Separao dos pigmentos do espinafre por cromatografia Introduo Na primeira prtica foi feita a extrao dos pigmentos de folhas

de espinafre usando o extrator de Soxhlet. Nesta nova prtica ser feita a separao como tambm a identificao usando mtodos de cromatografia. Definio de cromatografia Antes de falar sobre o procedimento efetuado, iniciaremos com uma definio de cromatografia. A definio abaixo dada pelo livro Fundamentos de Qumica Analtica (Skoog, West, Holler, Crouch): Cromatografia uma tcnica na qual os componentes de uma mistura so separados com base nas diferenas de velocidade nas quais so transportados atravs de uma fase fixa estacionria por uma fase mvel lquida ou gasosa. (Skoog et al., 2006) A cromatografia , portanto, um mtodo fsico-qumico de separao, fundamentada na passagem dos componentes de uma mistura por duas fases imiscveis, a fixa e a estacionria, e que possuem diferentes interaes entre si. Como existe uma grande variabilidade de combinaes entre fase mvel e estacionria, a cromatografia se torna uma das tcnicas mais diferenciadas. A cromatografia possui diferentes classificaes, mas em geral podemos classific-la da seguinte forma: 1. PLANAR i. Cromatografia por centrifugao: aplica alta velocidade circular a fase estacionria, acelerando o processo de eluio. Cromatografia em papel: uma amostra lquida flui por uma tira de papel adsorvente vertical, onde os componentes depositam-se em locais especficos. Cromatografia em camada fina ou TLC: a fase estacionria um slido (slica ou alumina) depositado em camada fina e uniforme sobre um suporte slido inerte. A fase mvel, um lquido de baixa viscosidade, evolui atravs da fase estacionria por capilaridade.

ii.

iii.

2. EM COLUNA i. Lquida a) Classica: eluio por fora gravitacional

b) Liquida de alta eficincia: fase estacionaria com partculas muito pequenas. Necessidade de uso de bomba de alta presso para forar eluio. ii. Cromatografia supercrtica: usa-se vapor pressurizado acima de sua temperatura crtica. Gasosa: a fase mvel um gs inerte e a fixa pode ser um liquido ou slido.

iii.

A figura abaixo esquematiza a classificao de cromatografia feita por ns anteriormente.

Aplicaes da cromatografia A cromatografia uma ferramenta verstil e poderosa para separao de espcies qumicas semelhantes (a exemplo da CCD), como na identificao qualitativa e determinao quantitativa das espcies separadas (a exemplo da CCF). Industrialmente, ele tem grande aplicao: Purificao de compostos Anlise simultnea de adoantes (aspartame e sacarina) e conservantes (cido ascrbico e cido benzico). [Anlise de aditivos alimentares] Anlise de EDTA que usado como antioxidante. [Anlise de aditivos alimentares]

Anlise de anti-bactericidas e conservantes de carne

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Os pigmentos do espinafre so formados por uma mistura de componentes, dentre os quais encontramos as clorofilas (a e b) e o -caroteno. Com base no principio da cromatografia e da diferena de polaridade entre os pigmentos, fizemos a determinao de seu numero (atravs da TCL) e, a seguir, a separao destes pigmentos (CCD). Aspectos fsico-qumicos da amostra Nossa amostra, pesada no procedimento 1, tinha como massa m=16,250g (amostra+vidrinho). Na semana seguinte (quando foi feito o procedimento aqui citado), observamos a presena de gua junto a nossa amostra e a massa da amostra (+vidrinho) foi de m=16,597g. Caso chegssemos a calcular o rendimento, este no seria real, visto que nossa amostra sofreu modificao, podendo inclusivo comprometer nosso analito. Quanto a cor, nossa amostra apresentava colorao esverdeada.

Cromatografia em camada fina Para a determinao do nmero de pigmentos, usamos o mtodo de cromatografia em camada fina (TLC), que um mtodo analtico (determinao do nmero e da natureza dos componentes de uma mistura, sem haver sua separao). Para este procedimento experimental, usou-se os seguintes materiais: placa cromatogrfica TLC de alumnio com slica gel lpis grafite tubo capilar Becker de 100ml vidro de relgio provetas de 10ml e 100ml

Os reagentes utilizados foram: acetona [CH3COCH3] hexano [CH3(CH2)4CH3]

Primeiramente preparamos a soluo de eluente. Adicionamos 7ml de hexano em uma proveta de 10ml e transferimos para outra de 100ml. Depois adicionamos 3mL de acetona em uma proveta de 10mL e adicionamos a de 100, para formar o eluente. Os reagentes se misturaram e mostraram-se miscveis em razo de interaes do tipo interao de Van der Walls. Em seguida colocamos uma folha de papel-filtro no Becker de 100mL, cortamos o excesso, adicionamos eluente at atingir altura de aproximadamente 0,5cm e tampamos com vidro de relgio e esperamos o eluente subir pela folha de papel. Colocamos o papel filtro, a fim de aumentar a saturao de eluente. A saturao essencial para a boa migrao das substancias. Enquanto isso, preparamos a placa de slica. Fizemos marcao com lapis a cerca de 1cm da base da placa e, com o tubo capilar, aplicamos o extrato sobre a linha. A seguir, transferimos a placa para o bquer e observamos a eluio. Quanto ao aspecto do extrato, observamos a presena de gua e uma colorao verde-escura. Pesado o extrato (+vidrinho), obtivemos m=16,597g. Pelo fato de haver gua, adicionamos um pouco de eluente no extrato, o que levou a separao da gua(que ficou em baixo) da parte orgnica (que ficou na parte superior). Iniciado o processo de eluio, o eluato que ascendeu mais rapidamente (por capilaridade) pela fase estacionria (placa de slica) tinha colorao laranjaamarelada. Outras trs manchas se formaram, mas ficaram prximas a linha de aplicao. Quando o eluente estava a cerca de 1cm da extremidade superior da placa, retiramos rapidamente a placa com uma pina e fizemos marcaes nos centros de cada mancha. Tomando a linha de marcao como origem, calculamos o Rf (fator de reteno) de cada mancha, que dado pela razo entre a altura atingida pelo pigmento e a distancia entre a linha e a extremidade superior. Obtivemos os seguintes resultados: a = 5,9cm b1=5,8cm b2=1,6cm b3=1,2cm b4=0,7cm

Sabendo-se que Rf = b/a, Rf1=0,098 Rf2=0,27 Rf3=0,20 Rf4=0,12

Esquema da placa.

A marcao teve que ser imediata porque os pigmentos podem desaparecer em contato com o ar, necessitando de outros meios para revel-los, sejam fsicos (luz UV), sejam qumicos. Mdotos de revelao tambm so necessrios para visualizar manchas cujos compostos so incolores. Com base no conhecimento sobre a estrutura dos trs principais pigmentos e na descrio dada pelo roteiro, podemos deduzir que o pigmento superior o -caroteno, visto que um hidrocarboneto pouco polar. Os outros dois pigmentos so clorofilas. A anlise da estrutura das clorofilas indica que a que ficou mais elevada a clorofila-a, pelo fato de ser menos polar que a clorofila-b. Assim, podemos concluir que, quanto a polaridade, podemos fazer a seguinte classificao: -caroteno > clorofila a (ou alfa) > clorofila b (ou beta)
Sentido de CRESCIMENTO da polaridade

Cromatografia em coluna delgada Atravs deste mtodo fizemos a separao dos pigmentos. Este um mtodo analtico preparativo e requer o uso de grandes quantidades da mistura para obter quantidades significativas de cada componente. Para tanto usamos o restante do extrato. Primeiramente procedemos com a preparao da coluna. Colocamos um pedao de algodo na ponta de uma coluna cromatogrfica. Pesamos 10g de slica em um bquer de 100mL e adicionamos hexano at formar uma pasta esbranquiada homognea, que foi transferida para a coluna. Com a ajuda de uma borracha e segurando a coluna na base, compactou-se a pasta, adicionando-se constantemente hexano para cobrir a parte superior da coluna e devolvendo o solvente recolhido no tubo de ensaio coluna (alm de economizar reagente, isso faz parte do programa de reduo de resduos do DQ).

Preparada a coluna, foi-se adicionado lentamente e pelas bordas o extrato com a ajuda de uma pipeta de Pasteur. O esquema da coluna est

representao ao lado. O primeiro pigmento a se separar foi o -caroteno (desceu lentamente pela coluna), o que j era esperado, em funo deste ser o menos polar. Quando estava finalmente separado, mudamos o solvente para o eluente usando na cromatografia TLC (7:3 hexano-acetona). Com o aumento da polaridade, uma banda verde passou a se desprender atravs da coluna, que a clorofila-a. Por fim, restou a clorofila-b (mais polar, em razo da presena do grupo (-CHO), cuja separao foi feita pelo mudana do eluente para um solvente mais polar, a acetona.

CONCLUSES O processo de cromatografia por camada fina foi importante da identificao dos pigmento de espinafre, embora tenhamos apenas considerado os visveis a olho nu. Atravs da cromatografia em coluna delgada fez-se a separao dos pigmentos, onde as clorofilas representaram a maior frao.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS AIP: the journal of chemical physics. Infrared spectroscopy of acetone-hexane liquid mixtures. Disponvel em: <http://jcp.aip.org/resource/1/jcpsa6/v126/i15/p154511_s1?isAuthorized=no>. Acessado em: 06/03/2011. SBQ, Sociedade Brasileira de Qumica. Cromatografia, um breve ensaio. Disponvel em: < qnesc.sbq.org.br/online/qnesc07/atual.pdf >. Acessado em: 11/05/2011 SCHULER, Alexandre. Cromatografia a gs e a lquido. Disponvel em: <https://sites.google.com/site/arquivosdeq/config/pagetemplates/material-dosprofessores/Cromatografia12.pdf?attredirects=0&d=1>. Acessado em: 08/05/2011. SHIMADZU Corp. Aplicaes da cromatografia a lquido. Disponvel em: <http://www.shimadzu.com.br/analitica/port/aplicacao/hplc2.cfm >. Acessado em: 10/05/2011. SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Fundamentos de Qumica Analtica. So Paulo: Cengage, 2006. 8 Ed, paginas 875/877