DNA i RNA

izolacija
• Centralna dogma molekularne biologije
DNA RNA PROTEIN
 Prisjetimo se!
• DNA je dvolančana molekula
izgrađena od dva
komplementarna lanca, koja
se na visokoj temperaturi A G
denaturira (razdvajaju se
lanci), a na nižoj se ponovo
može renaturirati (spajaju
se komplementarni lanci)
• RNA je jednolančana
molekula, vrlo je slična DNA T C
• RNA i DNA mogu međusobno
stvarati hibride – spajaju se
komplementarni lanci

U
 …izbor osnovnih metoda…
• Izolacija DNA i RNA
• Lančana reakcija polimerazom (PCR)
• Reverzna transkripcija-PCR (RT-PCR)
• Kloniranje gena
• Southern blot/Northern blot
• Određivanje primarne strukture DNA
(sekvenciranje)
 ZAŠTO IZOLIRAMO DNA i RNA

• Uklanjamo proteine
• Odvajamo DNA od RNA i obrnuto
• Želimo izolirati specifični dio DNA ili
RNA (izolacija ukupne DNA ili RNA je
prvi korak prema tome)
KOJA DNA SE MOŽE IZOLIRATI?
• IZ TKIVA/STANICA:
– GENOMSKA (KROMOSOMI)
– DNA IZ ORGANELA
• IZ VIRUSA
• IZ BAKTERIJA
– GENOMSKA
– PLAZMIDNA DNA
KOJA RNA SE MOŽE IZOLIRATI?
• UKUPNA
• mRNA
– Izbor ovisi o cilju eksperimenta (mRNA je
2-5% ukupne RNA)
– Za izolaciju mRNA potrebno je dodatno
pročišćavanje koristeći karakteristiku
mRNA da imaju polyA tail
 TIPOVI METODA
• 1) Temeljeni na razlikama u topivosti
– A) Namatanjem na štapić (samo DNA)
– B) Pročišćavanjem fenol-kloroform-izoamilnim
alkoholom (DNA i RNA)
• 2) Metode temeljene na adsorpciji na kolone
(DNA i RNA)
• 3) Metode centrifugiranja u gradijentu
gustoće CsCl (gotovo su je u potpunosti
zamijenile kolone) (DNA i RNA)
1)A)IZOLACIJA DNA NAMATANJEM NA ŠTAPIĆ
1)B)IZOLACIJA DNA FENOLOM
• DEPROTEINIZACIJA se postiže
razgradnjom PROTEINAZOM K i
ekstrakcijom organskim otapalima
– Proteinaza K razgrađuje proteine
– Ekstrakcija fenol-kloroform-izoamilni
alkohol,
• Za DNA uravnoteženo i nadsvođeno
0,1M Tris puferom pH 8
• Za RNA uravnoteženo H2O kiseli PH
Fenol denaturira proteine, kloroform
čuva fenol od oksidacije i uklanja
lipide, izoamilni alkohol sprječava
pjenjenje uzorka
• TALOŽENJE DNA i RNA
(PRECIPITACIJA)
• TALOŽENJE DNA i RNA (PRECIPITACIJA)
– DNA i RNA se taloži u mješavini vode i alkohola u
prisutnosti soli
– Konačne koncentracije soli: 0.8M LiCl, 0.3-0.5M
NaCl, NaOAc, ili 2.5M NH4Ac
– Alkohol (30%-50% konačna koncentracija
izopropanola; 60%-80% konačna koncentracija
etanola)
– Taloženje se pospješuje kratkim držanjem pri
–20°C ili –70°C, iza čega slijedi centrifugiranje
– Uklanjanje istaloženih soli postiže se“pranjem”
taloga s 70% alkoholom, ponovno se centrifugira, a
talog se suši i otapa u pogodnom puferu
2) ..gomila komercijalno dostupnih kolona; temelje se na adsorpciji DNA/RNA na kolone
 3) METODE IZOLIRANJA u
3) gradijentu CsCl

• Gradijent CsCl ukupne DNA

izolirane iz stanica kvasca.
Mitohondrijska DNA je A/T
bogata (80%) pa se smješta
u područje manje gustoće
nego kromosomalna DNA. Na
fotografiji je DNA bojana s
Hoechst 33258 (bis-
benzimide), upravo nakon
ultracentrifugiranja (Sorval
Discovery 90SE; 20 hours at
55,000 rpms).
SPECIFIČNOSTI IZOLACIJE RNA
• RNA izolacija je vrlo slična DNA izolaciji; ali
za razliku od DNA fenol je uravnotežen
vodom koja ima kiseli pH
• RNA se, za razliku od DNA, osjetljiva na
razgradnju
• DNaze za svoju aktivnost trebaju metalne
ione pa se mogu inaktivirati s EDTA
• RNase ne trebaju metalne ione zbog
reaktivne 2´ hydroxyl group RNA molekule 
 RNaza A iz pankreasa =
neprijatelj no. 1
• RNase A je endoribonukleaza
sastavljena od jednog
proteinskog lanca
• Rezistentna je na prisutnost
EDTA
• Može preživjeti dugotrajno
kuhanje i autoklaviranje
• Aktivnost joj ovisi o histidinu u
aktivnom mjestu i može se
inaktivirati histidin-specifičnom
alkilirajućem agensu: diethyl
pyrocarbonate (DEPC)
• Druge ribonukleaze (E. coli
RNase I and RNase M) vrlo su
slične RNase A
 Zaštita od RNaza
Egzogenih koje se mogu unijeti tijekom rada

Good working practices

Endogenih koje se oslobađaju iz stanica i tkiva tijekom

ekstrakcije

Uklanjaju se inhibitorima RNazne aktivnosti

Držanjem na ledu tijekom izolacije se smanjuje
njihova aktivnost
 Zaštita od RNaza
• Uvijek koristiti rukavice, na koži se nalazi obilje
ribonukleaza
• Otopine za RNA izolaciju se pripremaju u
autoklaviranom staklenom suđu (gdje je moguće
koristiti novo plastično posuđe)
• Spaliti spatule kod vaganja, kemikalije
autoklavirati nakon pripreme.
• Koristiti za pripremu otopina steriliziranu vodu
• Otopine se mogu tretirati s 0.1% DEPC (dodati
DEPC, ostaviti preko noći na sobnoj temperaturi,
autoklavirati) PAZI!!! DEPC JE JAKO KARCINOGEN!!!
 PROCJENA ČISTOĆE DNA I RNA
spektrofotometrijski

MJERENJE KONCENTRACIJE DNA I

RNA
A260 1.0 ≈ 50 µg/ml
DNA
A260/A280 1.6 - 1.8
A260 1.0 ≈ 40 µg/ml
RNA
A260/A280 ~2.0
 ELEKTROFOREZA
• Electro = protok struje, phoresis, od Grčkog
= nositi kroz
• Gel je koloidna otopina, suspenzija sitnih
čestica u mediju, ima konzistenciju želatine
• Gel elektroforeza je postupak nabijenih
molekula u gelu uz pomoć električne struje
• Nabijene molekule mogu biti DNA, RNA,
proteini...
 ELEKTROFOREZA U AGAROZNOM GELU
• Agaroza – polisaharid dobiven od
morskih algi. Otapa se u puferu,
zagrijava do vrenja, hladi pri čemu
se stvara čvrsta mreža molekula
• Gel elektroforeza u agaroznom gelu
je pogodna za razdvajanje
molekula između 100 bp i 30000 bp
• Gel se treba djelomično ohladiti
prije razlijevanja u kalup; tada se
dodaje etidij bromid (za
vizualizaciju pod UV svjetlom) i
stavlja se “češalj” koji će napraviti
u gelu rupe za nanošenje uzorka
• Pufer (TBE, TAE) osigurava ione koji
omogućavaju vođenje struje
– TAE, pH 8.0, ~50 mM - Tris,
Acetate, EDTA
– TBE, pH 8.0, ~50 mM - Tris,
Borate, EDTA
• Kad se gel stisne uranja se u kadicu
sa istim puferom (submarine gel)
ZAŠTO SE DNA i RNA razdvajaju u gelu?

• DNA i RNA su negativno nabijene (DNA, RNA

za negativno)
• Kad se DNA ili RNA izlože utjecaju
električnog polja one putuju prema
pozitivnoj elektrodi
• Manji fragmenti putuju brže od velikih
(linearna DNA se razdvaja po molekularnoj
težini)
• Razdvajanje i po obliku (ne putuje samo po
molekularnoj težini)
Elektroforeza u agaroznom gelu
Pozitivna elektroda

češalj
pufer Uzorci DNA
u gelu
 NANAŠANJE I PRAĆENJE ELEKTROFOREZE U
GELU AGAROZE

• Nanošenje uzoraka na gel olakšava miješanje

s puferom za nanošenje uzorka u kojem se
nalazi 30% glicerola (dodaje se u omjeru
uzorak : pufer = 1:5)
• Praćenje tijeka elektroforeze omogućuje
vidljiva boja koja se dodaje u pufer za
nanošenje uzorka
• xylene cyanol (kreće se kao fragment od oko 5.0 kb
fragments)
• bromphenol blue (kreće se kao fragment od nekoliko
stotina pb)
• orange G (kreće se kao fragment od oko 50 pb)
 Gel bojan Etidij DNA na agaroznom gelu

bromidom pod UV
svjetlom
• EtBr se interkalira
između baza
• MUTAGEN, SVAKAKO
RUKAVICE!!!!
• Vidljiv jedino pod
UV svjetlom
• Nositi MASKU zbog
UV svjetla!!
 REZOLUCIJA
• % Agarose (w/v) Size Range (kb
prs) for Optimal
Separation

• 0.5 2-30
• 0.75 0.7-20
• 1.0 0.5-10
• 1.5 0.2-3
• 2.0 0.1-2
• 3.0 (Nu-Sieve) 0.07-1.5
• 4.0 (N-S) 0.04-0.9
• 5.0 (N-S) 0.03-0.6
• 6.0 (N-S) 0.01-0.4 0.7% 2.5%

Isti uzorak na gelu različite gustoće

 IZOLACIJA RNA
• UKUPNA RNA
– Najveći dio izolirane RNA otpada na
ribosomalnu RNA: 28S i 18S.
– mRNA čini najmanji dio ukupne RNA.
RNA na agaroznom gelu
Nativna elektroforeza je dovoljna
za procjenu kvalitete RNA

Ocjena kvalitete RNA preparacije je

najbolja na denaturirajućem
agaroznom gelu u koji je dodan
formaldehid jer većina RNA
stvara unutarmolekularne
sekundarne strukture što ih
sprječava da u gelu putuju samo
po veličini

Kod dobre izolacije vrpce RNA

moraju biti oštre.
28S ribosomalna RNA treba biti
dvostrukog intenziteta od vrpce
18S.
 LANČANA REAKCIJA POLIMERAZOM
(PCR)
• Lančana reakcija polimerazom (PCR) (od
engl. polymerase chain reaction) je metoda
umnažanja određenog odsječka DNA u
uvjetima in vitro
• Koristi se u molekularnoj biologiji/medicini,
dijagnostici nasljednih i stečenih bolesti,
dijagnostici patogena, u forenzici…
• Izumitelju ove metode Dr. Kary Mullisu (rad
objavljen 1985. godine) dodjeljena je
Nobelova nagrada 1993. godine
DNA replikacija
 PCR-riječima (1)

• PCR je replikacija DNA u “ependorfici”, što omogućava umnažanje

ciljnog slijeda više od milijardu puta u samo 2 sata
• U stanici se replikacija odvija uz pomoć puno različitih proteina i
enzima dok se kod PCR reakcije sve izvodi jednim jedinim enzimom
DNA polimerazom
• U DNA replikaciji se DNA enzimatski odmota, denaturira, RNA
polimeraza sintetizira male komplementarne početnice, tu se veže
DNA polimeraza koja onda replicira DNA
• Tijekom PCR visoka temperatura se koristi za denaturaciju DNA,
sintetske početnice koriste se umjesto malih RNA koje uokviruju
regiju koja se želi umnožiti; početnice se vežu za komplementarne
lance, jedna početnica na jedan, druga početnica na drugi lanac.
 PCR-riječima (2)
• 1) U reakciju PCR se dodaje
– DNA
– DNA polimeraza
– Početnice
– 4 deoksinukleotida
– Kofaktor MgCl2
• 2) PROGRAM PCR mašine
– 1 do 10 minuta inicijalne denaturacije 94-96oC
– 1 do nekoliko minuta pri 50-65oC tijekom kojih se početnice hibridiziraju na
denaturirane lance
– 1 do nekoliko minuta pri 72oC tijekom koje DNA polimeraza nastavlja lanac
DNA, svaki ciklus ima duplo više molekula, nakon 30 ciklusa teoretski milijarda
......

• INOVACIJE KOJE SU OMOGUĆILE PCR:

– Temperaturno stabilna DNA polimeraza izolirana iz bakterije Thermus
aquaticus. Ovaj enzim, nazvan Taq polimeraza, je aktivan usprkos ciklusima
zagrijavanja i hlađenja.
– PCR mašine (DNA thermal cyclers) koriste kompjutersku tehnologiju za finu
regulaciju temperature u ciklusima.
PCR-slikom
 Program PCR

1. Denaturacija DNA u osnovne

lance
2. Hibridizacija početnica na lance
DNA
3. Produžavanje lanca DNA
polimerazom
4. Ponavljanje 30-35 puta
 Program PCR
5’ 3’
Ciljna DNA
3’ 5’

A
B Slobodni
početnice nukleotidi

Mg2+ Mg2+
2+
Pufer koji
Mg sadrži magnezij
Taq DNA Mg2+
Mg2+
Mg2+
polimeraza
 denaturacija
5’ 3’
Target DNA
3’ 5’

95oC

5’ 3’

3’ 5’
 hibridizacija
5’ 3’
Ciljna DNA
3’ 5’

A
B
početnice
~55oC

5’ 3’

B
5’
5’ A

3’ 5’
 Produljivanje lanca
5’ 3’
ciljna DNA
3’ 5’

72oC

5’ 3’

Taq polymerase 5’
5’

3’ 5’
 Odabir početnica
• Početnice trebaju biti dovoljno specifične
(komplemetarne) za određeni gen
• IPAK one se mogu i znatno razlikovati od ciljne
sekvence, a da se uz neke uvjete mogu umnožiti te i
jako slične sekvence (“degenerirane početnice”)
• Ključan kriterij za uspješnost reakcije PCR
• Početnice možemo odabrati ručno (prema slijedu) ili
uz pomoć specijaliziranih programa (npr. DNAStaR,
mnogi su i dostupni na mreži)
• Slijed i duljina početnica predstavljaju ključne
parametre pri uspješnom odabiru početnica, za
uobičajene svrhe početnice su 18-24 pb duljine
• Poželjno je da temperatura hibridizacije ili sparivanja (Ta
annealing temperature) bude između 50-65oC. Temperatura
koja se odabire za prvu reakciju PCR treba biti 5oC manje od
temperature taljenja (Tm, od engl. melting temperature), a
koja se izračunava po formuli.

Tm= 2(A+T) + 4(G+C)

• Odabrani par početnica treba imati što sličniju Tm

• Početnice trebaju sadržavati 45-55% G i C nukleotida
• Preporuka je da početnice počinju i završavaju s G ili C
nukleotidom
• Treba izbjeći ponavljanja purinskih ili pirimidinskih slijedova
nukleotida
• Treba izbjeći komplementarne sekvence dulje od 3 pb unutar
samih početnica i između para početnica (time se izbjegava
stvaranje sekundarnih struktura)
 …druga strana PCR-a
• U teoriji postoje pravila o reakciji PCR, ali
u praksi ne postoji univerzalni protokol,
pa svaku reakciju PCR treba optimizirati
mjenjajući sve parametre pojedinačno
– DNA kalup (potrebna je vrlo mala količina;
nekad mogu smetati nečistoće, ali vrlo
često zbog razrjeđenja to nije toliko bitno)
– Taq polimeraza (ni previše ni premalo)
– Početnice (temperatura hibridizacije)
– dNTP
– MgCl2 (par početnica je više ili manje
osjetljiv na promjenu koncentracije)
– Dodaci reakciji DMSO, glicerol, betain,
formamid, neionski detergenti, BSA… mogu
poboljšati specifičnost PCR reakcije
Nakon svakog ciklusa broj kopija je dvostruko veći
nego u prethodnom ciklusu 230=1,073,741,824
Ipak eksponencijalni porast broja kopija je ograničen
PCR mašina je sofisticirani termostat koji može brzo mijenjati
temperaturu u željenom ritmu
 PRIMJENA PCR
• ODREĐIVANJE MUTACIJA u genskim bolestima (insercije,
delecije, točkaste mutacije) npr. Duchenne mišićna
distrofija (sa 9 parova početnica dobiva se 9 različitih
PCR fragmenata u jednoj reakciji tzv. “multiplex PCR”,
kod osoba sa delecijama 1 ili više PCR produkata će
nedostajati)

• ODREĐIVANJE PRISUTNOSTI NEŽELJENOG GENSKOG

MATERIJALA (bakterijske i virusne infekcije)

• IDENTIFIKACIJA OSOBE (često se koristi “multiplex PCR”)

• FORENZIKA Može se umnožiti DNA i iz prilično

razgrađenog materijala, i iz vrlo malo materijala
 Real-Time PCR
• Lančana reakcija polimerazom u stvarnom
vremenu
• Razvijena zbog nedostataka PCR (plato
reakcije je već postignut u trenutku kada
imamo dovoljno produkta za vizualizaciju)
• Omogućuje kontinuirano praćenje reakcije
PCR, a temelji se na oslobađanju
fluorescentne boje tijekom PCR reakcije
• JAKO SKUPO
 RT-PCR
Reverzna transkripcija je metoda kojom se molekula RNA
prevodi u komplementarnu molekulu DNA (cDNA)
djelovanjem enzima reverzna transkriptaza

cDNA ili “complementary DNA” je kopija RNA, obično

mRNA

cDNA mRNA
Dvolančana Jednolančana

Stabilna Nestabilna

Jednostavna za manipulaciju Komplicirana za manipulaciju

 REVERZNA TRANSKRIPCIJA (RT)-PCR

Prevođenje RNA u cDNA uz pomoć reverzne transkriptaze

5’ 3’
Oligo dT AAAAAAA
TTTTTTT

5’ 3’
Slučajne početnice (pdN6) AAAAAAA
NNNNNN NNNNNN

5’ 3’
Gen-specifične početnice AAAAAAA
AGCGA
 REVERZNA TRANSKRIPCIJA (RT)-PCR
Reverzna transkriptaza
AMV (avian myeloblastosis Virus) ili

MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus)

Tipična RT reakcija
1 µg ukupne RNA 1µl
500 ng početnica (pdN6) 1µl
0.1 mM DTT 1µl
1mM dNTPs 2µl
1U RNase inhibitor 1µl
H2O bez nukleaza 13µl

19µl – zagrij 80°C 4’, prebaci u led

+ 1µl 200U MMLV – superscript
25°C - 10’
42°C – 50’
95°C, 2’
1-20µl u 50 µl PCR smjese
 RT-PCR
• semikvantitativni:
-uspoređuje se relativna količina ciljne mRNA u dva sustava uz korištenje
ubikvitarnog ("housekeeping") gena kao referentnog oslonca
• najčešće korišteni referentni geni: gliceraldehid-3-fosfat-dehidrogenaza
(GAPDH), β-aktin, ciklofilini, hipoksantin-fosforibozil-transferaza (HPRT),
mikroglobulini, rRNA

• kvantitativni:

-interni standard koji se umnaža u istoj epruveti s ciljnom cDNA, uz iste

početnice, dajući produkte različite veličine
(to je zapravo kompetitivni PCR)
- korištenjem poznatih razrjeđenja standarda može se odrediti
koncentracija ciljne mRNA
 Upotreba RT-PCR
• Određivanje razine ekspresije gena

• Izolacija gena nastavlja se

kloniranjem gena....
 KLONIRANJE U PLAZMIDNI
VEKTOR
• Što je klon?
– Klon je skupina identičnih molekula, stanica ili
organizama.
• Što je kloniranje?
– Kloniranje je postupak razvoja i odabira klona
• Kloniranje u plazmidni vektor je postupak
ubacivanja komadića DNA u plazmidni
vektor kako bi se njime moglo manipulirati
 Što su plazmidi?
• Plazmidi su cirkularne,
dvolančane molekule DNA u
bakterijama
• Mogu se replicirati neovisno o
stanici domaćinu.
• Veličina plazmida se kreće od
nekoliko kb do oko 100 kb.
• Plazmidni vektori potječu od
prirodnih plazmida koji prenose
rezistenciju na antibiotike,
osiguravaju toxine u patogenim
bakterijama, zaštićuju
bakterije od toksičnih metala
KLONIRANJE U PLAZMIDNI VEKTOR =
KLONIRANJE GENA
 …kada je počelo
• Prvi eksperiment kloniranja izveden je
1973. godine u kojem je korišten
prirodni plazmid iz Staphylococcus
aureus
• 1977 godine Bolivar and Rodriguez su
konstruirali prvi upotrebljivi vector
pBR322.
 Plazmidni vektori

• 1982 nastala je nova generacija vektora za kloniranje (J. Messing)

nazvana pUC serija. Razvijeni su od pBR322 i to tako da je
zamjenjena TcR-gene regija sa genom za alpha-peptid ß-
galactosidaze (lacZ') koji uključuje višestruko mjesto za kloniranje
(MCS) i koji počinje 15 nukleotida od lacZ' gena.
• Ostatak gena za β-galaktozidazu se osigurava u bakteriji domaćinu
E.coli
 Što plazmid čini plazmidom?
• Ori-origin of replication, izvorište replikacije
• MCS /multicloning site) višestruko mjesto za
kloniranje (ovdje se lako ubacuju DNA
fragmenti uz pomoć različitih restrikcijskih
endonukleaza)
• Gen za rezistenciju na antibiotik (ampicilin,
kanamicin, tetraciklin, higromicin)
Vrste plazmidnih vektora

PROKARIOTSKI

EUKARIOTSKI
 KLONIRANJE U PLAZMID
• 1. IZOLACIJA GENA
• 2. CIJEPANJE PLAZMIDA ( i
FRAGMENTA) RESTRIKCIJSKIM
ENDONUKLEAZAMA
• 3. IZOLACIJA DIJELOVA
VEKTORA I INSERTA
• 4. LIGACIJA
• 5. TRANSFORMACIJA
• 6. ODABIR KOLONIJA
• 7. PROČIŠĆAVANJE
 1. IZOLACIJA GENA
• Fragment dobiven PCR-om
• Fragment dobiven RT-PCR-om
• Fragment iz nekog plazmida
 2. CIJEPANJE PLAZMIDA ( i FRAGMENTA)
RESTRIKCIJSKIM ENDONUKLEAZAMA

• 1962. Arber and Dussoix su otkrili da E. coli

može zaustaviti rast bakteriofaga λ
degradacijom DNA faga
• 1965. Arber je otkrio da E. coli metilira svoju
DNA kako bi razlikovala svoju od tuđe DNA
(1978. Nobelova nagrada)
• 1970. Prva DNA specifična restrikcijska
endonukleaza izolirana iz Haemophilus
influenzae - HindII
• Endonukleaze izolirane iz
bakterija
• Prepoznaju specifične
palindromske sekvence
• “Molekularne škare” cijepaju
jedinstvene DNA sekvence
• Cijepaju asimetrično ili
simetrično i stvaraju “ljepljive”
ili “ravne” krajeve
3. IZOLACIJA ŽELJENIH DIJELOVA
VEKTORA I PLAZMIDA
• Nanošenje pocijepanih plazmida na gel
uz standard
• Izrezivanje iz gela dijelova koje želimo
spojiti
• Elektroelucija i pročišćavanje ILI
upotreba kita za izolaciju iz gela
• Mjerenje količine VEKTORA i INSERTA
(omjer ovisi o tipu kloniranja)
 4. LIGACIJA
• Upotreba DNA ligaze
• PREMA VRSTI KRAJEVA
KOJE SPAJAMO
RAZLIKUJEMO:
– Kloniranje ljepljivih
krajeva
– Kloniranje tupih krajeva
– AT kloniranje

– Kloniranje hibridiziranih
sintetskih
oligonukleotida
– Kloniranje tupih krajeva
• Krajevi koji se spajaju nastali su
djelovanjem restrikcijskih enzima koji
daju ravne (tupe) krajeve ili se radi o
insertu nastalom PCR-om i to DNA
polimerazom koja ostavlja ravne
krajeve (Vent, Pwo)

– Kloniranje ljepljivih krajeva

• Krajevi koji se spajaju nastali su
djelovanjem istog restrikcijskog
enzima ili djelovanjem dvaju različitih
enzima ali koji daju ISTE jednolančane
krajeve

– AT kloniranje
• Koristi karakteristiku obične TaqDNA
polimeraze da na 5’ krajevima ostavlja
A u insertu. Vektor se može obraditi
istim enzimom ali uz dodatak dTTPa ,
time se dobiva vektor koji ima T na
svojim krajevima
 5. TRANSFORMACIJA
• TRANSFORMACIJA NAKON KEMIJSKE OBRADE STANICA
– Postupak ubacivanje gole plazmidne DNA u stanicu. Ako ubačena DNA
posjeduje izvorište replikacije koje prepoznaje domaćinova DNA polimeraza,
bakterija će replicirati stranu DNA zajedno sa svojom.
– Postupak kombinacije transformacije sa SELEKCIJOM ANTIBIOTIKOM
omogućuje da nakon transformacije izrastu kolonije koje nose stranu DNA
(plazmidna DNA sadrži gen za rezistenciju na antibiotik)
– Bakterija koja je u stanju primiti u sebe stranu DNA naziva se KOMPETENTNA
BAKTERIJA
– Najčešći način obrade bakterija kako bi postale kompetentnima je obrada
bakterija u logaritamskoj fazi s CaCl2. Bakterijska membrana je propusna za
ione Cl, ali nije propusna za ione Ca. Kako ioni Cl prodiru u bakterije,
molekule H2O ih slijede. Taj unos H20 dovodi do bubrenja bakterije što je
neophodno potrebno za unos DNA. Točan molekularan mehanizam nije
poznat.
– U postupku transformacije nakon dodatka strane DNA slijedi temperaturni
šok. Pri čemu se aktiviraju geni potrebni za preživljenje (heat shock genes)
koji su uključeni u ulazak strane DNA u stanicu.
• ELEKTROPORACIJA je metoda kojom se unosi DNA u stanicu
• Primjenjuje se visoka voltaža kako bi se napravile privremene rupe u
bakterijskoj membrani kroz koje može ući DNA
• U periodu oporavka rupe se zatvaraju i unesena plazmidna DNA se može
replicirati unutar bakterije
 6. ODABIR KOLONIJA
koje sadrže plazmid

• Plavo bijela selekcija

• Izolacija plazmida i restrikcijska analiza
• PCR
• Southern blot hibridizacija na kolonijama
 PLAVO BIJELA SELEKCIJA
• Je metoda jednostavnog odabira bakterijskih kolonija
koje u sebi sadrže rekombinantni plazmid sa željenim
insertom
• pBluescript u sebi ima gen dojavljivač β-galaktozidazu
• Višestruko mjesto za kloniranje se nalazi usred gena za
β-galaktozidazu
• U “praznom” plazmidu dolazi do ekspresije β-
galaktozidaze koja dodani bezbojni supstrat (x-gal), u
prisustvu induktora IPTG, pretvara u PLAVO obojeni
• Ako je strana DNA ubačena u plazmid poremeti se ORF
(open reading frame) ili otvoreni okvir čitanja za
β-galaktozidazu nema enzimske aktivnosti i bakterije
nisu plave već BIJELE
SVE IZRASLE BAKTERIJSKE KOLONIJE SADRŽE PLAZMID
SVE PLAVE KOLONIJE SADRŽE PLAZMID BEZ INSERTA
SVE BIJELE KOLONIJE SADRŽE PLAZMID S INSERTOM
 7. IZOLACIJA PLAZMIDA
• = izolacija plazmidne DNA…

• Bakterije se talože centrifugiranjem i resuspendiraju u puferu

kojin sadrži glukozu i EDTA
• LIZA BAKTERIJA SDS-NaOH (SDS je ionski detergent koji otapa
fosfolipide, denaturira proteine, oslobađa se bakterijski sadržaj
u otopinu; NaOH denaturira DNA)
• Dodaje se K-acetat i octena kiselina (stvara se precipitat
SDS/lipid/protein; neutralizira se NaOH dodana u prethodnom
koraku-PLAZMIDNA DNA SE RENATURIRA)
• Precipitat se uklanja centrifugiranjem, a plazmidna DNA ostaje
u supernatantu
• Izopropanol precipitira DNA; odvaja se centrifugiranjem
• Pere se precipitat 70% alkoholom
• Suši se talog plazmidne DNA
• Resuspendira se u vodi ili u TE-puferu pH8
Kloniranje je metoda kojom se svašta može...
 SOUTHERN BLOT
-metodu je osmislio EDWIN SOUTHERN
temelji se na formiranju DNA hibrida između dva komplementarna lanca DNA,
koji dolaze iz različitih izvora
-zbog toga DNA lanci trebaju biti JEDNOLANČANI (DNA treba biti denaturirana)

ciljna (tražena) DNA obilježena sonda DNA

u smjesi različitih fragmenata DNA kojom tražimo ciljnu sekvencu
JEDNOLANČANA! JEDNOLANČANA!

 
A G T C T T G C A obilježena sonda DNA
komplementarni lanci A
|
T |
C |
A |
G |
A |
A |
C |
G |
T T ciljna (tražena) DNA
|
 Na gel nanosimo materijal u
kojem se traži neki slijed;
npr tražimo određeni gen,
staničnu DNA ćemo
pocijepati raznim
restrikcijskim enzimima
Razdvojenu DNA
prenosimo na najlonsku ili
nitroceluloznu membranu
PRIJENOS NA MEMBRANU
SE RADI KAKO BI
RAZDVOJENA DNA BILA NA
MEDIJU S KOJIM SE MOŽE
DALJE LAKŠE
MANIPULIRATI

PROBU (cDNA fragment)

obilježimo (radioaktivno ili
kemiluminiscentno)
INKUBIRAMO MEMBRANA s
probom u pogodnom puferu Ispiremo nevezanu probu

REZULTAT: Otkrili smo u

Kojim se fragmentima nalazi
Neki slijed
Način detekcije obilježene
probe ovisi o obilježavanju
(fotografski film-
kemiluminiscencija)
 HIBRIDIZACIJSKA SONDA
• Sonda je mali dio onoga što
tražimo
• Može se obilježiti Fotografski film
– Haptenom, npr.
digoxigenein-dUTP, biotin- kemiluminiscencija
dUTP; detekcija se vrši mišje anti DIG protutijelo
dalje obilježenim obilježeno enzimom
protutijelima
– Fluorokromom, npr. Otopljeni supstrat
fluorescein-dUTP; moguća DIG obilježena
je direktna detekcija hibridizirana sonda
• Načini obilježavanja Membrana
– Metodom nasumične klice
(random primer labeling)
– PCR
Slika 0.7% agaroznog gela sa 14 uzoraka i Fotografski film nakon Southern Blot
markerom MW. hibridizacije pokazuje u kojem se soju
Svaki uzorak je razgrađen istom nalazi slijed koji odgovara slijedu
restrikcijskom endonukleazom. korištene obilježene probe.
 NORTHERN BLOT
• Isto što i Southern ali se na agarozni gel
nanosi RNA (ime Northern je reakcija na
“Southern” blot)
• Proba je obilježena DNA ili RNA
• Sve što vrijedi za Southern, ali je po
analogiji rada s DNA potreban iznimni oprez
rada zbog rada s RNA (RNase…)
• Neizostavna metoda za dokazivanje jačine
ekspresije (mRNA), ili određivanje veličine
transkripta
 SEKVENCIRANJE
ili ODREĐIVANJE PRIMARNOG
SLIJEDA NUKLEOTIDA
• Nobelova nagrada za kemiju 1980.
godine: Paul Berg (1/2), Walter Gilbert
(1/4), Frederic Sanger (1/4)
 Sangerova (dideoksi-) metoda
• Temelji se na zaustavljanju
enzimatske sinteze
komplementarnog lanca DNA
ugradnjom OBILJEŽENIH
analoga nukleotida
(dideosiribonukleozid-
trifosfata; nedostaje 3’-OH
skupina deoksiriboze)
• Sinteza komplementarnog lanca
DNA započinje
oligonukleotidnom klicom koja
je komplementarna slijedu DNA
• Korištenjem smjese sva četiri
dNTP i jednog ddNTP, sinteza
novog lanca prekida se na
svakom mjestu ugradnje
ddNTP, dajući tako skup lanaca
različitih dužina
• Četiri odvojene reakcije, svaka
s različitim
dideoksinukleotidom, daju
potpunu informaciju o slijedu
nukleotida u analiziranoj
molekuli DNA.
Sekvenciranje Sangerovom dideoksi
metodom, upotrebom lančane reakcije
polimerazom i kapilarne elektroforeze
PROTEINI
 PROTEINI
• Natrij dodecil sulfat-poliakrilamid gel
elektroforeza (SDS-PAGE) i Western
blot
• Kultura stanica
• Transfekcija u eukariotsku stanicu
• Monoklonska protutijela
 ELEKTROFOREZA
• ELEKTROFOREZA je proces pokretanja
nabijenih molekula u električnom polju.
• Molekule se u električnom polju kreću u
ovisnosti o naboju, obliku i veličini.
• Najčešće korištene mediji za
elektroforezu: poliakrilamid i agaroza
 PAGE i SDS-PAGE
• Poliakrilamidni gel (PAGE) se formira kada
se mješavina akrilamida i umrežujućih
(cross-linker) bisakrilamida polimerizira u
duge lance kovalentnim vezama.
• Veličina pora u poliakrilamidnim gelovima je
određena % gela (što je veći postotak to su
pore manje)
• PAGE i SDS-PAGE se izvode na vertikalnom
gelu (agarozni gel je bio horizontalni gel)
 SDS-PAGE
• PAGE je metoda u kojoj se proteini razdvajaju po molekularnoj
težini i po naboju
• SDS-PAGE = sodium dodecyl (lauryl) sulfate – polyacrilamide gel
electrophoresis je metoda u kojoj se proteini razdvajaju po
molekularnoj težini
• SDS je detergent (nalazi se na listi sastojaka šampona, sapuna i
pasta za zube). SDS razara vodikove veze, blokira hidrofobne
interakcije i razmata protein, uništava tercijarnu i sekundarnu
strukturu proteina. Time se izjednačavaju naboji na molekulama
proteina (svi su negativno nabijeni).
• Proteini se mogu u potpunosti razmotati kada se u pripremi uzorka
koristi ditiothreitol ili 2-merkaptoetanol, koji cijepaju disulfidne
veze između cisteina.
• Za skoro sve proteine vrijedi pravilo da se SDS veže u količini 1.4 g
SDS-a na gram proteina, osiguravajući tako ukupni negativni naboj
svakog proteina
 SDS-PAGE se koristi za
– Određivanje veličine proteina
– Identifikaciju proteina
– Provjeru čistoće proteinskog uzorka
– Identifikaciju disulfidnih veza
– Kvantifikaciju proteina
 PUFERSKI SUSTAVI
• KONTINUIRANI
– Samo jedan gel za razdvajanje, uzorci se
odmah nakon stavljanja na gel počinju
razdvajati

• DISKONTINUIRANI
– Uzorci prvo prolaze kroz gel velikih pora
(stacking gel = gel za sabijanje) koji
omogućava ukoncentriravanje uzorka, a
zatim se razdvajaju u gelu manjih pora
(separating = running = gel za razdvajanje)
 PRIPREMA GELA

Gel za sabijanje

Gel za razdvajanje
PRIPREMA GELA = POLIMERIZACIJA
• Amonij persulfat je inicijator
• N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) je
katalizator
• Polimerizacija može biti i fotokemijska (riboflavin i UV
svjetlo dugih valnih duljina kao inicijatori, TEMED kao
katalizator)
recept za PRIPREMU GELA

7.5% 10% 15%

H2O 16.1 ml 13.6 ml 8.6 ml
akrilamid/bisakrilamid 7.6 ml 10.1 ml 15.0 ml
donji pufer TrisHCl pH 8.8 6.0 ml 6.0 ml 6.0 ml
APS 10% 100 ml 100 ml 100 ml
SDS 10% 300 ml 300 ml 300 ml
TEMED 15 ml 15 ml 15 ml
SDS-PAGE
 BOJANJE SDS-PAGE GELOVA
• Coomassie blue bojanje
– temelji se na
nespecifičnom vezanju
boje Coomasie blue na
proteine
– Razdvojeni proteini se
istovremeno fiksiraju i
bojaju, a zatim se
odbojava background-
proteini se pojavljuju kao
plave vrpce (bands) na
bezbojnoj podlozi
 BOJANJE SDS-PAGE GELOVA
• Bojanje srebrom
– Temelji se na vezanju
iona srebra na SH i
COOH grupe
razdvojenih proteina
– Proteini se nakon
elektroforeze
fiksiraju, izlažu
srebrnom nitratu i
“razvijanjem” se
stvara crni precipitat
srebra
ODREĐIVANJE MOLEKULARNE TEŽINE
PROTEINA IZ SDS-PAGE
 WESTERN BLOT
• Western blot je metoda detekcije jednog proteina, u
mješavini puno različitih proteina, razdvojenih SDS-
PAGE-om
• Nakon SDS-PAGE proteini se prenose na membranu na
kojoj se izvodi imunodetekcija
• Za imunodetekciju se koriste specifična protutijela na
željeni protein (primarna protutijela), nakon čega se
vezanje tih protutijela određuje protutijelima na
primarna protutijela (sekundarna protutijela) koja su
obilježena enzimom
• Signal se dobiva kemijskom reakcijom (kolorimetrija ili
kemiluminiscencija)
 WESTERN BLOT
• SDS-PAGE
• Prijenos na membranu
• Blokiranje veznih mjesta na membrani (nemasno
mlijeko, BSA)
• Inkubacija s primarnim protutijelom
• Ispiranje
• Inkubacija sekundarnim protutijelom obilježenim
enzimom
• Ispiranje
• Kemijska reakcija (kemiluminiscencija, kromogena
vizualizacija=kolorimetrija)
PRIJENOS PROTEINA NA MEMBRANU

TIPOVI PRIJENOSA

1)TANK TRANSFER

2)SEMI-DRY
 BLOKIRANJE MEMBRANE
• Blokiranje nespecifičnog vezivanja
proteina na membrani
• BSA, nemasno mlijeko u prahu,
ovalbumin, želatina…
• Puferi: PBS (phospahate-buffered saline)
ili TBS (Tris-buffered saline) uz dodatak
Tween-20 (neionski detergent za
smanjenje intenziteta nespecifičnih
interakcija)
 1) KROMOGENA VIZUALIZACIJA
• Primarno protutijelo
Enzim AP ili PO
• Sekundarno
protutijelo je
obilježeno alkalnom Otopljeni supstrat Sekundarno

fosfatazom ili protutijelo

peroskidazom
• Supstrat se bira Obojeni
precipitat
Primarno protutijelo

prema enzimu Protein

BCIP/NBT (AP) ili DAB Membrana

(PO)
 2) KEMILUMINISCENCIJA
• Primarno protutijelo Fotografski film

• Sekundarno protutijelo je Enzim AP ili PO

kemiluminiscencija
obilježeno alkalnom
fosfatazom ili
peroskidazom Otopljeni supstrat Sekundarno
protutijelo
• Supstrat se bira prema
enzimu, produkt reakcije
ima sposobnost Primarno protutijelo
kemiluminiscencije Protein
• Signal se bilježi na
Membrana
fotografskom filmu
 PREDNOSTI KEMILUMINISCENCIJE NAD
KROMOGENOM VIZUALIZACIJOM
• Kromogenom vizualizacijom
– može se detektirati samo jedan protein, a membrana
se ne može više koristiti za novu reakciju
• Kemiluminiscencija
– Membrana se može koristiti više puta za određivanje
različitih proteina (između stripping)
– Mijenjanjem vremena ekspozicije filma membrani
može se kontrolirati jačina signala i “uhvatiti” signal
upravo u trenutku kada je još uvijek linearan odnos
između količine proteina i signala na fotografskom
filmu
 KULTURA STANICA
• Stanice se mogu uzgajati u petrijevki
• S obzirom na podrijetlo:
– Primarne kulture (direktno iz tkiva), imaju
ograničen broj dioba
– Trajne kulture, neograničeno se dijele
• S obzirom na način rasta
– Adherentne
– Stanice u suspenziji
• Npr fibroblasti rastu oko 50
generacija i zatim umiru,
pokazuju kontaktnu inhibiciju,
odnosno prestaju rasti kada
postignu monosloj Primarne kulture
• NAČINI DOBIVANJA
1)EKSPLANTACIJA: dio tkiva se
stavlja u petrijevu zdjelicu,
stanice migriraju iz tkiva
(Upotrebljava se za stanice
koje su osjetljive na proteaze;
nije pogodno za stanice koje
se slabo adheriraju ili slabo
migriraju)
2) ENZIMATSKO OSLOBAĐANJE se
odabire za stanice koje su
otporne na enzimsku
razgradnju Enzimska
razgradnja služi da se stanice
razdvoje jedna od druge i da
se odvoje od ekstracelularnog
matriksa (Tripsin, Kolagenaza
II, Elastaza, Hijaluronidaza,
DNase, Pronaza, odnosno
kombinacije enzima)
 Trajne kulture
• Neograničeno rastu, neke imaju smanjenu
kontaktnu inhibiciju
– A) tumorske stanice
– B) stanice iz primarne kulture koje su prošle
krizu (gensku promjenu u kulturi), relativno
je jednostavno dobiti trajnu liniju iz stanica
glodavaca
– C) primarne kulture koje su transformirane u
kulturi tumorskim virusom ili onkogenom
 stanična kultura = uzgoj stanica in vitro

• ZA • PROTIV
Jednostavni sustav za Stanice u kulturi ne
proučavanje reagiraju potpuno
molekularnih jednako kako bi reagirale
mehanizama u tijelu
Promjene u organizmu se
ne mogu objasniti
promjenama u stanicama
Svako otkriće dobiveno na
nivou stanice mora se
potvrditi na organizmu
 UZGAJANJE STANICA
• Stanice se uzgajaju in vitro
– u plastičnim posudama (označene tissue culture)
različitog oblika (petrijeve zdjelice, T-bočice, roler
boce…..)
– U vlažnom inkubatoru pri pogodnoj temperaturi uz
kontrolirani dotok ugljičnog dioksida
– U potpuno sterilnim uvjetima (upotreba sterilnog
kabineta s protokom sterilnog zraka, upotreba svog
sterilnog suđa)
– U posebnom mediju za uzgoj stanica
 Najčešće korišteni mediji
• Eagle’s Basal Medium
• Eagle’s Minimal Essential Medium (MEM)
• Dulbecco’s modification of MEM (DMEM)

• ULOGA medija
Osiguravanje hranjivih tvari
aminokiselina, masnih kiselina, elemenata u tragovima,
soli, vitamina, kofaktora
Osiguravanje odgovarajućeg kemijskog okoliša
pH i osmolalnost (ioni i bikarbonati)
Izvor energije
 TRANSFEKCIJA U KULTURU
STANICA

• Transfekcija je postupak kojim se

može unjeti strana DNA (obično
plazmidna DNA) u eukariotsku stanicu
• Gen koji se u plazmidnoj DNA nalazi se
transkribira, translatira i eksprimira
 METODE TRANSFEKCIJE
Često se ove metode nazivaju
TROJANSKI KONJ
Jer se molekule nosači vezani za
DNA vežu na staničnu membranu
I unose u stanicu.

• Kalcij fosfat
• DEAE-dextran
• Transfekcija posredovana liposomoma
• Elektroporacija
• Genski pištolj (Gene gun) Često ih nazivaju metodama
GRUBE SILE
• Mikroinjekcija
 TIPOVI TRANSFEKCIJE
• PROLAZNA TRANSFEKCIJA
– Transfekcija pri kojoj se plazmid ne integrira u domaćinov kromosom. Prema
tome je i ekspresija gena koji se u plazmidu nalaze prolazna i istražuje se
obično 24-72 sata nakon transfekcije.
– Ova metoda se obično koristi uz neki gen dojavljivač (luciferaza, beta
galaktozidaza, zeleni fluorescentni protein gfp) čija se ekspresija određuje.
Prema tome ova metoda je česta za istraživanje promotora, ali se može
koristiti i za inaktivaciju nekog gena unošenjem neaktivne forme istog
(kompeticija neaktivne forme proteina za supstrat može se privremeno
inaktivirati funkcija nekog staničnog proteina)

• STABILNA TRANSFEKCIJA
– Stabilna transfekcija je metoda u kojoj se nakon transfekcije izoliraju stanice
koje su integrirale plazmid u kromosom stanice. Odabir ovih stanica omogućen
je genom za rezistenciju stanica na neku kemikaliju koji se nalazi u plazmidu
zajedno sa genom koji želimo u tim stanicama eksprimirati.
– Ovako izolirane stanične linije (potrebna je selekcija individualnih stanica-
klon stanica) mogu poslužiti za istraživanje funkcije nekog proteina, a mogu
služiti i za izoliranje veće količine proteina iz stanica.
 Vektor za transfekciju:

Za ekspresiju u
Ovdje ubaci gen!
eukariotskoj
stanici
Poliadenilacijsko mjesto
GFP
V
CM oter
om
Pr

Pr
SV oter
om
40
Gen za
rezistenciju
pCMV/GFP kako bi se
Ampi nce

mogla izolirati
resis

resist cin
Neom
stabilna
stanična linija
cillin
ta

ance
y
Za amplifikaciju
plazmida u
bakterijama

Poliadenilacijsko mjesto
pUC
Bakterijsko izvorište replikacije
TRANSFEKCIJA LIPOSOMIMA
Genski pištolj
 Detekcija fluorescencije nakon
Bojanje na β-galaktozidazu transfekcije plazmidom koji
nakon transfekcije sadrži
plazmidom koji sadrži zeleni fluorescentni protein (gfp)
β-galaktozidazu ili crveni fluorescentni protein
(rfp)
MDCK Cells
Madin-Darby Canine Kidney
Polarized Epithelial Cells

TRANSFEKCIJA JE IZVRSNA METODA ZA

PRAĆENJE LOKALIZACIJE PROTEINA U STANICI

DNA (Hoechst)
Golgi (ceramide)
Lysosomes (LysoTracker) Molecular Probes, Inc.
 MONOKLONSKA PROTUTIJELA
• Humoralni imunitet nas
štiti od patogena uz
pomoć protutijela
• Nakon što se organizam
susretne sa stranim
proteinom razvija se
čitav niz različitih
protutijela na taj
protein; oni se vežu na
različite epitope
(antigenske
determinante na
stranom proteinu)
TEHNOLOGIJA PROIZVODNJE
MONOKLONSKIH PROTUTIJELA

George Kohler i Cesar Milstein

1984. dobili Nobelovu nagradu
za medicinu, za otkriće MoAb

Treći nagrađeni Niels Jerne.

 Protutijela

POLIKLONSKA MONOKLONSKA

Dobivena od više Dobivena od jednog klona

različitih B linija B limfocita
limfocita
Reproducibilni, gotovo
neiscrpni izvorprotutijela s
Razlika od šarže do šarže točno određenom
specifičnosti

Ne baš tako dobor Izvrsno za dijagnostiku

sredstvo u dijagnostici
UPOTREBA MONOKLONSKIH PROTUTIJELA

• Nezamjenjivo u bazičnim
istraživanjima (Western,
imunocitokemija, pročišćavanje
proteina...)
• Nezamjenjivo u dijagnostici
• Upotreba u terapiji
– Odbacivanje
transplantataMuronomab-CD3
– Kardiovaskularne bolesti Abciximab
– Tumori Rituximab
– Infektivne bolesti Palivizumab
– Inflamatorne bolesti Infliximab