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Se denomina cultivo al proceso de propagar los microorganismos, proporcionndoles las condiciones ambientales adecuadas.

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Los microorganismos en fase de crecimiento realizan rplicas de s mismos y requieren de los elementos que se encuentran en su composicin qumica. Se le deben brindar los elementos nutritivos en una forma accesible desde el punto de vista metablico. Adems, los microorganismos requieren energa metablica con el objetivo de sintetizar macromolculas y conservar los gradientes qumicos esenciales a travs de sus membranas.

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Durante el crecimiento se deben regular los factores nutricionales (carbono, nitrgeno, azufre y fsforo, elementos trazas y vitaminas) y los factores fsicos (pH, temperatura, oxgeno, humedad, presin hidrosttica, presin osmtica y radiacin).

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REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO

El peso seco de los microorganismos consiste en materia orgnica que contiene carbono, hidrgeno, nitrgeno, oxgeno, fsforo y azufre. Se requieren, adems, iones inorgnicos como potasio, sodio, hierro, magnesio, calcio y cloruro para facilitar la catlisis enzimtica y conservar los gradientes qumicos a travs de la membrana celular.
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Durante el crecimiento, un microorganismo requiere todos los elementos de su materia orgnica y el complemento total de iones necesarios para la energtica y la catlisis. Adems, debe haber una fuente de energa que establezca la fuerza motriz protnica y que permita la sntesis macromolecular. Los microorganismos varan ampliamente en cuanto a sus demandas nutricionales y sus fuentes de energa metablica.
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Factores de crecimiento

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Nutrientes
* MACRONUTRIENTES
* Carbono. * Nitrgeno. * Fosforo. * Azufre * Potasio * Magnesio * Sodio * Calcio * Hierro

* MICRONUTRIENTES
* Cromo * Cobalto * Cobre * Manganeso * Molibdeno * Niquel * Selenio * Tungsteno * Vanadio y Zinc.

(ELEMENTOS TRAZA)

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Se requieren en muy pocas cantidades y solo por algunas clulas:

* Vitaminas

covalamina (vitamina B12) * Aminocidos, * purinas y * pirimidinas.

(tiamina (vitamina B1), biotina, piridoxina (vitamina B6) y

La mayora de los microorganismos son capaces de sintetizarlos.

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Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano

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* *
Tipo

La temperatura es un factor ambiental importante en el control de crecimiento microbiano. Los M.O pueden agruparse segn los mrgenes de temperatura que requieren.
Rango de Temperatura 0 - 20 20 - 40 40 - 70 Temperatura Optima 15 38 60 M.O Algas Psicrofilo Mesofilo Termofilo

Temperatura

E. coli Bacillus stearothermophillus Thermus acuaticus

Hipertermofilos

90 - 115

106

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pH
*La
acidez o alcalinidad de un medio tiene una gran importancia sobre el crecimiento microbiano. La mayora de MO, crecen a un pH entre 6 y 8. *El pH intracelular debe permanecer prximo a la neutralidad.

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Oxigeno
Los microorganismos son muy variables en cuanto a la necesidad del oxigeno. Se dividen dependiendo del efecto del oxigeno:

1.Aerobios estrictos: los que requieren oxigeno como aceptor terminal de

electrones, no proliferan en ausencia de O2. ej. Mycobacterium bovis. superficie de un medio slido. Ej. Haemophillus suis

1.Microaerofilos: utilizan O2 a niveles muy bajos. Un 12%. No proliferen en la 1.Anaerobios estrictos: las que no emplean oxigeno para su metabolismo, 1.Anaerobios aerotolerantes: pueden crecer en presencia o ausencia de
oxigeno, pero la energa la obtienen por fermentacin. Ej. Bacterias acidolacticas. sino que obtienen su energa de reacciones fermentativas. Ej. Clostridium tetani

1.Anaerobios facultativos: son bacterias que proliferan mediante procesos

oxidativos, utilizando oxigeno como aceptor terminal de electrones, o en anaerobiosis, empleando reacciones de fermentacin para obtener energa. Ej. Streptococcus, E. coli 4/16/12

Humedad
*Generalmente todas las clulas con un metabolismo
activo requieren agua del ambiente.

*A

diferencia de los organismos superiores, los organismos unicelulares estn expuestos directamente a su ambiente. La mayora de las clulas vegetativas slo pueden vivir pocas horas sin humedad; slo las esporas y los organismos formadores de esporas pueden existir en un ambiente seco.
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Presin hidrosttica

*Las

bacterias que viven a altas presiones mueren si son mantenidas en el laboratorio pocas horas en condiciones de presin atmosfrica estndar.

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Presin osmtica

*La

mayora de las bacterias pueden tolerar un rango amplio de concentraciones de sustancias disueltas. Su membrana celular contiene un sistema enzimtico llamado permeasas que regulan el 4/16/12 movimiento de las sustancias

Radiacin
*La
energa radiante, particularmente la luz ultravioleta, puede causar mutaciones y eventualmente ocasionar la muerte de los organismos. Sin embargo, algunos microorganismos tienen pigmentos que los protegen de la radiacin y ayudan a prevenir el dao del ADN. poseen sistemas enzimticos que pueden reparar algunos tipos de daos del ADN.
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*Otros

Factores que favorecen el Crecimiento de Microorganismos

Tiempo

Alimen to

Temperatu ra

Humed ad

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Transferencia asptica
Consiste en una serie de procedimientos que evitan la contaminacin durante la manipulacin de los cultivos y de los medios de cultivo estriles. Es uno de los primeros mtodos que tiene que dominar un microbilogo.

a.Se calienta el asa de siembra hasta incandescencia y se deja enfriar b. El tubo se destapa c. Se pasa el extremo del tubo por la llama d. Se extrae la muestra con el asa esterilizada e. Se vuelve a flamear la boca del tubo y la muestra se deposita en un medio estril f. Se vuelve a tapar el tubo y se calienta el asa de nuevo al final

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Obtencin de cultivos puros

2. Siembra en estras

Se esteriliza el asa y luego se toma una muestra del tubo

Crecimiento de colonias confluentes Colonias aisladas al al final comienzo de la de la siembra por siembra por estra estra
1. Dilucin y siembra por extensin en superficie

Se realiza una siembra por estra en una placa de agar con medio estril. Despus de una estra inicail Se hacen estras en ngulo

3. Dilucin y siembra en profundidad 4/16/12

CRECIMIENTO MICROBIANO
*Entendemos por crecimiento microbiano el
aumento del nmero de microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un nico microorganismo que denominaremos ciclo celular, sino al demogrfico de una poblacin.

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Es el aumento en el numero de clulas de una poblacin. Velocidad de crecimiento es el cambio en el numero de clulas o en la masa celular, experimentado por unidad de tiempo. Durante el ciclo de division celular, todos los componentes se duplican.

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Efecto del Crecimiento de Microorganismos Tiempo N de bacterias

12:00 12:20 12:40 13:00 14:00 15:00 16:00 19:00 1 2 4 8 64 512 4096 2097152
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EXPRESIN MATEMTICA DEL CRECIMIENTO En un crecimiento equilibrado, la velocidad de aumento de bacterias en un tiempo determinado es directamente proporcional al nmero o masa de bacterias presentes en ese tiempo.

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CURVA DE CRECIMIENTO
Es la representacin grafica del logaritmo del numero de clulas frente el tiempo.

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* Curva de crecimiento bacteriano

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El crecimiento de la poblacin no inicia inmediatamente, sino despus de cierto periodo de tiempo, el cual puede ser breve o largo, dependiendo de varios factores.

Fase 1: de adaptacin o latencia.

Fase 2: de crecimiento exponencial o logartmico

Es la consecuencia del hecho de que cada celula se divide en dos. Las bacterias se encuentran en un estado optimo. Su velocidad esta influenciada por temperatura, nutrientes.
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El medio de cultivo no se renueva, comienzan a acumularse metabolitos txicos, se modifica el pH, los nutrientes se agotan, la velocidad de multiplicacion se retrasa y hay un equilibrio entre bacterias vivas y muertas.

Fase 3: estacionaria. Fase 4: de Muerte.

Cuando continua el crecimiento en el medio de cultivo viejo se produce una inversin numrica con respecto a la fase exponencial. En este periodo son mas las bacterias muertas que las vivas, hasta que se termina con la muerte de todas. Si son bacterias con capacidad de esporular, se produce la esporulacin en esta fase.
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Descripcin de las fases o etapas de la curva de crecimiento Fase I: Fase lag o de retraso Vc = 0 Adaptacin a un medio ambiente de clulas empobrecidas del arsenal metablico (enzimas) y de sustratos como resultado de las condiciones desfavorables al final del cultivo. Existe un cese parcial de las funciones metablicas. Formacin de enzimas y metabolitos intermediarios necesarios para la reanimacin del crecimiento. Fase II: Fase de aceleracin positiva Vc = Creciente Las clulas disminuyen de tamao, comienzan a utilizarse las reservas, aparecen nuevas funciones. Fase III: Fase exponencial o de crecimiento logartmico Vc = Constante Proceso de catlisis que conlleva al aumento en forma exponencial de la masa bacteriana. Existe un equilibrio de flujo de material. Este proceso se mantiene hasta que: 1. Se agoten los nutrientes (fundamentalmente oxgeno en los aerobios). 2. Se acumulen muchas sustancias txicas que inhiban el crecimiento. 3. Se pongan de manifiesto las propiedades ms importantes de la clula. 4/16/12

Fase IV: Fase de desaceleracin o retardo Vc = Decreciente Estadio de deficiencia. Las clulas viven del metabolismo endgeno, disminuye la velocidad de crecimiento. Fase V: Fase estacionaria mxima Vc = 0 Cese completo del crecimiento por agotamiento de nutrientes y acmulo de sustancias txicas. Prdida lenta de clulas por muerte compensada debido a la formacin de clulas nuevas mediante su crecimiento y divisin. Fase VI: Fase de declinacin o muerte Vc = Negativa (muerte) Aumento de la tasa de mortalidad hasta un nivel sostenido. Persiste un nmero pequeo de sobrevivientes por meses o aos a expensas de los nutrientes de las que mueren. La clula pierde toda capacidad para los procesos degradativos.

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MEDICIN DEL CRECIMIENTO Para determinar la velocidad del crecimiento microbiano puede utilizarse: 1. La medida de la masa celular. 2. La medida del nmero de clulas. Prediccin de la masa celular
1.

Se efecta determinando el peso seco de las bacterias en un volumen fijo del cultivo, pero requiere mucho tiempo y es poco sensible.

2. Por absorbancia: cantidad de luz refractada por una suspensin celular; se define como el logaritmo del cociente entre intensidad de luz incidente (Io) sobre la transmitida (I):

Esta se mide por espectrofotometra o con un nefelmetro. 4/16/12

Medicin del nmero de clulas

1.

Se realiza en cmaras de recuento mediante microscopia.

2. Mediante el contador electrnico de Coulter. 3. Por recuento en placa: diluciones de una poblacin bacteriana son sembradas en medios convenientes, se cuenta el nmero de colonias crecidas despus de la incubacin y se multiplica el nmero de colonias por el factor de dilucin; es llamado recuento viable y resulta el mtodo ms sensible para la determinacin del nmero de bacterias.

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CRECIMIENTO SINCRNICO Hasta ahora se ha descrito el modelo de crecimiento poblacional. Para lograr informacin sobre el crecimiento de bacterias individuales debe recurrirse a los cultivos sincrnicos, clulas que se encuentren todas en la misma etapa del ciclo de multiplicacin. Estos cultivos pueden lograrse mediante tcnicas: 1. Inducidas: por manipulacin de las condiciones ambientales (cambios de temperaturas o suministrando nutrientes en la fase estacionaria). 2. Seleccionadas: separacin fsica de clulas (filtracin diferencial o centrifugacin).

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Aplicacin
1.

Son una fuente constante de clulas en fase exponencial de crecimiento.

2. Permiten el crecimiento continuo con una concentracin muy baja del sustrato. Esto ha permitido, entre otros, estudios tales como: la medida precisa de la frecuencia de mutaciones en las bacterias, cambios evolutivos en las poblaciones bacterianas y cintica de induccin de una enzima inducible a concentraciones muy bajas del inductor.

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CULTIVO CONTINUO DE LOS MICROORGANISMOS (MANTENIMIENTO DE LA FASE EXPONENCIAL) Los cultivos que han permitido el estudio de la curva de crecimiento bacteriano son discontinuos o cultivos batch, donde los nutrientes no se renuevan y la fase exponencial se manifiesta durante unas pocas generaciones; precisamente esto se puede lograr mediante un sistema de cultivo continuo, aadiendo medio fresco constantemente y eliminando el exceso, de manera que el volumen del recipiente se mantenga constante. La velocidad de adicin de medio fresco determina la velocidad del cultivo; este sistema se encuentra autorregulado por la adicin de uno de los nutrientes esenciales al microorganismo.

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Esto se controla con :

1.

Quimiostatos: la velocidad de crecimiento est ajustada por la velocidad de flujo.

2. Turbidostatos: controla el flujo y la velocidad de crecimiento mediante un dispositivo ptico que mide la absorbancia.

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Cultivo continuo
*El
quimiostato es un aparato que se utiliza para obtener un cultivo continuo en medio renovado, permite mantener poblaciones de clulas en crecimiento exponencial por largos periodos de tiempo.

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