Primera revisin Nota Fecha Firma del docente

Segunda revisin

Determinacin de riboflavina por fluorescencia

Autores Pablo Luzuriaga Lorena Sofa Pepa Leticia Anabella Randazzo Natalia Carolina Santoro Fecha de realizacin del TP: 23/08/11 Fecha de entrega del informe: 06/09/11 Objetivos del TP Optimizar parmetros instrumentales a fin de determinar la concentracin de dos muestras incgnita de riboflavina mediante la tcnica de fluorescencia. Materiales y mtodos Mtodo: cuantificacin por emisin de fluorescencia. Materiales: Soluciones patrn de riboflavina. Soluciones de muestras incgnita. Cubetas para absorcin de luz visible. Cubetas para emisin por fluorescencia. Fuente para espectroscopa LED. Software Spectra Suit. Espectrofluormetro de matriz de diodos. Resultados El valor obtenido para la muestra incgnita de mayor concentracin es de:

(7 2) M
La muestra incgnita ms diluida no se pudo cuantificar.

Evaluacin crtica 1

Primeramente se realiz la optimizacin de parmetros instrumentales. En esta parte del trabajo se trat de buscar un compromiso entre el tiempo de lectura, la sensibilidad y la relacin seal-ruido. Para cuantificar la muestra incgnita ms diluida fue necesario cambiar algunos parmetros instrumentales, ya que era necesario conocer si su seal se distingua de la del ruido instrumental. Para esto, se aument el tiempo de integracin, aumentando el tiempo en el que el detector recibe fotones, lo que genera una mayor sensibilidad, ya que la seal aumenta. Como la muestra era muy diluida, se pudo aumentar bastante este parmetro ya que el lmite de saturacin era mucho mayor que el correspondiente a la muestra concentrada. Por otro lado, se aument el boxcar width. Este cambio genera una mayor relacin seal-ruido, si bien disminuye la sensibilidad. Se cree que la calidad de la seal obtenida se podra haber mejorado mucho ms si se hubiera cambiado el nmero de scans, a valores fijos de boxcar width y de tiempo de integracin. Esto se debe a que el ruido disminuye significativamente, permitiendo una mejor distincin de la seal correspondiente a la muestra. Debido a la falta de tiempo, no se pudo verificar esta hiptesis, siendo necesario realizar anlisis posteriores. Con respecto a la performance analtica, en el caso de la muestra incgnita ms concentrada, se puede decir que el mtodo de cuantificacin de dicha muestra es adecuado. Esto se puede apreciar a travs de las figuras de mrito, mediante las cuales se puede afirmar que la relacin seal concentracin es lineal y que, tanto el lmite de deteccin (LD) como el de cuantificacin (LC), se encuentran muy por debajo de la concentracin de la muestra en cuestin. En el caso de la muestra incgnita ms diluida, no se tiene informacin suficiente para asegurar que la performance analtica fuera adecuada. Esto se debe a que se construy una curva de calibracin con dos datos, lo cual no es estadsticamente significativo. Adems, siendo una concentracin tan baja, lo nico que se pudo asegurar sobre la misma es que hay analito en la muestra (la seal es significativamente distinta del ruido instrumental, ya que la concentracin obtenida es mayor que el LD), pero no se pudo cuantificar, pues la concentracin obtenida es menor al LC. Conclusiones Se pudo cuantificar exitosamente la muestra incgnita ms concentrada, con lo cual se concluye que el mtodo utilizado es adecuado. En cambio, en el caso de la muestra incgnita ms diluida, apenas pudo distinguirse el analito del ruido, sin poder cuantificar la misma. Esto se debe a que, por un lado, la curva de calibracin no es la adecuada; debera haberse construido con varios patrones de concentracin menor. Por otro lado, el mtodo utilizado no es

adecuado para la cuantificacin de este tipo de muestras; tal vez sea necesario utilizar otro mtodo analtico, o bien preconcentrar la muestra incgnita.

Bibliografa consultada D.A. Skoog, J.J. Leary, Analisis Instrumental, pendice 1, McGraw-Hill, 4ta. Edicin, 1994. J.C. Miller, J.N. Miller, Estadstica para Qumica Analtica, Addison-Wesley, 1993. Apunte de calibracin de la ctedra de Anlisis Instrumental, ao 2011. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fluorhom e.html

Anexo
Optimizacin de parmetros instrumentales Se realiz un espectro de absorbancia:
2000

1500

Absorbancia

1000

500

0 400

450

500

550

600

650

Longitud de onda (nm)

Figura 1. Espectro de absorbancia de una solucin de riboflavina.

Se analizaron los parmetros analticos que influyen en el aspecto de dicho espectro: a. Tiempo de integracin: es el tiempo durante el cual el detector recibe fotones. Al aumentar este parmetro la intensidad de la seal es mayor, ya que el detector acumula ms carga. Esto implica una mayor sensibilidad. Sin embargo, este parmetro no puede aumentarse indefinidamente, ya que puede excederse el lmite de saturacin del detector. b. Nmero de scans: es el nmero de lecturas espectrales realizadas por el equipo para generar un solo espectro. Al aumentar este parmetro se obtiene un espectro ms limpio, ya que al promediar varias curvas, las seales correspondientes al ruido (que son aleatorias en magnitud) se compensan y el efecto neto es un espectro con una lnea de base mejorada. El tiempo de cada lectura es el nmero de scan multiplicado por el tiempo de integracin. c. Boxcar width (ancho de ranura): es el nmero de scans que utiliza el equipo para promediar las seales. A mayor boxcar width la curva se ve ms suave, es decir, aumenta el cociente seal-ruido, pero disminuye la sensibilidad (se achata la curva obtenida). Este no es un parmetro netamente 4

instrumental, pero tiene el mismo efecto sobre el espectro obtenido que el que tendra una rendija en un espectrofotmetro.

Se optimizaron los parmetros instrumentales para construir cada curva de calibracin; los valores fijados fueron: Parmetro Tiempo de integracin Nmero de scans Ancho de ranura Muestra ms concentrada 2 segundos 5 1 Muestra ms diluida 15 segundos 5 5

Tabla 1. Parmetros instrumentales de las dos curvas de calibracin.

Relacin entre los espectros de absorbancia y de fluorescencia

Se compararon los espectros de absorbancia y fluorescencia:

4000 3500 3000 2500

fluorescencia absorbancia

Seal

2000 1500 1000 500 0 400

500

600

700

Longitud de onda (nm)

Figura 2. Espectros de absorbancia y fluorescencia.

Se puede observar que hay un corrimiento hacia el rojo (hacia mayores longitudes de onda) de la fluorescencia respecto de la absorbancia (corrimiento de Stokes). Esto se debe a que la energa asociada con la emisin por fluorescencia es menor que la asociada a la absorcin. Adems, la emisin por fluorescencia es acompaada por transiciones entre niveles vibracionales del estado fundamental, lo que resulta en prdidas de energa por va trmica (no radiativa). Otros fenmenos, como efectos de orientacin del solvente, reacciones del nivel excitado, formacin de complejos y energa de resonancia pueden contribuir a las longitudes de onda mayores de la emisin. 5

Cuantificacin de muestras incgnita

Para cuantificar dos muestras incgnita de riboflavina por el mtodo de fluorescencia, se construyeron dos curvas de calibracin:
4000

3000

Seal de fluorescencia

2000

1000

0 0 5 10 15

Concentracin ( M)

Figura 3. Curva de calibracin para la muestra incgnita ms concentrada.

Figura 4. Curva de calibracin para la muestra incgnita ms diluda.

A continuacin pueden verse los picos obtenidos para el patrn y la muestra B.

Figura 5. Espectro correspondiente a la solucin de concentracin ms diluida

Figura 6. Espectro correspondiente a la solucin incgnita ms diluida.

de la curva

Parmetros de la regresin lineal: Curva Figura Figura Pendient e (M-1) 276 8 2241 Ordenada al origen 223 58 35,49 R2 0,9961 7 1

Tabla 2. Parmetros del mtodo de cuadrados mnimos utilizado para obtener la curva de calibracin.

a. Cuantificacin de la muestra incgnita ms concentrada: 6,60 M El error se calcula propagando los errores de la ordenada al origen y de la pendiente en la curva de calibracin:

M 7

En una cifra significativa: Sr = 2 M. b. Cuantificacin de la muestra incgnita ms diluida:

Debido a que esta concentracin se encuentra por debajo del LC, se concluye que no es posible cuantificar esta muestra. Sin embargo, se puede afirmar que hay analito en dicha muestra, ya que esta concentracin se encuentra por encima del LD, lo que implica que la seal no se debe slo al ruido instrumental. Figuras de mrito

Para determinar la performance analtica del mtodo utilizado, se calcularn las siguientes figuras de mrito utilizando los datos de la curva de calibracin para la muestra ms concentrada. La curva construida para la muestra incgnita ms diluida es estadsticamente poco significativa, por lo tanto, no se realizar este anlisis para dicha curva. a. Sensibilidad: se define como la derivada de la seal con respecto a la concentracin:

S = (276 8) M-1
b. Lmite de deteccin: se define como la concentracin necesaria para producir una relacin seal a ruido tres veces mayor a la desviacin estndar del blanco. Para calcular este parmetro, es necesario hacer un anlisis del ruido instrumental:

Figura 7. Histograma del ruido en 800-1000 nm para la Figura 8. Histograma del ruido en 8001000 nm para la muestra B (frecuencia muestra DILUIDA (frecuencia vs. cuentas). vs. cuentas).

La distribucin parece ser bimodal; al realizar el test de normalidad de ShapiroWilk se puede confirmar que la distribucin no es normal.
N Promedio Desviaci n estnda r 1,96 Mnimo Median a 1,28 Mximo

201

1,71

-4,29

7,36

Tabla 3. Parmetros estadsticos correspondientes a la figura 7. N Promed io 0,82 Desviaci n estnda r 1,66 Mnimo Media na 0,78 Mximo

201

-8,78

4,46

Tabla 4. Parmetros estadsticos correspondientes a la figura 8.

De esta forma, el lmite de deteccin es

LD = 3 DS / s = 3 * 1,96 / 276 = 0,0213 M

donde DS es la desviacin estndar del blanco (en este caso, fue extrada de una porcin del espectro que slo presenta ruido) y s es la sensibilidad, es decir, la pendiente de la curva de calibracin. c. Lmite de cuantificacin: se define como:

LC = 10 DS / m = 10 * 1,96 / 276 = 0,0710 M

En el siguiente grfico puede verse que la seal del ruido se ubica por debajo de la seal que arrojara la concentracin correspondiente al lmite de deteccin:

Figura 9. Seal vs. longitud de onda en nm (regin de 800 a 900 nm) para el espectro de la muestra B.

d. mbito lineal: Para verificar la linealidad de la relacin seal-concentracin, se pueden usar, entre otros, dos parmetros: 1. El coeficiente de correlacin lineal R: el valor arrojado por la regresin lineal es:

Este valor implica que hay una buena correlacin lineal entre los datos, dado que es cercano a la unidad. Los valores de Sxy, Sxx, y Syy estn relacionados con las diferencias entre los valores de x y respectivamente y los valores de sus promedios. Debido a que puede ocurrir que el numerador y el denominador de esta expresin sean parecidos, sin que la relacin seal-concentracin sea necesariamente lineal, es necesario realizar el anlisis de los residuos: 2. Los valores residuales se definen como:

donde y es el valor de la seal obtenida para la solucin patrn de concentracin conocida e y es el valor obtenido a partir de la curva de calibracin construida. Para el anlisis de residuos se realiza el grfico de residuos vs. concentracin:

10

100

50

Residuos

0 0 5 10 15

Concentracin ( M)
-50

-100

Figura 10. Grfico de residuos en funcin de la concentracin

Se puede ver que hay una distribucin aleatoria de los residuos positivos y negativos, de modo que se puede verificar la linealidad de la curva de calibracin. De este modo, se puede definir el mbito lineal del mtodo como:

AL = (1,25 12,5) M
e. Deteccin de datos anmalos: de acuerdo al test F de linealidad, se considera un dato anmalo a aqul dato que cumple con la siguiente desigualdad:

Concentracin (M) 12,5 10 7,5 5 2,5

Seal y 3601, 32 3033, 8 2316, 32 1703, 62 871,3 8

Seal predicha por la regresin y 3677,659455 2986,68728 2295,715105 1604,74293 913,770755

Residuos y y 76,33945 5 47,11272 20,60489 5 98,87707 42,39075 5

Deteccin de datos anmalos -1,02157653 0,630463618 0,275735229 1,323175467 -0,567274162 11

1,25

520,4 2

568,2846675 anmalos.

47,86466 75

-0,640526199

Tabla 5. Datos de los residuos y deteccin de datos

Se puede observar de los valores de la tabla que ningn valor excede a 1,5, de lo cual se deduce que no hay datos anmalos.

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