DETERMINACIN DE GRUPOS SANGUNEOS. TITULACIN DE ANTISUEROS.

1.- INTRODUCCIN La determinacin del grupo sanguneo es una prctica habitual e imprescindible para la transfusin de componente hemticos. La razn est en que el sistema inmune de algunos individuos rechaza los hemates de otros. Esta reaccin inmunolgica est mediada por anticuerpos y es fcilmente visualizable in vitro mediante reacciones de aglutinacin. Se conocen ms de 20 grupos de antgenos eritrocitarios codificados en otros tantos loci gnicos, para los cuales existen mltiples variantes allicas. El resultado son ms de 200 antgenos eritrocitarios identificables. Estos antgenos varan en su inmunogenicidad. Los ms importantes a efectos transfusionales son los antgenos del sistema H / ABO y los del sistema Rhesus (Rh). Sistemas H y ABO Los eptopos responsables son carbohidratos que aparecen en glicoesfingolpidos de membrana y tambin en glucoprotenas. El gen H codifica la enzima fucosil transferasa, que adiciona fucosa a una cadena oligosacardica precursora. Los tres ltimos azcares de la cadena se denominan antgeno H (Figura 1). En un locus aparte est el sistema ABO, con tres alelos. El alelo A codifica una transferasa que une Nacetil galactosamina a la cadena H, mientras que el alelo B codifica una transferasa que une una galactosa. El alelo O no produce transferasa y por tanto no modifica la sustancia H. El azcar unido al carbono 3 de la galactosa determina la actividad antignica. La galactosa no acepta azcar en el carbono 3 a no ser que haya fucosa unida al carbono 2.

Figura 1. Es importante destacar que estos genes son codominantes. Los individuos que expresan los alelos A y B tendrn oligosacridos con los dos tipos de modificaciones. As, se distinguen 4 grupos: A, B, AB y O. La importancia transfusional de estos antgenos radica en que los individuos de un grupo sintetizan anticuerpos frente a los oligosacridos que no estn en sus hemates (Tabla 1). Estos anticuerpos, que se denominan isoaglutininas y que suelen ser IgM, aparecen en grandes cantidades en circulacin sin necesidad de exposicin previa a sangre de otros grupos. La razn

parece estar en la reactividad cruzada de sustancias presentes en bacterias de la flora intestinal. Tabla 1 Grupo sanguneo A B AB O Sistema Rhesus Se han identificado ms de 40 antgenos del sistema Rh aunque no se sabe cuantos genes son responsables de este sistema. Son protenas integrales de membrana con un contenido lipdico alto. D es el antgeno Rh ms inmunognico y por tanto el ms importante a efectos transfusionales. La presencia de D da lugar al Rh+, mientras que la ausencia (d) da lugar al Rh-. Los anticuerpos anti D, que son IgG, aparecen en la circulacin de los individuos Rh- slo tras una exposicin previa a sangre D, por ejemplo por una transfusin de hemates o tras la gestacin de un feto D. Determinacin de antgenos eritrocitarios y anticuerpos sricos Antes de una transfusin se analizan los eritrocitos del receptor para ABO y D mediante antisueros anti-A, anti-B y anti-D. Simultneamente se analiza el suero para detectar anticuerpos contra antgeno eritrocitarios (isoaglutininas), mediante hemates A y B previamente tipados. Las reacciones positivas dan lugar a la aglutinacin de los hemates. Para asignar un grupo sanguneo, ambas pruebas deben dar un resultado coincidente. Los resultados discrepantes deben analizarse cuidadosamente. Un test adicional es la prueba cruzada, que examina la compatibilidad entre suero del receptor con los hemates del/los donantes. Para ello, hemates lavados del donante se mezclan con suero del receptor, se incuban, se centrifuga y se examina para hemlisis y aglutinacin 2.- OBJETIVOS Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: Interpretar reacciones de aglutinacin. Determinar los grupos ABO y Rh (D) en hemates. Determinar ABO en suero. Obtener antisueros para tipaje. Titular un antisuero. Genotipo AA, AO BB, BO AB OO Antgenos eritrocitarios A B AyB H Anticuerpos sricos Anti-B Anti-A Anti-A, Anti-B

3.- EQUIPAMIENTO

Centrfuga con rotor para tubos de 12x75 10x70 (alternativamente, con rotor para placas microtiter) Centrfuga para tubos eppendorf (tipo Minifuge) Microscopio Transiluminador Portaobjetos o placa microtiter de fondo en U Tubos eppendorf Tubos de 10x70 mm Pipetas de 5-40, 40-200 y 200-1000l y puntas Lancetas de un solo uso

4.- REACTIVOS Y MUESTRAS Antisueros anti-A, anti-B y anti-D Suero salino fisiolgico (NaCl 0.85%) Muestras de sangre anticoagulada con EDTA (tubos de 2 ml descartes rutinarios de los hemogramas). Se emplearn 5 o ms tubos por pareja de alumnos. Algodn y alcohol etlico de 70

5.- PROCEDIMIENTO PRECAUCIN: Todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosas 5.1 Determinacin de ABO y Rh (D) en hemates 1) Preparar un portaobjetos y un tubo eppendorf rotulado con las iniciales del alumno. En este ltimo se pipetea 1 ml de suero salino fisiolgico. 2) Se limpia un dedo con un algodn humedecido en alcohol y se pincha con la lanceta. Alternativamente, puede tomarse la sangre de los tubos anticoagulados con EDTA. 3) Sobre un portaobjetos se depositan tres gotas de aproximadamente 0.5 cm de dimetro (25-50 l) bien separadas. 4) Tomar 10 l de sangre y pipetearlos en el tubo eppendorf. Guardar a temperatura ambiente, se procesar al final. 5) Sobre cada gota de sangre del porta se pipetean 25 l de antisuero. El orden recomendable es anti-A, anti-B, anti-D. 6) Mezclar con una punta de pipeta durante unos segundos 7) Determinar la aglutinacin e interpretar el resultado. Puede visualizarse en el transiluminador o utilizar un microscopio en caso de reaccin muy dbil. 8) Determinar la frecuencia de cada grupo en la clase y compararla con las frecuencias establecidas. Grupo A B AB O % en la clase

Rh negativo 5.2 Lavado y preparacin de hemates al 2% 1) Rotular el tubo eppendorf de los 10 l de sangre con el grupo hemtico obtenido (A, B, AB, O). 2) Centrifugar el tubo 1 minuto en la Minifuge a velocidad alta. 3) Descartar el sobrenadante con bomba de vaco. 4) Resuspender el pellet y aadir 1ml de suero fisiolgico. 5) Repetir los pasos 2 y 3. 6) Resuspender en 490 l de suero fisiolgico. A esto se denomina hemates al 2% (v/v). Estos hemates sern compartidos por todos los alumnos del grupo. 2.3 Determinacin de ABO en suero o plasma (opcional) 1) 2) 3) 4) Centrifugar la sangre 5 minutos a 400xg. Extraer el suero (o plasma) y depositarlo en un tubo eppendorf. Lavar y diluir hemates A y B al 2% (v/v) en suero fisiolgico (Protocolo 5.2). Pipetear 50 l de suero en dos tubos de poliestireno de 10x70 o en dos pocillos. Pueden tambin prepararse controles negativos (suero fisiolgico) y positivos (suero anti-A,B). 5) Pipetear 25 l de hemates A en un tubo (o pocillo) y hemates B en el otro y mezclar. 6) Centrifugar a 400xg 15 segundos. 7) Dispersar el pellet y determinar aglutinacin. 5.4 Obtencin y titulacin de antisueros anti-A, anti-B y anti-A,B a partir de muestras de plasma. 1) Tomar 5 tubos de sangre anticoagulada con EDTA elegidos al azar. 2) Centrifugar la sangre 5 minutos a 400xg. 3) Extraer cuidadosamente el plasma y depositar en un tubo eppendorf rotulado con el nmero de la muestra. El pellet celular se reserva por si fuera necesario posteriormente. 4) En una gradilla colocar 15 tubos de poliestireno de 10x70 (5 filas x 3 columnas) (o utilizar una placa microtiter de fondo en U) 5) Pipetear 50 l de cada plasma en los 3 tubos (pocillos) de cada fila (Tabla de resultados). 6) En los 5 tubos de la primera columna pipetear 25 l de hemates A. En las columnas 2 y 3 pipetear 25 l de hemates B y O respectivamente. Puede procesarse una 4 columna de tubos si se hubieran encontrado hemates AB (ser un control positivo). 7) Incubar 5 minutos. 8) Centrifugar a 400xg 15 segundos. 9) Dispersar el pellet y determinar aglutinacin. (Si se ha trabajado en placa, dispersar el pellet con una pipeta y observar al microscopio invertido, centrndose en el fondo del pocillo). Calificar cada tubo o pocillo con -, + y ++ segn la aglutinacin observada y anotar en la tabla de resultados. 10)Preparar pooles de antisueros anti-A, anti-B y anti-A,B mezclando todos los obtenidos

en el grupo de prcticas. 11)Titular los pooles de antisueros obtenidos (uno cada pareja de prcticas). Para ello, llevar a cabo una dilucin seriada 1/2 y analizar la aglutinacin de una cantidad constante de hemates A o B, tal y como se describe a continuacin. 12)Tomar 8 tubos y rotular 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 y 1/128. 13)Pipetear 50 l de suero salino fisiolgico en todos los tubos excepto en el rotulado como 1. 14)Pipetear 50 l de antisuero en el primer y segundo tubo y mezclar. Del segundo tubo tomar 50 l y pasarlos al siguiente, y as sucesivamente. Descartar 50 l del ltimo tubo. 15)Pipetear 25 l de hemates que correspondan y mezclar. 16)Incubar 5 minutos. 17)Centrifugar a 400xg 15 segundos. 18)Dispersar el pellet y determinar aglutinacin. Anotar en la tabla. 19)El ttulo del antisuero ser la inversa de la mxima dilucin aglutinante. Tabla de resultados HEMATES A PLASMA Plasma 1 Plasma 2 Plasma 3 Plasma 4 Plasma 5 Titulacin Dilucin: Aglutinacin (++, +, +/- ,- ) B 0

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

PROFESOR Eptopos ABO se encuentran en muchas otras clulas aparte de los eritrocitos. Se han descrito 11 subgrupos de A. Los ms importantes son A1 y A2. Las diferencias son cuantitativas. Los hemates A1 tienen en membrana aprox. Un milln de copias, mientras que los A2 tienen 250 000. Aproximadamente un 78% de los individuos A son A1 y 22% son A2. La sangre AB tambin puede dividirse en tipos A1B y A2B. Los A o B dbiles darn aglutinacin con anti-A,B pero no con los otros antisueros. Aproximadamente el 1% de las muestras de sangre elegidas al azar contienen

aglutininas que pueden dar anormalidades en la determinacin de anticuerpos sricos. Pueden ser anti A1, anti-H, autoanticuerpos, o sueros de mieloma que producen roleaux o bien anticuerpos adquiridos por transfusiones o de origen materno en nios. En otros casos los anticuerpos pueden no detectarse, por ejemplo en inmunodeficiencias o en ancianos o en recin nacidos. En algunos individuos el gen H est ausente. Este fenotipo h homozigtico se denomina Bombay. Los individuos de fenotipo Bombay tienen ttulos altos de anti-A, anti-B y anti-H en su circulacin. Antgeno A:

Existen variantes dbiles de D denominadas Du que pueden no detectarse en anlisis rutinarios, si se identifican con antiglobulina. No hay peligro ya que los individuos Rhno se sensibilizan con eritrocitos Du positivos. La mayora de los antgenos sanguneos restantes raras veces participan en reacciones transfusionales. Los anticuerpos contra los sistemas Kidd, Duffy, Kell y MNS pueden originar hemlisis si un individuo sensibilizado recibe sangre positiva para estos antgenos. En general, los anticuerpos hemolticos son IgG y reaccionan a 37 C. Casi nunca producen hemlisis los anticuerpos IgM o de reaccin en fro. Los antgenos Rh estn tan separados en la membrana de los RBC que los Ac IgG anti Rh no fijan complemento ni aglutinan los eritrocitos Rh(+). Lisan los RBC por opsonizacin. Para detectarlos se emplea anti IgG humana (test de Cooms indirecto) si aglutinan los IgM. En general, estas pruebas de aglutinacin se llevan a cabo en solucin salina. Se sabe que esto disminuye la sensibilidad a la hora de detectar anticuerpos IgG debido a las fuerzas inicas de repulsin entre los eritrocitos. Para incrementar la sensibilidad puede aadirse albmina o solucin de baja fuerza inica o polibreno o tratar a los hemates con enzimas.

La mejor prctica transfusional es dar sangre isogrupo siempre (clulas, plasma y plaquetas). Cuando esto no se puede, los receptores A o B pueden recibir hemates O y los AB de cualquier grupo. Los receptores O slo reciben hemates O. El plasma con anti-A o anti-B raramente causa problemas salvo en nios muy pequeos. El plasma O es ms probable que cause problemas y debe ser la ltima eleccin en pacientes de grupo distinto del O. Para concentrado de plaquetas (que tienen ABH y aprox. 50 ml de plasma) se siguen las mismas indicaciones que para hemates. FRECUENCIAS Grupo sanguneo A B AB O Rh negativo Frecuencia (%) en caucsicos USA 40 11 4 45 15 Frecuencia (%) en asiticos USA 28 27 5 40 Menor del 15% Frecuencia (%) en negros USA 27 20 4 49 Menor del 15%

ISOINMUNIZACIN Rh La prevalencia de la formacin de Ac anti Rh depende de la dosis de clulas recibida. 1ml de clulas sensibiliza al 15% de individuos expuestos, mientras que 250 ml sensibilizan al 60-70%. Despus de la exposicin, tan pronto como a las 4 semanas, se detectan ac IgM dbiles, seguido de una conversin rpida a IgG. Una segunda exposicin a tan solo 0.03 ml de eritrocitos puede desencadenar una formacin rpida de IgG. La enfermedad hemoltica del RN ocurre por paso de sangre del feto Rh+ a la madre Rh- (durante el embarazo o durante el parto). Los Ac IgG pueden atravesar la placenta produciendo la hemlisis de los eritrocitos fetales. Inmunizacin Rh se presenta en el 8-9% (16% segn Rosen) de las mujeres Rh- tras el parto del primer hijo Rh+ ABO-compatible y en el 1.5-2% (7% segn Rosen) cuando el hijo Rh+ es ABO-incompatible. La inmunizacin Rh puede evitarse casi totalmente si se administra una dosis alta de anti Rh (RhIg) a las 28 semanas de gestacin (300 g, que no elevan el ttulo de anti Rh materno por encima de 1/4 y no daa al feto) y a las 72 horas del parto (o de la dosis potencialmente sensibilizante de clulas Rh+). Una dosis de 300 g de RhIg intramuscular previene la inmunizacin por exposicin a hasta 30 ml de clulas Rh+. Puede utilizarse como profilaxis en casos de aborto o amniocentesis. La administracin de RhIg a mujeres embarazads no tiene efecto perjudicial para el feto. Una vez que el individuo est inmunizado, la administracin de RhIg es ineficaz.