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Cavalcanti, Jos A. Visintin, Mayra E. O. A. Assumpo Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, USP, SP
1. Objetivos A citometria de fluxo uma ferramenta que pode avaliar sub-populaes celulares presentes em uma mesma amostra de smen. Este trabalho visou validar a citometria de fluxo com a associao de sondas fluorescentes, para avaliar clulas espermticas de bovinos separadas pelo gradiente de densidade (Percoll, Sigma, 45/90%). 2. Material e mtodo Este estudo utilizou a associao da sonda fluorescente FITC-PSA (isotiocinato de fluorescena conjulgado aglutinina de Pisum sativum) e o PI (iodeto de propdeo). O FITC-PSA cora em verde as clulas com leso acrossomal, e o PI cora em vermelho clulas com leso de membrana plasmtica. O equipamento utilizado foi o Guava EasyCyte Mini Flow Cytometry da GE Life Science. Para cada ensaio (n=xxxx) uma palheta de smen foi descongelada e o contedo submetido separao por gradiente Percoll (45% e 90%). As clulas viveis passam pelo gradiente 45 e pelo gradiente 90%, ficando no sedimento do tubo. Como grupo controle foi realizado a induo de injrias nas membranas acrossomal e plasmtica, submetendo repetidamente as clulas ao nitrognio lquido, seguido de descongelao rpida. 3. Resultados Para a padronizao dos experimentos foram avaliados os quatro grupos: Grupo 1 Clulas submetidas ao Percoll, sem a presena das sondas (Figura 1 A); Grupo 2 Clulas submetidas ao Percoll coradas com a associao das sondas (Figura 1 B); Grupo 3 - Clulas espermticas com leso induzida pelo choque frio (Figura 2 A); Grupo 4 Espermatozides frescos corados com as sondas, mas sem serem submetidos ao Percoll (Figura 2 B). As partculas residuais de Percoll foram removidas pelo ajuste da linha de corte de anlise.
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Figura 1: Em A, dotplot da auto-fluorescncia das partculas de Percoll. Em B, partculas de Percoll coradas com as sondas.
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Figura 2: Em A, dotplot do padro populacional das clulas com leso induzida. Em B, clulas ntegras em azul, leso de acrossomo em verde, leso de membrana plasmtica em vermelho e leso de ambas as membranas em laranja.
4. Concluso O procedimento de padronizao propiciou o ajuste dos parmetros para o uso das sondas FITC-PSA e PI, simultaneamente. Deste modo, a identificao de quatro sub-populaes celulares em ejaculados bovinos aps separao por gradiente de Percoll possvel o que propicia uma vantagem frente aos mtodos tradicionais de avaliao seminal, devido a maior sensibilidade e acurcia da tcnica, uma vez que se avalia um nmero maior de clulas por amostra 5. Referncias bibliogrficas
Guava EasyCyte Mini Flow Cytometry System Millipore Corporation, Billerica, U.S.A, 2008.