Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia Escuela de Qumica Biolgica Depto.

Bioqumica Laboratorio Bioqumica I, 2010

CROMATOGRAFA EN COLUMNA
Documento de Apoyo

La cromatografa es un mtodo muy empleado para la separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos de mezclas complejas. Ningn otro mtodo de separacin es tan poderoso, ni tiene tantas aplicaciones como la cromatografa. Los diversos mtodos cromatogrficos tienen en comn el empleo de una fase estacionaria y una fase mvil. Los componentes de una mezcla se pasan a travs de una fase estacionaria mediante el flujo de una fase mvil y las separaciones estn basadas en las diferencias en la velocidad de migracin entre los componentes de la fase mvil. Los mtodos cromatogrficos son de dos tipos fundamentales. En la cromatografa en columna la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto y la fase mvil se hace pasar por el tubo, con presin y por gravedad. En la cromatografa plana la fase estacionaria esta sujeta por una placa plana o en los poros de un papel. En este caso la fase mvil se mueve a travs de la fase estacionaria por accin capilar o por la influencia de la gravedad. Los mtodos de cromatografa en columna se clasifican de acuerdo con la naturaleza de la fase mvil, especficamente, lquidos, gases y fluidos supercrticos. La elucin es un proceso en el cual se limpian los solutos a travs de una fase estacionaria por el movimiento de una fase mvil. Esta ultima, que se encuentra en la columna, se conoce como el eluyente.

VELOCIDADES RELATIVAS DE MIGRACION DE LOS SOLUTOS La eficiencia de una columna cromatogrfica para separar dos solutos depende, en parte, de las velocidades relativas a las cuales se eluyen dos especies. Estas velocidades estn determinadas por la relacin de la concentracin del soluto en cada una de las dos fases. Constantes de distribucin. Todas las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias de la cantidad de la distribucin del soluto entre la fase mvil y la fase estacionaria. En cromatografa, la constante de distribucin para un soluto es igual a la relacin de su concentracin analtica molar en la fase estacionaria y su concentracin analtica molar en la fase mvil.

Tiempo muerto. Es el tiempo que se requiera para que una especie no retenida pase a travs de una columna. Este tiempo proporciona una medida de la velocidad promedio de migracin de la fase mvil y es un parmetro importante para la identificacin de los analitos. Con frecuencia, la muestra o la fase mvil contienen una especie no retenida. Tiempo de retencin. Es el tiempo entre la inyeccin de una muestra y la aparicin del soluto. Factor de retencin, k. Es un parmetro experimental importante que se utiliza para describir las velocidades de migracin de solutos en columnas. De manera ideal los factores de retencin para los analitos de una muestra deben estar entre 1 y 5. Factor de selectividad . Para los solutos A y B se define como la relacin de la constante de distribucin del soluto retenido con mas fuerza, B y la constante de distribucin del soluto retenido con menos fuerza, A. De acuerdo con esta definicin, siempre es mayor que la unidad.

COMATROGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR La purificacin de una sustancia de inters se hace siguiendo los criterios de separacin basados en alguna propiedad fsica o qumica que diferencia al compuesto en cuestin de otros que en principio estaran ligados a l. La cromatografa de filtracin en gel, ms corrientemente llamada de exclusin molecular, es una tcnica de purificacin muy extendida y apreciada debido a su sencillez y eficacia en la resolucin de mezclas complejas de macromolculas. Esta tcnica puede utilizarse con buenos resultados con fines analticos (por ejemplo, para la determinacin de pesos moleculares). Se definen los siguientes parmetros: Intervalo de fraccionamiento de un determinado tipo de gel, como los valores extremos (Mximo y mnimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de separar. Volumen de elucin, es el volumen necesario para eluir un compuesto de una columna. Volumen de exclusin de la columna al volumen al que eluyen las molculas de tamao superior al intervalo de fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de los huecos entre las partculas de gel.

Principio. Con la cromatografa de filtracin en gel se separan molculas en virtud de sus diferencias de tamao. La capacidad separadora reside en el gel cuya matriz consta de un gran nmero de esferas porosas microscpicas. Estas esferas estn constituidas por largas cadenas de polmeros unidas entre si por enlaces qumicos para formar una red tridimensional.

El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio (Fig. 1) quedando listo para su uso.

En el interior de una columna de cromatografa pueden distinguirse varios volmenes (Fig. 2): El volumen total (Vt), que es el volumen que ocupa el cilindro de gel hidratado. El volumen de matriz (Vg) El volumen de vaco (Vo), o el volumen de agua existente entre las esferas del gel (fuera de ellas). El volumen ocupado por el agua en las esferas del gel (Vi), que se expresa como la diferencia entre los dos volmenes anteriores: Vt-Vo-Vg.

Cuando una mezcla de molculas de diferentes tamaos se hace pasar a travs de la columna de gel, se produce la separacin en virtud del siguiente principio: Las molculas de muy pequeo tamao penetran en el interior de las esferas que componen el gel y, por consiguiente, no son extradas de la columna hasta que no ha pasado a travs de ella un volumen de lquido igual a su volumen total (Vt).

Sin embargo, aquellas molculas cuyo tamao es mayor que el de los poros de las esferas del gel, no pueden penetrar en su interior y atraviesan la columna recorriendo nicamente el volumen vaco (Vo), siendo las primeras en salir de la columna. El resto de las molculas, de tamao intermedio, presentan una mayor o menor facilidad para difundir al interior de las esferas en funcin de su tamao, siendo extradas fraccionadamente con volmenes que estn comprendidos entre el Vt y el Vo. Cuanto mayor es una molcula, menos capacidad tiene para acceder al interior de las esferas del gel y, por tanto, menor es el volumen de lquido que se requiere para extraerla de la columna (Fig.3). Teniendo en cuenta que para las protenas globulares el tamao est, en general, relacionado con el peso molecular, este tipo de cromatografa separa las sustancias en funcin de dichos pesos moleculares, obtenindose primero las ms pesadas.

Fig.3

Grados de los Geles Un gel es una red tridimensional cuya estructura est entrecruzada al azar. Los geles utilizados como tamiz molecular son polmeros hidroflicos e insolubles cuyas cadenas polimricas se entrecruzan hasta formar una red tridimensional. Las sustancias de peso molecular fuera de dicho rango no son fraccionadas sino que se extraen conjuntamente con el volumen vaco (Vo), las de peso molecular mayor que el rango, o con el volumen total (Vt), las ms pequeas que dicho rango. Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida. El gel de dextrano (polmero ramificado de glucosa, entrecruzado y formado en pequeas bolitas) se comercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintos tipos, segn el tamao de poro, proporcionando lmites de exclusin comprendidos entre 1 y 200 000 daltons. Estos geles se identifican por una denominacin de G-10 hasta G-200, lo que se refiere a la capacidad de retencin de agua de cada gel, se caracteriza por un rango de fraccionamiento que depende del tamao de sus poros. ste viene expresado por dos nmeros que representan pesos moleculares, correspondiendo el menor de ellos al peso molecular mximo de una sustancia que difunda perfectamente a travs de todos los poros del gel, y el mayor, al peso molecular mnimo que ha de tener una sustancia para que pueda ser excluida de las esferas del gel multiplicado por 10. En el mercado se encuentran geles con rangos de fraccionamiento muy diversos (desde 1.0005.000, hasta 10.000-4.000.000), lo que posibilita la separacin a diferentes escalas de pesos moleculares. Tabla No.1: Propiedades de algunos geles.

Factores que influyen en la separacin Adems de la diferencia intrnseca de tamao existente entre las molculas que van a ser cromatografiadas, hay diferentes factores que influyen en una correcta separacin de las mismas: Longitud de la columna. La capacidad de separacin de sustancias de diferente tamao aumenta con la longitud de la columna. Flujo. La resolucin de la separacin disminuye al aumentar el flujo del lquido con que son arrastradas las molculas a lo largo de la columna. Normalmente el flujo oscila entre 2 y 10 cm h-1. El volumen de la muestra a cromatografiar. Debe ser pequeo comparado con el volumen total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando volmenes de muestra iguales o menores al 5% del volumen total. Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se alteran profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no est empaquetado homogneamente en la columna o se encuentra excesivamente comprimido.

Caracterizacin del comportamiento cromatogrfico de un soluto Los resultados de la cromatografa de filtracin en gel se expresan habitualmente en forma de grficas (cromatogramas) donde se representa la cantidad de solutos en funcin del volumen de lquido extrado de la columna (Fig. 3).

Se pueden utilizar varios parmetros para caracterizar el comportamiento cromatogrfico de una sustancia: Volumen de elucin (Ve). Se define como el volumen de lquido necesario para extraer una determinada sustancia. Presenta el inconveniente de depender fuertemente del volumen total de la columna. El Ve de una sustancia vara entre Vt y Vo. Coeficiente de distribucin (Kd). Es el parmetro ms correcto y tambin el ms ampliamente utilizado. Indica la fraccin del volumen interior accesible a un compuesto especfico. El Kd de una sustancia se define como: Kd = Ve-Vo/Vt-Vo El valor de Kd oscila entre 0 (cuando Ve=Vo) y 1 (cuando Ve=Vt), y representa la fraccin de volumen del interior de las esferas a la que accede cada sustancia en virtud de su tamao. Adems, el coeficiente de distribucin est relacionado con el logaritmo del peso molecular de un soluto, a partir de su Kd, cromatografiando por filtracin varios patrones de peso molecular conocido.