Microbiology

Gram Stain & Acid Fast Stain

Gram Stain: Introduction

Interpretation Staining Procedure Theory Microscopy

Interpretation Clinical Signifance

Gram stain results can have dramatic effect on patient care. Hospitalization may be required when the Gram stain results indicate bacteria are present in a normally sterile body fluid. The initial choice of antibiotic therapy is guided by the Gram stain results.

Gram Stain

The Gram stain is a technique for staining and detecting bacteria and yeast. It is one of the most commonly performed procedures in the clinical microbiology laboratory.

Gram Stain: Procedure

Four reagents are used to perform a gram stain: crystal violet, Gram's Iodine, acetone - alcohol, and safranin.

Direct Smear Preparation

If the specimen is received on a swab, gently role the swab on a clean glass slide to avoid rupturing host cells. Allow to air dry.

Direct Smear Pap

If the specimen is a fluid, place a drop of fluid on a clean glass slide and allow to air dry. *In both cases, the specimen is fixed to the glass slide by passing it a few times over a flame.

Control Slide

Fishers Band Gram Slide has control Gram positive cocci and Gram Negative rods.

Staining Procedure

Step 1. Flood the slide with crystal violet for 1 minute. Rinse with water. Step 2. Flood the slide with Gram's iodine for 1 minute. Rinse with water.

Staining Procedure

Step 3. Decolorize the slides by gently rinsing with an acetone - alcohol solution for 1 to 10 seconds dependent on content of acetone in solution. Rinse with water. step4. Flood the slide with saffranin, the counterstain, for 1 minute. Rinse with water and dry air.

Theory: Cell Wall Construction

Gram positive and gram negative bacteria stain differently because of the structure of their cell walls. Gram - positive bacteria and yeasts stain purple. Gram negative bacteria and host cells stain pink.

Microscopy

Proper adjustment of the microscope is essential.

Microscopy

Scan slide on low power (10X) to find the best area of the slide. Than go to oil immersion (100X)

Scan slide on low power 10X: Many Neutrophils seen

Oil (100X): Neutrophils with gram positive cocci

Focusing Technique

Focusing techniques: Often it is necessary to focus through a specimen since organisms, and cells can be found on different planes.

Oil (100X): Slide shows neutrophils and gram positive cocci.

Morphology

Bacteria Host Cells: WBC's Macrophages, RBC's, Epithelial Cells

Yeast Artifact

Gram Positive Rods

Gram positive rods can be found in found in 4 clinically significant forms o long, wide o lonf, narrow o coccobacillus o Branched

Gram Positive Rods

Gram Positive Rods

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Gram Negative Rods

Gram negative rods can be present in 5 Clinically significant forms: o Long and narrow o Coccobacillus o Curved o Fusiform o Spiral

Gram Negative Rods

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Gram Negative Rods

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Mixed Populations Avian Stool, Gram stained 80% Gram positive rods 20% Gram negative rods

Find the Gram positive and Gram negative rods in this field.

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Gram negative spiral rods (spirochetes)

click on icon

Gram positive Cocci: a spherical bacterium Gram positive Cocci may be present as:

diplococci - pairs Chains of cocci Tetrad appear as a cluster of exactly four cocci Cluster - Groups of cocci with variable numbers

Bacteria: Gram positive Cocci

Gram positve Cocci

Diplococci

Clusters

Gram positive Cocci

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Gram positive Cocci

Gram positive cocci in cluster (top black arrow)

Gram positive cocci in tetrad formation (botton black arrow)

Gram Negative Cocci

Diplococci Do not form typically chains or clusters

Host Cells

Epithelial Cells Stain Gram Negative White Blood Cells

Yeast

Stains Gram Positive Can be budding or in branching hyphae form

Artifact Crystal violet precipitate on epithelial cell: May be confused with Gram positive cocci.

Crystal violet precipitate crystal on gram stain.

Underdecolorization

Neutrophils that should stain pink are underdecolorized at acetone alcohol step and stained purple

underdecolorized neutrophils

Overdecolorization

Part of this slide (pink area) has been overdecolori zed with the acetone alcohol giving the false impression of gram negative rods being present.

Reporting Results

Use systematic, descriptive terminology to report gram stain results. * For example, this Gram stain is properly described as "Gram positive cocci (clusters) and white blood cells present.

Reporting Results: Avian Stool Avian Gram Stain Report percentages of Gram positive, Gram negative bacteria and yeast.

Normal Psittacine stool consist of 95% gram positive rods and cocci and up to 5% gram negative rods. Occasional yeast is normal.

Gram Stain: Normal Avian (Psittacine) Stool

Normal Psittacine: 100% gram positive rods and cocci. No yeast seen.

Avian Stool: Increased numbers of Gram negative rods

Abnormal Avian gram stain: 50% Gram negative rods 50% Gram positive rods

Reporting Results

* It is NOT possible to determine the species of bacteria from Gram stain results alone! Difinitive identification requires culture and biochemical testing.

Acid fast stain: Ziehl Neelson Method

Procedure Morphology

Acid fast Organisms

Contains waxlike lipoidal material affecting staining quality. Carbolfuchsin is primary stain. Acid fast organisms resist decolorization with acid alcohol. After decolorization, methyelene blue is added to organisms to counterstain any material that is not acid fast.

Ziehl Neelsen Acid fast Stain method

Acid Fast Organisms on wrights stain

Acid Fast Stain: Ziehl neelsen method

Acid fast organisms stain red. Non acid fast organisms and tissue cells stain blue.

Acid fast stain: Cryptosporidium

Vida intrauterina de la semana 3-4

Blstula

Capas Germinativas

Somitas

Arcos branquieles

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sbado 3 de septiembre de 2011

El transporte activo a travs de la membrana celular

Los mecanismos que permiten a las sustancias cruzar las membranas plasmticas son esenciales para la vida y la comunicacin de las clulas. Para ello, la clula dispone de dos procesos: 1. Transporte pasivo: cuando no se requiere energa para que la sustancia cruce la membrana plasmtica 2. Transporte activo: cuando la clula utiliza ATP como fuente de energa pasa hacer atravesar la membrana a una sustancia en particular

TRANSPORTE PASIVO
Los mecanismos de transporte pasivo son: Difusin simple Osmosis Ultrafiltracin Difusin facilitada

Difusin Simple
Las molculas en solucin estn dotadas de energa cintica y, por tanto tienen movimientos que se realizan al azar. Ladifusin consiste en la mezcla de estas molculas debido a su energa cintica cuando existe un gradiente de concentracin, es decir cuando en una parte de la solucin la concentracin de las molculas es ms elevada. La difusin tiene lugar hasta que la concentracin se iguala en todas las partes y ser tanto ms rpida cuanto mayor sea energa cintica (que depende de la temperatura) y el gradiente de concentracin y cuanto menor sea el tamao de las molculas. Algunas sustancias como el agua, el oxgeno, dixido de carbono, esteroides, vitaminas liposolubles, urea, glicerina, alcoholes de pequeo peso molecular atraviesan la membrana celular por difusin, disolviendose en la capa de fosfolpidos. Algunas sustancias inicas tambin pueden cruzar la membrana plasmtica por difusin, pero empleando los canales constitudos por protenas integrales llenas de agua. Algunos ejemplos notables + + ++ son el Na , K , HCO3, Ca , etc. Debido al pequeo tamao de los canales, la difusin a travs de estos es mucho ms lenta que a travs de la bicapa fosfolipdica

Osmosis
o Es otro proceso de transporte pasivo, mediante el cual, un disolvente - el agua en el caso de los sistemas biolgicos - pasa selectivamente a travs de una membrana semi-permeable. La membrana de las clulas es una membrana semipermeable ya que permite el paso del agua por difusin pero no la de iones y otros materiales. Si la concentracin de agua es mayor (o lo que es lo mismo la concentracin de solutos menor) de un lado de la membrana es mayor que la del otro lado, existe una tendencia a que el agua pase al lado donde su concentracin es menor. El movimiento del agua a travs de la membrana semi-permeable genera un presin hidrosttica llamada presin osmtica. La presin osmtica es la presin necesaria para prevenir el movimiento neto del agua a travs de una

membrana semi-permeable que separa dos soluciones de diferentes concentraciones. La smosis puede entenderse muy bien considerando el efecto de las diferentes concentraciones de agua sobre la forma de las clulas. Para mantener la forma de un clula, por ejemplo un hemate, esta debe estar rodeada de una solucin isotnica, lo que quiere decir que la concentracin de agua de esta solucin es la misma que la del interior de la clula. En condiciones normales, el suero salino normal (0.9% de NaCl) es isotnico para los hemates. Si los hemates son llevados a una solucin que contenga menos sales (se dice que la solucin es hipotnica), dado que la membrana celular es semi-permeable, slo el agua puede atravesarla. Al ser la concentracin de agua mayor en la solucin hipotnica, el agua entra en el hemate con lo que este se hincha, pudiendo eventualmente estallar (este fenmeno se conoce con el nombre de hemolisis. Por el contrario, si los hemates se llevan a una solucin hipertnica (con una concentracin de sales superior a la del hemate) parte del agua de este pasar a la solucin producindose el fenmeno de crenacin y quedando los hematis como "arrugados".

Ultrafiltracin
En este proceso de transporte pasivo, el agua y algunos solutos pasan a travs de una membrana por efecto de una presin hidrosttica. El movimiento es siempre desde el rea de mayor presin al de menos presin. La ultrafiltracin tiene lugar en el cuerpo humano en los riones y es debida a la presin arterial generada por el corazn. Esta presin hace que el agua y algunas molculas pequeas (como la urea, la creatinina, sales, etc) pasen a travs de las membranas de los capilares microscpicos de los glomrulos para ser eliminadas en la orina. Las protenas y grandes molculas como hormonas, vitaminas, etc., no pasan a travs de las membranas de los capilares y son retenidas en la sangre.

Difusin facilitada
Algunas molculas son demasiado grandes como para difundir a travs de los canales de la membrana y demasiado insolubles en lpidos como para poder difundir a travs de la capa de fosfolpidos. Tal es el caso de la glucosa y algunos otros monosacridos. Esta sustancias, pueden sin embargo cruzar la membrana plasmtica mediante el proceso de difusin facilitada, con la ayuda de una proteina transportadora. En el primer paso, la glucosa se une a la protena transportadora, y esta cambia de forma, permitiendo el paso del azcar. Tan pronto como la glucosa llega al citoplasma, una kinasa (enzima que aade un grupo fosfato a un azcar) transforma la glucosa en glucosa-6-fosfato. De esta forma, las concentraciones de glucosa en el interior de la clula son siempre muy bajas, y el gradiente de concentracin exterior --> interior favorece la difusin de la glucosa. La difusin facilitada es mucho ms rpida que la difusin simple y depende: del gradiente de concentracin de la sustancia a ambos lados de la membrana del nmero de protenas transportadoras existentes en la membrana de la rpidez con que estas protenas hacen su trabajo

La insulina, una hormona producida por el pncreas, facilita la difusin de la glucosa hacia el interior de las clulas, disminuyendo su concentracin en la

sangre. Esto explica el porqu la ausencia o disminucin de la insulina en la diabetes mellitus aumenta los niveles de glucosa en sangre al mismo tiempo que obliga a las clulas a utilizar una fuente de energa diferente de este monosacrido.
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domingo 21 de agosto de 2011

Tcnicas de tincin

Tincin de Gram
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial que se aplica en la microbiologia para la visualizacin de bacterias, se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y las bacterias que se visualizan de color rosa o rojo se les considera bacterias Gram negativas.

Materiales y reactivos
Pipeta Pasteur. Porta y cubre objetos. Cristal violeta. Lugol. Alcohol-cetonico Safranina. Microscopio. Aceite de inmersin. Mechero Fisher.

Metodologa

Recoger muestras. Hacer el extendido en espiral. Dejar secar a temperatura ambiente. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.) Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las clulas gram positivas y gram negativas se tien de color azul-purpura.

Enjuagar con agua. Agregar lugol y esperar entre 1 minuto. Enjuagar con agua. Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la coloracion) Enjuagar con agua. Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar 1-2 min Este tinte dejar de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.

Enjuagar con agua.

Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin.

Tincin de Ziehl Neelsen

La tincin de Ziehl Neelsen es una tcnica de tincin diferencial rpida y econmica,y se aplica para la identificacin de microoganismos patgenos.

Fundamento

Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin de los cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tincin de contraste.

Tcnica

Esta tcnica puede realizarse tanto en muestras histolgicas como citolgicas.

Metodologa

Para demostrar la presencia de BAAR en cortes de tejido en parafina.Los reactivos necesarios para su realizacin son los siguientes: 1. cido peridico 58% 1. carbol fucsina de Ziehl (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado: 1. 0,5 g fucsina bsica 2. 50 cc agua destilada

3. 5 cc etanol absoluto 1. 1. 28,5 g cristales de fenol derretidos 2. hematoxilina 3. alcohol cido 1%: 1. alcohol de 35 2. cido clorhdrico El procedimiento es el siguiente: 1. desparafinar e hidratar los cortes 2. cido peridico 5%, 10 min 3. lavar con agua destilada 4. fucsina fenicada, 15 min 5. decolorar en alcohol cido al 50% 6. lavar con agua destilada 7. hematoxilina, 10 min 8. azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio 9. deshidratar, aclarar y montar preparaciones.

Tincin Hematoxilina-eosina

La tincin hematoxilina-eosina corresponde a la mezcla de hematoxilina y eosina. La tincin hematoxilina y eosina es uno de los mtodos mas populares de tincin utilizado en histologa y medicina diagnostica. El mtodo supone la aplicacin de la tincin de hematoxilina, que por ser catinica o bsica, tie estructuras cidas (basfilas) en tonos azul y prpura,como por ejemplo los ncleos celulares; y el uso de eosina que tie componentes bsicos (acidfilos) en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza aninica o cida, como el citoplasma.

Tcnica

Sumergir los preparados histolgicos en xilol para eliminar los excesos de parafina. Luego pasan por una serie de alcoholes (100. 95 y 70). Se lava en agua para eliminar exceso de alcohol Se sumerge en hematoxilina por 10 minutos, luego se lava en agua para eliminar excesos y se pasa rpidamente por alcohol cido. Se lava nuevamente Se sumerge 30 segundos en eosina. Se pasa por otra serie de alcoholes, en orden creciente (70, 95 y 100). Finalmente se deja remojar 10 minutos en xilol, antes de realizar el montaje final.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA. UNIDAD 1 BACTERIAS . INTRODUCCIN: Los microorganismos pueden ser eliminados, inhibidos o muertos por agentes fsicos o qumicos. Se dispone actualmente de una gran variedad de tcnicas y agentes que actan de manera diferente y cada uno tiene sus propios limites de aplicacin de practica. Entre los agentes fsicos ms utilizados estn el calor, la presin, la radiacin, los filtros y el ultrasonido. Entre los agentes qumicos se encuentran los compuestos de cloro, yodo, fluor y bromo; metales pesados como el mercurio; as mismo alcoholes, fenoles, aldehdos y cetonas entre otros. La eleccin del mtodo de esterilizacin depende de la naturaleza del material que va a ser tratado. Esterilizacin por autoclave. El autoclave es un instrumento para hervir el agua bajo presin. Es un cilindro de metal, horizontal o vertical con una tapa tambin de metal que puede ser cerrada mediante pestillos o cerrojos sobre una arandela de goma. Est provista de una llave de vapor, un manmetro y una vlvula de seguridad. El agua hierve en el cilindro ya sea mediante quemadores exteriores de gas o por calentador elctrico de inmersin. La tapa se atornilla y la llave de vapor se deja abierta, cerrndose cuando ya haya sido desplazado todo el aire, puesto que en caso contrario la presin leda sobre el manmetro indicara la presin del aire, ms presin de vapor y la temperatura obtenida seria la que corresponde nicamente al vapor. Cuando se cierra la vlvula de vapor se eleva la presin y es usual fijar la vlvula de seguridad para que se abra a 15 libras , que corresponde a una temperatura de 121 C. Esterilizacin por aire caliente. Las estufas de aire caliente esterilizan por calor seco, por deshidratacin de las clulas. El aire no es buen conductor del calor y este tipo de esterilizacin supone problemas de penetracin. El calentamiento puede ser por gas o por electricidad, pero en todos los casos la estufa debe tener un ventilador fijado en su parte superior, ya que si no, la temperatura puede variar considerablemente en puntos distintos del interior. Se precisan temperaturas de 160 - 180 C que pueden ser mantenidas con un termostato de gas sencillo, que darn unas diferencias de unos 5 C. El horno no elctrico es mucho mas limpio que el de gas. FORMAS BSICAS DE LAS BACTERIAS. Cocos Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao

form Divisin a lo largo del mismo plano, formando cadenas a cortas esfri ca: 2 cocos juntos: se Diplococos llama

Divisin a lo largo de 2 planos diferentes: Ttradas

Divisin a lo largo de 3 planos 4 - 20 en cadenas: Estreptococos regularm irregular ente: mente: Sarcinas Estafiloco

Coco Bacilos grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

cos

Forma de vara: se llaman Bacilos

Dos bacilos juntos: Diplobacilos

Cadenas de bacilos: Estreptobacilos

Empalizadas, Bacilos lado con lado o en figuras en X, V o Y

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Forma espiral rgida se llama: Espirilo

Si la espiral es flexible y ondulada se llama: Espiroqueta

Utilizamos el trmino Pleomorfismo para referirnos a la adopcin de diferentes formas en una misma especie. Tcnicas de tincin. Fundamentos. El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehdo, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el

cido tnco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas. Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente. Bacteria Gram Positiva Bacteria Gram Negativa

PRACTICA # 1 PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DEL MATERIAL PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA. OBJETIVO: El alumno aprenda la tcnica para la preparacin y esterilizacin del material de laboratorio usado en microbiologa. MATERIALES Y REACTIVOS: 11 Pipetas de 1 ml o 2 ml. 10 Tubos de ensayo sin tapn ( que cubra 1/3 del tubo de 10 ml ). 1 Pipeta de 10 ml. 1 Clip.

1 Gradilla. 1 Vaso de p.p. de 100ml o 250 ml. 1 Matraz erlenmeyer de 500 ml. 1 Probeta de 100 ml. 1 Mechero fisher. Agar. Algodn Alcohol Cinta adhesiva de papel. Papel dextrasa. Gasa. MTODOS: Preparacin para la elaboracin de los gorros. Para tener una base para el calculo del gorro, tenemos que aproximadamente con un pliego de papel dextrasa de tamao carta, se obtiene un gorro adecuado para tapar un matraz de 500 ml. Los pasos principales para la elaboracin de ellos ( figura no. 1.1 ) es la siguiente: Se corta el papel dextrasa en forma de rectngulo, del tamao segn se necesita. Se dobla el papel a la mitad con respecto a la parte larga del mismo. Se doblan las puntas superiores, segn indica la figura unindolas por el centro. De la parte inferior se dobla hacia arriba al borde de la hoja que queda encima, hasta la altura de las puntas unidas y se le da media vuelta al papel. Se doblan las puntas de los lados, hasta la altura donde sobre sale el doblez del inciso no. 4, segn indica la figura. de la parte inferior se dobla hacia arriba , el borde sobresaliente de la hoja hasta el doblez interior. se le da media vuelta al papel obtenindose de esta manera el gorro. Elaboracin de tapones de algodn. Los tapones son utilizados en los diferentes tamaos de tubos y matraces, por lo que el procedimiento presentado en la figura no. 1.2 es una forma generalizada del proceso. Como base para la elaboracin: con una tira de algodn de ( 15 - 20 cm de largo, 3 cm de ancho y un grosor de 0.5 cm ) aproximadamente , y con una gasa de 10 x 10 cm, se obtiene un tapn adecuado para un matraz de 500 ml.

Los principales pasos para la elaboracin de tapones de algodn ( figura no. 12 ) se describen a continuacin: Se corta una tira de algodn, de largo adecuado a las necesidades ( ya sea para los tubos de ensayo o para el matraz de 500 ml ) Con una pinza de diseccin se prensa uno de los extremos. Se enrolla el algodn en la pinza, de una manera que quede firme el enrollado. Por otro lado, se corta el cuadro de gasa adecuado al tamao requerido y se coloca en la boca ( en el del matraz o de los tubos de ensayo ), procurando centrarlo. Con la pinza y el algodn enrollado en ella, la gasa se presiona hacia adentro del matraz, de manera que entre uniformemente por todos lados a la boca de este, dejando a flote la punta superior del algodn. La pinza es sacada del algodn dando una vuelta en sentido contrario al enrollado para que afloje, y jalando hacia arriba presionando el algodn para que no salga de la boca del matraz o de los tubos de ensayo. Hasta este paso, deben quedar cuatro puntas de la gasa colgado a los lados de la boca del matraz: dos de las puntas que se encuentran opuestamente, se amarran entre si formando un lazo. Luego se amarran las otras dos puntas restantes, obtenindose de esta manera el tapn de algodn. Preparacin y envolturas de pipetas. La preparacin de las pipetas para su esterilizacin es sencilla; se lavan perfectamente con agua y jabn y se secan por 10 minutos en la estufa a 100 C. Con un clip se le introduce en la boquilla de succin un filtro de algodn , de forma de que el algodn entre suavemente y sin romperse con la presin del clip. Este tapn tiene una doble funcin, una es para evitar que en un descuido de succin forzada, por obstruccin de la pipeta, ingiera el alumno el producto succionado al destaparse bruscamente, y la segunda razn es para evitar que por la boquilla de succin entren microorganismos que alteren el trabajo realizado. Se corta una tira de papel dextrasa de aproximadamente 5 cm de ancho y 30 cm de largo. Se dobla el extremo inferior aproximadamente 2 cm. Se coloca la pipeta con la punta a la mitad del doblez anterior y con un ngulo de aproximadamente 25 - 30 grados de inclinacin con respecto a la posicin del papel dextrasa. Se le hace un segundo doblez , tapando la punta de la pipeta con la porcin de papel que sobresale a la punta de la pipeta. Se le hace un tercer doblez a la punta de la pipeta que queda en el ngulo de inclinacin, tal como se representa en la figura no. 1.3 de manera que cubra completamente la punta de la pipeta. Se d vuelta a la pipeta procurando que el papel vaya envolvindola en forma de espiral. Verificar que el enrollado no quede flojo, en caso de estarlo, reafirmar el papel con respecto a la forma de la pipeta. En la parte superior, doblar hacia abajo el papel sobresaliente. Cubrir con cinta adhesiva dicho doblez. Procedimiento para la envoltura de cajas de Petri.

Al utilizar cajas de Petri en los cultivos microbianos, tienen que ser esterilizadas para poder vaciar dichos medios de cultivo que servirn de nutriente a los microorganismos tratados. Estas cajas se pueden esterilizar por calor hmedo o calor seco, siendo ms recomendable el calor seco, por ser ms confiable su efectividad. Es necesario envolver las cajas Petri antes de esterilizarlas para evitar que al trmino de la esterilizacin estn expuestas al medio ambiente y se contaminen de nuevo. Para esterilizarlas se puede utilizar un recipiente cilndrico de metal o envolvindolas en papel dextrasa. La manera de envolver las cajas se representa en la figura 1.4 y se describe a continuacin: Se corta papel dextrasa, de tamao adecuado para el nmero de cajas que se deseen envolver y se colocan las cajas en el centro del papel. los bordes de los costados se unen al centro cubriendo las cajas que se envuelven. en la parte superior se unen los bordes de ambos lados y esta unin se dobla a la mitad, tal como se indica en la figura 1.4. Se hace un segundo doblez, quedando recargado ste sobre las cajas. Al papel se le presiona a los costados quedando al relieve el volumen de las cajas envueltas en el papel. se doblan las puntas del papel de cada una de las esquinas al centro, segn como se indica la figura. Se le d vuelta al material, quedando el doblez hacia abajo. Las puntas salientes del papel en los lados de las cajas se doblan hacia arriba y al centro de las cajas y se les asegura con cinta adhesiva. Preparacin del agar nutritivo para las bacterias. El frasco de agar dice 23 g/l. Y nosotros queremos preparar aproximadamente 200 ml, ya que cada caja se le va a vaciar aproximadamente 15 a 20 ml. Se va a pesar 4.6 gr de agar nutritivo en la balanza granataria. Se agregan inicialmente 50 ml de agua al matraz de 500 ml y se le agrega el agar, luego se le vaca el agua que es otros 50 ml sobre el papel ya que se puede quedar pegado el agar en el papel, despus se agregan los 100 ml de agua restantes. Entonces con un mechero se pone a calentar el agar que hay en el matraz, dndole vueltas sobre la llama del mechero, hasta que quede transparente a eso se le llama clarificar el agar. Se deja enfriar y se pone en una olla de presin, para que se esterilice el agar y poder vaciarlo en las cajas, una vez que haya llegado a 121 C y 15 lbf / in2 se comienza a contar 15 minutos y dejar enfriar. Luego se agarra el matraz y no este muy caliente, pero tampoco fri ya que puede gelificarse, se prende el mechero y hay un rea aproximadamente de 30 cm alrededor del mechero estril, se ponen las cajas boca abajo y se agarra una , se destapa el matraz se flamea la boca del mismo y se vaca en la caja aproximadamente 15 ml, se cierra la caja y se asienta hasta que gelifique. Una vez que se hayan vaciado todas las cajas el agar, se espera a que gelifique, se ponen boca abajo y se envuelven con papel dextrasa o vitafilm y se guardan en el cuarto fro. Preparacin de la solucin salina al 0.85% para los tubos de ensayo.

El peso del sodio es de 23 gr y el peso molecular del cloro es de 35.5 gr., Entonces el peso total de la muestra para preparar 1 litro de solucin es de 58. 5 gr., pero se necesita que la solucin este a 0.85% y se le va agregar a cada tubo 9 ml , como son 10 tubos son 90 ml, pero se necesita que este al 0.85%, entonces se hacen los siguientes clculos: Se pesan 0.04475 gr de NaCl y se diluye en 90 ml de agua, luego se vaca en cada tubo 9 ml de la solucin salina y se pone en la olla de presin para que se esterilice la solucin. PRACTICA # 2 AISLAMIENTO DE BACTERIAS. OBJETIVO: Que el alumno aprenda la tcnica para separar a las bacterias de los dems microorganismos que se encuentran en la muestra que haya trado. MATERIAL: 10 tubos de ensayo con la solucin salina previamente esterilizada. 11 pipetas estriles de 1 ml. 1 varilla de vidrio. 6 cajas de Petri con agar nutritivo. MTODO: Lo primero que se tiene que hacer es limpiar muy bien el rea de trabajo, se le pasa un trapo seco y limpio para poder quitar todo el polvo de las mesas, luego se roca con alcohol al 70% y se para el trapo, se lavan bien las manos antes y despus de trabajar con las bacterias ya que pueden ser patgenas. Lo que se debe hacer para poder aislar las bacterias es; (si es un liquido se agarra 1 ml de la muestra directamente y si es un slido, se pesa 1 gr y se diluye en agua), con una pipeta estril se toma 1 ml de la solucin y se vaca en el primer tubo con solucin salina previamente flameada la boca del tubo y en rea estril, entonces ya se tienen 10 ml, luego con otra pipeta estril, se toma 1 ml del tubo donde se agreg la muestra ( pura) y se pone en el otro tubo, luego se agarra otra pipeta estril, se destapa el tubo se flamea la boca del tubo anterior, se agarra 1 ml de la muestra, se tapa, tomas el siguiente tubo le quitas el tapn lo flameas y le agregas la muestra, lo vuelves a flamear y lo tapas de nuevo, y as sucesivamente hasta terminar lo 10 tubos. Una vez que se haya puesto la muestra en los 10 tubos, el se agarran 3 tubos el ms diluido, el menos diluido y uno de en medio de los dos. Entonces lo que se va hacer es poner las bacterias en las cajas de petri con agar para que crezcan, esto se hace por separado. Esto se hace por duplicado. Primero se agarra el mas diluido, se toma 0.1 ml de la muestra el tubo y se pone en la caja de petri, la varilla de vidrio se remoja en alcohol y se pasa en la flama, luego se deja que se enfri por 10 segundos y se esparce la muestra por toda la caja, luego se agarra el tubo de en medio y se toma 0.1 ml de la muestra, se pone en la caja de petri y se hace el mismo procedimiento con la varilla de vidrio y despus se esparce por toda la caja. Por ultimo se toma el tubo que tiene mas muestra de los tres, se agarra 0.1 ml de la muestra y se pone en la caja de petri, se agarra la varilla de vidrio y se esparce por toda la caja. Una vez terminado el trabajo, se flamea muy bien la varilla de vidrio, se envuelven las cajas ya sea con papel dextrasa o vitafilm y se guarda en la gaveta para esperar que crezcan las bacterias.

Se supone que en la primera caja que es la menos diluida debe haber ms colonias de bacterias que en las otras dos cajas. Por ejemplo: 30 colonias, 10 diluciones y se agarro el tubo mas diluido 1010. 30 x 10 x 1010 = esto nos da el no. De clulas viables por mililitro de solucin. PRACTICA # 3 PURIFICACIN DE LA CEPA BACTERIANA OBJETIVOS: Escoger una cepa bacteriana y purificarla hasta que no tenga una contaminacin alguna u otra bacteria en la caja. MATERIALES: 6 cajas de petri con la muestra antes sembrada. Asa de siembra. 2 cajas de petri nuevas con agar. METODOLOGA: El asa de platino se expone a la flama del mechero hasta quedar al rojo vivo. Se coloca el asa de 10-15cm de la flama del mechero, es decir dentro del rea estril esperando aproximadamente de 10 a 20 segundos para que se enfri Se toma una caja con la cepa madre, toco la colonia la cual ya se debi haber marcado. Alzar a la altura de la llama del mechero una caja Petri de agar nutritivo, utilizando la mano contraria con la que se tiene levantada el asa de platino y elegir un punto en el cultivo, el cual le pondremos punto 1 y comenzamos a hacer una serie de estras. Se flamea el asa en la llama del mechero hasta el rojo vivo. Se le da un pequeo giro a la caja de Petri de tal forma que la punta de la ltima estra de la serie anterior, quede a modo para hacerse la siguiente serie de estras (punto 2). Tocando el punto 1 solo dos veces al comenzar a estriar. Se aplica el inciso 5 y se da de nuevo el pequeo giro, para comenzar a estriar en la ltima estra del punto 2, igual solo se toca solo9 dos veces al comenzar a estras, el punto3. Se repite el inciso 5 y 6 solo que ahora es del punto 3 al punto 4 el cual tan solo es un pequeo zigzag, que se realiza teniendo cuidado de no tocar las estras anteriores para no cargar de nuevo carga microbiana, pues el objetivo es lograr colonias separadas. PRACTICA # 4 MORFOLOGA COLONIAL Y MICROSCPICA DE BACTERIAS.

OBJETIVO: El alumno observar las caractersticas microscpicas y microscpicas de la bacteria que se ha aislado. MATERIALES Y REACTIVOS: Microscopio Asa de siembra. Portaobjetos y cubreobjetos. Cultivo a analizar Aceite de inmersin. Cristal violeta. Mechero Fisher. Esptula. Alcohol desnaturalizado. Agua destilada. METODOLOGA: Se realiza una resiembra del cultivo puro para analizar y se inocula durante 24 a 48 horas, es decir el tiempo en el que aproximadamente la bacteria ya a crecido y formado colonias separadas. Despus de las cuales de escoge una colonia aislada; para realizar las observaciones. Para la observacin de las caractersticas macroscpicas se estudia el tipo de colonia formada por la cepa. Para las observaciones microscpicas se procede de la siguiente manera: Se hace un frotis fresco; en un portaobjetos se pone una gota de cristal violeta con ayuda del asa previamente esterilizada; posteriormente se toma una azada de la colonia separada y se extiende sobre el colorante, no demasiado cerca del mechero para evitar que se seque la muestra. Se cubre con el cubreobjetos cuidando que la muestra no se salga por los bordes. Se observa en un microscopio a 10x, 45x, y a 100x utilizando el acebote de inmersin. OBSERVACIN MACROSCOPICA: Edad: 24 horas Tamao de la colonia: aproximadamente de 0.1 a 3 mm Color: pearly gates 47 A - 2P Consistencia: Suave.

Luz transmitida: translucidas Borde: Entero Estructura interna: Homognea Elevacin: Elevada Superficie: Lisa OBSERVACIN MICROSCPICA. PRACTICA # 5 TINCION GRAM

OBJETIVO: El alumno aplicar la tcnica de preparacin de frotis y la metodologa para la tincin Gram. MATERIALES Y REACTIVOS:

Pipeta Pasteur. Porta y cubre objetos. Cristal violeta. Lugol. Alcohol-cetonico Safranina. Microscopio. Aceite de inmersin. Mechero Fisher. Alcohol desnaturalizado Agua destilada. METODOLOGA: PREPARACIN DE UN FROTIS. Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teir (si es lquido) o se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra. Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no est estril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estril para transferir una pequea cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solucin salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeas que pueden perderse en una gota de lquido se emplea una varilla delgada de madera estril con la cual se toca la colonia obtenindose as una fraccin apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no queme. Se prepara un frotis, y se coloca el portaobjetos sobre un vaso de precipitados. A continuacin se tie la muestra: Se le adiciona cristal violeta por un minuto, Se le agrega lugol por un minuto, despus se lava suavemente con un chorro de agua Se le agrega alcohol-cetonico durante 10 o 15 segundos, Se le agrega safranina por un minuto, despus se lava suavemente con un chorro de agua hasta que el agua salga sin colorante. Una vez que la preparacin esta totalmente seca, observar en los objetivos de 10, 45, y 100x, poniendo en este ltimo el aceite de inmersin. PRACTICA # 6

TINCION ACIDO - RESISTENCIA OBJETIVO: El alumno aplicar la tcnica de tincin de Ziehl - Neelsen para determinar la cido resistencia de la bacteria aislada. MATERIALES Y REACTIVOS: Pipeta Pasteur. Porta y cubre objetos. Vaso de precipitados de 200ml. Soporte universal con arillo. Tela de asbesto. Matraz aforado de 500ml. Asa de platino. Cubre y porta objetos. Fucsina fenicada. Alcohol cido. Azul de metileno. Microscopio. Aceite de inmersin. Mechero Fisher. Alcohol desnaturalizado Agua destilada. METODOLOGA. Preparacin de reactivos. Fucsina fenicada. Formula. Fucsina bsica 5g. Fenol 25g.

Etanol al 95% 50ml. Agua destilada. Forma de prepararlo: Colocar el fenol en 100ml de agua y calentar a ao Maria. Cuando el fenol esta en solucin aadir la fucsina bsica poco a poco para que no forme grumos. Esperar a que enfri y agregar el etanol, mezclar. Aforar a 500ml con agua destilada. Alcohol-cido Formula. cido clorhdrico 3ml. Etanol al 95% Forma de prepararlo: Adicionar lentamente el cido al alcohol y se agita, aforar a 100ml. Azul de metileno. Formula. Azul de metileno 5g. Agua destilada 100ml. Forma de prepararlo: Mezclar el azul y metileno con el agua hasta disolver completamente. Preparacin del frotis fijo y coloracin. En un porta objetos limpio se coloca una gota de agua destilada a la que con el asa de siembra, previamente esterilizada en la llama, se lleva una pequea cantidad de suspensin de las bacterias o en su caso de una colonia. Con el asa se extiende una gota y las bacterias sobre el portaobjetos se espera que seque y se fija la extensin por el calor, pasando dos o tres veces suavemente sobre la llama pero sin calentar demasiado, que lo soporte el dorso de la mano. Coloracin. Cubrir la preparacin con la fucsina, calentar la preparacin en un bao Maria durante 5 min. No debe hervir. Si se evapora colocar mas colorante para evitar que se seque. Lavar con agua el resto del colorante.

Decolorar con la mezcla de alcohol-cido hasta que no caiga mas colorante. Lavar con agua el resto del colorante. Secar la preparacin. Examinar en el microscopio en objetivos de 10, 45, y 100x. Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de cidos teicoicos. cido Lipoteicoico que est en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplsmica. Y cido teicoico de la Pared que est en la superficie y se une slo a la capa de peptidoglicano. El cido Teicoico es el responsable del determinante antignico del organismo. Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. En el lipopolisacrido, la porcin de lpido est embebida en el fosfolpido y el antgeno O polisacrido est en la superficie. El lpido se llama Lpido A y es txico, pero el lipopolisacrido entero se llama Endotoxina. La pared de la clula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplsmica y la pared celular hay un espacio periplsmico con enzimas hidrolticas, enzimas inactivadoras de antibiticos y protenas de transporte.

INFORME N 6