Secuenciacin automtica de ADN.

Estrategias de secuenciacin
Curso de doctorado: tcnicas instrumentales. 2008
Manuel Snchez Hernndez Servicio de Secuenciacin de ADN, Universidad de Salamanca.

SECUENCIACION DE ADN Mtodos clsicos de secuenciacin .Mtodo qumico de Maxam y Gilbert (1977) .Mtodo enzimtico de Sanger (1977) Secuenciacin automtica .Secuenciacin con cebadores fluorescentes .Secuenciacin con terminadores fluorescentes Secuenciadores automticos .Secuenciadores en geles desnaturalizantes .Secuenciadores capilares .Secuenciacin masiva, nanosecuenciacin

METODO QUIMICO DE MAXAM Y GILBERT

Metodo de Sanger (1977)

ssDNA dsDNA

Desnaturalizar Hibridacin con el oligo

5 3

DNA Polimerasa y dNTPs (uno al menos marcado ) 5 3

A C G T
5 Cuatro reacciones de parada con un desoxinucletido cada una ddA ddC ddG ddT 3 Electroforesis A G C T A T G A C A C A

A A A A A

C C

C G G

Autorradiografa

Autorradiografia
Leemos unos 300 nucletidos Electroforesis corta

SECUENCIACION AUTOMATICA CON FLUOROCROMOS

Secuenciacin con terminadores marcados

ddNTPs dNTPs Taq polimerasa A C G T

ANILLAMIENTO

A A A A A A A

C C C C C C

C C C C C

G GT GTA GTAT

ELECTROFORESIS

EXTENSION

PRODUCTOS

ANALISIS DE LOS FRAGMENTOS EN EL SECUENCIADOR

SECUENCIACION AUTOMATICA CON FLUOROCROMOS

Secuenciacin con los primer marcados
ddNTP dNTPs Taq polimerasa A ANILLAMIENTO EXTENSION

A ACCGTA PRODUCTOS

AC ACC

ELECTROFORESIS

ACCG ANALISIS EN EL SECUENCIADOR

ACCGT ACCGTAT

CICLO DE LA REACCION DE SECUENCIACION AUTOMATICA

ANILLAMIENTO MEZCLA DE REACCION A C G T Enzima, dNTPs

EXTENSION

94C 96C 50C 60C 4C

3 min 10 sec 5 sec 4 min 25 CICLOS

A C C TG

DESNATURALIZACION

MOLDE ORIGINAL

A A A A A A A

C C C C C C

C C C C C

G GT GTA GTAT

PRODUCTOS

Secuenciadores automticos

*Secuenciadores en geles desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida. *Secuenciadores capilares.

Gel de acrilamida-bisacrilamida para el 377 DNA sequencer

Preparacin de la electroforesis en el 377 DNA sequencer

A: Casette B: Tapa cubeta superior C: Barra protectora del laser D: Cubeta superior E: Pinzas F y G: cubeta inferior H: Dispositivo de carga

ABI PRISM 377 DNA SEQUENCER

3100 Capillary Array

ABI PRISM 3100 GENETIC ANALYZER

ABI PRISM 3100 GENETIC ANALYZER

A C G T

Autorradiografa (300 nt)

Secuenciador Automtico (+700 nt)

VENTAJAS DE LA SECUENCIACION AUTOMATICA

La contaminacin que se produce es mucho menor pues no utiliza radiactividad. Ms cmodo, la secuencia la obtenemos directamente en el ordenador, no tenemos que leer una autorradiografa que puede conducir a cometer errores de lectura. Mucha ms secuencia en cada gel. En la secuenciacin automtica se leen unos 700-800 nucletidos por carrera y en cada gel pueden entrar hasta 96 carreras. En la manual normalmente se colocan 7 carreras y se puden leer alrededor de 300 nucletidos en cada una. Los secuenciadores capilares pueden llegar a analizar 96 Carreras en menos de dos horas.

Es mucho ms rpido que la manual para poder leer grandes fragmentos de ADN.

Es ms barato. El inconveniente mayor es la inversin inicial al adquirir el equipo

UTILIDADES DE LA SECUENCIACION AUTOMATICA

Comprobar si una construccin es correcta. ADN recombinante Encontrar mutaciones en un fragmento de ADN Diagnstico de enfermedades genticas (gen Ras y cncer) Conocer la secuencia de genes. Enviamos las secuencias a las bases de datos Identificacin de especies y control de cruces entre animales (ADN mitocondrial) Secuenciacin completa de genomas. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Genoma humano... Proyectos de ESTs

PROYECTOS DE ESTs
Los PROYECTOS DE ESTs son una herramienta fundamental de la gentica funcional, pues ofrecen una visin global de los genes que se expresan en un organismo en unas condiciones determinadas.

ESTRATEGIAS DE SECUENCIACION

Subclonacin dirigida. Dividir el fragmento en trozos pequeos que podamos leerlo con una carrera Deleciones dirigidas utilizando la Exonucleasa III

Chromosome Walking. Disearamos oligonucletidos para utilizarlos como primer al final de cada carrera.

Insercin del transposon EZ::TN Shotgun. El fragmento a secuenciar se rompe al azar en trozos. Se leen muchos fragmentos y posteriormente se anillan las secuencias

Tratamiento con la Exonucleasa III

Plsmido
Linealizacin del plsmido

vector inserto Oligo para secuenciar

Exo III

Tratamiento con la ExoncleasaIII A distintos tiempos. Religacin de los fragmentos Obtenidos.

500 pb

Chromosome Walking

Molde de ADN

Secuencia obtenida Primer para secuenciar

SHOTGUN SEQUENCING
Gel de agarosa Sonicacin Reparacin Klenow y T4 polimerasa
3 kb

Random Fragmentos

1.5 kb

Geneclean Fragmentos DNA (1.5-3 Kb) KS Eco RV Ligacin Transformacin Preparacin DNA Secuenciacin

E. coli

Ensamblaje de secuencias

. . .. . . .

ENSAMBLAJE DE SECUENCIAS (SeqMan, DNAstar)

ENSAMBLAJE DE SECUENCIAS (SeqMan, DNAstar)

Analisis de los datos del secuenciador.

Resecuenciacin. Comparacin de secuencias para detectar mutaciones

Analisis de los datos del secuenciador.

Secuenciacin de genomas desconocidos.

ALGUNAS NORMAS PARA LA SECUENCIACION AUTOMATICA

En principio algunas de las normas a seguir son las siguientes: - H abr un cuaderno en mi sitio -habitacin 314(REACCIONES) en el que os apuntar segn se vaya llegando u os apuntais vosotros (si no e stoy) y me dejais el DNA a - 20 C. D ebeis apuntar vuestro nombre y como habeis marcada cada eppendorf. Las reacciones las har segn orden de llegada. -El DNA debe estar limpio, hay varios mtodos de obtencin que pueden servir: . M ediante columnas. . Un a mini normal, pero debe estar bien fenolizada. . Para productos de PCR, geneclean o alguno de los kit que utilizan columnas. - La cantidad de DNA es el factor ms importante, estas son las cantidades necesarias. . Para plsmidos (doble cadena) se necesitan 400-600 ng. Siempre en un volu men de 5 ul en agua. . Cadena sencilla: 100-150 ng en 5 u l de agua. . P ara productos de PCR entre 50-150 ng en 5 ul d e agua.

IMPORTANTE. Es necesario cuantificar bien el DNA, he comprobado que si no se utilizan las cantidades que os indico, casi nunca funciona la reaccin. Si os excedeis en la cantidad tambin hay problemas. Os aconsejo que cuantifiqueis los plsmidos sin cortar en un gel de agarosa. Si quereis al principio os puedo dejar controles de plasmidos ya cuantificados. - La cantidad de oligonucletido que se necesita son 3 pmoles. Los resuspendeis en 3 ul de agua. S i necesitais utilizar los primer universal o reverso, os los puedo aadir yo, p ero debeis comunicarmelo. En total cada eppendorf que me entregeis tendra 8 ul, 5 d e DNA y 3 de oligo. Cualquier oligo sirve en principio para secuenciar, pero cuando diseeis los vuestros debeis tener en cuenta al menos: . Que el primer nucleotido que leereis con claridad estar a unos 70 -80 nucletidos del extremo 3' del oligo utilizado. . La Tm que est alrededor de los 55 C ( la reaccin de secuencia se realiza a 50 C normalmente). Los resultados (cromatogramas) sern enviados por E.mail.