Gentica 1 Gua de Problemas

Segundo Cuatrimestre de 2007

Profesores responsables: Dres. Esteban Hopp, Beatriz Saidman y Liliana Mola

1. CONCEPTOS Y TCNICAS BSICOS DE GENTICA MOLECULAR

Bibliografa: Repaso IBMyC, Alberts, Griffiths Cap 1 y Recombinant DNA (Watson et al.).
secuenciacin masiva de genes y genomas posibilitando el advenimiento de la genmica y proyectos como el genoma humano. La tcnica de M&G es un mtodo degradativo y tiene 2 reacciones de terminaciones de nucletidos inespecficas (revela 2 nucletidos y el verdadero se saca por comparacin con otra calle del gel). Esta razn dificulta, adems, la automatizacin. Por otro lado resultan ms difciles de controlar las condiciones. 3) En qu consiste la PCR de punto final? Es una tcnica cualitativa o cuantitativa? Qu diferencias existen entre PCR de punto final y PCR de tiempo real? Es posible hacer una PCR a partir de RNA? Cmo? Puede utilizarse para diagnstico (la deteccin de HIV, por ejemplo)? Qu ventajas o desventajas tendra respecto a otras tcnicas diagnsticas como el ELISA? R: PCR: polymerase chain reaction (esquema del Recombinant DNA de Watson et al.) - Utiliza la Taq polimerasa: Thermus aquaticus - Permite amplificar segmentos especficos de ADN. - No requiere digestin del ADN. - No requiere clonar el segmento - Se requiere poca cantidad de ADN. Es una tcnica fundamentalmente cualitativa, debido a que llega a una meseta de amplificacin por limitantes que no suelen ser la concentracin del templado. La PCR en tiempo real va siguiendo la cintica de amplificacin permitiendo comparar las fases logartmicas de amplificacin entre s y as cuantificar con precisin los templados frente a una referencia o estndar. Para realizar una PCR a partir de RNA se debe hacer RT-PCR (se llama igual que la otra una por RetroTranscriptasa y la otra por Real Time). Se realiza la primera reaccin con retrotranscriptasa y despus se continua con Taq pol. Es posible utilizar PCR para diagnstico y tiene como ventaja que se trata de un mtodo directo (detecta al virus y no los anticuerpos con los que reacciona el paciente). Por eso sirve para la deteccin en recin nacidos o personal mdico de alto riesgo que trabaja con pacientes, antes de los 6 meses que tarda en detectarse una respuesta inmunolgica. No da falsos positivos (salvo por contaminacin de amplicones: un problema general de las PCRs). Desventajas: ms complejo, caro y menos automatizable que un ELISA. Hay que purificar RNA e implica mayor exposicin al virus por parte del personal que hace el diagnstico. 4) En qu consiste un Southern blot? y el northern? y el western? Para qu se usan y qu tipo de molculas se detectan en cada caso? Qu relacin tiene el Southern con los RFLPs? Mencione 4 aplicaciones de los RFLPs. Compare la utilizacin de Southern vs. PCR, northern vs. RT-PCR y western vs. ELISA. R: Southern blotting:

Gua terica:
1) Qu son, de dnde se obtienen y para qu sirven las enzimas (mejor llamadas endonucleasas) de restriccin? Cmo hacen las bacterias que producen ER para evitar que su genoma se vea afectado por las mismas? Qu tipos de especificidad presentan? Qu tipos de extremos pueden generar en el ADN sustrato? R: Las endonucleasas de restriccin son producidas por bacterias como mecanismo de defensa contra los fagos. El genoma se encuentra protegido por metilacin especfica del sitio de restriccin mediante una metilasa con igual especificidad que la endonucleasa. Cortan el ADN en sitios especficos (secuencias definidas de ADN de 4 6 bases, generalmente). Algunos dejan extremos cohesivos, otros dejan extremos romos. Siempre el sitio blanco (de reconocimiento) es un palndrome, aunque el sitio de corte puede no coincidir con el sitio de reconocimiento. Los fragmentos generados se pueden separar fcilmente mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La velocidad de los fragmentos depende de su longitud: los ms pequeos migran ms rpido. 2) En qu consiste la tcnica de secuenciacin de Sanger? Qu trascendencia tuvo y tiene en Gentica y Genmica? Porqu desplaz a la tcnica de Maxam & Gilbert? Cul es la ventaja de la secuenciacin automtica y en qu se diferencia de la manual? R: En la secuenciacin manual, se suele marcar con radioistopos y se corren 4 calles por secuencia (una para cada nucletido). Se revela por autoradiografa. Secuenciacin de Sanger (ver esquema de libro): secuenciacin por dideoxinucletidos - ADN simple cadena - Oligonucletido iniciador (primer) - Incubacin c/ 4 diferentes dideoxinucletidos (uno para cada calle) - (Mono)deoxinucletidos (uno de ellos marcado, usualmente [32P]dCTP) - Electroforesis en gel de poliacrilamida Existen mtodos no radiactivos (como tincin con nitrato de plata), pero son menos utilizados. En la secuenciacin automtica se marca con fluorocromos (aqu se marca el primer, con un color distinto para cada nucletido a detectar) y se corren las cuatro reacciones en el mismo carril (que suele ser un capilar). Los fragmentos se detectan mediante un lser a la salida del gel que distingue los 4 fluorocromos. No requiere detener la corrida electrofortica, por lo que revela un mayor nmero de nucletidos. Permiti la

- Se parte de ADN (genmico de alto peso molecular en el caso de los RFLP) y se lo digiere con enzimas de restriccin. - Los fragmentos de ADN se separan por electroforesis en gel de agarosa. - Se transfiere a un filtro de nylon o nitrocelulosa y se desnaturaliza el ADN. - Se incuba con una sonda marcada especfica de la secuencia en estudio. - Lavado y exposicin del filtro. - Deteccin autoradiogrfica o fluorogrfica. Esta tcnica permite determinar: a) Presencia y nmero de sitios de corte con una determinada enzima de restriccin en un fragmento de ADN dado y establecer la existencia de polimorfismos para fines diagnsticos o de estudio gentico (RFLP). b) Nmero de copias (aproximado) del gen en el genoma, por ejemplo cuando se hacen transgnicos. Los RFLP surgen de comparar los patrones de restriccin de Southern blot entre distintos individuos, especies, etc. observando diferencias (polimorfismos) en sitios de corte. Aplicaciones de los RFLP: - mapeo gentico - diagnstico prenatal - diferenciacin de individuos (fingerprinting) - estudios evolutivos Northern blotting: - El ARN celular total o mRNA se separa por tamao utilizando electroforesis en gel de agarosa (en presencia de un agente desnaturalizante como el formaldedo para evitar la formacin de estructuras secundarias en el ARN durante la corrida). - Se transfiere a un filtro de nitrocelulosa o a un papel tratado qumicamente. - Hibridacin con una sonda apropiada marcada seguida por autoradiografa. Se revelan bandas que indican el nmero y tamao de los tipos de ARN complementarios a la sonda. Permite cuantificar aproximadamente y evaluar niveles de expresin de genes (para mejor precisin se usa RT-PCR en tiempo real). Tambin es til, entre otras cosas, como auxiliar del clonado de cDNA porque el tamao de un mRNA especfico puede compararse con el tamao de los cDNA copiados de ese mRNA, y revela si este cDNA est completo. En el Western blotting se transfieren protenas corridas en un gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o PVDF y luego se las visualiza por su reaccin con anticuerpos especficos. La PCR ha desplazado, paulatinamente, al Southern para varias de sus aplicaciones (por ser menos complejo, tener menos requerimientos de cantidad de templado, y porque puede automatizarse mejor) pero no en todos los casos (por ej., comparaciones evolutivas). Pero an en este ltimo caso, hoy en da empiezan a ser reemplazados por los SNPs o por comparacin directa de la secuencia nucleotdica de genes dia-

gnsticos. En algunos casos, se puede tener una sonda pero no conocer la secuencia nucleotdica para disear los iniciadores, por lo que se puede hacer un Southern si no se tiene la informacin como para hacer PCR. Northern y RT-PCR, dem que con Southern. La PCR comn (denominada de punto final) no es cuantitativa, para ello se debe hacer PCR de tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). El western es ms especfico que el ELISA (se identifica la banda). No da falsos positivos. Es ms complejo y caro. Se utiliza para confirmacin del HIV, por ej. 5) Indique si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas y justifique su respuesta: a) Un experimento de northern requiere desnaturalizacin de la doble cadena de ADN. b) En una reaccin de PCR estndar se utilizan dos primers complementarios a la cadena codificante. c) La secuenciacin por el mtodo de Sanger no requiere, en ningn paso la desnaturalizacin de la doble cadena del ADN. d) Al leer una autoradiografa en una secuenciacin de Sanger el extremo 5 del fragmento secuenciado se encuentra ms cerca del polo positivo y el extremo 3 ms cerca del polo negativo. R: a) FALSO. Se trata de ARN de simple cadena el que se somete a electroforesis. b) FALSO. Se utilizan dos primers complementarios a las dos cadenas. c) FALSO. En esta secuenciacin se requiere la desnaturalizacin del ADN. d) VERDADERO: Dado que es un mtodo de secuenciacin por sntesis, los fragmentos ms pequeos correspondern a la regin 5 del fragmento a secuenciar. Estos fragmentos pequeos migran ms y lo hacen hacia el polo positivo (ya que el ADN tiene carga negativa).

Problemas:
1) Suponiendo un alineamiento al azar de nucletidos en un fragmento de ADN, cul es la probabilidad de que una endonucleasa de restriccin cuyo sitio de reconocimiento consta de cuatro bases pueda cortar el ADN? y para una enzima de seis bases? y para una de ocho? R: A T C G 4 bases X X X * ( )4 = 3.9 10-3 *(probabilidad de que c/base se encuentre y que al lado se encuentre una base cualquiera) 6 bases ( )6 = 2.4 10-4 8 bases ( )8 = 1.5 10-5 Frmula general: (1/4)n, donde n = longitud de la secuencia que se busca. A medida que aumenta el nmero de bases disminuye la probabilidad de encontrar un sitio blanco de restriccin. 2) Un fragmento de ADN clonado, con extremos cohesivos generados por EcoRI, lleva el gen que codifica para un polipptido de la cpside de un virus que infecta a humanos, pero que enferma slo a personas

que tienen las defensas inmunolgicas disminuidas. Ese fragmento de ADN, que tiene 8 kpb de longitud, se inserta en el plsmido bacteriano pBR322 en su nico sitio para EcoRI. El plsmido recombinante es clivado por dos endonucleasas de restriccin (por separado o juntas) y luego es sometido a electroforesis en un gel de agarosa y teido con bromuro de etidio. En la figura se muestra el patrn de bandas (visualizadas por medio de luz UV) originado por cada uno de los tratamientos:
A) EcoRI B) BamHI C) E + B
8 kpb 6 kpb

a) Cul ser el patrn de bandas del RFLP para un individuo A1A1 utilizando la sonda 1? Y para uno A2A2? Y para el heterocigota? b) Y con la sonda 2? R:
Sonda 1
A1A1 A2A2 A1A2 6 kpb 4 kpb 6 kpb 4 kpb 2 kpb

Sonda 2
A1A1 A2A2 A1A2

5,5 kpb 4,5 kpb 4 kpb

4 kpb 3,5 kpb 3 kpb 2,5 kpb 1 kpb

Al realizar Southern blots de los geles "B" y "C", qu fragmentos hibridarn con una sonda del gen de la cpside del virus? R:
EcoRI 3 2,5 BamHI 5,5 4 4,5 3,5 1 EcoRI BamHI 4 BamHI

Aclaracin: Las distancias que se encuentran dentro del crculo son las correspondientes a los sitios de cortes BamHI. Las subrayadas, ms externas, marcan la distancia entre los dos sitios EcoR I y las que estn en negrita corresponden a las distancias entre cada sitio de corte (representado por las flechas). Los fragmentos de 3, 4 y 1 kpb del gel C estn dentro del segmento de 8 kpb, y estos hibridan con la sonda del gen de la cpside del virus. Dado que todos los fragmentos del gel B contienen una porcin del gen viral todos los fragmentos de este gel hibridarn con la sonda. 3) Un investigador est estudiando un polimorfismo en el largo de los fragmentos de restriccin (RFLP) ubicado en el cromosoma 7, que presenta dos alelos. El sitio de corte para EcoRI indicado con la flecha est presente en uno de los alelos (A1) y ausente en el otro (A2).
Sonda 1 Sonda 2 EcoRI EcoRI EcoRI

4 kpb

2 kpb

4) Un investigador est estudiando gen bacteriano que presenta tres dominios y desea introducirle mutaciones a dicho gen con el fin de estudiar su funcionalidad. Para ello parte del gen, del cual conoce su secuencia completa, clonado en un plsmido para su expresin en bacterias. a) Cmo hara para delecionar el dominio intermedio del gen? b) Cmo hara para verificar que el vector generado porta la delecin? c) Qu elementos de secuencia debe tener el plsmido para poder mantenerse, amplificarse y expresarse en bacterias? R: a) Un mtodo posible es cortando con una misma enzima de restriccin (o dos enzimas distintas que dejen extremos compatibles) flanqueando el dominio intermedio. Luego se religa el vector al cual le faltar el domino intermedio. En caso de que no se encuentren dichos sitios de restriccin se pueden generar mediante mutagnesis sitio dirigida. b) Para verificar que el vector porta la delecin se puede hacer una PCR con primers flanqueado la secuencia del dominio intermedio. Si est deletado dar un producto de PCR de menor tamao. c) El vector deber tener un origen de replicacin para poder duplicarse en la bacteria y un marcador de seleccin (generalmente un gen de resistencia a antibitico) de forma de poder seleccionar a las bacterias transformadas. En el caso de un vector cuya finalidad sea la expresin en bacterias, deber tener adems una secuencia promotora ro arriba del sitio mltiple de clonado (regin con sitios nicos de corte para muchas enzimas de restriccin). 5) El interfern est codificado por un gen que no contiene intrones. Por clivaje con BamHI, se genera un nico fragmento de restriccin conteniendo al gen completo, que puede ser identificado en un Southern blot con una sonda de cDNA marcada radiactivamente. Para determinar la posible causa de una inmunodeficiencia, muestras de sangre de pacientes y de personas no afectadas fueron utilizadas para estudiar el gen del interfern y la expresin del mismo. Se muestran a continuacin autorradiografas de Southern y northern de dichos experimentos, as como tambin un

western blo representat ot tivo utilizand anticuerp ando pos ti-interfern . Los indi n ividuos 1 y 2 no son afe ectados (sanos). En base a los resultados o n obtenidos en Soutn hern, northe y western ern n:
Southern Nort thern Western W

1 2

3 4

1 2

3 4

1 2

3 4

a) Cul sera la posib causa de l inmunodeficienble la cia en los pa acientes 3, 4, y 5? b) Qu ca aracterstica particular ti iene el individuo 2 para el gen del interfer ? n c) Importa a partir de qu tejido s realiz el Souta se l hern? Y el Northern y el Western? R: a) Pacie ente 3: En ba al northe notamos que el ase ern paciente 3 no present mensajero funcional. Esto ta o podra debe a una mu erse utacin punt tual en el pro omotor del gen, qu inhibe su expresin. Dado que el frague mento de re estriccin es de mayor t s tamao (corr mere nos en el S Southern) po odra tratarse de una mu e utacin puntual en el promotor perdindos un sitio b r se blanco para la enz zima de res striccin uti ilizada en p para el Southern. T Tambin pue ser inser ede rcin en la regin promotora y por lo tant no dar m to mRNA. El hec de cho no presenta mensajero trae como consecuen ar o o ncia la

al servarse a pa artir ausencia de protena lo cua puede obs del western. aciente 4: pre esenta el ale de tama normal en el elo o n Pa So outhern, men nsajero de tam mao salvaje pero una p e, protena defectuos de menor tamao. Po sa r odra debers a se un mutacin p na puntual que genera un codn Stop p c prema aturo y una p protena de m menor tamao o. Pa aciente 5: el t tamao del fr fragmento de restriccin, del e me ensajero y la protena parecieran ser normales, sin a em mbargo, pres senta inmun nodeficiencia Esto pod a. dra exp plicarse por una mutaci puntual que provoca un n q cam mbio aminoa acdico y la p protena pier su activid rde dad (ca ambio confo ormacional) o bien que el origen de la e enfermedad no tenga relac o cin con est protena. Por ta eje emplo podra tratarse de u mutacin en el recep a una ptor de interfern lo cual dar un fenotip similar al de ra po l los otros pacie s entes. Habra que demostrar, en un sia gu uiente paso, s la protena es o no fun si a ncional. Se les ocu como ha urre acerlo? b) El individu 2 es heter uo rocigota para dos varian ntes al licas del gen del interfer , mient que los r n rn tras restan son hom ntes mocigotas par uno (indiv ra viduos 1, 4 y 5) u otro alelo (in o ndividuo 3). c) Dado que e Southern se hace a partir de DN el NA gen nmico y to odas las clu ulas tienen el mismo DN e NA ent tonces no im mporta a par de qu tejido se ext rtir t trae mi ismo. En cam mbio en el n northern y en el western s e n im mporta dado que se est evaluando la expresin de l n los genes, la cu puede ser tejido especfica (como en s ual r o est caso). te

1. DIVIS SIN CEL LULAR

b) mitosis y meiosis II sis is c) meios I y meiosi II Co onsidere las d diferencias ta anto en el mecanismo co omo en los producto finales. os 3) El grfico r representa la variacin del contenido de o AD durante e ciclo vital de una clul DN el la:

Bibliograf fa:
Alberts y col. Cap. 17. Seccione La estrate es: egia general del ciclo cel lular, Cap. 20 Clulas ger 0 rminales y fertilizacin Beneficios del sexo, Meiosis n: hs ompor Griffith y col Cap.3: Mitosis y meiosis, Co tamient paralelo de genes auto to osmicos y c cromosomas, Gentica me endeliana y c ciclo de vida. . # problemas opcionales s #1) Cules son los mecanismos qu generan v s ue variabilidad en los organismos? 2) Enumere al menos 4 diferencias e e entre: a) mi itosis y meiosis I

Qu ocurr en el interv de tiemp de 2 a 3? re valo po C Cmo se deno omina la fase que transcu entre 3 y 4? e urre E grfico c Este corresponde a un ciclo mi ittico o a un no me eitico? Si la cantidad de ADN no se ha modif d ficado al fina al del ciclo, qu utilidad tien este proces ne so?. 4) Si C es la cantidad de ADN conte a e enida en un game eto, cul se la cantid de ADN (C, 2C, 4 er dad N 4C),

cromosomas y cromtidas en los siguientes perodos del ciclo celular en la especie humana? Marque con H D si la clula es haploide o diploide. valor Ncromo- N crom- H/D C somas tidas
G1 premittica G2 premittica Profase mittica Metafase mittica Telofase mittica (en c/ncleo) Espermatozoide Profase meitica I leptoteno Metafase meitica I Anafase meitica I Metafase meitica II Telofase meitica II (cada polo) Interfase premeitica (antes S) Interfase premeitica (despus S)

#5) Albert y Swift (1953) encontraron las siguientes cantidades relativas de ADN (en unidades arbitrarias) por ncleo en varios tipos de clulas del anlido Sabellaria: a) Primer cuerpo polar: 127 + 3 b) Esperma: 61 + 1 c) Profase mittica: 263 + 10 d) Telofase mittica: 124 + 3 Explique estas diferencias. 6) Una especie animal tiene 2n cromosomas: Qu proporcin de las gametas formadas tendrn los centrmeros: i) de origen paterno nicamente; ii) de origen materno nicamente; iii) de origen materno y paterno simultneamente? 7) Una cigota posee un 2n = 8; en el primer par de cromosomas homlogos uno de los miembros presenta un abultamiento ("knob") intersticial; en el segundo par uno de los miembros posee un satlite en posicin terminal, en el tercero uno de los cromosomas presenta un segmento heterocromtico terminal y el cuarto par es acrocntrico. Realice un esquema de las siguientes etapas de la mitosis y meiosis. a) metafase mittica b) metafase de meiosis I c) metafase de meiosis II d) anafase de mitosis e) anafase de meiosis I (dibuje los ordenamientos posibles en anafase I e indique qu probabilidad tiene cada uno de producirse). f) anafase de meiosis II

8) Otra cigota posee un complemento de dos pares de cromosomas homlogos A y a, B y b: a) cules de los siguientes complementos cabra esperar en las clulas somticas durante el crecimiento: AaBB, AABb, AABB o aabb? b) Podra encontrarse ms de una combinacin? Cuando este individuo llegue a adulto: c) cules de las siguientes combinaciones de cromosomas cabra esperar en las gametas?: Aa, AA, aa, Bb, BB, bb; Aa, Bb; A, a, B, b; AB, Ab, aB, ab; Aa, Ab, aB, Bb. 9) Dibuje la configuracin de los bivalentes en Paquitene, *Diplotene, Diacinesis y Metafase I de una especie con 2n= 4, donde uno de los pares es metacntrico y muestra regularmente durante toda la meiosis un quiasma intersticial a cada lado del centrmero; el otro es un acrocntrico con un nico quiasma intersticial en el brazo largo. Use lpices de colores para diferenciar a los dos homlogos. 10) Los conceptos de divisin reduccional o divisin ecuacional se refieren a: a) fenmenos citolgicos o genticos? b) Hay paralelismo entre dichos aspectos citolgicos y genticos? Si se tiene un par de cromosomas homlogos acrocntricos donde se ubican los genes A y a: c) En qu estadio efecta reduccin el segmento que contiene el gen A si ocurre un intercambio en la regin I? d) Realice el mismo razonamiento si el intercambio ocurre en II.

I II __________A____________ _______________________ A __________a____________ _______________________ I a II

#10) En qu organismos esperara la mayor variabilidad: a) en los que se reproducen asexualmente en los que lo hacen sexualmente? b) Suponga que el proceso meitico nunca hubiera aparecido en la evolucin biolgica: cul piensa Ud. que habra sido la consecuencia? c) En las especies animales que poseen una meiosis masculina aquiasmtica, hay recombinacin gentica en esas especies? 11) IMPORTANTE La direccin www.biologia.arizona.edu/cell/tutor/mitosis/01q.html contiene problemas relacionados al tema de divisin celular y cada uno de ellos trae cuatro opciones de respuesta siendo solo una la correcta. Es til como mtodo de ejercitacin y de autoevaluacin.

2. LEYES DE MEND S DEL Y EXTENSIONES DEL ANLISIS M A MENDELI IANO I

Bibliograf Griffiths y col. Cap. 2 y 4 a: Gua teric ca 1) Seale la importan ncia del con ncepto de se egregacin, por un lado, e ind n dependencia, por el otro, de la , herencia de caracteres d e derivada de las leyes de Mene del. Cul es la import tancia de la diploida en todo n esto? Sera lo mismo s las arvejas fueran mon a si s noploides en vez d diploides? de ? R: Adems de repasar l leyes de Mendel, se resalta las que la segre egacin e in ndependencia de la heren a ncia de los caracter es, valga la redundan res ncia, indepen ndiente de si los or rganismos so haploides o diploides y peron mite la reco ombinacin, entendida c como nuevas coms binaciones de alelos d distintos genes. Se puede de hacer, como ejercicio, q hubiese p o qu pasado con l gelas neraciones p paternales, F1 y F2 si las arveja fueas ran haploides. Ahora bi ien, la segreg gacin de ale se elos ve enmasca arada en los diploides po las interac or cciones de dominan ncia-recesivid dad. Por eso, antes de M Mendel, no se le enc contraba lgi a que 2 in ica ndividuos de fenoe tipo domina ante, tuviera descendie an entes con fe enotipo recesivo, por ejemplo. Destacar la importanc del cia anlisis num mrico-estad dstico para e establecer es lestas yes y que po ocos aplicaro previamen on nte. 2) Por qu procesos recombinan los genes en la u n meiosis? R: Despus de Mende se pudier el ron incorpor los rar conceptos d derivados de los avance en citoge e es entica (teora crom mosmica de la herencia y reformu e a) ular, en su acepcin moderna q los gen situados sobre n que nes diferentes c cromosomas recombinan mediante la sen gregacin a azar de los cromosom en la ana al mas afase y los genes si ituados en el mismo crom l mosoma se r recombinan por m medio del ent trecruzamien nto. 3) a) Qu es un monoh hbrido? Qu es un hbr u rido en ronmico o comercial (p ej. un h por hbrido sentido agr superrendid para Cla dor arn Rural)? b) Qu sig gnifica hacer un cru uzamiento di ihbrido o tri ihbrido? R:a) Monohbrido es s sinnimo de heterocigot para ta un nico g gen. Un hbr rido comercial es tambi un in heterocigota (pero con s a sobredomina ancia para el carcter rendimie ento). No se lo debe conf fundir con h bridos interespecf ficos que so resultados de cruzam on s mientos interespecf ficos y se ver en la gua de alteracio rn a ones. b) Hacer un cruzamiento dihbrido o trihbrido si n o ignifica analizar v varios pares de alelos, do (Aa Bb) o 3 (Aa os Bb Cc) resp pectivamente siempre he e, eterocigotas. 4) Qu es r retrocruza? cruzamien prueba? Y nto R: Un cruza amiento prue es un cru eba uzamiento en un ntre heterocigota y el padre recesivo pa las caracterstia ara cas en estud dio AA x aa Aa A Se h hace Aa x aa (cruzamient prueba) to

La retrocruza e un cruzam a es miento entre el heterocigo e ota (F1) o cualquie de las sig era guientes gene eraciones y cualquiera de los padres originales. 5) qu cons En siste la prueb de comple ba ementacin? R: Cruzamient entre dos mutantes ho to omocigotas c con fen notipo simila (por ejemp albino) para determi ar plo p inar si la F1 tiene fenotipo sal lvaje (indica ativa de que las mu utaciones est localizad en distintos genes). Es el tn das cas tpico de una va m so e metablica de varios pas e sos. Ta anto si hay u mutacin para el pri una n imer paso de la e va como para el segundo, la consecue a, a encia es que no e se formar el producto fin (por ejem nal mplo antocia anas de color rojo, dando albinismo). Si se cruza una m mutan para el ge codificant para la prim enzima de nte en te mera a la va metabli con otro para la segu ica unda, la F1 s ser het terocigota para ambos g genes. Como generalme o ente los alelos salv s vajes (enzima normal act a tiva) son dominan ntes, las en nzimas sintet tizadas se complementa c arn par restaurar la va metab ra blica, indep pendienteme ente de que los al lelos salvaje estn en repulsin (en es n ans). El 100% de la F1 es salvaje. Esta prueba se a tra con ntrasta con la prueba de recombinaci (lo que c in confun a los alu nde umnos). En la prueba de recombinaci in, pu uede ocurrir que las muta antes indepe endientes se corre espondan al mismo gen pero en nuc cletidos dist tintos lo que pos s, sibilita que se produzca un entrecru uzami iento entre las 2 posicio ones mutadas generando un s rec combinante s salvaje. En e caso, la F1 ser de fe este F enotip mutante en un 100% (los alelo mutados del po % os mi ismo gen no se pueden co omplementar salvo algunos r, cas muy exc sos cepcionales llamados de complemen e ntaci intragnic En la F en una proporcin m n ca). F2, p muy pequea (por ejemplo 1x1 -4) aparece salvajes por 10 en rec combinacin Claramen n. nte, no son proporcio n ones me endelianas. E tipo de experimento le sirviero a Este os on

Benzer para establecer las distancias mnimas o problemas que se refieren a estos ejemplos dado que, unidades de recombinacin en sus experimentos con experimentalmente, cuando se obtiene una progenie fagos. Hoy sabemos que esta distancia o unidad es el segregante, normalmente no se sabe de antemano si el comportamiento es de tipo episttico y menos an a nucletido. 6) Qu ventajas tiene el uso de caracteres, genes o qu variante de epstasis se corresponde. En este conmarcadores codominantes (respecto a los dominantes) texto, resulta til disponer del cuadrito de abajo que muestra algunos ejemplos del tipo de proporciones en un anlisis gentico de segregacin? R: Se puede distinguir los heterocigotas de los homo- fenotpicas posibles. cigotas, por lo que se dispone de mayor informacin Problemas: (estadstica) en una Tipo de interaccin gnica 9 3 3 1 Razn F2, por ejemplo. ReA-B- A-bb aaB- aabb fenotpica trocruzar F1 con el Ninguna (cuatro fenotipos distintos) 9 3 3 1 9:3:3:1 doble recesivo (cruAccin gnica complementaria 9 7 9:7 zamiento prueba), en Supresin dominante de A sobre el alelo dominante B 12 3 1 13:3 vez de autofecundar. Epstasis recesiva de aa sobre los alelos B y b 9 3 4 9:3:4 7) Cul es la base Epstasis dominante de A sobre los alelos B y b 12 3 1 12:3:1 molecular de las inGenes duplicados 15 1 15:1 teracciones gnicas, 1) Si dispone de las siguientes cepas de Drosophila dominancia, semidominancia, codominancia, sobreii) salvaje y iii) bw_vg ; dominancia (=heterosis o vigor hbrido), y dominancia i) bw e ; bw e bw vg incompleta? R: Repasar concepto un gen-un polipptido y qu im- y desea comprobar las leyes de Mendel, indique: plica a nivel de fenotipo (ej. grupos sanguneos). Es a) Todos los cruzamientos que le permitiran hacerlo y la segregacin de qu carcter (o caracteres) estudiara decir, en la codominancia se expresan los dos alelos. La sobredominancia implica que la F1 supera en el en cada caso. carcter estudiado (usualmente rendimiento agron- b) Es equivalente el cruzamiento directo al recproco? mico) a ambos padres. Dominancia incompleta: el heterocigota presenta ras- c) Deben usarse hembras vrgenes en todos los cagos intermedios entre cada tipo de homocigota, no es sos? 2) Si dos pares de genes A:a y B:b se transmiten inigual a ninguno de ellos. dependientemente y se sabe que A es dominante sobre 8) Normalmente, de un carcter autosmico doa y B dominante sobre b, cul es la probabilidad de minante relacionado con alguna enfermedad se obtener: espera que cada individuo afectado tenga al menos un progenitor tambin afectado. Pero, puede a) una gameta AB a partir de un individuo AaBb? b) una gameta Ab a partir de un individuo AA Bb? suceder que ambos padres no manifiesten la enc) una cigota AABB a partir de aabb X AABB? fermedad? d) un fenotipo AB a partir de AaBb X AaBb? R: Penetrancia (incompleta) e) un fenotipo AB a partir de AABB X aabb? f) un fenotipo aB a partir de AaBb X AaBB? 3) Considere el cruzamiento AaBbCcDdEe x aa aaBbccDdee. (a) Qu proporcin de la descendencia ser fenotpicamente como: 1) el primer parental, 2) el segundo parental, 3) cualquiera de los dos parentales y Aa 4) ninguno de ellos? (b) y genotpicamente? Suponga 9) A qu se denomina interacciones gnicas? que la segregacin es independiente. R: Interaccin entre dos o ms genes de distintos loci 4) Enumere las proporciones genotpicas y fenotpicas en la que uno interfiere o modifica la expresin feque puede formar el trihbrido AaBbDd cuando es notpica de otro. Generalmente se denomina hiposttiautofecundado (o cruzado por uno de constitucin co al gen que slo se manifiesta fenotpicamente genotpica similar) suponiendo que A y B son domicuando otro locus (episttico) presenta determinado nantes y que D tiene dominancia incompleta sobre d. genotipo. Epstasis = modificaciones de las proporciones fe- 5) Se sabe que existe una serie de 4 alelos en determinada especie diploide (2n); cuntos estaran presentes notpicas debidas a interaccin gnica b) un par cromosmico? Los casos de epstasis son muy numerosos en genti- en: a) un cromosoma? c) un individuo de la especie? ca, muchos ms de los que aparecen en los libros de texto. Sin embargo, varios textos tratan con detalle e d) sobre la misma base: cuntas combinaciones difeincluso dan definiciones de algunos de estos ejemplos. rentes de alelos se espera que ocurran en la poblacin No es de inters para esta materia que los estudiantes completa? memoricen estos ejemplos y mucho menos las defini- 6) En el ratn, el gen para el albinismo presenta una ciones de cada uno de ellos. Sin embargo, hay algunos serie de alelos mltiples. Cuatro de estos alelos (clasi-

ficados de acuerdo con la disminucin de intensidad del color de pelo de los homocigotas) son: C = color completo (tipo salvaje) cch= chinchilla cd = dilucin extrema c = albino Las relaciones de dominancia son C> cch> cd> c. a) Haga un esquema de un cruzamiento entre un ratn salvaje heterocigota para dilucin extrema y un ratn chinchilla heterocigota para el albinismo. b) Otro gen que afecta el color del pelo en el ratn tiene su locus en otro cromosoma, y presenta los alelos B para pelo negro (tipo salvaje) y b para castao. Ampliar el esquema anterior incluyendo el dato de que los dos ratones que se cruzan son heterocigotas para ese gen. 7) Un fitopatlogo llamado Flor vio que algunas variedades de lino presentan diferente resistencia a distintas razas de un hongo, Melampsora lini. La variedad de lino 770B es resistente a la raza 24 y susceptible a la raza 22, mientras que la raza Bombay es resistente a la 22 y susceptible a la 24. Si se cruzan las variedades 770B y Bombay, el hbrido obtenido es resistente a ambas razas 22 y 24. Cuando autofecund la F1 se produjo una F2 con las siguientes proporciones fenotpicas: RAZA 22 RAZA 24 Resistente Susceptible Resistente 110 43 Susceptible 32 9 a) Proponga una hiptesis para explicar la base gentica de la resistencia del lino a estas razas particulares de hongos. b) En base a su hiptesis, qu nmero de cada una de las cuatro categoras aparece en F2? c) Pruebe su hiptesis usando 2. LEYES DE MENDEL Y EXTENSIONES DEL ANLISIS MENDELIANO II 8) Si el carcter antenas largas (a) est ligado al sexo (determinacin XX-XY) en el mosquito Sinospica rascaremus, qu probabilidad hay de obtener un mosquito macho y con antenas largas en el cruce A/a x A/Y?. 9) Averiguar si el modelo de herencia del rasgo definido en el siguiente pedigr, se corresponde con un tipo de herencia autosmica dominante, autosmica recesiva, dominante ligada a X, recesiva ligada a X o ligada a Y. Podra ser vlida ms de una hiptesis?

fueron los siguientes: 92 rojas, 30 cremas, 41 blancas. Explique. 10) En el ratn hay un alelo mutante que causa encorvamiento de la cola. A partir de los resultados de los cruzamientos que se indican a continuacin deduzca el tipo de herencia de este carcter: a) Es recesivo o dominante? b) Es autosmico o ligado al sexo? c) Cules son los genotipos de los progenitores y de las progenies en cada uno de los cruzamientos? Cruza Progenitores Progenie 1 2 3 4 5 6
Madre Padre Normal Curva Curva Curva Norma Curva Curva Hijas Hijos Todas curvas Todas normales 0,5 curvas 0,5 curvas Normal 0,5 normales 0,5 normales Normal Todas curvas Todas curvas Normal Todas normales Todas normales Curva Todas curvas Todas curvas 0,5 curvas Curva Todas curvas 0,5 normales

9) En una especie cultivada se realiz un cruzamiento entre plantas de flores rojas y plantas de flores blancas. La progenie F1 fue roja. En la F2 los resultados

11) En Drosophila se aparearon 2 moscas de fenotipo "alas curvadas" (Curly) y "setas anormales" (Stubble). Se analiz un gran nmero de descendientes adultos y la proporcin fue la siguiente: 4 CySb: 2 CySb+: 2 Cy+Sb: 1 Cy+Sb+. Explique estos resultados. 12) El color del pelaje en los perros depende de la accin de por lo menos 2 genes. En un locus, un inhibidor episttico dominante (I) de la pigmentacin evita la expresin de los alelos del color que se ubican en otro locus de segregacin independiente y en consecuencia produce pelaje blanco. Cuando se da la condicin recesiva ii , los alelos del locus hipoststico pueden expresarse: iiN_ produce color negro, iinn produce color caf. En un cruzamiento dihbrido para ambos loci, determine: a) proporciones fenotpicas esperadas en la progenie. b) probabilidad de hallar, en la progenie de color blanco, un individuo que sea homocigota para ambos loci. 13) En una especie cultivada se realiz un cruzamiento entre plantas de flores rojas y plantas de flores blancas. La totalidad de la F1 present flores rojas. En la F2 los resultados fueron los siguientes: 92 rojas, 30 cremas, 41 blancas. Qu procesos explicaran estos resultados? 14) Se cruzaron dos cultivares de arveja con flores blancas y se obtuvo una F1 homognea con flores moradas. El cruzamiento al azar entre individuos de la F1 produjo 96 plantas hijas, de las cuales 53 presentaron flores moradas y 43 presentaron flores blancas. En este ejemplo: a) A qu proporcin fenotpica se aproxima la F2? b) Qu tipo de interaccin participa? c) Cules seran los genotipos probables de las cepas progenitoras? 15) Las gallinas Black Langshan tienen patas con plumas, mientras que las patas de las Buff Rock no son emplumadas. Del cruzamiento entre ambas se obtiene una F2 integrada por 15 individuos con patas

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emplumadas y slo 1 sin plumas. Diagrame los cruzamientos y explique los resultados. 16) En la rata, dos parejas allicas A:a y R:r interactan de la siguiente forma: A_R_: pelaje gris. aaR_: pelaje negro. A_rr: pelaje amarillo. aarr: pelaje color crema. Estos genotipos slo pueden expresarse en presencia de un alelo dominante de un tercer gen, D, mientras que su alelo recesivo d causa albinismo. Cuatro lneas albinas homocigotas diferentes fueron cruzadas con una lnea pura de color gris, y estos cruzamientos produjeron las correspondientes F1 grises. Estas F1 produjeron las siguientes F2: Lneas Cantidad de individuos en las distintas F2 albinas Gris Amarillo Negro Crema Albino 174 0 65 0 80 1 48 0 0 0 16 2 104 33 0 0 44 3 292 87 88 32 171 4 a) Cul es el genotipo de cada lnea albina? b) Qu tipo de interaccin -si la hay- est implicada en estos cruzamientos? IMPORTANTE: Una vez resueltos los problemas de la gua, las siguientes direcciones de Internet contienen problemas que, a manera de repaso, permiten incursionar en las tcnicas de autoaprendizaje con autoevaluacin. http://www.biologia.arizona.edu/mendel/sets/mono/m ono.html (cruza monohbrida) http://www.biologa.arizona.edu/mendel/sets/di/02Q.h tml (cruza dihbrida)

3. MAPEO CROMOSMICO
Bibliografa: Griffiths o cualquier otro libro de gentica. Gua Terica: 1) Cmo y cuando se encontr el fenmeno de ligamiento entre genes? Por qu contradice las leyes de Mendel? R: A principios del siglo XX se encontraron genes que no respondan a la segunda ley de Mendel. En ese momento no se conoca la base fsica (teora cromosmica de la herencia) pero el descubrimiento del ligamiento ayud mucho a postular esta hiptesis, luego comprobada. Actualmente se sabe que, en los organismos diploides, hay 2 copias homlogas de cada cromosoma que pueden llevar alelos distintos del mismo gen. Estas copias segregan en igual proporcin que las gametas, de acuerdo a la primera ley de Mendel. Si consideramos 2 genes ubicados en cromosomas diferentes, stos segregarn al azar, obtenindose proporciones similares de gametas parentales y recombinantes (primera ley de Mendel). Si, en cambio, los 2 genes se ubican en el mismo cromosoma, no segregan en forma independiente sino que tendern a segregar juntos. Se dice, entonces, que estos genes se encuentran ligados. En este caso las gametas sern nicamente parentales, no formndose recombinantes. Es como

si los dos genes fueran en realidad uno slo. Sin embargo, durante la primera fase de la meiosis, se producen entrecruzamientos entre cromosomas homlogos que resulta en un intercambio fsico como lo demostraron Creighton y Mc Clintock en 1931 utilizando marcadores citolgicos combinados con marcadores genticos. Estos entrecruzamientos se visualizan como quiasmas a nivel citolgico. Si imaginamos una distribucin aleatoria de los entrecruzamientos a lo largo del cromosoma, la probabilidad de que ocurra un entrecruzamiento es aproximadamente proporcional a la distancia que separa a los genes en el cromosoma: cuanto ms separados se encuentren, ms probable es que ocurra un entrecruzamiento entre ellos. En consecuencia, determinando la frecuencia de recombinantes, podemos obtener una medida de la distancia entre los genes ligados. Esta es la base para la construccin de mapas genticos. El mapeo gentico se realiza mediante anlisis de cruzamientos planificados, pruebas de progenie y anlisis de pedigr. Es decir, mediante el anlisis comparativo de fenotipos recombinantes. El mapeo fsico se realiza mediante el anlisis de clones genmicos (mediante mapeo de contigs de los cuales se conocen, por ejemplo, sus mapas de restriccin), combinado con secuenciacin nucleotdica, por hibridacin in situ, u otros mtodos que no involucran cruzamientos y anlisis de recombinantes. En este caso, las distancias se calculan en nucletidos o mediante medicin de cromosomas. 2) Cundo se dice que 2 genes estn en acoplamiento o en repulsin? R: Alelos mutantes ubicados en el mismo cromosoma o separados en los 2 cromosomas homlogos. Acoplamiento: AB ; Repulsin: Ab ab aB 3) Qu relacin existe entre ligamiento y mapeo? R: Establecer el ligamiento y calcular la distancia permite en base a las distancias relativas de muchos genes establecer un mapa gentico. 4) Cul es la base fsica del mapeo gentico? Qu relacin tienen los estudios de mapeo gentico con los entrecruzamientos y quiasmas que se observan en las meiosis? Qu similitutes, relaciones y diferencias existen entre el mapeo gentico y el mapeo fsico o genmico? R: Los genes son segmentos de ADN pertenecientes a una larga molcula que constituye un cromosoma. Los recombinantes para genes pertenecientes al mismo cromosoma surgen porque en la meiosis hay entrecruzamientos (que se pueden visualizar microscpicamente en la forma de quiasmas) entre cromosomas homlogos. El mapeo gentico se realiza mediante anlisis de cruzamientos planificados, pruebas de progenie y anlisis de pedigr. Es decir, mediante el anlisis comparativo de fenotipos recombinantes. El mapeo fsico se realiza mediante el anlisis de clones genmicos mediante mapeo de contigs (de los cuales se conocen, por ejem-

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plo, sus mapas de restriccin), combinado con secuenciacin nucleotdica, por hibridacin in situ, u otros mtodos que no involucran cruzamientos y anlisis de recombinantes. Las distancias se calculan en nucletidos o mediante medicin de cromosomas. El orden fsico de los genes en el cromosoma coincide con el orden que surge de su mapeo gentico. Existe, adems, una correspondencia proporcional relativa entre distancia gentica y distancia calculada en nucletidos, aunque la correspondencia no es absoluta y vara en distintas partes del cromosoma. Es decir, una unidad de mapa significa un nmero distinto de nucletidos cerca del centrmero que cerca del telmero, porque las frecuencias de entrecruzamiento (formacin de quiasmas) son distintas. La vecindad de regiones heterocromticas tambin afecta la frecuencia de aparicin de quiasmas y la relacin absoluta entre distancia gentica/distancia fsica. 5) Qu es y cmo se hace una prueba de 2 puntos? Qu significa la palabra punto en prueba de 2 puntos? Implica ligamiento? R: Se estudia el ligamiento en cruzamientos de dobles heterocigotas por dobles recesivos (Ver libro para una explicacin ms completa) 6) Qu es una unidad de mapa? Es sinnimo de centiMorgan, frecuencia de recombinacin o de unidad de recombinacin? A cuntos nucletidos equivale una unidad de mapa? R: Se define como unidad de mapa a la distancia entre genes (o marcadores) para los cuales se observa un recombinante con una probabilidad de uno en 100 productos de la meiosis. Una unidad de mapa sera, entonces, equivalente a una frecuencia de recombinacin del 1%. Es decir, que se calcula mediante la frmula del % de recombinantes sobre totales y es sinnimo de unidad de recombinacin. Los cM tienen otra frmula de clculo que toma en cuenta la posible existencia de dobles entrecruzamientos y la interferencia. No siempre coinciden. Como se mencion, la unidad de mapa gentico vara (en nmero de nucletidos) segn la especie, el cromosoma y localizacin dentro del mismo cromosoma. Groseramente, 1 cM equivale a 1 megabase (un milln de pares de bases) en humanos. 7) Pueden 2 genes estar ligados a ms de 50 u.m.? Por ejemplo, pueden estar a una distancia de 200 u.m.? Qu es un grupo de ligamiento y a qu se corresponde fsicamente? R: Primero, hay que ver de dnde sale este lmite de 50 u.m. Al momento de la meiosis, cada cromosoma del par de homlogos se halla conformado por 2 cromtides. Es decir, al momento del apareamiento en el que se produce el entrecruzamiento tenemos 4 cadenas de ADN vecinas. Sin embargo, slo 2 de las 4 hebras participa en el entrecruzamiento, por lo que, como resultado, slo la mitad de las gametas podrn ser recombinantes. O sea que entre 2 genes ubicados en el mismo cromosoma que estn lo suficientemente

lejos como para que siempre exista un entrecruzamiento entre ellos, la mxima proporcin de recombinantes ser del 50%. Por lo tanto, 2 genes pueden estar ligados a ms de 50 u.m., pero no lo puedo determinar mediante una simple prueba de 2 puntos entre ambos genes analizados, porque la mxima distancia determinable por este mtodo es de 50 u.m. Necesito un gen puente (o varios) para poder integrar a los dos genes en el mismo grupo de ligamiento. Por lo tanto, un grupo de ligamiento est formado por el conjunto de genes (o marcadores genticos) que se comportan como ligados entre s en forma directa o a travs de otros genes puente. El grupo de ligamiento se corresponde a todos los genes o marcadores genticos localizados en el mismo cromosoma o molcula de ADN. Se llama desequilibrio de ligamiento al fenmeno que se da entre dos alelos de dos genes distintos que se heredan juntos con una probabilidad mayor que la dada por el azar. Esto se debe en general a que los genes estn ligados. 8) Qu es una prueba de 3 puntos? En una prueba de 2 puntos, se puede establecer un orden de los genes? y en una de 3? hasta qu punto? R: Cuando se estudia el ligamiento simultneo entre 3 genes (por ej. A, B y C), se puede establecer un orden ya que (suponiendo que el orden sea ABC), la distancia (prueba de 2 puntos) entre A y C es aproximadamente igual a la suma de la distancia entre A-B + B-C. En una prueba de 2 ptos. no se puede establecer un orden, slo distancias relativas. En la de 3 s, pero no se sabe si los 2 puntos extremos (A y C) estn a la derecha o a la izquierda. 9) Porqu no hacer 2 o 3 pruebas de 2 puntos? Dan distintos resultados? Por qu? Qu es interferencia y cmo se calcula el coeficiente de coincidencia? R: Pueden dar resultados distintos por el fenmeno de subestimacin de dobles entrecruzamientos y/o de interferencia. En el ejemplo de arriba, la distancia entre A y C (medida como prueba de dos puntos) suele ser menor a la de A-B + B-C. Esto se debe a la presencia de de entrecruzamientos dobles entre Ay C cuyo resultado final es la formacin de gametas parentales AC y ac para estos 2 genes que se computan como No recombinantes, cuando en realidad lo son. Si nosotros no hubiramos mapeado el gen B nunca hubiramos detectado estos dobles entrecruzamientos (ni triples, ni cudruples). Si extendemos este pensamiento, en realidad tampoco sabemos si entre A-B hubo entrecruzamientos dobles y si tambin estamos subestimando la proporcin de recombinantes entre A y B. Cuanto ms grande la distancia entre 2 marcadores, ms inexacta ser la frecuencia de recombinantes como medida de la distancia entre los genes. Adems, est el fenmeno de interferencia que se relaciona con un impedimento estrico o fsico que reduce la probabilidad de que se produzcan Adems, est el fenmeno de interferencia que se relaciona con un impedimento estrico o fsico que reduce la probabilidad de

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que se produzcan quiasmas muy cercanos entre s (se interfieren) por lo que el nmero de recombinantes entre genes muy cercanos entre s es menor al probabilsticamente esperado. Algunas funciones de mapeo ms refinadas, toman en cuenta este fenmeno. Estas funciones se derivan de la funcin de Poisson y son, fundamentalmente, dos: la de Haldane (que considera los dobles entrecruzamientos pero no considera la interferencia) y la de Kosambi (que considera ambas). Por lo general, todos los mapas que se publican se basan en la funcin de Kosambi. 10) Por qu, en una prueba de 3 puntos, realizar un cruzamiento prueba facilita el anlisis? R: Porque el cruzamiento con el homocigota recesivo permite concentrarse directamente en las gametas de la F1 permitiendo distinguir las gametas que portan alelos recesivos de dominantes mediante una sencilla relacin de 1 a 1. Esto es particularmente til para genes en los que no se puede distinguir el fenotipo heterocigota del homocigota dominante. Toda la progenie segregante ser homocigota recesiva o heterocigota (no habrn homocigotas dominantes) 11) Es sencillo aplicar los sistemas arriba mencionados para mapeo en humanos? Por qu? Es posible utilizar informacin de pedigr para hacer estudios de ligamiento? Existen otros mtodos alternativos de mapeo? En qu consiste el mtodo de mapeo con hbridos somticos (fusin interespecfica de clulas)? En qu consiste la hibridacin in situ? R: No se pueden planificar cruzamientos en humanos, obtener lneas puras (depresin por endocra) y las progenies son poco numerosas (estadsticamente problemticas). El mapeo preciso y fino se realiza mediante tcnicas fsicas como la utilizacin de hbridos somticos (libro). Lo que se utiliza es la informacin de pedigr con funciones de mapeo basadas en Lod score. El ndice Lod score es la medida estadstica del ligamiento. Cuando las familias son numerosas y se encuentran individuos recombinantes en ellas, el anlisis es simple. Pero esto no siempre es as. Las familias con enfermedades interesantes no suelen ser numerosas, y no sirven para realizar un anlisis estadsticamente significativo. Por lo tanto, se deben tomar los datos de varias familias. El lod score, Z, es el logaritmo de la probabilidad de que dos loci estn ligados respecto de que no lo estn. La probabilidad general de ligamiento en un grupo de familias, es el producto de las probabilidades de cada familia individual, por lo que los lods scores al ser logaritmos permiten que se sumen los datos para esas familias. 12) Qu significa ndice Lod o Lod score? En qu casos se utiliza?Por qu en los ltimos aos prcticamente todos los estudios de mapeo gentico en todas las especies se realizan con marc. moleculares? R: Probabilidad de ligamiento (ver Griffitts). El Lod es el logaritmo en base 10 del cociente entre: Probabilidad de obtener los datos observados si los loci estuvieran ligados/ Probabilidad de obtener los datos observados si no estuviesen ligados. Por ej. un

Lod = 3 para un par de genes indica que es mil veces ms probable que los genes estn ligados respecto a que no lo estn. Programas como el MapMaker tambin utiliza Lod Scores para comparar diferentes rdenes posibles entre varios genes. Al orden ms probable le asigna un 0 y a los restantes le asigna valores negativos. Porque permiten una cobertura del genoma que no permiten los caracteres morfolgicos. 13) Qu similitudes y diferencias existen entre los clculos de distancias usando las frmulas vistas arriba y los algoritmos de programas como el Mapmaker? R: Las frmulas son un distintas porque los algoritmos del Mapmaker estn basados en Lod score (clculo de probabilidades). Estos clculos probabilsticos estn basados, sin embargo, en el mismo concepto y la misma lgica que existe atrs de las funciones de mapeo en pruebas de dos o tres puntos. Sin embargo, son ms poderosas, porque al tratarse de una prueba de muchos puntos simultneamente, permite afinar mucho ms el clculo minimizando errores debidos a dobles entrecruzamientos e interferencias.

Problemas:
1) En el gusano de seda Bombix mori, el gen recesivo l produce color amarillo limn en la larva, mientras que el L da color blanco. El dominante B, produce bandas negras transversales, mientras que el recesivo b no las produce. Ambos loci estn ligados y su distancia gentica es de 30 unidades de recombinacin. Se cruz una hembra homocigota blanca y con bandas con un macho amarillo sin bandas negras. Los machos de la F1 se utilizaron para fecundar hembras amarillas y sin bandas negras. Qu segregacin fenotpica y genotpica se obtuvo? 2) a) En Drosophila y para caracteres autosmicos, cuando se quiere realizar un cruce de prueba se utilizan hembras heterocigotas y machos homocigotas recesivos. Por qu no se hace el cruzamiento recproco? b) En D. melanogaster se encuentra un gen letal a que produce, en homocigosis, la muerte de la larva, y est ligado con un 40% de sobrecruzamiento al locus B/b. El alelo B produce un abdomen deforme y el b un abdomen normal. Se pide la segregacin fenotpica y genotpica observable en los adultos en un cruzamiento entre un macho heterocigota en fase de acoplamiento y una hembra heterocigota en fase de repulsin. 3) Una mosca de la fruta con genotipo B R/ b r es retrocruzada con una de genotipo b r/ b r. En el 84% de las meiosis no ocurren quiasmas entre los pares de genes ligados; en el 16% ocurre un solo quiasma entre ellos. Qu porcentaje de la progenie ser Bbrr? a) 50%; b) 4%; c) 84%; d) 25% ; e) 16%. Explique. 4) En Lathirus odoratus hay un locus que codifica para el color de las flores: P = prpura, p = rosa, y otro locus para la forma de la semilla: R = semilla redonda, r = semilla alargada. En la polinizacin de una planta, resultado del cruce de lneas puras prpura redonda por rosa alargada, con otra descendiente del

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cruce rosa redonda por prpura alargada, se obtuvieron los resultados indicados: PR=99, Pr=44, pR=44, pr=3. Existe ligamiento entre ambos loci? 5) En la descendencia de un cruzamiento prueba de un triheterocigota se obtuvieron los siguientes resultados: Fenotipos Frec. abs. ABD 50 ABd 32 AbD 538 aBd 600 abD 28 abd 62 Se desea saber: a) la fase del genotipo parental; b) el locus central; c) las distancias genticas; d) el valor de la interferencia. 6) En los ovarios de plantas superiores se forman ncleos haploides que resultan de una meiosis y sucesivas mitosis sin citocinesis, formando una clula multinucleada llamada gametofito femenino (el ncleo masculino se fusiona con uno de estos ncleos, que acta como vulo). En algunas conferas, el gametofito femenino puede ser bastante grande; este hecho permite que pueda ser extrado y analizado electroforticamente. Un rbol de pino es heterocigota para los alelos electroforticos "rpido" (r) y "lento" (l) de las enzimas alcohol dehidrogenasa (AdhF/AdhS) y fosfoglucomutasa (PgmF/PgmS). Se estudi electroforticamente una muestra de 237 gametofitos femeninos y se encontraron los siguientes fenotipos: 23 AdhF PgmF, 24 AdhS PgmS, 93 AdhF PgmS y 97 AdhS PgmF. a) Estn estos genes ligados? b) Calcule la distancia entre los genes Adh y Pgm y en qu fase estn. Otro gen que codifica para la enzima esterasa (Est) tambin presenta dos alelos: EstF y EstS; el mismo est ubicado entre los loci Adh y Pgm. De la misma muestra antes estudiada se obtuvieron los siguientes resultados. Calcule la distancia: AdhF EstF PgmF: 7 AdhS EstS PgmS: 10 AdhS EstF PgmS: 14 AdhF EstS PgmF: 16 1 AdhF EstS PgmS: AdhS EstF PgmF: 1 F F S Adh Est Pgm : 92 96 AdhS EstS PgmF: Total 237 c) Coinciden las distancias calculadas para AdhPgm? Explique. d) Cul es el coeficiente de coincidencia y la interferencia? 7) El padre del Sr. Spock, segundo oficial de la nave Enterprise, proviene del planeta Vulcano y su madre del planeta Tierra. Los vulcaneos tienen sus orejas puntiagudas (P), ausencia de glndulas adrenales (A) y el corazn del lado derecho (R). Todos estos alelos son dominantes sobre los alelos terrqueos. Estos genes son autosmicos y estn ligados, tal como se muestra en el mapa de ligamiento:

P/p A/a R/r _l___________l____________l__ l__15 um____l___20 um____l Si el Sr. Spock se casa con una terrquea y no existe interferencia (gnica), Qu proporcin de sus hijos mostrarn: a) Apariencia vulcanea para los tres caracteres? b) Apariencia terrquea para los tres caracteres? c) Orejas y corazn vulcaneos, pero adrenales terrqueas? d) Orejas vulcaneas pero corazn y adrenales terrqueas? 9) Bridges y Morgan realizaron numerosos cruzamientos en Drosophila melanogaster. En cierto experimento cruzaron machos sin alas (apterous) con hembras de cuerpo negro (black). En la F2 obtuvieron 186 individuos salvajes, 85 apterous, 99 black y ninguno con ambos caracteres. Qu se deduce de los resultados obtenidos?. Razone la respuesta. 10) Un genetista quiere mapear los genes A, B, J, D y E mediante dos cruzamientos de tres puntos. El primer cruzamiento lo realiza con lneas puras para los cinco genes. Despus, el investigador cruza los individuos de la F1 con individuos homocigotas recesivos, y el fenotipo de la descendencia es como sigue: ABJDE 316 ABJdE 31 AbJdE 130 AbJDE 17 abJdE 314 abJDE 39 aBJDE 140 aBJdE 13 Las lneas puras utilizadas en el segundo cruzamiento son las siguientes: AABBJJDDEE x aaBBjjDDee. De nuevo, el investigador cruza los individuos de la F1 con homocigotas recesivos, obteniendo los siguientes fenotipos: ABJDE 243; ABJDe 155; aBjDe 237; aBjDE 165; ABjDe 62; aBJDe 46; aBJDE 58; ABjDE 34. Por trabajos previos el investigador sabe que los genes D y E tienen segregacin independiente entre s. a) Elaborar el mapa correspondiente a estos 5 genes y determinar, si es posible, la distancia entre ellos. b) Existe interferencia? Mapeo II 11) El gen de resistencia al virus del mosaico del tabaco se ha tratado de mapear en tomate respecto a marcadores moleculares que detectan RFLP. Se supone que existe un alelo que confiere resistencia, dando un fenotipo totalmente resistente en homocigosis, y un fenotipo parcialmente resistente en heterocigosis. Existe una variedad de Lycopersicum peruvianum (especie emparentada al tomate) totalmente resistente al virus pero con otras caractersticas agronmicas indeseables; y otra que es totalmente susceptible al virus pero potencialmente atractiva agronmicamente. Al cruzar individuos de ambas variedades se obtuvieron plantas hbridas F1, parcialmente resistentes. Se presentan los resultados de RFLP, para tres marcadores moleculares diferentes, de los individuos parentales y de 20 individuos originados por autofecundacin de la F1 (F2), acompaados de los resultados fenotpicos

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observados en los ensayos biolgicos con el virus: R (totalmente resistente), P (parcialmente resistente) y S. Fenotipo Padres 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Sonda R S P P R R P R R P R --- --- --- --- --- --- --- --PTG9 ----- --- ----- ----- --- ------PCD3 ----- --- --- --- --- --- --- --- ----------- --PXY ----- --- ----- --- ----Fenotipo 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Sonda R P P R S R S R S P R --- --- --- --PTG9 --- --- --- --- --- --------- --- --- ----- --------- --PCD3 --- --- --- --------- ------- --- --- --- --- --PXY --- ----- ----- ----- ----a) Calcular el porcentaje de cosegregacin del gen de resistencia junto a cada gen marcador e indicar cul de estas 3 sondas (pTG9, pCD3, pXY) utilizara Ud. como marcador de RFLP para seguir la herencia del gen de resistencia al virus en un proceso de mejoramiento a travs de cruzamientos controlados. b) Qu ventajas tendra usar el marcador elegido para testar resistencia al virus, en lugar de hacer el ensayo biolgico correspondiente? c) Cuntas generaciones de retrocruza (contra la variedad susceptible) llevara, en promedio, tener una variedad resistente al virus pero con un 99% del genoma de la variedad agronmicamente interesante? d) Qu individuos F2 elegira para la primera retrocruza, para tratar de acortar el n de generaciones calculado en c)? 12) Para ciertas enfermedades no se cuenta an con una sonda del gen implicado, sin embargo es posible hacer el diagnstico por un mtodo indirecto. Siendo requisito contar con marcadores polimrficos ligados a la enfermedad.Indique el riesgo gentico (probabilidad de estar afectado) para los individuos en gestacin (diagnstico prenatal) en el siguiente pedigr, en el que se indican los fenotipos para el Sndrome de Marfan (enfermedad autosmica dominante) y un marcador situado a 10 cM del locus de la enfermedad (fenotipos A1; A1A2; A2). A1A1

su aplicacin a este tipo de cuestiones, que tomaron importancia en la restitucin de hijos de personas desaparecidas por la ltima dictadura (1976-1983) a sus legtimas familias. Existen seis nios de los cuales se sabe con seguridad que slo tres pertenecen a dos familias que no guardan ninguna relacin entre s (son de distintas ciudades). De ambas familias slo viven los abuelos probables. Utilizando una sonda para un gen con un alto polimorfismo para una enzima de restriccin (existen 4 alelos en la poblacin) se revelan los Southern blots de ADN genmico de los seis nios y de los posibles abuelos, que se muestran en el grfico:

A1A2

A2A2

A1A2 ? A2A2 13) Antes que aparecieran los microsatlites, los RFLP se utilizaron, en el pasado, como marcadores genticos para la identificacin de parentesco. En ciertos casos, p.ej. verificacin del vnculo abuelo-nieto en ausencia de los padres, este tipo de pruebas constituyen la nica evidencia vlida de que se dispone. El siguiente problema representa una simplificacin de

A1A2

a) Definir los haplotipos para cada individuo analizado. Cules nios pertenecen, con alta probabilidad, a cada familia? Para cules esta experiencia no es suficiente para decidir a qu familia pertenecen? Cules, con seguridad, no pertenecen a ninguna de las dos? b) Cree Ud. que el hecho de no considerar la existencia de eventos de recombinacin (entre cromosomas homlogos) dentro del gen marcador en las meiosis de los abuelos y padres puede llevar a conclusiones errneas? 14) Una pareja afligida llega a Ud. para que le de asesoramiento gentico. Su segundo hijo falleci poco despus de nacer debido a una enfermedad gentica y la madre esta nuevamente embarazada. El hijo fallecido ha sido el segundo en la familia afectado por la enfermedad (el primer afectado ha sido un hermano de su abuela paterna). Ud. dispone, a travs de estrategias de clonado, de una sonda de la regin cromosomal donde se ubica el gen involucrado en esta enfermedad autosmica recesiva. Usando esa sonda, pudo construir un mapa de restriccin de dicha regin, y adems, obtuvo datos que muestran que, en la poblacin, existe polimorfismo para sitios reconocidos por

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una enzima de restriccin E (indicado como +/- en la figura). Mapa de restriccion del gen que hibrida con la sonda:

Ud. aisl DNA de linfocitos de los abuelos y de los miembros vivos de la familia y ha obtenido los correspondientes fragmentos de restriccin visualizados en el esquema del Southern. Ud. est ahora en condiciones de hacer un diagnstico pre-natal a partir de clulas fetales. Qu patrn de restriccin indicara que el feto hered la enfermedad (dibjelo)?

15) Se lleva a cabo el anlisis de ADN en una familia numerosa en la que algunos miembros estn afectados por una enfermedad rara autosmica dominante de manifestacin tarda (hacia los 40 aos). Se extrae el ADN genmico de todos los miembros de la familia, se digiere con HaeIII y los fragmentos obtenidos se separan por tamao en un gel de agarosa. Mediante la tcnica de Southern se transfieren dichos fragmentos a una menbrana de nylon y se hibrida con una sonda radiactiva procedente de un fragmento de ADN humano de secuencia nica clonado de un vector bacteriano y se obtienen los resultados indicados en la autorradiografa (ver debajo del pedigr).

Autoradiografa correspondiente
I1 I2 II1 II2 II3 II4 II5 II6 II7 II8 II9 II10 II11

16) El mosquito transmisor del dengue (Aedes aegypti) es una plaga endmica de climas tropicales, pero que desde hace pocos aos est extendiendo su distribucin hacia Buenos Aires. Se encontr una variante de mosquito que no transmite el temible virus. El carcter se comport como dominante mostrando un patrn de herencia mendeliana simple. Con el objeto de introducir este carcter en la poblacin, comenzaron a realizarse cruzamientos. Como el carcter es muy difcil de evaluar porque se requiere (para su anlisis) que el mosquito hembra pique huspedes infectados con el virus, se analizaron en cada generacin los patrones de 50 microsatlites con el fin de determinar ligamiento entre alguno de ellos y el carcter de resistencia. Slo uno de los marcadores (m25) mostr ligamiento a este carcter y a una distancia de 5 cM. Los patrones microsatlites observados cuando se utiliz este marcador en los genotipos homocigotas notransmisor y en el transmisor, respectivamente, fueron como se ve en la figura. Si se cruzan las dos variantes de mosquitos (no-transmiso-res x transmisores: generacin F0) se obtienen individuos heterocigotas con fenotipo no transmisor (F1). a) Qu patrones de micro- Tam. Trans NO satlites y fenotipos de mole- misor trans misor transmisin y no- cular transmisin presentarn los descendientes de una F1 258 pb cruzada por la lnea parental transmisora? y 236 pb b) en qu proporciones? c) Como se explic ms arriba, para la determinacin de los fenotipos slo se pueden utilizar las hembras. Cmo hara si quiere evaluar a los machos de la retrocruza? Qu cruzamientos hara y qu resultados esperara?. 17) Se desea hallar un marcador molecular asociado al locus que determina resistencia al barrenador del tallo (Diatraea saccharalis) en maz para utilizarlo en seleccin indirecta. Por esta razn se analiz el patrn de bandas generado por 5 RAPD utilizando una poblacin de 23 lneas recombinantes endocriados provenientes de un cruzamiento entre un padre resistente por otro sensible al ataque del insecto. RESISTENTES SENSIBLES
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 23

4 kpb 3 kpb 1 kpb Explique la variacin obtenida con la sonda dibujando la regin cromosmica correspondiente. a) Cmo se explica el tercer hijo? b) Con qu probabilidad aparecer un individuo enfermo con el patrn de restriccin de la madre sana? Tendran alguna utilidad estos resultados para aconsejar a las personas de esta familia?

A B C= = = = = == == === D E a) Qu marcadores son polimrficos? b) Qu marcadores estn ligados al locus? c) Calcule la distancia gentica. d) Indique qu marcadores NO estn ligados al locus. e) Indique el/los marcadores para los que, con estos datos, no puede afirmar que estn ligados (o no). 18) Se realiz el anlisis de ADN de una familia numerosa en la cual ocurrieron casos de una enfermedad

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autosmica dominante letal de manifestacin tarda (alrededor de los 40 aos). El mtodo aplicado fue el del anlisis de segregacin de RFLP utilizando la sonda denominada T4. A continuacin se muestra un esquema del autorradiograma de los individuos analizados alineado con la genealoga correspondiente. Los individuos afectados se representan con smbolo lleno.

a. Proponga los genotipos ms probables para el sndrome y el marcador molecular para cada individuo de la genealoga b. De acuerdo con estos resultados, se podra suponer ligamiento entre el marcador molecular y la enfermedad? Justifique su respuesta. c. Si un investigador demuestra que el lod score entre estos dos caracteres (bandas y enfermedad) es mayor que 3, cmo explicara la ocurrencia de un enfermo que presentara slo la banda de 5kb? d. Si otro integrante de la familia de 20 aos de edad quisiera saber el riesgo de tener la enfermedad qu estudio le hara y cmo interpretara los resultados? e. Cuando se analizaron lneas celulares hbridas hombre-ratn se obtuvieron los siguientes resultados para la sonda T4 y tres productos metablicos A, B y C. Indique en los casos en que sea posible la ubicacin cromosmica de la secuencia homloga a la sonda T4 y los productos A, B y C. Ln Crom. human. present. A T4 B C cel 2 3 4 5 6 7 8 9 23 + + + + - - - ? - + - + 34 + + - - + + - ? + - + 41 + - + - + - + ? + + - +

4. ALTERACIONES CROMOSMICAS
Bibliografa recomendada Griffiths y col. Captulos: 17- Chromosome mutation I: Changes in chromosome structure; 18- Chromosome mutation II: Changes in chromosome number Lacadena, J.R. Gentica General. Conceptos fundamentales. (1999) Editorial Sntesis S.A., Madrid. 13- Variaciones cromosmicas estructurales 14- Variaciones cromosmicas numricas Gua de estudio 1) Porqu las hemoglobinas humanas constituyen un ejemplo acerca del papel evolutivo de las duplicaciones? 2) Cundo se dice que las inversiones son supresoras o reductoras de la recombinacin. Nos referimos: a) Al mecanismo citolgico o a su consecuencia gentica? b) A homocigotas o a heterocigotas estructurales?

c) A la zona invertida o al cromosoma completo? d) A las inversiones paracntricas o a las pericntricas? 3) Enumere las dos caractersticas que considere ms importantes en las inversiones paracntricas y en las translocaciones recprocas. 4) En un heterocigoto estructural para translocacin recproca, podra originarse algn gameto viable a partir de los productos meiticos originados en una meiosis con orientacin adyacente? 5) Los grupos de ligamiento se mantienen constantes en cada especie? 6) El nmero diploide de un organismo es 2n= 12. Cuntos cromosomas tendr: a) un monosmico. b) un dismico.c) un tetrasmico d) un doble trismico. e) un nulismico.f) un haploide. g) un triploide.h) un autotetraploide. 7) Cul es la diferencia fundamental entre la aneuploida y la euploida? 8) Indique las diferencias entre auto y alopoliploides. 9) Debido al pequeo tamao del cromosoma IV de Drosophila melanogaster, las moscas pueden ser monosmicas o trismicas para este cromosoma y continuar siendo viables. a) Si una mosca dismica para el cromosoma 4 y homocigota para el gen recesivo eyeless de dicho cromosoma se aparea con una mosca monosmica para este cromosoma pero normal, cul ser el aspecto de la F1? b) Cules seran las proporciones fenotpicas que se obtendran al cruzar los distintos fenotipos de la F1? Problemas 1) En una seccin de cromosomas salivales de Drosophila las bandas tienen una secuencia 123.45678. El homlogo con el que este cromosoma debe aparearse tiene una secuencia: a)123.45876; b)123.445678; c)123.478; d)14.325678; e) 1234.45678; f) 124.35678. Qu clase de cambios cromosmicos han ocurrido en cada caso? 2) En el cromosoma X de D. melanogaster se observa la regin 7B constituda por 12 bandas. El carcter quetas chamuscadas se debe a la mutacin recesiva sn situada en el cromosoma X, efectiva en hemicigosis. Cruzando machos de quetas chamuscadas con hembras de fenotipo normal, pero heterocigticas, para diferentes deleciones que abarcan varios segmentos de la zona 7B del cromosoma X, se obtuvieron los resultados que figuran en la tabla: Hembra Delecin Fenotipo de las hembras de la descendencia 1 7B1-7B8 50% con quetas chamus cadas y 50% normales 2 7B2-7B5 Todas con quetas norma les 3 7B7-7B12 Todas con quetas norma les 4 7B5-7B10 50% con quetas chamus cadas y 50% normales

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Teniendo en cuenta que todas las deleciones estudiadas son letales en homocigosis y hemicigosis, y que las hembras utilizadas en los cruzamientos eran hijas de machos de fenotipo normal, deduzca cul es la posicin del locus sn en el mapa de cromosomas politnicos. 3) En la descendencia de un cruzamiento entre una hembra normal de Drosophila y un macho, white (w)Bar (B), Bridges observ que una hembra no haba heredado el carcter Bar del padre, pero era heterocigota para el carcter white. A esta hembra se la retrocruz con un macho w B, y las proporciones que se obtuvieron en la descendencia fueron dos hembras a un macho. a) Cul es la explicacin ms simple de estas proporciones anormales? b) Cul es el fenotipo de la descendencia? Se cruzaron las hembras heterocigotas estructurales de la descendencia con distintos machos que eran hemicigotas para los mutantes rudimentary (r), forked (f) o fused (fu), que estn cercanos a Bar ( como lo muestra el siguiente mapa): 1.1 55.1 56.5 57 59.5 __l_____________l______l______l______l___ w r f B fu En los cruzamientos con machos forked se observaron en F1 hembras forked; sin embargo, de los cruzamientos con machos r o fu no se obtuvieron hembras r ni fu, respectivamente. c) Cmo explicara estos resultados? 4) En un cromosoma de Drosophila persimilis se han reconocido citolgicamente 8 regiones denominadas a,b,c,d,e,f,g,h. Dentro de estas especies 4 razas diferentes tienen el siguiente orden cromosmico: a) a h b d c f e g. b) a e d c f b h g. c) a h b d g e f c d) a e f c d b h g. Suponiendo que cada raza evolucion por una inversin paracntrica simple a partir de otra raza, muestre cmo pudo haberse originado cada una. 5) En un heterocigota estructural para una inversin paracntrica, un cromosoma tiene una ordenacin 12.3456789 y su homlogo 12.3765489. a) En un meiocito se produce un entrecruzamiento en la regin 4-5, durante paquitene qu se observara en anafase I? b) Cmo se observara la anafase I de otro meiocito en el que se produce un entrecruzamiento en la regin 6-7? c) En cul de los dos meiocitos ser mayor el tamao del fragmento formado en Anafase I? 6) En cierta especie de Drosophila, que tiene los cromosomas telocntricos, se conocen los loci A,a, que est muy prximo al centrmero, B,b situado a 30 cM del anterior y C,c a 15 cM de B,b y a 45 cM de Aa. Un macho de fenotipo normal capturado en el campo se cruz con una hembra, perteneciente a una poblacin de laboratorio, que es normal en todos los

aspectos, salvo recesiva para los tres caracteres antedichos. Toda la descendencia del cruzamiento fue de fenotipo dominante. Cuando las hembras de este cruzamiento se sometieron a un cruzamiento de prueba con machos de la poblacin de laboratorio se obtuvo la siguiente descendencia: Fenotipo Nmero de individuos ABC 4250 Abc 490 aBC 510 abc 4480 a) Explique por qu aparecen slo cuatro fenotipos. b) De los datos de la tabla se deduce que la fraccin de recombinacin entre A,a y B,b es 0,1. Cmo se puede explicar esta discrepancia con los datos del enunciado? 7) En hembras de D. melanogaster heterocigotas para las siguientes 3 mutaciones: Bristle (Bl), mutacin dominante ubicada en el cromosoma 2; Dichaete (D), mutacin dominante ubicada en el cromosoma 3, y eyeless (ey), mutacin recesiva ubicada en el cromosoma 4, fueron cruzados individualmente con machos homocigotas para ey. La mayora de los cruzamientos producen las 8 clases fenotpicas esperadas: Bl D ey+; Bl D ey; Bl D+ ey+; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D+ ey+; Bl+ D+ ey; Bl+ D ey Seis hembras produjeron un nmero limitado de fenotipos que es el siguiente: a) Bl D ey+; Bl D ey; Bl+ D+ ey+; Bl+ D+ ey. b) Bl D ey; Bl D+ ey+; Bl+ D ey; Bl+ D+ ey+ c) Bl D ey; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D+ ey+. d) Bl D+ ey+; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D ey. e) Bl D ey+; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D+ ey. f) Bl D ey+; Bl D+ ey+; Bl+ D ey; Bl+ D+ ey. Para cada una de estas hembras d la explicacin ms simple de la causa que pudo restringir el nmero de fenotipos de la descendencia (considere que los quiasmas son terminales). 8) En el cultivar de centeno Ails (2n=14), que presenta polimorfismo para translocaciones recprocas, se cruz una planta heterocigota para una translocacin, que a su vez era heterocigota para 4 loci distintos (AaBbCcDd), por una planta homocigota estructural para la ordenacin normal, que tambin era homocigota recesiva para los 4 loci. Los resultados obtenidos en este cruzamiento se indican en la tabla: Configuracin meitica en metafase I de los descendientes Loci 5 II + 1 IV 7 II . A,a Aa:50 aa: 9 Aa: 7 aa:57 B,b Bb:33 bb:26 Bb:31 bb:33 C,c Cc:59 cc: 0 Cc: 0 cc:64 D,d Dd:30 dd:29 Dd:32 dd:32 a) Indique si alguno de los loci se comporta como ligado a la translocacin. b) Cmo explica la ausencia de individuos cc con 5 II y 1 IV, y la de individuos Cc con 7 II?

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9) Suponga que est est tudiando la c citogentica d cinde co especies ntimament relacionad de Droso te das ophila. La figura d abajo mue de estra el orden de los gen (las n nes letras indican genes qu son idnt ue ticos en las cinco especies) y los grupos d cromosom que se en de mas ncuentran en cada especie. a

2n n=26. Los hb bridos entre estas especies muestran los sig guientes arreg cromos glos micos duran la meiosi nte is: HI IBRIDO C Configuraci in meit tica e metafase I en e
G. hirsutum x G. thurberi 13 II pequeos + 13 I grande s es G.h hirsutum x G.herbaceum 13 II grandes + 13 I pequeo os G.t thurberi x G.h herbaceum 13 I grandes + 13 I pequeos

1+ +

a) Explique de qu mod probablem e do, mente, estas e especies evoluci ionaron una a partir de ot esquema tra, atizando los camb ocurrido en cada pa (Nota: as bios os aso. segrese de que comparar el orden de los genes con c s cuidado). b) Esquema atice una celu en paquit ula tene y otra a anafase I de una hembra h brida obten nida a part del tir cruzamiento de un ma o acho de la e especie a po una or hembra de la especie c. (Considere solamente los dos . pares mayo ores, y la form macin de u solo quias un sma en cada bivalen nte). 10) Tratand de locali do izar (mapear en una e r) especie autgama (2 7x) el lo 2n= ocus correspondiente a u pauna reja allica A,a, se cru un indiv uza viduo de ge enotipo recesivo po los 7 trism or micos de un variedad de gena notipo dom minante, obte enindose u una F1 com mpuesta por individu de 14 y 15 cromosom Al auto uos mas. ofecundar estos l ltimos (los d 15 cromos de somas) se ob btuvieron los res sultados que figuran en la tabla. E qu e En cromosoma est el loc considera a cus ado? Justifiq su que respuesta
Trismico os cromosoma 1 a cromosoma 2 a cromosoma 3 a cromosoma 4 a cromosoma 5 a cromosoma 6 a cromosoma 7 a Fenotipo de la descen o ndencia obteni por ida autofecu undacin de lo trismicos d la F1 os de A a 140 45 73 24 115 40 405 130 700 20 95 34 208 70

Nota: II bivalente I univalen es, ntes a) Cmo podr interpreta estos resultados desde un ra ar e pu unto de vista filogentico? ? b) Cmo pod probar q su interp dra que pretacin es corre ecta?. 13) Existen sei especies p is principales del gnero Br raslza sic al que per ca rtenece la col (y la can nola): B. cari inata, B. campestr B. nigra B. oleracea B. juncea, B. ris, a, a, , nap Las rela pus. aciones entre las especie pueden de e es educir a partir de la tabla: rse e a) Deduzca el nmero de c cromosomas de B. camp s pestris B. nigra y B. oleracea. s,
Especie o hbr E rido F1 Crom mosomasBivalentesUnivalen ntes B. carinata 34 17 7 0 B. napus 38 19 9 0 B. juncea j 36 18 8 0 B. juncea x B. ni j igra 26 8 10 B.n napus xB.camp pestris 29 10 0 9 B.c carinataxB.ole eracea 26 9 8 B. juncea x B.ole j eracea 27 0 27 BcarinataxB.cam mpestris 27 0 27 B. napus x B. nig gra 27 0 27

b) Algunas de las especies mencionadas son polie s plo oides ? Cu les? c) En caso afir rmativo sea las especi progenito ale ies oras de cada una de las especies poliploides. e s . d) Explique me ediante cruza amientos com se origina mo aron las especies poliploides n s.

5. GENM MICA Y P POSTGEN NMICA A

11) La zar rzamora eur ropea (Rubus idaeus) tie 14 s ene cromosoma Otro tipo de mora (R as. o Rubus caesi ius) es tetraploide con 28. Los hbridos en estas es s ntre species son individ duos F1 estr riles. Alguna gametas q no as que han reducid sus cromo do osomas en la F1 son funci ionales en las cruz retrgrad zas das. Determ mine el nme de ero cromosoma y el nivel d ploida pa cada uno de los as de ara siguientes c casos: a) F1; b) Retrocru con amb pauza bos dres. 12) Las esp pecies de alg godn del N Nuevo Mundo Goso sypium hirs sutum tienen 2n=52. Las especies del Viejo l Mundo: G. thurberi y G.herbaceu tiene cad una um da

Gu de estud ua dio 1) Para qu si irven los mar rcadores gen nticos (mole ecular y no mole res eculares)? R: Para mapea Existen distintos mto ar. odos de map peo: fsico y genti ico. Los map fsicos se construye a pas s en par de la se rtir ecuenciacin del ADN y otras tcni icas

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moleculares, como el mapeo con enzimas de restriccin (como se vio en la gua 1 Biologa Molecular-) usando o no Southern blot, la hibridacin in situ, la alineacin de insertos genmicos clonados en BAC y YAC, caminatas cromosmicas, comparacin sintnica de genomas filogenticamente relacionados, etc. Los mapas genticos se construyen a partir de anlisis de ligamiento en poblaciones segregantes posteriores a la recombinacin y sumando distancias entre loci sucesivos lo ms prximos posibles (ver gua 7 de mapeo). Ambos mapas no coinciden en cuanto a las unidades utilizadas (nmero de nucletidos o pares de bases versus unidades de recombinacin) ni en las distancias relativas (las frecuencias de recombinacin no son parejas a lo largo de todo el cromosoma), pero s en el orden de los marcadores. 2) Compare el uso de marcadores genticos moleculares, bioqumicos y morfolgicos. R: Su uso para mapeo gentico es similar, salvo cuando los marcadores morfolgicos estn determinados por ms de un locus (epstasis) o son de distribucin continua (cuantitativos). Pero an en estos casos existen formas de utilizarlos que se vern en otras guas. Los marcadores morfolgicos pueden verse influidos por el ambiente, el momento de desarrollo, el rgano y otros factores. A menos que se conozca su base molecular (secuencia nucleotdica) no pueden ser usados para mapeo fsico (salvo que sean marcadores citogenticos = morfologa cromosmica). Los marcadores bioqumicos (fundamentalmente patrones de electroforesis de protenas e isozimas), tienen particularidades intermedias. 3) En qu medida los marcadores moleculares permiten relacionar los mapas genticos con los mapas fsicos? R: Porque se puede relacionar su localizacin gentica con su hibridacin y mapeo fsico en clones genmicos alineados de BACs y YACs. Una serie de clones solapados se denomina contig. Para formar el contig, se emplean secuencias cortas y nicas presentes en los insertos clonados como si fueran marcas distintivas (por ejemplo, un sitio de restriccin en el contexto de la secuencia nucleotdica de un gen que se puede revelar mediante un RFLP). Esas marcas especficas se denominan STS (sequence-tagged sites). Es decir que un RFLP determinado puede ser un STS. Debido a lo tedioso y poco automatizable de la tcnica de RFLP; como usualmente se conoce la secuencia nucleotdica, se la convierte en una tcnica basada en PCR llamada CAPS. Como estos mismos RFLP (CAPS) pueden mapearse poblaciones segregantes, esto permite superponer el mapa gentico con el mapa fsico. 4) Cmo clasificara de acuerdo a la metodologa a las distintas tcnicas conducentes a obtener marcadores genticos moleculares (RFLP, AFLP, RAPD, SSR, SNP). Haga una comparacin entre ellas. R: Los RFLP fueron los primeros marcadores de ADN en ser utilizados. Surgen de comparar los patrones de

restriccin de Southern blot entre distintos individuos, especies, etc. observando diferencias (polimorfismos) en sitios de corte. Debido a que se basan en la hibridacin molecular lo que permite el reconocimiento entre secuencias que no son totalmente homlogas, se los considera marcadores relativamente conservados que permiten comparaciones evolutivas entre especies, gneros y familias relacionados (dependiendo de la secuencia, se puede progresar en la escala taxonmica hasta ms arriba). Se continan usando en estudios de sintenia (mapeo comparativo). Como contrapartida, resulta ms complicado encontrar variabilidad (polimorfismos informativos) intraespecficos para hacer, por ejemplo, genotipificacin (identificacin a nivel de individuo o fingerprinting). Hoy en da, los RFLPs han sido desplazados en gran medida por los SNPs (polimorfismo de nucletido simple nico-, se pronuncia SNiP). Los SNP no tienen una nica metodologa como los RFLP sino varias, aunque todas ellas requieren de PCR en alguno de sus pasos. Cualquier tcnica que permite visualizar un cambio en un nucletido se clasifica como SNP. Como ejemplo ya se mencion a los CAPs que implican la amplificacin y posterior digestin del producto de PCR con una enzima de restriccin (aquel que fuera responsable del polimorfismo en el RFLP). Hoy en da, los polimorfismos a detectar son identificados a partir de estudios previos de secuenciaciones genmicas ms que de RFLP. No todos los SNPs requieren restriccin. Otra tcnica bastante clsica clasificada como SNP es la SSCP que consiste en desnaturalizar el ADN y diferenciar electroforticamente las diferencias de migracin de los plegamientos secundarios intracatenarios derivados del cambio nucleotdico. Estos marcadores ofrecen varias ventajas respecto de los RFLP: a) existe mayor nmero de alelos en la poblacin (en humanos se stima que hay un SNP cada 1000 pb) y b) el grado de heterocigosis es alto, con lo que resultan ser ms informativos. Comparten con los RFLP la ventaja de no ser annimos (se conoce su identidad secuencia, pertenencia a un gen, por ej.-) y su codominancia (posibilidad de diferenciar heterocigotas de homocigotas). Los otros marcadores de mayor utilizacin (junto con los SNPs) son los microsatlites o SSR (single sequence repeats) estn constituidos por un motivo (secuencia corta de ADN) de repeticin en tndem de di-, tri y tetranucletidos. La repeticin ms comn es la del dinucletido CA en animales y TA en vegetales. Aqu lo que vara no es un nico nucletido, sino el nmero de veces en que se repite el motivo de repeticin, lo que es detectado como productos de amplificacin que poseen tamaos que varan segn la cantidad de repeticiones. Son los marcadores ms utilizados para genotipificacin (tambin llamado genotipado o fingerprinting). Los RAPDs (randomly amplified polymorphic DNA, se pronuncia RAPiD) son marcadores moleculares que surgen luego de utilizar un nico oligonucletido ini-

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ciador (primer) en la reaccin de PCR. Son polimorfismos para fragmentos de ADN amplificados al azar del genoma, obtenindose una serie de bandas de distintos tamaos segn donde se haya pegado ese primer. Este conjunto de bandas sirve como una huella de ADN que puede emplearse para caracterizar a un individuo. Se dice que es al azar pues se utilizan primers que no se sabe en qu lugar del genoma hibridan. Por eso se dice que son annimos porque se desconoce la secuencia y (salvo mapeo especfico) su localizacin cromosmica. Como son oligonucletidos de 10 bases, en general pegan en varias regiones del genoma, por lo que al correr el producto de la PCR en geles de agarosa, generalmente se observan varios fragmentos, que miden hasta 2 kpb. Otra desventaja es que son marcadores dominantes (no se puede diferenciar al heterocigota del homocigota) y problemas de reproducibilidad. Su mayores ventajas son los costos y la posibilidad de usarlos con cualquier genoma de cualquier especie aunque se desconozca absolutamente todo de su secuencia genmica. Al igual que los RFLPs, se los puede mejorar secuenciando y convirtiendo en marcadores de PCR especfica (en este caso se llaman SCARs). Los AFLP representan una sofisticacin ms reproducible que combina restriccin con endonucleasas y amplificacin selectiva por PCR. Si bien comparte desventajas y ventajas con los RAPD (son dominantes y annimos, no requieren de informacin genmica previa), son ms costosos pero su mayor costo se ve compensado por la generacin de muchas ms bandas polimrficas por corrida (data points) y mayor reproducibilidad.
RFLP AFLP RAPD SSR SNP restriccin PCR hibridacindominantes codominan. + + + + + + + + + + +/+ +

4) Cul es el origen de la variacin genmica (mutaciones) detectada por cada una de ellas y cul es su magnitud?
RFLP AFLP RAPD SSR SNP sustitucin INDELHiper AltaConservado + + + + + + + + + + -

Aclaraciones: sustituciones: cambio de nucletidos, INDELs: Inserciones o DELeciones, Hiper: hipervariables (altsima tasa de mutacin/evolucin, mximo polimorfismo), Alta: variacin, Conservado (particularmente cuando afecta secuencias funcionales codificantes) 5) Suponiendo que en un genoma dado las 4 bases posibles se encuentran representadas en forma similar y totalmente al azar (contenido de GC = 50% uniformemente distribuido a lo largo del genoma): a) Cul es la distancia promedio esperable entre sitios de restriccin para enzimas que reconocen especi-

ficidades de secuencia de 6 pares de bases, como EcoRI? y para una de 4 o de 8 pb? b) Cuntos sitios de restriccin y, por lo tanto, bandas de DNA en un gel, se generaran en un genoma humano (109 pb), bacteriano (106 pb), o mitocondrial humano (104 pb) se generaran con EcoRI? c) Cuntas bandas generaran los RAPD que usualmente se hacen con decmeros y se detectan por PCR? R: a) Un sitio de restriccin de 6 bases aparecer, como promedio, una vez cada 46 bases, es decir 4.096 pb. Una de 4 ser cada 44 pb = 256 pb, uno de 8 pb ser de una cada 65.536 pb. b) 109 dividido por 4x103 = 250.000 bandas o sitios para el genoma humano; 250 para una bacteria y entre 2 y 3 para el genoma mitocondrial. c) Por un lado debemos considerar que los sitios complementarios a los primers tienen que ser perfectos (los 10 nucletidos tienen que ser perfectamente complementarios, lo que no es necesariamente cierto). Por lo tanto la distancia se podra calcular como para los sitios de restriccin 410 = 1.048.576. En un genoma humano habra 1000 sitios, en uno bacteriano, uno slo. De todos modos, para que haya bandas se requieren 2 condiciones adicionales: que las orientaciones estn invertidas y apuntando hacia adentro entre primers vecinos (se reduce a un cuarto = 250 y la distancia media aumenta a 4 millones) y que la distancia sea menor a los 4000 pb porque la Taq polimerasa deja de funcionar eficientemente ms all de este tamao. La probabilidad de que 2 sitios distintos estn en una posicin arbitraria es de uno en 410 x 410 = 42x10 = 1.099.511.627.776 ~ 1012. Sabiendo que las distancias para una amplificacin detectable varan entre un poco menos de 100 y aproximadamente 2500-2600 pb, la probabilidad de encontrar 2 secuencias en alguno de esos nucletidos es 44-2x10 x 2500 = 10-12 x 2,5.103 = 2,5 x 10-9, lo que significa que espero encontrar entre 2 y 3 bandas por genoma de organismo superior por primer, es decir que de las 250 bandas potenciales, slo el 1% est a la distancia necesaria para dar bandas amplificables. Sin embargo, el nmero de bandas observadas es mayor, debido a que no es requerida una complementaridad de bases perfecta en las condiciones de anillado de los primers. 6) Qu ventajas tendra el usar enzimas que son sensibles (no cortan) a la metilacin de citosinas en el sitio de restriccin (como es el caso de PstI) y que ocurren con enorme frecuencia en el DNA heterocromatinizado de organismos eucariticos? R: Si lo que se busca es clonar genes transcripcionalmente activos este comportamiento es una ventaja porque slo se clonara aquello que es digerido por la enzima. El DNA metilado dara fragmentos demasiado grandes para ser detectado o clonado (el DNA de muy alto peso molecular se transfiere pobremente a filtros en los Southerns y por su tamao no puede ser clonado eficientemente en los vectores ms comunes, entre otras razones). Tambin serviran para diferen-

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ciar alelos epigenticos (como los que estn en el cromosoma X en mujeres) o diferencias de estados del gen entre tejidos expresantes (hipometilados) versus silenciados (hipermetilados). 7) En qu consiste el clonado posicional y el "caminado cromosmico"? Para qu se utiliza? Clonado posicional: El clonado posicional se utiliza cuando no se dispone de otra informacin del gen que se desea clonar ms que su posicin cromosmica relativa respecto a un marcador molecular. La idea es poder disponer en el mismo inserto clonado en un vector, tanto el gen deseado como la secuencia del marcador molecular o en algn otro vector de secuencia vecina contigua (contig). Este tipo de clonados fueron posibles a partir de la aparicin de vectores que permiten clonar segmentos de ADN grandes (200.000 bases hasta 1.000.000 de bases) como los BAC y YAC. Caminado cromosmico: Los extremos de un fragmento clonado se usan como sondas para seleccionar otros clones de la genoteca. Estas sondas detectan clones de regiones del ADN que se superponen con el clon inicial Se aisla un pequeo segmento de ADN de un extremo del material, se inserta en el primer clon y se lo usa como sonda para volver a rastrear la genoteca en busca de un clon que contenga ese segmento y la secuencia contigua del genoma. Con el segundo clon se puede obtener un tercero, y as sucesivamente, hasta tener un conjunto de segmentos clonados que se solapan. Permite el clonado posicional. Es decir, conociendo la localizacin del gen y disponiendo de uno vecino clonado, se puede aprovechar esta vecindad para as clonarlo. 8) Cmo se encara un proyecto genmico? Por dnde se empieza? Qu tipo de vectores de clonado son los ms habitualmente usados? R: Como no se puede secuenciar sobre los cromosomas (la longitud de ADN es muy larga y el ADN est mezclado) lo primero que debo hacer es segmentarlo en fragmentos manejables por las actuales tcnicas moleculares. Esto se hace en 2 etapas: primero se clona en vectores que permiten insertos grandes (BAC y YAC) y a stos ltimos se los subclona en vectores con insertos ms pequeos (fagos y plsmidos). Ahora bien, al segmentar un genoma pierdo el ordenamiento lineal que tena el ADN en el cromosoma por lo que tengo que organizar los clones en grupos de contigs y as rearmar el ordenamiento perdido. Esto se logra mediante mapeo fsico y gentico por lo que, en realidad, todo proyecto genmico comienza siendo un proyecto de mapeo. 9) Qu es el transcriptoma y los EST? Cmo se construyen y para qu sirven? R: Como el procedimiento arriba descripto es largo, laborioso y a veces econmicamente inviable, se procede paralelamente (o exclusivamente) por otra va que aporta, adems herramientas que son necesarias para el mapeo. En este procedimiento se privilegia la secuenciacin de lo que ms interesa y que son los

genes. Como los genes (a diferencia de las secuencias intergnicas no codificantes) se transcriben, una forma es armar clonotecas de ADNc de distintos tejidos y en distintas situaciones ambientales y fisiolgicas y secuenciarlas en forma grosera y masiva. De esta manera se obtiene una coleccin de secuencias representativas del transcriptoma denominadas EST (expressed sequence tags o secuencias expresadas) de las cuales se desconoce mayormente su funcin. En muchos casos, esta funcin puede deducirse en base a la homologa de las secuencias con las de genes caracterizados en otras especies mediante bsqueda y comparacin con las bases de datos de los bancos de genes. Estos ESTs pueden usarse para el diseo de micromatrices (chips de ADN) y para mapeo por RFLP/SNP y servir como marcas ancladas (STS). 10) A qu se llama genmica funcional y anlisis de proteoma? En este contexto para qu se usa el etiquetado mediante transposones o transposon-tagging? Qu son las micromatrices o microarrays y chips de DNA? Para qu se usan? Qu tcnicas para la caracterizacin de interacciones protena-protena conoce? R: La genmica funcional es la rama de la genmica que estudia la funcin molecular asociada a las secuencias expresadas descriptas por los proyectos genmicos. Estos estudios comprenden tanto estudios predictivos in silico por comparacin de una secuencia incgnita con secuencias depositas en bases de datos como la corroboracin de su funcin molecular a travs de distintas estrategias. Estas estrategias incluyen estudios de complementacin gnica por sobre expresin o silenciamiento de secuencias incognitas, la asociacin de determinado fenotipo con mutantes inducidas tanto por mutagenesis qumica como por transposon tagging. Esta ltima estrategia permite utilizar secuencias conocidas correspondientes a transposones que interrumpen genes de inters como etiquetas para asilar estos genes. En la ltima dcada la genmica funcional ha contado con el desarrollo de micromatrics de ADN o chips que son soportes slidos que incluyen un elevado numero de secuencias correspondientes a un organismo, pudiendo estar representado el transcriptoma completo de una especie para estudios de expresin concertada en disitntas estadios de desarrollo, distintas condiciones de crecimiento, respuestas a estreses biticos u abiticos, etc. La protemica estudia el conjunto de proteinas presentes en determinadas condiciones de desarrollo y/o crecimiento en los sitemas biolgicos de interes, permitiendo la determinacin de las secuencias primarias as como de su possible estructura e interaccin con otras protenas a travs de sistemas de estudios de interaccin protena-protena como el sitema doble hibrido en levaduras. Problemas: 1) El famoso detective Sherlock Molecularis se encuentra investigando un asesinato. La pista determinante del caso es una mancha de semen encontrada en la ropa de la vctima, de la que pudo extraerse DNA,

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el cual se s someti a co por una enzima de r orte restriccin apropi iada y posterior electrof foresis, cuyo Souto hern blot se analiz por hibridacin con el fago M13 e r n o (sonda de J Jeffreys, Natu 314 [198 67-72). En un ure 85]: carril parale se corri, en idntica condicione una elo as es, muestra de DNA de li infocitos del sospechoso Jack l o Destripador rius. En la fig gura se mues el resulta de stra ado la correspon ndiente autor rradiografa: I.- Si Ud. f fuera Watso (no James), cul de las sion guientes afi irmaciones c creera correc para ases cta sorar a Sherlock?: a) Jack es presumiblem mente culpab porque la sonda ble a hibrida tant con el DN de la ma to NA ancha como con el de Jack. La diferencia en el patrn d bandas se debe a n de que el sem contiene gametas y estas refle men e ejan la constitucin haploide. P n Para confirm la culpab mar bilidad habra que repetir el an nlisis con u muestra de seuna men de Jack k. b) Jack no es culpable porque los patrones son difeo e n rentes a pe esar de que ambos DNA hibridan con la As sonda y com mparten buen parte del p na patrn de ban ndas. c) El presu unto culpable pas a ser el hermano prfugo de Jack (con antec k cedentes pol liciales) porq el que patrn de bandas de Jac no coincid pero las b ck de, bandas comunes (a aproximadam mente la m mitad de tod las das bandas) hac sospecha de l. Se requiere, si emcen ar in bargo, un an nlisis del D DNA del jove escurridiz para en zo confirmar esta hiptesis s. II.- Dado q estas secuencias son tan hipervar que riables (muy polim mrficas), se s supone que l tasa de mu la utacin (creacin d nuevos alelos por el mecanismo de rede combinaci n desigua al o por deslizam r mientoresbalamien de la DN polimera nto NA asa) en game etas es considerable (se calcula un = 0,00 Cree U que a 01). Ud. se puede us este tipo de anlisis p sar para tests de paternidad? III.- Qu % de bandas coincidente se esperar ens es ra contrar, com mparando los patrones de bandas de persos e nas relacion nadas por los siguientes p s parentezcos?: - madre e hijo - abuelo y nieto - to y sob brino 2) Mediante hibridacin in situ, se pudieron localizar e n 5 YACs de DNA huma (YAC-A a YAC-E) e una e ano A en regin crom mosmica det terminada de genoma hu el umano y se desea hacer un m mapa fsico d alineamien de de nto dichos clon (mapa de contigs). Los 5 clones fueron nes e evaluados m mediante hibridacin con 3 STS (sequ n uencetagged site o sitios de secuen es ncia indicad dora marcadora-) ). Para obtene los STS, s digiri DN con una e er se NA enzima de restriccin y se con nstruy una genoteca en fago n lambda con los fragmen n ntos resultan ntes. Se anal lizaron varios de lo clones de esta genoteca mediante hibrios e dacin con DNA gen n mico YAC humano, d descartando todos STS A B C D E S aquellos clo ones que hibrida- 1 + + + - ban con DN repetitiv De 2 NA vo. - + + + aquellos qu hibridaban con ue 3 + + - - +

cuencias ni icas, se selec csec cio onaron 3, lo cuales s os se hib bridaron con los YAC n Cs obtenindose l siguiente los es res sultados: a) Por qu no se trat d de hacer Souther rns con lo os YA y realiza un mapeo AC ar por restriccin de esta ma n aner Porqu no hibrida ra? ar dir rectamente lo YAC entr os re s, evitando re ecurrir a un na sub bgenoteca en fago lamb n bda de los mism mos? Por q se desca qu artaron aquel llos clo ones de la ge enoteca en fa lambda que no hibri ago idaban con secuen n ncias nicas? ? b) Dibuje un m mapa fsico con la aline eacin de lo 3 os ST y ordene (en paralelo) el mapa de contigs de los TS e YA ACs. 3) La levadura fue la prim a mera de las es species eucar riticas que fue t totalmente se ecuenciada y constituye un sis stema model de invest lo tigacin deb bido al tama ao rel lativamente chico de su genoma y el nmero ta e ambi relativam n mente chico d genes. Se sabe que h de e hay ~6 6000 genes codificantes p para protena de los cua as, ales hay 2400 para los que no s tiene ni id de qu f y se dea funci cumplen. Uno de los temas que siempre conc n s cit int ters es el pr roceso de es sporulacin (que en leva ( aduras est asocia a la me s ado eiosis). La misma se puede m con ntrolar y sinc cronizar con relativa sen n ncillez ya que se e inc cuban levadu uras diploid en un medio con defides m cie encia de ni itrgeno, lo que dispara la meiosisesp porulacin. L misma o La ocurre en 3 fases bien difef ren nciadas. La I o temprana en la que se abandona el a, a est tado vegetat tivo para pa asar al espor rulado. La I o II me edia, coincid con la mei de iosis I. La III o media-tar I rda coincide con la meiosis II. Previament a la aparic a te cin de los arreglo de DNA (DNA array o chips de os ys) DN se haba identifica NA, an ado, mediant los cada v te vez m obsoletos Northern bl s lots unos 250 mRNAs. C 0 Con la llegada de los chips, e nmero ca el ambi drsti icaente col. cience 282:6 699). Se prep par me (Chu y c 1998, Sc mR RNA total de cada una de las fases y se hibrid c e contra las secuenc de los 6000 genes. Se identifica a cias S aron 256 genes que se activan especficam e mente durante la e fas I. En la gr mayora de ellos se identific la sese ran i cuencia: 5GG GCGCC3 a 6 pb del nucletido 1 del 600 n gen en direccin 5. n, a) Qu le sugiere este res sultado? Se identificaro 158 genes adicionales especficos de on s s s la fase II, de lo cuales, el 70% tienen otra secuen os l n ncia con nsenso deno ominada M MSE. Adem aparecie s, eron otr 61 genes especficos de la fase III. Finalmen ros s s I nte, un observaci curiosa fu que 600 genes que se enna n ue g con ntraron activ en la fase vegetativa no pudieron ser vos e det tectados dura todo el p ante proceso de esporulacin. e . b) Tendr algn inters e ltimo dato? este d

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c) Podr h hacer una est timacin de qu proporc cin de los gene est impli es icado, direct o indirecta ta amente con el p proceso de es sporulacin? d) A qu se dedica el resto de los 6000 genes? ? 4) Pas sin llamar much la atenci una pelcu esho n ula trenada hac unos ce llamada aos GATTACA (que A no debe su nombre a una gat muy ta agresiva sin a una no secuencia nucleotdica y a la vez nombre de un centro de viaje al eses pacio del futuro cercano). S trata Se de un tpico thriller o con ambie ente de ciencia-ficc cin que se plantea u esceun nario futur muy ro inquietante (ms detalles en:http://ww ww.spe.sony.com/Picture es/SonyMvie es/mov ies/Gattaca/ /home.html). Gracias a la tecnolog del . ga genoma hum mano, se pod predecir c bastante precidr con e sin las pro obabilidades de morir, p ejemplo, de un por ataque card daco antes de los 30 ao Hasta aqu nada os. u nuevo que no hayan de estacado tod los diari codos ios mentando las posibilida ades de la ci iencia real a partir de la secuenciacin del genoma hu l umano. La pelcula avan-za en otro aspecto que es la po osibilidad de planificar la com mposicin gen ntica (a-lelo de los hi- de os) -jos una pareja. No lo hace en un sent e tido tan decl laradaista de mente fasci (que todos sean arios, rubios y d ojos azules estilo Los nios de Brasil) sino tratan de o ), ndo evitar los a alelos de la l llamada carg gentica (alelos ga que predisp ponen a enfe fermedades c coronarias, c cncer, neurolgica etc.). No s trata de c as, se clonar un H Hitler o un premio N Nbel, sino d elegir entr los futuros hijos de re posibles dis sponibles, los mejores a alelos del p padre y la madre de futuro hij el jo/a, sin des spreciar los clsicos color d ojos, coefi de ficiente intele ectual o altur ra. a) Le pare que esto sea factible en la ciencia real? ece a Si Ud. fuera un cientfic convencid de las bon a co do ndades de liberar a la especie humana de su carga gen ntica, basndose e las tcnic que apre en cas endi sobre clonacin e ingen niera gentica en anima (que no e este ales es caso) Cm diseara un sistema de anlisis d este mo de tipo? b) Si bien e una parte de la pelcu en meno de 5 en ula, os minutos pu ueden genera un largo d ar diploma con la secuencia nuc cleotdica de una muestra sacada de un pea lo, an en el mejor es scenario futu (en el s uro sentido cientfico), no se podr secuenciar los 30.000 genes n r humanos pa una aplic ara cacin masiva como la m mencionada Qu tipo de ma arcadores m moleculares t tendra

qu utilizar par esta detec ue ra ccin? Podr detectar to odas las mutaciones posibles? D s s Discuta este punto. p c) Despus de resolver el ltimo probl lema de la g gua de mutaciones le parece q librar a la humanidad de que a d tod los alelo deletreos es un obje dos os s etivo alcanza able po mejorami or iento? Para premia la planif P ar ficacin gen ntica familia ar, la sociedad de GATTACA se divide en 2 clases b e A e bien diferenciadas. Aquellos que fueron planificad dos tie enen acceso a los mejo ores empleos mientras q s, que aq quellos que son hijos d azar so considerados del on in nvlidos o de-gen-era ados y slo pueden ser barre enderos o ten profesion mal paga En la pel ner nes as. cula, una familia tiene 2 he a ermanos (uno de cada c o clase El herma no planif e). ano ficado gen ticamente in nferio logra en or ngaar al sis stema y acce eder a un bu uen em mpleo aprove echando la c complicidad de una perso ona g genticament calificada que le da muestras de t te m tejido (de su DNA bah). Tod va bien ha que se p o A, do asta produ un asesin uce nato y.... no le vamos a contar la pa arte su ustanciosa de la pelcula El tema es que hay u e a. e una c chica linda ( ms ni m (ni menos que Um mma Thurm man) qu se enamor del mucha ue ra acho que, si bien ser ge enticamente infe erior, es tam mbin tan bueno y lin b ndo! Bu ueno, la chic lleva pelo a una em ca os mpresa que, por pocos dlares, le analiza ( (por computa adora) la hue ella dig gital gentica de identid del muchachito (obv dad viame ente tiene su dudas y n es cuesti de juntar sus us no n ale con un d elos desconocido) ). d) Es esto po osible? Qu tcnicas utilizara para poder hacer una cosa as? (no estamos ha r o ablando de p predis sposicin a e enfermedades sino de ide s, entidad). 5) Mgy y co olaboradores (Genome Biology, 20 s B 002) pu ublicaron un trabajo de i identificacin de ESTs ( n (secuencias transc criptas) espe ecficamente expresadas en e ntre s ron: el corazn. En los ESTs identificados encontrar NA ADH dehidrogenasa, ubi iquinona, miosinas, tro opomi iosina y actin (involucra na ados en la co ontraccin m muscular), coligina (interacta con el col a a geno cardac co), 13 no mostraro poseer fu on unciones rela acionadas (ha asta est trabajo) c el corazn y 11 no tenan func te con cin alg guna conocid Adems, 5 de ellos (TG114, TG da. ( G13, TG G131, TG13 32_7, TG78) fueron rel ) lacionados p previa amente con p problemas ca ardacos. Es decir, la enf ferme edad se relac ciona con la malfuncin de los mism mos. La figura mues la topolo a stra oga de la reg gin regulato oria en el extremo 5 de 17 prom 5 motores de genes cardac g cos. Fig gura CAAT GC, TAT y CAP son secuenc T, TA cias con nsenso relacionadas a la unin de la RNA polime erasa II. Otros mo otivos llama ados TRANS SFAC y MEM ME as se representan como punta de flecha. Los cuadrados osc curos (GKLF representa sitios de unin de un f F) an u factor de transcripcin pareci al Krpp de Dros r ido pel sophil Similarm la. mente, (Tcf11 _Rora, TC 1 Cf11_API_C) se ) rep presentan otr motivos n ros nucleotdicos identificado s os. a) Qu son y qu funcin cumplen estas secuenc n e cias en la regin 5 no codifican de estos genes? nte g

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b) Porqu algunas secuencias estn en la mayora de los genes y otros no? Es esta una muestra representativa? c) Dado que a esta altura est totalmente secuenciado el genoma humano porqu estos investigadores utilizaron esta metodologa ms antigua para poder identificar genes cardacos? Es decir, porqu no les alcanz esa informacin previa? Se podran haber utilizado chips (microarreglos de DNA)? d) Encuentra alguna relacin entre unin de factores de transcripcin y patologas cardacas? Cul? Podra proponer a uno (o varios) gen/es sospechoso/s a la lista? e) Con estos datos limitados podra proponer una hiptesis de explicacin molecular de las patologas cardacas? f) Cmo confirmara sus hiptesis de la relacin establecida en el punto d y e a nivel funcional? Recuerde que, por razones de tica (hacia nuestra especie) todos los experimentos se hacen con ratones 6) P36 es una protena de 36 kDa de Mycobacterium tuberculosis cuya funcin fue asociada a los mecanismos de virulencia del bacilo. La ahora Licenciada Laura Klepp estudi durante su trabajo de tesis de Licenciatura, la interaccin de dicha protena con el proteoma micobacteriano empleando un sistema de doble hbrido en bacterias basado en la induccin, mediada por cAMP del opern lactosa via protena CAP. El sistema se basa en la expresin, por un lado, del dominio T25 de la adenilato ciclasa y por otro lado, del dominio T18. Cuando estos dominios estn separados, no se detecta actividad de adenilato ciclasa. En cambio cuando se produce una interaccin protenaprotena que las acerca fsicamente, se recompone dicha actividad. Se clon el gen P36 en el plsmido

pKT25 (anzuelo codifica el dominio T25) y tambin se construy una genoteca de M. tuberculosis en el plsmido pUT18C (codifica el dominio T18 en fusin con el gen de la protena a pescar). Para ello, lo primero que se llev a cabo fue la amplificacin del gen P36 por PCR. a) El oligonucletido 5 fue diseado de manera que se respete el marco de lectura del fragmento codificante para T25 presente en el sitio de clonado Por qu? b) Luego de llevada a cabo la ligacin y la transformacin, los clones positivos se identificaron en la placa por presentar color blanco en presencia de IPTG (anlogo de la lactosa) y X-Gal (sustrato incoloro de la -galactosidasa y que se convierte en un producto azul). Qu hubiera significado que fueran colonias azules? c) Ya obtenido y caracterizado el anzuelo, vino la parte de la protena a pescar: se subclonaron fragmentos producidos al azar del genoma de M. tuberculosis en pUT18C. Los plsmidos recombinantes se introdujeron, junto con los que contienen secuencias del gen para P36, en clulas competentes de E. coli por cotransfeccin y se obtuvieron clones positivos. Cmo identificaron aquellos clones en los que las protenas derivadas de P36 se reconocieron y unieron con otras expresadas en el vector pUT18C? d) Las secuencias con capacidad de unin pudieron ser asignadas a 2 genes ya secuenciados (Rv1417 y Rv2617) de funcin desconocida, pero que posiblemente sean protenas de membrana y transmembrana. Cmo se hizo para asignar las secuencias a estos 2 genes? Cmo hara para investigar la funcin de estas secuencias nuevas? e) El plmido pKT25 (donde se clon el anzuelo tiene un gen de resistencia a neomicina, mientras que el pUT18C (donde van insertos los potenciales pescados) tiene un gen de resistencia a ampicilina. Por qu esta diferencia? f) Cmo es el genotipo de las E. coli que se utilizan para este tipo de experimentos en cuanto al gen de la adenilato ciclasa? Ac+ o Ac-? Por qu? Qu hubiera pasado si E. coli expresaba algn gen propio muy similar a Rv1417, Rv2617 o P36? g) Cmo fue la composicin del medio de seleccin? mnimo o rico (conteniendo glucosa)?

6. REGULACION DE LA EXPRESION GENETICA

Bibliografa: Repaso de IBMyC, Biol. Molec. Clula, Watson y col. (2a Ed.) y Genes VIII, B. Lewin cmo el DNA poda codificar una protena y desde el Gua terica: 1) Cul es el concepto moderno o molecular de gen? descubrimiento de los intrones y el splicing (particuHacer un esquema de un gen eucaritico tpico, sea- larmente el transplicing y el splicing alternativo) y la lar qu parte se transcribe como mRNA y qu parte se edicin de RNA rompieron la idea de la unidad y conexpresa como protena. Comparar con un gen proca- tinuidad transcripcional. Definicin funcionalista de gen: ritico. R: La respuesta tpica sera que es una secuencia de Unidades hereditarias que se transmiten de una geneDNA codificante para una protena. Sin embargo, racin a otra en forma uniforme y predecible conteesta definicin estructuralista se acota a un perodo de niendo informacin decodificable sobre estructuras y tiempo determinado entre mediados de los 50 y los funciones. 80. Entre Mendel y Watson y Crick no se conoca

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2) Qu mecanismos moleculares co y posttranscripcionales conoce que sean capaces de producir una sustancial modificacin en la secuencia de un transcripto primario? Describa los 4 tipos de procesamiento (splicing). Describa la edicin del RNA. R: El procesamiento del ARN genera un ARNm maduro (para genes que codifican para protenas) o ARNr a partir del transcripto primario. El capping (agregado de una metilguanosina en el extremo 5), la poliadenilacin (agregado de una cola de poli A en el extremo 3), el splicing (remocin de intrones) son ejemplos de modificacin co-transcripcional, mientras que el editing (cambio de bases) y el NMD (nonsense mediated decay) son ejemplos de mecanismos de modificacin post-transcripcional. Mediante sileciamiento post-transcripcional (o interferencia o quelling) tambin se produce degradacin o inactivacin especfica de ARNs. Otro mecanismo muy utilizado en bacterias es la utilizacin de aptmeros (secuencias complementarias de ARN ubicadas en la regin 5no En el caso de genes procariotas, la situacin es ms compleja dado que los genes individuales pueden codificante del ARNm) que, segn el tipo de plegacompartir sus secuencias regulatorias con otros genes miento secundario, pueden inducir terminacin temformando operones (no siempre, el gen I del represor prana de la transcripcin (atenuacin) o el autoclivaje del opern lactosa no conforma un opern sino que se del ARN mediante ribozimas autocatalticas. parece, en este sentido a los genes eucariticos). De- Muchos transcriptos sufren splicing alternativo, remobido a esto, en los libros se suele encontrar esquemas cin de intrones y unin de los exones de un gen. de operones y no de genes individuales (ej. opern lac Como consecuencia de esta modificacin cotranscripcional se producen diferentes secuencias de formado por los genes Z,Y,A, ver abajo). ARNm que codifican distintas formas de protenas los P I O Z Y A P cuales sern tejido especficas. Otro mecanismo de procesamiento es el ARN editing. En este proceso la informacin contenida en una molcula de ARN se ve alterada. Se trata de mecanismos que incluyen deaminaciones de C a U y de A a I, y tambin inserciones y deleciones. Afecta ARNt, Transcripcin ARNr y ARNm. En este ltimo caso, se ve afectada la En estos esquemas se suele incluir, adems de los 3 secuencia aminoacdica de la protena, de manera que genes que conforman el opern, el gen del factor de la misma difiere de lo que se puede predecir a partir transcripcin (I = represor) que est fsicamente liga- de la secuencia de nucletidos en la molcula de do a 5 del opern, pero no a otros genes reguladores ADN. Se da mayormente en eucariotas y se relaciona igualmente importantes (como el que codifica a la con la presencia de variantes de protenas segn el protena CAPCRP- en el caso operon lac). No se sue- tejido.

Definicin detallada de gen (combinacin de estructura y funcin) Unidad de informacin (fsicamente constituida por un cido nucleico, DNA o RNA, que puede estar particionado, superpuesto con otros genes o no) codificante para una unidad de funcin (polipptido o RNA, por ej. ribosomal). Propiedades: tienen capacidad de variar (mutar, recombinar, es decir evolucionar) y de tener una dinmica poblacional (comportamiento frente a la seleccin natural o artificial) dentro del contexto de especies biolgicas. Tienen capacidad de almacenamiento y reproduccin fidedigna de la informacin, as como su decodificacin. Los esquemas de los genes en los libros suelen tener varios errores conceptuales. Por ejemplo: en el esquema que sigue, no se explicita que, as como hay un promotor, existe tambin un terminador. Faltara incorporar los enhancers (que s aparecen en otros libros). Estructura de un gen eucariota:

le esquematizar (en el opern lac) un segundo operador que es el sitio de unin (reconocimiento) de la protena CAP, que servira para que el opern lac constituyera un ejemplo de regulacin negativa (represor) y positiva (activador CAP). No se suele esquematizar tampoco el promotor del gen I, ni los terminadores de transcripcin correspondientes y otras secuencias no codificantes importantes del futuro mensajero (por ej. la secuencia de unin a ribosomas llamada Shine Dalgarno), los codones de iniciacin (que muchos estudiantes suelen confundir con el nucletido +1) y los codones de terminacin de lectura.

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La degradacin mediada por mutaciones terminadoras o nonsense mediated decay (NMD), es un proceso de eliminacin de ARNm portadores de una mutacin terminadora o de una mutacin del marco de lectura que derivan en la creacin de codones de finalizacin precoz de la sntesis de una protena. De no eliminarse estos ARNm se produciran polipptidos defectuosos o incompletos al ser traducidos. Estos poliptidos pueden retener parte de su funcin (por ejemplo actividad enzimtica o capacidad de unirse a otra protena) pero no toda (por ejemplo se puede perder la regulacin de la actividad enzimtica o la capacidad de unirse a otra protena). Por lo tanto si se produjeran estos poliptidos, estas mutaciones podran resultar dominantes. Al eliminarse estos transcriptos por NMD muchas de estas mutaciones sern recesivas. 3) A travs de qu mecanismos un mismo gen puede producir varias protenas distintas? R: Por un lado se pueden producir distintos mRNAs por los siguientes mecanismos: -Splicing alternativo -Poliadenilacin alternativa: un mismo gen puede tener ms de un sitio de poliadenilacin y dependiendo de las situaciones fisiolgicas, tejidos, etc. se puede utilizar uno u otro sito. De esta forma se puede producir, a partir de un mismo gen, protenas con distintos extremos C-terminales. Esto sucede en el caso de los genes de las inmunoglobulinas y de esta forma se regula si las mismas sern secretadas o formarn un receptor de membrana. -Promotores alternativos: Puede haber ms de un sitio de inicio de la transcripcin y cada promotor dar un exn 1 diferente. De esta forma se pueden producir protenas con distinto extremo N-terminal. Adems cada promotor puede tener una regulacin diferente. Por otro lado, a partir de una protena traducida se pueden producir distintas variantes por modificacin post-traduccional: fosforilacin, glicosidacin, clivaje especfico, acilacin, etc. 4) A travs de qu mecanismos se pueden regular los niveles de una determinada protena? R: -Estado de condensacin de la cromatina -Regulacin de la transcripcin -Transporte del mRNA al citoplasma -NMD (en caso de haber un STOP prematuro) -Estabilidad del mensajero: Es tan importante encender rpido un gen cuando se necesita su producto como apagarlo cuando ya no se lo necesita. Existen protenas que se unen generalmente a la regin 3 no codificante del mRNA que regulan positiva o negativamente la vida media del mensajero. Tambin se puede regular por microRNAs. -Traducibilidad del mensajero: en algunas situaciones fisiolgicas o ante infecciones virales se favorece o desfavorece la traduccin de algunos mensajeros. -Estabilidad de la protena: Algunas protenas son rpidamente degradadas luego de ser producidas. Este mecanismo tambin puede ser regulado.

5) Cul es la diferencia entre un opern, que codifica para un mensajero policistrnico, y un gen que codifica para una poliprotena? En qu tipo de organismos se presenta cada uno de estos mecanismos? R: Un opern es una unidad transcripcional compuesta por una zona regulatoria de la transcripcin y una serie de genes ubicados hacia 3 de dicha zona promotora-reguladora. Este segmento de ADN u opern se transcribe como un todo y a partir del mensajero policistrnico, se producen varias protenas, cada una a partir de su propio codn de iniciacin, como el caso del opern lactosa en bacterias. Un gen que codifica para una poliprotena es un gen cuyo producto se clivar post traduccionalmente para producir mltiples pptidos. Los primeros son tpicos de los procariotas y los segundos de los eucariotas (virus eucariotas, precursores de neuropptidos, etc.). 6) Qu es un nucleosoma? Qu protenas participan? R: Un nucleosoma es la unidad fundamental de empaquetamiento del ADN. Consiste en un core central de ocho protenas bsicas llamadas histonas que se ubican alrededor de un segmento de ADN superenrrollado de 146 pb. 7) Cmo influyen los distintos rdenes de empaquetamiento del ADN en la expresin gentica? Cmo vara el grado de empaquetamiento durante el ciclo celular? Cmo resulta la susceptibilidad de corte por DNAasa I en cromatina transcripcionalmente activa con respecto a la inactiva? R: Durante la mitosis, los cromosomas se condensan y son transcripcionalmente inactivos. Sin embargo, durante la interfase, la mayora de las fibras de cromatina se descondensan. Este material se denomina eucromatina, la cual contiene zonas transcripcionalmente activas con regiones de ADN no transcribibles. Es decir que la condensacin de la cromatina se asocia a la prdida de la expresin gnica. La DNAsa I corta secuencias de ADN doble cadena. Si a las mismas se le unen factores de transcripcin, existe una proteccin a la digestin con la enzima ya que estas protenas ocultan el sitio de corte de la DNAsa I. 8) Cmo influye la metilacin de las citosinas sobre la expresin gentica en eucariotas? Comparar el grado de metilacin de la heterocromatina en relacin con el resto del genoma. R: La metilacin del ADN se relaciona con una represin de la transcripcin. La heterocromatina es cromatina altamente condensada a lo largo de todo el ciclo celular, a diferencia de la eucromatina que se condensa en metafase. Existen dos clases de heterocromatina, la facultativa, que puede ser genticamente activa o inactiva, y la constitutiva que permanece siempre en estado inactivo. 9) Qu es un gen reportero? Para qu se utilizan? Mencione algunos ejemplos. R: Los genes reporteros son secuencias que codifican para protenas de simple deteccin. Adems deben estar ausentes en la especie que se estudia para descar-

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tar una posible actividad endgena. Se utilizan para reemplazar productos gnicos difciles de medir y poder, entonces, determinar la actividad promotora. Algunos ejemplos son: -Luciferasa: Oxida a la luciferina emitiendo fotones los cuales son cuantificados en un luminmetro -GFP: Protena verde fluorescente de medusa -CAT: Cloranfenicol acetil-transferasa --galactosidasa: hidroliza un sustrato incoloro (ONPG) para dar un producto amarillo -SEAP: fosfatasa alcalina 10) Indique las caractersticas moleculares distintivas de los diferentes tipos de factores de transcripcin eucariotas. R: Los factores de transcripcin reconocen y unen una secuencia de nucletidos corta, como resultado de una complementariedad entre la superficie de la protena y la regin de la doble hlice en la zona del binding. En eucariotas, estos factores presentan un dominio de unin al ADN y otro de activacin. El de binding presenta un motivo estructural de -hlices y as se une al ADN. Los ms comunes son: cierres de leucina, hlice- vuelta- hlice y dedos de zinc. 11) a.- Describir el efecto de la regulacin de la transcripcin en procariotas en los siguientes casos: I- Opern lactosa por el represor. II- Opern lactosa por CRP (o CAP)-AMPc. III- Opern triptofano por el represor. b. Qu utilidad tiene para la bacteria que la lactosa sea un inductor de su opern y en cambio el triptofano sea un co-represor del suyo? c. Qu diferencias funcionales existen entre los represores bacterianos y los factores de transcripcin eucariticos? y entre un operador y un enhansn (secuencia de unin de un factor de transcripcin localizado en un enhancer o en un promotor)? R: a) I- El represor del opern lac reprime la expresin del opern ya que se pega a la zona operadora impidiendo que la ARNpol inicie la transcripcin. Slo cuando en el medio haya ligando, en este caso, lactosa, habr transcripcin del opern por remocin del represor. Se trata de un mecanismo de regulacin negativa. II- En el caso del opern lactosa, la protena CAP (tambin llamada CRP) coopera en la expresin del opern. Normalmente, la ARNpol se pega muy dbilmente a la zona promotora. Pero si adems se une la protena CAP en posicin 5 del promotor, se ve un aumento de los niveles de transcripcin. Se trata de un mecanismo de regulacin positiva. La protena CAP se une al ADN si en el medio existe AMPc. Los niveles de AMPc se elevan cuando no existe en el medio otra fuente de carbono como la glucosa que ejerce lo que se conoce como represin catablica, inhibiendo (indirectamente) la transcripcin del opern lac. III- En el caso del opern triptofano, un set de cinco genes adyacentes codifican las enzimas necesarias para la sntesis del aminocido. Existe un represor que

se pega al ADN junto con el triptofano. Se trata de un mecanismo de regulacin negativa, ya que al igual que el opern lac, el binding de la protena regulatoria suprime la transcripcin. b) Que no se sintetice triptofano cuando haya trp en el medio, y que se induzca la sntesis de -galactosidasa cuando hay lactosa en el medio para aprovecharla como fuente de carbono y energa. c) Ninguna y ninguna. Distintos nombres para igual funcin. 12) Qu son los elementos genticos reguladores (de la transcripcin) en cis y en trans? Describirlos para: a) el opern lactosa. b) un gen eucaritico como el que codifica actina. c) el gen de una protena eucaritica inducida por una hormona esteroidea. R: Existen elementos genticos que modulan la transcripcin desde una dada posicin en el genoma (en cis), mientras que otros producen elementos difusibles como protenas que se unen a otras zonas del ADN (actan en trans). a) cis: operador, sitio de unin (binding de CAP) y promotor. trans: represor y CAP. b) Cis: enhancers y promotor, trans: factores de transcripcin que actuan sobre el promotor del gen. c) Cis y trans: idem actina y la hormona que se une a una zona determinada del ADN despus de unirse a un receptor soluble intracelular (que es, a su vez, factor de transcripcin). 13) Cmo explica que las mutaciones que generan codones STOP prematuros sean dominantes si ocurren en el ltimo exn de un gen de globina, mientras que son recesivas si ocurren en los primeros exones? R: Los mRNAs con codones de terminacin prematuros que ocurren en los primeros exones son eliminados por nonsense-mediated decay. Si los individuos son heterocigotas para dicha mutacin y la dosis gnica del alelo salvaje es suficiente para mantener la funcin biolgica, entonces los individuos sern sanos y por ende la mutacin recesiva. En cambio mutaciones en el ltimo exn no son eliminadas por NMD y el producto de dicho alelo puede tener un efecto dominante negativo interfiriendo con la funcin del alelo salvaje, resultando en una enfermedad dominante. 14) Qu son las ribozimas, los ribointerruptores y los aptmeros? R: Las ribozimas son enzimas cuya composicin qumica es ARN (en vez de protena). Tambin existen desoribosimas (de ADN). En forma natural se las descubri en el proceso de splicing autocataltico de intrones de mitocondrias del protozoo Tetrahymena. En este caso se trata de una ribonucleasa especfica de secuencia pero existen otras actividades naturales y sintticas. Los ribointerruptores (riboswitches) son secuencias de ARN que determinan la finalizacin de una transcripcin de un ARNm o un splicing a travs de secuencias que son parte del ARN llamadas aptmeros (que tienen la posibilidad de formar estructuras internas de doble cadena por su complementaridad de

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secuencia). Estas estructuras secundarias se ven afectadas porque la propiedad de inters de estos aptmeros es que tienen una afinidad muy fuerte de unin a un metabolito regulador (parecido al de una enzima por su sustrato), cuya presencia modifica el patrn de plegamiento del ARN desencadenando su degradacin por una ribozima o por terminacin temprana de transcripcin porque esta estructura secundaria acta como terminador informando a la transcriptasa que debe detener la transcripcin. 15) Qu relacin existe entre los cromosomas politnicos de Drosophila con la resistencia a metotrexato en fibroblastos? R: En ambos casos se produce gran amplificacin de ADN, programada a nivel de desarrollo y afectando cientos de genes en el primer caso y como respuesta al antibitico localizada en el gen de la dihidro folato reductasa (DHFR) en el segundo. 16) El mapa del opern lac es: I P-O Z Y A El promotor (P) es el sitio donde se une la RNA polimerasa antes de comenzar la sntesis de mRNA. El operador (O) es donde se une el represor (en ausencia de inductor) codificado por el gen I. Dados los genotipos de los siguientes diploides parciales, completar la siguiente tabla con "+" si espera actividad de la protena codificada por "Z" (-galactosidasa) y de la codificada por "Y" (permeasa) o con "-" si no espera actividad. Considere que las mutaciones indicadas por "-" impiden: que las correspondientes regiones no codificantes del opern se unan al ligando especfico. que las correspondientes regiones codificantes del opern puedan originar por traduccin una protena biolgicamente activa. Is: gen del represor con una mutacin que origina una protena incapaz de unirse al inductor (pero su capacidad de unirse al operador est intacta).
Genotipo I+ P+ O+ Z+ Y+/I+ P+ O+ Z+ Y+ I- P+ O- Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+ I+ P- O- Z- Y+/I- P+ O- Z+ YIs P+ O+ Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+ Is P+ O+ Z+ Y+/I- P+ O+ Z+ Y+ I- P+ O- Z+ Y-/I- P+ O+ Z- Y+ I- P- O+ Z+ Y+/I- P+ O- Z+ YI+ P+ O+ Z- Y+/I- P+ O+ Z+ Y galac- Permeasa tosidasa +lac -lac -lac +lac

Problemas: 1) La figura muestra la estructura de un plsmido. El gen R del fago lambda codifica un represor que reprime la transcripcin de ciertos genes del fago controlados por el promotor/operador PL; pero en este caso, R tiene una mutacin tal que la protena codificada resulta termosensible: reprime a 30C, pero no reprime a 42C porque su estructura 3-D se altera dramticamente. El gen R lleva su R PL propio promotor PRM que, a los efectos de este problema, PRT Zrev consideraremos constitutivo. El gen Zrev contiene la secuencia codificante de la gal de E.coli en orientacin antisentido con respecto a su promotor: PL. Con este plsmido se transforman mutantes de E.coli con distintas caractersticas genotpicas, las cuales se detallan en la tabla. Completar con + o con "-", segn si espera o no actividad enzimtica. pls Actividad -gal mi30 C 42 C do s/IPTG c/IPTG s/IPTG c/IPTG I-P+O+Z+ S I+P-O+Z+ No I-P+O-Z+ S I+P+O-ZS IsP+O+ZNo I-P+O+Z+/ I+P+O+Z- S Para aquellos casos en los que indic que no hay actividad de -gal, indique adems, para cada uno, si se debe a: I- inhibicin de la transcripcin II- inhibicin de la traduccin III- Produccin de una -gal inactiva genotipo

genotipo
I-P+O+Z+ I+P-O+Z+ I-P+O-Z+ I+P+O-ZIsP+O+ZI-P+O+Z+/ I+P+O+Z-

pls mido
Si No Si Si No Si

Actividad -gal 30 C 42 C s/IP c/IP s/IP c/IP TG TG TG TG + + II I + + II - 30CIII/42CII 42C I + - 30CI/42CII*

R:
galac- Permeasa tosidasa Genotipo +lac -lac -lac +lac I+ P+ O+ Z+ Y+/I+ P+ O+ Z+ Y+ + + I- P+ O- Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+ + + + I+ P- O- Z- Y+/I- P+ O- Z+ Y+ + Is P+ O+ Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+ Is P+ O+ Z+ Y+/I- P+ O+ Z+ Y+ I- P+ O- Z+ Y-/I- P+ O+ Z- Y+ + + + + I- P- O+ Z+ Y+/I- P+ O- Z+ Y+ + I+ P+ O+ Z- Y+/I- P+ O+ Z+ Y+ +

* A 42C: sin IPTG no hay transcripcin pues el represor se une al operador; con IPTG hay transcripcin pero no hay traduccin pues se transcribe Zrev.

2) La ribulosa bisfosfato carboxilasa (abreviada "rubisco") es una enzima localizada en el interior de los cloroplastos. Permite fijar CO2 en la sntesis de triosas en el estroma cloroplstico. Rubisco est formada por dos tipos de subunidades, la subunidad grande (LSU), codificada en el genoma del cloroplasto, y la subunidad chica (SSU), codificada en el genoma nuclear e importada desde el citoplasma. Ambas son ensambladas entre s dentro del cloroplasto con ayuda de una chaperona. El estudio de la regulacin de la expresin de los genes LSU y SSU despert el inters de mu-

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chos investigadores. Con el objeto de encarar, en un futuro, la produccin de plantas transgnicas con genes de resistencia a virosis reguladas por luz, se realiz el siguiente experimento: se tom un fragmento de ADN ubicado entre -973 y -4 bp del gen de la SSU de papa (por convencin, se denomina +1 al sitio de iniciacin de la transcripcin) y se lig ro arriba de la secuencia codificante del gen de origen bacteriano de la cloranfenicol acetil-transferasa (CAT). Con esta construccin se transformaron protoplastos (clulas desprovistas de pared) de hojas de tabaco y se las someti a condiciones de luz u oscuridad. Luego de varias horas, se aisl ARN para analizar la expresin de CAT dentro de esos protoplastos, mediante northern blot usando como sonda el cDNA de CAT. Los resultados fueron: Luz Oscuridad Posteriormente se eliminaron los siguientes fragmentos del gen, y con cada una de las nuevas construcciones se transformaron protoplastos, se sometieron a las mismas condiciones y se aisl el ARN para hacer nuevos Northerns:
Sin eliminar Luz Osc.

una de las 2 construcciones se hizo un Northern, todo bajo las mismas condiciones que antes:

1)

luz oscuridad luz

2) oscuridad
d) De acuerdo a los resultados obtenidos, Qu tipo de elemento regulatorio est contenido en la secuencia 973/-772 aislada del gen SSU? 3) Imagine que las sin-herculitis son una serie de enfermedades genticas en humanos producidas por defectos recesivos en la expresin del gen de la herculina, una protena asociada al desarrollo y tono muscular. La enfermedad no es mortal pero se caracteriza por una tendencia a la flaccidez y la pereza. Para analizar los distintos tipos de la enfermedad, se dispone de biopsias musculares de individuos sanos homocigotas, es decir no portadores (S) y de enfermos (homocigotas) (X1, X2 , ...), adems de un mapa de restriccin del gen de la herculina, un clon de cDNA de longitud completa y anticuerpos anti-herculina. Para comenzar se realiza una serie de experiencias de Southern (DNA genmico cortado con la enzima BamHI), northern y western blots que se muestran en la figura. Gen sano
E1 500 pb E2 200 pb BamHI E3 800 pb BamHI

(-90/-4) eliminado

Luz Osc.

(-973/-90) eliminado

Luz Osc.

(-972/-722) eliminado

Luz Osc.

BamHI

a) Qu conclusiones se pueden sacar con respecto al papel de las secuencias de SSU manipuladas? b) Qu conclusin se puede sacar del hecho de que los protoplastos fueran de tabaco y no de papa? 5 kpb c) Podran haberse usado protoplastos preparados a 4 kpb partir de races de tabaco?
1 kpb

1000 pb
S X1 X2 X3 X4 X5

4000 pb
S X1 X2 X3 X4 X5

1,5 kpb

1)

-973

SSU

-772

P nos Pnos

cat
Southern Northern
S X1 X2 X3 X4 X5

2)

-772

SSU

-973

cat
50 kDa

Finalmente, se realiz la siguiente construccin: el fragmento de -973/-722 de SSU se fusion en los sentidos posibles ro arriba del promotor (P) del gen nopalina sintetasa (nos), gen que se expresa en vegetales y que no est regulado por luz. Esta construccin se fusion ro arriba de la regin codificante del gen CAT. Luego de transformar los protoplastos con cada

a) Interpretar los resultados caracterizando cada alelo mutante X1, X2, X3, X4 y X5.

Western

30

Dado que los pacientes X4 y X5 presentaban el mismo patrn de bandas en el Southern, en el northern y en el western, y con el fin de determinar si ambos pacientes presentaban la misma alteracin, se realiz otro experimento que consisti en la construccin de plsmidos mediante fusin de: la zona 5' de un clon genmico de la herculina de individuos enfermos con un patrn tipo X4 y X5 (homocigotas) o de un individuo sano (S) + la parte codificante del gen de la gal. Luego se realizaron los siguientes experimentos de transfeccin: Lnea celular Plsmido Activ. -gal Fibroblastos 3T3 p5S / CAT --Fibroblastos 3T3 p5X4 / CAT --Fibroblastos 3T3 p5X5 / CAT --Mioblastos L6 p5S/CAT +++ Mioblastos L6 p5X4 / CAT +++ Mioblastos L6 p5X5 / CAT --b) Cmo explica los resultados del experimento de transfeccin? c) Qu fenotipos tendrn individuos heterocigotas con genotipos S/X1, S/X4, S/X5 y X4/X5? d) Dibujar el resultado de Southerns (con enzima BamHI) de individuos que sean portadores sanos de los alelos recesivos X1, X2, X3 y X4. e) En qu casos el polimorfismo de sitios de restriccin con la enzima BamHI ser til para el diagnstico prenatal de la enfermedad? f) Si se crea un ratn transgnico con una copia del gen humano sano completo y sabiendo que el gen sano de la herculina de ratn tiene el siguiente mapa de restriccin para la enzima BamHI, dibujar los resultados de los Southern de ratones sanos (homocigotas) transgnicos y no transgnicos hibridizados con una sonda de herculina humana, a alta y baja sal.

a) Qu conclusiones obtiene de los resultados de medicin de actividad de luciferasa en las plantas transgnicas? b) Qu controles agregara al experimento con plantas transgnicas? El resultado sorprende al estudiante por lo que se decide a realizar experimentos para determinar qu secuencias en cis regulan la transcripcin del gen. Para ello asla los fragmentos 1263 a 877 y 525 a 226 y los marca en uno de los extremos 5, los incuba con preparaciones de protenas nucleares de plantas de tabaco cultivadas a distintas temperaturas, los trata con DNasa I y separa los fragmentos por electroforesis en gel de poliacrilamida. De este experimento de footprinting obtiene el siguiente autorradiograma:
Fragmento -1263 a 877
Extracto -

Fragmento 525 a 226

10C 28C

10C 28C Extracto -

BamHI

BamHI

BamHI

1800 pb

5000 pb

4) Un estudiante de doctorado est decidido a encontrar los factores que regulan la transcripcin del gen OMEGA8 en plantas. Se sabe que los niveles de mRNA de OMEGA8 aumentan cuando se exponen las plantas de tabaco a baja temperatura, aunque la funcin real de OMEGA8 es desconocida. Para lograr su objetivo, el estudiante realiza una serie de construcciones gnicas donde fusiona fragmentos de la regin 5 upstream del gen OMEGA8 a la regin codificante del gen de la luciferasa. Acto seguido introduce dichas construcciones por transformacin en plantas de tabaco. Cuando obtiene las lneas transgnicas, analiza la respuesta del transgn a la temperatura y obtiene los siguientes resultados: Nota: bloque blanco = regin 5 upstream del gen OMEGA8, +1= sitio de iniciacin de la transcripcin, bloque negro = regin que codifica para luciferasa.

Nota: la primera calle de cada gel corresponde a la incubacin del fragmento de DNA correspondiente con la DNasa I, en ausencia de extracto nuclear. c) Qu le sugiere el footprinting? d) En base a sus respuestas a) y c), haga un esquema de la regin -1588/-1 indicando el rol de cada regin e) Qu otro experimento de footprinting hara para confirmar este modelo? f) Por qu el estudiante hizo fusiones a la regin codificante del gen de la luciferasa y no de la propia secuencia codificante del gen OMEGA8? 5) Un investigador est estudiando la expresin de una enzima heptica X la cual tambin se expresa en pncreas slo en condiciones de stress oxidativo. Am-

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bas enzimas son estructural y bioqumicamente idnticas. El gen en cuestin tiene la siguiente estructura:
E1 E2 E3

Las flechas indican sitios de clivaje y poliadenilacin. La regin en gris es la regin codificante. En primer lugar, realiz un nort- Hgado Pncreas hern blot con RNA extraido a CT S CT S partir de hgado y de pncreas de ratones control y ratones sometidos a stress: a) Esquematizar los mRNAs maduros que se expresan en hgado y en pncreas. b) Cmo hara para confirmar su hiptesis? Qu experimento realizara para descartar que la diferencia de tamao de los mensajeros se deba a splicing alternativo del transcripto primario? Interesado por la regulacin de la expresin de esta protena en pncreas el investigador clon el promotor de la enzima X ro arriba del gen de la luciferasa y transform, con esta construccin, clulas de pncreas. Para su sorpresa, tanto las clulas sometidas a stress como las clulas control expresaron niveles similares y elevados del gen reportero. c) Qu puede decir, hasta el momento, sobre la regulacin de la expresin de la enzima X en pncreas? Sospechando que la secuencia perteneciente a la regin 3 UTR presente en el mensajero en pncreas, pero ausente en el hgado, podra estar relacionada con estos resultados, el investigador dise las siguientes construcciones: (P: promotor constitutivo)
1 P P Luc Luc

Cuando se expresa tTA se induce la transcripcin del gen de inters dado que se une a las zonas regulatorias de pTetOp. El sistema tiene un paso ms de regulacin: En presencia de tetraciclina, tTA no se puede unir a pTetOp debido a un cambio en su conformacin. Esta inhibicin es reversible. Una vez removida la tetraciclina, tTA se puede unir a pTetOp. Se disearon ratones transgnicos con las siguientes construcciones:
PromTetOp Gen de inters PromTej. esp. tTA

3UTR

Con estas construcciones transfect clulas pancreticas y las someti a condiciones de stress o control durante 8 horas. Finalmente midi la actividad de luciferasa: Construccin 1 Construccin 2 Control 3000 400 Stress 3000 2000 d) Qu puede decir del papel de la regin 3UTR en la regulacin de la expresin de la enzima X? 7) Se desea desarrollar un mecanismo para expresar genes en el cerebro de ratn en un determinado momento de su vida. Para ello Chen y col. disearon una estrategia utilizando el sistema Tet off. El sistema funciona de la siguiente manera: el gen de inters se clona ro abajo de un promotor (pTetOp) inducible por el factor de transcripcin tTA. A su vez el gen tTA se clona ro abajo de un promotor tejido especfico. El mecanismo es el siguiente:

Lnea 1 (pTetOp-luciferasa): Lnea transgnica con una construccin que lleva el gen de la luciferasa ro abajo de TetOp. Lnea 2 (pEnolasa-tTA): Lnea transgnica que lleva una construccin con el gen tTA ro abajo de las zonas regulatorias del gen de la Enolasa (pEnolasa). Lnea 3 (pNestina-tTa): Lnea transgnica con una construccin que lleva el gen tTA ro abajo de las zonas regulatorias del gen de la Nestina (pNestina). Lnea 4 (pActina-tTA): Lnea transgnica con una construccin que lleva el gen tTA ro abajo de las zonas regulatorias del gen de la Actina (pActina). Se cruzaron los ratones pTetOp-luciferasa por cada una de las lneas fundadoras 2, 3 y 4. La F1 transgnica para ambas construcciones (corroborada mediante Southern blot) se utiliz para los ensayos de actividad de luciferasa en diferentes tejidos en ratones de 2 semanas de edad: ACTIVIDAD LUCIFERASA 2 semanas. Lnea 1 F1 F1 F1 sola (1x2) (1x3) (1x4) Corteza 4 400 500 2300 Cerebro Estriado 3 90 1400 2000 Hgado 2 6 7 1900 corazn 3 7 6 2150 Nota: los nmeros representan medidas arbitrarias relativas de actividad de luciferasa. a) Teniendo en cuenta los resultados de la tabla, en qu se diferencia la regulacin de los promotores analizados (pNestina, pEnolasa, pActina y pTetOp)? b) Para qu sirve medir la actividad de luciferasa? c) Esquematizar los northern blots esperados para Nestina y Enolasa en estriado y en corteza de ratas salvajes de dos semanas de edad. (tamao del mensajero de Nestina:1800 bases, tamao del mensajero de Enolasa: 3200 bases). Se quiere utilizar este sistema de expresin (TetOptTA) para el desarrollo de una terapia contra una enfermedad neurodegenerativa. El objetivo es expresar una protena neuroprotectora en el estriado de ratas sanas y enfermas en determinado momento de sus vidas y no en otro (NOTA: A las ratas se les puede dar de tomar agua con tetraciclina el tiempo que sea necesario y sta llegar a todos los tejidos).

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d) Bajo qu zonas regulatorias pondras a la protena neuroprotectora? Qu lnea transgnica utilizaras para hacer el experimento? Cmo haras el experimento?

7. GENTICA DE POBLACIONES

Gua de Estudio: 1) a) En una poblacin en equilibrio: Cul es la frecuencia de heterocigotas que puede haber?Cul es la de homocigotas dominantes?Cul es la de homocigotas recesivas? b) La invariabilidad de las frecuencias gnicas de una generacin a otra, implica que est en equilibrio (de Hardy Weinberg) la poblacin parental? c) La estructura gentica de una poblacin, viene dada por sus frecuencias gnicas o por las genotpicas? d) El conocimiento de las frecuencias gnicas de una poblacin, implica conocimiento de su estructura genotpica? Y si la poblacin est en equilibrio H-W? R:a) Frecuencias heterocigotas H=2.p.q < 0.50 (si hay dos alelos), H = 1 - pi (si hay ms de dos alelos) Frecuencia homocigotas dominantes D=p2 Frecuencia de homocigotas recesivos R=q2 b) La invariabilidad de las frecuencias gnicas de una generacin a otra no implica que la poblacin parental est en equilibrio. La generacin parental puede tener D, H, R p 2, 2pq, q 2, pero llega al equilibrio en una generacin de panmixia. Para que hablemos de equilibrio deben mantenerse constantes las frecuencias gnicas y genotpicas. c) La estructura gentica de una poblacin viene dada por sus frecuencias gnicas y genotpicas. Si (D, H, R) (p 2, 2pq, q 2 ) puede deberse a que no hay panmixia, o que hay seleccin, deriva, mutacin, etc., que afectan la estructura gentica. d) El conocimiento de las frecuencias gnicas de una poblacin no implica el conocimiento de su estructura genotpica, a menos que la poblacin est en equilibrio de Hardy-Weinberg. 2) En el caso de loci ligados a cromosomas sexuales, cundo se considera que una poblacin se encuentra en equilibrio? R:En estos casos, el sexo heterogamtico presenta solo dos genotipos, y el homogamtico tres. Por lo tanto podemos describir sus frecuencias genotpicas poblacionales de la siguiente manera:

AA Aa aa A a P H Q R S pBfB = frec. del alelo A en la poblacin femenina qBfB = frec. del alelo a en la poblacin femenina pBmB = frec. del alelo A en la poblacin masculina qBmB = frec. del alelo a en la poblacin masculina En este caso, 2/3 de los alelos totales de la poblacin son transportados por el sexo homogamtico y 1/3 por el sexo heterogamtico. Las frecuencias gnicas en cada uno de los sexos sern diferentes si la poblacin no est en equilibrio. Siguiendo la nomenclatura asignada para cada uno de los genotipos, la frecuencia del alelo A en las hembras ser igual a: pf = P + H y en los machos pm = R En la poblacin total ser igual a: p = 2/3 pf + 1/3 pm Si las frecuencias en ambos sexos no son iguales en un comienzo, y se produce apareamiento aleatorio, las frecuencias irn oscilando en los dos sexos hasta alcanzar el equilibrio cuando: pf = pm = p Los machos obtienen sus genes ligados al sexo de la madre, por lo tanto: pm = pf de la generacin anterior (identificada con el apstrofe). Las hembras obtienen sus genes en igual proporcin de los progenitores, por lo tanto, pf = (pm + pf ) de la generacin anterior En cada generacin se reduce a la mitad la diferencia de las frecuencias gnicas entre los dos sexos, lo que se desprende de la siguiente ecuacin: pf - pm=pm+pf - pf=pm - pf= - (pm+pf) Por lo tanto, el equilibrio no se alcanza en una sola generacin de apareamiento aleatorio, sino en varias. Las frecuencias se van acercando asintticamente al valor medio poblacional, momento en el cual se alcanza el equilibrio. 3) Por qu, en teora, la consanguinidad no favorece un incremento en la frecuencia de alelos recesivos en una poblacin sino que solamente afectara la distribucin de alelos entre genotipos? R:La falta de panmixia no modifica las frecuencias gnicas sino las genotpicas. Entonces, por la consanguinidad p y q no cambian. El apareamiento entre parientes no afecta las frecuencias gnicas conjuntas, sino que aumenta la frecuencia de homocigotas. La consanguinidad har que los genes recesivos raros se presenten en homocigosis con una mayor frecuencia que si existiese apareamiento aleatorio en poblaciones de tamao grande. Problemas: 1) Una condicin anmica en el hombre llamada talasemia es determinada por un par de alelos codominantes. El genotipo homocigtico dominante TmTm produce una anemia grave (talasemia mayor) y el genotipo heterocigtico TmTn produce una anemia benigna (talasemia menor). Los individuos normales son homocigticos TnTn. Se encontr que la distribucin de esta enfermedad en una muestra de una poblacin italiana era de 4 con talasemia mayor, 400 con talasemia

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menor y 9596 normales. Indique si esta muestra est de acuerdo con los valores indicados segn el equilibrio de Hardy-Weinberg dentro de lmites estadsticos aceptables. 2) Cierta planta presenta flores azules, celestes y blancas y se sabe que esos tres colores estn determinados por un locus biallico de dominancia incompleta. Un eclogo vegetal encuentra una poblacin de esta planta y considera que pueden reconocerse dos subpoblaciones. Desea entonces averiguar si cada una de ellas se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg y qu sucede con la poblacin total. Si parti de los siguientes datos A qu conclusin lleg? Azul Celeste Blanco Total Subpoblacin I 164 32 4 200 Subpoblacin II 20 80 100 200 Total 184 112 104 400 3) Los grupos sanguneos humanos (AB0) estn determinados por un sistema de alelos mltiples en el que existen relaciones de codominancia y dominancia (segn la interaccin). La jerarqua de dominancia de estos tres alelos es: IA = IB > i. En una muestra de una poblacin humana se encontraron 23 individuos del grupo AB, 441 del grupo 0, 371 del grupo B y 65 del grupo A. a) Calcule las frecuencias allicas de IA, IB e i. b) Calcule el porcentaje de la poblacin que se espera que sea de los grupos A, B, AB y 0 si las frecuencias gnicas fueran: IA = 0,36, IB = 0,20 e i= 0,44. 4) Al analizar, en una poblacin de mamferos, un carcter monognico con ligamiento total al cromosoma X, se encontr que la frecuencia del gen dominante en las hembras es 0,8, mientras que el 30 % de los machos son recesivos. Qu frecuencias gnicas aparecern en cada sexo en la 3ra generacin a partir de la citada? Hacia qu valor tienden dichas frecuencias al cabo de un gran nmero de generaciones? 5) La enzima 6-glicerol fosfato deshidrogenasa presenta, en algunos lepidpetros, distintas formas, diferenciables en una corrida electrofortica., donde cada banda depende de la presencia de un alelo diferente para el locus autosmico 6-Gpd. Los alelos ms comunes son el F y el S. Se inician 4 poblaciones experimentales. En la tabla se muestra el nmero de individuos de cada genotipo para cada sexo y en cada poblacin. Machos Hembras FF FS SS FF FS SS POBLACION 1 48 84 18 18 84 98 POBLACION 2 24 24 72 24 24 72 POBLACION 3 9 42 49 9 42 49 POBLACION 4 20 20 60 9 42 49 Suponiendo que a partir de estas poblaciones se dan las condiciones de equilibrio de Hardy-Weinberg: a) Cules se inician con frecuencias de equilibrio? b) Cules sern las frecuencias gnicas y genotpicas de equilibrio en las poblaciones que no ofrecen diferenciacin sexual en las frecuencias gnicas? c) Cuntas generaciones tardarn en alcanzarlo?

6) En un acuario se mantienen numerosos ejemplares de Rana pipiens. Se estudiaron los individuos para el locus isoenzimtico diallico esterasa, encontrndose el nmero de individuos de cada genotipo en estado de renacuajo y adulto que se indican en la figura. a) Calcule las frecuencias allicas de este locus en la poblacin y diga si est en equilibrio tanto en el estado de renacuajo como en el de adulto. b) Compare la supervivencia larva adulto de los tres genotipos. RENACUAJOS

EST
Nde indiv. observados

1272 ADULTOS

652

76

Nde indiv. observados

1032

508

60

El becario que cuida las ranas para su tesis descubre un nuevo producto para mantener el pH del acuario, a mitad de precio del que vena utilizando habitualmente. Despus de cierto tiempo de utilizar este producto se da cuenta que aparcen en el acuario varios individuos muertos y hace de nue-vo el estudio anterior, 1440 520 40 encontrndoRENACUAJOS se los siguientes datos:

EST

Nde indiv. observados

1008

364 ADULTOS

c) Calcule las frecuencias allicas de este locus en esta poblacin y diga si estn en equilibrio tanto en estado larvario como adulto. d) Compare la supervivencia larva-adulto de los tres genotipos. e) El producto nuevo utilizado afecta diferencialmente algn genotipo? Por qu?.

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7) Un seor muy enfermo que estaba redactando su testamento, deseaba saber si l era verdaderamente el padre biolgico del segundo hijo de su anterior esposa, que, a pesar de su duda, llevaba su apellido. Sus abogados le recomendaron que realizara las pruebas genticas de filiacin. En un prestigioso laboratorio se tomaron entonces las muestras de sangre del hijo y de ambos padres. Se extrajo ADN genmico. Mediante PCR y a partir de primers adecuados se amplificaron 8 regiones de microsatlites altamente variables del ADN (loci), con el fin de determinar el ndice de paternidad. A continuacin se muestran los esquemas de los patrones electroforticos de bandas obtenidos al correr en geles de poliacrilamida los productos de amplificacin obtenidos para cada locus. P= padre, H= hijo y M= madre. A los costados se indican los alelos que difieren en el tamao del fragmento. En la tabla se indican las frecuencias poblacionales de estos alelos.

P H

M P H M P H M __ 117 __ __ 157 __ __ 195 __ 155 __ 193 __ __ 113 __ 153 __ __ 111 __ __ 149 __ __ __ 179

Locus 2 Locus 3 Locus 4 P H M P H M P H M __ 166 __ 205 __ __ 104 __ __ 199 __ __ __ 156 __ 195 __ __ 88 __ __ 185 Locus 5 Locus 6 Locus 7 P H M __ __ __ __ __ __ Locus 9 232 214 184 182 P H M __ __ 115 __ __ __ 109 Locus 8

Frecuencias allicas: Locus 2: 117= 0.18; 113= 0.16; 111= 0.1 Locus 3: 149= 0.01; 153= 0.32; 155= 0.1; 157=0.16 Locus 4: 179= 0.16; 193= 0.09; 195= 0.01 Locus 5: 156= 0.65; 166= 0.05.Locus 6: 185= 0.025; 195= 0.05; 199= 0.25; 205=0.13. Locus 7: 88= 0.58; 104= 0.28 Locus 8: 109= 0.3; 115= 0.16 Locus 9: 182= 0.13; 184= 0.29; 214= 0.01; 232= 0.01. A partir de estos datos calcule el ndice de paternidad para cada locus (razn de verosimilitud hijo/ no hijo). y el valor acumulado para todos los loci.

8.- MUTACIONES
Guia de estudio 1) Explique los conceptos siguientes:

- mutacin inducida - mutacin espontnea - clastgeno - mutacin somtica - mutacin germinal - mutacin letal - mutacin condicional - mutacin polar - reversin R: clastgenos son mutgenos que producen ruptura cromosmica. Son en general fsicos (Radiacin X, por ejemplo) y no son detectables por el test de Ames. Se requiere de ensayos cromosmicos (como el intercambio de cromtides hermanas) para ser detectados. 2) Indique las formas ms habituales de expresar la probabilidad de que ocurra una mutacin. 3) Describa un proceso selectivo para aislar microorganismos revertantes de auxtrofos. Cmo se puede demostrar que esas mutaciones revertantes son previas al momento del contacto con el agente selectivo? 4) Defina los siguientes conceptos y d ejemplos: - transicin (los 4 casos posibles) - transversin (los 8 casos posibles) - mutacin silenciosa - mutacin neutra - mutacin por corrimiento del marco del lectura (o "frame-shift") - mutacin por sustitucin "missense" - mutacin por sustitucin "nonsense" - mutacin supresora intragnica - mutacin supresora extragnica 5) Diferencie los siguientes mecanismos de mutacin espontnea: - errores en la replicacin del ADN. - lesiones espontneas 6) Con relacin a los errores en la replicacin del ADN, con qu base se aparean por puentes de hidrgeno los siguientes nucletidos: - la forma imino de C? - la forma enol de T? - la forma imino de A? - la forma enol de G? 7) Indique dos tipos de lesiones espontneas que, de no ser reparadas, pueden generar mutaciones. 8) Explique la causa por la cual las posiciones de 5metilcitosina constituyen "hotspots" para transiciones C T G A. Cul es la funcin de la uracil-DNA glicosidasa? Cun especfica es la uracil-DNA glicosidasa? Por qu no sera ventajoso para una clula tener uracilo como constituyente normal en su DNA? Qu significado evolutivo tiene el hecho de que en eucariotas las zonas no codificantes tienen una mayor cantidad de A-T que las codificantes? 9) Describa un proceso selectivo para aislar microorganismos revertantes de auxtrofos. Cmo se puede demostrar que esas mutaciones revertantes son previas al momento del contacto con el agente selectivo?

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10) Hermenigildito, el hijo de Eulalia y Casimiro, herva de fiebre y diarrea. El doctor, al observar al infante y sabiendo que muchos tratamientos haban sido ineficaces para controlar esta salmonelosis en otros pacientes, recet un cctel con un antibitico tradicional derivado de la penicilina: ampicilina y otro antibitico sinttico de ltima generacin llamado bacterminator III del prestigioso laboratorio BioTruch S.R.L. (Sociedad de Responsabilidad muy Limitada). Despus de una breve mejora, el prvulo volvi a recaer y el prestigioso mdico dictamin: las bacterias se volvieron resistentes al nuevo antibitico, no es la primera vez que veo que ciertos antibiticos inducen resistencia. Gumersindo, despierto hermano de la vctima, contest prontamente: - pero Doctor a m me ensearon en Gentica I que todas las mutaciones son preadaptativas. Los dems pusieron cara de no entender (o mejor dicho, no entendieron un pepino). - los agentes selectivos como los antibiticos no inducen la resistencia, la seleccionan, algunas de las bacterias ya eran resistentes antes de que Ud. administrara los antibiticos. Ante la cara de incredulidad de todos los presentes, Gumersindo tuvo que aclarar. a) Qu pudo haber dicho el enigmtico Gmer? Despus de la explicacin, el mdico no qued muy convencido y le dijo: Cmo puede haber resistencias preexistentes a antibiticos con los que estas bacterias jams tuvieron contacto previo? Demustremelo. Gmer llev, entonces, al doctor a la FCEyN y prepar unos menjunjes para cultivar bacterias y le pidi al matasanos aislamientos de bacterias de distintos intestinillos tratados y no tratadas con el nuevo antibitico. b) Qu experimento reprodujo Gmer para convencer al terco galeno? Obviamente, Gmer utiliz para su demostracin bacterias de pacientes que no fueron tratados previamente con el antibitico por qu? c) Gmer aprovech los distintos aislamientos para estudiar la razn por la que estas bacterias eran resistentes a tantos frmacos distintos. l vio que la frecuencia de aparicin de colonias resistentes a bacterminator era de 10-2 y mientras que para la ampicilina (y otros antibiticos), los valores eran de 10-9. Qu concluy Gmer de estos resultados? Cuando busc evaluar colonias simultneamente resistentes a bacterminator y ampicilina, se gast todas las cajas de Petri de la facultad para encontrar apenas una colonia. Con cifras tan bajas era muy difcil explicar lo que le haba pasado a su hermanito. Sin embargo, hasta ese momento, slo haba estudiado la gua de problemas de Mutaciones. Cuando lleg a la de gentica bacteriana se le prendi la lamparita. Se puso a hacer experimentos con el aislamiento de su hermanito (a esa altura, Gmer sufra de una terrible fiebre, haca frecuentes visitas al bao y enflaqueca aceleradamente, vaya a saber porqu motivos). Cuando puso en contacto clulas del aislamiento con una cepa de E.

coli Amp- Bac-, en cuestin de minutos fue capaz de aislar colonias de E. coli resistentes a ambos antibiticos con altsimas frecuencias. Sin embargo, Escherichia y Salmonella claramente pertenecen a especies (y gneros) distintos. Gmer no lo pudo explicar porque est en cama y estudiando Gentica para el parcial. d) Podr Ud.? R: a) No existen mecanismos por los cuales los antibiticos puedan modificar el ADN y los genes, slo lo pueden hacer los mutgenos pero de una manera inespecfica (no dirigida a un gen en particular) y no es el caso de los antibiticos. Lo que ocurre es que las poblaciones bacterianas se cuentan por miles de millones, lo que hace que un evento improbable (una mutacin al azar en algn lugar muy preciso de algn gen) se vea representada en una o en unas pocas clulas. Como todas se mueren salvo esos raros mutantes, se tarda un tiempo hasta que estas pocas clulas alcanzan un nmero importante (breve mejora hasta la recada). b) Hizo rplicas de placas de Petri sembradas con una suspensin conteniendo numerosas bacterias y que contenan el antibitico y le mostr al mdico que el nmero y la distribucin de las colonias resistentes fue idntica en todas las rplicas, lo que slo es posible si las clulas que originaron dichas colonias ya eran resistentes ANTES de la colocacin del antibitico. Si hubiesen sido inducidas por el antibitico, no existira ninguna razn para que seleccionara el mismo nmero y en la misma ubicacin en repetidas ocasiones. c) Que el antibitico puede ser neutralizado por varios mecanismos de accin diferentes: por una mutacin en un hot spot (nucletido con una frecuencia de mutacin muy superior al resto), por un aumento en el nivel de expresin del promotor que controla la cantidad de la protena afectada, diluyendo el efecto del antibitico; por transposicin del gen que codifica para la protena blanco a un plsmido de alto nmero de copias, aumentando su expresin, modificacin de enzimas con leves cambios (varios cambios diferentes alcanzan para la resistencia), por efecto de varias mutaciones distintas independientes entre s (lo que es lo mismo), etc. d) La conjugacin no suele reconocer barreras de especies. Adems, como lo que se suelen transferir son plsmidos (donde suelen ubicarse los genes de resistencia a antibiticos), ni siquiera se requiere de que los genomas de las bacterias conjugantes tengan homologa muy grande entre s ya que los mismos no se transfieren. La transferencia horizontal de plsmidos que combinan varios genes de resistencia a antibiticos es un conocido mecanismo de apilamiento y dispersin de dichos genes en varias especies de bacterias patognicas. 11) Adems de permitir el estudio del proceso mismo de mutacin, las mutaciones pueden ser tiles en algunos casos. D ejemplos de esos casos. 12) Por qu hay que preocuparse por el agujero de ozono? Explique.

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13) Qu procedimiento y sistema selectivo se le ocurren a Ud. para obtener plantas resistentes a una sustancia txica? R: Desde los aos 70 se sabe que las plantas que regeneran in vitro en ciertas condiciones son propensas a sufrir mutaciones aunque algunos autores opinan que las mutaciones pueden producirse previamente, en las clulas somticas que originan el explante (tejido vegetal del cual se parte para iniciar el cultivo de tejidos). Este fenmeno de mutagnesis por cultivo de tejidos es conocido en la literatura como variacin somaclonal (variacin por mutacin y somaclonal porque las plantas se derivan clonalmente de clulas somticas por regeneracin in vitro). El cultivo de tejidos in vitro ofrece varias de las ventajas que tiene el manejo de microorganismos, fundamentalmente, la posibilidad de seleccionar en frascos aplicando un agente selectivo al medio de cultivo, por ejemplo, un antibitico (que es una sustancia txica). La frecuencia de variacin somaclonal puede ser incrementada por el agregado de mutgenos al medio. 14) Explique el modo de accin de los siguientes mutgenos y el tipo de mutacin (a nivel molecular) que producen: - los anlogos de bases (ej., el 5-bromouracilo) - los modificadores de bases, como los agentes alquilantes (ej., etilmetanosulfato y nitrosoguanidina) - aflatoxina B1 - los agentes intercalantes (ej., proflavina, naranja de acridina, bromuro de etidio) R: el 5-bromouracilo es un anlogo de T pero forma, con mucha mayor frecuencia que sta un tautmero, que en su forma enlica adquiere propiedades de apareamiento como las de C. - etilmetanosulfato y nitrosoguanidina son capaces de conferir alquilos a nucletidos, preferencialmente G, confirindole propiedades de apareamiento iguales a las de A. - la Aflatoxina B1 producida por el hongo Fusarium, est muy frecuentemente presente en alimentos (cereales, manes,etc.) y es un modificador de bases muy especial, que forma un derivado de G, el cual es eliminado enzimticamente, generando un sitio apurnico. (Los sitios apurnicos pueden inducir un mecanismo de reparacin imperfecto, introduciendo una A enfrente de esos sitios.) - Los agentes intercalantes se ubican entre bases obligando a la polimerasa a producir inserciones o deleciones. 15) Mencione los mecanismos biolgicos de naturaleza enzimtica ms importantes en la reparacin del ADN daado. 16) Explique en qu consiste el test de Ames. Por qu se usan varias cepas mutantes de Salmonella? 17) Cules son las diferencias entre mutaciones somticas y germinales? y entre mutgenos y oncgenos o cancergenos? R: mutaciones somticas son aquellas que se producen en clulas pertenecientes a tejidos no reproducti-

vos y NO son heredables por lnea germinal. Pueden, o no, conducir a un cncer (lo ms frecuente es que la mutacin sea neutra o silenciosa y, en caso de afectar algn gen, disminuya la funcionalidad celular o lleve a la muerte de la clula). Mutaciones germinales son aquellas que afectan las clulas de la lnea germinal y que darn origen a las gametas. Como no hay cncer de gametas (aunque s lo puede haber del tejido somtico que las alberga ovarios, testculos-), no se puede afirmar que sean cancergenas aunque afecten especficamente a un protooncogn. Mutgeno es cualquier agente qumico o fsico que induzca o aumente la frecuencia de mutaciones en el ADN o el ARN. Oncgeno es aquel que lo hace en determinadas clulas somticas afectando a oncogenes y que pueden derivar en el desarrollo de un proceso tumoral (el cual suele requerir de ms de un oncogn para producirse, adems de fallas en los sistemas de defensa). No todos los mutgenos son oncgenos ni todos los oncgenos son mutgenos porque hay compuestos que se metabolizan formando otros compuestos que s son mutagnicos en determinadas condiciones especficas que slo se producen en determinados tejidos u rganos. 18) Qu es un oncogn y un protooncogn? Recuerda el c-myc en el linfoma de Burkitt? R: Protooncogn es todo gen que, por mutacin del gen o de ADN circundante, es capaz de convertirse en un oncogn. Pueden ser genes codificantes para hormonas de crecimiento o divisin celular, factores de transcripcin, telomerasas, etc. El c-myc es el oncogn que se induce extemporariamente en linfocitos por efecto de posicin del enhancer de un gen de inmunoglobulinas que se localiza cercanamente debido a una traslocacin recproca. Es un caso en que no necesariamente muta el oncogn, sino que lo hace el ADN circundante (efecto de posicin). 19) Cul es la base molecular de la teora mutacional del cncer?Existen otras teoras?Se contagia el cncer?Se hereda? R: Ver punto anterior. La teora viral, particularmente la retroviral, que tuvo su auge en los 70-80, se basa en la transduccin por parte de un virus de un oncogn celular (por ej. el c-myc pasa al virus de la leucemia aviar, pasando a llamarse v-myc) transmitiendo infecciosamente. Este mecanismo demostr ser de escasa o nula importancia en humanos. Por lo tanto, no se contagia en humanos (aunque s entre algunos animales). Un cncer es un fenmeno muy complejo que involucra usualmente la interaccin de varios genes. Se puede heredar la predisposicin heredando alguna mutacin en algn protooncogn en la lnea germinal, pero definitivamente no se puede heredar una mutacin somtica. Es decir, una persona que tuvo o tiene un cncer particular no transmite, a priori, la enfermedad a sus hijos porque las mutaciones determinantes son mutaciones somticas. 20) Qu mtodos se utilizan para evaluar oncogenicidad especfica de rgano?Por qu no es suficiente con mtodos como el test de Ames?

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R: A veces, el agente inductor no es de por s mutagnico sino que es metabolizado por alguna enzima celular especfica en condiciones especficas de pH, por ejemplo, para producir un mutgeno/oncgeno. Para investigar el potencial mutagnico de este tipo de compuestos en los que el agente es un subproducto metablico, el test de Ames puede ser adecuado convenientemente mediante el agregado de extractos celulares de los tejidos/rganos que se desea detectar, se trata de un sistema bactetiano que guarda diferencias con el de los humanos. Debido a esto, se desarrollaron en los ltimos aos varios modelos murinos transgnicos. Por ej. el MutaMouse es un sistema que se basa en un ratn transgnico que contiene unas 40 copias repetidas en tndem del genoma completo de un vector comn en ingeniera gentica (el gt10) el cual, a su vez, tiene una copia funcional del gen de la -galactosidasa del opern lac. Al extraer DNA total del ratn y mezclarlo con un extracto de empaquetamiento, estas copias del genoma de se encapsidan y pueden infectar clulas de E. coli (lac-) y expresarse generando placas azules en presencia de IPTG y Xgal. Si se recuperan placas translcidas, se atribuye a mutacin y puede ser verificada por secuenciacin del clon. La relacin entre placas blancas y las totales genera un coeficiente que se denomina frecuencia de mutacin.

posible mutgeno o carcingeno extraccin de DNA de rganos Problemas:

1) Se est estudiando un gen de E. coli que especifica cierta protena. Una parte de la secuencia de la misma es ala-pro-trp-ser-glu-lys-cys-his. Se obtuvo una serie de mutantes de este gen que no mostraban actividad enzimtica. Aislando los productos enzimticos mutantes se encontraron las siguientes secuencias: Mutante 1: ala-pro-trp-arg-glu-lys-cys-his Mutante 2: ala-pro Mutante 3: ala-pro-gly-val-lys-asn-cys-his a) Cul es la base molecular ms probable de cada mutacin? b) Cul es la secuencia de ADN ms probable que especifica esta parte de la protena? Utilice el cdigo gentico. 2) Un hombre (H.S.), empleado durante varios aos en la planta nuclear de Springfield, se convierte en padre de un varn hemoflico (B.S.), el primer caso en el rbol genealgico tanto suyo como de su esposa (M.S.). Otro trabajador de la misma planta durante varios aos tiene un hijo enano acondroplsico, tambin el primer caso en su familia y en la de su esposa. Los dos compaeros de trabajo demandan a su empleador (Mr. M.B.). Como genetista, lo llaman a Ud.

a declarar en el juicio. Qu dira Ud. en relacin a cada situacin? Aclaraciones: - la hemofilia es recesiva ligada al cromosoma X. - la acondroplasia es autosmica dominante. 3) El mutgeno etilmetano sulfonato (EMS), que se utiliza mucho en mejoramiento vegetal, induce transiciones G-C A-T. La aflatoxina B1, micotoxina que frecuentemente contamina alimentos, induce transversiones G-C T-A. Diga si cada mutgeno es capaz de revertir codones mbar (UAG) y ocre (UAA) tipo salvaje. 4) Una mutante de E. coli defectuosa en el sistema de reparacin SOS es resistente a la mutagnesis por luz UV. Por otro lado, clulas de piel de un paciente que padece xeroderma pigmentosum (deficiencia de una de las enzimas reparadoras por escisin) son extremadamente propensas a morir (y desarrollar tumores) por exposicin al sol. Intente explicar la aparente contradiccin. 5) Ud. fue nombrado Jefe del Laboratorio de Bromatologa (Ministerio de Salud y Accin Social), encargado de otorgar permisos para la venta de nuevos productos alimenticios que se desean lanzar al mercado, luego de constatar su inocuidad. Ud. recibe, de manos de una empresa productora de alimentos, una muestra de un nuevo edulcorante artificial para analizar, junto con un placas totales vs placas blancas proyecto de una impresionante campaa publicitaria planeada, y adems un inesperado cheque. Para realizar los anlisis, Ud. dispone de un cepario de Salmonella con 5 auxtrofos que no pueden sintetizar histidina, que se comportan frente a 3 mutgenos as: frecuencia de reversin his- his+
mutantes hisespontnea 5-Br-U aflatoxi- Bromuro de na etidio

1 0 0 0 0 2 10-8 10-5 10-8 10-8 -8 -8 -5 3 10 10 10 10-8 -8 -8 -8 4 10 10 10 10-5 -5 -5 -5 5 10 10 10 10-5 a) Qu mutantes eligira para usar en el test de Ames con el objeto de evaluar la potencial mutagenicidad del nuevo edulcorante? b) Si la mezcla de las mutantes elegidas + muestra a analizar + extracto heptico produce crecimiento bacteriano en ausencia de histidina exgena (1 colonia de cada 10.000 bacterias plaqueadas), otorgara Ud. el permiso para la venta libre del edulcorante? 6) La 2-amino-3-metilimidazo[4,5-f]quinolina (IQ) es una amina heterocclica aromtica que se podra formar durante la coccin de ciertas comidas. Como algunos compuestos de esta familia son genotxicos, se

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decidi inv vestigarla. P Primero se utiliz el te de est Ames, con resultados n negativos. Si embargo se dein mostr in v vitro que, en presencia de citocromo P450 e se produce una N-oxi idacin a 2-(hidroxiami ino)-3metilimidaz [4,5-f] qu zo uinolina, la c cual reaccion con na el DNA for rmando N-(d deoxiguanosi in-8-il)-2-am mino-3metil-imida azo[4,5-f]quin nolina (dG-C C8-IQ). La reversin de mu utaciones por test de Am de este ltimo r mes compuesto (a diferencia del precur a rsor) mostr mutaciones de cambio de lectura de una o dos pares G:C. a Cuando se e ensay con e sistema M el Muramouse se obtuvieron los siguientes v s valores (* = diferencia. s significativa respe al contro ecto ol): rganoTrat tamiento total placas Mu utantes FMx105 Hgado Con ntrol 1 70 030 01 47 2.81.1 1x20 mg/kg 1 41 460 0 15 72 5.12.3* 5x20 mg/kg 2 71 226 0 10 349 12.9 6.2* Colon Con ntrol 1 29 750 99 35 2.71.2 1x20 mg/kg 1 22 900 0 23 68 5.63.5* 5x20 mg/kg 1 31 970 0 16 97 7.41.4* Rin Con ntrol 1 54 100 40 51 3.31.3 1x20 mg/kg 1 52 600 0 23 71 4.72.1 5x20 mg/kg 1 61 830 0 11 95 5.90.8* a) Por qu el control (a que se le in al nyect agua) da ) valores posi itivos en los 3 rganos an nalizados? b) Hipotetic por qu lo resultados son diferentes en ce os diferentes rganos c) A la luz d estos resu de ultados Cons sidera Ud qu la ue IQ produce una respuest mutagnic generaliza o ta ca ada especfica d tejido? de Para estudia si el mecan ar nismo de acc cin tiene alg que go ver con el h hipotetizado, se secuencia aron todas las placas blancas derivadas de DNA de h e gado y se tab bularon los porc centajes relat tivos de tipo de mutacin en n los controle y en las tra es atadas con IQ (recordar q se Q que trata de porc centajes rela ativos y que s IQ produce en si e, algn caso a algn porcen ntaje menor a control, es no al so significa qu haya gener ue rado un nm mero absoluto meo nor de placa blancas qu el control) as ue ) Control IQ Tipo mutaci in Transicin GC AT G 38% 1 15% AT GC A 9% 1% Transversi n GC TA G 25% 5 52% GC CG G 16% 7% AT TA A 3% 4% Cambio de marco +1 + 6% 1% Cambio de marco 1 3% 19% 1 Delecin 2 pb 0% 1% d) Detecta Ud algn tip de mecan po nismo prefere encial? Cul? e) Todo lo anterior result importa ante para la deteccin de mu utaciones som mticas (com las oncog mo gnicas o carcinog nicas) Le parece que los ratones transgnicos tam mbin podran servir para estudiar mu n a utaciones germina ales? Qu t tejido se le o ocurre que s sera el ms apropia para estu ado udiar este asp pecto?

10.- TRAN NSPOSONE ES

1) Explique la siguiente terminolog e a

- secuencias de insercin n - transposon nes - repeticione invertidas es Secuencias de insercin: traduccin de insert e n tion seq quences o I que fuer descubiertas como ta IS, ron ales en genomas ba acterianos, de all su nom e mbre. Son tra ansposones simple autnomo ya que co es, os, odifican para las a enz zimas que p permiten su t transposicin (una trans n sposas En sus extremos co sa). ontienen secu uencias inve ertidas repetidas (casi idntica que son reconocidas por as), r la transposasa. Cuando se i insertan en el genoma hu e usped, se produc pequea repeticione (direct re cen as es epeats a cada lado del transpo s) o osn. Tr ransposones: son fragme entos discreto de ADN q os que tienen la capac cidad de mo overse a otro sitios del geos noma. Contrar riamente a lo que ocurre con plsmidos o e y fagos, su mo f ovimiento se restringe al genoma hu e l usped. Re epeticiones i invertidas: inverted re epeats, los extre emos de los transposone se caracte es erizan por te ener sec cuencias sim milares (de all repeticion nes) en orien ntaci invertida l de un extr n la remo respecto de la del ot o tro. 2) Explique, a nivel molec cular, la form de chupe ma etn observada al microscopio electrnico adoptada por o o cad denas simple de DNA q contiene transposon es que en nes, lue de desna ego aturalizacin y lenta renat turalizacin. R: Cuando sec cuencias con nteniendo tra ansposones son desnaturalizada y renatura as alizadas, los extremos re epetid invertido pueden rea dos os accionar en forma intram molec cular, forman una estru ndo uctura doble cadena. Co e omo la transposasa no tiene regi iones repetid se mantiene das, com ADN de simple cad mo e dena. Los ex xtremos inve ertidos forman la b base de la es structura de chupetn, mi c ientra que la tran as nsposasa form el cuerpo de la misma ma a. 3) Cmo se c cree que han evolucionad las bacter n do rias ue esistentes a v varios antibi ticos al mis smo qu hoy son re tiempo? R: Existen tra ansposones c compuestos, que llevan secuencias del h husped. Un ejemplo so aquellos f on forma ados por dos IS. Dos IS c cercanos pue eden comport tarse como un n nico transpos y llevar consigo las sesn los sos, cuencias que l separan. En algunos de estos cas alg gunas de las IS perdi la capacidad de transposic d cin y todo se trans t spone como u unidad. En otros cas una sos, am mbas IS son funcionales pero con una frecuen s, ncia baj suelen tra ja ansponer en conjunto, lle evando cons sigo las secuencias que los sep s paran. Si bien estos even n ntos son de baja fre n ecuencia, cu uando las sec cuencias que se e tra ansponen lle evan resiste encia a anti ibiticos, es stos eventos son se eleccionados y aparecen con ms f s n frecuencia. Los tr ransposones no se transfi fieren entre b bacter rias, pero s lo hacen los plsmidos en los que p s e pueden insertarse los transposo n ones; de ah que la mayo ora de las bacteria con multiresistencias lleven las m as misma en plsmid as dos. 4) Marque las diferencias entre los mecanismos no s s m rep plicativo y replicativo de transposici e in. Qu en nzima participan? as

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R: En el mecanismo no replicativo, el transposn se mueve de un lugar a otro del genoma, sin dejar una copia en el sitio dador. En el mecanismo replicativo, se genera una nueva copia en el sitio de transposicin. En ambos casos acta una transposasa, que unida a los extremos del transposn, es la encargada de clivar una cadena del sitio dador y una del aceptor y ligarlas en forma cruzada, por un mecanismo que tiene similitudes con las topoisomerasas. Las estructuras que se forman tienen similitud con las orquillas de replicacin. Si dichas horquillas son sustrato para la maquinaria de sntesis de ADN, entonces habr una duplicacin del transposn, se formar un cointegrado y est ser resuelto por una recombinacin homloga, catalizada por una resolvasa, tambin codificada por el transposn. Si las horquillas no son sustrato para la sntesis de ADN, entonces se produce un segundo corte y ligacin en el sitio aceptor, pero el sitio dador no se reconstituye, por lo que el salto del transposn produce una rotura del ADN en dicho sitio. 5) Qu evidencias experimentales demuestran que en algunos casos la transposicin ocurre a travs de un RNA intermediario? R: En muchos transposones se encuentran huellas del procesamiento del mRNA, como ser uniones exn-exn precisas, colas de poli A y extremos 5 que coinciden con el inicio de la transcripcin 6) Qu analoga tienen los retrovirus con los transposones? R: Los retrovirus tambin tienen extremos repetidos y se insertan en el genoma del husped. 7) Qu son y cmo funcionan los elementos controladores en maz? R: Los elementos controladores de maz tambin son transposones. Se los denomin originalmente controlling elements. Existen varias familias en el genoma del maz. Dentro de cada familia se los puede clasificar en autnomos y no autnomos. Los primeros pueden transponer por s mismos, mientras que los segundos perdieron la actividad transposasa, por mutacin o delecin, y son estables a menos que acte en trans una transposasa de un elemento autnomo de la misma familia. 8) Qu son los elementos P de Drosophila? R: Los elementos P de Drosophila tambin son transposones, que se encuentran en las cepas P. Estos transposones se activan cuando se cruzan machos P por hembras M. La activacin del transposn produce lo que conocemos como disgnesis del hbrido, ya que la transposicin continuada en la lnea germinal produce esterilidad en los hbridos de dicha cruza. El cruzamiento opuesto no produce disgnesis y eso ocurre por un efecto materno en las lneas P, que reprime la transposicin. La transposicin slo ocurre en la lnea germinal. La explicacin molecular de dichos eventos radica en que el transposn codifica para dos productos de splicing alternativo que difieren en la inclusin o no del intrn 3. Cuando el intrn se incluye, el producto de 66 kDa es un represor de la trans-

posicin, mientras que cuando el intrn no se incluye, el producto es la transposasa de 87 kDa. En la lnea germinal se produce el evento de splicing que elimina el intrn 3 y se produce la transposasa activa. El efecto materno se explica por la presencia del represor en la lnea germinal. 9) Cmo se supone que surgieron los pseudogenes? R: En algunos casos, los pseudogenes procesados se originaron de secuencias de ARN que fueron retrotranscriptas. Si bien no contienen informacin necesaria para su transposicin, pueden haber sido sustrato para un sistema de retrotransposones. En general este tipo de pseudogenes se encuentra en porciones del genoma no relacionadas con la del locus que les dio origen. En otros casos, los pseudogenes aparecieron por duplicacin de los genes originales, seguida de una prdida de la capacidad de expresarse de una de las copias. En este ltimo caso no hay ARN intermediario, la estructura del pseudogen no revela huellas de procesamiento de ARN.

Problemas
1) En 1938, Marcus Rhoades analiz genticamente el maz negro (pigmentado) mexicano. De la autopolinizacin de una variedad totalmente pigmentada, surgi una progenie con los siguientes fenotipos: 12/16: granos totalmente pigmentados 3/16: granos blancos con manchas pigmentadas 1/16: granos blancos Estos resultados fueron confirmados por su contempornea Barbara McClintock quien, profundizando sobre el tema, logr interpretar agudamente sus observaciones citogenticas, lanzando, en los '50s, una teora muy resistida en su momento sobre genes "mviles". Tres dcadas ms tarde, la Gentica Molecular permiti la interpretacin de esos datos, al identificar un gen dominante P que determina la pigmentacin y otro gen dominante (situado en otro cromosoma) que controla la reversin a un alelo Pm mutado por insercin de un elemento mvil. a) Cules son los genotipos de la planta parental y de la progenie? b) Qu tendr el gen controlador que le falta al transposn que se meti en el gen de la pigmentacin?Qu deben tener en comn los dos? c) En qu tipo de clulas (somticas o germinales) y en qu momento del desarrollo ocurri la reversin en los granos mosaico? d) Cul sera el resultado de un Southern de las partes blancas y pigmentadas de los granos mosaico, usando el gen P como sonda? 2) Una estrategia alternativa a los marcadores moleculares para el clonado de genes es el "transposon tagging", es decir etiquetado de genes mediante transposones. Se realiz la transformacin -va Agrobacterium- de Arabidopsis thaliana resistente al hongo Cladosporium fulvum, con el elemento Ds a unas plantas, y con un elemento Ac defectivo a otras plantas. Como resultado, se obtuvieron algunas transgni-

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cas visiblemente mutadas (plantas enanas, albinas, sin flores, etc.), pero ninguna presentando fenotipos mosaico. Sin embargo, al cruzar ambos tipos de transgnicas entre s (con Ds x con Ac), la progenie resultante inclua varios individuos con fenotipos mosaico debido a mutaciones somticas. Uno de los fenotipos analizados fue el aspecto de las hojas luego de inocular con Cladosporium fulvum, llamando la atencin una planta que tena una hoja saludable excepto en una zona necrtica-daada por el hongo- bien delimitada. Al hacer un Southern sembrando DNA -cortado por Hind III- aislado de dos zonas de la hoja mosaico (resistente (R) y susceptible (S) al hongo), el resultado fue:

kpb 15-13-7--

kpb

insercin, no se expresa y los ojos resultan blancos. Por sucesivas cruzas, se obtuvo una poblacin de machos y hembras con todos sus cromosomas X conteniendo el gen white interrumpido por peach. Por otro lado, se logr una construccin denominada hsp, en la que el elemento mariner salvaje se puso bajo la regulacin del promotor del gen de la protena hsp70 (heat shock protein), que es inducible por calor. Esta segunda construccin se introdujo en uno de los cromosomas del par 2 de moscas transgnicas que ya eran peach, obtenindose moscas hsp/+. Se realizaron cruzas entre moscas transgnicas peach, en las que uno de los parentales tena 1 dosis de hsp (hsp/+) y el otro parental, ninguna (+/+). Se cont el porcentaje de la progenie, criada a 25C (actividad basal de hsp) o a 37C (actividad inducida de hsp), que exhiba ojos rojos.

Genotipo del cromosoma 2 de los padres hsp/+ ; +/+ 6-hsp/+ ; hsp/+ Sonda: Ac +/+ ; +/+

3-Sonda: Ds
Nota: Hind III no corta a Ds ni a Ac a) Haga un esquema que muestre qu zona del plsmido Ti (o derivado de Ti) usara para colocar a los transposones con el fin de transgenizar a las plantas? Cmo hara para lograr una seleccin de las plantas verdaderamente transformadas? b) Por qu aparecieron mutantes somticas (fenotipos mosaico) en la F1 y no en las parentales? c) En qu se basa el "tagging" del gen a clonar, en este caso? En base al Southern, por cul mecanismo (replicativo o no replicativo) transpone Ds? d) Si usted desea clonar el gen de resistencia a partir de una biblioteca genmica indique: I. la fuente de DNA para hacer la "library" (qu parte de la planta?) II. el tipo de "library" (genmica o de cDNA?) III. si usara alguna enzima de restriccin. Cul? IV. el tipo de vector para construir la "library" (indique, adems, si debe permitir o no expresin de insertos y por qu) V. la sonda que usara y el fundamento del "screening" VI. en qu consistira el anlisis del clon aislado 3) Recientemente, un grupo de investigadores estudiaron los mecanismos de regulacin del elemento transponible mariner, que est presente en genomas de invertebrados, hongos y humanos. Obtuvieron un macho transgnico que tena reemplazado un fragmento del gen white, localizado en el cromosoma X, por otro homlogo, pero interrumpido por un mariner cuya transposasa no era funcional. Esta variante de transposn con transposasa no funcional se denomin peach. El gen white codifica para un pigmento rojo del ojo y cuando est mutado por

Temp. % progenie (c/ ojos rojos) 25 8 37 17 25 18 37 48 25 1 37 2

a) Interprete los resultados numricos b) En qu etapa del desarrollo ocurren los eventos que dan a origen a la progenie con ojos rojos ? c) En este tipo de cruza tambin aparecen individuos con ojos blancos con manchas rojas (fenotipo mosaico). Cmo justifica estos resultados? En qu etapa del desarrollo ocurrieron los procesos que originaron los ojos mosaico? d) Las hembras mosaico presentan un mayor nmero de manchas rojas que los machos mosaico. Cual es la causa? 3) Un ejemplo muy llamativo de transposon tagging es el del trabajo publicado por Ling y col. en Science 282:943 (1998) en el que clonaron el gen Matusalem (Methuselah) que prolonga la vida de las moscas (y de gusanos). Recientemente (febrero del 2002) se public en varios diarios la identificacin del gen homlogo en humanos. Los investigadores introdujeron, de manera controlada como para evitar la disgnesis del hbrido, elementos P en una cepa de Drosophila que no los tena (cepa M). a) Cmo supone que lo hicieron? b) Le parece que aparecieron mosaicos? Por qu? Si bien identificaron varios mutantes en la M1 (primera generacin de mutantes equivalente a lo que comnmente se llama F1 pero que en este caso no proviene de un cruzamiento sino de un tratamiento mutagnico), encontraron muchas ms en la M2 (o en generaciones posteriores de endocra entre hermanas, equivalente a la F2, segunda generacin despus de la mutacin). c) Por qu es esto?

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Entre los nuevos mutantes haba uno que les llam mucho la atencin: era capaz de vivir un promedio de 77 das en vez de los 57 que vivan, como promedio, las moscas normales, por lo que bautizaron Matusalem al gen en cuestin. d) Quin fue Matusalem? Quiere decir que este gen en forma normal alarga la vida? Adems estas mutantes eran ms resistentes al ayuno y a condiciones de estrs oxidativo. Por todas estas razones, inmediatamente clonaron y secuenciaron el gen en cuestin. e) Por qu esto les result, relativamente, fcil de hacer? Porqu no les habra sido tan fcil mutagenizando con un producto qumico como el EMS? El gen result ser un receptor de superficie celular de 514 aminocidos del tipo de los receptores G, pero de funcin desconocida. Con este gen se pudo clonar rpidamente un gen muy similar en Caenorhabditis elegans (un nemtodo muy estudiado como modelo en anlisis genmico y del cual ya se conoca buena parte de la secuencia genmica). Su mutacin tena efectos fenotpicos muy similares a lo observado en moscas. f) Qu le indican estos resultados respecto a la evolucin del gen? g) Cmo se pudo aislar tan rpidamente este nuevo gen de nemtodos y modificar el mismo para hacer estas observaciones sin repetir el transposon tagging de las moscas?

11.- INGENIERA GENTICA

Bibliografa: Recombinant DNA, Watson y col.

Gua de estudio:
1) Qu significa "clonar" un gen? Defina la expresin "ADN recombinante", "vector" e "inserto" Mencione un mtodo que sirva para reconocer fcilmente colonias de bacterias que llevan plsmidos que contienen insertos.

R: Clonar un gen (o una secuencia de ADN) significa sinifica aislarlo de su contexto original y colocarlo en otro contexto donde pueda ser amplificado. Es decir, aislarlo del genoma (por ej. con enzimas de restriccin) para insertarla en un vector (por ej. un plsmido bacteriano) para que, despus de introducida la construccin recombinante en una bacteria como E. coli, se pueda multiplicar esta secuencia para su anlisis molecular (por ej. secuenciacin nucleotdica). El concepto difiere de la clonacin biolgica en el sentido de que ac estamos hablando de un segmento de ADN y no de un organismo completo. Para reconocer bacterias que llevan plsmidos con inserto se hace visualizacin de color (o falta de color) de colonias (ver uso de -gal, ms adelante). 2) Defina la expresin "ADN recombinante" R: ADN recombinante es un trmino que se origin cuando se desarrollaron las primeras tcnicas de Ingeniera Gentica y se refiere a un fragmento de ADN que se origina por la unin in vitro de dos fragmentos distintos, que pueden provenir, inclusive, de especies no relacionadas. Quimera (sinnimo) Nota: La expresin recombinante (aqu) no es sinnimo de recombinacin homloga porque no hay un intercambio de segmentos homlogos. En todo caso, se parece a la llamada recombinacin ilegtima (como por ejemplo la integracin de fago lambda para hacerse lisognico, ver gua de gentica bacteriana). 3) Qu tipos de vectores de clonado conoce que funcionen en clulas procariotas? y en eucariotas? R: Vector se refiere a un fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un determinado husped y , como el tmino lo indica, puede servir de vehculo para multiplicar otro fragmento de ADN que haya sido fusionado al mismo. Elementos bsicos de un vector: ser transferible por algn mtodo, ser seleccionable, ser propagable, aceptar la insercin de DNA exgeno. Inserto se refiere a un fragmento de ADN que se fusiona al vector; en general representa el ADN de inters, que fusionado al vector puede replicarse en el husped adecuado. En clulas procariotas hay plsmidos y fagos. Los primeros con circulares y tienen un origen de replicacin que permite que se repliquen y se mantengan en la clula. Los hay de alto y bajo nmero de copia. Los fagos pueden ser utilizados como vectores, donde el ADN se inters debe ser insertado en el genoma del fago. En ambos casos se puede tambin diferenciar a los vectores de expresin, ya sean fagos o plsmidos, que tienen promotores y terminadores que flanquean al inserto, de forma de producir un mRNA y la protena correspondiente. En clulas eucariotas tambin hay vectores virales y plsmdicos. Estos ltimos slo se se parecen a los bacterianos naturalmente en levaduras. En clulas de mamferos se los ha fabricado articialmente utilizando orgenes de replicacin y replicasas de origen viral (como los plsmidos derivados de SV40 en clulas

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Cos). Muchos de ellos fueron modificados para incorporar orgenes de eplicacin de E. coli para as poder replicar tambin en bacterias, especialmente cmodo para producirlos en buena cantidad. Por eso se los denomina: de combinacin (shuttle). En levaduras tambin se desarrollaron cromosomas artificiales (YACs), que fueron los primeros en utilizarse para clonar grandes fragmentos que fueron secuenciados en los albores de la genmica estructural. Posteriormente fueron sustitudos por otro tipo de vectores com los BACs (Bacterial Artificial Chromosomes). 4) Qu es una genoteca (o library genmica) y cmo se construye? Qu diferencia tiene con una clonoteca (habitualmente llamada library) de ADNc (cDNA)?Cmo se realiza una bsqueda, prospeccin, relevamiento (habitualmente llamado screening)? Cmo se puede marcar una sonda? Cmo se procede para identificar bacterias que llevan una construccin de inters, luego de haber sido transformadas con una mezcla de ligacin? R: Genoteca o genomoteca es una biblioteca de ADN donde, en vez de colecciones de biblios. (que significa libros) dispongo de colecciones de segmentos de genomas. En general son especficas de un organismo determinado. Se utiliza ADN genmico que se corta ya sea con enzimas de restriccin o por mtodos fsicos y se liga a un vector, que puede ser un plsmido, un fago o un BAC. Este material se utiliza para transformar bacterias competentes (preparadas fisiolgicamente para permitir la entrada de ADN extracelular) o para infectarlas, si se utiliza un fago. La poblacin de bacterias obtenidas representa a todos los posibles fragmentos del ADN genmico original. En el caso de la clonoteca o library de cDNA se utiliza ADNc en lugar de ADN genmico, pero el proceso es similar, salvo que no es necesario cortar el ADNc. Hay varias formas de marcar sondas, las que numeramos a seguir. Random priming: se incuba el fragmento con una poblacin de oligonucletidos (hexmeros y/o octmeros) en presencia de fragmento Klenow (fragmento de la ADN polimerasa de E. coli), dNTPs, alguno de los cuales est marcado en Alpha (primer fosfato) y Mg2+. Despus de un proceso de desnaturalizacin y renaturalizacin se agrega la enzima, los oligonucletidos se unen al ADN y son utilizados como sustrato por la enzima. Actualmente el ms usado. Nick translation: si una de las cadenas de un plsmido se corta exponindo un extremo 3OH, la ADN polimerasa I utiliza ese extremo como sustrato e inicia la sntesis de ADN, desplazando a la cadena existente, y corriendo el nick. Aqu tambin se lleva a cabo la reaccin con dNTPs, alguno de los cuales est marcado y Mg++, adems de la ADN Polimerasa I de E. coli. Marcacin terminal: se puede marcar el extremo de un fragmento utilizando una quinasa especfica y ATP marcado en gama.

PCR: la reaccin de PCR puede utilizarse introduciendo un dNTP marcado en la reaccin o utilizando un primer previamente marcado en su extremo 5 con una quinasa. Lo mismo puede hacerse con hexmeros de secuencia al azar. Ribroprobes: con el plsmido adecuado , en presencia de una ARN polimerasa como la T7 y de ribonucletidos, se puede transcribir un gen in vitro y marcarlo pasa ser utilizado como sonda. En el caso de las genotecas, se llama screening a la bsqueda del clon que contiene el fragmento de nuestro inters. Existen esencialmente dos formas. La primera es utilizar un fragmento y oligonucletido de nuestro gen marcado. Este fragmento se hibrida con una membrana obtenida de una placa de petri conteniendo mltiples colonias o playas de lsis, dependiendo del vector utilizado. El ensayo es anlogo al Southern blot. La marca (sea radiactiva o no radiactiva) indicar las colonias o placas positivas, las cuales se pueden recuperar de la placa madre. La segunda forma es utilizar una forma de detectar la protena expresada, en caso de los vectores de expresin. En general puede hacerse utilizando anticuerpos que detectan la protena producida y nos darn la posicin de la colonia o playa de lisis positiva, en un ensayo que es anlogo al de un western blot. Para identificar bacterias que llevan una construccin de inters, luego de haber sido transformadas con una mezcla de ligacin y seleccionadas para la presencia de plsmidos: Se preparan plsmidos a partir de un cierto nmero de clones positivos y se los chequea por restriccin, es decir se los digiere para comprobar el mapa de la construccin realizada. A veces se hace PCR con primers especficos directamente de las colonias positivas (la Taq pol es mucho ms barata que las enzimas de restriccin y permite analizar muchos clones a la vez). 5) Cul es la diferencia entre una transformacin y una transfeccin? R: En animales, transformacin se refiere a la conversin de una clula o tejido en neoplsico, por lo que no es correcto sinonimizarlo con transfeccin. En bacterias, tambin es preferible decir transfeccin porque la transformacin natural que vimos en gentica bacteriana tiene diferencias con la artificial que se usa en ingeniera gentica. En plantas son sinnimos. 6) En qu situaciones usara Ud. las siguientes enzimas?: retrotranscriptasa ligasa Taq polimerasa DNAasa I RNAsa H R: RT: Es una ADN polimerasa dependiente de ARN por lo que se la usa para fabricar ADN a partir de ARN por ejemplo en el proceso de clonado molecular de ARNm. Nota: raramente se la puede usar como ADN polimerasa dependiente de ADN cuando hay dificultades en la secuenciacin manual de regiones

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con estructuras secundarias que dificultan la accin de las ADN polimerasas tradicionales. L: Para ligar fragmentos. Para unir un inserto a un vector. Requiere ATP y Mg. Taq pol: en PCRs. DNAasa I: para cortar ADN en forma inespecfica, por ejemplo para introducir los nicks en la marcacin por nick translation. RNAsa H: para eliminar la hebra de ARN despus de la accin de la tanscriptasa reversa. 7) Se quiere clonar el gen de una protena que se expresa en cerebro de ratn. Ud. no tiene, ni puede llegar a saber, la secuencia de aminocidos de la protena y depende exclusivamente de anticuerpos. Qu tipo de genoteca usara para comenzar?: a) una genmica hecha con ADN obtenido de cerebro de ratn? b) una genmica obtenida de hgado de ratn? c) una de ADNc hecha con ARNm de corazn en pBR322? d) una de ADNc hecha con de ARNm de cerebro en pBR322? e) una genmica de expresin hecha en el fago gt11 hecha a partir de ADN de ganglios linfticos de ratn? f) una genmica de expresin hecha a partir de ADN genmico obtenido de cerebro de ratn? g) una de ADNc de expresin hecha en fago gt11 a partir de ARN de cerebro de ratn? R: La opcin g) porque es en el tejido en el que el ARNm es ms abundante. 8) Qu es la mutagnesis dirigida in vitro? Mencione algn procedimiento para lograrla, uno usando clulas y el otro sin usarlas. R: Suponiendo que la secuencia que quiero mutar se encuentra entre 2 sitios de restriccin de tipo cohesivo dentro de un plsmido, puedo digerir con la enzima y religar para obtener una delecin. Otra: teniendo la secuencia clonada en un plsmido, se la desnaturaliza con calor (para obtener ADN de cadena simple) e hibrida (anilla) con un oligonucletido sinttizado artificialmente de forma de tener una secuencia complementaria, salvo por un nucletido (que es el que interesa modificar) y que est ubicado en el centro del oligo. El ADN heterodplex (tiene una base mal apareada o missmatch) se incuba con una ADN polimerasa que usa el oligo como iniciador (primer) para completar la cadena complementaria. Transformo bacterias con el plsmido heterodplex y su replicacin dentro de la clula originar 2 molculas hijas: una normal y la otra mutante. Un ejemplo de mutagnesis usando clulas es el reemplazo allico que se produce en un experimento de knock out de un gen. 9) Dada una secuencia de inters: mediante qu estrategias se pueden generar mutaciones in vitro? D ejemplos de generacin de mutantes in vivo. A) Partiendo de la secuencia de inters clonada en un plsmido, se pueden hacer deleciones, inserciones o

reemplazos puntuales 1) mediante el uso de primers especficamente diseados que amplifiquen la secuencia con la modificacin deseada. Se trabaja con DNA simple cadena (por desnaturalizacin del plsmido, por obtencin de molculas de simple cadena si el plsmido es derivado de un fago), primers y DNA polimerasa. (Hacer esquemas ilustrativos). Las bacterias son transformadas con el plsmido heterodplex y su replicacin dentro de la clula originar 2 molculas hijas: una normal y la otra mutada. 2) Se pueden hacer deleciones por digestin y religado de la secuencia de inters. Se necesita disponer de sitios adecuados de enzimas de restriccin. B) Por amplificacin de la secuencia de inters por PCR en condiciones de alto error (concentraciones bajas de alguno de los ddnucletidos, reemplazo de Mg por Mn). Los fragmentos son clonados y se obtiene una library de mutaciones. Una secuencia de inters puede ser mutagenizada in vivo mediante la introduccin en clulas de construcciones adecuadas (algunas se describieron arriba). Una posibilidad es el reemplazo allico que resulta en una modificacin funcional (Ej. generacin de mutantes termosensibles) o en la anulacin de la funcin (Ej.: en un experimento de knock out de un gen). 10) Cul es la diferencia entre una transfeccin transitoria y una estable? En qu casos se utiliza la primera? R: En la transitoria (no se dice transiente) el ADN ingresa al ncleo y se expresa, pero no se integra al genoma. Despus de un tiempo se degrada o se pierde por dilucin a medida que no puede acompaar la replicacin del ADN cromosmico. Se usa para determinar ms rpidamente la especificidad y nivel relativo de expresin de un promotor, as como en muchos otros casos (reporteros en clulas animales, expresin de protenas de fusin por ej.). Obtener clones estables en cultivos celulares animales o vegetales es un proceso lento y engorroso. 11) Cules son los mtodos ms comunes para transfectar clulas animales? En qu casos o aplicaciones se utilizan la transfeccin de clulas animales cultivadas in vitro versus la de animales transgnicos? R: Coprecipitacin con fosfato de Ca (el ms antiguo, en desuso), microinyeccin (dem), electroporacin, liposomas usando lpidos catinicos e infeccin con vectores virales. Aplicaciones: industriales-farmacolgicas (algunas comunes otras distintas en ambos casos) = molecular farming. Mejoramiento (aunque no hay casos de esto ltimo a nivel comercial). 12) A qu se llama organismo "transgnico" u OGM u OVM? D ejemplos. Las definiciones son necesariamente artificiosas y arbitrarias porque no basta con decir que se trata de un organismo que contiene ADN procedente de otra especie o forneo. Todos los cultivos modernos tienen esta caracterstica debido a que fueron mejorados mediante cruzamientos interespecficos y hasta inter-

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genricos (el trigo, por ejemplo, fue cruzado con el centeno para incorporarle genes de resistencia a enfermedades fngicas) por lo que seran transgnicos. Por lo tanto, se denomina as a los organismos obtenidos por biotecnologa moderna, entendiendo por biotecnologa moderna a la ingeniera gentica y a la fusin celular entre clulas de especies que no se pueden cruzar entre s. OGM (organismos genticamente modificados) es nomenclatura del Codex-FAO, OVM (organismos vivos modificados) del Protocolo de Bioseguridad del Tratado de Cartagenadependiente del Convenio de Biodiversidad de PNUMA (Prog. Nac. Unidas Medio Ambiente). 13) Qu utilidad tiene el plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens? R: El plsmido Ti contiene lo que se conoce como regin T, que es la regin que la bacteria transfiere a la planta en el proceso de infeccin, y otra que contiene los genes vir que se requieren en trans para que la regin T pueda ser transferida. En los primeros ensayos de obtencin de plantas transgnicas, la regin T se modific, agregando los genes de inters y manteniendo los bordes derecho e izquierdo que son importantes para la transferencia. De esta forma se logr transferir un ADN de inters a plantas. En este momento se utilizan plsmidos Ti desarmados, es decir, que no contienen la regin T, en conjunto con plsmidos pequeos que contienen los bordes de la regin T, flanqueando los genes de inters. Este tipo de plsmidos se denomina binarios y permiten que la manipulacin sea mucho ms simple que con el plsmido Ti completo ya que este ltimo tiene aproximadamente 250 kpb contra las 10 kpb de los plsmidos binarios. 14) Qu tipo de plantas se suelen transformar con el plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens y cuales por mtodos biolsticos y por qu? R: Si bien es posible utlizar ambos mtodos con todo tipo de plantas, las dicotiledneas suelen ser transformadas con Ti mientras que las monocotiledneas lo son por el mtodo biolstico debido a que existen grandes diferencias en su eficiencia relativa. Esto es as porque estas ltimas no son huspedes naturales de Agrobacterium. 15) A qu se llama "vacuna recombinante"? Hay alguna en el mercado? R: Vacuna recombinante es aquella producida por mtodos de ADN recombinante. En general consiste en la produccin del gen codificante para un antgeno (protena recombinante) en un sistema viral heterlogo. El antgeno funciona como vacuna cuando logra despertar en el organismo una respuesta inmune que lo protege del ataque del patgeno que lleva ese antgeno. Un ejemplo muy utilizado es la vacuna contra la Hepatitis B,Vaccinia- rabia. Retrovirus felino para perros.... 16) Qu significa "terapia gnica"? R: Es una terapia que implica el uso de vectores para lograr introducir ADN conteniendo un gen funcional en clulas de un paciente con el propsito de revertir

los sntomas de una enfermedad, generalmente producida por un gen defectuoso. 17) Cules son los riesgos para el ambiente y para la salud humana que pueden traer estas tecnologas? R: Las inquietudes, algunas genuinas, otras no tanto, pueden agruparse en 3 categoras: a) Potenciales efectos sobre la salud humana y animal (toxicidad, alergenicidad, transferencia horizontal de resistencia a antibiticos, ingestin de ADN forneo que modificara nuestra constitucin gentica, utilizacin de secuencias de ADN de origen viral) b) Potenciales consecuencias ambientales (dao a especies ajenas al proceso, como la mariposa Monarca; la aparicin de insectos resistentes; que el cultivo se convierta en una supermaleza; que haya flujo de genes desde cultivos a malezas; que las protenas transgnicas se difundan en el ambiente; que disminuya la biodiversidad y otros semejantes). c) Preocupaciones de tipo poltico, econmico o social: concentracin de beneficios monoplicos en empresas, particularmente multinacionales; limitacin de acceso a la biodiversidad gentica por un patentamiento concebido como apropiacin comercial no tica; avasallamiento del derecho de agricultores; acrecentamiento de brechas sociales y productivas entre productores pequeos y grandes; crecimiento de una agricultura industrial poco sustentable, en detrimento de prcticas que lo sean; dificultades de la coexistencia con la agricultura orgnica. Un riesgo que se debe considerar como de ocurrencia probable, es que el uso generalizado de plantas resistentes a plagas y herbicidas seleccione la aparicin de insectos y malezas capaces de superar dicha resistencia (ver problema de gentica de poblaciones en el anexo). La experiencia acumulada en 20 aos de comercializacin masiva del primer producto derivado de un OGM, la insulina humana, y en 10 aos de cultivos, no parece indicar que la mayora de estas inquietudes se puedan fundar genricamente en la tecnologa. Es decir, un OGM no conlleva riesgo por ser tal, si bien podra tenerlo por el transgn especfico que lleve incorporado. Debido a ello, los organismos nacionales e internacionales de anlisis y regulacin estudian caso por caso el producto final. Por ejemplo, los riesgos de soja con resistencia a herbicidas son distintos que los de maz con el mismo gen incorporado por ingeniera gentica (o transgn), o a los de soja con otro transgn. Es ms, los sistemas regulatorios suponen razonablemente que una soja resistente a un herbicida como resultado de acciones de ingeniera gentica tiene idnticos riesgos ambientales que una obtenida por mtodos convencionales. Los riesgos alimentarios se evalan de acuerdo con procedimientos bien establecidos y aceptados internacionalmente. Adems de analizar su toxicidad y su degradacin en jugos gstricos sintticos, se realizan pruebas de equivalencia entre alimentos derivados del cultivo convencional y otros preparados con el OGM.

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Si bien el riesgo de que los transgenes se incorporen por cruzamiento a otras plantas de la misma especie o de especies relacionadas demostr ser real, los perjuicios, segn se encontr, fueron ms comerciales que ambientales. En todo caso, la incidencia real de estos riesgos est muy lejos de obligar a la consideracin de un abandono de los cultivos OGMs. Por otro lado, se comprob que, a pesar de la demora en la liberacin de desarrollos realizados por instituciones pblicas de OGMs con caracteres que favorecen a los productores ms pequeos, stos tambin se beneficiaron notblemente al cultivar los OGMs de primera generacin. 18) Qu pas en Asilomar en la dcada del 70? Qu conoce del tema de la bioseguridad del manejo de OGMs en Argentina y en el mundo? Lo de Asilomar est en el Recombinant DNA de Watson: Poco despus de que se descubrieran las enzimas de restriccin y se produjeran las primeras molculas recombinantes, cuando an no exista Greenpeace, los propios cientficos plantearon inquietudes de bioseguridad del tipo: qu pasara si una E. coli (habitante habitual del intestino humano) recombinante con un oncogn se escapa al ambiente e infecta la humanidad? A partir de ese momento se disearon laboratorios con distintos niveles de seguridad: desde P1 (muy bajo) para trabajar con plantas (no se las consideraba peligrosas) hasta P4 (parecido a la pelcula epidemia, igual nivel de seguridad que para trabajar con bola). Posteriormente se demostr que la excesiva cautela no fue justificada y los niveles de seguridad se restringieron al nivel del problema estudiado, ms que a la metodologa. Es ms, hoy se considera ms seguro trabajar con secuencias clonadas de patgenos (como el HIV) que trabajar con el patgeno mismo. La Secretara de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos public en su sitio de internet un documento donde responde a las preguntas que frecuentemente se hace la gente sobre los transgnicos: http://www. sagpya.mecon.gov.ar/ ir a Biotecnologa donde se puede obtener ms informacin sobre el sistema regulatorio en Argentina.

Problemas:

1) Se desea clonar el gen que codifica a una entomotoxina proteica con propiedades insecticidas que se encuentra en Bacillus thuringiensis (bacteria del suelo originalmente aislada de insectos muertos), pensando en producir soja transgnica resistente a lepidpte- Cla I pTEros. Para cumplir con la primera etapa del objetivo ORF ampR TORF Cla I planeado, se cort el DNA total de B.t. con MboI en Cla I cantidad limitante (tubo 1). Por otra parte, el plsmido R pAMP 6 kpb Bluescript (parecido al pUC19) fue incubado con 5 kpb BamHI (tubo 2, ver tabla de sitios de reconocimiento en la gua 1 y comparar BamHI y MboI). Despus se mezclaron los contenidos de los tubos 1 y 2 en pre- El plsmido recombinante pTETORFAMP se obtuvo sencia de ligasa, incubndose durante la noche a 16 C por transformacin en una cepa de E. coli recA (in(tubo 3). Luego se transformaron clulas competentes capaz de hacer recombinacin homloga). Las bacte(permeabilizadas con CaCl2) de una cepa de E. coli rias transformadas con la ligacin se crecieron a que era RecA-, AmpS, lac- en presencia de ampicilina, 30C. Posteriormente, el plsmido obtenido fue introIPTG y X-gal (X-gal es un sustrato cromognico de la ducido por transformacin en una cepa de E. coli sal-

-galactosidasa que da un producto azul). Como la relacin entre colonias blancas y azules result apropiada, se decidi continuar haciendo rplicas de las colonias en filtros de nitrocelulosa. Finalmente, los filtros se revelaron con un anticuerpo antientomotoxina, mediante el mtodo del segundo anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina. Diga si es verdadero o falso y fundamente el razonamiento: a) Los extremos generados por BamHI no pueden ligarse a extremos generados por MboI. b) Se utiliz BamHI porque la enzima universalmente reconoce los codones de iniciacin de todos los genes permitiendo su correcta insercin en el vector utilizado con respecto a su posicin respecto del promotor lac. b) La ampicilina sirvi para seleccionar bacterias transformadas. c) La ampicilina sirvi para seleccionar bacterias transformadas con algn plsmido recombinante (es decir plsmido con inserto). d) Las colonias que llevaban algn plsmido recombinante (es decir con inserto) son azules. e) Dado que la maquinaria transcripcional de E. coli es similar a la de B.t. fue posible encontrar algunos clones positivos que contenan el gen de la entomotoxina completo (incluyendo su promotor) orientado en cualquiera de las dos sentidos respecto al vector. 2) Utilizando como sonda un cDNA de la subunidad mayor del receptor de GABA (un neurotrans-misor) y empleando condiciones de baja rigurosidad, se aisl a partir de una genoteca de E. coli un fragmento de DNA (llamado ORF ms adelante) conteniendo un marco de lectura abierto con cierta similitud de secuencia con la sonda usada. Con el objeto de identificar la funcin de este gen (la cual seguramente no es recibir neurotransmisores) se utiliz la siguiente estrategia: El plsmido pAMPR (ver Fig.) fue digerido con la enzima de restriccin Cla I y el fragmento de 1,6 kpb conteniendo el gen de la -lactamasa (enzima que hidroliza a la ampicilina y confiere resistencia a este antibitico) fue purificado e introducido en el sitio Cla I de pTETORF (ver Figura) Este plsmido contiene el fragmento clonado (ORF) y un gen (tet r) que confiere resistencia al antibitico tetraciclina. La replicacin de pTETORF es termosensible, funciona a 30C y se inhibe a 42C.

vaje (recA+). Las bacterias fueron cultivadas a 42C durante 15 horas en presencia de ampicilina y luego una alcuota fue sembrada en gar conteniendo medio rico y ampicilina. Se hizo un plaqueo en rplica hacia una placa conteniendo el mismo medio ms tetraciclina. Las colonias resistentes a ampicilina y sensibles a tetraciclina fueron utilizadas en los ensayos siguientes. A-Cul es el objetivo del protocolo? Por qu fueron elegidas las bacterias ampR tetS? Hubiera bastado con determinar la resistencia a ampicilina?Por qu? B-Qu hubiera pasado si las bacterias hubieran sido cultivadas a 30C? C-Qu ensayos hara para confirmar que las mutantes aisladas tienen el genotipo esperado? Una vez confirmada la mutacin, obtenemos como primera conclusin que sta no parece afectar la capacidad de la bacteria para crecer en medio rico. (D- De dnde saca esa conclusin?). El experimento siguiente fue plaquear las bacterias mutantes en medio mnimo. No se encontraron diferencias respecto de las salvajes en nmero ni en morfologa de colonias. Luego de tanto tiempo de trabajo infructuoso y, con tal de tener un resultado, los investigadores decidieron mapear por conjugacin el locus ORF aprovechando las caractersticas de la mutacin introducida. E-Que caracterstica de las mutantes facilita el mapeo del locus ORF? Podra hacerlo si no la tuvieran? Muchos aos despus, un joven e inquieto estudiante de biologa, buscando tema para su tesis de Licenciatura, rescat de una congeladora esta vieja mutante y se propuso caracterizarla. Su razonamiento fue: si este gen no es esencial en condiciones de crecimiento normales, quizs sea necesario en condiciones de estrs (calor, fro, hiperosmoticidad, hipoosmoticidad). Haciendo curvas de crecimiento en medio lquido en estas condiciones, encontr que la cepa mutante mostraba una marcada deficiencia (comparando con la salvaje) para crecer a temperaturas mayores a 45C. Al mostrarle este resultado a su ya decrpito director ste lo desanim dicindole que seguramente tanto tiempo en la heladera haba introducido nuevas mutaciones en la cepa. Aunque extraado el estudiante enseguida pens y realiz un experimento que despej toda duda sobre la causa gentica de la deficiencia de la cepa congelada. F- Cul fue el experimento realizado? 3) Disee una estrategia detallada para expresar anticuerpos monoclonales contra el virus de la diarrea infantil (un rotavirus) en leche vacuna, usando las tcnicas de uso comn en ratones transgnicos. Para ello dispone de la lnea celular necesaria (hibridoma) produciendo dichos anticuerpos, todo tipo de variantes de bacterias y vectores utilizados en ingeniera gentica. 4) El tema de las patentes de secuencias nucleotdicas es polmico, particularmente en el caso de las secuencias humanas. Para analizar el tema se analiza el caso de la patente No. 4943674 de Calgene en Estados

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Unidos que protege a secuencias nucleotdicas de unin de factores transcripcionales especficos de fruto. La patente protege todo uso de estas secuencias en cuanto a su uso en la obtencin de plantas transgnicas que provoquen CUALQUIER tipo de cambio fenotpico en el fruto de CUALQUIER planta (desde vid, sanda, citrus, peras, cerezas, ciruelas, etc. hasta tomate, pepinos y zapallos). Para sustentar el reclamo, la empresa provee una serie de datos experimentales. A partir de una clonoteca (coleccin de clones) de cDNA diferencial se clon y caracteriz la secuencia codificante para la poligalactouronasa (PGU). Esta enzima se sintetiza en los tomates maduros y ataca la pared celular produciendo el ablandamiento del fruto, proceso no deseado comercialmente. La concentracin del mRNA para PGU aumenta ms de 2000 veces cuando se compara la concentracin en tomates rojos (maduros) con la de tomates verdes (inmaduros) por lo que hipotetizan que la regulacin del gen es fundamentalmente a nivel transcripcional. Posteriormente, clonaron y secuenciaron el gen completo de la PGU (incluyendo su promotor) e hicieron una construccin en la cual invirtieron la orientacin de la secuencia codificante la cual introdujeron en plantas de tomate (transgnicas para la misma). Como consecuencia, se transcribe un RNA complementario al mRNA para PGU que al formar una doble cadena con el mRNA bloquea su traduccin (esta forma de inactivacin de la expresin de genes se denomina estrategia RNA antisentido). De esta forma se obtuvo el tomate FlavSav (con mucho aroma y sabor) que constituy la primera planta transgnica liberada, comercializada y consumida a nivel mundial (1988). I) Describa cmo obtuvieron la clonoteca diferencial. II) Describa cmo clonaron el gen PGU completo. III) Describa cmo hara para demostrar en forma ms precisa, usando secuencias indicadoras (reporteras), el control transcripcional ejercida por este promotor. No olvide detallar construcciones, vectores, mtodos de transformacin, evaluacin de la expresin, etc. IV) La descripcin de la patente viene acompaada por la secuencia nucleotdica completa del promotor del gen de la PGU. Sin embargo la empresa se preocupa particularmente en proteger no slo la secuencia completa sino tambin cualquier fragmento parcial de la misma por qu? V) La secuenciacin del gen incluy al terminador del gen. Sin embargo, a diferencia del promotor, la empresa no solicita su proteccin mediante esta patente por qu? VI) Si Ud. fuera funcionario de la oficina de patentes y le toca evaluar esta presentacin particularmente en cuanto a la amplitud de la proteccin solicitada (derechos extensivos a todas las plantas, por ej.) qu experimentos adicionales solicitara para sustentarla? 5) En la pelcula de los expedientes secretos X, se plantean una serie de situaciones cuya verosimilitud sera interesante constatar. Al principio de la pelcula (30.000 aos AC) un virus extraterrestre infecta a un

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humano primitivo. Posteriormente, ya en el presente, los "malos" de la pelcula tratan de multiplicar este virus para su transmisin de varias formas (en una escena la agente Scollie se infecta al ser picada por una abeja transmisora del virus). En otra parte de la pelcula se comenta que el virus est siendo producido (biotecnolgicamente) en unos maces "transgenticos". Imagine que resulta contratado por una activa organizacin ecologista tratando de demostrar el peligroso uso de estas plantas transgenticas como arma biolgica de produccin de virus activos, cmo hara para demostrar que tales plantas pueden realmente ser producidas? Dispone para ello de viriones aislados de un picornavirus (virus de RNA+ a los que pertenecen, por ej. el virus de la poliomelitis, el de la fiebre aftosa. y que se caracterizan porque a partir de su genoma se traduce una nica protena autoclivable postraduccionalmente -poliprotena-) y todos los recursos posibles a su alcance. I) Detalle cada uno de los pasos del clonado de secuencias necesarias y de las construcciones genticas que realizara para su posterior introduccin en maz por ingeniera gentica. II) Indique por qu va introducira esta construccin en maz y justifique brevemente. III) Cmo seleccionaria las plantas transformadas? IV) Qu herramientas moleculares y biolgicas utilizara para confirmar que el virus se produce en esas plantas? 6) La hormona del crecimiento (HC) es una protena que se sintetiza y se secreta en la glndula pituitaria. La expresin de este gen depende de un factor de transcripcin especfico llamado Pit-1, el cual reconoce la secuencia de ADN (T/A)NCTNCAT. Adems de Pit-1, existen otros elementos regulatorios que juegan un papel importante en la expresin de este gen como CRE, GRE y TRE, cuyas secuencias de reconocimiento son conocidas. La zona promotora del gen HC de pollos (HCp), no ha sido tan bien estudiada como la de mamferos. Se describieron slo 500 pb de la regin promotora del gen HCp, lo cual no permita realizar un anlisis profundo de la regulacin de la transcripcin en esta especie. Ip, S et al. (Exp.Biol.Med 229: 640-649, 2004) decidieron entonces estudiar ms extensamente esta zona regulatoria, y lograron identificar un fragmento de 1,8 kbp de la regin promotora de HCp. a) Describa cmo le parece que hicieron los autores para clonar el gen completo de HCp (zona reguladora de 1,8 kpb + region codificante). Qu sonda/s habrn utilizado? b) Cmo se le ocurre que los autores determinaron los posibles sitios de unin de Pit-1 y de otros elementos regulatorios? Los resultados revelaron dos sitios de reconocimiento de Pit-1 en el fragmento de 1,8 kpb. : uno proximal 113/-104 pb y el otro distal 541/-533 pb, y un posible motivo TRE (CAATGAGGTA) a 137/128. Para ca-

racterizar funcionalmente la zona 5 del gen HCp, se realizaron ensayos de transfeccin in vitro usando como gen reportero al gen de la luciferasa. c) Qu consideraciones cree Ud. que se deberan tener para elegir un gen reportero? d) Que construcciones genticas los autores podran haber utilizado para el ensayo de transfeccin? e) Qu clulas pudieron haber utilizado para el ensayo de actividad promotora por transfeccin? Qu control/es considera Ud. que los autores deberan haber realizado? Con los ensayos de luciferasa concluyeron que la zona entre 187/+48 pb es la secuencia mnima para tener la mayor actividad promotora. Luego, para determinar si los sitios proximales y distales de unin de Pit-1 eran ambos funcionales, midieron actividad de luciferasa en el fragmento de 1,8 kbp al cual le haban introducido, previamente, mutaciones en la zona distal, proximal o ambas. Los resultados se muestran en la siguiente figura. -1727pb -541pb -113pb + 48pb
LUCIF.

% Act. Prom relativa a 1 100

Pit-1
LUCIF.

80

LUCIF.

100 80

LUCIF.

motivo ADN salvaje motivo de ADN mutado Secuencia codificante del gen de la enzima luciferasa. f) Cmo interpreta Ud. estos resultados? Finalmente compararon las zonas regulatorias del gen HC de pavo (HCv) con las de HCp. Encontraron que dichas zonas en ambas aves tienen un 90% de identidad de secuencia. Sin embargo, informaron que existe poca similitud entre estas zonas del gen HCp y las zonas regulatorias de HCm (mamferos como rata y humanos). g) Qu le sugieren estos resultados?
LUCIF.

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12.- GENTICA CUANTITATIVA

Gua de estudio:
1) Qu caractersticas particulares permiten diferenciar los caracteres de herencia cuantitativa y aquellos de herencia cualitativa?

Caracteres Cuantitativos Caracteres Cualitativos

U U

Diferencias de grado

Diferencias de clase

Variacin continua: Variacin discontinua: Clases fenotpicas que forman Clases fenotpicas discretas un espectro mtrico continuo Muchos genes involucrados Pocos genes en determinacin del carcter Efectos individuales de los Efectos individuales de los genes no discernibles, por ser genes discernibles pequeos y afectados por el ambiente El anlisis gentico se realiza El anlisis gentico se realiza mediante estimaciones es- por conteo y proporciones tadsticas de los parmetros de la poblacin, como media y varianza

2) Qu es la heredabilidad de un carcter? Se refiere a la proporcin de la variabilidad fenotpica total de un carcter que es genticamente heredable en una poblacin (h2 = VA/VP, VA = varianza gentica aditiva, Vp = varianza fenotpica; en otras palabras h2 es la proporcin de la varianza fenotpica que se debe a la varianza gentica aditiva). 3) Una heredabilidad de 0,4, significa que para un determinado carcter, un individuo presenta el 40% de su fenotipo determinado genticamente, y un 60% determinado por el medio ambiente? R: No!!!!, es un parmetro poblacional, por lo tanto significa que en una poblacin, slo el 40% de la variabilidad fenotpica total observada para ese carcter est determinada genticamente. 4) Por qu es importante conocer el valor de este parmetro en el marco de programas de mejoramiento? R: Porque permite que el mejorador tenga un indicio de cual es la respuesta potencial a la seleccin que se est aplicando sobre el carcter. De esta manera se disean los cruzamientos adecuados para obtener la mejor respuesta (mejora del carcter) evitando la depresin endogmica y la disminucin drstica del tamao poblacional.

5) a) Por qu el mejoramiento de los toros es ms rpido que el de las vacas? Por qu es ms fcil mejorar cerdos que ovinos o bovinos?Por qu en teora la consanguinidad no favorece un incremento en la frecuencia de alelos recesivos en una poblacin sino que solamente afectara la distribucin de alelos entre genotipos?, b) Cul es la razn por la que no se obtienen lneas puras en animales?Qu son las "razas" en trminos de mejoramiento animal?, c) Por qu la seleccin individual se llama fenotpica y la familiar genotpica? R: El mejoramiento en toros es conveniente pues producen mayor descendencia que las vacas. Los machos son siempre ms convenientes pues se pueden evaluar ms descendientes sin alargar el intervalo generacional (edad media de los padres cuando nacen los hijos). Adems se pueden seleccionar pocos animales con el caracter deseado sin afectar el tamao poblacional del rodeo. - Es ms fcil mejorar cerdos, por ser multparos. - Consanguinidad: p y q no se modifican. El apareamiento entre parientes no afecta las frecuencias gnicas conjuntas, sino que aumenta la frecuencia de homocigotas. La consanguinidad har que alelos recesivos raros se presenten en homocigosis con una mayor frecuencia que si existiese apareamiento aleatorio. - Lneas puras en animales no existen pues no hay autofecunfacin. Las razas en trminos de mejoramiento son poblaciones altamente endocriadas. - En la seleccin individual se elige al individuo progenitor para realizar mejoramiento por su FENOTIPO. La seleccin familiar es GENOTPICA pues se elige por el pedigree del individuo, por ejemplo, el carcter produccin de leche en toros se elige por su ta, madre o abuela. 5) A qu se denominan QTL? R: El trmino se aplica a los loci que afectan caracteres cuantitativos. Es decir que se refiere a la ubicacin de genes que afectan caracteres que pueden ser medidos en una escala lineal o cuantitativa. El mapeo de QTL es una tcnica de mapeo por recombinacin y requiere de: 1) uso de grupos de individuos que difieran marcadamente en el carcter que se quiere mapear; 2) identificacin de aquellos marcadores moleculares polimrficos que difieran entre ambas lneas; 3) anlisis de la F2 segregante entre ambos grupos (o de la retrocruza o de RIL!!!!), tanto en cuanto a los marcadores moleculares como en cuanto a los valores para el carcter cuantitativo en estudio, 4) anlisis estadstico de los datos (ANOVA simple o de regresin como primer paso crudo - el anlisis real requiere mapeo del intervalo compuesto con estadstica de mxima probabilidad para estimar valores LOD a lo largo del cromosoma). 6) Qu son las lneas recombinantes endocriadas o RILs (recombinant imbred lines)?y las lneas haploides duplicadas? R: Las RIL son lneas endocriadas con 9 o ms generaciones (14 en Drosophila) de autofecundacin o endocra (cruzamiento entre hermanos) y son, por lo tanto, prcticamente homocigotas. Sue-

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len ser derivadas de un cruzamiento entre dos parentales altamente divergentes (contrastantes) para uno o ms rasgos cualitativos o cuantitativos representando diferentes combinaciones aleatorias de alelos que estaban fijados en las lneas parentales. Se parte de una F2 (o retrocruza de F1 por un parental). Es una alternativa al cruzamiento prueba dado que todos los segregantes sern homocigotas dominantes o recesivos. Otra ventaja es que la autofecundacin (o endocra) de las lneas mantiene el genotipo (no hay segregaciones), lo que permite su mantenimiento (inmortalizacin) y distribucin entre distintos grupos que compatibilizan mapas genticos. Los haploides duplicados tienen las mismas caractersticas, pero se obtienen por un mecanismo distinto. En muchas plantas es posible cultivar anteras (gametas) in vitro de forma de generar plantas haploides. Partiendo de una F1 se obtienen, entonces, gametas haploides que generan plantas que combinan genes de distintos loci de las dos lneas paternas. Cuando se las trata con colchicina, se pueden duplicar los cromosomas dando individuos diploides que son homocigotas porque los cromosomas homlogos representan copias idnticas del mismo cromosoma del haploide original.

Problemas: 1) Suponga que dos pares de genes con dos alelos cada uno Aa y Bb, determinan en una poblacin la altura de las plantas en forma aditiva. El homocigota aabb tiene una altura de 30 cm y el AABB, 50 cm. a) Cul es la altura de la F1 de un cruzamiento entre estas dos cepas homocigotas? b) Despus de un cruzamiento F1xF1, qu genotipos de la F2 presentarn una altura de 40 cm? c) Cul ser la frecuencia de estas plantas en la F2? d) Si se seleccionaran los individuos de 45 cm o ms de altura para obtener la siguiente generacin, cul sera la altura media de sta? 2) Se cruzaron dos razas diferentes de maz, cada una con una altura media de 1,72 m y se obtuvo una F1 con una altura media tambin de 1,72 m. En la F2 haba una considerable variacin que iba de 0,91 m a 2,5 m. De las 1942 plantas consideradas, 8 alcanzaban una altura de 2,5 m y 7 una de 0,91 m. La altura del maz, sera para Ud. un carcter cualitativo o cuantitativo? Por qu? Cuntas parejas de genes estn implicadas en la determinacin del carcter segregaron en la F2? Explique estos resultados en trminos gnicos asumiendo que el ambiente fue mantenido constante en todos los casos. 3) Johannsen midi el peso de las semillas de porotos de la variedad Princesa. Los porotos son autgamos (autofertilizados) y por lo tanto esta variedad es una lnea pura. Los pesos en centigramos de una muestra pequea pero representativa se enumeran a continuacin: 19 31 18 24 27 28 25 30 29 22 29 26 23 20 24 21 25 29 a) Calcule el peso promedio y la desviacin estndar de las alubias en esta muestra. b) Calcule la varianza ambiental.

c) Calcule la heredabilidad del peso de las alubias en esta variedad. d) Si el peso promedio de las alubias seleccionadas para ser progenitores es 30 cg, prediga el peso promedio de las alubias de la siguiente generacin. 4) Al medir el contenido en protenas por mg de materia seca de las plantas de una poblacin se obtuvieron los siguientes resultados: Protenas (unidades arbitrarias): 3 4 5 6 7 8 9 10 11 N de individuos 1 3 6 10 18 13 6 2 1 Al seleccionar como progenitores para formar la generacin siguiente los individuos con contenido proteico superior a 7 unidades se obtuvieron los siguientes resultados: Protenas (unidades arbitrarias): 3 4 5 6 7 8 9 10 11 N de individuos 0 3 4 10 18 9 6 2 0 A la vista de estos resultados, se desea saber: a) El valor de la heredabilidad del carcter "contenido de protena" b) De acuerdo con dicho valor de la heredabilidad, qu consecuencia se puede sacar respecto al componente gentico del carcter analizado? c) Podra darse esta interaccin en una algama? 5) Si 3 genes que segregan independientemente, con dos alelos cada uno, determinan la altura de una determinada planta, por ej.: Aa, Bb y Cc, de modo que la presencia del alelo representado por la mayscula aada 2 cm a la altura base (que es de 2 cm). a) Indique la altura que esperara en la F 1 de un cruzamiento entre las cepas homocigotas AABBCC (14 cm) X aabbcc (2 cm). b) Indique la distribucin de las alturas (fenotipos y frecuencias) que se espera en un cruzamiento F1 X F1. c) Qu proporcin de esta F2 tendra la misma altura que las cepas paternas? d) Si los alelos representados por maysculas actuasen como dominantes, por ej.: A_B_C = 8 cm, cules seran las respuestas a los epgrafes a), b) y c)? e) Si los alelos representados por maysculas actuasen multiplicando la altura existente, por ej.: Aabbcc= 4 cm, AAbbcc= 8 cm, AABbcc= 16 cm, etc., cules seran las respuestas a los puntos a), b) y c)? 6) Tiempo atrs sali en los diarios el descubrimiento del gen del temor (o cobarda) en ratas de laboratorio basado en diferencias observadas en el patrn de comportamiento de ratas frente a la aplicacin de shocks elctricos poco despus de hacer sonar un sonido peculiar en un lugar de sus laberintos. Las ratas temerosas desarrollaron un reflejo condicionado de cobarda por el que huan rpidamente al escuchar el sonido o cuando eran colocadas en ese lugar del laberinto, sin necesidad de aplicar el shock elctrico. El grado de cobarda se estableci cronometrando el tiempo que tardaban las ratas en huir despus de emitirse el sonido caracterstico y al ser colocadas en el lugar prefijado. Se analiz la influencia del cromoso-

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ma 1 en este comportamiento mediante cruzamientos controlados. Se estudiaron distintas RILs para dicho cromosoma obtenidas a partir de un cruzamiento entre lneas temerosas y valientes. a) Haga un esquema de los cruzamientos con los que se obtuvieron las RILs ejemplificando con el caso de este problema.
Valor proEsquema 1 Sondas RFLP Xabg XKna XCent Xpsr medio y 601 1 1 121 desvo Padre valiente 10 2,8 Padre temeroso 0,9 0,3 Clase 1 1 0,5 Clase 2 9 2,5 Clase 3 10 2,6 Clase 4 9,5 2,4 Clase 5 0,8 0,4 Clase 6 1 0,6 Clase 7 8,5 2,3 Clase 8 0,9 0,6 Clase 9 1,3 0,7

ra llegar a las mismas conclusiones? e) Reflejan los datos la ocurrencia de segregacin transgresiva? Por qu? f) En el esquema siguiente se representa uno de los RFLPs obtenidos para los padres temeroso y valiente, respectivamente, utilizando la sonda Xabg601 y la enzima Eco RI. Complete el patrn obtenido para cada una de las clases recombinantes endocriadas.
Padres T V 1 2 Clases Recombinantes 3 4 5 6 7 8 9

En el esquema 1 se representa una regin del cromosoma 1 en las distintas familias recombinantes (negro perteneciente al padre temeroso, blanco perteneciente al padre valiente). De cada clase recombinante esquematizada se obtuvieron al menos 50 ratas que fueron ensayadas biolgicamente mediante un diseo estadstico apropiado. Para cada clase recombinante se obtuvo un promedio y un desvo estndar. Indique cmo se hizo para ordenar los distintos marcadores en el cromosoma 1 b) Porqu se utilizaron 50 ratas de cada una de las lneas recombinantes y no solamente una? c) Qu conclusiones puede sacar acerca de la localizacin gentica del temor? Est este QTL ubicado en el cromosoma 1? Podra Ud localizar ms de un QTLs en el esquema 1? Supone que puede estar ubicada en otras partes del genoma? Por qu? d) Podra haber utilizado otro mtodo alternativo pa-

6) El enanismo es un carcter muy buscado en trigo porque est asociado a una menor susceptibilidad al vuelco y a un mayor rendimiento. Para estudiar este carcter se construyeron lneas de sustitucin cromosmica entre las variedades Mara y CappelleDesprez. Es decir, se obtuvieron distintas lneas de la variedad Cappelle-Desprez las cuales tienen alguno de sus cromosomas reemplazados por los de la variedad Mara. Mara es como 12 cm ms baja que C-D (cuyo promedio de altura es de 103 cm de alto, ver ordenadas del grfico). Observando el grfico adjunto: a) Qu clase de carcter es la altura? b) Qu podra decir acerca de la cantidad y de la localizacin de los genes de altura de Mara? c) Puede existir algn otro gen relacionado con altura que no est siendo detectado por este anlisis? d) Podra sospechar algn efecto episttico para el carcter altura a partir de este anlisis? e) Considera que a partir del cruzamiento se podran obtener lneas ms bajas (o ms altas) que estas variedades parentales (por segregacin transgresiva)? f) Servira este mtodo de utilizacin de lneas de sustitucin para asignar una localizacin cromosmica a marcadores moleculares?

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13. GENTICA BACTERIANA

Bibliografia Microbial Genetics, D. Freifelder, Jones and Bartlett Publishers, Inc. Modern Microbial Genetics. Streps UN y Yasbin RE (1991) J Wiley Sons. ral de gar, un polmero extrado de algas, de consistencia similar a una gelatina. El crecimiento bacteriano ocurre sobre la superficie del gar, de forma que los microorganismos no pueden moverse libremente y forman colonias aisladas. Los componentes solubles del medio difunden lentamente, por lo que disminuye considerablemente la competencia entre los microorganismos que comparten el medio de cultivo. El medio slido se suele realizar en cajas de Petri (de varios tamaos y formas), o en frascos chatos (de Roux, utilizados para clulas tipo fibroblastos). Cada microorganismo origina una colonia, que en muchos casos, por sus caractersticas, permite la identificacin del microorganismo que la gener. Los medios de enriquecimiento permiten aumentar la proporcin de un microorganismo determinado en una poblacin heterognea. Para ello debe haber competencia entre las distintas cepas microbianas, de forma tal que aumente la proporcin de aquellas para las cuales el medio de cultivo es adecuado. Es por ello que los medios de enriquecimiento son lquidos, de forma de facilitar la difusin de nutrientes y/o de inhibidores que se utilicen. El medio slido sirve para aislar colonias (clones) individuales (purificar). El medio lquido sirve para obtener masa (gran cantidad) de clulas, por ejemplo, para obtener plsmidos en forma preparativa. 4) Qu diferencia un medio selectivo de medio diferencial. R: Un medio selectivo es aqul donde slo crecern determinadas cepas o especies. Es un caso extremo de medio de enriquecimiento, pero dado que la competencia entre microorganismos no es necesaria, se utilizan medios slidos. Un ejemplo de medio selectivo es el que utiliza un antibitico que slo permite el crecimiento de las cepas resistentes. Un medio diferencial es aquel que permite diferenciar al menos una de las distintas cepas/especies de una muestra. Los medios diferenciales son slidos, para permitir el crecimiento aislado de las distintas colonias, de forma tal que puedan distinguirse. El medio diferencial no impide el crecimiento, simplemente permite diferenciar. (ej. bacterias lac+ vs lac- en presencia de X-gal). 5) Diferencie entre un medio completo y uno definido Para qu los utilizara? R: Medio completo es el que contiene todos los nutrientes incluyendo fuentes de carbono y nitrgeno necesarias para el crecimiento pero no estn bien definidos en su composicin que puede variar levemente de partida a partida. Por ej. la triptona del medio LB es un hidrolizado de casena con tripsina, el extracto de levadura es un extracto soluble de levaduras hidrolizadas. El medio definido, en cambio, contiene componentes y concentraciones de aminocidos individuales y vitaminas (por ejemplo biotina para E. coli) perfectamente establecidos y constantes. 6) Qu es la tcnica de plaqueo en rplica (replica plating)? Para qu sirve?

Gua de Estudio:
1) Cmo es la estructura de una clula bacteriana? Como est organizado su genoma? R: La clula bacteriana (gram-) contiene dos membranas externas que encierran el espacio periplsmico y una pared celular, generalmente de pptidoglucano, que le otorga rigidez y protege de los shocks osmticos. La membrana interna encierra al citoplama, separndolo del periplasma. En el citoplasma encontramos toda la maquinaria necesaria para la sntesis de cidos nucleicos y protenas. La membrana interna es compuesta por una bicapa lipdica mayormente de fosfolpidos, mientras que la externa contiene una hemimembrana interna similar y una capa externa de lipopolisacrico. Las bacterias gram+ no tienen membrana externa y la pared de peptidoglicano es ms gruesa que la de las gram-. Si bien no existe un ncleo, como en las clulas eucariotas, el ADN se encuentra organizado en el nucleoide, que es una masa de ADN y protenas (80% ADN), que puede ser observado por microscopa. El nucleoide contiene dominios cuyo grado de superenrrollamiento no es afectado por los dominios vecinos. Este grado de independencia sugiere que los dominos estn asociados a una matriz que impide que se transfieran las tensiones entre ellos. El cromosoma bacteriano no est tan empaquetado como el de los eucariotas, pero se encuentra asociado a una serie de protenas que cumplen funciones anlogas a las de las histonas, como ser HU, HN-S, Fis e IHF. En la mayora de los casos conocidos, las bacterias poseen un nico cromosoma circular que se replica en forma bidireccional. Pueden contener plsmidos grandes (el factor F o el plsmido Ti, por ejemplo, pueden llegar a tener 200 kpb y pueden servir como vectores para ingeniera gentica: BAC). 2) Cmo se multiplican las bacterias? R: Se reproducen asexualmente por divisin binaria (aunque no es la nica forma). Es asexual y en los libros viejos se la llama fisin). Incluso las bacterias que esporulan (Bacillus y Clostridium) lo hacen asexualmente y son un ejemplo del fenmeno de diferenciacin celular. 3) Qu es un cultivo lquido? Y uno slido? Para qu se utiliza cada uno? R: Medio de cultivo lquido: es un medio que no tiene soporte slido, donde los microorganismos crecen en suspensin y los nutrientes difunden libremente, por lo que existe competencia por ellos entre los microorganismos. El medio lquido se puede realizar en tubos de ensayo (pocos ml), Erlenmeyers (decenas o cientos de ml) o en fermentadores de varias escalas. Medio de cultivo slido: difiere del lquido en el agregado de una matriz inerte que sirve de sostn para el crecimiento bacteriano. Esta matriz es por lo gene-

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R: Cuando obtenemos sobre la superficie del agar de una caja de petri un nmero de colonias, cada una de las cuales proviene de un solo microorganismo y debemos analizar su comportamiento en distintos medios de cultivo, existe la posibilidad de replicar dicha placa de petri. Esto implica obtener otra placa con la misma distribucin de colonias, cada una de las cuales debe ser genticamente idntica a la de la placa madre. Para ello se usa un trozo de terciopelo estril, que cubre un lado de un cilindro del dimetro de la caja de petri. El cilindro se coloca suavemente sobre la caja de petri a replicar, contactando el terciopelo con las colonias. Algunos microorganismos de cada colonia quedarn adheridos al terciopelo, y este se usa a la manera de un sello en una caja de petri vaca. En esta ltima, crecern colonias idnticas a las originales, en la misma posicin. Podramos evaluar, por ejemplo cuales son resistentes a un antibitico determinado, con lo que bastara con preparar una placa con dicho antibitico y hacer la rplica a dos placas, una con y otra sin antibitico. 6) Qu es una placa (playa o calva) de lisis? R: La difusin limitada que se observa en los medios slidos tambin puede ser utilizada para estudiar fagos (virus) bacterianos. Si distribuimos sobre una placa de petri un cultivo denso de bacterias, ellas crecern cubriendo toda la superficie, lo que llamamos csped. Si antes de sembrar la placa, mezclamos las bacterias con una suspensin diluda de fagos, stos infectarn y lisarn las bacterias y en la superficie del gar se observar un halo translcido por cada fago infectivo como consecuencia de la lisis localizada de bacterias. Es decir, las bacterias son el medio de cultivo de los fagos. Esto no slo permite titular (contar) suspensiones de fagos, tambin permite trabajar con ellos en forma anloga a lo que hacemos con otros microorganismos. Existe un mtodo anlogo para estudiar virus animales, aunque eso se hace sobre monocapas de clulas en cultivo. Para obtener un nmero bajo y cuantificable de placas se requiere mezclar un exceso de bacterias con una cantidad mucho menor de viriones (a esto se le llama baja multiplicidad) de manera que la probabilidad de que 2 partculas virales distintas penetren en la misma clula sea insignificante. Despus se plaquean las clulas sobre la caja de Petri. 7) Qu se entiende por "sexo" en organismos procariticos (NO en eucariticos!)? R: A los bizarras formas de transferencia parcial de ADN entre bacterias de la misma o de distinta especie: transformacin, a travs: bacterias muertas que actan como machos (donantes); transduccin, a travs de sus virus; conjugacin: a travs de plsmidos y estructuras de secrecin que conforman puentes celulares. 8) Describa brevemente el mecanismo de conjugacin. Siempre se observa transferencia de informacin gentica cromosmica?

R: Se produce entre una bacteria conteniendo un plsmido conjugativo (histricamente denominado Factor F o episoma) llamada F+ y una que no lo contiene. La conjugacin es el mecanismo por el cual una bacteria transfiere a otra una hebra simple de ADN. El mecanismo es similar al de replicacin por crculo rodante (rolling circle). Primero se genera un corte (nick) en una de las cadenas, ms precisamente en la regin conocida como oriT, por origen de transferencia. En el sitio de corte, una helicasa comienza a separar ambas cadenas, a partir de ese punto comienza la transferencia de una de ellas. La transferencia termina cuando se transfiere la secuencia completa (plsmido, por ejemplo) o cuando se interrumpe el contacto entre la bacteria aceptora y la dadora (transferencia cromosmica). En el caso de los plsmidos, cuando finaliza la transferencia se recircularizan utilizando el oriT y la cadena complementaria se sintetiza de novo tanto en la bacteria dadora como en la aceptora. Adems del oriT, los plsmidos transmisibles contienen una serie de genes que son necesarios para la transferencia, los genes tra. Estos genes codifican para el pilus que es una estructura que protruye de la bacteria dadora y hace contacto con la bacteria receptora y facilita la formacin de complejos de secrecin tipo III. Adems del pilus, otros genes tra codifican para protenas que no tienen un rol estructural, como ser la endonucleasa que realiza el corte inicial y la helicasa .Otro tipo de plsmidos que no son transmisibles, pero si son movilizables se encuentran en la naturaleza. Dichos plsmidos no contienen el juego completo de genes tra, pero s contienen la regin mob, que permite que los genes tra de un plsmido transmisible puedan actuar en trans para transferir a los plsmidos movilizables. La regin mob contiene un origen de transferencia y algunas de las enzimas necesarias para la transferencia, como ser la endonucleasa y la helicasa. En el caso ms comn, slo se transfiere una copia (en general completa) del plsmido (ej. factor F) por lo que la clula receptor (F-) se convierte en F+. NO hay tranferencia de genes cromosmicos ni, por lo tanto, aparicin de recombinantes para genes crosomales; a menos que estos se encuentren transpuestos en el Factor F (sexduccin), lo que no es muy comn. Esta forma de apareamiento permite transferir horizontalmente (es decir, incluso entre especies distintas como E. coli y Salmonella typhimurium) genes nuevos importantes como pueden ser los genes de resistencia a antibiticos que pueden ubicarse en plsmidos por la susodicha transposicin. Se observa transferencia de ADN cromosmico en donantes Hfr (factor F cointegrado al genoma cromosomal) o en sexduccin (factor F recombinado = F conteniendo algn gen cromosomal). 9) Cul es la diferencia entre una cepa Hfr y una F+? R: Hfr proviene de High frequency recombination. El plsmido F tiene aproximadamente unas 100 kpb y codifica para los genes tra que lo hacen transmisible,

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manteniendo en general una copia por clula. Las cepas F+, son las que contienen el plsmido F como episoma. Como el plsmido F tiene algunas secuencias homlogas a secuencias cromosmicas (transposones llamados elementos IS), en algunos casos ocurren eventos de recombinacin, donde el plsmido F se integra al cromosoma. En estos casos, el oriT y los genes tra siguen siendo funcionales, y promueven la transferencia del cromosoma, que puede llegar incluso a ser completa. La transferencia cromosmica es la causa de la alta frecuencia de recombinacin de estas cepas y de all su nombre Hfr. La cointegracin del plsmido (la cual se produce, usualmente, por entrecruzamiento via recombinasa (rec A combinada con recBCD) entre el cromosoma y el factor F en regiones con secuencias homlogas, usualmente transposones duplicados en ambos ADNs o, ms raramente, como producto de una transposicin sin resolucin). Resolucin quiere decir: separacin de los 2 crculos cointegrados despus de que se produjo la copia o transferencia del transposn entre el crculo de ADN dador al receptor). 10) Qu es un F' y cmo se origina? R: Un F es un plsmido derivado del F que contiene fragmentos de ADN cromosmico. Cuando un plsmido F se escinde de una cepa Hfr (resolucin), en general ocurre por recombinacin entre los sitios IS flanqueantes (los mismos que permitieron la integracin). Hay casos en que los eventos de recombinacin ocurren entre secuencias ms lejanas (otros elementos IS o secuencias homlogas) y el plsmido que se escinde es mayor que el original y contiene el fragmento cromosmico que estaba contenido entre las secuencias que recombinaron. Estos plsmidos F se denominan F. Tambin se pueden generar plsmidos F por otros mecanismos como ser la transposicin.Un F es una forma natural (in vivo) de clonado molecular en un vector plasmdico, sin uso de enzimas de restriccin, muy usada por los genetistas bacterianos. Los genetistas bacterianos suelen utilizar, para ello, un virus-que es, al mismo tiempo, un transposn llamado fago . 11) Cmo determinara orden y distancia entre genes utilizando la tcnica de "apareamiento interrumpido"? R: Cuando una cepa Hfr conjuga con una cepa F-, el ADN se transfiere desde el oriT. Puede llevar ms de una hora y media la transferencia completa, lo que generalmente no ocurre. El ADN transferido puede recombinar con el cromosoma de la cepa aceptora. Dado que en la suspensin, la interrupcin de la conjugacin ocurre durante todo el proceso, la frecuencia de recombinantes cae exponencialmente con la distancia al oriT. La frecuencia de recombinacin para un marcador es entonces una medida de la distancia al oriT. Para determinar el orden entre dos marcadores se analizan la cantidad de recombinantes dobles. Cuanto mayor es la frecuencia de aparicin de los dobles recombinantes, menor es la distancia entre ellos (menor es la frecuencia de recombinantes entre ellos).

Por lo tanto, se hace cronometrando la aparicin de recombinantes en una conjugacin entre una Hfr y una F-que se interrumpe artificialmente con una licuadora a distintos intervalos y que implique la transferencia de alelos diferenciables de los genes a estudiar. 12) Algunos bacterifagos tienen la capacidad de llevar a cabo dos tipos de ciclos dentro de su hospedador. Explquelos y ejemplifique. Qu es un profago o un provirus? R: Existen fagos en los cuales el proceso de infeccin puede tomar por dos vas antagnicas, lisis o lisogenia. En el ciclo ltico, la funciones tempranas y tardas codificadas por el fago son activadas en forma programada originando un gran nmero de partculas virales y provocando finalmente la lisis. En el ciclo lisognico, la mayor parte de los genes virales son reprimidos, el ADN viral se cointegra al genoma bacteriano formando un provirus (llamado profago en bacterias) y se multiplica silenciosamente en la bacteria. Hay procesos externos, como el dao al ADN que producen la activacin del ciclo ltico. Esta cointegracin puede ser mediada por enzimas de recombinacin codificadas por los virus como es el caso de la integrasa del fago que, a diferencia de la recombinasa del husped, produce recombinacin especfica de sitio (una secuencia de ADN llamada attB, presente entre los operones gal y bio de E. coli. Como esto es muy distinto a la recombinacin homloga tradicional, se lo denomina recombinacin ilegtima. El virus HIV (y otros retrovirus eucariticos) tambin tienen una fase proviral. Si bien el mecanismo es ms complejo, los retrovirus son capaces de transducir genes cromosomales (por ejemplo se ha estudiado mucho la transduccin de oncogenes entre clulas eucariticas, al igual que lo hacen los fagos en bacterias). 13) Compare transduccin generalizada y especializada. R: En la transduccin, un bacterifago (virus) transfiere DNA desde la bacteria en la cual se reprodujo a la bacteria que infecta. El virus debe tener la caracterstica de no producir la lisis del hospedero al cual transfiere el material gentico, es decir la partcula viral debe ser defectiva. Existen diferentes tipos de transduccin, ellas son: Los fagos que las realizan tienen estrategias diferentes de encapsidacin. Los fagos que permiten la transduccin generalizada (por ej. P1) no son capaces de reconocer especficamente el ADN que encapsidan por lo que son capaces de transducir cualquier segmento de ADN cromosmico, sin importar su secuencia. Es decir que, potencialmente, pueden transferir cualquier segmento cromosmico del tamao apropiado. Es decir, que es aquella en que cualquier porcin del genoma del hospedante del virus puede hacerse parte de la partcula viral madura reemplazando al ADN viral. Transduccin Especializada o Restringida. Se define a sta cuando el virus slo puede transferir determinados genes bacterianos cercanos a su sitio de integracin genmica.

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Los fagos que permiten t.e. son aquellos que pueden pasar por una fase lisognica (por ej. el fago ) integrndose en un sitio preciso del genoma (entre los operones gal y bio en el caso de ) y tienen mecanismos de reconocimiento de ADN al encapsidar (tipo secuencia cos del fago ) por lo que slo son capaces de transportar genes vecinos al sitio de integracin que accidentalmente permanecen unidos al genoma viral en el entrecruzamiento que se produce al resolver el cointegrado (como primer paso hacia la activacin de la fase ltica). Adems, en la t.g. el segmento de ADN donante se incorpora por recombinacin homloga reemplazando al alelo nativo (la clula sigue siendo monoploide). En la t.e. el ADN donante se integra como si fuera un profago y se produce un diploide parcial. Nota: todo esto se puede resumir en un cuadro. 14) Cmo sera afectada en su capacidad de dar colonias transducidas una cepa bacteriana rec-(deficiente en los sistemas de recombinacin celulares) al infectarla con un lisado transductor de el bacterifago ? y por el fago P1? R: La induccin del fago requiere de la protena RecA. RecA se activa por dao cromosmico (por formacin de ssDNA que es sustrato de RecA) y, a su vez, esta interacta con el represor del ciclo ltico. Esto produce la derrepresin de las funciones lticas y el ciclo ltico comienza. El fago se integra como profago al genoma bacteriano en sitios especficos, attB. Requiere adems funciones celulares como IHF y la integrasa que es una recombinasa especfica de secuencia (la secuencia attB) de , pero NO requiere RecA. Esto implica que no se vera afectada la capacidad de transducir si la cepa aceptora es RecA-. En el caso del fago P1, la capacidad de transduccin se vera afectada, ya que el fago P1 transduce fragmentos de ADN cromosmico de la cepa dadora que tienen que recombinar con las porciones homlogas de la cepa aceptora. 15) Pueden recombinar los virus entre s? Qu mecanismos estn involucrados? R: S. En los casos de virus con genoma de ADN de doble cadena: recombinacin homloga usando las enzimas de la clula husped. En los virus a ADN de simple cadena, la recombinacin puede realizarse entre las formas replicativas (que son de doble cadena). Hay mecanismos de (pseudo)recombinacin en virus a ARN cuya explicacin excede lo que se pretende ensear en la materia. 16) Describa algunas aplicaciones de la utilizacin de fagos para la ingeniera gentica. R: El fago es un vector ampliamente utilizado en ingeniera gentica en el que el ADN conteniendo los genes codificantes para lisogenia fueron artificialmente reemplazados por ADN (por ej. humano) que es transducido sin posterior lisogenizacin a bacterias (que no tienen otra opcin que ser lisadas) para su clonado molecular, conservacin y multiplicacin.

Genes de salvaje En recombinante lisis lisogenia lisis lisis inserto lisis 17) Qu es la transformacin bacteriana? Se logra nicamente en forma artificial o tambin ocurre en poblaciones naturales? R: La transformacin bacteriana es un proceso por el cual las bacterias incorporan ADN del medio. Se logra en condiciones de competencia, es decir, cuando las bacterias son competentes para la transformacin. La competencia puede ser natural, lo que se observa en algunas especies o puede ser inducida en laboratorio. La transformacin natural implica, entre otras cosas, el ingreso de ADN de simple cadena en la clula receptora despus de un reconocimiento por receptores ubicados en la periferia celular, un reemplazo allico en las colonias recombinantes. En la transformacin artificial (tambin llamada transfeccin), las clulas son forzadas a permeabilizar el ingreso de ADN (que suele ser de doble hebra como por ejemplo un plsmido) mediante mecanismos artificiales. E. coli, por ejemplo, no es una bacteria que intercambia ADN por transformacin en la naturaleza y es la bacteria que ms se transforma (= transfecta) en el laboratorio. Se puede esquematizar en un cuadro. 18) Se pueden mapear genes por transformacin? R: S; en forma similar a la transduccin, la eficiencia de cotransformacin es una medida de la cercana de dos loci determinados. Contrariamente a los mapeos utilizando cepas Hfr, pero en forma similar a la transduccin, la transformacin es til para los mapeos finos. Al igual que en la transduccin generalizada, el % de cotransformacin de 2 genes es inversamente proporcional a su distancia. Estos mtodos de mapeo gentico en bacterias han sido totalmente reemplazados, en la actualidad, por mtodos de mapeo fsico por lo que se les prestar menor importancia a la que se le da en los libros de texto. 19) El grfico muestra el resultado de un experimento de apareamiento interrumpido entre las siguientes cepas de E. coli: Hfr: a+ b+ c+ d+ strps X F-: a- b- c- d- strpr

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c + strpr a + strpr

d + strpr b + strpr 5 10 15 20 Min.

a) Defina en forma precisa a las variables del eje X y del eje Y. b) Por qu algunos marcadores alcanzan valores de frecuencias ms altos que otros? c) Deduzca el orden y la distancia gentica en minutos. Qu puntos de la curva utiliz? d) Cul es la utilidad de la resistencia a antibitico que posee la cepa receptora?

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R: a) eje x: nmero de recombinantes / 100 bacterias Hfr; eje y: tiempo en minutos, posterior a la mezcla de los parentales. b) Frecuencia mayor: ms prximos al origen de transferencia. Los marcadores que entran antes estn representados en una proporcin mayor de recombinantes ya que tuvieron ms tiempo para integrarse. c) orden c a d b tiempo 3 4 9 14punto donde cruza eje x (y=0) 3 es el tiempo al cual se transfiere el primer marcador d) distinguir recombinantes a+ b+ c+d+ str R de los parentales Hfr a+ b+ c+ str s. Elimina a cepa dadora. 20) En la hmeda profundidad de la Baticueva, el Hombre Murcilago intenta olvidar su desengao amoroso con una famosa reportera de Ciudad Gtica mapeando una cepa bacteriana hilarante desarrollada en los laboratorios secretos del Guasn. Mientras Alfred le acerca un sabroso vaso de leche cultivada con una bacteria probitica genticamente modificada, el encapotado contempla los datos proporcionados por la BatiPC:
Resultados de la transferencia por conjugacin de material gentico en secuencias diferentes. Se indica tiempo de entrada en un receptor F- (dador Hfr):

niegan su transgenicidad (fueron obtenidos por mejoramiento convencional y no por ingeniera gentica).

Problemas: 1) Bitcora de vuelo: fecha espacial 1654.9. Habla e1

capitn Kirk. Toda la tripulacin del Enterprise sufre una diarrea infernal. E1 seor Spock afirma que se trata de una extraa bacteria intestinal proveniente de la tercera luna del cuarto planeta de la segunda estrella del sistema Papanpulos XXXIII. Sospecho que la bacteria fue introducida involuntariamente por el seor Cheko despus de la ltima visita a su novia en Nueva Creta. En el tiempo que le queda libre despus de repartir pastillas de carbn, el doctor McCoy logr identificar cuatro genes implicados en la regulacin de un sistema enzimtico. Tambin aisl una mutante: Fa-,b-,c- y d- StrR, la cual normalmente da revertantes a+, b+, c+ o d+ a una frecuencia aproximada de 1 colonia revertante por cada 107 clulas sembradas en el medio selectivo correspondiente. Con esta cepa aisl un clon con las mismas auxotrofas (a-b-c-d-) y con la misma tasa de reversin hacia a+ y d+ pero con una frecuencia de aparicin de revertantes c+ y b+ reducida a niveles no detectables. Se utiliz esta cepa como receptora en un experimento de apareamiento con la Hfr a+ b+ c+ d+ StrS. La figura muestra los resultados obtenidos usando medios selectivos que carecen de a, b, c o d. c + strpr N recomb.

genes ja je ji jo tiempo 15 21 32 48 genes ju ji jua jo jue 57 2 tiempo 10 17 22 33 genes jui juo juu ay jo jua 11 33 48 49 60 3 tiempo 6 genes juo jui ja ju 4 tiempo 18 23 35 45 Podr Bruno Daz construir un mapa gentico que incluya todos estos hilarantes marcadores y sealar la distancia de tiempo entre genes adyacentes? No se pierda la continuacin de este batiapasionante captulo, a la misma batihora, por el mismo baticanal y en la misma batimateria. R: JA JE JU JI JUA JO AY JUU JUE JUO JUI y, dando la vuelta, de nuevo JA. De una forma similar a esta se demostr por primera vez la circularidad del genoma de E. coli. Era la nica forma de justificar resultados como stos. Nota sobre el enunciado: las bacterias probiticas (tipo la Lactobacillus casei del Actimel) suelen producir una modificacin favorable o reconstitucin de la flora bacteriana intestinal (por ejemplo por cambio del pH intestinal). No hay evidencia cientfica clara de que produzcan ninguno de los efectos que muestra la publicidad. Es ms, este tipo de publicidad est prohibida en la mayora de los pases del primer mundo. Algunas bacterias del yogur (como el famoso Lactobacillus G de origen francs que comercializa La Serensima) estn genticamente modificadas e incluso contienen genes de resistencia a antibiticos, aunque fueron obtenidos por mecanismos de gentica bacteriana (como en los ejercicios de esta gua ingeniera gentica in vivo) por lo que las legislaciones no los consideran OGMs y los fabricantes (y los ecologistas)

cepa 1

b+ c+ d+ 10 20 30 40 min. Luego se tomaron 100 colonias d+, 100 b+ y 100 c+ de las placas de 30 minutos y se ensay su genotipo para los otros dos marcadores. Los resultados se resumen en la tabla. Explique los resultados. 2) Cuando Sledge d+ b+ c+ Hammer le dijo al 93 93 capitn Tronk: d+ ----95 ----100 -Confe en mi, s b+ exactamente lo que c+ 92 100 ---hago-, a la teniente Dureau se le erizaron los pelitos de la nuca. Entonces Sledge se encerr durante siete das en el laboratorio del cuartel (despus de desalojar a punta de revlver al mdico forense). Cuando sali, Sledge anunci que haba resuelto el misterioso caso de los coliformes mutantes. Ms tarde, en una ronda de prensa sensacionalista, Sledge declar: - Bueno, se trataba de un aislamiento de la cepa bacteriana Mgnum 44 la cual es Hfr y StrS y, lo que es ms grave, completamente salvaje. De este condenado germen, aislamos un engendro mutante (F-StrR arg-lac-). La cuestin es que conjugu ambos demonios pero interrumpiendo su disgustante orga a distintos tiempos con lo que logr

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hacerles confesar lo ms ntimo de sus genes sometindolas a un medio con estreptomicina y suplementados como se indica en la tabla, con el sencillo trmite de contar el nmero de colonias al da siguiente. Con esto queda demostrado, una vez ms, que el crimen es la N de colonias observadas en profesin menos t (min) lac glu arg+lac arg+glu paga des1 0 0 0 500 pus de la 5 0 128 0 491 de Estu 10 40 201 58 509 diante de 15 80 199 127 498 Biologa. 20 82 203 139 504 a) A qu distancia del opern lac mapea el origen de transferencia en la cepa Hfr usada? b) Cules son los genotipos de las bacterias que crecen en los distintos medios? c) Porqu los valores de la primer columna son menores que los de la tercer columna? d) Qu estrategia se podra seguir para clonar el gen (salvaje) involucrado en la sntesis de arginina cuya versin defectuosa est en la cepa F-? 3) Se realiz una coinfeccin en medio lquido (a alta multiplicidad densidad- de fagos y sobre una cepa sensible), con dos fagos T4 mutantes: T4m- (playas pequeas) y T4tu (playas turbias). Una alcuota del lisado resultante fue usada para infectar (a baja multiplicidad de infeccin) nuevas bacterias de la misma cepa y se obtuvo un 7% de playas grandes y claras (salvajes). Qu porcentaje de playas pequeas y turbias se habr obtenido? 4) Teodorico Snopolsky se aboc a una tarea que le haba quitado el sueo durante la mayor parte de su vida: obtener bacterias que sintetizaran whisky y gi-

nebra. A continuacin se reproduce una pgina del cuaderno de Snopolsky, encontrado por unos expedicionarios groenlandeses: Anotacin N 12.506: Para transformar una cepa bacteriana incapaz sintetizar whisky (whi-) y ginebra (gin-) us, por una parte, una mezcla de ADN de dos cepas. Una whi+ gin- y la otra whi- gin+ y, por otra lado, e1 ADN de una cepa whi+ gin+. Obtuve clases transformadas en las siguientes proporciones:
ADN donante whi+ ginwhi- gin+ whi+ gin+ whi- gincepa receptora whi- ginclases transformadas whi- gin+ whi+ ginwhi+ gin+ whi- gin+ whi+ ginwhi+ gin+ N colonias 248 175 3 315 201 382

A qu se debe la aparicin de un mayor nmero de colonias transformadas whi+ gin+ en el segundo caso?
5) Uno de los objetivos de la microbiologa es construir microorganismos recombinantes para que acten como remediadores del medio ambiente dentro de un ecosistema contaminado, y que al terminar su funcin se autodestruyan. Existe un compuesto txico, 3-metil-benzoato (3MB) que es catabolizado por la bacteria Pseudomonas putida. Los genes responsables del catabolismo del 3MB estn organizados en un opern dentro de un plsmido denominado TOL. Los genes de este opern estn regulados positivamente en presencia de 3MB. Construya, mediante conjugacin, una cepa de Pseudomonas putida capaz de destruir al 3MB presente en un lago contaminado, y que esta cepa se autodestruya luego de eliminar el contaminante. Se dispone de los siguientes elementos:

(1) a (4) cepas de P. putida: TOL

opern Trp

TOL

TOL
p3MB -gal

TOL
p3MB lacI

(1) lac; leu / pTOL / pOpern Trp

(2) leu- / pTOL

(3) leu / pTOL / p[p3MB--gal]; kmR (I) leu; ala-; mob+; tra+ (en el cromosoma)

(I) y (II) cepas de E. coli

(4) lac; leu / pTOL / p[p3MB-lacI]; kmR (II) leu; ala-/ pRK2013 (mob+; tra+; bom+; kmR)

(A) a (C): Plsmidos que poseen origen de replicacin de amplio rango de husped (funciona en Pseudomonas y Escherichia), contienen un gen de resistencia a ampicilina y las siguientes caractersticas:

II
pRK2013

leu+
A

leu+ bom
B

leu bom
C

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plac gef
- p3MB-gal: promotor del opern que cataboliza el 3MB a 5del gen de la enzima -galacosidasa. - p3MB-lacI: promotor del opern que cataboliza 3MB a 5del gen del represor del opern lactosa. - lac y leu: La (delta) significa que lo que sigue est delecionado (opern lac o leu, en este caso la delecin involucra tambin al gen del represor I). - tra: genes de transferencia del plsmido F - mob: endonucleasa que corta en la regin bom - bom: origen de transferencia del plsmido F - ptrp : promotor opern triptofano (otro distinto) - plac: promotor del opern lactosa - gef: es un gen suicida, es decir que codifica para una protena que produce la muerte de la bacteria cuando se expresa. Gua terica 1. Qu se entiende por determinacin sexual y diferenciacin sexual? R: Determinacin sexual: sistemas biolgicos que determinan el desarrollo de las caractersticas sexuales de un organismo (determinacin cromosmica, gnica, por nivel de ploida o ambiental) Diferenciacin sexual: procesos necesarios para alcanzar las caractersticas sexuales previamente determinadas 2. Qu son los cromosomas sexuales y en qu grupos taxonmicos se los encuentra? R: Son los cromosomas que determinan genticamente el sexo. Se encuentran muy distribuidos en insectos, mamferos, aves y plantas dioicas. 3. Qu se entiende por regin pseudoautosmica (PAR)? Solucin: regin de homologa y apareamiento entre los cromosomas sexuales 4. Los genes relacionados con la diferenciacin sexual estn ubicados exclusivamente en los cromosomas sexuales? Explique R: Nooo!! Slo es necesario que se localicen all los genes regulatorios codificantes para los factores de transcripcin maestros que disparan el proceso que se describe en los libros. Existen muchos genes importantes para el sexo (incluso los que codifican para cosas tan importantes como son las hormonas sexuales) que se localizan en los autosomas y pueden verse influidos por los cromosomas sexuales. 5. A la inversa, pueden existir genes que no tienen nada que ver con el sexo localizados en los cromosomas sexuales? Explique. R: S, el gen que determina la presencia de pelos en el borde de la oreja, se encuentra en la regin diferencial del cromosoma Y.

ptrp gef

plac gef

a) Disee una estrategia para construir (mediante conjugacin) la cepa de Pseudomonas putida que sea capaz de metabolizar el contaminante 3MB y que luego se autodestruya, indicando cules cepas y plsmidos elige y cmo se selecciona la bacteria de inters. b) Justifique las/los que descarta. c) Esquematice mediante un grfico la curva de crecimiento (nmero de bacterias en funcin del tiempo) y el nmero de bacterias en funcin de la concentracin de 3MB. Considere t=0 al lago conntaminado en el momento del agregado de las bacterias limpiadoras. d) Por qu se debe evitarel escape de la bacteria limpiadora al medio ambiente? 6. Cmo se comportan, en relacin con las leyes de Mendel, los genes que se encuentran en los cromosomas sexuales? R: Su herencia difiere de la de los genes ubicados en los autosomas, ya que los alelos se heredan asociados con el sexo de la descendencia. La misma est influida, a su vez por hemicigosis (genes del cromosoma Y), heterocromatinizacin (genes del cromosoma X), etc. 7. Qu diferencia existe entre genes LIGADOS, caracteres LIMITADOS a un sexo e INFLUIDOS por el sexo? R: Los genes ligados al sexo, son aquellos que se encuentran en la regin diferencial de los cromosomas sexuales (ligados al X o Y). Los caracteres limitados a un sexo, son aquellos que se expresan solamente en un sexo aunque los genes que los determinan estn presentes en ambos (ej. distribucin facial del vello en hombres). Los caracteres influidos por el sexo, se expresan en ambos sexos pero con diferente relacin de dominancia (ej. el alelo que determina la calvicie humana, es dominante en hombres y recesivo en mujeres) 8. En qu consiste la determinacin del sexo por equilibrio gnico? R: En Drosophila melanogaster, el sexo est determinado por la relacin: cromosoma X/conjunto de autosomas. Siendo 1 la relacin que determina hembras y 0,5 la que determina machos. 9. Cul es el mecanismo de determinacin sexual en humanos? R: En humanos el sexo se determina cromosmicamente, siendo el cromosoma Y el determinante masculino (portador del gen SRY, factor determinante del desarrollo de los testculos). 10. Qu es la compensacin de dosis gnica en mamferos?. Qu establece la hiptesis de Lyon? D

14. GENTICA DEL SEXO

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una evidencia citolgica y una gentica de la compensacin de la dosis. R: La compensacin de la dosis es el mecanismo mediante el cual se iguala, en ambos sexos, la actividad de los genes que se encuentran en el cromosoma X. Hiptesis de Lyon: en mamferos, la compensacin de la dosis ocurre por inactivacin, al azar, de uno de los cromosomas X de las hembras (heterocromatinizacin). El corpsculo de Barr es la evidencia citolgica de esta inactivacin. Una evidencia gentica puede obtenerse analizando la expresin de Glu6Pdeshidrogenasa en hembras heterocigotas. 11. Cul es el mecanismo de compensacin de dosis gnica en Drosophila? R: La compensacin de la dosis ocurre por hiperactivacin del cromosoma X de los machos. 12. En qu consiste el mecanismo de determinacin del sexo por haplodiploida? En qu grupos taxonmicos se encuentra? R: En este sistema, la determinacin del sexo depende de la dotacin cromosmica de los individuos, siendo las hembras diploides y los machos haploides. Se encuentra en los himenpteros (abejas, hormigas, termitas) 13. Qu mecanismos de reproduccin permiten perpetuar un genotipo mas all de la existencia del individuo? Conoce alguno que implique la produccin de semillas? R: Apomixis Problemas: 1) En los embriones de los mamferos, la presencia del cromosoma Y determina el desarrollo de testculos y genitales externos masculinos. En 1990 se clon un fragmento de 14 kpb del cromosoma Y que contiene todo el gen determinante del sexo, al cual se lo llam Sry (Sex Reversal Y, es decir, revierte el sexo). Como era previsible para un gen regulatorio, Sry codifica para una protena (SRY) que contiene un dominio de unin al ADN, la misma acta en el conducto genital precursor de los testculos y el comienzo de la expresin es alrededor de 10 a 12 das post-coito o postreimplantacin. Con la intencin de obtener ratones transgnicos, se inyectaron vulos fecundados con una solucin acuosa conteniendo el gen Sry clonado. Las cigotas fueron reimplantadas en madres adoptivas seudo-preadas. Se obtuvo una camada de 93 cras nacidas (machos y hembras). Para determinar rpidamente qu ratones de la camada eran transgnicos, se obtuvo ADN genmico de trozos de cola de toda la camada, y se realiz un Southern-blot con 2 sondas radioactivas. Sonda A = fragmento del gen Sry clonado, revela una sola banda de 3,5 kpb. Sonda B = fragmento del gen Zfy, revela dos bandas de 11 kpb y 5 kpb. El gen Zfy es un gen del cromosoma Y, localizado lejos de Sry y por fuera del fragmento de 14 kpb. a) Dibujar las bandas que se observaran en un Southern hecho con ADN genmico de las cras e hibrida-

do simultneamente con las sondas A y B. Considere todos los resultados posibles. b) Gracias a estudios previos con cepas de ratones con anomalas cromosmicas, se sabe que la presencia de ms de un cromosoma X en el ratn macho, siempre da por resultado esterilidad. Cules de las cras obtenidas seran frtiles y cules estriles? c) Proponga otras metodologas para la deteccin de los ratones transgnicos. 2) En un laboratorio de gentica de Drosophila melanogaster, se obtuvo por irradiacin una poblacin A con alteraciones en la gametognesis tanto de hembras como de machos, la misma consista en fallas meiticas durante anafase II. Como resultado de estas anormalidades se observ, por un lado, no disyuncin de todo el complemento cromosmico, con la consecuente produccin de gametas completamente no reducidas y, por el otro, no reduccin de cromosomas sexuales, producindose gametas parcialmente no reducidas. Este tipo de gametas se encontraba en una frecuencia elevada, pero tambin aparecieron gametas normales. Con el objetivo de estudiar la viabilidad y capacidad de fecundacin de estas gametas, se realizaron cruzamientos entre hembras y machos de la poblacin A, y se analizaron todos los descendientes obtenidos. Considerando que las gametas pueden fecundarse totalmente al azar, prediga el complemento cromosmico de toda la descendencia posible y su fenotipo sexual. 3) En humanos, el gen Sry (localizado en el segmento diferencial del cromosoma Y) determina masculinidad. Qu fenotipo sexual, y cuntos corpsculos de Barr presentarn los siguientes individuos: a) 46, XY; b) 47, XXY; c) 45, X 4) Supongamos que una determinada enzima dimrica A, cuyo locus se encuentra en el segmento diferencial del cromosoma X, interviene tanto en el metabolismo de Drosophila como en el del ratn, y que en ambos casos dos variantes moleculares de dicha enzima estn codificadas por los alelos A1 y A2. El genotipo de los individuos es distinguible por electroforesis segn el siguiente esquema:

A1A1 + -

A2A2

Se hace el siguiente experimento, tanto en Drosophila como en ratn. A partir de un tejido adecuado de una hembra heterocigota A1A2 se obtiene un cultivo celular primario y de este 10 subcultivos unicelulares. Qu patrones electroforticos se obtendrn en los siguientes casos? a) Cultivo primario de Drosophila. b) Subcultivos de Drosophila. c) Cultivo primario de ratona. d) Subcultivos de ratona. 5) En el ratn existen dos sistemas enzimticos cuyos productos son detectables en los glbulos rojos. Los mismos estn determinados por las parejas allicas A,a y B,b, cuyos loci respectivos estn situados en el

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segmento diferencial del cromosoma X. Unas hembras diheterocigotas (hijas de machos que presentaban las enzimas A y b) se cruzaron con machos AB, obtenindose la siguiente descendencia masculina: AB:34; ab:26; Ab:67; aB:73. Teniendo en cuenta la hiptesis de Lyon, de los ocho tipos de hembras que se sealan en la tabla, Cules sern las hermanas de los machos antes indicados? Con qu frecuencia aparecer cada una? Porcentaje de gbulos rojos con Tipo de las enzimas que se indican Hembra AyB Ayb ayB ayb 100 1 2 3 4 5 6 7 50 50 50 50 50 50 50 50 25 25 25 25 100

50 50 8 6) Ni el Zar Nicolas II ni su esposa la Emperatriz Alexandra tenan la enfermedad conocida como hemofilia, caracterizada por estar ligada al sexo. Su hija, la princesa Anastasia, tampoco la tena, pero el Zarevich Alexius, su hermano, s. Podria Anastasia haber sido portadora de la hemofilia? Si se hubiese casado con su primo Henry, que era hemoflico, alguno de sus hijos o hija habran sido hemoflicos? 7) Es de conocimiento popular que todo gato de 3 colores es gata (hembra). A este tipo de gatos se los llama calico. Se sabe que el pelaje blanco presente en sectores o mosaicos proviene de un gen independiente del que produce pelaje naranja o negro. Se realizaron dos cruzamientos: 1) Macho blanco y negro x Hembra blanca y naranja 50% machos blancos y naranjas 50% hembras tricolores 2) Macho blanco y naranja x Hembra blanca y negra 50% machos blancos y negros 50% hembras tricolores a) Cul es el indicador ms evidente de la ausencia de herencia mendeliana? b) Por qu gatos machos no tienen nunca 3 colores? c) Explique la base gentica de este comportamiento. d) Cmo sera el resultado de cruzar una hembra tricolor por un macho blanco y negro? 8) Es posible que, en los humanos, un gen mutante recesivo est localizado en el cromosoma X, si una

mujer que presenta el rasgo recesivo y un hombre normal tienen un hijo varn normal? Explique. 9) En la especie humana la presencia de cierto mechn de pelo blanco es un caracter influido por el sexo, dominante en el hombre y recesivo en la mujer. La protanopia (tipo especial de ceguera al color rojo) est determinada por el alelo recesivo de un gen situado en el segmento diferencial del cromosoma X. Un hombre con mechn blanco y visin normal, cuyo padre careca de dicho mechn, tiene descendencia con una mujer sin mechn y con visin normal, cuyo padre careca del mechn y tena protanopia, y cuya madre tena el mechn. a) Qu proporcin de los descendientes sern hembras con mechn blanco y visin normal? b) Qu proporcin de la descendencia sern machos con mechn blanco y protanopia? 10) En la mariposa trbol todos los machos son amarillos, en cambio las hembras pueden ser amarillas si tienen el genotipo homocigota AA, o blancas si poseen el alelo (A'_). Sin tomar en consideracin el sexo, qu proporciones fenotpicas pueden esperarse en F1 de la cruza AA' x AA'?

15.- HERENCIA DE ORGANELAS

Gua terica: 1) Qu es la HERENCIA materna (tambin llamada uniparental, citoplasmtica o extranuclear) y cmo se diferencia de la INFLUENCIA materna? Cul es su base genmica? Mediante qu mecanismos se multiplican las organelas? R: Herencia materna: genes presentes en organelas con un modo especial de herencia, la progenie hereda los genes de las organelas de uno de los progenitores (herencia uniparental), en la mayora de los casos de la madre. Debido a que las organelas se encuentran en el citoplasma y que en la formacin del cigoto el principal aporte citoplasmtico proviene del huevo u vulo es que las organelas se transmiten por va materna, tambin se utiliza el trmino herencia citoplasmtica. Adems debido a que el ADN de las organelas se encuentra fuera del ncleo tambin se lo denomina herencia extranuclear. Influencia materna: Diferencias en el fenotipo causadas por componentes citoplasmticos presentes en las gametas. Nuevamente debido a que el principal aporte citoplasmtico proviene de la madre es que se lo denomina influencia materna. Los componentes citoplasmticos pueden ser protenas u otros factores que influyen en el fenotipo del cigoto pero no en su genotipo. Pueden perderse los efectos de la influencia materna luego de una generacin si el genotipo del cigoto no posee los genes que codifican para dichos componentes. 2) Explique la organizacin genmica de mitocondrias y cloroplastos, tomando como base mitocondrias de humanos, levaduras y cloroplastos de plantas superiores. Dira Ud. que su evolucin fue lenta o rpida comparada al genoma nuclear? Si dependiera del caso, ejemplifique.

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R: La organizacin genmica de mitocondrias y cloroplastos es significativamente diferente del ADN nuclear. Ambas organelas se originaron por transferencia horizontal que involucr eventos de endosimbiosis donde clulas eucariotas adquirieron el genoma bacteriano intacto (ver siguiente pregunta). Cloroplastos: Genoma circular que no posee histonas ni otras protenas cromosomales presentes en el ADN nuclear. Muchas de las protenas utilizadas en la fotosntesis estn codificadas en el ADN de los cloroplastos. Comparado con el ADN nuclear vegetal la tasa de evolucin es ms rpida (menor velocidad de cambios que las mitocondrias). Mitocondrias: genoma circular que no posee protenas cromosomales. Las mitocondrias de plantas, hongos y animales difieren en estructura, composicin, tasa de evolucin y modo de herencia (ver tabla). Tabla. Caractersticas del ADN mitocondrial
Plantas Tamao del Extremadagenoma mente variable (300kb a 2400kb en una misma familia) Estructura Variable, circular o lineal Informacin rRNA, tRNA, protenas ribosomales, protenas involucradas en respiracin Presencia de No, pero intrones abundantes regiones no codificantes Modo de Variable, prinherencia cipalmente materna Tasa de dilenta vergencia de secuencia comparada con el correspondiente ADN nuclear Hongos Animales Muy variable Pequeas y (26,7kb a poco varia115kb en as- bles 16kb comycertes filamentosos) circular circular rRNA, tRNA ,protenas ribosomales, protenas involucradas en respiracin Si rRNA, tRNA, protenas involucradas en respiracin No, pocas regiones no codificantes materna rpida

Cualquiera de los dos parentales media

3) Qu origen evolutivo tienen estas organelas? Es el mismo monofiltico o polifiltico? Explique la teora de Margulis. R: Una de las principales hiptesis es el origen endosimbitico (Margulis 1970; 1993). La idea es que las organelas se originaron a partir de bacterias que vivieron como simbiontes internos de las clulas eucariotas primitivas. La secuencia de los genes de las organelas apoyan esta hiptesis siendo similares en secuencia a los genes bacterianos. Los genes mitocondriales son similares a los genes presentes en proteobacterias y los genes de cloroplastos similares a los presentes en cianobaterias. En el caso de los cloroplastos el origen es polifiltico ya que cloroplastos de algas tienen un origen diferente que los cloroplastos de plantas supe-

riores, en el caso de las mitocondrias se encuentra en discusin. 4) Hace unos 10 aos una noticia sacudi los titularesEva (s, la de Adn y Eva) fue negra y vivi hace 200.000 aos. En qu se bas el periodista?Por qu ignor olmpicamente al pobre Adn?Era feminista? R:La noticia se basaba en la reconstruccin filogenetica de la evolucion humana mediante la secuenciacion de regiones nocodificantes de ADN mitocondrial. Los rboles obtenidos sugieren un orgen africano de la especie humana. Se calcula que el ancestro comn a todos los ADN mitocondriales presentes vivi hace 166000 y 249000 aos. Los criterio empleados fueron: 1) asumir que las mutaciones en el genoma mitocondrial se acumlan a tasa constante; 2) utilizar secuencias de chimpanc de manera comparativa; 3) usar estimadores de tiempo de divergencia entre humanos y chimpanc basados en la teora del reloj molecular (tasa mutacional constante a lo largo del tiempo, se explicar ms adelante) Debido a que las mitocondrias se heredan por la va materna es que se lo llam Eva mitocondrial. Todos los humanos heredamos nuestras mitocondrias de Eva. Estas comparaciones determinan otros hechos que echan por tierra teoras racistas. Muchas variantes de negros son ms distintas entre s que los blancos de algunos negros (con los que estn muy emparentados). Toda la clasificacin de razas humanas tiene mucho ms que ver con la evolucin de unos poqusimos genes determinantes de caracteres fenotpicos como el color de la piel y poco tiene que ver con la evolucin global del resto del genoma y mucho menos con caracteres como la inteligencia. 5) Cmo se puede hacer mapas genticos de genomas de organelas?Cmo se hace para mapear usando levaduras ptites y bromuro de etidio? R: Hay muchos mtodos, slo veremos el mapeo de ptites que consiste en tratar levaduras con bromuro de etidio (un mutgeno que produce deleciones de segmentos del DNA mitocondrial). Al perder genes mitocondriales, se puede estudiar con qu frecuencia se pierden juntos 2 genes, lo que es proporcional a la distancia en el mapa. Como en general se pierden funciones mitocondriales importantes, la levadura pierde la capacidad de respirar, por lo que crece menos que las normales o grandes (en francs) en medio aerbico. Por eso, se llaman petites a estas mutantes. Problemas 1) Una enfermedad humana que produce cardiomiopatas muestra el siguiente pedigr:

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a) Cmo ex xplica el pat trn de heren ncia de esta enfermedad? b) Si el ind dividuo 5 tie hijos con una madre sana, ene n e como esper que sean s hijos var ra sus rones? Y sus hijas mujeres? c) Puede el individuo 10 tener una hija sana? Y un ? hijo? Justifi ique d) La pareja formada po los individ or duos 3 y 4 tu un uvo cuarto hijo sano, como lo explicara Puede ded a? ducir si ese hijo es v varn o muje Justifique er? e. 2) La polill de la harina Ephestia kuehniella posee la a ojos negros y cuerpo pi s igmentado debido a un p precursor del pigm mento (prote ena kynuren nina) cuyo c control de expresin est dado p el gen do por ominante A. Cuando el genot tipo de la po olilla es aa e fenotipo e ojos el es rojos y cue erpo sin pigm mentar. Si se realiza el cruzamiento de u macho he un eterocigota p una hemb repor bra cesiva el re esultado es de polillas pigmentadas con s ojos negros y 1/2 de po olillas no pig gmentadas co ojos on rojos. Si se realiza el cr ruzamiento r recproco tod las das larvas nacen pigmentad pero los a n das adultos resul ltan en con ojos negros y c ojos rojo con os. a) Explique los fenotip observad en ambo crue pos dos os zamientos. D que tipo de herencia s trata? De se b) Qu explicacin m molecular tie ene este tip de po herencia? c) Que exp perimento rea alizara para probar la re espuesta dada en 2 Consider que cuenta con herram 2). re a mientas para anular genes de la polilla en estados espec cficos de su ciclo d vida. de 3) Una estrategia comer rcial en la pr roduccin de maz e es la genera acin de hbr ridos con est terilidad del polen. De esta ma anera el productor debe comprar se emillas todo el tiem adems de que evita la autofec mpo cundacin y la co onsecuente p prdida de va comercia (por alor al disminucin del vigor hbrido). L determi n r Los inantes genticos de esterilidad del polen es e stn localizados en las mitocon ndrias (en ma se conoce por lo men 20 az en nos determinant distintos) Para evita la expresi de tes ). ar in estos determ minantes en las plantas que actan como parentales e los cruzam en mientos para generar los hbria s dos, se utiliza un gen n nuclear dom minante resta aurador de la fertili idad (Rf) que permite qu la planta pueda e ue dar polen au unque sea ge enotpicamen androest Si nte ril. usted tiene una semilla de maz cu ualquiera de origen desconocido cmo har para sab su genotipo en o ra ber cuanto a est carcter? te 4) El anlisis de la correspondencia entre la secuencia a nucleotdica del DNA g a genmico mit tocondrial de plane tas superior y la secu res uencia de am minocidos de las protenas co odificadas in ndic que el codn CGG que l G, "universalm mente" determ mina Arg, lo hace para T en o Trp las mitocon ndrias de plan (el cdig "universal para ntas go l" Trp es UGG sugiriend que, al igu que en m G), do ual mamferos y hong gos, las mito ocondrias ve egetales tien un nen cdigo gen tico propio. Sin embarg un invest . go, tigador argentino e Francia re en evis esa po ostura y dete ermin que las mito ocondrias ve egetales se rigen por el c cdigo universal. Cmo explic esta contr ca radiccin apa arente?

C Cul mecanis smo de los s siguientes pu uede estar in nvoluc crado?: a- Mutacin puntual somt tica b- Reordenam miento cromosmico c- Transposici gentica in d- tRNAs supr resores e- Splicing del RNA l f- Correccin (edicin) del RNA ("edit l ting") 5) Cmo se e explica que l secuencia de amino las as cidos de la subu unidad III de la citocromo oxidasa ais o slada de: - mitocondrias de mamfer m s ros - mitocondrias de plantas m s - kinetoplastos de tripanosomtidos k s est muy cons tn servadas evo olutivamente, mientras qu ue los genes respe s ectivos guard muy poca homologa dan a ent s? tre 6) La idea del origen proca aritico de la mitocondr as rias se ve avalada/s por las sigu s uientes evide encias que in ndican similitudes con las bac n s cterias actuales y diferenc cias con el equivale nuclear: n ente a) Grado relati de homo ivo ologa de sec cuencias de nucle etdos de los genes ribos somales mito ocondriales. b) La estructur policistrn del RNA inmaduro mira nica A toc condrial. c) El cdigo ge entico mitoc condrial. d) El sistema d replicacin del DNA mitocondrial. de n m . e) La secuenci de amino ia cidos de las isozimas mitocon ndriales, f) El fenmen de "trans no splicing" y/o "editing" del o RN mitocond NA drial g) La herencia materna de l genes mi los itocondriales s. h) E1 fenmen de conjuga no acin mitoco ondrial. Ind dique las op pciones corre ectas y falsas y justifique. . 7) Los prione son agent es tes fecciosos in nvolucrados en inf enfermedades neurodegen nerat tivas en los mamferos c como la conoci o ida encefali itis esp pongiforme bovina o e enfer rmedad de la vaca loca y a el scrapie en ovejas. En los humano se incluye la n n os e enfermedad de Creutzfelde -Jakob, el ins somio fatal y el ku El aspect ms pecul del proce de infecc uru. to liar eso cin por priones es que no tien cidos nu nen ucleicos asoc ciados, en person sanas y e nas enfermas se encuentran los mi ismos alelos de los genes que codific para la p s can protena prinica. La naturalez infecciosa de los prio za a ones der de que l protena p riva la prinica pued existir en dos de est tados confor rmacionales: el normal o no infeccioso (40 de hlice y casi nada de plega 0% es amientos ) y el anormal o infe eccioso (muy rico en estr y ructuras de t tipo ). Cuando la protena se encuentra en conformac . n cin inf fecciosa tien propiedade del tipo chaperona, en ne es , el sentido de q es capaz de convertir protenas n que r norma en infec ales cciosas (mediante una rea accin en ca adena) produciend los agreg ) do gados neuron nales caracte ersticos de la en nfermedad. E enfermedades como el En o ku uru o de la vaca loca la conforma acin infecci iosa

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aparece en el husped como consecuencia de la ingestin de tejido nervioso enfermo. En cambio, en enfermedades hereditarias como la de Kreutzfeld-Jakob ciertas mutaciones en el gen prinico aumentan la chance de aparicin espontnea de la conformacin infecciosa sin necesidad de ingestin del agente infeccioso. A este ltimo tipo de transmisin se lo considera herencia infecciosa (un tipo especial de herencia extranuclear). Hasta hace poco se pensaba que slo existan priones en mamferos, pero actualmente se tiene certeza de que tambin estn presentes en levaduras. Uno de estos priones fngicos (el PSI) tiene una funcin biolgica conocida (es un factor de terminacin de la traduccin citoplasmtico). Esta protena puede existir en 2 variantes: PSI+ y PSI-. La herencia sigue un patrn de herencia infecciosa como el mencionado anteriormente. a) Esquematice un cruzamiento entre levaduras Psi+ y psi- y su segregacin en F1 y F2. No omita las convenciones correspondientes para la ploida, tipos de apareamiento y proporciones genotpicas y fenotpicas en cada una de las generaciones. Lea atentamente, para ello, el ciclo de vida de las levaduras en su libro de texto. b) Dnde tendra que estar localizado el gen Psi? en un autosoma, en un cromosoma sexual, en un plsmido o en genoma mitocondrial? por qu? Justifique. Gua terica: 1) Qu similitudes y diferencias tiene el desarrollo embrionario en vertebrados y en moscas? Qu importancia relativa tienen las gametas masculina y femenina (los vulos o futuros huevos)? 2) Qu diferencias y similitudes existen entre determinacin (o compromiso) y diferenciacin? 3) Describa la determinacin autnoma versus la determinacin en comit o grupal. 4) Qu es una cascada regulatoria y los efectos de posicin? Sirven para explicar porqu el producto de un mismo gen tiene efectos opuestos en distintos tejidos? 5) Qu caractersticas tienen los genes que condicionan y participan en el desarrollo? Son todos genes para factores de transcripcin? 6) Son los genes hometicos un subgrupo de los mismos? 7) Existen efectos maternos (como los que Ud. vio para el caracol del gnero Limnaea) para alguno de estos genes? 8) Si la mayora de estas mutaciones (como la del problema 2) son letales. Cmo hacen para mantenerlas (y visualizar su efecto sobre los embriones)? 9) Existen similitudes entre los genes de artrpodos y vertebrados? Implica esto una evolucin convergente de estos genes? Problemas 1) Clulas de fibroblasto cultivadas "in vitro" fueron transfectadas ("transformadas gentica-mente") con un gen quimrico conteniendo la secuencia estructural

La herencia de esta protena fue siempre intrigante porque en ninguna de las decenas de mutantes petite se afecta la herencia de la protena. En cambio el fenotipo prinico PSI+ poda ser revertido a PSI- con altsima frecuencia al someter a las levaduras a agentes desnaturalizantes de protenas como el hidrocloruro de guanidina, no sucediendo as con tratamientos mutagnicos. Los tratamientos mutagnicos s pueden producir que levaduras PSI- se transformen en PSI+. Las mutaciones responsables son puntuales y el gen determinante (Psi) pudo ser ubicado en un cromosoma nuclear. Todo esto llev a cuestionar la herencia infecciosa-materna del gen y llev a la hiptesis de que el fenotipo PSI+ depende de la conformacin de la protena como en el mal de la vaca loca. c) Teniendo en cuenta lo anterior y disponiendo de: una sonda del gen Psi (sabiendo que la mutacin puntual que condujo a transformar una levadura PSIen PSI+ coincide con el sitio de restriccin EcoRI). anticuerpos monoclonales que reconocen diferencias conformacionales entre PSI+ y PSI-. Esquematice un experimento para estudiar la herencia del gen Psi en sus dos variantes allicas. Cmo seran las proporciones genotpicas y fenotpicas en una progenie resultante del cruzamiento de Psi+ y psi- (recordando que la protena codificada por Psi+ tambin tiene propiedades de chaperona infecciosa)? del gen myoDI (gen que codifica para un factor de transcripcin de activa expresin en mioblastos: clulas musculares) y un promotor constitutivo del virus SV40 (virus animal cuyo promotor funciona en un amplio rango de clulas de mamferos). Como resultado, se observ la brusca formacin de un mioblasto incluyendo la formacin de un sincisio a partir de clulas uninucledas.

16. GENTICA DEL DESARROLLO y EPIGENTICA

Gen quimrico Gen virus SV40 Gen myoDI prom Sec. cpside viral prom Sec. estructural promotor Sec. estructural

a) Explique cmo tan abrupta "transdetermina-cin pudo ser causada por un solo gen. b) Por qu no se utiliz el gen myoDl con su propio promotor para realizar el experimento y se lo cambi por uno constitutivo? c) Podra ocurrir lo mismo con cualquier clula de cualquier otro tejido, como ser una clula neuronal? Por qu? 2) Para estudiar la regulacin del gen hometico "hairy" de Drosophila, se clon la regin promotora del mismo, reemplazando la secuencia estructural por la del gen indicador lac Z (-galactosidasa de E. coli). Posteriormente, se transformaron embriones sinciciales de Drosophila y se les suministr X-gal en el momento en que normalmente se expresa el gen "hairy", observndose la aparicin de 7 anillos (segmentos)

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coloreados de azul. A continuacin se hicieron deleciones en la regin 5' de la regin promotora para analizar la contribucin de cada parte de esta regin promotora. Como resultado, se identificaron secuencias * Regin promotora gen hairy Regin 5'
CAT y TATA boxes

regulatorias especficas que resultaron ser responsables, individualmente, de la formacin de cada uno de los anillos. Embrin transfectado

Sec. estruct. lac Z 1234567 1 2 6

transcripcin

Para estudiar la accin de estas secuencias, se tom la construccin responsable de la formacin del anillo 6, y con ella se transformaron embriones de moscas mutantes hometicas deficientes para el gen "knirps" y para el gen "Krppel", y otra que expresa el gen "Krppel" en forma constitutiva, con los siguientes resultados: Salvaje - knirps - Krppel expresin constitutiva Krppel Con anticuerpos especficos e hibridaccin "in situ" del mRNA, se ensay la concentracin relativa de los productos de los genes knirps y Krppel en el embrin de las moscas salvajes, observndose la siguiente distribucin: protena Krppel protena knirps

prot. knirps + prot. Krppel

Anillo 6

a) Por qu se utiliz una secuencia estructural de -galactosidasa en lugar de la secuencia estructural del mismo gen, pudiendo disponer de anticuerpos para detectar la expresin de la protena "hairy"? b) Por qu no se elimin la regin promotora conteniendo las CAT y TATA boxes en los experimentos de delecin? c) Cmo explica la disminucin en nmero, de 7 a 1, de los segmentos "teidos" con X-gal en las deleciones? d) En base a los experimentos con mutantes y de deteccin de productos de los genes knirps y Krppel qu funcin cumplen estos productos? En su contestacin considere la posibilidad de que sean receptores de membrana, hormonas, factores de transcripcin, reguladores positivos, negativos, segundos mensajeros y/o protenas especficas de tejidos diferenciados como podra ser la hemoglobina de los glbulos rojos de vertebrados. e) Proponga un modelo de regulacin (un esquema al estilo del opern lactosa) para explicar la funcin de la secuencia regulatoria estudiada en la expresin del gen hairy

INTERFERENCIA/SILENCIAMIENTO E IMPRONTA
3) La impronta genmica ("genomic imprinting") es una rara propiedad que presentan algunos genes de transcribir y expresar slo el alelo derivado del progenitor de un determinado sexo, es decir o del padre exclusivamente, o de la madre exclusivamente y no del otro; mientras que el alelo proveniente del progenitor del otro sexo no se expresa. El alelo que no se expresa es el que se dice que est imprinteado. Cada gen tiene su patrn de imprinting especfico. Se cree que este fenmeno est relacionado con los casos epigenticos de silenciamiento pretranscripcional descriptos en plantas dado que la metilacin representara una impronta o marca a nivel molecular para distinguir el alelo paterno del materno (para una revisin del tema: Cell 77, 473-476 [1994]). El gen del factor de crecimiento "insuline-like growth factor" tipo 2 (IGF2) humano, que se expresa en las etapas embrionaria y fetal, est sujeto a "imprinting". El "imprinting" est asociado a un grado de metilacin diferencial en cada uno de los alelos, que se establece en las gametas, no siendo claro an cmo es que un patrn de metilacin se mantiene en el DNA de las clulas somticas de la descendencia, y cmo es capaz

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de borrarse en la lnea germinal de la descendencia del sexo opuesto. Para estudiar este fenmeno en el gen del IGF2, se aprovech uno de sus polimorfismos -que cae en una regin del exn 9 que corresponde a la regin 3' no codificante-, que da dos alelos posibles: uno que presenta el sitio para la enzima Apa I, y otro que carece de l (Nature Genetics 4, 98-101 [1993]). Usando dos oligonucletidos especficos del exn 9, los autores del trabajo amplificaron una regin de 236 pb que abarca a dicho sitio. La enzima Apa I corta al fragmento amplificado a partir del primer alelo mencionado, en dos fragmentos: uno de 173 pb y otro de 63 pb, como muestra la figura: Ud. es un bilogo muy riguroso y crtico (eso est bien) y duda de mucho de lo que le dicen sus docentes (eso no est tan bien) con respecto a la existencia del "imprinting", queriendo revisar Ud. mismo lo hecho por los autores del trabajo. Disee un protocolo experimental para determinar si el gen IGF2 est sujeto a "imprinting" y si ste es de tipo materno o paterno, indicando: a) Qu individuos analizara? b) Qu genotipo (homocigota o heterocigota con respecto al sitio Apa I) eligira en los individuos a analizar? Cmo determinara esos genotipos? c) Qu tcnicas usara? Qu tipo de muestra usara de cada individuo (DNA o RNA?). 4) Las plantas poseen diversas estrategias de defensa para contrarrestar el ataque de patgenos. En Arabidopsis, por ejemplo, la presencia de un pptido correspondiente a los ltimos 22 residuos de la flagelina de bacterias (flag22) sirve de seal para desencadenar grandes cambios en los niveles de transcriptos de ciertos genes. Navarro et al. (2006) hallaron que la respuesta a flag22 involucraba principalmente cuatros genes, cuyos patrones de abundancia de transcriptos se muestran a continuacin:
1.25 Cantidad 1 Relativa 0.7 de mRNA 0.50 0.25
Sin flag22 Con

minutos y medir los niveles de mensajero de GFP se observaron los siguientes resultados:
2
Sin flag22 Con flag22

1 Cantidad relativa de mRNA GFP

TIR1 ABF

ABF

miR39

TIR1

ABF

ABF

miR39

TIR1, ABF2, ABF3: receptores de auxinas miR393: microRNA 393 *Todas las diferencias son significativas a) Cmo se modificaron los niveles de mRNA en cada caso? Con el objeto de estudiar la regulacin de estos genes en presencia de patgenos se obtuvieron plantas transgnicas que contenan la regin promotora de cada uno de ellos ro arriba de la regin codificante de GFP (Green Fluorescent Protein). Al someter las plantas transgnicas a tratamiento con flag22 durante 30

b) Cmo interpreta los resultados del experimento 2 teniendo en cuenta lo observado en el experimento 1? Qu tipo de regulacin estara siendo ejercida en cada caso? El anlisis de secuencia de la regin codificante de TIR1, ABF2 y ABF3 revel que los tres genes poseen una regin conservada de 25 pb que puede ser reconocida por microRNAs. c) Proponga un mecanismo para explicar los cambios observados en los niveles de transcriptos de los cuatro genes en respuesta a flag22. 5) La ingeniera gentica de plantas para conferir resistencia a enfermedades virales tiene larga data. Las primeras transgnicas resistentes a virosis, lo fueron por expresin de funciones (protenas) virales (como la cpside) las cuales interfirieren la estrategia de multiplicacin de los virus. Tambin se intent bloquear la traducibilidad de los mensajeros virales expresando secuencias de ARN complementario (llamadas de orientacin antisentido). En los ltimos tiempos se enfoc en el aprovechamiento del mecanismo de defensa llamado silenciamiento post-transcripcional mediante la expresin de secuencias nucleotdicas virales. En un trabajo reciente, Vazquez Rovere y col. (Arch. Virology 146:1337, 2001), obtuvieron papas transgnicas que expresaban las siguientes 3 construcciones genticas conteniendo el gen de la replicasa del virus PLRV (ORF2b): Aclaraciones: ATG-rep: Construccin que contiene el gen de la replicasa con el codn de iniciacin (ATG AUG); No codific-rep: Idem sin ATG; Anti-rep: construccin antisentido (la secuencia se encuentra invertida); RB y LB: bordes derecho e izquierdo del segmento T de Agrobacterium tumefaciens; 35S, mas5: promotores constitutivos fuertes; t-nos, mas3 terminadores de transcripcin; ORF2b: gen de la replicasa; nptII: gen de resistencia a kanamicina; Flechas: indican la orientacin 5 3de la secuencia.

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a) Para qu se us la resistencia a kanamicina? Las plantas transgnicas fueron desafiadas con el virus y se encontraron plantas con resistencia (y tambin con susceptibilidad) con cualquiera de las 3 construcciones. Para caracterizar el mecanismo que media esta resistencia, se bombardearon hojas de las papas transgnicas utilizando un can gnico y una construccin que codifica para una protena de fusin GUS::replicasa (Fig. 2, la GUS -glucouronidasa es detectable en forma similar a la -lac). La fusin, sin embargo, afecta parcialmente la actividad enzimtica. Es decir, la enzima funciona un poco peor, pero fun-

ciona. De esta forma se consigue la expresin (transitoria) de las construcciones genticas bombardeadas en las clulas impactadas y su fcil visualizacin en forma de puntos azules (fig.2). Nota: No se grafican las transgnicas con la construccin ATG-rep porque dan casi igual que las no codific-rep. b) Para qu se hicieron los experimentos de la Fig. 2? Interprete los resultados: i) Cmo me doy cuenta de cunto afecta a la actividad GUS la fusin con la replicasa? Qu resultados comparo para evaluarlo? ii) Para qu sirven, adems, los experimentos realizados con la construccin 2 (GUS slo)? iii) A qu atribuye las diferencias entre A1 y A2 y entre S1 y S2? Qu relacin tiene con la resistencia? iv) Cul mecanismo (mediado por protena, mediado por bloqueo de la traduccin antisentido-, mediado por silenciamiento posttranscripcional) media la resistencia? Aclaraciones: GUS-rep: construccin gentica capaz de expresar una protena (y su mRNA) de fusin GUS+replicasa, GUS: Idem slo GUS. uid-A: gen codificante para GUS; A1 y A2 son 2 plantas transgnicas representativas para la construccin antisentido (Anti-rep); S1 y S2 plantas con la construccin sentido (no codific-rep). (S) y (R) representan plantas susceptibles y resistentes. Ken (NT) es un control de la misma variedad de papa que el resto (Kennebec) pero no transformada.

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16. EVOLUCIN, BIODIVERSIDAD Y MEJORAMIENTO

tocondriales de sus hospedantes. De esta manera se puede tener una relativa precisin para evoluciones que, se supone, tienen menos de 100 aos de antigedad. A partir de un estudio utilizando RT-PCR de secuencias nucleotdicas virales de distintos aislamientos de HIV y sus variantes en humanos, as como los virus del tipo SIV en monos, se identific una regin que muestra un gran polimorfismo, la cual se quiere usar para hacer un anlisis filogentico y un estudio poblacional de cuantificacin de la variabilidad gentica. a) Por qu se utiliz RT-PCR y no clonado molecular de cDNA (y posterior secuenciacin de los clones)? Cmo se relaciona esto con el concepto de las cuasiespecies en virologa? b) Se muestran las secuencias de cuatro aislamientos:

1) La epidemia global del SIDA es provocada por el HIV, un retrovirus que infecta linfocitos. Se conocen al menos 2 variantes llamadas HIV-1 y HIV-2, siendo el HIV-1 el causante principal de la epidemia) Se especul mucho sobre su origen y ha habido muchas versiones como que el virus fue diseado en un laboratorio de ingeniera gentica hasta otras en las que mdicos a la antigua se inyectaron suero de monos para probar proteccin (vacunas) contra determinadas enfermedades y permitieron as el ingreso del HIV al husped humano ayudando a cruzar barreras interespecficas.

1. 2. 3. 4.

AGGCC AAGCC ATAGC TGTCC AGGCA AAGAC ATACC TGACC AGGCC AAGAC ATAGC TGTCC AGGCA AAGAC ATACC TGTCC

Mono verde africano Mono sootey mangadey Mono sykes HIV-2 Mandril

chimpanc ZR59

HIV-1
Independientemente de esta ltima hiptesis, siempre se especul acerca de la relacin evolutiva con la familia de SIVs (virus de inmunodeficiencia de simios) que presentan chimpancs, mandriles y otros simios, los cuales no son patognicos en sus huspedes pero que, al transferirse a los humanos, pudieron haber adquirido propiedades patognicas hacia el mismo. Debido a su particular sistema de replicacin, las enzimas que intervienen no tienen mecanismos de correccin eficientes para los posibles errores de copia de cidos nucleicos. Por lo tanto, el reloj molecular es mucho ms rpido que para los genes nucleares o mi-

Construya una matriz de distancia gentica simple expresada como el nmero de diferencias nucleotdicas por sitio polimrfico para cada par de secuencias comparadas (por ejemplo, las secuencias 1 y 2 tienen 20 nucletidos y tienen 4 diferencias 4/20 = 0,2). c) Qu secuencias se encuentran ms relacionadas entre s? d) Construya un fenograma con estos datos e) Podra proponer una posible secuencia evolutiva de cambios? Qu tiene que ver esto con el principio de parsimonia? f) Podra asignar a una de las secuencias el papel de primitiva y otras de evolucionadas? Qu necesitara para poder hacerlo? En un trabajo publicado por Wain-Hobson (Nature 391:531, 1998) se propone un rbol filogentico como el que se muestra a continuacin. g) Opina que la 1 2 3 4 clasificacin en HIV-1 y 1 0,2 HIV-2 refleja 2 correctamente la 3 taxonoma de este virus? 4 El origen del HIV, es monofiltico o polifiltico? Discuta. h) En 1998 caus mucho asombro el anlisis de una muestra de sangre conservada desde 1959 perteneciente a un individuo africano de sexo masculino (ZR59). Si bien no se pudo secuenciar completamente, fue suficiente para ubicar su relacin evolutiva en el centro de HIV-1. Como Ud. sabe, el SIDA se hizo conocido (por afectar a actores como Rod Hudson) a fines de los 80 y principios de los 90 (en ese momento se lo llam peste rosa) Qu conclusiones puede sacar sobre la antigedad de la enfermedad y su evolucin?

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Paciente C Paciente A Paciente G Paciente B Paciente E Dentista CL 1 CL 2 Paciente F CL 3 CL 4 Paciente D

i) Cun altas le parece que pueden ser las probabilidades de contagiarse de SIDA de un chimpanc infectado con SIV? Porqu? La rapidsima velocidad de evolucin se puso de manifiesto en un sonado estudio a nivel de epidemiologa molecular con pacientes de un dentista en Florida, Estados Unidos, en la dcada del 90 (ver figura, CL son controles locales de pacientes de las inmediaciones, con SIDA, pero que no tuvieron ningn contacto o relacin con el dentista y sus pacientes). j) Podra Ud. confirmar con estos datos que las prcticas dentales hechas sin las debidas precauciones deben ser consideradas como un factor de riesgo? Considera que todos los pacientes se enfermaron por esta causa? Para qu se utilizaron controles? Porqu fueron locales y no externos? Le permite esto inferir que todos los casos analizados provienen de un origen comn (monofiltico)? 2) En un trabajo de un grupo de investigacin interesado en filogenia de hominoides, publicado en Mol. Biol. Evol. 7, 203 (1990), se muestran las secuencias alineadas de una regin transcripta (3500 pb) del gen rRNA 28S de varios primates. En la tabla se presentan los valores tabulados como diferencias encontradas entre los diferentes pares.La parte del gen elegida es lo suficientemente conservada para no dar variaciones intra-especie (entre individuos) y relativamente variable para dar pequeas diferencias (puntuales) comparando con otras especies o gneros.
Hum. Chimp gorila humano chimpanc gorila orangutn ratn 19 31 53 242 Orang ratn

b) Sobre la base de los datos, los autores concluyen que el chimpanc es el primate ms cercano al humano. Est Ud. de acuerdo? c) Los autores no incluyeron "gaps" (huecos que aparecen en alguna de las secuencias al alinear todas) en el anlisis porque dicen que uno no est seguro de que los "gaps" fueron consecuencia de eventos simples nicos de mutacin? Ud. esta de acuerdo con esa decisin de los autores? d) Conoce algn otro mtodo molecular que pudiera aportar ms datos para confirmar la teora concluida en b? 3) Otro caso evolutivo de inters epidemiolgico es el de la BSE (encefalopata espongiforme bovina o mal de la vaca loca causada por priones) y que ya se coment en un problema de la gua de herencia no mendeliana. Se sabe que la protena normal debe estar involucrada en la sealizacin nerviosa dado que se encontraron alteraciones en los niveles de GABA en ratones knock-out para el gen correspondiente. Una de las particularidades epidemiolgicas de esta enfermedad es que la misma es transmisible desde ovejas enfermas de scrappie a bovinos que se alimentan de tejidos ovinos infectados. Los humanos desarrollan la enfermedad de Creutzfeld-Jacobs (o kuru) si consumen tejidos bovinos infectados, pero nunca pudo demostrarse la infeccin por consumo de carne ovina. Los genes para priones de 33 especies distintas han sido secuenciados y permitieron construir un fenograma como el de la figura.

a) La topologa del rbol es bastante inusual en algunos aspectos de relaciones entre primates Orangutn Humano Gorila Chimpanc Gibn Cabra Oveja Vaca (comparar con el obtenido en el problema 2) Cules aspectos?
b) Independientemente de ello, la posicin de los rumiantes (respecto de los primates) es coherente. Permite este rbol inferir la cadena epidemiolgica oveja vaca humano? Por qu? c) Una peculiaridad llam mucho la atencin. Los OTUs marcados en negritas subrayadas tienen una serina en la posicin 143 y una histidina en la 155, mientras que la mayora de los otros priones tienen asparragina y tirosina en dichas posiciones. Cmo se puede explicar este resultado? Le parece que, para el

29 57 245

59 239

250

a) Para qu se incluye al ratn?

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caso de este gen, vacas y humanos tienen un origen filogentico comn? Surge de estos resultados alguna nueva interpretacin epidemiolgica? d) Opine si el resultado experimental observado: que ratones y ovejas pueden ser infectados con BSE (aunque carecen de las 2 modificaciones mencionadas) contradice las conclusiones de c). 4) Se postula que los cromosomas sexuales de los humanos evolucionaron a partir de autosomas. Se cree que los actuales (y escasos) pares de genes que an recombinan entre su posicin en el cromosoma X e Y son fsiles moleculares de una homologa mucho ms extensiva del pasado evolutivo. En un trabajo de Lahn y Page (aparecido en Science 286:964, 1999) se estudi la evolucin comparando secuencias genes autosmicos ancestrales (llamados ancestrales porque su homologa con genes autosmicos actuales es muy baja) que persisten en los cromosomas X e Y. Se tomaron en cuenta 2 variables: 1) la posicin de los genes en el mapa y 2) la divergencia de la secuencia nucleotdica. a) El mapeo se realiz mediante la utilizacin de hbridos somticos irradiados. El mapa se ilustra en la figura de la izquierda. En el cromosoma X estos genes se concentran en la regin distal del brazo corto. En cambio, aparecen mucho ms dispersos en el cromosoma Y. b) La comparacin de secuencias se hizo analizando las mutaciones silenciosas (tambin llamadas sustituciones sinonmicas) que no cambian la secuencia de aminocidos de la protena. A partir de este anlisis se hizo una cuantificacin mediante el parmetro Ks (promedio de sustituciones sinonmicas por sitio, estadstico que sirve para estimar el tiempo evolutivo transcurrido desde que las secuencias que se comparan empezaron a divergir por ausencia de recombinacin homloga; en este caso, entre cromosomas X e Y). i) Por qu se considera que las sustituciones sinonmicas o silenciosas son prcticamente neutras respecto a la seleccin? ii) Porqu se eligieron estas mutaciones en particular (y no otras) para este clculo de "edad" de genes? Sorprendentemente, encontraron 4 grupos bien diferenciados de genes: 1) con valores de Ks de 0,94-1,25; 2) 0,52-0,58; 3) 0,23-0,36 y 4) 0,05-0,12. Las diferencias son estadsticamente significativas. Ms sorprendentemente, los genes pertenecientes a cada uno de los 4 grupos mapean juntos en el cromosoma X y se ordenan en el mismo por edad. Es decir, el grupo 1 se ubica en el brazo largo, el 2 en el brazo corto (cerca del centrmero), el 3 en el medio del brazo corto y el 4 en el extremo del brazo corto (ver de nuevo la figura de arriba). En cambio, en el cromosoma Y no se observa este ordenamiento. Ud. sabe (de cuando vio alteraciones estructurales) que las inversiones cromosmicas constituyen un mecanismo que impide la re-

combinacin homloga, porque los alelos de los a genes homlogos dejan b de aparearse en la meio- 4 sis. c iii) le ayudan estos co- 3 nocimientos a entender las diferencias de edades de los genes contenidos estos 4 segmentos 2 cromosmicos? Por lo tanto, se postula a que estos resultados reflec jan 4 eventos evolutivos puntuados de inversin cromosmica (y eventual b prdida de DNA de los segmentos) del cromosoma Y, que llevaron a la 1 prdida de ordenamiento por grupo de edades de estos genes en el cromosoma Y (ver segunda figura). Esto sugiere que la inversin ms reciente (grupo 4) ocurri hace 30-50 millones de aos (en la lnea de los primates), la del grupo 3 hace 80-130 Ma, etc. Desde el punto de vista de la evolucin de los grandes grupos, esto significa que el sistema de determinacin del sexo basado en cromosomas X e Y apareci muy tempranamente en la lnea evolutiva de los mamferos. iv) Indique si estos datos corroboran (o no) que el sistema de determinacin Z-W de las aves es independiente (o no) del de los mamferos. Qu podra decir del sistema de determinacin del sexo de los reptiles de los que se originaron mamferos y aves? Otro resultado de inters es que los genes SOX3 y SRY (genes que primariamente determinan el sexo) tienen valores de Ks que los ubican entre los genes ms antiguos (es decir, genes originalmente homlogos y que divergieron en el transcurso de la evolucin). v) Por qu estos genes son importantes? Finalmente, otro resultado de inters es el del gen XIST, involucrado en la heterocromatinizacin de uno de los cromosomas X en las mujeres. Este gen se ubica en el grupo de genes ms reciente, contrariando hiptesis preexistentes que indicaban que surgi contemporneamente con la determinacin del sexo basada en el sistema X-Y. vi) Qu funcin cumple la heterocromatinizacin del cromosoma X y cmo supone que era la situacin antes de que sta apareciera? Podra postular si esta heterocromatinizacin es evolutivamente tarda o temprana?

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Emergencia de los cromosomas sexuales despus del primer evento inversin cromosmica del cromosoma Y (320-240 Ma) Expansin de la zona pseudoautosmica (120-130 Ma) Segunda inversin del Y (130-170 Ma) Tercera inversin del Y (80-130 Ma) 3 2 4 3 2

Cuarta inversin del Y (30-50 Ma)

Autosomas Autosomas reptiles

X Y XY monotremas

Y XY marsupiales

X Y X Y XY en mamferos placen- XY humanos tarios no simios

MEJORAMIENTO
5) La (kappa) -casena es una protena presente en la leche bovina y juega un papel importante en el proceso de elaboracin de quesos. Un alelo del gen de la casena, llamado A, produce un tipo de casena que da un queso de calidad superior a la que da otro alelo,
gtgctggag(t/c)aggtatcctag

llamado a. La nica diferencia entre ellos radica en una base que abarca el sitio de restriccin para la endonucleasa Hind III, lo cual hace que el sitio est presente en A y ausente en a:

sitio Hind III +/regin 3 no codificante regin codificante DNA amplificado (874 pb)
ggtcacaacaa cgtg agatg

Al hacer PCR con iniciadores ("primers") especficos (indicados en la fig.) sobre muestras de sangre de cinco toros y posterior tratamiento con Hind III, se obtuvieron los siguientes resultados (Animal Genetics 22, 11 [1991]):

pb 874 521 353

a) Qu clase de marcador estamos analizando: dominante o codominante? b) Cul es el genotipo de los toros testados? c) Si Ud. fuera un rico y poderoso productor agropecuario que abastece leche a una importante fbrica de muzzarella, - cules bovinos elegira para realizar apareamientos dirigidos? - seleccionara adems basndose en otras caractersticas fenotpicas? - financiara un proyecto de investigacin a realizar por un Licenciado en Biologa para optimizar (por ejemplo automatizar) la tipificacin genotpica?

d) Qu ventajas tiene este mtodo sobre el clsico de RFLP? e) De qu otros tejidos se podra extraer DNA de los toros? f) Se podra determinar el genotipo de vacas, haciendo PAGE no desnaturalizante de protenas en muestras de leche? 6) Varios trigos argentinos portan la translocacin 1BL/1RS trigo-centeno (es decir son transgnicos con muchos genes de centeno). El segmento de centeno translocado lleva genes de resistencia a roya de la hoja, del tallo y a oidio. Adems, algunos autores encontraron una asociacin positiva entre dicha translocacin y el rendimiento. Por otro lado, evidencias ms recientes muestran un efecto detrimental sobre la calidad panadera debido a la presencia de un gen en el 1RS que codifica para una secalina (protena de reserva de centeno) que afecta a la interaccin de las gluteninas (protenas de reserva de trigo) que constituyen el gluten. Por eso muchos programas de mejoramiento estn tratando de eliminar esta translocacin de las variedades comerciales ms modernas sin desaprovechar el resto de los alelos fijados en las variedades que estn bien adaptadas. a.- Conociendo el mtodo de retrocruza. Cmo hara para obtenerlo? b.- Evale las siguientes tcnicas para hacer la seleccin pertinente en cada generacin de retrocruza en cuanto a:

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i) descripcin de cmo sera el modus operandi de la tcnica involucrada ii) complejidad del equipamiento y del personal involucrado (es decir, qu instrumentos y nivel de capacitacin se requiere?) iii) posibilidad de masificar el anlisis (relacin tiempo empleado por muestra) Citolgicas: recuento cromosmico, anlisis cariotpico, bandeo C Bioqumicas: electroforesis de protenas de reserva (secalinas vs. gluteninas-gliadinas), isoenzimas, ELISA de secalinas. Moleculares: Microsatlites, hibridacin in situ Inoculacin con roya c.- Cul recomendara? Por qu? Nota: el satlite del brazo corto 1RS del cromosoma de centeno no se expresa en el fondo gentico del trigo. El cultivar de trigo que lleve centeno tendr una constitucin 42-2 (cromosomas-satlites) en lugar de 42-4 de un cultivar sin genoma de centeno. 7) El vigor hbrido o heterosis es una interaccin que se produce en genotipos heterocigotas muy buscada en mejoramiento animal y vegetal por su asociacin con caracteres productivos como el rendimiento. Adems, en muchos casos se producen relaciones epistticas positivas importantes cuya base bioqumica o molecular est lejos de ser entendida. Las especies autotetraploides como la papa ofrecen la posibilidad de obtener tetrahbridos (heterocigosis con hasta 4 alelos diferentes).

A la papa comn (Solanum tuberosum spp tuberosum) se le pueden aplicar muchas tcnicas biotecnolgicas como son: i) cultivo de anteras (es decir, polen) para reduccin del nmero cromosmico ii) fusin de clulas somticas (de protoplastos) iii) cruzamientos amplios (cruzamientos interespecficos con otras especies de nmero cromosmico compatible) Adems, tiene especies silvestres relacionadas con genes interesantes para el mejoramiento pero que, en general, son diploides y autgamas (por lo tanto con un alto grado de homocigosis), pero que tambin admiten la realizacin de cruzamientos interespecficos mediante castracin e inoculacin de polen. Ud. dispone genotipos caracterizados de 4 especies (Solanum tuberosum tuberosum -4n-, Solanum tuberosum andigena -2n-, Solanum chacoense -2n- y Solanum phureja -2n-, todas cultivadas en distintos pases) con varios genes agronmicos de inters y quiere combinarlos de alguna manera. a) Disee un mtodo para la obtencin de tetrahbridos de estas 4 especies. b) Sabiendo que existe un mapa gentico de RFLPs muy bien caracterizado (con sondas que detectan bandas en todos los cromosomas) en Solanum tuberosum tuberosum y que hay mucho polimorfismo para este tipo de marcadores, indique una forma sencilla de evaluar el grado de xito que obtuvo con la estrategia diseada en a).

BIODIVERSIDAD

8) Ud. es un bilogo muy preocupado por la conservacin de la biodiversidad y le han encargado tratar de armar una coleccin de germoplasma de una especie vegetal o seleccionar un grupo de animales en peligro de extincin para su conservacin en un rea protegida. Como est interesado en mantener la mayor cantidad de diversidad gentica pero el nmero de individuos que puede seleccionar es pequeo, est tratando de establecer parmetros objetivos para su seleccin. Decidi probar con los marcadores RAPD y debe evaluar qu primers y bandas son los ms informativos.Con el primer primer que prueba obtiene el siguiente patrn de bandas:

sencia o ausencia de banda. Felicitaciones! Acaba de construir una MBD (matriz bsica de datos). b) Calcule la frecuencia de presencia de cada banda (alelo). c) Calcule el contenido de informacin polimrfica (PIC) de cada una mediante la frmula de Anderson (1993):
2 PICi = 1 j =1 pij n

a) Cuntas bandas diferentes pudo detectar (aydese de una regla)? Numrelas y arme una tabla con ellas, en la que pondr este nmero en la primera columna y los nombres de los individuos (A, B, C, etc.) en la primera fila. Rellene el cuadro con 0 y 1, segn pre-

donde p es la frecuencia del alelo j para el marcador i. d) Como Ud. est bastante ansioso, y considera que la muestra de individuos aqu analizados es representativo, como as tambin confa en el patrn de bandas obtenidas, quiere avanzar y tener una medida de la diversidad gentica, se decide a estimarla. Para ello utiliza la frmula de Weir (1996). sta est formada por la suma de cuadrados de las frecuencias de los alelos

D = 1

1 i L l

en promedio para L loci, donde p es la frecuencia del alelo i en el locus.

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Anexo: Compendio de preguntas de parciales anteriores (cursos 2000-2006 de verano):

Nota: la inclusin de las siguientes preguntas y, particularmente, las respuestas esperadas que sirvieron de gua para la correccin de los parciales por parte de los docentes, no tienen otro propsito didctico que el de orientar a los estudiantes acerca de cmo son los parciales de la materia y de cmo se corrigen. Aquellas preguntas de parciales que los docentes consideramos que aportaban a la mejor comprensin de algn captulo de la materia, fueron incluidas en la gua de problemas y no se repiten aqu. Algunas de las preguntas de parciales integran ms de un captulo de las clases de problemas. Las preguntas de los parciales de la presente cursada tendrn el mismo espritu pero sern diferentes en sus enunciados. El orden de los temas no es el mismo que en la gua. Regulacin e Ingeniera Gentica 1) Los operones mce de Mycobacte-gal rium tuberculosis (bacteria que produce la tuberculosis) codifica para 500 pP3Rv 200 100 protenas potencialmente involucraRv das en la virulencia de este patgePromotor mce no. En el genoma de M. tuberculosis hay 4 operones mce similares en pP3 -gal secuencia y organizacin, que codifican para protenas secretadas o de membrana y una protena de tipo -gal pJEM15 invasina. Estos genes son exclusivos de las micobacterias y no se encuentran en otras bacterias mejor caracA terizadas como Escherichia coli. Santngelo y col (del INTA CasteB lar) publicaron en Microbiology (2002, 148:29973006) un trabajo C en el que estudian la regulacin de este opern en base a la informacin genmica dispo- a) Qu tipo de efecto tiene la presencia del gen Rv nible. Por un lado conocan las secuencias estructura- sobre la regulacin del gen quimrico? les de los genes mce pero no tenan bien caracterizado b) Si la construccin que interesa analizar es pP3Rv su promotor. Por otro lado, les llam la atencin un para qu se hicieron los experimentos con pP3 y con gen (llamado Rv) ubicado hacia 5 de uno de los ope- pJEM15? rones dado que codificaba para una protena cuya es- c) Por qu se reemplaz la secuencia codificante de tructura predicha por los modelos bioinformticos era mce por la de la -gal? similar a la de algunos factores de transcripcin. Para Para investigar la localizacin del sitio de unin de la estudiar la funcin de este gen realizaron las siguien- protena codificada por Rv hicieron gel-shifting en los que se diferencian electroforticamente los DNAs tes construcciones quimricas: pP3Rv contiene el gen Rv completo (incluyendo el sueltos de los que tienen pegados una protena porque sta les repromotor de Rv), la regin intergnica completa hasta A B C el codn de iniciacin del primer gen mce (es decir, 1 2 3 1 2 3 1 2 3 - trasa su migracin en el gel. Los donde debera ubicarse el promotor de mce). La seDNAs se detectan cuencia codificante para mce fue reemplazada por el por hibridacin con gen lac una sonda del pP3 es igual, pero sin Rv segmento interpJEM15 es el vector vaco (salvo por el gen lac) gnico. Se incubaA, B y C representan segmentos de la regin interron los siguientes gnica (1-100, 1-200 y 200-500 pb hacia 5 del ATG, productos de PCR: respectivamente) A) nucletidos 1Lo primero que hicieron fue estudiar el efecto de in+ 100 B) 1-200, troducir las construcciones quimricas en E. coli obteC) 200-500 con 1) niendo los siguientes resultados: bfer 2) ex tractos de bacterias transformadas de Efecto del gen Rv sobre el promotor mce: E.coli conteniendo la construccin pP3Rv; 3) extracMicobacterias transformadas con tos de bacterias de E. coli conteniendo la construcpJEM15 (vector sin insertos) [barras blancas] cin pP3 pP3 (construccin sin Rv) [barras grises] d) Dnde se localiza el sitio de unin de la protena? pP3Rv (construccin con Rv) [barras negras]

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e) Por qu se utiliz u zaron extrac ctos de E. coli (transforma adas con las construcci iones) y no de o micobacteri ias?

7 kb

3 kb

12 kb E2 370 pb E3 0 pb 8 E4 4 130 pb 0

prom m otor 21 de actina a de tomate t

E1 pb

vector

Respuesta esperada a) Activad as as dor b) La com mparacin e entre la ac ctividad de p3 y p3Rv es lo que permi determin que Rv es un o ite nar elemento a activador (o represor si lo hubiese sido). o i pJEM15 es un control negativo. s

rn s s con en un Souther de DNAs genmicos digeridos c nientes de: a) tomate normal, b) A n Aloe HindIII proven ver c) tomate transgnico hibridando con una son ra, e o; o nda de cDNA de lo ongitud comp pleta. 2) Por qu h habr elegido tomate y no tabaco, por o eje emplo? 3) Analizando la expresin de los mRN de aloe n NAs everin en distinto tejidos de tomate tran na os el nsgnico por la r tc cnica de Nor rthern, usand como son al cDNA de do nda A alo oeverina de longitud co ompleta, se observ lo siRNA de RNA d tomate transgnico de

c) Porque e fcil de de es etectar enzim mticamente y los Aloe vera: hoja ra v az hoja r raz fruto flor resultados n son afect no tados por la expresin d los de _ genes mce endgenos ( (cromosmic cos) de las m micomRNA I A bacterias tra anformadas. d) 100-200 mRNA II A e) Porque n necesito extra de una c aer lula que exp prese la protena Rv, porque si no, nunca podra estu a udiar su efecto. + 2) El Dr. Cu ureta, en su e eterna bsqu ueda de la p cima gu uiente: de la juvent eterna, es tud studi la estr ructura y exp presin a) Cules son los tamaos del mRNA I y mRNA II s I? del gen de la aloeverina que produc una prote a ce ena de b) En el prime esquema u er ubique (con flechas) la p promaravillosa propiedade curativas y rejuvenecedoras as es bab ubicaci del codn de iniciaci y la del de ble n n in en Aloe ver (planta no comestible). Este gen d orira o da ter rminacin. gen a dos protenas dife erentes en las hojas y las races s c) Por qu el Dr. Cureta r reemplaz en su experim n mende la planta por splicin alternativo Sin embar a ng o. rgo, la to el promotor de la aloev r verina por el de la actina de a nica que ti iene propieda ades especia es la de l hoja ales la tom mate? Le p parece que eligi el prom motor ms a adeque se prod duce en cantidades muy p pequeas. Ad dems, cuado para sus propsitos? Por qu? su purificac cin es inefic ciente, con e agravante d que el de d) Qu concl lusiones saca a partir de los resultados a e sus propiedades se ven a afectadas po las fenolox or xidasas del Northern e cuanto a la especificidad tisular del en que se liber de los liso ran osomas cuan estas org ndo ganelas spl licing del RN del gen d la aloeveri NA de ina? se rompen en el proces de homog so genizacin. E es Esta e) Qu suger rencias expe erimentales le hara al Dr. la estructura del gen de la aloeverina a a: Cureta par mejorar la performanc de sus ex ra a ce xpekb 3 kb 12 kb 7 rimentos y as obtener los resultado deseados? os Respuesta 1) tomate, no da nada Aloe vera 3 as a. a: bandas de 7, 3 y 12 kpb. Toma transgni ate ico: E2 E3 E4 E1 1 promotor dem. 2) Porque el tabaco tampoco es comestib 0 pb 130 pb o ble. 210 pb 70 pb 8 3 El tomate, s. Respues alternativ Si la idea es sta va: a Las flechas indican sitio para la en os nzima HindII Los II. vidad, el taba (por su a aco alta dos mRNAs difieren po s orque en uno est present y en la de mejorar la productiv o te oduccin de biomasa) po odra haber si una alter ido rnapro el otro est ausente el ex E3 de 80 pb. El Dr. Cureta xn 0 va e. decidi obt tener tomate transgni es icos transfec ctando tiv interesante 3) a) 790 y 710, b) ATG: Una flecha un poco a la de n erecha del ex xtremo del exn 1 (no en el e n con un pls smido recom mbinante con el gen clona de ado ext tremo porqu siempre ha un extrem 5 de mRN ue ay mo NA la aloeverin en el que h na haba reempl lazado al pro omotor no codificante) o al principio del ex 2. Stop: u n una nativo de la aloeverina por el de la actina de to a a omate, echa un poco a la izquier del extremo derecho del o rda fle con el fin de analizar la expresin d mRNAs de aloede e exn 4 (siempr hay un se re egmento 3 no codificant a n te verina en lo distintos te os ejidos: e o 1) Sabiendo que los to o omates no t tienen ning gen 3 del codn de terminacin), c) El promotor nativo es n poco eficiente y lo reemp e plaza por uno constitut u tivo endgeno h homlogo a de la aloeverina, dib al buje el fue erte, pero po odra haber elegido mejo el promot or tor: patrn de bandas de hib bridacin que esperara o e obtener por ej. uno es specfico de fruto de tom mate, que es el s

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tejido de inters para alimentacin. d) Aparentemente, el sistema que permite reconocer al exn 3 como tal, es especfico de hoja y de especie y, tal vez, de gen (pero eso no lo podemos determinar con estos datos). e) Usar una construccin SIN intrones para evitar el procesamiento incorrecto. 3) Para el opern lactosa de Escherichia coli, indique el genotipo de al menos uno de los diploides parciales posibles capaces de producir beta-galactosidasa (codificada por el gen Z) constitutivamente y permeasa (codificada por el gen Y) en forma normal (es decir inducible con anlogos de la lactosa) usando la nomenclatura practicada en las clases de problemas. Respuesta: lacI+ lacOc lacZ+ lacY- / lacI+ lacO+ lacZ- lacY+ (en alguno de los 2 genotipos lacI puede ser lacI-) 3) En la pelcula Blade II, el hroe (Blade) es un semivampiro que lucha a favor de la humanidad con los vampiros malos que quieren dominar el mundo. En una escena trascendental de la pelcula, Blade es capturado para poder extraer su sangre (y su ADN) porque los vampiros estaban diseando nuevas variantes transgnicas clonadas con mejor adaptacin. Si bien ya haban logrado obtener vampiros resistentes a la plata modificando el gen de la metalotionina, queran extraer de Blade un gen de resistencia a la luz solar. Ud. ha sido contratado por los vampiros para hacer este trabajo (le han prometido vida eterna como forma de pago) y dispone de un laboratorio de ingeniera gentica excelentemente equipado que le permite, entre otras cosas, cultivar in vitro vampiroblastos (clulas equivalentes a los fibroblastos humanos). Los vampiroblastos extrados de vampiros comunes se lisan en presencia de luz solar, mientras que las clulas extradas del cuerpo de Blade son luminoresistentes. No se dispone de informacin alguna sobre la secuencia del gen a clonar, ni anticuerpos, ni secuencias parciales de aminocidos de la protena. Tampoco se pueden planear cruzamientos genticos de Blade con vampiresas para estudiar su progenie porque llevara mucho tiempo. Inspirndose en el ejemplo histrico del clonado molecular de los primeros oncogenes qu estrategia de clonado y caracterizacin funcional del gen de resistencia a luz solar propondra? Respuesta: En caso de seguir los pasos histricos descriptos en el Recombinant DNA de Watson y col.: se extrae ADN total de Blade (slo o con una etiqueta tag- de secuencia nucleotdica conocida ligada) y se lo usa para transfectar vampiroplastos por la tcnica de coprecipitacin con fosfato de calcio. Despus se exponen los vampiroblastos a la luz y se extrae ADN total de las clulas transgnicas resistentes y se fabrica una genoteca en fago lambda. Se releva (screenea) la genoteca con ADN repetitivo de Blade (el equivalente a secuencias Alu) o con la sonda para el tag para identificar el ADN procedente de Blade. Se confirma la identidad del clon de lambda por transfeccin de vampiroblastos que se convierten en luminoresistentes.

Con tcnicas ms modernas se aislara el ADN de Blade y se lo clonara en BACs (se puede aceptar que sea en otros vectores como csmidos o en fagos lambda). Con mezclas (pooles) de clones recombinantes se transfectan vampiroblastos para identificar clulas luminoresistentes (por electroporacin o usando liposomas). A las mezclas que producen clones positivos se las separa en clones individuales hasta identificar el clon conteniendo el gen de inters. Una vez identificado el clon se subclona y secuencia el inserto para ver si hay ORFs candidatos, los cuales son testados funcionalmente de la misma manera. 4) La Dra. Romntica est intentando encontrar genes que aceleren la floracin. Con este objetivo en mente procede a transformar plantas de Arabidopsis thaliana mediante la utilizacin de Agrobacterium, con la siguiente construccin:

LB y RB: bordes izquierdo y derecho del T-DNA, 35S: enhancer fuerte y constitutivo, nptII: gen de resistencia a kanamicina Pnos: promotor constitutivo, tnos: terminador Entre las miles de plantas generadas encuentra una mutante (M) que florece en la mitad de tiempo que las plantas salvajes (wild type = wt). A partir de una hoja de esta planta extrae DNA, lo digiere con BamHI, lo corre en un gel de agarosa, transfiere a una membrana y lo revela con una sonda radiactiva correspondiente al TDNA completo. Cuando cruz esta planta con una planta salvaje, dentro de la descendencia, algunas plantas presentaron floracin temprana y otras no. Al repetir el Southern blot con 10 plantas de la F1 se obtuvieron los siguientes resultados:

a) Para qu se incluy el gen quimrico npt II en la construccin? b) Cul fue el objetivo de introducir un enhancer suelto no acompaado de un promotor o de una secuencia estructural? c) Cree que el hecho de que se observen dos bandas en el mutante parental se deba a que BamHI corte dentro del TDNA o a qu se insertaron dos T-DNAs (en lugar de uno) en ms de un lugar en el genoma? Analice teniendo en cuenta los resultados obtenidos con la F1. d)Qu plantas de la F1 seguira analizando? Justifique. El hecho de conocer la secuencia de la construccin utilizada le permiti a la Dra. Romntica median-

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te PCR, secuenciacin y finalmente comparacin con la base de datos del genoma de Arabidopsis, identificar el sitio exacto de insercin del T-DNA. Este sitio de insercin se encuentra 1 kpb ro arriba (5) de un marco de lectura abierto an no estudiado (ORF4329). e) Qu efecto cree que tiene la insercin del T-DNA sobre el ORF4329? Qu experimento hara para comprobarlo? Muestre mediante un diagrama los resultados esperados. f) Cree que el ORF4329 es un gen inductor o represor de la floracin? Disee un experimento complementario al realizado por la Dra. Romntica que, mediante ingeniera gentica, le permita comprobar su hiptesis, indicando los resultados esperados. Recuerde que en la transformacin mediante Agrobacterium el T-DNA no se integra mediante recombinacin homloga (en biobalstica tampoco). g) Como Arabidopsis es un yuyo y sus flores son bastante feas, un estudiante de doctorado de la Dra. Romntica est interesado en ver si los rosales tambin tienen un gen homlogo al ORF4329. Cmo lo hara experimentalmente sabiendo que el genoma del rosal no est secuenciado? En caso de que haya un gen homologo al ORF4329 presente, cmo clonara el gen homlogo completo? Respuestas esperadas a) Como gen marcador selectivo que permite seleccionar las plantas transgnicas de las no transgnicas durante la regeneracin de plantas en un medio conteniendo el antibitico kanamicina b) Porque el objeto del experimento es que este enhancer estimule constitutiva y fuertemente los promotores cercanos al sitio de insercin del segmento T con la esperanza de que alguno de ellos estimule la floracin temprana. c) No puede haber ocurrido que haya slo un sitio de insercin y que BamHI corte dentro del DNA-T pues en la F1 las dos bandas segregan independientemente. Seguramente el DNA-T se insert en 2 sitios distintos. d) Seguira analizando alguna de las siguientes plantas: 1, 6 o 9 ya que presentan floracin temprana, pero no heredaron el inserto del T-DNA no relacionado con la induccin temprana de la floracin. El descartar las plantas 4, 7 y 10 facilita los pasos siguientes de identificacin del sitio de insercin. e) Dado que el T-DNA no interrumpe un gen ni el promotor mnimo, pero s se ubica cercano al promotor, la insercin del DNA-T estara aumentando la transcripcin del ORF4329 mediante los enhancers 35S. Para comprobar esta hiptesis habra que realizar un Northern partiendo de mensajeros de plantas normales y mutantes (sera interesante comparar tambin tejidos florales y no florales ya que el enhancer 35S es constitutivo) utilizando una sonda complementaria al ORF4329. f) Es un inductor de la floracin pues al aumentar su expresin se adelanta la floracin. Para comprobarlo se podra hacer un antisense del ORF4329 y espero

ver un retraso o ausencia de floracin. Si repito el Northern vera menos mensajero que en el normal. g) Otra respuesta alternativa que pueden pensar los alumnos sera realizar un knock out de ese ORF. En realidad tericamente no sera correcto pues en plantas no suelen realizarse knock outs, pero ellos probablemente no lo sepan (conceptualmente no importa, tcnicamente, lo knock outs en la actualidad, salvo en bacterias, se hacen por interferencia transformando transitoriamente con RNAi o establemente con construcciones que expresen iRNA). Adems est la aclaracin de que la integracin del T-DNA no es por recombinacin homloga y s saben que para hacer un knock out dirigido se requiere recombinacin homloga. h) Hara un Southern usando como sonda al ORF4329 y condiciones de baja rigurosidad en la hibridacin. Para clonarlo hara una genoteca y localizara el gen homlogo mediante hibridacin con la sonda de Arabidopsis. 5) Los ritmos circadianos que corresponden a ciclos de aproximadamente 24 horas permiten a los organismos regular su actividad con la alternancia danoche. Aunque estos ritmos son autnomos, algunos estmulos externos, tales como la luz, pueden poner en hora este reloj interno. En mamferos, existe un marcapasos central, ubicado en el ncleo supraquiasmtico (NSQ) del hipotlamo anterior. Varios genes estn involucrados en el mecanismo molecular del reloj interno, existiendo entre ellos lazos de retroalimentacin positiva y negativa a nivel de la expresin y de la actividad de las protenas que codifican. Se sabe que la fase de este marcapasos central se puede adelantar con un estmulo lumnico durante la noche relativa que es captado en la retina y llevado al NSQ a travs del tracto retino-hipotalmico (que libera el neurotransmisor glutamato) y que este cambio de fase est asociado a un aumento rpido de la expresin del gen Per1. Ro arriba (hacia 5) de este gen se encuentra una secuencia cre (elemento de respuesta a cAMP), a la cual se puede unir en ciertas condiciones el factor de transcripcin CREB. Se realiza el siguiente experimento: a un cultivo sincronizado de clulas del NSQ de ratn se lo estimula durante la noche relativa con concentraciones adecuadas de glutamato (provoca el mismo efecto que la luz provoca in vivo) o db-cAMP (dibutiril cAMP: anlogo del cAMP que puede atravesar la membrana celular) o con solucin salina (control). Despus de 30 minutos se extraen RNA y protenas. Northern Blot con sonda para Per1: Control Glut db-cAMP

Relacin entre CREB fosforilado (P) y no fosforilado Relacin CREB-P/CREB Control Glut. db-cAMP 0,3 4,2 2,2

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Esta relacin se determin realizando Western Blot con anticuerpos anti-CREB y anti-CREB-P. Para poder confirmar el rol de CREB se construy el siguiente sistema indicador (reportero) y se transfect en clulas del NSQ en cultivo. Prom: promotor del gen Per1. cre
Prom

Sec estr.gen luc

La luciferasa (codificada por la secuencia estructural del luc) es una enzima que reacciona con el agregado de luciferina produciendo luminiscencia. Se ensaya la actividad de estas clulas en las siguientes condiciones: + inhibidor de AC - (baja expresin) - glutamato - sin inhibidor - (baja expr.) +++ (alta expr.) + inhibidor de AC + (expr. media) + glutamato - sin inhibidor AC (adenilato ciclasa): enzima que sintetiza cAMP a partir de ATP, responsable del aumento de cAMP durante la transduccin de seales de diversos estmulos. Interpretar estos resultados. Se sospecha que el glutamato ejerce su accin va cAMP pero que esta podra no ser la nica va en que lo hace. Qu opina acerca del rol de CREB en los dos tipos de estmulo? Justificar. Respuestas a) Esta respuesta implica un mnimo de detalle de descripcin de para qu se hicieron los 3 experimentos y qu datos aporta cada uno. Conclusiones: tanto glutamato como cAMP inducen la expresin de Per1. La induccin por glutamato es ms fuerte que por cAMP. Adems, el glutamato es capaz de activar el promotor de CREB an en presencia de inhibidores de la AC. b) La contestacin a esta pregunta puede tener algunas variantes de respuesta y se evaluar en funcin de la coherencia del razonamiento que se emplee. La respuesta esperada es que puede deberse a que el glutamato activa la misma va de seal del cAMP y adems otra (u otras) o a que activan vas totalmente separadas que terminan en el mismo efecto (siendo la de glutamato una va ms fuerte). En cuanto a CREB, se ve que la fosforilacin de CREB se corresponde con una alta expresin, por lo que podra pensarse que CREB est implicado en la activacin de Per1. El menor efecto de cAMP tambin se ve en este caso, lo que lleva a pensar en principio que la menor expresin vista con cAMP se debera a una menor activacin de CREB y no a que falte activarse otro factor de transcripcin adems de CREB que s se active con glutamato.

presentan a los cobayos negros y los blancos a los cobayos de fenotipo blanco. Se dispone del siguiente rbol genealgico, en el cual los individuos II1 y II4 pertenecen a lneas altamente endocriadas (asumir que pertenecen a lneas puras). a) Represente I 2 1 el genotipo probable de cada indiviII 1 2 3 4 duo (en los casos de que III 1 2 ? pueda ser ms de uno, represente con un guin bajo, i.e. B_) b) Calcule la probabilidad de que un descendiente del cruzamiento entre III1 y III2 sea blanco. Para contestar es suficiente que escriba los genotipos al lado de los smbolos en el esquema y las probabilidades (slo de las que se usarn para hacer los clculos) sobre el esquema (puede dibujarlo o escribir sobre este enunciado). De lo contrario, explique su razonamiento Respuestas esperadas:

I BB II III

Bb 1

Bb

2/3 BB ---Bb 1 2 bb 3 4 b BB b Bb 1 2 Bb ?

Mendel y extensiones
1) En los cobayos, el color de pelo (negro vs blanco) es determinado por el gen B. Los smbolos negros re-

En caso de respuesta con explicacin: I1 y I2 tienen que ser heterocigotas (Bb) porque si no, no podran tener un hijo blanco II1 y II4 son BB por definicin de lneas puras, II2 bb porque su fenotipo refleja su genotipo II3 es B_ porque no podemos saber qu segundo alelo recibi. Tiene 1/3 de posibilidades de ser BB y 2/3 de ser Bb (son tercios y no cuartos porque se descarta que pueda ser bb dado que su pelaje es negro). III1 es Bb porque deriva de un BB y un bb III2 es B_ dado que, como se explica arriba, existe una probabilidad de 2/3 que su padre II3 sea Bb Si II3 era BB, III2 es BB. Si II3 era Bb, existe de probabilidad de que III2 sea BB o Bb. Slo si III2 resulta Bb, podr tener de posibilidad de tener un hijo blanco con III1 Por lo tanto, la probabilidad de que se produzca un cobayo blanco es (2/3)(1/2)(1/4) = 2/24 = 1/12 2) La anemia de clulas falciformes (ACF) es un proceso hereditario humano causado por un alelo autosmico recesivo de muy baja incidencia en las poblaciones occidentales. Un matrimonio quiere conocer la probabilidad de tener un hijo afectado. Con sus conocimientos sobre herencia mendeliana qu podra decirles si: a) ambos miembros de la pareja son normales, pero cada uno de ellos tiene un padre afectado y el otro progenitor no tiene historia familiar de ACF?

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b) el marido est afectado por la enfermedad pero la mujer no tiene antecedentes familiares de ACF? I) Para cada caso construya las genealogas posibles para esta familia indicando los genotipos y fenotipos de todos los individuos involucrados. II) Sobre qu fundamento(s) incluido(s) en la/s ley(es) de Mendel) se apoyan sus predicciones en los casos anteriores? Nomenclatura: S alelo determinante de hemoglobina falsiforme, N de Hb normal, _ puede ser cualquiera de los 2 alelos (N o S) Respuesta: a) b) 0 I) a) abuelos SS (enfermo) x NN (sano) padres SN (sanos en ambos casos) hijos posibles NN, SN o SS b) abuelos en un caso: S_ x S_ (ambos sanos o enfermos) padre SS (enfermo), abuelos en otro caso NN x NN padre NN (sanos todos) II) En el concepto de segregacin de los alelos al formar las gametas que darn origen a la progenie explicitada en la primera ley de Mendel. 3) La corea de Huntington es una enfermedad rara, mortal, que aparece normalmente a mediana edad. Se debe a un alelo dominante. Un hombre fenotpicamente normal, de poco ms de 20 aos, advierte que su padre ha desarrollado la corea de Huntington. a) Cul es la probabilidad de que ms tarde l mismo desarrolle la enfermedad? b) Cul es la probabilidad de que la desarrolle su hijo al cabo del tiempo? (Nota: Para sus clculos asuma que la frecuencia del alelo que produce la enfermedad en la poblacin humana es insignificante). Respuesta Suponiendo que el padre que desarrolla la enfermedad fuese heterozigota para el alelo mutante (dado que la probabilidad de que tambin lo tenga la madre es insignificante): a) b) . Si suponen que el padre tambin poda ser homocigota (adems de heterocigota) y se hacen los clculos correctos [a) 1 b) ] para esta segunda posibilidad el problema se considerar bien contestado. Si ponen homocigota como nica posibilidad an cuando se hagan los clculos correctos, el problema est mal contestado. 4) Dos plantas enanas de maz (E1 y E2) tenan origen distinto, pero eran fenotpicamente idnticas. Se cruzaron cada una de estas plantas enanas con una lnea altamente endocriada de plantas altas que, se saba, son homozigticas para todos los genes que determinan el tamao. Ambos cruces dieron lugar a una F1 constituida nicamente por plantas altas. Al autofecundar cualquier planta de la F1, la proporcin de la F2 fue de 3 altas: 1 enana. Los cruzamientos entre las dos lneas enanas paternas E1 x E2, solo dieron lugar a plantas altas en la F1. A pesar de este resultado, en la F2 reaparecieron las variantes enanas. La proporcin de plantas enanas en la F2 fue de 7/16. a) Explicar los resultados obtenidos, indicando todos los genotipos implicados.

b) Qu proporciones genotpicas y fenotpicas esperara si se realizase el cruzamiento prueba de la F1 del cruzamiento E1 x E2 con el progenitor E1? Respuesta a) Dos genes afectan al tamao A (normal)> a (enanismo 1) B (normal)> b (enanismo 2) [Es un caso de epstasis complementaria] P E1=AAbb x E2=aaBB F1 AaBb (altas) F2 9 A_B_ (altas) vs 7 aa__ o __bb (enanas) b) AaBb x AAbb AABb , AaBb , AAbb , Aabb . Proporciones fenotpicas: A- B- 1/2 altas; A- bb 1/2 enanas 4) Un joven de 35 aos se acerca a un consultorio mdico con el fin de investigar cules son las chances de desarrollar la enfermedad que aquePedigr de la familia. El individuo 4 ja generacin es el que se acerc al consultorio. tras generacin a su familia. Su abuelo materno y su madre murieron de una rara enfermedad neurodegenerativa que los sorprendi a la edad de 45-50 aos, y que ahora tambin aqueja a su hermana mayor, pero no as a sus otros dos hermanos, ambos ya en sus 50s. Lo primero que hace el mdico es analizar el rbol genealgico de la familia: a) Qu tipo de herencia tiene esta enfermedad? b) Determine los posibles genotipos de todos los individuos esquematizados en el pedigr (con excepcin del 4).

A partir de la descripcin de la enfermedad y del rbol genealgico el mdico sugiere que el paciente se haga un anlisis de DNA para tratar de detectar la posible existencia de una enfermedad de esas caractersticas, para la cual, afortunadamente, se tienen marcadores moleculares que se sabe que cosegregan perfectamente con el gen mutado. c) Qu caractersticas esenciales debe tener un marcador molecular para que sirva en el anlisis de cosegregacin? Qu tiene que permitir distinguir? De esta forma el mdico analiza resultados de los exmenes del individuo en cuestin y de todos sus hermanos, obtenidos con el marcador PV123:

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d) Qu sonda se utiliz para revelar el Southern? Esquematizar la regin cromosmica correspondiente y marcar dnde hbrida la sonda. e) A la luz de estos resultados, qu le dira al muchacho? Justifique su respuesta analizando los resultados del Southern. Respuesta: a) Debida a un alelo dominante b) Aa x aa Aa x aa (1) Aa , (2) aa, (3) aa, (4) ? (por lo que se ve ms abajo es Aa) c) Estar localizado (mapear) lo ms cerca posible (estrechamente ligado) al locus a diagnosticar. Me tiene que permitir distinguir no solamente al enfermo (o que potencialmente se va a enfermar) del no enfermo (fenotipo) sino tambin homocigotas de hetrocigotas (sobre todo en enfermedades recesivas, que no es este caso). d) El marcador PV123 tiene 2 alelos: uno que se visualiza como una banda de 5 kb (alelo sano) y otro como 2 bandas de 3 y 2 kb (alelo enfermo), respectivamente. [El polimorfismo probablemente se deba a la aparicin de un nuevo sitio de restriccin en el segundo caso] e) Que comience un tratamiento para amortiguar la aparicin de la enfermedad dado que es portador del alelo que predispone a la enfermedad. 5) Se present ante los tribunales de justicia el siguiente caso: la familia Prez reclama que cierto beb (Juan), que les dieron en la maternidad, no les pertenece y que, en cambio, el beb Felipe, que tiene la familia Garca, es el suyo y se lo cambiaron. La familia Garca niega este hecho, y el tribunal ordena el examen de los grupos sanguneos de los bebes y de los padres, con los siguientes resultados: Ma- PaBeb dre dre Familia Prez AB O A (Juan) Flia. Garca A O O (Felipe) Qu familia tiene razn y por qu? Respuesta: la Garca. Si escribimos los genotipos completos de los padres resulta claro que el primer podra ser resultado de cualquiera de las 2 parejas, pero el segundo beb slo de la segunda Ma- Pa- Beb dre dre Familia Prez AB OO AO Flia Garca AO OO OO

Mapeo
1) En una determinada especie animal los loci A,a; B, b y C,c se localizan en el mismo autosoma. El locus B,b es el central. La distancia entre A,a y B,b es de 20 unidades de mapa, la distancia entre B, b y C, c es de 10 unidades de mapa y el coeficiente de coincidencia es 0,6. Indicar la proporcin esperada de individuos obtenidos con el fenotipo Abc.

Respuesta: Cc = Frecuencia de dobles observadas (FO) / Frecuencia de dobles esperados (FE) = 0.6 FO= 0.6 x FE= 0.6 x 0.2 x 0.1=0.012 N de dobles observados = 0.012 x 100 = 1,2% individuos dobles recombinantes: AbC y aBc distancia. A-B = N de Individuos recombinantes entre estos marcadores + N de dobles recombinates x 100 / n total de individuos = 20 n ind. rec. entre estos marcadores + 1,2 = 18,8 Es decir, 18,8 % son recom. Abc y aBC por lo tanto aproximadamente tendremos la mitad de individuos de cada tipo: 9,4 % 2) Se est estudiando una nueva especie de plantas descubierta recientemente. Se sabe que el alelo Q codifica para hojas verdes, y el q para hojas moteadas (Q domina sobre q); por su parte el alelo R codifica para hojas redondas, y el r para puntiagudas (R domina sobre r). Todava no se sabe la funcin del gen E/e. A estos investigadores les result raro que, a pesar de haber muestreado una gran regin en la que este tipo de planta habita, no se encontr ninguna planta con hojas verdes y puntiagudas simultclases Nro neamente. Para dilucidar esta cuesEqR 280 tin, se realiz un cruzamiento eqr 203 prueba, y los resultados fueron los EQR 199 siguientes: eqR 7 a) Qu genes estn ligados? 67 b) Hay interferencia? Contestar si Eqr 279 o no, no hace falta calcularla eQr numricamente (lo mismo en a) eQR 73 c) Por qu piensa que no se observan individuos de uno de los genotipos posibles? e) Analizando los resultados, discuta qu supuestos de los que se utilizan para este tipo de estudio para calcular las distancias gnicas en base a las frecuencias observadas pueden no estar cumplindose. Rta: a) Q/q y E/e estn ligados, E/e y R/r estn ligados, q/Q y R/r no pareceran estar ligados porque el porcentaje de recombinacin es del 50%. Sin embargo, se encuentran en el mismo cromosoma (estn ligados a 50 um o ms) Para hacer los clculos (no pedidos para responder la pregunta), primero tienen que sacar el locus central que es el E/e. Despus: dist Q/q E/e = 36,9 um dist E/e R/r = 13,27 um dist q/q R/r = 50,07 um (no estn ligados) Lo correcto para calcular la distancia entre los genes de los extremos es sumar las distancias internas (da 50,07 um), en vez de realizar una prueba de dos puntos (da 48,92 um), pues de lo contrario no se estaran considerando los dobles recombinantes. b) Si. Para hacer los clculos (no pedidos para responder la pregunta) Cc = 7 / 54,25 = 0,12 Por lo tanto I = 1- 0,12 = 0,88 Siendo 7 el nro de dobles rec observados

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Siendo 54,25 el nro de dobles rec esperados (0,369 * 0,1327 * 1108) Siendo 1108 el total de individuos c) Una posibilidad es que, como sugera el enunciado, la combinacin de alelos Q/q r/r sea letal, siempre y cuando a su vez el genotipo sea E/e. En el campo abierto podra presentarse el mismo fenotipo generado por el genotipo anterior por ejemplo por la combinacin de QQ Ee rr, Qq EE rr Qq eE rr (pues se pueden dar todas las combinaciones posibles, al no tratarse de cruzamientos prueba). Dado que en el enunciado se menciona que a campo abierto no se observa ese fenotipo (hojas verdes y puntiagudas) se puede pensar que tanto Q/Q r/r como Q/q r/r son combinaciones letales en presencia de por lo menos un alelo E. (y no en presencia de ee, ya que se observan parentales del cruzamiento prueba que son Qq ee rr) d) Hay que recordar que para calcular distancias en base a frecuencias fenotpicas, se supone que todas las gametas son igualmente viables. En este caso vemos que no es as. Respuestas esperadas a) Las gametas de los caballos tendrn 32 cromosomas (la mitad de 64) y las de los burros 31 32 +31 = 63 (el 2n de la mula es impar!). b) A los problemas de apareamiento y segregacin meitica derivados de cromosomas tan dismiles y de nmero impar.

cas clulas se convertiran en Hfr). Sin embargo, tendr el mismo problema que la cepa b).

2) Se realizaron experimentos de conjugacin interrumpida entre cepas Hfr AmpS leu+mal+trp+ y F- AmpR leu-mal-trp-. Los resultados se exponen en la siguiente figura: (mal: capacidad de metabolizar la maltosa)

Gentica Bacteriana
1) Cmo esperara que fuera la transferencia heredable del gen lac+ en cruzamientos entre cepas donoras de E. coli lac+ a) Hfr, b) F+ y c) F'lac con cepas receptoras F- lac- incapaces de recombinar (rec-)? Justifique su respuesta Respuesta: El nico cruzamiento capaz de transferir el gen lac+ en forma heredable es aquel en el que interviene la donora c) F'lac debido a que el gen lac+ forma parte del plsmido transferido que no requiere de recombinacin (entrecruzamiento) para mantenerse establemente en la clula receptora.. La cepa b) es capaz de transferir lac+ pero la cepa receptora requiere de las funciones de recombinacin homloga para que se produzca el reemplazo allico (entrecruzamiento) para integrar establemente el gen recibido. Como el segmento transferido es inestable (es lineal, no puede replicarse correctamente y es susceptible a degradacin por nucleasasas) termina perdindose. La cepa a) F+ slo puede transferir lac+ con muy baja frecuencia si en alguna de sus clulas el factor F se integra previamente al cromosoma principal (esas po-

1) Por qu los recombinantes para leu y mal aparecen con mayor nmero de recombinantes? 2) Explique en qu medios se hicieron crecer las bacterias para analizar su genotipo, y qu tipo de bacterias (qu genotipo) crece en cada uno. 3) A qu distancia del ori de transferencia mapea el gen que codifica para trp? Y los que codifican para leu y mal? 4) Qu experimento hara para determinar el orden entre leu y mal? 5) Dibuje, indicando Origen de transferencia y terminacin, el modo en que el plsmido F se integr al cromosoma bacteriano y dio origen a esta HFR. 6) Qu tipo de recombinacin ocurre para que las bacterias leu- pasen a ser leu+? Qu tipo de recombinacin ocurre cuando el plsmido F se integra en el cromosoma bacteriano? (15 ptos) Rta: 1) Porque al estar ms cerca del origen de transferencia pasan antes y le dan menos tiempo a las bacterias conjugantes a que se separen espontneamente e interrumpan la transferencia. 2) MM + ampicilina + los 2 aac que no se analizan en cada caso F- AmpR aac+ donde aac+ es leu+, mal+ (que en realidad no es un aminocido) o trp+, respectivamente. Para los otros 2 genes cuyos aac estn presentes en el medio, los genotipos pueden ser + o -. Por ej, en el primer caso el genotipo es F- AmpR leu+ mal+/trp+/-

B1

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3) 10, 5 S19 bp26 bmp18 / 1 4) una prueba de recombinacin equiva990 bp 696 bp p26f p26r p18f p18r lente a una prueba de 3 puntos con los 3 B + B marcadores de este experimento. 5) Diluc Primer evento bujito R pKS26L Kn de entrecruza3) Un tema de inters para la medicina sac humana y veterinaria es el desarrollo de Integracin del plsmido suicida vacunas ms confiables. En el caso de la R 2 Kn brucelosis (que es una zoonosis, es deluc bp26 bp26 bmp18 / sacB cir, enferma a animales y a humanos) se a b desarrollaron vacunas para el ganado Segundo evento Seleccin con sacarosa vacuno que consisten en bacterias vivas de entrecruzaatenuadas por diferentes procedimientos N B de cultivo. En este contexto, en la Arluc bmp18 3 / 1837 bp 990 bp gentina se utiliza la cepa S19 que tiene p26f p26r p18f p18r algunos problemas porque no est sufi+ bmp18 cientemente atenuada. Con el adveniR Primer evento pSD18 miento de la ingeniera gentica se puAp de entrecruzadieron caracterizar genes como el bp26 sacB y el bmp18 que, al ser mutados, prctiIntegracin del plsmido suicida camente eliminan la virulencia, tal como 4 lo publican Campos y col (Veterinary R sacB Ap bmp18 bmp18 luc Microbiology, 2002). En un trabajo pre/ a vio, lo demostraron mediante el desarrob Segundo evento llo de mutantes knock-out para ambos Seleccin con sacarosa de entrecruzagenes. a) Indique una estrategia de cmo 5 bmp18 hubiese obtenido Ud. esta mutante INTA2 luc / 694 bp 1837 bp knock-out. Utilice exclusivamente esp26f p26r p18f p18r quemas para su respuesta distinguir animales vacunados de infectados en forma Debido a que no resulta deseable la liberacin de organismos modificados genticamente conteniendo sencilla, barata y masiva. Tradicionalmente, el diagenes de resistencia a antibiticos (y menos si stos gnstico se realiza mediante la deteccin de anticuerson patognicos), para la construccin de la cepa mu- pos anti-Brucella en sangre porque la bacteria es muy tante vacunal bp26::luc bmp18 ( simboliza dele- difcil de detectar y no resulta sencillo diferenciar encin y :: simboliza insercin y que bautizaron IN- tre los animales que tienen estos anticuerpos debido a TA2) usaron una tcnica de contraseleccin (ver Figu- que estuvieron infectados o porque fueron vacunados. Qu solucin le parece que proponen los diseadores ra). de esta vacuna? Aclaraciones: El gen sacB (de Bacillus subtilis) codiRespuestas esperadas: a) Se podra usar el mismo fica para una levansacarasa que metaboliza la sacarosa esquema del enunciado (parte izquierda) reemplazanen un levano que es txico para Brucella. Es decir que do el gen luc por un gen de resistencia a antibitico las bacterias que contienen este gen se mueren cuando (por ej. a Tetraciclina) y manteniendo el gen de resisse agrega sacarosa al medio de cultivo. a y b sealan tencia a kanamicina (o el SacB) para seleccionar el secuencias homlogas (probables sitios de entrecrudoble recombinante. zamiento). El gen luc codifica para la luciferasa de b) i) Suponiendo que se quiera ir paso a paso (como lucirnaga, los genes ApR y KnR para resistencia a sugiere el flujo de esquemas) y seleccionar primero el ampicilina y kanamicina, respectivamente. En varios cointegrado (construccin 2) y recin despus el doble de los genes se especifican, con flechas, oligonuclerecombinante (construccin 3): KnR servira para setidos diseados para PCR y el tamao del fragmento leccionar en un medio conteniendo kanamicina (en de amplificacin esperado. ausencia de sacarosa). En un segundo paso, se pasarb) Qu funcin especfica cumplen los siguientes an las bacterias a un medio conteniendo sacarosa, en genes marcadores en el esquema de obtencin de la ausencia de kanamicina. [De hecho, esto fue lo que cepa vacunal? hicieron los autores del trabajo]. Lo mismo con ApR i) ApR y KnR (2 ptos); ii) luc (2 ptos); iii) sacB para el gen bmp18. c) Porqu se usaron plsmidos suicidas? Otra respuesta correcta: Suponiendo que se quisiera d) Disee un sistema molecular de deteccin para dis- seleccionar directamente la construccin 3, sin pasar tinguir los 5 genotipos posibles entre s. Explquelo. por la construccin 2 (doble recombinante directo), e) Un punto importante en cualquier campaa de erra- KnR no tiene funcin alguna en el experimento del dicacin de enfermedades como la brucelosis es poder

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problema. Al utilizarse el sistema de contraseleccin PCR. En la realidad, esta ltima variante no es practibasado en SacB podra no estar presente, sin afectar cable, porque la cepa vacunal sobrevive muy poco a con su ausencia el resultado. En este caso, su nica las defensas del animal y resulta muy lento, peligroso funcin es ser un marcador selectivo en E. coli (otorga y poco prctico el aislamiento de bacterias patognial plsmido una ventaja selectiva que ayuda a mante- cas. nerlo, evitando su prdida, durante su multiplicacin 4) Bacterias de una cepa de E. coli Hfr rec+ bio+ his+ en E. coli). En el caso del segundo plsmido conte- StrS son mezcladas junto a bacterias de otra cepa de E. niendo ApR, esta aproximacin es mucho ms difcil coli F- rec+ bio- his- StrR. A diferentes tiempos, se (aunque no imposible) porque no tengo un gen indica- inter-rumpieron las conjugaciones, se plaque en los dor y slo puedo distinguir dobles recombinantes siguientes medios selectivos (todos conteniendo Str) (construccin 5) de salvajes (construccin 3) mediante y al da siguiente se cont el N de colonias. (MM = PCR de las colonias, por ej. medio mnimo) Tiemp N de colonias en ii) Este gen sirve para distinguir las mutantes knock (min) M MM+b MM+h MM+bio+ out para el gen bp2 que quiero seleccionar (consM io is his truccin 3) de las revertantes salvajes (construccin 5 0 0 0 503 1), dado que ambas sobreviven en el medio conte10 0 0 34 487 niendo sacarosa. 15 0 0 44 499 iii) Como dice el enunciado, este gen sirve para con20 0 0 50 503 traseleccionar (seleccionar en forma negativa) las 25 0 0 59 498 construcciones 2 y 4 en presencia de sacarosa. 30 20 30 80 501 c) Bsicamente, el que el plsmido sea suicida me a) El experimento anterior se aprovech para mapear permite seleccionar ms eficientemente al recombilos genes involucrados en la sntesis de biotina. nante. Suponiendo que la seleccin de las construcUbique en el mapa gentico el gen bio. Se aclara la ciones se hizo paso a paso [como se explica en b) posicin donde est integrada la secuencia del i)], si el plsmido replicara en Brucella, la seleccin plsmido F en esta cepa Hfr, y adems la del gen his, en presencia de kanamicina solo me dara muchsimas previamente mapeado. bacterias con el plsmido sin integrar y me sera exb) Un amigo suyo, estudiante de Biologa, le cuenta tremadamente dificultoso aislar el recombinante que hizo un experimento de conjugacin -mientras (construccin 2) por su baja probabilidad de ocurrenmiraba videoclips de Britney Spears- con una cepa cia. Hfr diferente a la anterior, la cual, al conjugar con la Ahora, suponiendo la alternativa de seleccin directa misma F- que en el experimento del doble recombinante [como se explica en otra resanterior, le transfiere el gen his a puesta correcta en b) i)], el primer plsmido podra los 20 min y el gen bio a los no ser suicida, porque sera seleccionado en forma F 40 min. Le creera a su negativa en presencia de sacarosa. amigo o pensara que se d) Por PCR usando los primers flanqueantes de los distrajo mientras haca los his genes. Las construcciones 1, 3 y 5 daran una sola experimentos? banda por primer (total 2 bandas), a saber 696 + 990 c) Un fago que hace en 1, 1837 + 990 en 3 y 1837 + 694 en 5. Los cointetransduccin generalizada grados daran 2 bandas, para el par de primers p26 en puede encapsidar fragmentos de 2 o para el par de primers p18 en 4. En total 3 bandas. DNA genmico de una cepa bacteriana infectada y Tambin se considerarn correctas respuestas con lisada que tengan un tamao de hasta 30.000 pb. Si otras variantes (deteccin de fluorescencia en lugar de ese fago es usado para infectar una cepa de E. coli la banda de 1837 combinada con PCR de los otros salvaje, y el lisado resultante es usado, a baja genes; RFLPs usando bp26 y bmp18 como sondas, multiplicidad de infeccin, para infectar a la Fdeteccin de las protenas codificadas mediante Wesmencionada antes. Esperara observar colonias en tern, etc.), siempre y cuando la respuesta permita difeMM? Justifique (1 min equivale a 20 kpb aprox) renciar claramente los 5 genotipos. e) Usara Ud. la cepa F- en MM para testear la mutae) La presencia de anticuerpos anti-luciferasa diferengenicidad de una sustancia en un test de Ames? cian animales vacunados con esta cepa respecto de los que se infectaron con una cepa salvaje no recombinan- Respuestas esperadas a) El gen bio entra a los 10 te. La ausencia (versus presencia) de anticuerpos con- y el his a los 30, por lo tanto el gen bio se encuentra a 1/3 de la distancia entre F e his.b) Le creo, seguratra bp26 y bmp18, es otra variante de la respuesta. Tambin se considerar correcta (con la mitad de la mente tiene un Hfr distinto con el F integrado apunnota = 2,5 ptos) la respuesta que proponga el aisla- tando al revs y en otra posicin. Ntese que la dismiento de bacterias del animal, las cuales deberan no tancia entre his y bio es de 20 (igual que en este exser fluorescentes en presencia de luciferina en el caso perimento). c) No, estn demasiado lejos para ser code la cepa de campo y ser fluorescentes en el caso de transducidos. d) No, porque es una doble auxtrofa y la cepa vacunal. Idem si la tcnica seleccionada es una por lo tanto requiero de la mutacin (reversin) si-

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multnea de al menos 2 bases distintas y cuya reversin no necesariamente requieren del mismo mecanismo de mutacin Respuesta alternativa que, en caso de aparecer, debe ser considerada correcta: S, si utilizo MM+ bio (o MM+ arg) 4) Un investigador est interesado en mapear y estudiar 3 genes bacterianos a, b y c involucrados en la biosntesis de aminocidos. Se sabe que los productos de los genes a, b y c catalizan las siguientes reacciones: C
Leu A X B Val Ile

vectores
Alu I

que
P

se
Alu I

muestran.

AmpR Vector 1

AmpR

P = promotor del opern Vector 2 lac

donde X es un compuesto que puede ser sintetizado por ambas cepas de bacteria creciendo en un medio mnimo (MM). Para realizar el estudio dispone de 2 cepas de bacterias: Hfr a+b+c+ StrS y otra F- a- b- c- StrR con las cuales realiz un experimento de conjugacin interrumpida obteniendo los siguientes resultados:
N recombinantes

c+ StrR

a+ StrR b+ StrR

a) En qu medios se seleccionaron cada uno de los genotipos de bacterias del grfico anterior? b) A qu distancia del origen de transferencia de la cepa Hfr utilizada mapean los genes a, b y c? c) Grafique y explique los resultados que hubiera tenido en el experimento de conjugacin interrumpida si el genotipo de la cepa dadora hubiese sido: i) Hfr a+b+c+ StrR ii) F+ a+b+c+ StrS iii) Si el origen de transferencia de la cepa Hfr se encontrara entre el gen b y el c. El hecho de que a y b mapearan juntos y formaran parte de una misma va metablica le sugirieron al investigador que a y b pertenecen a un mismo opern. Con el objeto de estudiar esta posibilidad realiz el siguiente experimento: A) Se digiri ADN genmico de una cepa salvaje con la ER Alu I (de corte frecuente) en cantidades limitantes. Luego los fragmentos se ligaron en uno de los

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16

20

24

t (min)

B) Luego se transformaron bacterias a- b- c+ AmpS con uno de los vectores y se plaquearon las bacterias transformantes en gar + MM + ampicilina + un aminocido. Cada una de las colonias que crecieron en estas placas fueron luego cultivadas en gar + MM + ampicilina obtenindose los siguientes resultados: Vector 1: Todas las bacterias que crecieron en MM+Amp+Leu crecieron tambin en MM+Amp. -De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Val el 60% crecieron en MM+Amp. Vector 2: De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Leu+Lac, el 55% crecieron en MM+Amp +Lac. -De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Val+ Lac, el 50% crecieron en MM+Amp+Lac. d) Cules son los genotipos de las bacterias que crecen en cada uno de los 3 medios? e) Cmo interpreta los resultados de este experimento? Demuestre que estos resultados son compatibles con la hiptesis de que a y b estn en el mismo opern. f) Cul de los genes est ms cerca del promotor: a o b? Justifique. g) Cmo hara, utilizando la tcnica de PCR, para demostrar que a y b pertenecen al mismo opern? Indique los resultados esperados tanto si a y b forman parte de un opern como si se transcriben independientemente. Respuesta a) a+ StrR = MM + Str + Val + Ile b+ StrR = MM + Str + Leu + Ile c+ StrR = MM + Str + Leu + Val b) a y b mapean a 12 min del OriT y C mapea a 6 min. c) i) Se hubieran seleccionado a las bacterias dadoras por lo que no hubiera habido diferencias entre los distintos medios ni tampoco entre los distintos tiempos. ii) Se hubieran obtenido muy pocas recombinantes (aquellas en las que el plsmido F+ se hubiera incorporado en la cepa dadora y luego los marcadores a, b o c se hubieran transferido a la cepa aceptora). iii) Dependiendo de la orientacin del OriT hay dos posibilidades: -que a y b salgan primero y bastante tiempo despus salga c -que c salga primero y bastante tiempo despus salgan a y b. En el grfico tienen que quedar claro esto, y adems que la frecuencia de recombinantes para los genes que

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salen primero debe ser bastante mayor que la de los genes que salen al final. d) MM+Amp+Leu = a- b+ AmpR y a+ b+ AmpR. Es decir, b+ AmpR MM+Amp+Val = a+ b- AmpR y a+ b+ AmpR. Es decir, a+ AmpR MM+Amp = a+ b+ AmpR La lactosa no importa, slo se usa para inducir la expresin mediada por el promotor lac. e) De las bacterias transformadas con el vector 1 todas las bacterias b+ tambin eran a+, pero slo el 60% de las a+ eran b+. En cuanto a las bacterias transformadas con el vector 2 el 55% de las bacterias b+ tambin eran a+, y el 50% de las a+ eran tambin b+. La diferencia en los resultados obtenidos con ambos vectores radica en que el vector 1 no contiene un promotor por lo que la expresin de los transgenes se dar solo si vienen acompaados de su promotor. El hecho de que todas las bacterias b+ sean tambin a+ nos indica que b se transcribe utilizando el promotor de a sugiriendo que a y b forman parte de un opern. En el caso del vector 2 dado que aporta un promotor (y ste est encendido debido a la lactosa) s se obtienen bacterias a-b+. f) Dado que, cuando se transform con el vector 1, no se obtienen bacterias a-b+ pero s a+b- esto nos sugiere que no se necesita que se transcriba b para que se transcriba a (pero s al revs). Esto indicara que a se encuentra ms prximo al promotor que b. g) RT-PCR usando primers de la regin 5 del gen a y de la regin 3 del gen b. Si amplifico es porque hay transcriptos que contienen al gen a y al b. Hay otras posibilidades que se evaluarn caso por caso 5) Se realiza un experimento de transformacin con una cepa bacteriana donante resistente a cuatro antibiticos: A, B, C y D. La cepa receptora es sensible a las cuatro drogas. La poblacin de clulas receptoras tratada se divide y se Antibiticos N colonias siembra en placas de meA 1.156 dios suplementados con B 1.148 varias combinaciones de C 1.161 las drogas. Los resultados D 1.139 fueron: AB 46 AC 640 a) Uno de los genes est AD 942 claramente alejado de los BC 51 otros tres, los cuales pareBD 40 cen estar estrechamente CD 786 ligados. Cul es el gen ABC 30 distante? ABD 42 b) Cul es el orden de los ACD 630 tres marcadores que estn BCD 36 ligados? ABCD 30 Rta: a) B es el gen distanTotal 7.877 te; b) A D C.

Mutagnesis y Transposicin
1) En levaduras, el tratamiento con mutgenos permiti seleccionar, en forma independiente, varios tipos

de mutantes auxtrofas incapaces de utilizar galactosa como nutriente. El mapeo de las mutaciones responsables de esta caracterstica permiti clasificarlas en 2 grupos de ligamiento distintos (mendelianamente independientes). a) Significa este resultado que los genes involucrados se encuentran en 2 cromosomas distintos? Por qu? b) Cul ser el fenotipo resultante del diploide resultado del cruzamiento entre mutantes (haploides) pertenecientes a distintos grupos de ligamiento? Por qu? c) Cmo sern las proporciones fenotpicas de las levaduras (haploides) derivadas de las ascosporas una vez producida la meiosis? d) Qu clase de mutagnesis es la ms apropiada para este tipo de experimentos? la producida por radiacin (gamma) o por algn compuesto qumico como el EMS o la nitrosoguanidina? Justifique muy brevemente. Respuesta: a) En principio s, los grupos de ligamiento pueden comprender y extenderse ms all de 50 u de recombinacin y pertenecer al mismo cromosoma [es decir, si bien 2 genes o marcadores pueden comportarse mendelianamente como independientes por estar a ms de 50 unidades de mapa, a travs de otros marcadores o genes intermedios puedo incluirlos a ambos en el mismo grupo de ligamiento = cromosoma. Sin embargo pueden existir 2 grupos de ligamiento pertenecientes al mismo cromosoma si no tengo la suerte de encontrar marcadores o genes intermedios]. b) Prottrofa. Por complementacin. [Si a es el alelo mutante de A y b de B: Ab x aB AaBb fenotipo salvaje] c) 3 a 1, auxtrofas a prottrofas [ ab, Ab, aB vs AB] d) Usualmente se utiliza algn mutgeno qumico (como EMS o nitrosoguanidina) que producen mutaciones puntuales y se pueden dosificar ms fcilmente. La radiacin produce rupturas, deleciones y rearreglos cromosmicos groseros, por lo que sera menos conveniente. 2) Se estudia el efecto de 2 conocidos mutgenos en levaduras: el etil metanosulfonato (EMS) y el bromuro de etidio (EtBr) observando la frecuencia de aparicin de petites (levaduras que forman colonias de crecimiento mucho ms lento que las normales o grandes, debido a un malfuncionamiento del sistema de fosforilacin oxidativa). A primera vista, los resultados parecen similares ya que ambos mutgenos inducen una abundante aparicin de mutantes. Sin embargo, ms del 99% de las mutantes obtenidas con EMS, segregaban en una proporcin mendeliana de 50% grandes a 50% petites, al ser cruzadas con levaduras salvajes (grandes). Nota: recordar que las levaduras son usualmente haploides y que los fenotipos descriptos se refieren a lo observado con ese nivel de ploida. En cambio, ms del 90% de las mutantes obtenidas con EtBr segregaban 100% de petites o 100% de grandes. Es decir, a pesar de tener un parental petite y

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un parental grande, la progenie era toda petite o toda grande. Cmo se explican estos resultados? Solucin: el EMS afecta, fundamentalmente a genes nucleares (que pueden afectar a las funciones mitocondriales para resultar en un fenotipo petite -no realizan fosforilacin oxidativa- porque stas importan ciertas protenas codificadas en el ncleo) y el EtBr tiene mayor especificidad por los genes mitocondriales que se heredan uniparentalmente. 3) En un estudio sobre mutaciones inestables de maz, un investigador propuso los siguientes genotipos para dos plantas distintas de esta especie: I) C/cd ; Ac+/AcII) C/ca ; Ac- /AcC: alelo silvestre que permite la expresin del color del grano; cd: es un alelo inestable producto de la insercin de un elemento mvil no autnomo Ds que inactiva la expresin del gen. ca: es un alelo inestable producto de la insercin de un elemento mvil Ac autnomo que inactiva la expresin del gen. Ac+ presencia/ Ac- ausencia del elemento mvil (atencin que esta nomenclatura es distinta a la empleada en algunos libros de texto). Se realizaron los siguientes cruzamientos: a) plantas con genotipos I y II se cruzaron con plantas c/c; Ac- /Ac-, en donde el alelo c representa una forma mutante incolora, producto de una sustitucin de bases. b) planta con genotipo I) se cruz con planta con genotipo II). Qu fenotipos y en qu proporciones aparecern en la descendencia de los cruzamientos a) y b)? NOTA: Asumir que Ac y C no estn ligados, y que la frecuencia de rupturas cromosmicas es despreciable.

LTR Promotor

Sec abierta lectura Intrn

LTR

Mediante sondas especficas para el intrn y para la secuencia abierta de lectura de Ty, es posible seguir, mediante Southern blots, la transposicin de Ty en el genoma de levaduras. Cuando las levaduras se cultivaron usando glucosa (es decir en ausencia de galactosa) no se evidenciaron cambios importantes (es decir no hubo -o hubo muy poca- aparicin de nuevas copias de Ty). En presencia de galactosa (inductor), en cambio, la sonda de Ty permiti detectar la aparicin de numerosas bandas (copias) nuevas en las clulas. Sin embargo, la sonda para el intrn gal fall en revelar la aparicin de bandas nuevas. Los Northern blots del mRNA confirmaron estos resultados (deteccin de una banda por parte de la sonda Ty y falta de deteccin de la misma banda por parte de la sonda para el intrn). a) Cmo explica estos resultados? b) Porqu y para qu se reemplaz el promotor presente en el LTR por el promotor inducible por galactosa? c) Porqu y para qu se introdujo un intrn? d) Hubiera sido lo mismo (para lo que se quiere demostrar en este experimento) reemplazar el promotor de levaduras inducible por galactosa por el promotor del opern lactosa de E. coli e inducir con lactosa o IPTG? Por qu? e) Y reemplazar la secuencia abierta de lectura por el gen de la -galactosidasa, sabiendo que es muy

Respuesta: a) I) prpuras, blancas, mosaico II) prpuras, mosaico; b) prpuras, mosaicos [Todos los genotipos C_, homo- o heterocigotas, son prpuras; la probabilidad de que un transposn (por ej. del locus Ac) justo vaya a insertarse en un locus especfico del genoma es extremadamente baja. Todos los genotipos dobles recesivos (conteniendo c, cd o ca) son mosaicos si est ca_ o cd_, Ac+_] 4) Se desea estudiar el mecanismo de transposicin gentica de los elementos Ty ("transposons of yeast") caracterizando la funcin de una secuencia abierta de lectura (ORF, open reading frame) con homologas con el gen de la replicasa de retrovirus. Para ello se introduce en una levadura un plsmido conteniendo el transposn. El transposn fue modificado mediante insercin (cortando con enzimas de restriccin y ligando) de un promotor gen inducible por galactosa en el LTR izquierdo desplazando el promotor nativo del transposn. Curiosamente, como no se encontraron intrones en el gen de la replicasa, se introdujo uno procedente de otro gen de levaduras resultando la siguiente construccin: Plsmido Ty modificado

sencillo detectar de esta manera la transcripcin colorimtricamente usando X-gal?

Posteriormente, se realiz un experimento similar en moscas M (carentes de elementos P en su genoma). En este caso se dispone del cDNA del gen que se desea estudiar, el cual se fusion con un promotor de un gen de moscas inducible por calor (heat shock protein). Igual que para las levaduras, se introdujo un intrn de otro gen de dpteros y se dispone de una sonda para su deteccin, as como de otra pra el cDNA incgnita. Plsmido con elemento P modificado

IR

Prom HSP

Sec abier lect Intrn

IR

Cuando se tranfectaron embriones y se cultivaron a 20C no se evidenciaron cambios importantes (es decir hubo muy poca aparicin de nuevas copias de P). A 37C, en cambio, la sonda del cDNA permiti detectar la aparicin de numerosas bandas (copias) nuevas en las clulas. Sin embargo, contrastando lo ocurrido en levaduras, la sonda para el intrn revel las mismas bandas nuevas que el cDNA. Sin embargo, el Northern blot del mRNA dio como en levaduras. Es

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decir, se detecta una banda con la sonda para P y no se detecta nada con la sonda para el intrn. f) Cmo explica Ud. este resultado? Respuestas: a) Hubo transcripcin inducible por galactosa del ORF, splicing con prdida de intrn, lo cual permiti la retrotransposicin (RNA cDNA integracin cromosmica) del Ty mediada por la RT endgena o codificada por el mismo gen. b) Para poder convertir el sistema de expresin de la RT en inducible y poder atribuir diferencias de comportamiento de la transposicin a la transcripcin inducible del gen. c) Porque si se quiere demostrar que la transposicin es mediada por el RNA transcripto, el intrn debe procesarse y desaparecer. Si lo que se transcribe es un gen de una transposasa la cual despus mueve el transposn a nivel de DNA, el intrn debera aparecer en las copias. d) No, por 2 razones: 1) los promotores bacterianos muy raramente funcionan en eucariontes como las levaduras y 2) porque la construccin introducida en levaduras no incluye el gen del represor del opern lactosa ni el de la protena CAP que deberan estar presentes (convenientemente modificados genticamente para su funcionamiento en levaduras) para que el sistema regulatorio del opern lac est completo. e) No, porque la beta-galactosidasa no es capaz de reemplazar la funcin del gen incgnita 8la transposicin). Los genes indicadores (reporteros) sirven para estudiar la funcin de los promotores. Aqu no estoy estudiando el funcionamiento de un promotor, sino de una secuencia estructural. f) El cDNA codifica para una transposasa que reconoce los IR y transpone el elemento P tal cual est en la construccin (incluyendo el intrn). Si bien el mRNA de la transposasa probablemente est procesado, por los datos del Northern, la transposicin en s misma del DNA no produce procesamiento (splicing) de intrones. Una cosa es la expresin del gen de la enzima y otra muy distinta es la accin de esta enzima en la transposicin. 5) Se confeccionaron varios mutantes del Tn5 mediante ingeniera gentica. El mapa y el fenotipo se muestra ms abajo: grafica una delecin del DNA entre los extremos de la llave. grafica un fragmento de 800 pb de DNA forneo que se insert en la posicin O. Las capacidades del mutante de transponerse y de resistir a neomicina (NeoR) se indican a la derecha de cada mutante. WT significa wild type (normal o salvaje). y indican las regiones repetidas invertidas (IR) del Tn5. NOTA: Para su respuesta suponga que entre los valores de la tabla 90 y 100 o entre 0 y 0,5 no existen diferencias estadsticamente significativas.

cepa

Qu conclusiones puede sacar acerca de: a) la(s) region(es) requerida(s) para la transposicin y region(es) no requeridas? b) Por qu estos resultados son inesperados y se contradicen con lo que Ud. aprendi en la materia? c) la(s) regio(es) requeridas para NeoR?

Solucin: a) Para la transposicin:

completo,

slo el extremo izquierdo (aquella parte afectada en la mutante 135). b) Porque hubiera esperado que TODO el hubiera sido imprescindible para la transposicin. c) El gen NeoR (completo o su extremo 5) est ubicado en algn lugar entre el extremo derecho de y su regin derecha adyacente (es decir, parte o todo el fragmento afectado por la delecin en la mutante 138). [Con los datos suministrados no puedo afirmar que TODO el gen NeoR est en ese segmento. Tampoco puede concluirse, con estos datos, que haya una superposicin entre parte del gen y el IR izquierdo, pero resulta altamente sospechoso. Para confirmarlo, deberan hacerse mutaciones dirigidas usando deleciones ms pequeas o sustituciones nucleotdicas puntuales]. 6) En un trabajo reciente (Mol Gen Genomics, 2006, 275: 231-241) un grupo japons estudia la coloracin de las flores en Gentiana scabra, una planta ornamental muy difundida en Japn. Para ello analizan tres cultivares de G. scabra: cv. Momokorin (flores rosadas), la lnea mejorada 13-98 (flores rosadas) y el cv. Alta (flores azules); y G. triflora cv. Macyri (flores azules). Primero, miden la acumulacin de antocianinas mediante HPLC de extractos obtenidos de los ptalos de las flores. Los perfiles de HPLC obtenidos fueron los siguientes: a y d) cv. Alta: dos picos, uno mayor correspondiente a delfinidina y otro menor a cianidina. b,c y e,f) Lnea 13-98 y cv. Momokorin: un nico pico correspondiente a cianidina.

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i) Qu le i indican estos resultados en cuanto a la des terminacin bioqumic del colo de las f n ca or flores?

La enzima clave en la b biosntesis d delfinidina es la de a flavonoidil 35-hidroxi ilasa (F35H que cata H) aliza la hidroxilaci en 5 del anillo B d esqueleto de la n l del o antocianina. La expresi gnica d esta enzi in de ima se muestra en la siguiente f figura: a) Anlisis de Norts hern blot usando t RNA total de ptalos de los tres cultivares de G. sc cabra. La membrana fue hibridada con ca una de ada las sondas correspondientes a los genes F35H y F F3H (codifica para una enzima que c cataliza la hidroxilaci en 3 n del anillo B de flavonoides). rR RNA: control de ca antidad de RNA riboso omal teido con br romuro de etidio. b) Anlisis de RTs PCR para amplificar el ORF d F35H de usando RN NA total extrado de ptalos. Los nmeros a la derecha in s ndican los tamaos de los fragm s mentos ampli ificados. Nota: por 3 3RACE amp plifican trans scriptos men nores a 1,4 kb en la lnea 13-98 a c) Anlisis de PCR para amplif s ficar la secuencia genmica d F35H c los inici de con iadores emp pleados para la RT-PCR. Los n meros a la derecha indi ican lo mismo que en b.

ii) Cul fue e objetivo d los experim el de mentos most trados en a y b? iii) Para qu s realiz la h ) se hibridacin con F3H? c iv) Qu explicacin mole ) ecular podra dar a los ca a ambio en el perfi de los trans os il scriptos? A continuacin, a partir de ADN ge enmico de las pla antas amplif fican fragme entos conten niendo el O ORF F35H (ver pa c de la figura anterior arte r): v) Cul fue el objetivo de este experim l mento? vi) Qu evidencian estos r ) resultados? Lo fragmento de 4 kb y 3,3 kb fue os os eron clonado y os sec cuenciados. El fragmento d 4 kb de la lnea 13-98 presentaba en de a 8 a el exn 1 una insercin (a la que llama aron dTgs1) cuya secuencia c contena un sitio blanco de duplicac cin (TSD) de 8 p y repetici pb iones termin nales inverti idas (TI de 14 pb La secuen IR) b. ncia TIR pre esentaba una regi palndrom imperfe n mica ecta y exhiba similitud p parcia con un ele al emento dTph de petunia (el cual se sabe h qu es reconoc ue cido por la tra ansposasa Ac c). El fragmento d 3,3 kb de cv. Momo de el okorin conte ena un insercin en el exn 1, a la qu denomina na ue aron Gs sTRIM. Esta secuencia p a presentaba repeticiones dir rec ctas terminales (TDR). Esta insercin no conte ena sec cuencias que codificaran para alguna protena. A e n a Asimi ismo, presen ntaba similitu con secue ud encias de Lo otus japonicus, designadas LjTRIM. , vii) Qu le permiten confirmar estos datos de n secuencia? Cul es e ? entonces la explicacin p e para los diferen fenotipo observados? ntes os Como los elementos T TRIM fueron identificado a n os partir de a anlisis de ba ases de dato de secuenc os cias nucleotdi icas y mostra aron la pecul liaridad de es star conservad en distint especies de plantas, r dos tas realizaron un anlisis f n filogentico empleando las secuencias TDR y usa s ando los pro ogramas CLU USTAL W y TREEVIE EW. El rbol obtenido se muestra a continuacin n:

vii Qu pued concluir d agrupam i) de del miento mostra ado en el rbol? vii Sugiera u experimen simple para analizar la ii) un nto p r existencia de los elemento dTgs1 y GsTRIM en el os n noma de otra especies d Gentiana. as de gen Rt Aclaraci Las gent ta: n: tianas rosada vienen sien as ndo obtenidas por mejoramien a partir de mutacio nto ones esp pontneas a partir de ge entianas azu ules, pero el/ /los

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mecanismo/s involucrado/s eran desconocido/s hasta el momento. i) Estos resultados indican que hay diferencias en la acumulacin de las distintas antocianinas en ambas plantas (azules y rosadas), en particular, las plantas rosadas carecen de delfinidinas. Pero la acumulacin de cianidinas es similar para ambas. ii) Como los autores saben que la F35H es la enzima clave en la sntesis de delfinidina y viendo los resultados anteriores, analizan si hay diferencias en cuanto a la expresin del gen para esta enzima entre los dos tipos de plantas y analizan si esto podra explicar los fenotipos observados. iii) La hibridacin con F3H es usada como control. Tanto en plantas azules como rosas se obtiene el mismo patrn de expresin. Es otra enzima involucrada en la sntesis de pigmentos pero que produce otro compuesto (que no tiene nada que ver con las delfinidinas, si bien pertenece a la misma ruta biosinttica). Tambin prueban con otros genes relacionados con la sntesis de flavonoides y ven que exhiben los mismos patrones que la F3H pero esto tampoco lo muestran en el trabajo original. iv) Los resultados evidencian que: No se observa transcripto de F35H para la planta rosada, lnea 13-98 tanto por Northern blot como por RT-PCR (Aclaracin: los primers para esta RT levantan el ORF por completo, full length). Adems se aclara que por 3RACE obtienen fragmentos menores a 1,4 kb. Para la planta rosada cv. Momokorin, el transcripto de F35H es de tamao mayor que el observado para la planta azul cv. Alta (Northern). Por RT-PCR este cultivar muestra dos fragmentos de 1,3 y 2,1kb que difieren del de 1,6kb observado para la planta azul. En conclusin: ninguna de las plantas rosadas acumulan el transcripto de tamao normal esperado (1,6kb) v) El objetivo de este experimento fue examinar la estructura del gen para F35H en estas plantas a partir de amplificacin sobre el ADN genmico de las mismas, para ver si existen diferencias que puedan explicar los resultados a nivel de transcriptos. vi) Se obtienen fragmentos de amplificacin de distinto tamao para las distintas plantas. Estos resultados muestran que el cv. Alta (azul) muestra un fragmento de 2,8kb mientras que para la lnea 13-98 y el cv. Momokorin (rosadas) las bandas son 1,2 y 0,5kb mas grandes, respectivamente (sus tamaos eran 4 y 3,3 kb, respectivamente). Es probable que en el gen de las plantas rosadas haya alguna insercin. vii) Estos resultados, dadas las similitudes de las secuencias con elementos transponibles, evidencian que las inserciones observadas corresponderan a transposones (dTgs1 y GsTRIM1). La explicacin para los diferentes fenotipos observados es que estos transposones interrumpen la secuencia del gen, resultando en transcriptos anormales (o ausencia de transcripto) que no permiten la sntesis de la enzima F35H y por lo

tanto no se sintetizan el pigmento que produce la coloracin azul (delfinidina). vii) Los resultados claramente muestran que GsTRIM1 y LjTRIM se agrupan juntos y apartados del resto de los TRIMs reportados previamente, indicando que estos dos transposones son evolutivamente diferentes de los otros elementos TRIM de plantas. vii) Al inicio del problema, en el enunciado, se indica que tambin disponen de G. triflora cv. Macyri. Por lo tanto, el experimento sera hacer Southern blot de sta conjuntamente con las 3 plantas analizadas de G. scabra e hibridar con dTgs1 y GsTRIM1 (Southerns separados, obviamente) y observar la aparicin de muchas bandas (esto mostrara que, como la mayora de este tipo de transposones, son miembros de una familia de alto nmero de copias, y que estn distribuidos por todo el genoma de Gentiana).

Alteraciones cromosmicas y cromosomas

1) El caballo (Equus caballus) tiene un complemento diploide de 64 cromosomas, de los cuales 36 que son acrocntricos. El burro o asno (Equus asinus) tiene 62, de los cuales 22 son acrocntricos. a) Indique el nmero (diploide) de cromosomas que tendr el hbrido interespecfico (la mula) b) A qu atribuye la usual esterilidad (incapacidad de producir gametas viables) de la mula? R: a) Las gametas de los caballos tendrn 32 cromosomas (la mitad de 64) y las de los burros 31 32 +31 = 63 (el 2n de la mula es impar!). b) A los problemas de apareamiento y segregacin meitica derivados de cromosomas tan dismiles y de nmero impar 2) Describa un ejemplo de alteracin cromosmica estructural que afecte la fertilidad en individuos heterocigotas para la alteracin. Justifique brevemente su respuesta. Respuesta: Cualquiera de los ejemplos de alteraciones estructurales que dio Liliana o figuran en los libros (translocaciones recprocas, por ejemplo) que impliquen la formacin de configuraciones meiticas como trivalentes, tetravalentes, etc. y que afecten la correcta migracin de los cromosomas en la anafase meitica. La inclusin de algn esquema reemplaza buena parte de la explicacin. 3) Se desea localizar en qu cromosoma se localiza el locus para un marcador molecular de tipo codominante (microsatlite) ligado a un carcter de inters agronmico (QTL). La especie vegetal tiene un nmero diploide de 2n=10 cromosomas y se dispone de la serie monosmica completa. Se cruza una planta dismica homocigtica (muestra una banda de 200 pb) por cada uno de los diferentes monosmicos todos los cuales muestran una banda de 180 pb. Algunos de los descendientes muestran ambas bandas (200/180 pb) y otros slo una (la de 200 pb). Las descendencias obtenidas se desglosan en la tabla clasificadas de acuerdo a su constitucin cromosmica, es decir si poseen 9 cromosomas (es decir, monosmicas) o 10

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cromosomas (dismicas, ver columna 1) y a su patrn de bandas (columnas 2 a 5): Descendencia de los 5 cruCromosoma en zamientos analizados condicin moDismicos Monosmicos nosmica 200/180 200 200/180 200 1 140 0 139 0 2 97 0 93 0 3 193 0 0 196 4 58 0 57 0

sionar gametas desbalanceadas. Luego repiti los cruzamientos arvejas de flores blancas por arvejas de flores rojas. Qu proporciones de plantas con flores blancas y rojas obtuvo en la F2? Describa los genotipos simplificados de dicha F2, de la F1 que le dio origen y de los parentales poliploides (usar guiones bajos para ejemplificar casos en que ambas variantes genotpicas resultan en fenotipos equivalentes) Respuesta correcta:

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Explique los resultados obtenidos e indique en qu cromosoma se localiza el marcador molecular. Solucin: Si el locus no est en un cromosoma cualquiera de los que se encuentran en 2 copias (es decir no est en el monosmico) tendr una segregacin 1:1 mendeliana normal y todos sus descendientes sern heterocigotas 200/180. Si el locus est en el cromosoma crtico lo que realmente estamos cruzando es 200/200 x 180, y de esta descendencia, los individuos con 9 cromosomas sern 200 y los de 10 cromosomas sern 200/180. Si observamos la tabla vemos que este razonamiento se compatibiliza con los resultados del cromosoma 3. Por ej. para el cromosoma 1: 200/200 x 180/180 todos 200/180 (sean mono- o dismicos) Para el cromosoma 3: 200/200 x ---/180 50% 200/180 (dismicos) y 50% ---/200 (monosmicos) 4) En una enfermedad gentica humana se observa la siguiente conformacin cariotpica de los pares de cromosomas 7 y 21 (notar las similitudes de bandeo mostradas por las llaves). a) Cual fue el origen de esta anomala y qu nombre recibe? b) En caso de examinar la gametognesis de este individuo esperara observar alguna peculiaridad durante la meiosis? Cul? c) Podra implicar una reduccin en la fertilidad de las gametas? Por qu? Respuesta: a) Translocacin recproca desigual 7:21 b) S. Multivalentes formados entre el 7, el 21 , el 21 translocado, que se denomina 217, y el 721, que es el otro producto recproco de la translocacin desigual. c) S, como consecuencia de lo descripto en b) se afectara la migracin a los polos provocando aneuploidas capaces de inviabilizar las gametas 5) Un investigador trat con colchicina las famosas arvejas de Mendel y obtuvo los tetraploides correspondientes. Por otro lado, tambin introdujo un transgn proveniente del trigo que estabiliza una forma de herencia diploide evitando la formacin de multivalentes (por ej. tetravalentes) que puedan oca-

Como los bivalentes se forman al azar, ya que son producto de autoploliploida por tratamiento con colchicina, la frecuencia de individuos aaaa en la F2 es 1/ 36 (1:35). Todos los cromosomas son homlogos, si no estuviera el transgn se formaran todos cuadrivalentes.
6) En un reciente trabajo de Learmonth y colaboradores se estudiaron los efectos a largo plazo de las artroplastas (injerto o reemplazo de partes seas por prtesis metlicas) que generan debris (restos) en linfocitos de sangre perifrica. Estos restos metlicos se suelen alojar en las adyacencias de la prtesis, ganglios linfticos, hgado y pncreas. Para ello realizaron hibridacin in situ (FISH: preparados cromosmicos a los cuales hibridaron) con sondas especficas del cromosoma 1 marcadas con un fluorforo (rodamina) que lo tie especficamente de rojo, contrastando con el color azul del resto de los cromosomas (teidos con DAPI). Observaron que cuando se utilizan prtesis con cromo-cobalto se observa un aumento de 3,5 veces de conformaciones cromosmicas del tipo de la figura 1 y 2,5 veces de las de la fig. 2 respecto a la utilizacin de prtesis de acero inoxidable. a) Defina el tipo de mutaciones cromosmicas estructurales y numricas detectadas en las figs. 1 y 2. b) En el trabajo se hizo un especial esfuerzo para que el muestreo realizado se independizara de factores como el hbito de fumar, el nmero de radiografas, etc. Por qu?

Fig. 2

Fig. 1

c) De acuerdo a lo que muestra este trabajo. En principio, las prtesis de cromo-cobalto inducen mutaciones somticas o germinales? Es decir, podran aumentar la probabilidad de que se produzcan malformaciones genticas en la descendencia de estos pacientes?

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d) En este trabajo solo se examinaron mutaciones de tipo estructural y no aquellas de tipo puntual? Se le ocurre algn modelo experimental (no humano) para estudiar este aspecto. Le servira este modelo para contestar con ms certeza la pregunta c)? Rta a) traslocacin y aneuploida (triploida) del cromosoma 1 b) Porque son otros factores mutagnicos comprobados que tambin aumentan la tasa de mutaciones y podran interactuar sinrgicamente (o no) con el factor que estoy estudiando. c) Somticas. En principio, no. (los debris no se acumulan en tejidos reproductivos) d) Los sistemas basados en ratones transgnicos vistos en clase de problemas injertados con prtesis o inyectados con debris metlicos en sangre, analizando distintos tejidos incluyendo el reproductivo. Pueden contestar otros sistemas como pueden ser los de intercambio de cromtides hermanas (por ej) pero este sistema no detecta tan bien mutaciones puntuales sino las cromosmicas o el test de Ames pero no podran examinar tejido reproductivo.

Gentica cuantitativa
1) La longitud media internodal en espigas de cebada de la variedad gran cervecera es de 4,24 mm (con baja variancia). En la variedad imperial la media internodal es de 6,34 mm (con baja variancia). La media de la F1 de un cruce entre las dos variedades tiene, aproximadamente, 5,4 mm (con baja variancia). La F2 da tambin 5,4 mm pero con un rango de variacin continuo desde un extremo parental al otro (alta variancia). El anlisis de la progenie de la autofecundacin de cada uno de los individuos de la F2 mostr 3 distribuciones entre sus descendientes: i) tipo gran cervecera con media de 4,24 mm y baja variancia, ii) tipo imperial de 6,34 mm y baja variancia y iii) igual a la F2. La longitud internodal en espigas de cebada, es un carcter discontinuo o cuantitativo?Cuntos loci estn involucrados en la segregacin del carcter?Por qu? Respuesta: La respuesta puede ser de distintas maneras (ver ms abajo) pero se debe concluir que la herencia involucra un nico locus y es tpicamente mendeliana (en este caso semidominante ) y no de tipo cuantitativa. Si gran cervecera es AA e imperial aa, la F1 es Aa (semidominante) y los individuos de la F2 son AA, aa o Aa, como lo demuestra el comportamiento de las respectivas pruebas de progenie. Se puede contestar que es un carcter discontinuo (medido cuantitativamente) o que es cuantitativo (por su forma de medicin) pero formado por un nico locus (QTL). 2) Una poblacin vegetal silvestre es sometida durante muchas generaciones sucesivas a un proceso de seleccin artificial basado en sembrar cada ao nicamente las semillas procedentes de plantas incluidas en el 20% de mayor produccin. Como consecuencia de la seleccin practicada, la produccin media aumenta gradualmente. Los valores de heredabilidad del carc-

ter produccin en dicha poblacin a lo largo del proceso selectivo sern a) creciente, b) decreciente, c) primero creciente y luego decreciente d) constante. Justifique su respuesta. Respuesta: Decreciente. La heredabilidad est en funcin directa con la variabilidad gentica (varianza genotpica), la cual disminuye con el proceso de seleccin.[Respuesta alternativa: debera ser decreciente y despus constante, una vez agotada la variabilidad genotpica]. 3) Dados los excepcionales conocimientos de Gentica que adquiri en tiempo rcord en este curso de verano y gracias a la devaluacin y sus bajas pretensiones salariales, una exitosa empresa textil exportadora de productos regionales decide contratarlo para mejorar la productividad y la calidad de la lana de sus rebaos de llamas. El establecimiento del NOA dispone de una poblacin de animales cuya produccin de lana y calidad de la fibra siguen una distribucin de tipo normal y que se muestran en A y B, respectivamente. Tal como aprendi en Gentica I, lo primero que hace es estudiar la heredabilidad del carcter y para ello dividi la poblacin en 3 subgrupos cada una (denominados 1, 2 y 3 en la figura) de acuerdo a los valores promedio de produccin o calidad X1, X2 y X3, respectivamente). Seguidamente dej que los individuos de cada una de las subpoblaciones creadas se aparearan entre s y analiz la distribucin de valores de la siguiente generacin. Como se ve en la figura, los valores promedio de la nueva generacin coincidieron con los valores promedio de cada una de las subpoblaciones paternas en A (productividad). En cambio en B (calidad) coincidieron con el promedio de la poblacin original sin seleccionar.

a) Cmo fue la heredabilidad de los 2 caracteres? Debido a que es un profesional muy serio, antes de hacer un diagnstico prefiri esperar un par de aos ms y ver que ocurre en una segunda generacin antes de emitir un diagnstico y una estrategia de mejoramiento. Para ello, sin aplicar nueva seleccin, dej cruzar entre s a los nuevos individuos pertenecientes a las subpoblaciones. b) Cmo seran las distribuciones en esta segunda generacin? c) Cul fue su diagnstico y qu plan de mejoramiento present a la empresa? Aprovechando su estancia en el NOA decidi hacerse un viajecito a Bolivia y, en el lago Titicaca observ unas llamas con una fibra de excepcional calidad (muy superior a cualquiera de las del establecimiento

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argentino) aunque de productividad de lana muy inferior. Indeciso, compra esas llamas y vuelve al establecimiento a realizar nuevos cruzamientos entre ellas y las argentinas. Para su sorpresa, entre los descendientes no slo obtiene individuos con un aumento de la calidad de la fibra, sino que algunos (muy pocos) animales tienen una productividad superior a la observada en la subpoblacin seleccionada de A. Desconfiado, supone que los valores de estos pocos individuos podran estar influidos por el ambiente, por lo que los pone aparte, deja que se crucen entre s y analiza sus hijos. Resultado: la alta productividad se mantiene y obtuvo las mejores llamas de la historia. d) Cmo explica su buena suerte? Es decir, a qu fenmeno gentico atribuye este resultado? A todo esto, ya pasaron varios aos y decide ir con sus resultados a pedir un considerable aumento de sueldo. Sin embargo, a esta altura del partido, vuelve Cavallo al ministerio de Economa, reimplanta la convertibilidad y la empresa entra en crisis, entre otras cosas porque, durante los aos en Ud. haca estudios genticos, la productividad no aument y decidieron prescindir de sus servicios por ineficiente (no vale la pena hacer investigacin y desarrollo en la Argentina, le argumentaron) y le vendieron las llamas a Telecom para su famosa propaganda (porque observaron que llamaban por telfono muy seguido a sus familiares bolivianos). Mientras tanto, su hermanito ms chico decide seguir sus pasos y en la facultad aprende que un grupo en Australia, public un trabajo en el que encuentra una asociacin entre un RFLP correspondiente a un gen que interviene en la sntesis de la queratina en la lana en ovejas y que explica el 90% de la variabilidad (varianza gentica) del carcter calidad de la fibra. e) En base a toda esta experiencia y en no ms de 10 renglones qu hubiera hecho distinto (adems de votar con conciencia) para evitar este final? Nota: se castigar con -1 punto si la respuesta excede los 10 renglones. Respuesta: a) 1 (100%) y 0, respectivamente, b) igual, c) Que, dada la alta heredabilidad de A, puedo tratar de seguir seleccionando individuos en base a produccin y que, dada la nula heredabilidad de B, no hay variabilidad gentica y no tiene sentido seleccionar para este carcter. Deberan buscarse otras fuentes de variabilidad. d) Segregacin transgresiva. e) Hubiera tratado de hacer mis primeras evaluaciones utilizando la mayor diversidad gentica disponible (y no limitarme a los animales del establecimiento) y, en paralelo, hubiera buscado la literatura cientfica relacionada para evaluar la factibilidad de encontrar marcadores moleculares para el carcter estudiado que me sirvan para seleccionar con ms eficiencia. Por ejemplo, intentara usar el gen de oveja como sonda que, si hibrida con el gen homlogo de la llama, podra servir para observar si encuentro un polimorfismo til en llama para RFLP (u otra tcnica como STS, SSCP, etc.), es decir, ver si hay cosegregacin de un marca-

dor con mi caracterstica de inters para as usarla en seleccin asistida por marcadores. Respuesta alternativa: llamas transgnicas con el gen de la oveja. 4) En el mejoramiento bovino se busca un aumento ms rpido del peso de los animales en determinados ecosistemas de pasturas semitropicales. Se trata de un carcter cuantitativo y aditivo. Para ello se cruzaron vacas con cebes (de aumento ms rpido, pero cuya calidad de carne es menor) obtenindose una F1 con valores intermedios (la media se ubic equidistante entre la media de las vacas y la media de los cebes). La varianza fue muy similar tanto a la de vacas como de cebes (que a su vez se parecan entre s). Los integrantes de la F1 se cruzaron entre s para obtener una poblacin segregante. a) Cmo supone que fue la media de esta poblacin segregante? mayor, menor o similar a la de la F1? b) La varianza fue mayor, menor o igual a la de la F1? Entre los individuos de esta poblacin se encontraron algunos que superaron en aumento de peso a los mejores cebes. c) Conoce alguna explicacin gentica a este fenmeno? Respuestas esperadas: a) Similar, b) mayor, c) segregacin transgresiva 5) Un conocido protagonista de Los Simpsons que habitualmente se disfraza de Vaquita de San Antonio se dedic a la lucrativa venta de dichos colepteros pero, para hacerlos ms atractivos, necesitaba aumentar su tamao dado que naturalmente tienen una media de tan solo 5 mm. Seleccion los machos y hembras ms grandes que encontr (promedio de 8 mm) pero como eran muy pocos decidi reproducirlos para as disponer de volumen para la venta. Para su sorpresa, la descendencia no mantuvo la esperada longitud media de 8 mm sino que baj a 6,5 mm. Muy enojado por la baja performance de los bichos, los tir y se fue a recoger colepteros nuevos y repiti el procedimiento de seleccin (con idnticos resultados). a) Por qu baj la longitud promedio de la descendencia? b) Puede calcular la heredabilidad de este carcter? Despus de admirar el tamao de las cucarachas del bar de Moe, abandon la idea de seleccionar y se le ocurri criarlas con una dieta que le recomend Homero. De esta manera logr aumentar el promedio de longitud de 5 a 6,5 mm (lo mismo que arriba!) c) Es casualidad que ambas medias hayan coincidido? Finalmente decidi contratarlo como consultor d) Qu hubiera hecho Ud en caso de querer convertirse en vendedor de vaquitas de San Antonio super size, disponiendo nicamente de una regla milimetrada y sabiendo que en Springfield NO existen laboratorios de marcadores moleculares o ingeniera gentica? Respuestas esperadas 1) a) Porque el tamao observado es la combinacin de una estructura gentica poblacional particular (va-

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riancia gentica) que puede segregar y de la influencia ambiental (no heredable) o variancia ambiental. b) La seleccin diferencial fue de 8 5 = 3 mm y la respuesta selectiva 6,5 5 = 1,5 mm. Por lo tanto, la heredabilidad fue de h2 = 1,5/3 = 0,5 (50%) c) S (o no, en el sentido de que se reduce a un mnimo la variancia ambiental permitiendo expresar el mximo potencial gentico; de todos modos sigue siendo casualidad que coincida una media general nicamente debida a factores genticos de una poblacin sin seleccionar con los de una poblacin seleccionada en la que no se afect la influencia ambiental) d) Volver a seleccionar en la descendencia y en las siguientes generaciones hasta que la heredabilidad se acerque a 0 (adems de darles la dieta de Homero). 6) La resistencia al patgeno Sclerotinia sclerotiorum en girasol es un carcter complejo que involucra distintos loci y se evala cuantativamente mediante un ndice de dao en el captulo floral. Para evaluar la heredabilidad del carcter se sembraron 100 plantas de una lnea moderadamente resistente (no existen variedades totalmente resistentes al patgeno) en Balcarce, obtenindose una media de ndice de dao de 0,20. De esta poblacin, se seleccion un grupo de individuos de mayor resistencia, con una media para el ndice de dao de 0,10, como padres para la siguiente generacin, siendo la media de esta ltima generacin de 0,13 para la variable evaluada a) Cul es la heredabilidad del carcter resistencia? Cuando el mismo experimento, utilizando el mismo material y presin de seleccin se realiza en otra localidad, la heredabilidad obtenida fue de 0,50 b) A qu se debe la diferencia en la heredabilidad obtenida en ambos casos? Sobre una poblacin segregante F2 proveniente del cruzamiento de la lnea resistente estudiada arriba y una lnea susceptible al patgeno, se realiz un estudio con marcadores moleculares codominantes, detectndose 2 marcadores estrechamente ligados a 2 QTLs, uno en el grupo de ligamiento 8 (GL8) y el segundo en el grupo de ligamiento 6, que explican el 50 y 35 % de la varianza gentica del carcter resistencia respectivamente. En base a estas conclusiones, c) Descartara la presencia de otros QTLs para este carcter en la poblacin en estudio? El siguiente esquema representa el patrn para el marcador asociado al QTL del GL8 en el padre moderadamente resistente (MR), en el sensible (S) y en 10 individuos F2, evaluados como moderadamente resistentes o sensibles (ver fila superior) Padres Resistentes Susceptibles MR S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ------- ---------------- ---- ---- ---- ---- ---Cmo explica el patrn encontrado para el marcador en estudio en los individuos 3 y 5 cuya evaluacin fenotpica es moderadamente resistente? Rta: a) h2 = Xf Xo = 0,7

Xs - Xo b) a la varianza ambiental e interaccin genotipoambiente (carcter cuantitativo, con alta componente ambiental). c) Dado que entre los dos QTLs explican el 85 % de la varianza gentica, es muy probable que haya otro/s QTLs de efecto menor en otros grupos de ligamento no detectados d) Se esta evaluando con un marcador ligado a un solo QTL y la resistencia moderada observada puede deberse a la presencia de otro/s QTL/s en esos individuos. Tambin pueden decir que hubo recombinacin entre el marcador y el QTL, pero dado que se dijo que estaban estrechamente ligado se espera que deduzcan la primera respuesta

Gentica de poblaciones 1) La apolipoprotena E (apoE) fue implicada como

un factor de riesgo en las enfermedades cardiovasculares y en el Alzheimer. Se describieron 3 alelos comunes: apoE2, apoE3 y apoE4. La tabla muestra la distribucin poblacional de los distintos genotipos: Cul es la frecuencia del alelo apoE2? a) 0,002 b) 0,040 c) 0,076 d) 0,175 Respuesta:b) [f(E2)= (2x2)+(64)+(7)/(937x2)=0,040] GenotipoE2E2E2E3 E2E4 E3E3E3E4E4E4Total N indiv 2 64 7 684 169 11 937 2) Uno de los riesgos cientficamente aceptados en el uso de las plantas transgnicas Bt (es decir, conteniendo un transgn que codifica para la entomotoxina de una cepa de Bacillus thuringiensis) con resistencia a los insectos, es el que se refiere a la predecible seleccin de mutantes de insectos resistentes. Varios factores contribuyen a predecir este desarrollo de resistencia: la historia previa de uso de insecticidas qumicos y, ya ms especficamente, la seleccin de insectos resistentes en cultivos orgnicos que utilizan este insecticida como mtodo de control biolgico, el uso generalizado de plantas resistentes que reemplazaran a las sensibles (alta presin de seleccin), la presencia de un nico transgn codificante para una nica protena (en lugar de varias) lo que implica que con una nica mutacin de un gen contra esa protena se obtendran mutantes especficamente resistentes para esa protena, y datos de seleccin en condiciones de laboratorio. Por ejemplo, el grupo de Gould (PNAS 89:7986, 1992) seleccion la cepa mutante YIID2 mediante alimentacin artificial en medios conteniendo dosis subptimas de la toxina por nueve generaciones. El anlisis gentico de la mutante utilizando marcadores moleculares indic la presencia de un gen de resistencia mayor de expresin recesiva. El modo de accin del gen es disminuir la capacidad de unin de la toxina a las protenas intestinales. Que son blanco de la toxina. Tambin se demostr que esta mutante es capaz de atacar exitosamente al algodn transgnico comercial en condiciones de invernculo. Si bien ninguno de los datos anteriores demuestra que vaya a haber resistencia funcional en condiciones de campo,

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los mismos contribuyen a la construccin de posibles modelos tericos que pueden ayudar a manejar el desarrollo de estas resistencias y, por lo tanto, el impacto ambiental sobre la estructura gentica poblacional de la plaga. El escenario que se predice en los modelos es la presencia de frecuencias poblacionales muy pequeas de genes de resistencia (r), recesivos o semirecesivos, que requieren estar en homocigosis para conferir una resistencia eficiente (rr). En otro trabajo publicado por el mismo grupo (PNAS 94:3549, 1997), se trat de estimar la frecuencia de alelos de resistencia en poblaciones no expuestas a la entomotoxina de B. thuringiensis mediante el siguiente procedimiento: i) colocaron trampas en regiones geogrficas diversas conteniendo feromonas femeninas para atrapar insectos machos, ii) cruzaron estos insectos con la cepa de hembras mutantes de laboratorio YIID2 descripta arriba, iii) de esta manera analizaron 1028 familias derivadas de los cruzamientos, de las cuales 4 mostraron segregar cerca de un 50% de resistentes. a) Cul son las frecuencias gnicas suponiendo equilibrio de Hardy-Weinberg? Es decir, calcule p y q. b) Qu frecuencia de individuos resistentes (rr) esperara encontrar? c) En base a su respuesta anterior, por qu le parece que utilizaron un procedimiento tan complicado como es hacer estos cruzamientos (y evaluar su genotipo mediante pruebas de progenie) en lugar de tomar directamente insectos a campo y probar (tambin directamente) su resistencia? d) Por qu era tan importante hacer el experimento con poblaciones naturales no expuestas previamente a la toxina? e) Todo esto es previo a la introduccin de las transgnicas Bt, las cuales actuaran seleccionando qu genotipos? i) los rr, ii) los rs, iii) los ss, iv) los rr y los rs. Explique. f) Dentro del esquema de utilizacin de refugios para el control de resistencia qu proporcin de plantas no transgnicas debo mantener para que haya suficientes insectos sensibles (ss + sr) para garantizar que sobrevivan para mantener algo parecido a un equilibrio de Hardy-Weinberg si se quiere mantener una frecuencia de alelos r menor al 10% (frecuencia de r = 0,1)? Se presupone que las polillas se aparean y distribuyen al azar sin distinguir si los huevos que depositan estn sobre plantas transgnicas o no transgnicas, por lo que la proporcin de plantas es sinnimo de proporcin de insectos que deben quedar vivos. Para hacer el clculo suponga, adems, que no hay un efecto de seleccin importante a lo largo de las generaciones que cambie las proporciones previamente calculadas, como ser que todas las resistentes sobrevivan independientemente de que les haya tocado en suerte crecer y alimentarse en una planta transgnica como no transgnica.

Solucin: Datos: 1024 de los 1028 insectos machos colectados fueron SS (porque mediante el cruzamiento pruba con las hembrasdoble recesivas rr, el 100% de la descendencia dio susceptible, es decir Sr). Por lo tanto p2= 1024/1028 = 0,996 (observado). Los heterocigotas fueron 4 (Sr x rr 50% rr + 50% Sr). Por lo tanto H = 2pq = 4/1028 = 0,004. No se observaron homocigotas recesivos (rr) por lo que el q2 observado (no el esperado) fue 0. a) p = raz cuadrada de 0,996 = 0,998, 2pq = 0,004 q = 0,004/ 0,998 x = 0,002 b) R = q2 = 0,000004 es decir, el valor esperado es de 4 resistentes (homocigotas rr) cada 100.000 insectos. c) Sin contar los errores de muestreo, habra que haber muestreado un mnimo de 25.000 insectos para pescar (con suerte) uno resistente. Si adems se quiere calcular un error estadsticamente confiable, la muestra tendra que haber sido an mucho mayor. El mtodo empleado es ms engorroso, pero con un poco ms de 1000 insectos recolectados se pudieron obtener datos relativamente fiables. Respuesta esperada: porque al detectar heterocigotas (en vez de los homocigotas recesivos) se necesita analizar una muestra menor. d) Porque la seleccin distorsiona el equilibrio de Hardy-Weinberg. e) Los rr. Los rs son, selectivamente iguales a los ss. Si bien van a aumentar, lo hacen porque al aumentar rr aumentan automticamente los rs. f) q = 0,1 R = q2 = 0,12 = 0,01. Es decir, que tengo que garantizar un nivel de resistentes menor a 0,01 cuando tengo una proporcin real (sin usar plantas Bt) de 0,0004%. Quiere decir que dejando muchsimo menos que un 1% de plantas no transgnicas me garantizara dichas proporciones (para ese gen en particular). 3) Hagamos un poco de ciencia-ficcin. Supongamos que la ciencia mdica avanzase hasta el punto de que, con un tratamiento aplicado a lo largo de toda la vida, la especie humana dejase de sufrir nuevas mutaciones. Admitamos tambin que tal tratamiento se aplica a toda la humanidad en el intervalo de una sola generacin, y se mantiene as en lo sucesivo. Qu ocurrira con la variabilidad gentica en las sucesivas generaciones? Aumentara? Desaparecera? Se mantendra? Explquese tanto como pueda. Respuesta: Suponiendo panmixia, ausencia de seleccin y el alto nmero poblacional de la especie, la variabilidad debera mantenerse constante (en equilibrio de HW). Por lo tanto, se mantendra. Lo que se impedira es el surgimiento de potenciales nuevos alelos inexistentes en la poblacin actual. 4) Segn algunos las rubias (no teidas) estn condenadas a la extincin cuando la poblacin humana mundial llegue a total panmixis. El alelo determinante del color rubio del principal gen involucrado en el color del cabello es de expresin recesiva. Si mediante un clculo arbitrario estimamos que la cantidad de rubias/os es de 22 millones sobre una po-

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blacin mun ndial de 6.60 millones y hay 50 mill 00 lones de heterocig gotas. a) Cul ser la proporc r cin de rubios cuando la p poblacin llegue a equilibrio de Hardy-W Weimberg? b) Qu pro oporcin de r rubios de la p poblacin ten ndrn los dos padr no rubios res s? Rta: p=R+1 1/2H= 22/6600 +50/6600 0*1/2= 0,007 71 q=1-p= =0,9929 En equilibrio H-W la poblacin de rubios ser n s p2=5*10-5 b) NO era n necesario con ntestar. La re espuesta era q2 2pq=0,014. La proporc cin de matr rimonios (0,0 2= 014) -4 2*10 Hijos * 2 2*10-4 = 5.10-5

En B se sombr n rean: II 2, 3, 5; III 1, 3, 4, 8,10,11; IV , tod dos 2) El siguiente rbol mues una fam e stra milia que hereda un forma seve de hidroc na era cefalia causa por una m ada mutac cin en el gen L1CAM (l localizado en el cromoso n oma X) y que pres ) senta una he erencia reces siva. Utilizan ndo un marcador in n ntragnico qu tiene tres alelos (12, 8 y ue s 7) se hace el d diagnstico del propsit (nombre q to que rec ciben los p pacientes p parte de los genetis por e stas m dicos y que se in ndica con una flech ha).

Genticas no Mendel lianas

1) La neuro opata ptica hereditaria de Leber (N a NOHL) es una enfer rmedad rara en la especie humana qu proue duce una r pida atrofia del nervio ptico y que g genera ceguera en adultos jve enes. Esta en nfermedad es cast racterizada por una prd dida bilatera de la visi cenal n tral mientra que se ma as antiene la visin perifri La ica. genealoga de la izquier muestra la herencia d esta rda de enfermedad en una fami bastante amplia: d ilia

Cul es el tipo de he erencia ms probable p s para la NOHL en la especie h humana? Ex xplique su ra azonamiento. Segn su hi iptesis com mplete la gene ealoga de la derea cha indicando los indivi iduos afectad dos. Respuesta: Observamo que todos los descend os dientes

independien ntemente de su sexo, mu uestran el fe enotipo de la madre [Esto no p e. podemos exp plicarlo si el carcter estuvier en los cro ra omosomas se exuales, ya que el fenotipo de la descenden no depe ncia ende de si el carcter es domin nante o recesivo, o de la direccin del crua zamiento, s sino slo del fenotipo de la madre]. Por lo l e tanto podra amos asegura que este c ar carcter es u caso un de herencia materna.

C fue el resultado del d Cul diagnstico? a) La propsito es portador del alelo mutante o ra m b) La propsito es heteroci o igota no portadora c) La propsito es homocig para el alelo normal o gota a d) El resultado no permite dar un diag o e gnstico prec ciso sob el genotipo. bre Re espuesta: b) 3) En el antig guo testamento, Dios dispuso que los d hijos de Isaac y su mujer c constituiran la nacin jud da. Sin embargo, l esposa de Isaac era ba n la astante mayo y or sup puestamente infecunda. Segn las co ostumbres lo ocales de la poca ella eligi u mujer al s a, una lternativa con la n qu Isaac tuvo un hijo: Esa Un da, la anciana mu ue a. a ujer le coment a I Isaac que est taba encinta y tuvo un h hijo: cobo. Poster riormente, Ja acobo se cas con 5 herm maJac nas (de otra fa familia) y tu 13 hijos y varias hij uvo jas. uponiendo qu pudiera ac ue cceder a mu uestras de tej jido Su de Isaac, Esa Jacobo y de los hijos de Jacobo y, , o adems, pudie extraer D ese DNA y analizarlo: a) Cuntos ha aplotipos o s secuencias nucleotdicas din fer rentes en la regin del c cromosoma Y en la reg gin del gen Sry obt tendra? Justifique. b) Cuntos tip de secue pos encias nucleo otdicas difer rentes del D-loop de DNA mi s itocondrial obtendra? Ju o ustifiq que. So olucin: a) Uno slo: el que prov viene de Is saac (he erencia ligad al sexo, etc da c.) b) 4: el de Isaa (donado po su madre) el que prov ac or ), viene de la madre de Esa, e que provie de la ma e el ene adre de Jacobo y el que provien de la mad de las 5 h ne dre herma anas (herenci materna...) ia 4) Aproximada amente el 0, ,3% de la hu umanidad tiene na ad leve llamada LHON pro a oduun enfermeda gentica l cid por una m da mutacin que substituye una Asn por u u una As en el comp sp plejo NADH mitocondria H al.

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a) Cules son las frec cuencias gen notpicas par este ra carcter? S Seran distin ntas a las fre ecuencias al licas? por qu? b) Si aparec ciese una cor rriente eugen nsica que pr reconice mejorar la raza hu r umana que p proponga eliminar las enfermedades gen ticas por m mtodos dr sticos deberan p prohibir tene hijos a tod los indiv er dos viduos con sntomas de LHON N?por qu? Atencin: ignore ? los datos qu se enumer a continu ue ran uacin para c contestar esta preg gunta. Gracias a lo conocimie os entos adquiridos en gent I y tica para buscar argumentos cientficos para enfren r s ntar al movimiento eugensico a Ud se le o o ocurre hacer 2 estudios: i) diagnstico molecular c confirmatorio y ii) cuantificaci de la fre in ecuencia de aparicin es spontnea de esta mutacin. E el primer caso encontr que, En r adems de los enfermos, existen individuos c con la mutacin p pero asintom mticos (debi idos a heter roplasmia: presen de mitoc ncia condrias con genotipo normal y mutante en una nica c clula) y en el segundo que la ignificativa. misma es si c) Argumen por qu estos estudio demostrar nte os ran la inutilidad p prctica de encarar la s seleccin ne egativa propuesta por los eugen nsicos. Respuestas a) Este es u carcter m s: un mitocondrial por lo que, salvo a algn caso r raro de heter roplasmia, el alelo est presen o ausente (como si fuera una e nte e especie monoploide Por lo t e)]. tanto, las fr recuencias a allicas son iguales a las ge enotpicas f( f(LHON) = 0,3% F(normal) = 0,97% b) A las mu ujeres (y no a los varone porque s trata es) se de una herencia materna no hay nec a, cesidad de ev vitar la reproducci de los varo n ones dado qu no transm ue miten la enfermedad d c) Despu de la sele s eccin negati la segreg iva gacin somtica de los heteroplsticos y la aparicin co e onstante de nueva mutacione similares llevaran la enferas es medad gen tica a las mismas cif fras actuales (despus de algunas pocas generaciones) 5) El seor sealado con un crcu rojo ulo tiene una ra enferara medad gen tica y le pregunta: -V que Vos hiciste un cu rpiurso do de gent me tica podrs aver riguar qu probabilidad tengo de d transmitirle esta enfermedad a mis futuros hijos? M seora Mi no posee est enferta medad pero con la o gentica nun se nca sabe!. Me tendr que hacer un anlisis yo o m seora? mi

L podr cont Le testar sin nec cesidad de pe edirle un an lisis gentico detallado (pedi s igr) a la seora? Justifique bre evemente.

Rt La proba ta: abilidad es n nula porque se trata de un cla ejemplo de herencia materna. No requiere de aro a N m anlisis. s Re espuestas alt ternativas v lidas a esta pregunta (no a pedidas): a) Imprinting m materno b) podra ser un gen auton n mico recesiv vo En el caso b), S debera h n hacer anlisis genticos. s

Evolucin Mejoram n, miento, Biod diversidad 1) La papa-oca es un culti andino de origen pre a ivo d ecolom mbino (fue, para los inc tan impo cas, ortante como la o pap comn) q se cultiv en el NOA y es de g pa que va gran int ters evolutivo, antropol lgico y eco onmico. Per rtenece a la esp pecie octoploide Oxalis tuberosa. El s n mero bsico de cromoso o omas permit agrupar e ti esta esp pecie con otr dentro d gnero y postular su o ras, del origen evolutivo por alopolip n ploida o aut topoliploida de a esp pecies del g nero. Para c corroborar es agrupami ste iento mediante est tudios de ev volucin molecular y cuantific la similitu gentica c otras esp car ud con pecies del g nero, Tosto y co (Plant Sy , ol. ystem Evol 2000) utiliza 2 aron

AF FLP para ob btener patron de banda polimrfi nes as icas par as genera un dendrog ra ar grama.

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a) En la comparacin se incluy a O. articulata, la cual no pertenece al agrupamiento. Por qu? b) En la comparacin se incluyeron varias accesiones (individuos) de cada especie Por qu? c) Observando el dendrograma y comparando distintas especies podra intuir si la variabilidad gentica de la especie cultivada es relativamente muy baja debido a la poliploidizacin, mejoramiento y seleccin? Por qu? Respuestas esperadas: a) Es un control externo (outgroup) y sirve para relativizar las distancias genticas o los ndices de similitud que se obtienen dentro del agrupamiento en estudio. b) Para tener una idea del grado de variabilidad intraespecfica y compararlo con la interespecfica. c) Salvo por 2 individuos que parecen idnticos, el resto parece ser muy variable. A juzgar por el largo de las ramas, la variabilidad intraespecfica de O. tuberosa es no es menor a la variabilidad intraespecfica de las otras especies no cultivadas analizadas. 2) Existen teoras en conflicto acerca del origen del hombre. Existe consenso en que una especie anterior, llamada Homo erectus, se origin en frica y se movi hacia otros continentes hace ms de un milln de aos. Posteriormente a este suceso empieza la controversia. La evidencia paleontolgica parece apoyar la llamada teora de evolucin multiregional que postula que el Homo sapiens evolucion local y paralelamente en Europa, Asia y frica a partir del Homo erectus. Cuando se realizaron estudios moleculares con DNA mitocondrial surgi otra hiptesis (llamada out of Africa igual que la famosa pelcula) que postula un origen nico africano del Homo sapiens hace apenas 200.000 aos. El hombre moderno se habra movido (igual que el Homo erectus) fuera de frica, desplazando (y posiblemente extinguiendo) a otros homnidos. Los fsiles de los hombres de Neandertal ofrecen una oportunidad para confrontar ambas hiptesis. Los neandertales son homnidos descendientes del Homo erectus que vivieron en Europa entre 300.000 y 30.000 aos atrs que, de acuerdo con la teora africana, fueron desplazados por el hombre moderno (hombre de Cromagnon) procedente de frica (o Asia central) hace unos 50.000 aos atrs, mientras que la teora multitregional apoyara una relacin evolutiva entre neandertales y los pueblos europeos ms antiguos (como por ejemplo, los celtas). A partir de huesos fsiles se aisl DNA cuyas secuencias mitocondriales mostraron que sobre 994 nucletidos analizados, un promedio de 27 posiciones mostraban diferencias entre humanos y el neandertal, mientras que los DNAs humanos de muestras de los ms diversas procedentes de todos los rincones del mundo tienen diferencias en 8 posiciones. El fenograma obtenido se muestra a continuacin. a) A cul de las 2 hiptesis apoyan estos resultados? Explique b) Podra afirmar, con estos datos, que los neandertales (hasta ahora llamados Homo sapiens sbp neander-

talensis) pertenecieron a una especie distinta al Homo sapiens sbp sapiens? Por qu?

Neandertal Humanos modernos (incluyen blancos, negros, australianos, amerindios, etc)

c) Por qu se utilizaron secuencias mitocondriales y no secuencias nucleares? Respuestas: a) A out of Africa porque muestra que neandertales y cromagnones forman clusters (agrupamientos) muy separados entre s. Si fuera cierta la hiptesis multiregional se esperaran mayores similitudes. De todos modos, hubiese sido interesado usar un outgroup (control externo) para relativizar estos valores. b) S, por lo explicado en a) aunque para estar seguro necesitara comparar con, por ejemplo, el chimpanc. c) Porque las secuencias nucleotdicas mitocondriales tienen una tasa de mutacin (velocidad de evolucin) mucho mayor y permiten ajustar con mejor precisin el reloj molecular en estas distancias evolutivas. [Sin embargo, tambin se usa una secuencia nuclear ubicada en el cromosoma Y].

Genmica
1) Mediante el uso de marcadores moleculares se construy un mapa de ligamiento del ratn, usando como genotipos parentales de la poblacin de mapeo a dos lneas endocriadas que presentan una marcada diferencia respecto a su predisposicin a contraer Alzheimer experimental (enfermedad caracterizada por una acelerada desmielinizacin a nivel cerebral). Se localiz en dicho mapa de ligamiento, adems, un locus (gen de expresin recesiva) involucrado en dicha predisposicin. El mencionado gen (al que se denomin alz) mapea en el cromosoma 3, flanqueado a 10 cM y 13 cM por dos marcadores RFLP humanos denominados hs3 y hs1, respectivamente (Fig. 1) (Nota: fue posible usar sondas humanas ya que muchas sondas de esta especie hibridan con DNA de ratn debido a su alto grado de parentesco). Recientemente, un grupo de investigacin, clon molecularmente en humanos, un gen (gdm) involucrado en la regulacin de la produccin de mielina a nivel cerebral y lo mape en el cromosoma 8, flanqueado a 12cM y 15cM, por los mismos marcadores hs3 y hs1. En la publicacin de dicho trabajo, los autores reportaron la localizacin cromosmica del gen y su secuencia completa. Al leer este trabajo, se sospech (y con fundamento) que el gen de ratn podra ser un homlogo del gen

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humano. La amentableme ente ambos g grupos nunca colaa boraron par que esto se pudiera dem ra e mostrar. a) Cules fueron los fu undamentos de la sospech ha? b) Qu est trategia utilizara usted p para clonar, al menos parcialm mente, al gen supuestam mente homlo de ogo ratn (recue erde que el g de ratn est mapead pero gen do no est secu uenciado y n se sabe si la similitud de seno cuencia es a alta, ni tampo si hibridan entre s)? oco c) Cmo verificara, funcionalme ente, si el g de gen humanos cu umple la mis sma funcin que su hom n mlogo en ratones? Disee un experiment recordand que ? to do los genes y las protena humanas s funciona en as son ales ratones y vi iceversa.
Fig. F 1
cM cM c

10 13

hs3 gdm hs1

12 15 1

hs3 alz hs1

Hum mano

Ratn

Respuesta: a) La sint tenia evolut tiva (conserv vacin filogentica de mapas g a genticos ent especies empatre rentadas) y, tal vez, las caracters, ticas de los genes en cu s uanto a su rol fisiolgi ico. b) Clonado posicional ( (cualquiera de sus va ariantes es correcta). Otras altern nativas de clonado ingeniosas pu ueden llegar a aceptarse. c) Hacer es studios de co omplementacin en ratones tra ansgnicos (alz/alz, es decir homoc cigotas recesivos) us sando el gen humano n como transg gn. Espero que a ninguno se le ocurra hacer humanos r transgnicos para Alzhe eimer.. 2) El clonad molecular de genes do r de resistenc (R) a enfe cia ermedades en plantas e un viejo ob es bjetivo de los fitopatl logos que tra abajan en interaccin husped-pat tgeno. A fines de los 90 se clona aron los primeros ge enes R por es strategias de clonado p posicional (v figura) ver y en la actualidad ya hay decenas y de estos gen en el Gen nes neBank y otras bases de datos. Ud se invod lucra en un proyecto de este tipo

ra solver un nm mero de cues spar su tesis y tiene que res tio ones: En el paso s identificar marcador moleculares n se ron res lig gados al locus a distancias genticas del orden de los d 10 cM. En el p paso se obt tuvieron mar rcadores ms s cer rcanos de for tal de di rma isminuir las distancias fs d sicas para que en el paso p s n poder trabaja con un ar n mero no muy grande de clones. y a) Con qu tip de colecci po iones (librar ries) de clone es se trabaja para hacer esto? i) genmicos g ii) o de cDNA y por qu? b) Qu tipo de vectores se utilizan (pl e e smidos, fagos, csmidos, BAC o YAC) y porqu? C c) Suponiendo que los marcadores mole eculares emple eados (M1, M M3 y M4 son RFLP Cmo se M2, 4) Ps hace (metodol gicamente) para identifi los clone icar es 1, 2, 3 y 4 de la figura y su ordenamien posicional a nto (m mapa fisico)? d) Cul es el t tamao fsico aproximad (en kiloo do par de bases) de 1 unidad de mapa ge res ) d entico (1 cM M) en el ejemplo d la figura? de Por qu esta d diferencia de unidades? Cmo se mide cad una de ell da las? Un vez identificados los c na clones corresp pondientes a est regin cromosmica, s insertos se subdividen ta sus s n en tamaos m chicos (paso ) para su subclonado y s s tra ansferencia a plantas (pas so ) para ev valuar a estas lt timas fenotp picamente co omo R (resist tentes) o S (se ensibles) a la enfermedad a d.

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e) Para introducir los segmentos de ADN en plantas se requiere de algn paso de subclonado en vectores especiales? Se requiere, dentro de lo anterior, modificar el promotor y el terminador? Por qu? Se debe tener alguna consideracin acerca del genotipo que se va a transformar? Es decir se puede usar un clon de la misma planta que se us para clonar el gen de resistencia? En el ltimo paso (el ) se secuencian los insertos, se identifican las ORF (secuencias abiertas de lectura) presentes, las que se constituyen en candidatos a genes R. f) Cmo se identifica una secuencia ORF en un inserto? g) y si hay ms de una, cmo me doy cuenta de la correcta? h) Bioinformticamente de qu manera puedo asignarle una posible funcin al gen? Rta: a) Genmicos porque tengo representada una copia exacta del segmento cromosmico que estoy identificando, incluyendo regiones no codificantes que me van a servir para empalmar (identificar solapamientos entre clones) las secuencias con las que se arma el mapa fsico de la regin. Si usara clones de cDNA, no podra empalmar un clon con otro porque no habra secuencias comunes entre ellos. b) BACs o YACs porque son los que me permiten contener insertos ms grandes y as poder tener reprensada la regin cromosmica en el menor nmero de clones posible. c) Las sondas utilizadas para RFLP pueden utilizarse como sondas para inspeccionar (screenear) la genoteca y as identificar los clones que se corresponden al segmento cromosmico en estudio. El ordenamiento de los insertos lo puedo deducir de estas hibridaciones. S que el orden deducido del mapa gentico es M1-M3-M4-M2. El mapa fsico, en cambio, slo me permite ubicar M3 y M4 porque no tengo clones que abarquen a M1 y M2 (+ el gen que quiero clonar) y sean contiguos a M3 y M4. Por lo tanto, el inserto del clon 1 (que slo hibrida con M3) tiene que estar ubicado en un extremo y as sucesivamente. La ocurrencia de insertos que hibridan un marcador y al gen (clones 3 y 4) facilitan este ordenamiento. d) 600-700 kpb / 0,2 cM = 2000 3500 kpb Porque uma proviene del mapeo gentico que se realiza mediante cruzamiento y recuento de recombinantes (unidades de recombinacin o cM) y la otra por mapeo de restriccin donde se comparan los tamaos de los insertos com estndares de tamao molecular en kilo pare de bases. e) Si se decide utilizar transformacin mediada por Agrobacterium tumefaciens, se requiere subclonarlo en un vector Ti. En el caso de usar biolstica (can gnico), no hara falta subclonar en ningn vector es-

pecial. No se requiere cambiar secuencias regulatorias porque estamos trabajando con genes y secuencias nativas y el experimento no requiere cambiar la regulacin de su expresin. No se puede elegir un clon de la planta de la cual se clon el gen porque sera resistente independientemente del inserto que se le introduzca. Debera elegirse un genotipo susceptible a la enfermedad. f, g y h) Identificando codones de iniciacin (ATG) y terminacin (alguno de los 3 codones STOP) con programas informticos. Esto se podra complementar mediante la identificacin de secuencias consenso de promotores, terminadores, splicing, etc.Mediante el uso de BLAST y comparacin con otras secuencias ya publicadas.

Desarrollo, epigentica, etc.

1) Durante el desarrollo de la mosca Drosophila melanogaster participan varias molculas conocidas como morfgenos, siendo en las primeras etapas, de origen materno ( los mRNAs que codifican para dichos morfgenos se traducen en el huevo, pero provienen de las clulas nutricias maternas). Ejemplo de esto y responsables del establecimiento del eje anteroposterior son: -en la parte anterior del embrin, BICOID (bcd) y ms tardamente HUNCHBACK (hb), productos de los respectivos mRNA maternos. -en la parte posterior del embrin, NANOS (nos) y ms tardamente CAUDAL (cd), productos de los respectivosmRNA maternos. Se demostr tambin que: -la protena bcd reconoce el 3UTR del mRNA de cd y enla regin promotora del gen hb -la protena nos reconoce el 3UTR del mRNA de hb. I) Qu tipo de accin presentan bcd y nos segn lo comentado anteriormente? Para contestar complete el siguiente esquema con flechas de unin: (convenciones: activacin, ---| inhibicin).

II) Con toda la informacin que tiene acerca de bcd, complete los fenotipos que espera observar en los experimentos de la Fig asignando en cada caso, alguna de las 4 opciones que se muestran debajo de la figura, en donde se ha ensayado el agregado de mRNA bcd en embriones con diferentes fondos genticos En la Figura siguiente, complete (con flechas) el esquema de los resultados de inyeccin de mRNA de bcd.

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Rta I) bcd nos

gen HB

mRNA

hb

cd

mRNA cd

hb

Explicacin: bcd y nos son los morfgenos de la parte anterior y posterior: bcd actua como factor de transcripcin para hb regulando positivamente su transcripcin, pero tambin es un inhibidor de la traduccin del morfgeno cd, que es ms tardo. Anlogamente, nos es un inhibidor del morfgeno ms tardio de la parte anterior, hb. II) Explicacin: bcd es el morfgeno principal anterior, ya que donde se coloca, se generan zonas que darn lugar a estructuras anteriores (cabeza y torax). El esquema del primer experimento sera anlogo a una complementacin (mutante bcd-, con fenotipo WT por el agregado del morfgeno anterior en la zona correspondiente).
Desarrollo normal Desarrollo en mutante bcdinyectado adelante inyectado al medio iny. atrs en salvaje

Las 4 opciones para los 3 casos incgnita 2) Muchos tipos de cncer humano tienen su causa en la hipometilacin del ADN. Para estudiar este fenmeno se generaron ratones transgnicos conteniendo alguna de estas construcciones: i) Vector conteniendo un promotor de SV40 (constitutivo, proveniente de un adenovirus) controlando la expresin de la secuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en orientacin antisentido ii) Vector conteniendo un promotor de SV40 (constitutivo, proveniente e un adenovirus) controlando la

expresin de la secuencia de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en orientacin sentido iii) Vector conteniendo el promotor constitutivo proveniente del fago controlando la expresin de la secuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en orientacin sentido iv) Vector conteniendo el promotor constitutivo proveniente del fago controlando la expresin de la secuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en orientacin antisentido

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Se sabe que la enzima Dnmt1 controla la metilacin del ADN en ratones y que su sobre-expresin permite metilar exhaustivamente todo potencial ADN metilable y que su disminucin causa una sustancial hipometilacin del ADN en todos los tejidos. a) Cul de los 4 vectores usara? Por qu? b) En base al vector elegido, cmo espera que sea el grado de metilacin general del ratn transgnico? Explique el mecanismo c) Con cul de las siguientes tcnicas corroborara que el ADN est hipometilado? Justifique: i) digestin con sendas ER que reconocen sitios metilados y no metilados, respectivamente, seguido de Southern Blot con la sonda Dnmt1 ii) ensayo de proteccin a la digestin por ADNasaI iii) preparacin de ARN de ratn salvaje y ratn transgnico, seguida de Northern Blot con la sonda Dnmt1 iv) digestin con ER que reconocen sitios metilados, seguido de Southern Blot con la sonda de igf2 (insulin-like growth factor-2, conocido gen que sufre impronta gnica) v) secuenciacin bisulftica genmica directa de Dnmt1y/o igf2 vi) secuenciacin bisulftica del cDNA de Dnmt1y/o igf2 Para la/s tcnica/s elegida/s indique los controles que hara. El ratn transgnico desarroll tumores en varios tejidos. Se determin que el gen Tm, candidato a causar tumores en hgado, se encontraba hipometilado en estos ratones. Ud. sabe que Tm presenta dos alelos, Tm1: sin sitio para EcoRI y Tm2 con sitio para EcoRI. d) Cmo hara para probar que Tm sufre impronta (imprinting) en ratones salvajes? Ud cuenta tanto con ratones homocigotas como con heterocigotas. e) Suponiendo que realmente existe impronta de Tm en el macho cmo sera la proporcin de Tm1 y Tm2 metilados y no metilados en la F2, es decir los nietos de un cruzamiento entre ratones homocigotas para Tm1 y Tm2? Respuesta a) El i) porque es el nico que tiene un promotor que se expresa en clulas eucariticas y tiene potencialidad de reducir la actividad de mutilacin bloqueando la traduccin del gen que codifica la enzima Dmnt 1. Contestacin no necesaria: Podra venir bien usar al vector ii) pero slo como CONTROL

contrastante del experimento. Las construcciones de los vectores iii) y iv) no se expresaran en clulas eucariticas porque slo funciona en bacterias. b) Altamente reducida. El RNA antisentido (complementario) de Dmnt 1 formar una doble cadena de RNA con el mensajero nativo dificultando su traducibilidad. Al reducirse la cantidad de enzima, se reduce tambin el efecto de la misma. c) La v) dado que este tipo de secuenciacin permite detectar nucletidos metilados. Se debe secuenciar un gen ya caracterizado como metilado. No sabemos si ste es el caso del gen Dmnt1 y lo ms probable es que no lo sea. En todo caso, Dmnt1 puede servir como control (no metilado). En realidad, el control ms importante es comparar con la secuenciacin comn (que es insensible a la metilacin) y (como se indica despus) ratones transgnicos vs no transgnicos. La iv) sirve si se compara el patrn de restriccin de ratn transgnico vs no transgnico. Tambin podra ser aceptada como vlida si se explica que se usa ER que NO reconocen sitios metilados, adems de los metilados para as comparar ambos patrones, dado que usar slo una enzima que s reconoce sitios metilados, no es capaz de diferenciarlos de los no metilados. Una complicacin (que no es necesario explicitar en la respuesta correcta) es que los genes metilados por imprinting tienen una copia (epialelo) metilado y otro no metilado. d) Cruzara 2 homocigotas: por ej. homocigotas para Tm1 y Tm2. Despus, analizara en la F1 la correspondencia entre metilacin (por ej. por secuenciacin bisulftica que, adems, me revelar la presencia/ausencia del sitio EcoRI en el epialelo metilado). (La otra alternativa es una doble digestin con ER sensible/insensibles a metilacin + EcoRI seguido de Southern). En base a cual alelo aparezca metilado determinar si el imprinting es paterno o materno. La confirmacin del imprinting se puede hacer realizando un cruzamiento prueba con el parental que no metila sus gametas. Debera ver un 50% de la progenie con metilacin para cada alelo. e) 25% de individuos Tm1 homocigotas con una copia de las 2 metiladas (Tm1m/Tm1), 25% Tm2 homocigotas dem (Tm2m/Tm2), 25% de heterocigotas con metilacin en Tm1 (Tm1m/Tm2) y 25% de heterocigotas con metilacin en Tm2 (Tm2m/Tm1).