Chapitre III : physiologie bactrienne I. les besoins nutritifs bactriens. Relation avec le type trophique...................................... 3 1.

les besoins lmentaires ..................................................................................................... 3 2. les facteurs de croissance ................................................................................................... 4 3. les besoins nergtiques ..................................................................................................... 4 4. la source dlectrons........................................................................................................... 4 5. la classification des bactries ............................................................................................. 4 II. les milieux de culture .......................................................................................................... 4 1. les constituants fondamentaux des milieux de culture ....................................................... 5 2. la classification des milieux de culture .............................................................................. 5 3. le dveloppement bactrien ................................................................................................ 9

III. les facteurs physiques influenant la croissance bactrienne ...................................... 10 1. la temprature ................................................................................................................... 10 2. le pH ................................................................................................................................. 11 3. loxygne .......................................................................................................................... 13 4. la pression osmotique ....................................................................................................... 14 5. la pression mcanique ...................................................................................................... 15 6. lhumidit ......................................................................................................................... 15 IV. les techniques dtudes de la croissance bactrienne.................................................... 16 1. la multiplication bactrienne ............................................................................................ 16 2. la mesure du nombre de cellules ...................................................................................... 16 3. la mesure de la biomasse .................................................................................................. 17 V. la croissance en milieu non renouvel.............................................................................. 17 1. la courbe de croissance..................................................................................................... 17 2. les paramtres dtats de la croissance ............................................................................. 18

3. physiologie des phases de la croissance ........................................................................... 18 4. modlisation mathmatique.............................................................................................. 18 VI. mode de vie des bactries ................................................................................................ 18 1. recherche de nourriture par chimiotactisme ..................................................................... 19 2. les biofilms ....................................................................................................................... 19

Chapitre III : physiologie bactrienne

I. les besoins nutritifs bactriens. Relation avec le type trophique Pour se dvelopper, les microorganismes ont besoins de 3choses. source dnergie source de carbone source dhydrogne et dlectrons 1. les besoins lmentaires les lments majeurs Reprsente 95% du poids sec de la bactrie. Carbone, azote, hydrogne, oxygne, soufre, phosphore Ces lments majeurs sont de concentrations proches du g.L Carbone, oxygne, hydrogne : besoin qui est satisfait partir dune mme molcule. Un microorganisme autotrophe est capable de synthtiser es mtabolites partir dlments minraux. Il na pas besoin de substances organiques. La source de carbone sera le dioxyde de carbone. Un microorganisme htrotrophe exige une source de carbone plus complexe afin de synthtiser tous ces mtabolites. Il est incapable de synthtiser tous ces mtabolites partir dlments minraux. Azote : synthse acides amins et des bases azotes et certains glucides. Soit elle est commune la source de carbone soit une molcule spcifique. Certaines bactries sont capables de fixer lazote atmosphrique. Soufre et phosphore : le soufre sert la synthse des acides amins et vitamine. Le phosphore sert la synthse des phospholipides. La source principale est le phosphate inorganique. Les lments mineurs Fer, calcium, sodium, potassium Rentre dans la synthse de cofacteurs et rentre dans la composition de la chane respiratoire. Les microlments Clnium, cuivre, nickel Elments indispensables pour la synthse de ces cofacteurs et coenzymes.

2. les facteurs de croissance Dfinition Molcules indispensables au dveloppement des microorganismes mais il narrive pas les synthtiser. Il va falloir amener ce facteur de croissance dans le milieu. Acides amins ou vitamines Relation avec les types trophiques Microorganismes prototrophe capable de produire tous ses constituants carbons partir dune seule source de carbone. Une souche prototrophe est capable de synthtiser tous ces constituants cellulaires sur un milieu minimum. Microorganisme auxotrophe : bactrie incapable de synthtiser une ou plusieurs molcules. En gnral, on prcise lauxotrophie. 3. les besoins nergtiques Microorganisme phototrophe : microorganisme photosynthtique utilisant lnergie du rayonnement lumineux. Microorganisme chimiotrophe : utilisent lnergie de loxydation de produits chimiques, organiques ou minraux. 4. la source dlectrons Litotrophe : utilisent des substances minrales comme source dlectrons. Organotrophe : extraient les lectrons de composants organiques. 5. la classification des bactries Photolitotrophes : se dveloppent sur un milieu minral Photoorganotrophes : ncessite la prsence de matires organiques Chimiolitotrophe : bactries intervenant dans les cycles de matires Chimioorganotrophes : grosse catgorie de bactries

II. les milieux de culture Ce sont des prparations qui vont permettre le dveloppement de la bactrie. Le milieu doit apporter : Tous les lments dont la bactrie a besoin 4

Une source dnergie et des facteurs de croissance Un pH correct Une force ionique optimale

Les milieux de culture doivent permettre disoler les bactries, les identifier, les compter et les conserver. Un milieu qui ne contient que ce qui est absolument ncessaire au dveloppement de la bactrie se nomme un milieu minimum. 1. les constituants fondamentaux des milieux de culture Les extraits de viande : viande finement hache mis dans de leau et porter bullition. Aprs filtration, on garde le liquide. Bonne source dacides amins, de vitamines, et minraux. Les extraits de levures : levures de boulangerie hydrolyses. Bonne source dacides amins et de vitamines. Peptones et hydrolysats : matires protiques hydrolyses par des enzymes. Bonne source de carbone, hydrogne, oxygne, acides amins Les produits biologiques : ne doivent pas contenir des antibiotiques ; ils ne sont pas toujours autoclaves. Les indicateurs colors : ils changent de couleur en fonction du pH. Au dpart la couleur de la glose dpend du type dindicateurs et dpend du pH de la glose. Lors du dveloppement du microorganisme, le pH du milieu peut : Rester stable Descendre : cas des bactries qui utilisent des sucres et rejettent des acides Monter : la bactrie ne peut pas utiliser le sucre mais mtabolise des acides amins

Lagar : extrait dalgues rouge ayant des proprits glifiantes. Elle possde 3 proprits : Glifie les milieux dans lequel elle a t incorpore. Jamais dgrad par les bactries Se dissout dans leau 90C reste e surfusion jusqu 45C. A temprature basse, il y a glification. 2. la classification des milieux de culture Classification selon la consistance

Milieux solides

Classification selon la consistance

Milieux semi solides

Milieux liquides

Classification selon leur composition

Milieux semi synthtique

(fraction connue et fraction inconnue)

Classification selon la composition

Milieux synthtiques (connait exactement la composition)

Milieux naturels (connait peu prs la composition)

Classification selon la complexit

Milieux enrichis (composition et prparation complexe)

Classification selon la complexit

Milieux usuels (prparation et composition simple)

Classification selon leur utilisation

Milieux slectifs

Milieux non slectifs Classification selon leur utilisation

Milieux de conservations

Milieux dorientations et didentificatio ns

Milieux denrichissem ents

3. le dveloppement bactrien En milieux liquides : apparition dun trouble. Le dveloppement peut apparatre sous diffrentes formes : Trouble homogne Sdiment au fond du tube Voile en surface Limpide

En milieux solide : formation de colonies. Observation macroscopique. Plusieurs critres : Taille Couleur Relief Contour Consistance

 Transparence Quand on mixe ces critres on obtient 3 types de colonies : R S N

III. les facteurs physiques influenant la croissance bactrienne La plupart des cellules animales sont organises en structure multicellulaire immerges dans un liquide isotonique qui les maintient un pH optimal. Les cellules vgtales sont souvent soumises des agressions mais ont une organisation multicellulaires et se spcialisent. Les bactries sont des organismes unicellulaires qui vivent dans des environnements qui changent brutalement. Ces modifications vont avoir un impact direct sur la physiologie bactrienne. Les bactries vont devoir sadapter trs rapidement des changements denvironnements. Certaines bactries sont devenues totalement indpendantes de leur environnement. 1. la temprature Impact de la temprature : la temprature va avoir un effet direct sur la vitesse des ractions mtaboliques. Chaque augmentation de 10C augmente par 2 la vitesse de raction enzymatique. Au-del dune certaine temprature, il y a dnaturation des protines, destruction des membranes cellulaires et mort de la bactrie. Les tempratures cordinales Minimale : pas de dveloppement Optimale Maximale

Ces tempratures changent selon le type de bactries. La temprature optimale est trs proche de la temprature maximale. Les catgories Msophiles : temprature optimale entre 30 et 37C temprature moyenne de croissance 20 et 40C Psychrophiles : temprature optimale : 10C Psychrotrophes : temprature optimale : 25C mais peuvent se dvelopper 0C Thermophiles : temprature optimale : 45 55C Thermophile extrmes : tempratures optimales : 70C Thermotrophes : temprature optimale : 30C mais peuvent se dvelopper 50C

Les mcanismes molculaires de ladaptation la temprature

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Sil y a baisse importante de temprature il y a risque de glification de membrane. Les bactries vont synthtiser de nouveaux acides gras au niveau des phospholipides, ces acides gras sont insaturs et vont permettre de maintenir la fluidit. Si la temprature augmente, il y a risque e dnaturation des enzymes. Les bactries vont synthtiser de nouvelles protines qui vont rsister la chaleur. Les techniques de laboratoire Pour cultiver une bactrie, on va se placer temprature optimale et constante. On peut utiliser le bain marie et des tuves, des frigos, boucles de rgulation (fermenteur). 2. le pH Impact du pH influence sur lactivit mtabolique. La synthse de lATP dpend du fonctionnement de certaines pompes anioniques. Une modification de pH altre le fonctionnement de ces pompes. Permabilit de la membrane : modification de lquilibre ionique de part et dautre de la membrane. Le milieu de culture contient des molcules intressantes pour le microorganisme. La modification du pH peut changer la charge de ces molcules. Si la charge des molcules change, il peut y avoir des problmes de transport.

Les catgories Le pH intracellulaire des microorganismes est denviron 7.

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Alcalophile (8.5 et11.5)

Classification des bactries

Acidophile (1et 5.5)

Neutrophile (5.5 et8)

Techniques de laboratoire On ajuste le pH du milieu de culture au pH de la bactrie que lon veut faire pousser. Lors de la croissance, le microorganisme : Mtaboliser un sucre et relarger des dchets acides donc le pH va baisser Mtaboliser les acides amins et relarger des dchets basiques donc le pH monte

Plus le microorganisme, plus le milieu devient toxique. On ajoute lors de la fabrication du milieu un tampon qui va minimiser les variations de pH. 3 cas : Culture non renouvele : culture en tube ou en erlenmeyer. Le pH va voluer au bout de quelques heures de culture et au bout de 24h le milieu devient toxique. Culture non renouvele en fermenteur : capteur de pH qui va mesurer le pH en continu. On a des pompes qui permettent dinjecter soit des produits alcalins soit acides. Le pH va rester constant. Culture renouvele : ajout sans arrt du milieu de culture. Le pH varie trs peu.

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3. loxygne Les catgories

Aro anarobies facultative

Anarobie arotolrante Classification des bactries

Micro arophile

Arobies strictes

Anarobies strictes

Dtermination du type respiratoire Glose solide prsente en tube crayon Chauffer le tube 100 C Laisser refroidir le tube 50 C Ensemencer le tube avec la bactrie sur toute la glose Incuber

Les effets de loxygne

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Arobies strictes : loxygne est laccepteur final dlectrons. Chez les bactries, il existe de la respiration anarobie, laccepteur final dlectrons est autre chose que loxygne. Pour les autres, loxygne est plus ou moins toxique. Les techniques au laboratoire Pour les bactries arobies strictes et les anarobies facultatives, on injecte de loxygne en fermenteur. Pour les anarobies strictes, on va les cultiver en absence doxygne en ajoutant un rducteur. On cultive ces bactries dans un sac hermtique, en jarre anarobie. 4. la pression osmotique Les effets de la pression osmotique. Les bactries sont trs rsistantes aux variations de pression osmotique. Si on met la bactrie dans un milieu hypotonique, leau va rentrer mais la bactrie va tre protge grce sa paroi. Si on met la bactrie dans un milieu hypertonique, la bactrie va synthtiser des soluts trs forte concentration et donc leau arrte de sortir. Les catgories

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Les halotolrantes

Classification des bactries

Les non halophile [NaCl] <0.2M

Les halophiles 0.2< [NaCl] <5.2M

5. la pression mcanique Les bactries qui vivent dans des milieux fortes pression sont des barophiles. Toutes les bactries sont rsistantes aux fortes pressions. Les bactries barophiles devront tre cultives e laboratoire sous fortes pressions.

6. lhumidit Utilisation de leau Leau sert de solvant pour le transport des molcules. Leau va tre utilise pour les ractions dhydrolyse. Quantification de lhumidit Utilisation de Aw (activit de leau)

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Aw = nombre de molcules de solvant / nombre de molcules de solvant + nombre de molcules de solut Technologie de laboratoire Pour les milieux liquides, leau nest pas un facteur limitant. Pour les milieux solides, aprs 72h dincubation, leau devient un facteur limitant. IV. les techniques dtudes de la croissance bactrienne

1. la multiplication bactrienne Le processus de division Pas de mitose chez les bactries. Au moment de la division, il y a : Rplication de lADN bactrien Allongement de la bactrie Synthse de membrane et de la paroi Formation de 2 cellules filles qui peuvent se sparer ou rester attach ensemble

Dans tous les cas, les cellules filles sont identiques la cellule mre dun point de vue morphologique, physiologique et gntique (reproduction asexue) La croissance bactrienne Lors de la croissance, il y a augmentation du nombre de cellules. Cette croissance suit une progression gomtrique de raison 2. Le suivi de la croissance Lors de la croissance, on va avoir 2 changements : Accroissement du nombre de cellules Modification de la composition du milieu de culture et modification physicochimique.

Pour suivre une croissance, on peut mesurer Le nombre de cellules Les modifications physico-chimiques 2. la mesure du nombre de cellules Les cellules de comptage

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Pour chaque cellule, on connat la surface du quadrillage et la profondeur Dnombrement aprs culture sur glose A partir dun chantillon de concentration inconnue, on ralise des dilutions en cascade. On ensemence certaines de ces dilutions sur des milieux gloss. Chaque bactrie va donner une colonie. Ensemencement en surface : dpt de 0.1 mL dune dilution la surface dune glose Ensemencement en masse : dpt de 1 mL dune dilution au fond dune bote de Ptrie vide puis ajout de glose 50C. Mthode par filtration : rserv des milieux liquides faiblement concentre en bactries. Filtrage dun certains volume liquide. Le filtre laisse passer lchantillon mais retient es bactrie. On rcupre le filtre quon dpose sur une glose et chaque bactrie donne une colonie. 3. la mesure de la biomasse Plus lchantillon est trouble, plus labsorbance est grande. V. la croissance en milieu non renouvel

1. la courbe de croissance On suit lvolution du nombre de cellules en fonction du temps. On peut galement suivre la concentration ou labsorbance. Il est difficile de tracer cette courbe sur une chelle arithmtiques on utilise plutt une chelle logarithmique. Fonction de la coure de croissance Connaitre la vitesse de multiplication dun microorganisme Situer certaines proprits bactriennes Mesurer le degr dactivit des antibiotiques Description de la courbe de croissance On spare la courbe en plusieurs phases : Phase de latence Phase dacclration Phase exponentielle de croissance Phase de ralentissement Phase stationnaire Phase de dclin

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Chaque microorganisme a sa propre courbe de croissance. La courbe dpend des conditions du milieu et dpend des paramtres physico-chimiques. 2. les paramtres dtats de la croissance La vitesse spcifique de croissance Vitesse spcifique Vx exprime en T-1. Plus v est grand, plus la vitesse du microorganisme est grande. La vitesse change en fonction des phases. Le temps de gnration (g) Temps de ddoublement de la population bactrienne. Il est dtermin partir de la dtermination de Vx. 3. physiologie des phases de la croissance Phase de latence : les bactries se prparent utiliser le milieu de culture. Elles synthtisent les enzymes puis synthse dADN. Augmentation de la taille des bactries. Idalement, cette phase ne dpasse pas 3h. Phase exponentielle de croissance : la vitesse spcifique est la plus grande. A lintrieur de la bactrie, lactivit mtabolique tourne fond. Production dexotoxines. En gnral, cest une phase relativement courte. Phase stationnaire : les bactries continuent consommer du milieu de culture et librent des dchets. Il y autant de nouvelles bactries que de bactries qui meurent. Cest une phase qui dure longtemps pour les bactries rsistante et court pour les bactries sensibles. Les bactries commencent changer de forme. Apparition de spores. A la fin de cette phase, les bactries vivent sur leurs rserves. Phase de dclin : le nombre de bactries diminue. Il y a plus de bactries qui meurent que de bactries qui naissent. Libration de grosses quantits dendotoxines. De temps en temps, la croissance reprend car les bactries se nourrissent des bactries mortes. 4. modlisation mathmatique = LN X2 / T2 LN X1 /T1

g = Ln 2/ VI. mode de vie des bactries

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1. recherche de nourriture par chimiotactisme Dfinition Mouvement orient des bactries soit vers des substances attractives ou en sens oppos de substances rpulsives. Mise en vidence Prparation dune suspension bactrienne de concentration connue. Introduction dans un capillaire des substances tester. Mise en contact des capillaires avec la suspension bactrienne. Dtermination de la concentration de bactries dans le capillaire. Mcanisme de dtection La bactrie possde des rcepteurs qui sont capables de dterminer la concentration dans le milieu de la bactrie. Le dplacement des bactries Les chimiorcepteurs sont coupls aux flagelles. En absence de gradient de concentration, la bactrie nage tout droit et sinon elle change de direction. Globalement la bactrie reste dans la mme rgion. Avec un gradient de concentration, les courses sont plus longues et les culbutes sont orientes. 2. les biofilms Les biofilms peuvent vivre sous 2 formes : Forme libre Cessile

Dfinition Communaut microbienne immobilises sur une surface et enfuit dans une matrice constitue de polymres. Formation du biofilm Une bactrie libre se fixe sur une surface Le contact avec la surface induit un stress la bactrie qui va synthtiser des glycoprotines. Renforce ladhsion Multiplication des bactries et synthse dexopolysaccharides qui va former un gel. Spcialisation des cellules. Dveloppement du biofilm. Certaines bactries se dcrochent et se dispersent.

Composition du biofilm

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La structure du biofilm est adapte aux conditions environnementales. A lintrieur du biofilm, il y a un rseau de canaux. Les bactries lintrieur du biofilm forment des microcolonies. Ce biofilm est trs stable et rsiste aux stress.

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