y densidad) GRUPO AUXOCROMO: portador de la carga elctrica, positiva o negativa, que se une al sustrato
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ANILINA O2N - NH2+ / Cl-

cromforo

cromgeno

auxcromo
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PARTES DE UN COLORANTE
Grupos cromforos: -NO (nitroso) -NO2 (nitro) -N=N- (azo) -C=S (tio)
Son grupos atmicos en resonancia (nubes de electrones en vibracin), que confieren una aptitud colorante a la molcula. Aportan el color de base: morado en el caso de la anilina

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PARTES DE UN COLORANTE
Fraccin cromgena Anillo bencnico
Cuanto mayor sea el peso de esta fraccin mas intensa ser la accin colorante Pueden ser cclicos (derivados de Benceno, Antraceno o Naftaleno) o Acclicos (Etil, Metil,...)

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PARTES DE UN COLORANTE Grupos auxcromos
Catinicos (+): Amina primaria NH2 Amina secundaria -NHDerivados arlicos y alqulicos Carboxilo COOH Sulfnico SO3H Oxidrilo OH Fosfrico PO4H3

Aninicos (-):

Nota: Actan como lugar de enganche al sustrato celular. Para ser activos deben hallarse como sales solubles (sdicas, potsicas, cloruros, sulfatos, etc)
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COLORANTES BASICOS

Los AUXOCROMOS CATIONICOS o bsicos (+) se salifican con los cidos (-) del sustrato:

BASOFILO

BASOFILIA
afinidad del sustrato celular [-] por colorantes bsicos [+]

BASOFILIA INTENSA EN EL CITOPLASMA DE 27 UN PLASMOCITO

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COLORANTES ACIDOS

Los AUXOCROMOS ANIONICOS o cidos (-) se salifican con las sustancias bsicas (+) contenidas en las estructuras celulares:

ACIDOFILIA
afinidad del sustrato celular [+] por colorantes cidos [-]
EOSINOFILO

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COLORANTES NEUTROS
Sus molculas contienen AUXOCROMOS CATIONICOS Y ANIONICOS, que les permite presentar acidofilia y basofilia segn los sustratos celulares sobre los que se fija. Ejemplo: Eosinato de azul de metileno

[+]/Cl-

[-]/Na+

BASOFILIA
CELULA

+
ACIDOFILIA
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COLORANTES NEUTROS
Suelen emplearse diluidos en soluciones alcohlicas (metanol con frecuencia), en las que existe un equilibrio entre los iones [+] y [-]
NEUTROFILO

Ejemplo: El eosinato de azul de metileno tie los ncleos de las clulas reaccionando con los cidos nucleicos (azul de metileno[+]) y con las nucleoprotenas (eosinato[-])
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COLORANTES NEUTROS

Variando el pH del medio en el que interaccionan el colorante y los sustratos celulares, se puede modificar la afinidad y por tanto la coloracin final

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COLORANTES NEUTROS
Las protenas celulares contiene grupos aminos y grupos cidos: Cualquier protena a un pH inferior a su punto isoelctrico (PI) se carga [+], con lo que tendr mayor afinidad por los colorantes cidos [aninicos -].

Por el contrario, si elevamos el pH por encima de su PI se pondrn de manifiesto sus cargas [-], aumentando su avidez por los colorantes bsicos [catinicos +].

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COLORANTES NEUTROS

HEMOGLOBINA: protena eritrocitaria rica en grupos cidos (-COO-) y amino (-NH2). La tincin de MGG proporciones varias coloraciones: = Sepia (beige claro), a pH 7 - 7.2

= Rosa a rojo, a pH 6.4 6.8 (til si policromasia)


= Gris-azulada, a pH 7.2 7.6

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pH 7.4

pH 6.8

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NEUTROFILO

COLORANTES NEUTROS
Normalmente para teir extensiones de citologas sanguneas se emplean colorantes qumicamente neutros, con los que se obtiene una:

TINCION PANCROMATICA, una TINCION PANOPTICA


LINFOCITO
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En 1.891, ROMANOVSKI emple una solucin acuosa de Azul de Metileno para teir una muestra de sangre con Plasmodios, en la que haban aparecido colonias de hongos despus de 3-4 meses.

Sorprendido, observ que los ncleos de los polimorfo nucleares adquiran un tono rojo prpura, mientras el citoplasma permaneca ms o menos azulado.
TINCION NORMAL CON AZUL DE METILENO 36

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AZUL DE METILENO

CH3 N+

CH3
N

auxcromo

cromgeno

cromforo

N+

CH3 CH3
auxcromo
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AZUL

AZUL DE METILENO
AZUL-VIOLETA

-CH3

AZUR B
VIOLETA-ROJO

-CH3

AZUR A
ROJO OSCURO

-CH3

VIOLETA DE METILENO
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El azul de metileno y sus derivados aportan 3 colores principales: Rojo Azul

Violeta

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TINCION PANCROMATICA
Una SOLUCION UNICA, compuesta por varios colorantes y sus derivados qumicos en solucin aportan toda una gama de colores

NEUTROFILIA 40

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TINCIONES PANCROMATICAS
De los trabajos de ROMANOVSKI, y de otros autores como LEISHMAN, WRIGTH, GIEMSA, TRIBONDEAU, etc, derivan las actuales tinciones pancromticas, basadas en diversas combinaciones de: Azul de metileno y sus derivados (azures)

Eosina

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TINCIONES PANCROMATICAS
COLORANTE DE WRIGHT: Resulta de la demetilacin del Azul de Metileno (AM) en un medio muy alcalino (CO3HNa) y a 1 atmsfera de presin, obtenindose sucesivamente una mezcla de:
Azul de Metileno

Azur B (I)

Azur A (II)

Violeta de Metileno
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TINCIONES PANOPTICAS
Empleo sucesivo de 2 o ms soluciones colorantes. En general son de mayor calidad cromtica que las tinciones pancromticas
Ejemplo: La Tincin de May-Grnwald-Giemsa
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TINCIONES PANOPTICAS

COLORACION DE MAY-GRNWALD-GIEMSA (o panptica de Pappenheim)

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TINCIONES PANOPTICAS
GIEMSA: - Eosinato de Azur II (azur A) - Azur II al 0.76% en glicerina y metanol MAY-GRNWALD (*): Eosinato de AM al 0.2% en metanol

(*): Eosinato de Azul de Metileno (una molcula de Eosina unida a dos de Azul de Metileno) al 0.2-0.25% en metanol

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TINCIONES PANOPTICAS
FIJACION: metanol
MAY-GRNWALD

PRECOLORACION: AM + eosina
COLORACION FINAL

GIEMSA

NOTAS: La adicin de pequeas cantidades de GLICERINA a la solucin de Giemsa aumenta la ionizacin del colorante y su disponibilidad, y por otra parte disminuye la formacin de precipitados cuando la tincin es prolongada. Si adems se aade una gota de ACETONA (x 20 cc de sol. de Giemsa) se mejora la penetrabilidad del colorante, hecho muy til cuando existe una gran densidad celular 46

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EL COLOR DE LAS ESTRUCTURAS CELULARES

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Para COMUNICAR lo que vemos al microscopio debemos reconocer determinadas CARACTERISITCAS de las clulas teidas, e informar en trminos concretos que definan situaciones de normalidad o de anormalidad. Vamos a tratar a continuacin sobre la TERMINOLOGIA que debemos usar para expresar nuestros resultados

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Componentes moleculares implicados en la qumica de las coloraciones
Acidos Nucleicos Nucleoprotenas Lpidos (fosfo-)
Carbohidratos

Ac. Fosfrico: anin principal Alcalinidad de HIS, ARG y LIS cidos, bsicos o neutros
En su mayora acdicos

(+): alcalino, carcter bsico, pH elevado (>7), catin (-): carcter cido, pH bajo (<7), anin 49

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COLORACION CELULAR Fijando con metanol y coloreando con AM/derivados y Eosina, se tien: CROMATINA NUCLEAR

el ADN tiene avidez por el azul de metileno y sus derivados, adquiriendo una tonalidad violeta oscura-negruzca, ms intensa cuanto ms maduro es el ncleo y ms compacto. Las nucleoprotenas son ricas en histonas y protamina (+), por lo que tienen afinidad por la eosina, que aporta una tonalidad roja.

ERITROBLASTO MADURO

ERITROBLASTO INMADURO 50

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COLORACION CELULAR = HEMOGLOBINA de los hemates: ya hemos visto que esta protena tiene numerosas cargas elctricas (+) y tambin (-). Esto da lugar a que pequeas variaciones en el pH de la tincin modifica su basofilia/acidofilia = GRANULOS NEUTROFILOS: toman las molculas de eosinato de AM sin disociar, completas = GRANULOS BASOFILOS: debido a su contenido cido (heparina) poseen alta afinidad por el AM.
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COLORACION CELULAR
POLIMORFONUCLEAR

= GRANULOS EOSINOFILOS: su contenido fuertemente bsico atrae nicamente a colorantes cidos, como la eosina
= VACUOLAS: cuando su contenido es graso puede ser disuelto por el alcohol usado como fijador, y aparecen como estructuras vacas

MONOCITO

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TERMINOS DE USO HABITUAL SOBRE COLORACION
BASOFILIA GRANULAR BASOFILIA DIFUSA

BASOFILIA

La GRANULACION del basfilo (-COO-) tiene afinidad por los colorantes alcalinos (+). Igual ocurre en la basofilia difusa de las clulas plasmtica, ricas en ARN (-COO-)
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BASOFILIA

ANILINA O2N - NH2+ / Cl-

cromforo

cromgeno

auxcromo

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BASOFILIA

AZUL DE METILENO

CH3 N+

CH3
N

auxcromo

cromgeno

cromforo

CH3
N

CH3

auxcromo
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AZUROFILIA

A veces se comenta errneamente que el Azul de Metileno produce metacromasia, y no es cierto.


Se trata en realidad del fenmeno de AZUROFILIA, coloracin violeta-rojiza y no azul como sera de esperar, debida a la presencia de pequeas cantidades de derivados trimetilados del A.M., denominados Azur I (o Azur B).

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TERMINOS DE USO HABITUAL SOBRE COLORACION

AZUROFILIA

La GRANULACION del mielocito neutrfilo es tpicamente azurfila, igual que la de algunos linfocitos
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ACIDOFILIA

EOSINA

cromgeno

COO-/Na+ auxcromo

ACIDOFILIA

Br O

Na+/Oauxcromo

Br Br cromforo

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TERMINOS DE USO HABITUAL SOBRE COLORACION

ACIDOFILIA

La GRANULACION del eosinfilo (protenas catinicas [+]) tiene avidez por los colorantes cidos [-](como la eosina)
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TERMINOS DE USO HABITUAL SOBRE COLORACION

HIPOCROMIA

FALTA DE INTENSIDAD en la coloracin: en la imagen la hipocromia tpica de la falta de Hb en la anemia ferropnica


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TERMINOS DE USO HABITUAL SOBRE COLORACION

HIPERCROMIA

REFUERZO DE LA TINCION: en la imagen el ncleo del eritroblasto es hipercromtico


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TERMINOS DE USO HABITUAL SOBRE COLORACION

ANISOCROMIA

Distinta intensidad de la coloracin en el mismo tipo de clulas


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TORMINOS DE USO HABITUAL SOBRE COLORACION

POLICROMASIA

Distinto color en el mismo tipo celular


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CARACTERISTICAS DEL NUCLEO

Redondeado

Hendido

Lobulado

Linfocito

Linfocito hendido

Polimorfonuclear Neutrfilo
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CARACTERISTICAS DEL NUCLEO

Arrionado

Irregular

Bilobulado

Monocito

Monocito

Eosinfilo

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CARACTERISTICAS DEL NUCLEO

Centrado

Excntrico

Eritroblasto

Cl. Plasmtica
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CARACTERISTICAS DEL NUCLEO

Cromatina laxa

Cromatina de densidad media

Cromatina densa

Blasto indiferenciado

Monocito (cromatina peinada)

Eritroblasto
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CARACTERISTICAS DEL NUCLEO

Un nuclolo

Dos nuclolos

>2 nuclolos

Mononucleosis Infecciosa

Blasto maligno

Blasto maligno
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CARACTERISTICAS DEL CITOPLASMA

INTENSAMENTE BASOFILO
Es decir contiene sustancias con gran avidez por los colorantes bsicos. Y concretamente las clulas con gran actividad de sntesis poseen una gran basofilia debido a la presencia en el citoplasma de ARN, que contiene abundantes grupos fosfricos (PO3-).

PLASMOCITO

LINFOCITO ACTIVADO
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CARACTERISTICAS DEL CITOPLASMA

DE BASOFILIA MEDIA
Como ocurre en los linfocitos ligeramente activados o en los promielocitos

LINFOCITO T ACTIVADO (MONONUCLEOSIS I.)

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CARACTERISTICAS DEL CITOPLASMA

Bordes netos

Bordes irregulares

Linfocito activado (mononucleosis inf.)

Linfocito
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CARACTERISTICAS DE LA GRANULACION
Eosinfila ( acidfila)

Basfila

Neutrfila (mixta)

Granulocito Eosinfilo

Granulocito Basfilo

Granulocito Neutrfilo
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PROBLEMAS TECNICOS

Vamos a revisar brevemente algunos defectos comunes en las tinciones de rutina que se realizan en los laboratorios de Hematologa

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PROBLEMAS TECNICOS Las extensiones de sangre para examen morfolgico se deben de realizar inmediatamente despus de la extraccin de la muestra en EDTA.

Cuando pasan ms de 2 o 3 horas, comienzan a aparecer fenmenos degenerativos en las clulas.


CELULA NO IDENTIFICABLE, CON EL NUCLEO EN DEGENERACION (CARIOLISIS) 74

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PROBLEMAS TECNICOS

La solucin de fijacin precoloracin se ha derramado, secndose en la zona dejada al descubierto

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PROBLEMAS TECNICOS

Fijacin defectuosa y depsitos de colorantes en torno a los hemates

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PROBLEMAS TECNICOS
Precipitados de colorante en halo entre las clulas

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PROBLEMAS TECNICOS

Defecto en la fijacin: es imposible distinguir la morfologa de los eritrocitos


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PROBLEMAS TECNICOS
Extensin insuficientemente seca, y mal fijada por el alcohol

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PROBLEMAS TECNICOS

Entre otros excesos se observa una sobre-tincin que impide reconocer las caractersticas de la cromatina de los ncleos

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PROBLEMAS TECNICOS

La cantidad de solucin fijadoracolorante es deficiente

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PROBLEMAS TECNICOS

Solucin de lavado con suciedad que dificulta la visin

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T. PANCROMATICA DEFICIENTE: EXCESO DE COLORANTE QUE IMPIDE VER LA CROMATINA NUCLEAR Y SUCIEDAD

T. PANCROMATICA CORRECTA

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PROBLEMAS TECNICOS

LA GRANULACION ESPECIFICA DEL BASOFILO SE HA PERDIDO PARCIALMENTE. AL SER SU CONTENIDO SOLUBLE EN AGUA, UN EXCESO DE LAVADO LA HA ELIMINADO

LA GRANULACION SECUNDARIA DEL BASOFILO MUESTRA SU TIPICA COLORACION NEGRUZCA DEBIDO A LA AVIDEZ DE LA HEPARINA (ACIDO) POR EL AZUL DE METILENO (BASE)

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PROBLEMAS TECNICOS

En las tinciones que usamos, ya hemos comentado que el color se logra por una atraccin electrosttica, establecindose enlaces qumicos estables aunque no muy fuertes. Por ello un lavado excesivo, combinado o no con una cantidad insuficiente de solucin colorante, puede conducir a una decoloracin ms o menos intensa

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SOLUCIONES A LOS PROBLEMAS TECNICOS

Limpieza de los portaobjetos Eter / Alcohol [1:1] pH del agua destilada: 7-7.2 Hervir o tamponar Secado de las extensiones Mnimo 2 horas; ptimo 24 h
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SOLUCIONES A LOS PROBLEMAS TECNICOS

Sobrecarga de color: precipitados Glicerina

Suciedad de fondo Lavar con A.D. Conservacin Cubrir con DPX


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CASOS DE MORFOLOGIA

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Ncleo Forma
Cromatina Nuclolos Citoplasma Coloracin

Fig. 1: Linfocito

Bordes

Grnulos
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Ncleo Forma
Cromatina Nuclolos Citoplasma Coloracin

Fig. 2: Eosinfilo

Bordes

Grnulos
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Ncleo Forma
Cromatina Nuclolos Citoplasma Coloracin

Fig. 3: Mielocito

Bordes

Grnulos
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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOS

Ncleo Forma
Cromatina Nuclolos Citoplasma Coloracin

Fig. 4: Neutr. Banda

Bordes

Grnulos
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Ncleo Forma
Cromatina Nuclolos Citoplasma Coloracin

Fig. 5: Linfocito

Bordes

Grnulos
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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOS

Ncleo Forma
Cromatina Nuclolos Citoplasma Coloracin

Fig. 6: Basfilo

Bordes

Grnulos
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Ncleo Forma
Cromatina Nuclolos Citoplasma Coloracin

Fig. 7: Neutr. Segmentado

Bordes

Grnulos
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Ncleo Forma
Cromatina Nuclolos Citoplasma Coloracin

Fig. 8: Monocito

Bordes

Grnulos
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Ncleo Forma
Cromatina Nuclolos Citoplasma Coloracin

Fig. 9: Blasto

Bordes

Grnulos
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Ncleo Forma
Cromatina Nuclolos Citoplasma Coloracin

Fig. 10: Linfocito

Bordes

Grnulos
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