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Khler Eggers Fleischer Marre Pfister Pulverer (Hrsg.

Medizinische Mikrobiologie
8., vllig neu bearbeitete Auflage Mit 369 Abbildungen und 197 Tabellen

Mit Beitrgen von


Rainer Ansorg, Peter Bartmann, Adolf Bauernfeind, josef Beuth, Renate Blaschke-Hellmessen, Erik C. Bttger, Wolfgang Bredt, Barbara Broker, Joachim Denner, Edeltrud Dietlein, Hans J. Eggers, Volker Erfle, Martin Exner, Bernhard Fleischer, Matthias Frosch, Barbara C. Grtner, Hans R. Gelderblom, Alexander von Graevenitz, Jrg Hacker, Walter Hampl, Jrgen Heesemann, Franz X. Heinz, Heidi Holzmann, Wolfgang Jilg, Manfred Kist, Hans-Dieter Klenk, Werner Khler, Dietmar Pierre Knig, Hans A. Kretzschmar, Joachim Khn, Reinhard Kurth, Rudolf Ltticken, Walter A. Maier, Reinhard Marre, Gottfried Mauff, Thomas Mertens, Volker ter Meulen, Detlef Michel, Helmut Mittermayer, Lutz von Mller, Nikolaus Mller-Lantzsch, Georg Peters, Herbert Pfister, Georg Plum, Andreas Podbielski, Gerhard Pulverer, Reinhard Rchel, Hans-Georg Sahl, Klaus Peter Schaal, Jrg Michael Schierholz, Herbert Schmitz, Karl-Eduard Schneweis, Gabriele Schnian, Heidi Schtt-Gerowitt, Hanns Martin Seitz, Gnter Siegl, Hans-Jrgen Streckert, Heinz-Jrgen Thiel

URBAN& FISCHER
Mnchen Jena

Zuschriften und Kritik an: Urban & Fischer Verlag, Lektorat Medizin. Karlstrae 45, 80333 Mnchen Herausgeber: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Dr. h.c. Werner Khler, vorm. Direktor des Instituts fr Experimentelle Mikrobiologie, Adolf-Reichwein-Str. 26. 07745 Jena Prof. Dr. med. Hans J. Eggers, vorm. Direktor des Instituts fr Virologie der Universitt zu Kln, Frst-Pckler-Slr. 56. 50935 Kln Prof. Dr. med. Bernhard Fleischer, Direktor des Bernhard-Nocht-Instituts fr Tropenmedizin, Bernhard-Nocht-Str. 74, 20359 Hamburg Prof. Dr. med. Reinhard Marre, Direktor des Instituts fr Mikrobiologie und Immunologie, Universitt Ulm, Robcrt-Koch-Strae 8, 89081 Ulm Prof. Dr. rer. nat. Herbert Pfister, Direktor des Instituts fr Virologie der Universitt zu Kln, Frst-Pckler-Strac 56, 50935 Kln Prof. Dr. med. Dr. h. c. Gerhard Pulverer, vorm. Direktor des Instituts fr Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universitt zu Kln, Goldenfelsstrae 19-21, 50935 Kln Wichtiger Hinweis fr den Benutzer Die Erkenntnisse in der Medizin unterliegen laufendem Wandel durch Forschung und klinische Erfahrungen. Herausgeber und Autoren dieses Werkes haben groe Sorgfalt darauf verwendet, da die in diesem Werk gemachten therapeutischen Angaben (insbesondere hinsichtlich Indikation. Dosierung und unerwnschter Wirkungen) dem derzeitigen Wissensstand entsprechen. Das entbindet den Nutzer dieses Werkes aber nicht von der Verpflichtung, anhand der Beipackzettel zu verschreibender Prparate zu berprfen, ob die dort gemachten Angaben von denen in diesem Buch abweichen und seine Verordnung in eigener Verantwortung zu treffen. Geschtzte Warennamen (Warenzeichen) werden besonders kenntlich gemacht. Aus dem Fehlen eines solchen Hinweises kann jedoch nicht geschlossen werden, da es sich um einen freien Warennamen handelt. Die Deutsche Bibliothek - CIP-Einheitsaufnahme Ein Titeldatensatz fr diese Publikation ist bei der Deutschen Bibliothek erhltlich. Alle Rechte vorbehalten 8. Auflage 2001 Urban & Fischer Verlag Mnchen Jena ISBN 3-437-41640-5 Das Werk einschlielich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschtzt. Jede Verwertung auerhalb der engen Grenzen des Urheberrechtsgesetzes ist ohne Zustimmung des Verlages unzulssig und strafbar. Das gilt insbesondere fr Vervielfltigungen, bersetzungen. Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen. Projektmanagement: Elke Klein, Mnchen Redaktion: Dr. med. Bettina Haake, Mnchen; Sabine Stauber, Erlangen; Susanne Szczepanek. Dachau Zeichnungen: Henriette Rintelen, Velbert Herstellung: Petra Laurer, Mnchen Umschlaggestaltung: prepress ulm GmbH, Ulm Satz: Typodata GmbH, Mnchen Druck und Verarbeitung: Wilhelm Rock Graphische Betriebe, Weinsberg Printed in Gcrmany Aktuelle Informationen finden Sie im Internet unter der Adresse: http://www.urbanfischer.de

Vorwort zur 8. Auflage


Der seit der letzten Auflage des Lehrbuches der Medizinischen Mikrobiologie eingetretene Wissenszuwachs machte eine grndliche Neubearbeitung erforderlich, die vertiefte Einblicke in die Pathogenese und eine verbesserte Diagnostik von Infektionskrankheiten ermglicht. Bei einigen Erkrankungen gelingt erst jetzt durch molekulargenetische Verfahren ein zuverlssiger Nachweis. Mehr als 50 Autoren haben sich bemht, diese Sachverhalte fr Studierende der Medizin und der Biologie ebenso darzustellen wie fr den angehenden Facharzt. Der begrenzte Umfang des Gesamtwerkes machte eine beschrnkende Auswahl in den einzelnen Kapiteln erforderlich. Als neuer Teil wurde das Kapitel Klinische Infektiologie (organorientiert)" aufgenommen. In diesem Teil sind, nach Organsystemen geordnet, die wesentlichen Erreger, die von ihnen hervorgerufenen Infektionskrankheiten und deren Therapie zusammengefat, um auch aus klinischer Sicht einen Zugang zur Diagnose, Behandlung und Bekmpfung zu schaffen. Damit ergibt sich zwangslufig eine gewisse Redundanz, die aber von den Herausgebern gewollt ist. Wir haben den etablierten Begriff Infektiologie" bernommen, wohl wissend, da er sprachlich korrekt Infektologie" lauten mu. Der Glaube, durch Antibiotika und Chemothcrapeutika die Infektionskrankheiten besiegen zu knnen, hat sich als falsch erwiesen: in den industrialisierten Lndern durch Resistenzentwicklungen, in den Lndern der Dritten Welt durch den Mangel an diesen Therapeutika. Infektionskrankheiten sind, wenn auch mit nderungen in ihrer jeweiligen Bedeutung, nach wie vor ein ernstzunehmendes Problem. Das vorliegende Buch soll fr ihre Erkennung, Bekmpfung und Verhtung eine Hilfe geben.

Jena, Kln, Hamburg, Ulm, im August 2001

Werner Khler Hans J. Eggers Bernhard Fleischer Reinhard Marre Herbert Pfister Gerhard Pulverer

Inhaltsverzeichnis
1 Allgemeine Infektionslehre .......................................
REINHARD MARRE, BERNHARD FLEISCHER, BARBARA M. BROKER, GOTTFRIED MAUFF

2 Mikrobiologische Diagnostik ...................................


KLAUS PETER SCHAAL, JOACHIM KHN, EDELTRUD DIETLEIN, MARTIN EXNER

73

3 Allgemeine Bakteriologie

.......................................

155

HANS-GEORG SAHL, JRG HACKER, WERNER KHLER, ADOLF BAUERNFEIND, GEORG PETERS, HELMUT MITTERMAYER

4 Spezielle Bakteriologie ................................................


GEORG PETERS, GERHARD PULVERER, ANDREAS PODBIELSKI, RUDOLF LTTICKEN, MATTHIAS FROSCH, JRGEN HEESEMANN, RAINER ANSORG, GEORG PLUM, ALEXANDER VON GRAEVENITZ, WERNER KHLER, MANFRED KIST, HEIDI SCHTT-GEROWITT, JOSEF BEUTH, ERIK C. BTTGER, KLAUS PETER SCHAAL, WOLFGANG BREDT

247

5 Allgemeine Virologie ................................................


HANS J. E GGERS, THOMAS M ERTENS , L UTZ VON M LLER

485

6 Spezielle Virologie .......................................................


GNTER SIEGL, HERBERT PFISTER, HANS J. EGGERS, KARL-EDUARD SCHNEWEIS, HANS R. GELDERBLOM, WOLFGANG JILG, HANS-JRGEN STRECKERT, VOLKER TER M EULEN , HEIDI HOLZMANN, FRANZ X. HEINZ , HANS-DIETER K LENK, HEINZ-JRGEN THIEL, HERBERT SCHMITZ, VOLKER ERFLE, HANS A. KRETZSCHMAR

549

7 Allgemeine Medizinische Mykologie .......................


RENATE BLASCHKE-HELLMESSEN, GABRIELE SCHNIAN

665

8 Spezielle Medizinische Mykologie ...........................


HEIDI SCHTT-GEROWITT, REINHARD RCHEL

681

9 Allgmeine Medizinische Parasitologie .......................


HANNS M ARTIN S EITZ, W ALTER A. M AIER

699

VIII

Inhaltsverzeichnis

10 Spezielle Medizinische Parasitologie .......................


HANNS M ARTIN S EITZ, W ALTER A. M AIER

701

11 Klinische Infektiologie (organorientiert)

..............

749

WERNER KHLER, REINHARD MARRE, JRGEN HEESEMANN, WOLFGANG JILG, MATTHIAS FROSCH, VOLKER TER MEULEN, PETER BARTMANN, WOLFGANG BREDT, JOACHIM DENNER, REINHARD KURTH, JRG MICHAEL SCHIERHOLZ, JOSEF BEUTH, DIETMAR PIERRE KNIG, HERBERT PFISTER

12 Prinzipien bei aktiven und passiven Immunisierungen .......................................................


DETLEF M ICHEL, THOMAS MERTENS

827

Farbtafeln I-XIl nach Kapitel 12 Anhang...................................................................... Register ..................................................................... 847 851

Autorenverzeichnis
Professor Dr. RAINER ANSORG Universitt - GH Essen Institut fr Medizinische Mikrobiologie Hufclandstr. 55 45122 Essen Professor Dr. Dr. med. PETER BARTMANN Direktor des Zentrums fr Kinderheilkunde Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universitt Bonn Abteilung Neonatologie Adenauerallee 119 53113 Bonn Professor Dr. ADOLF BAUERNFEIND Max-von-Pettenkofer-lnstitut fr Hygiene und Medizinische Mikrobiologie Petlenkoferstrae 9a 80336 Mnchen Professor Dr. JOSEF BEUTH Institut zur wissenschaftlichen Evaluation Naturheilkundlicher Verfahren der Universitt zu Kln Robert-Koch-Str. 10 50931 Kln Professor Dr. RENATE BLASCHKE-HELLMESSEN Am Park 1 01468 Friedewald Professor Dr. ERIK C. BTTER Institut fr Medizinische Mikrobiologie der Universitt Zrich Gloriastr. 30/32 CH-8028 Zrich Schweiz Professor Dr. med. WOLFGANG BREDT Institut fr Medizinische Mikrobiologie u. Hygiene Klinikum der Albert-Ludwigs-Universitt Freiburg Hermann-Herder-Strae 11 79104 Freiburg Dr. BARBARA BROKER Bernhard-Nocht-Institut fr Tropenmedizin Bernhard-Nocht-Str. 74 20359 Hamburg Dr. JOACHIM DENNER Robert-Koch-Institut Nordufer 20 13353 Berlin Dr. med. EDELTRUD DIETLEIN Hygiene-Institut der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universill Bonn Sigmund-Freud-Str. 25 53127 Bonn Professor Dr. HANS J. EGGERS Institut fr Virologie der Universitt zu Kln Frst-Pckler-Str. 56 50935 Kln Professor Dr. VOLKER ERFLE GSF-Forschungszenlrum fr Umwelt und Gesundheit Institut fr Molekulare Virologie Ingolstdter Landstr. 1 85764 Neuherberg Professor Dr. med. MARTIN EXNER Hygiene-Institut der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universitt Bonn Sigmund-Freud-Str. 25 53127 Bonn Professor Dr. BERNHARD FLEISCHER Bernhard-Nocht-Institut fr Tropenmedizin Bernhard-Nocht-Str. 74 20359 Hamburg Professor Dr. MATTHIAS FROSCH Universitt Wrzburg Institut fr Hygiene und Mikrobiologie Josef-Schneider-Str. 2 97080 Wrzburg Dr. BARBARA C. GRTNER Institut fr Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Abt. Virologie Gebude 47 66421 Homburg/Saar

Autorenverzeichnis

Dr. med. HANS R. GELDERBLOM Robcrt-Koch-Institut Nordufer 20 13353 Berlin Professor Dr. ALEXANDER VON GRAEVENITZ Institut fr Medizinische Mikrobiologie der Universitt Zrich Gloriastr. 30/32 CH-8028 Zrich Schweiz Professor Dr. med. JRG HACKER Zentrum fr Infektionsforschung Institut fr molekulare Infektionsbiologie Universitt Wrzburg Rntgenring ff 97070 Wrzburg Dr. WALTER HAMPL Institut fr Mikrobiologie der Universitt Abt. Virologie Albcrt-Einstein-Allee 11 89069 Ulm Professor Dr. Dr. med. JRGEN HEESEMANN Max-von-Pettenkofcr-Institut fr Hygiene und Medizinische Mikrobiologie Pettenkoferstrae 9a 80336 Mnchen Professor Dr. FRANZ X. HEINZ Universitt Wien Institut fr Virologie Kinderspitalgasse 15 A-1095 Wien Austria Professor Dr. HEIDI HOLZMANN Universitt Wien Institut fr Virologie Kinderspitalgasse 15 A-1095 Wien Austria Professor Dr. med. WOLFGANG JILG Klinikum der Universitt Regensburg Institut fr Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Franz-Josef-Strau-Allee 11 93053 Regensburg

Professor Dr. MANFRED KIST Institut fr Medizinische Mikrobiologie Klinikum d. Albert-Ludwigs-Universitt Hermann-Herder-Str. 11 79104 Freiburg Professor Dr. med. HANS-DIETER KLENK Universitt Marburg Institut fr Virologie Robert-Koch-Strae 17 35037 Marburg Professor Dr. Dr. Dr. h.c. WERNER KHLER Adoll'-Reichwein-Str. 26 07745 Jena Dr. DIETMAR PIERRE KNIG Klinik fr Orthopdie Universittsklinik Kln Joseph-Stelzmann-Str. 9 50962 Kln Professor Dr. med. HANS A. KRETZSCHMAR Institut fr Neuropathologie Ludwig-Maximilians-Universitt Marchioninistr. 17 81377 Mnchen Professor Dr. med. JOACHIM KHN Institut fr Medizinische Mikrobiologie und Virologie der Universitt Von-Stauffcnberg-Str. 36 48151 Mnster Professor Dr. REINHARD KURTH Robert-Koch-Institut Nordufer 20 13353 Berlin Professor Dr. RUDOLF LTTICKFN RWTH Aachen Institut fr Mikrobiologie und Immunologie Pauwelsstr. 30 52074 Aachen Professor Dr. med. WALTER A. MAIER Institut fr medizinische Parasitologie der Rheinischen Friedrich-WilhelmsUniversitt Bonn Sigmund-Freud-Str. 25 53127 Bonn

Autorenverzeichnis

XI

Professor Dr. med. REINHARD MARRE Institut fr Mikrobiologie und Immunologie der Universitt Ulm Abt. Med. Mikrobiologie und Hygiene Robert-Koch-Strae 8 89081 Ulm Professor Dr. med. GOTTFRIED MAUFF Laborrztliche Gemeinschaftspraxis Dr. Kramer & Kollegen Lauenburgerstr. 67 21502 Geesthacht Professor Dr. med. THOMAS MERTENS Institut fr Mikrobiologie und Immunologie der Universitt Ulm Abteilung Virologie Albert-Einstein-Allee 11 89081 Ulm Professor Dr. VOLKER TER MEULEN Institut fr Virologie und Immunbiologie Versbacher Str. 7 97078 Wrzburg Priv.-Doz. Dr. rer. nat. DETLEF MICHEL Institut fr Mikrobiologie und Immunologie der Universitt Ulm Abteilung Virologie Albert-Einstein-Allee 11 89081 Ulm Primarius Univ.-Professor Dr. HELMUT MITTERMAYER Institut fr Hygiene, Mikrobiologie und Tropenmedizin am Krankenhaus der Elisabethinen Fadingerstr. 1 A-4010 Linz Austria Dr. med. LUTZ VON MLLER Institut fr Mikrobiologie und Immunologie der Universitt Ulm Abteilung Virologie Albert-Einstein-Allee 11 89081 Ulm

Professor Dr. rer. nat. NIKOLAUS MLLER-LANTZSCH Institut f. Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Abt. Virologie Gebude 47 66421 Homburg/Saar Professor Dr. med. GEORG PETERS Institut fr Medizinische Mikrobiologie Westflische Wilhelms-Universitt Mnster Domagkstrae 10 48149 Mnster Professor Dr. rer. nat. HERBERT PFISTER Institut fr Virologie der Universitt zu Kln Frst-Pckler-Strae 56 50935 Kln Dr. med. GEORG PLUM Institut fr Medizinische Mikrobiologie u. Hygiene Universitt zu Kln Goldenfelsstr. 19-21 50935 Kln Professor Dr. med. Dr. rer. nat. ANDREAS PODBIELSKI Universitt Rostock Institut fr Medizinische Mikrobiologie Schillingstr. 70 18057 Rostock Professor Dr. med. Dr. h. c. GERHARD PULVERER Direktor des Instituts fr Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universitt zu Kln Goldenfelsstrae 19-21 50935 Kln Professor Dr. REINHARD ROCHEL Georg-Augusta-Universitt Hygiene-Institut, Abt. Med. Mikrobiologie Universittsklinikum Kreuzbergring 57 37075 Gttingen Professor Dr. HANS-GEORG SAHL Institut fr Medizinische Mikrobiologie und Immunologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universitt Sigmund-Freud-Str. 25 53127 Bonn

XII

Autorenverzeichnis

Professor Dr. med. KLAUS PETER SCHAAL Institut fr Med. Mikrobiologie und Immunologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universitt Bonn Sigmund-Freud-Strae 25 53127 Bonn Dr. JRG MICHAEL SCHIF.RHOLZ Stiftung caesar Friedensplatz 16 53111 Bonn Professor Dr. HERBERT SCHMITZ. Bernhard-Nocht-lnstitut fr Tropenmedizin Bernhard-Nocht-Strae 74 20359 Hamburg Professor Dr. KARL-EDUARD SCHNEWEIS Institut fr Medizinische Mikrobiologie und Immunologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universitt Bonn Sigmund-Freud-Str. 25 53127 Bonn Dr. GABRIELE SCHNIAN Institut fr Mikrobiologie und Hygiene Universittsklinikum Charite Humboldt-Universitt zu Berlin Dorotheenstr. 96 10098 Berlin

Dr. med. Dr. rcr. nat. HHIDI SCHUTT-GEROWLI I Institut fr Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universitt zu Kln Goldcnfelsstrae 19-21 50935 Kln Professor Dr. med. HANNS MARTIN SEITZ Institut fr Medizinische Parasitologie der Rheinischen Friedrich-WilhelmsUniversitt Bonn Postfach 1825 53008 Bonn Professor Dr. rer. nat. GNTER SIEGI. Institut fr Klin. Mikrobiologie und Immunologie IKMI Frobergstrae 3 CH-9001 St. Gallen Schweiz Priv.-Doz. Dr. HANS-JRGEN STRECKERT Alte Strae 41b 58452 Witten Professor Dr. HEINZ-JRGEN THIEL Institut fr Virologie Fachbereich Veterinrmedizin (FB 18) Frankfurter Str. 107 35392 Gieen

XIII

Abkrzungsverzeichnis
A
ADCC

Adenin antikrperabhngige zellulre Zytotoxizitt Antigen Antigen-AntikrperReaktion Antikrper antigenprsentierende Zellen

EC

enterohmorrhagische Colitis Enzyme linked immuno sorbent assay Flavin-Adenin-Dinukleotid follikulr dendritische Zellen Fleckfiebergruppe (Rickettsien) Filament-Hmagglutinin (bei Bordetella pertussis) Fluoreszenzimmunoassay Fluoreszenz-Treponema- Antikrper-Test Guanin Gastrointestinaltrakt Glykoprotein Ffmagglutinin (Influenzaviren) Hmagglutinations-Test Human granulocytic Ehrlichia Hmagglutinations-Hemmtest human leukocyte antigen hmolytisch-urmisches Syndrom Harnwegsinfektion 50%ige Infektionsdosis Immunfluoreszenz Interferon Infektionsschutzgesetz Immunglobulin Indirekter Immunofluoreszenz-Test Interleukin Insertionssequenz intravense Applikation von Immunglobulin G Koloniebildende Einheiten (= CFU) Komplementbindungsreaktion

ELISA

Ag
Ag-AkReaktion

Ak APC
ARDS

FAD FDC FG FHA FIA FTA-Test G GIT gp HA HAH HGE HHT HLA HUS HWI ID50 IF IFN IfSG Ig IIFT IL IS-Element IVIG

AT ATP BS C C
CFXJ

Acute respiratory distress syndrome Ataxia teleangiectasia Adenosintriphosphat BLOOM-Syndrom Komplement Cytosin colony forming units (= KBE) combined immunodeficiency (kombinierte Immunschwche) cytomegalic inclusion disease (zytomegale Einschlukrperchen-Krankheit) zervikale intraepitheliale Neoplasien zytopathischer Effekt Komplementrezeptor C.-reaktives Protein koloniestimulierender Faktor

CID

CID

CIN CPE CR CRP CSF CTL CTX DC DNA DNS DTH

CD8+ zytotoxische T-Zellen Choleratoxin dendritische Zellen deoxyribonucleic acid (= DNS) Desoxyribonukleinsure (= DNA) delayed type hypersensitivity (Typ IV-Allergie, berempfindlichkeitsreaktion vom Spttyp) Elementarkrperchen

KBE KBR

EB

XIV

Abkrzungsverzeichnis

LAS

Lymphadenopathie-Syndrom 50%ige letale Dosis Lipopolysaccharid hitzelabile Enterotoxine (bei E. coli) mukosaassoziiertes Lymphom minimal bakterizide Konzentration Haupthistokompatibili ttskomplex minimale Hemmkonzentration monocyte chemotactic protein (ein Chemokin) messenger ribonucleic acid Neuraminidase (Influenzaviren) Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid Nukleinsure-Amplifikations-Technik nicht-gonorrhoische Urethritis Nosokomialinfektion natural killer cells Neutralisationstest overwhelming post-splenectomy infection Open reading frame postantibiotischer Effekt Pathogenittsinsel penicillinbindende Proteine Polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) postgonorrhoische Urethritis Proteinkinase A progressive multifokale Leukoenzephalopathie polymorphkernige neutrophile Leukozyten (polymorphkernige Neutrophile) Pertussis-Toxin regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted (ein Chemokin)

RB RES RFLP RIA RNA RNS ROI rRNA RT RT-PCR

Retikularkrperchen retikuloendotheliales System Restriktionsfragmentlngenpolymorphismus Radio-Immunoassay ribonucleic acid (= RNS) Ribonukleinsure (= RNA) reactive oxygen intermediate

LD50

LPS LT

MALT MBK MHC MHK MIP mRNA NA NAD NAT NGU NI NK-Zellen NT OPSI ORF PAE PAI PBP PCR PGU PKA PML PMN

ribosomale RNA reverse Transkriptase reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion severe combined immunodeficiency; schwerer kombinierter Immundefekt Glutamat-Oxalazetat-Transaminase Glutamat-Pyruvat-Transaminase systemic inflammatory response syndrome Subspecies hitzestabile Enterotoxine (bei E. coli) sexually transmitted disease (Geschlechtskrankheiten) streptokokkenbedingtes toxisches Schock-Syndrom Thymin Adhsin (bei Vibrio cholerae) T-Zellrezeptor Treponema pallidumHmagglutinations-Test Treponema pallidum-Immobilisations-Test Transfer-RNA toxic shock syndrome toxic shock syndrome toxin-1 vasoaktives intestinales Peptid Yersinia-Adhsin Yersinia outer proteins Zeckenbi-Fleckfiebergruppe (Rickettsien)

SCID

SGOT SGPT SIRS ssp. ST STD STSS T TcP TcR TPHA-Test TPI-Test tRNA TSS TSST-1

VIP

PT RANTES

Yad YOP ZG

Abkiirzungsverzeichnis

XV

Abkrzungen von Gattungsnamen bei Bakterien, Pilzen und Protozoen


A. actinomycetemcomitans - Actinobacillus actinomycetemcomitans A. bovis - Actinomyces bovis A. gerencseriae - Actinomyces gerencseriae A. hydrophila - Aeromonas hydrophila A. israelii - Actinomyces israelii A. pelletieri - Actinomadura pelletieri A. tumefaciens - Agrobacterium tumefaciens A. salmonicida - Aeromonas salmonicida A. veroni - Aeromonas veroni B. abortus - Bruceila abortus B. afzelii - Borrelia afzelii B. anthracis - Bacillus anthracis B. avium - Bordetella avium B. bronchiseptica - Bordetella bronchiseptica B. burgdorferi - Borrelia burgdorferi B. canis - Bruceila canis B. catarrhalis - Branhamella catarrhalis B. cepacia - Burkholderia cepacia B. distasonis - Bacteroides distasonis B. fragilis -Bacteroides fragilis B. garinii -Borrelia garinii B. gladioli - Burkholderia gladioli B. henselae - Bartonella henselae B. lusitaniae - Borrelia lusitaniae B. mallei - Burkholderia mallei B. melitensis - Brucella melitensis B. neotomae - Bruceila neotomae B. ovatus - Bacteroides ovatus B. ovis - Brucella ovis B. parapertussis - Bordetella parapertussis B. pertussis - Bordetella pertussis B. pseudomallei - Burkholderia pseudomallei

C. burnetii - Coxiella burnetii C. chauvoei - Clostridium chauvoei C. difficile - Clostridium difficile C. diphtheriae - Corynebacterium diphtheriae C. fetus - Campylobacter fetus C. freundii - Citrobacter freundii C. histolyticum - Clostridium histolyticum C. hominis - Cardiobacterium hominis C. jejuni - Campylobacter jejuni C. koseri - Citrobacter koseri C. novyi - Clostridium novyi C. perfringens - Clostridium perfringens C. pneumoniae - Coxiella burnetii C. psittaci - Chlamydia psittaci C. septicum - Clostridium septicum C. tetani - Clostridium tetani C. trachomatis - Chlamydia trachomatis C. xerosis - Corynebacterium xerosis DAEC - diffus adhrente Escherichia coli EAEC - enteroaggregative Escherichia coli EHEC - enterohmorrhagisehe Escherichia coli EIEC - enteroinvasive Escherichia coli EPEC - enteropalhogene Escherichia coli ETEC - enterotoxische Escherichia coli E. aerogenes - Enterobacter aerogenes E. agglomerans - Enterobacter agglomerans E. canis - Ehrlichia canis E. chaffensis - Ehrlichia chaffensis E. cloacae - Enterobacter cloacae E. coli - Entamoeba coli E. coli - Escherichia coli E. corrodens - Eikenella corrodens E. dispar - Entamoeba dispar E. equi - Ehrlichia equi E. faecalis Enterococcus faecalis E. faecium - Enterococcus faecium E. fergusomi - Escherichia fergusonii E. granulosus - Echinococcus granulosus E. hartmanii - Entamoeba hartmanii E. hermanni - Escherichia hermanni E. histolytica - Entamoeba histolytica E. ictaluri - Edwardsieila ictaluri E, koshinae - Edwardsieila koshinae

B. quintana - Bartonella quintana B. suis - Brucella suis B. thetaiotaomicron - Bacteroides thetaiotaomicron B. valaisiani - Borrelia valaisiani B. vulgatus -Bacteroides vulgatus B. wachsworthia - Bacteroides wachsworthia C. albicans - Candida albicans C. botulinum - Clostridium botulinum

XVI

Abkrzungsverzeichnis

E. multilocularis - Echinococcus multilocularis E. rhusiopathiae - Erysipelothrix rhusiopathiae E. sennetsu - Ehrlichia sennetsu E. tarda - Edwardsiella tarda E. vulneris - Escherichia vulneris F. necrophorum - Fusobacterium necrophorum F. novicida - Francisella novicida F. tularensis - Francisella tularensis G. vaginalis - Gardnerella vaginalis H. alvei - Hafnia alvei H. aphrophilus - Haemophilus aphrophilus H. ducreyi - Haemophilus ducreyi Hib - Haemophilus influenzae Typ b H. influenzae - Haemophilus influenzae H. paraaphrophilus - Haemophilus paraaphrophilus H. parahaemolyticus - Haemophilus parahaemolyticus H. parainfluenzae - Haemophilus parainfluenzae H. pylori - Helicobacter pylori H. segni - Haemophilus segni K. kingae - Kingella kingae K. ornithinolytica - Klebsieila ornithinolytica K. oxytoca - Klebsieila oxytoca K. planticola - Klebsiella planticola K. pneumoniae - Klebsiella pneumoniae K. terrigena - Klebsiclla terrigena L. canicola - Leptospira canicola L. donovani - Leishmania donovani L. grippotyphosa - Leptospira grippotyphosa L. hyos - Leptospira hyos L. icterohaemorrhagiae - Leptospira icterohaemorrhagiae L. interrogans - Leptospira interrogans L. major - Leishmania major L. micdadei - Legionella micdadei L. pneumophila - Legionella pneumophila L. tarrasovi - Leptospira tarrasovi L. tropica - Leishmania tropica M. abscessus - Mycobacterium abscessus M. agilis - Micrococcus agilis

M. avium - Mycobacterium avium M. bovis - Mycobacterium bovis M. chelonae - Mycobacterium chelonae M. fortuitum - Mycobacterium fortuitum M. gcnaveuse - Mycobacterium genaveuse M. genitalium - Mycoplasma genitalium M. haemolyticum - Mycobacterium haemolyticum M. hominis - Mycoplasma hominis M. lacunata - Moraxella lacunata M. leprae - Mycobacterium leprae M. marinum - Mycobacterium marinum M. morganii - Morganella morganii M. nonliquefaciens - Moraxella nonliquefaciens M. ozzardi - Mansonella ozzardi M. pneumoniae - Mycoplasma pneumoniae M. streptocera - Mansonella streptocera M. ulcerans - Mycobacterium ulcerans M. xanthus - Myxococcus xanthus N. abscessus - Nocardia abscessus N. asteroides - Nocardia asteroides N. brasiliensis - Nocardia brasiliensis N. farcinica - Nocardia farcinica N. gonorrhoeae - Neisseria gonorrhoeae N. nova - Nocardia novia O. tsutsugamushii - Orientia tsutsugamushii P. aenes - Propionibacterium aenes P. P. P. P. P. P. P. P. P. P. P. P. P. P. P. P. P. P. aeruginosa - Pseudomonas aeruginosa alcalifaciens - Providencia alcalifaciens avidum - Propionibacterium avidum bivia - Prevotella bivia buccae - Prevotella buccae disiens - Prevotella disiens fluorescens - Pseudomonas fluorescens freudenreichii - Propionibacterium freudenreichii intermedia - Prevotella intermedia malariae - Plasmodium malariae micros - Peptostreptococcus micros mirabilis - Proteus mirabilis melaninogenicum - Prevotella melaninogenicum multoeida - Pasteurella multoeida myxofaciens - Proteus myxofaciens ovale - Plasmodium ovale penneri - Proteus penneri propionicum - Propionibacterium propionicum

Abkrzungsverzeichnis

XVII

P. rettgeri - Providencia rettgeri P. stuartii - Providencia stuartii P. sttzen - Pseudomonas stutzeri P. vivax - Plasmodium vivax P. vulgaris - Proteus vulgaris R. prowazekii - Rickettsia prowazekii R. rickettsii - Rickettsia rickettsii R. typhi - Rickettsia typhi S. agalactiae - Streptococcus agalactiae (B-Streptokokken) S. anginosus - Streptococcus anginosus S. aureus - Staphylococus aureus S. boydii - Shigella boydii S. bovis -Streptococcus bovis S. downei - Streptococcus downei S. dysenteriae - Shigella dysenteriae S. flexneri - Shigella flexneri S. gordonii - Streptococcus gordonii S. haematobium - Schistosoma haematobium S. intcrmedius - Streptococcus intermedius S. japonicum - Schistosoma japonicum S. mansoni - Schistosoma mansoni S. moniliformis - Streptobacillus moniliformis

S. pyogenes - Streptococcus pyogenes (A-Streptokokken) S. sobrinus - Streptococcus sobrinus S. sonnei - Shigella sonnei S. suis - Streptococcus suis T. b. gambiense - Trypanosoma brucei gambiense T. b. rhodesiense - Trypanosoma brucei rhodesiense T. gondii - Toxoplasma gondii T. pallidum - Treponema pallidum T. phagedenis - Treponema phagedenis T. refringens - Treponema refringens T. saginata - Taenia saginata T. solium - Taenia solium T. vaginalis - Trichomonas vaginalis T, vincentii - Treponema vincentii U. urealyticum - Ureaplasma urealyticum V. alginolyticus - Vibrio alginolyticus V. cholerae - Vibrio cholerae V. damsela - Vibrio damsela V. fluvialis - Vibrio fluvialis V. furnissi - Vibrio furnissi V. hollisae - Vibrio hollisae V. metschnikovii - Vibrio metschnikovii V. mimicus - Vibrio mimicus V. parahaemolyticus - Vibrio parahaemolyticus Y. pestis - Yersinia pestis Y. pseudotuberculosis - Yersinia pseudotuberculosis

S. mutans - Streptococcus mutans S. liquefaciens - Serratia liquefaciens S. maltophilia - Stenothrophomonas maltophilia S. marcescens - Serratia marcescens S. oralis - Streptococcus oralis S. pneumoniae - Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken)

XVIII

Abkrzungsverzeichnis

Abkrzungen von Virusbezeichnungen


AIDS Acquired immunodeficiency Syndrome, Immunschwchesyndrom avian leucosis virus JCV BIV BKV BLV CJD CMV CPE DHV bovine immunodeficiency virus BK-Virus (ein Papillomvirus) bovines Leukmie virus
CREUTZFELDT-JAKOB-Krankheit

IMV

intrazellulre, reife, infektise Viren (bei Poxviren) JC-Virus (ein Papillomvirus) Lymphozytres Choriomeningitis-Virus long tcrminal repeat Molluscum contagiosum Virus Maus-Leukmievirus Maus-Mammatumorvirus Norwalk-like virus (ein Calicivirus) neue Variante der CREUTZFELDTJAKOB-Krankheit progressive Rteln-Panencephalitis Respiratory Syncytial Virus Rous-Sarkomvirus reverse Transkriptase simian immunodeficiency virus Sapporo-like virus (ein Calicivirus) Subakute sklerosierende Panencephalitis simian T cell lymphotropic virus Slow virus Infektion Varizella-Zoster-Virus Woodchuck hepatitis virus (Waldmurmeltier-Hepatitis-Virus)

ALV

LCMV LTR

Zytomegalievirus zytopathischer Effekt duck hepatitis virus (Enten-Hepatitis-Virus) EPSTEIN-BARR-Virus extrazellulre infektise Viren (bei Poxviren) feline immunodeficiency virus Frhjahr-Sommer-Meningoencephalitis ground squirrel hepatitis virus (Erdhrnchen-Hepatitis-Virus) Hepatitis B core antigen Hepatitis B surface antigen Hepatitis B-Virus Humanes Zytomegalievirus Hepatitis C-Virus Hepatitis D-Virus humane endogene Retroviren Humane Herpesviren humanes Immundefizienzvirus (human immunodeficiency virus) humanpathogene Papillomviren Herpes simplex Virus humanes T-Zell Leukmievirus

MCV MLV MMTV NLV nvCJD

EBV EEV

PRP FIV FSME

GSHV

RSV RSV RT SIV SLV SSPE STLV SVI

HBcAg HBsAg HBV HCMV HCV HDV HERV HHV HIV HPV HSV HTLV

vzv
WHV

Allgemeine Infektionslehre

1
46 49 50 50 52 57 59 59

1.1

Grundlagen der Infcktionslehre REINHARD MARRE Stellung der Infektionslehre in Geschichte und Gegenwart Konzepte der Klinischen Infektiologie Allgemeine Infektionslehre Pathogenitt und Virulenz der Bakterien Prinzipien der immunologischen Infektabwehr BERNHARD FLEISCHER BARBARA M. BROKER Das Immunsystem Zellen der Immunabwehr Anatomie des Immunsystems Humorale Abwehrmechanismen Das Komplementsystem Phagozyten T-Lymphozyten mit -T-Zellrezeptor

1.2.8 1.2.9 1.2.10 1.2.11 1 212 1.2.13 1.2.14 1.2.15 1.3

T-Zelleffektorfunktionen Natural-Killer-Zellen Interleukine und ihre Rezeptoren Die Begrenzung und Beendigung einer Immunreaktion Spezielle Infektabwehr Pathologische Auswirkungen der Immunreaktion Immundefizienz Immunabwehr von Tumoren Epidemiologie bertragbarer Krankheiten GOTTFRIED MAUFF Grundbegriffe der Epidemiologie Epidemiologische Methoden Epidemiologische Faktoren Spektrum der Infektionskrankheiten Nosokomialinfektionen Verhtung und Bekmpfung bertragbarer Erkrankungen

1.1.1 1.1.2 1.1.3 114

2 4 5 7

1.2

17

60 61 62 62 65 68 69

121 1.2.2 1.2.3 1.2.4 12 5 126 1.2.7

17 22 24 27 36 38 38

13 1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 135 1.3.6

Allgemeine Infektionslehre

1.1 Grundlagen der Infektionslehre


REINHARD MARRE

(Die Ausfhrungen in diesem Abschnitt bauen auf dem gleichnamigen Kapitel der 7. Auflage von Herrn M. Rllinghoff auf.) 1.1.1 Stellung der Infektionslehre in Geschichte und Gegenwart Infektionskrankheiten gehren ebenso wie Hunger, Kriege und Naturkatastrophen zu den stndigen, hufig mrderischen Begleitern der Menschheit. Die Infektionserreger haben die Entwicklung der Menschheit geprgt und sind ko-evolutionr von ihr geprgt worden (Abb. 1.1). Gleichzeitig sind sie Spiegel der jeweiligen Lebensformen. Dabei traten die Infektionskrankheiten auf 1. als Teilaspekl eines intakten kologischen Systems (z.B. Malaria), 2. als Ergebnis eines genderten kologischen Systems (z.B. Darminfektionen nach Urbanisation ohne gleichzeitige Trennung von Fkalentsorgungs- und Lebensmittelversorgungssystemen), 3. als epidemiologische Einbahnstrae (z.B. Toxoplasmose des Menschen, die im Gegensatz zur Toxoplasmose der Maus normalerweise nicht auf die Katze rckbertragen wird) und 4. als Ergebnis des vernderten kosystems Mensch (z.B. nach Zytostatikagabe, Organtransplantation). Aus Sicht des Mikroorganismus wre im Falle von Geschlechtskrankheiten vermutlich auch die Promiskuitt unentbehrlicher Teil eines intakten kosystems. Infektionskrankheiten haben stets eine Sonderrolle gespielt, weil sie nicht nur das Individuum, welches in vielen gesellschaftlichen Kulturen nur gering geschtzt wird, sondern die Bevlkerung in ihrer Existenz bedrohten, so da Religion und Staat Vorschriften zur Bekmpfung von Seuchen erlieen. Das explosionsartige Auftreten von Infektionskrankheiten fhrte und fhrt immer noch zu Angst und Panik unter der Bevlkerung, was durch Unwissenheit und eventuelle Wirkungslosigkeit von Schutzmanahmen noch verstrkt wird und die Empfnglichkeit fr Auenseitermeinungen erhht. Diese Sonderrolle haben sich die Infektionskrankheiten bis in die Neuzeit bewahrt. Keine andere Gruppe von

Krankheiten wird durch gesetzliche Vorschriften und Verordnungen (Infektionsschutzgesetz, Biostoffverordnung, Lebensmittel- und Trinkwasserverordnung) so detailliert erfat wie die Infektionskrankheiten und bei kaum einer anderen Gruppe von Krankheiten nimmt der Staat einen solchen Einflu auf Prventionsmanahmen (staatlich empfohlene Impfungen, amtsrztlich verordnete Hygienemanahmen). Eine Sonderposition haben die Infektionskrankheiten auch, weil viele Prventivmanahmen (z.B. Impfungen) besonders einfach und nachhaltig wirksam sind und die voraussichtliche Wirksamkeit von Therapeutika bereits durch in vitro Untersuchungen ermittelt werden kann. Der Nachweis von Infektionskrankheiten mit den Laborverfahren der Mikrobiologie besitzt daher verschiedene Funktionen, die sich nicht nur auf die individuell kurativen Zwecke beschrnken:
Er ist die Basis fr eventuell erforderliche Prventivmanahmen und Therapieentscheidungen. Er ermglicht zuverlssige Aussagen ber die Erregerepidemiologie und die Epidemiologie der Resistenzentwicklung. Er ist, ebenso wie die Pathologie, Teil eines wirksamen Programms zur Sicherung der Qualitt der Patientenversorgung, weil klinische Diagnosen durch Anwendung naturwissenschaftlicher Verfahren verifiziert bzw. korrigiert werden knnen.

Auch die zur Therapie eingesetzten Antibiotika nehmen innerhalb der Gruppe der Arzneimittel wegen ihrer notwendigen Vielfltigkeit hinsichtlich Wirkspektrum, Wirkintensitt. Pharmakokinetik eine besondere Position ein. Im Gegensatz zu den blichen Medikamenten ist ihre Wirkung vergnglich. Eine Zunahme des Verbrauchs von Antibiotika fhrt unweigerlich zu einer Zunahme des Selektionsdrucks und frdert die Selektion antibiotikaresistenter Bakterienstmme. Beispiele aus jngster Zeit sind die Penicillinresistenz von Pneumokokken, die in einigen Staaten bereits bei 40% der Isolate nachgewiesen werden kann, und die Ampicillinund Makrolidresistenz von Ilaemophilus influenzae.
Die Resistenzentwicklung verengt somit das Spektrum verfgbarer und wirksamer Antibiotika und gefhrdet Therapieoptionen.

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

Wir sind besiedelt!


Im Biotop Mensch ist der Mensch in der Unterzahl Kein Mensch ist allein. Er ist ein kosystem. In unserem Krper zhlt man Billionen von Zellen. Rund 90% von ihnen sind aber nicht menschlich, sondern sie gehren zu jenen Geschpfen, denen die Evolution den Menschen zugewiesen hat: als Nahrungsmittel und Schlafplatz, Hochzeitsmarkt und Raststtte. Bakterien stellen das Gros; allein auf der etwa 1,6 qm groen Haut eines Menschen leben soviele Mikroben wie Menschen auf unserem Planeten. In unserer Mundhhle schwimmt die Ambe Entamoeba gingivalis; in den Poren unseres Gesichts die wurmhnliche Milbe Demodex folliculorum. Schlielich existieren auch Flhe, Fliegen, Mcken, Wanzen, Egel, Zecken im Habitat Mensch.

Wir sind besiedelt! Ins Positive gewendet: Kein Mensch ist allein und war jemals allein.
Das wirkt sich unweigerlich auf das Bild des Menschen aus. Wenn wir in unserem Krper nur eine Art unter Hunderten stellen, kann keine Rede mehr davon sein, Homo sapiens sei die mchtigste Spezies. Falls Auerirdische jemals einen Menschen treffen sollten, wrden sie ihn vermutlich als Ansammlung vieler kleiner Lebewesen bezeichnen, die sich auf einen ziemlich groen niedergelassen haben. Angesichts der Mehrheitsverhltnisse in uns und auf uns stellt sich die Frage, wer hier wessen Untertan ist. Hat der Mensch wirklich das Tier domestiziert? Oder haben Geschpfe wie Kopfluse und Amben den Mensch gezhmt? Eines ist sicher: der Mensch meistert die Fhrnisse des Lebens nicht allein; vielmehr hat sich da in den vergangenen Jahren eine ungemein bunte Lebensgesellschaft gefunden, in der immer etwas los ist. Erst in vergleichsweise kurzer Zeit, in der Steinzeit, ist die Kleiderlaus zu uns gestoen. Der echte Menschenfloh dagegen, eben noch begafftes Zierkustierchen, findet sich mittlerweile auf der Liste der vom Aussterben bedrohten Arten. Einige unserer Bewohner gehren zu den gefhrlichsten Tieren der Welt, bertragen sie doch Malaria, Typhus, Gelbfieber und die Pest. Chlamydien scheinen Herzinfarkte zu begnstigen, bestimmte Mundbakterien bewirken Karies, und die surefesten Mikroben Helicobacter pylori fressen uns Geschwre in den Magen. Der Keim Mikrococcus sedentahus schlielich steht im Verdacht, ksigen Fugeruch zu verbreiten. Doch die allermeisten sind harmlose Tischgenossen, Kommensalen. Mehr noch. Ortsansssige Bakterien bilden auf der Haut eine Schtzenlinie, um schdliche Mikroorganismen abzuwehren. Im Darm wiederum assistieren Bakterien bei der Verdauung und versorgen die Menschen mit lebenswichtigen Vitaminen. Dieses dichte kologische Miteinander in Gut und Bse unterteilen zu wollen, wre vermessen. Als htten sie dies geahnt, sind unsere Vorfahren mit ihren Bewohnern weit gelassener umgegangen. tzi ertrug einen Peitschenwurm namens Trichuris und andere Plagegeister. Noch vor 200 Jahren verstie es nicht gegen die guten Sitten, auch in vornehmster Gesellschaft mit einem Flohglas nach Ungeziefer zu suchen. Heute empren wir uns, wenn eine Mcke unser Blut trinkt. Denn Krpersfte sind das geheimste, was wir austauschen knnen. Doch schlagen wir die vollgesogene Mcke dann voller Rachsucht tot, haben wir vornehmlich uns selbst totgeschlagen, denn mehr als die Hlfte des Flecks auf der Tapete besteht aus unserem eigenen Blut. Fast scheint es, mit unseren Besiedlern verhielt es sich wie mit Kindern: ohne sie wre unser Dasein rmer, dunkler und einsamer. Und hnlich wie wir unsere Gene an die nchste Generation geben, vererben Mutter und Vater dem Nachwuchs ihre persnliche Flora und Fauna. Bereits mit dem Durchtritt durch die Scheide nimmt es Bakterien auf, die sich in den ersten Tagen noch vermehren. Vom ersten Schrei an lassen uns die Bakterien nicht mehr allein und respektieren unsere Gastfreundschaft ein ganzes Leben lang. Dann erst, wenn wir tot sind, fressen sie uns auf. Von JRG BLECH, aus Das Leben auf dem Menschen - die Geschichte unserer Besiedler" Abb. 1.1 Biotop und kosystem Mensch. Dieser Beitrag ist in dem Buch Leben auf dem Menschen - die Geschichte unserer Besiedler" von JRG BLECH enthalten (Rowohlt-Verlag, 2000).

Allgemeine Infektionslehre

1.1.2 Konzepte der Klinischen Infektiologie


Whrend sich die Medizinische Mikrobiologie mit der Laboratoriumsdiagnostik befat, besteht die Aufgabe der Klinischen Infektiologie in der patientennahen Diagnostik, der Veranlassung der Laboratoriumsdiagnostik, der Umsetzung der Laborbefunde in praktische Medizin und in der Therapie und Beratung des Patienten.
Im Gegensatz zum amerikanischen Gesundheitssystem hat sich die Klinische Infektiologie in Deutschland als eigene Disziplin nicht etabliert, sondern ist der mehr oder weniger umfangreiche Teil der verschiedenen klinischen Fcher, insbesondere der Inneren Medizin und der Kinderheilkunde. Wichtige Bereiche der Klinischen Infektiologie werden durch die Medizinische Mikrobiologie abgedeckt. Die Zersplitterung der Klinischen Infektiologie hat dazu gefhrt, da eine strukturierte klinisch-infektiologische Aus- und Weiterbildung in Deutschland nicht angeboten wird und die Vermittlung klinisch-infektiologischen Wissens sowohl durch Lehrbcher und Unterrichtsveranstaltungen der Medizinischen Mikrobiologie als auch durch die Lehre der verschiedenen klinischen Fcher erfolgt. Da jedoch die wesentlichen Konzepte der klinisch-infektiologischen Krankenversorgung in allen klinischen Fchern gleich sind, bietet es sich an, diese in einem Lehrbuch fr Medizinische Mikrobiologie darzustellen.

Proteins. Diese Befunde sind typisch fr bakterielle Infektionen, whrend viele virale Infektionen nur eine geringfgige Vernderung der unspezifischen Entzndungsmarker verursachen. Eine Bluteosinophilie spricht fr parasitr bedingte Infektionen.
Die Aussagekraft der mikrobiologischen Laboruntersuchung wird nicht nur durch die Leistungsfhigkeit des Laboratoriums bestimmt. Sie wird ebenfalls ganz erheblich von dem am Patientenbett ttigen Arzt abhngen:

Zur klinischen Infektionsdiagnostik gehrt zustzlich zur allgemeinen Anamnese stets die spezifische Anamnese, die besondere Infektionsrisiken aufdecken soll und z.B. Auslandsaufenthalte, hnliche Erkrankungen in der Umgebung, Tierkontakte oder riskante persnliche Verhaltensmanahmen (z.B. i.v. Drogenmibrauch) erfragt. Bei der krperlichen Untersuchung ist die Suche sowohl nach primren Manifestationen der Infektion, den Eintrittspforten als auch nach metastatischen mikrobiellen Absiedlungen an Haut und inneren Organen, Lymphknotenvergrerungen, Leber- und Milzvergrerungen fr die spteren differentialdiagnostischen berlegungen wichtig. Auf der Basis dieser Vorinformationen sollte es mglich sein, Verdachts- und Ausschludiagnosen zu entwickeln und mit Hilfe mikrobiologischer und laborchemischer Untersuchungen und bildgebender Verfahren weiter einzuengen. Einfache laborchemische Verfahren knnen bereits Hinweise auf Infektionserreger geben: Leukozytose, Linksverschiebung, toxische Granulation in den Granulozyten, Erhhung der Blutsenkungsgeschwindigkeit, Erhhung des C-reaktiven

1. Es mu das richtige Untersuchungsmaterial zum richtigen Zeitpunkt entnommen werden. 2. Es mssen geeignete Materialtransportbedingungen eingehalten werden. 3. Es mu durch geeignete klinische Informationen sichergestellt sein, da im mikrobiologischen Labor diejenigen Untersuchungsverfahren ausgewhlt werden, die die klinisch relevanten Infektionserreger erfassen. Damit der sptere Untersuchungsbefund auch Basis der Therapie sein kann, sollte sich der Kliniker bereits vor Materialanforderung ber Antworten zu den in Abb. 1.2 genannten Fragen im klaren sein. Die mikrobiologische Untersuchung kann einen mikroskopischen und kulturellen Erregernachweis, einen Nachweis erregerspezifischer Genomabschnitte durch PCR und andere Amplifi-

Welches Erregerspektrum kommt bei der Erkrankung in Frage? Welche Untersuchungsmaterialien eignen sich zum Erregernachweis? Welches ist der geeignete Zeitpunkt zur Materialentnahme? Sind im Erregerspektrum Erreger enthalten, die durch eine routinemige Anforderung nicht erfat werden? Sind sehr seltene Erreger zu erwarten, die eine vorherige Kontaktaufnahme mit dem mikrobiologischen Labor erforderlich machen? Sind besondere Materialtransportbedingungen zu beachten? Sind aufgrund therapeutischer Probleme besondere Resistenztestungen anzufordern? Abb. 1.2 Fragen, die vor der Materialabnahme zu stellen sind.

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

kationstechniken, Antigen- und Antikrpernachweise sowie den Nachweis mikrobieller Toxinc umfassen. Die mikroskopischen und kulturellen Erregernachweise haben den Vorteil, da sie ein breites Erregerspektrum erfassen, so da erregerspezifische Untersuchungsanforderungen hufig nicht erforderlich sind. Desweiteren steht bei dem kulturellen Nachweis ein Isolat auch fr weitere Charakterisierungen (Antibiotikaempfindlichkeit, Vorhandensein von Virulenzeigenschaften) zur Verfgung. Nachweise durch PCR, Antigen- und Antikrpernachweise hingegen sind speziesspezifisch ausgerichtet, so da ausschlielich eine Aussage ber die eine untersuchte mikrobielle Spezies/Gattung mglich ist. Ihr Vorteil besteht darin, da auch nicht mehr lebens- und vermehrungsfhige Mikroorganismen und ihre immunologischen Hinterlassenschaften" (Antikrper) nachgewiesen werden knnen. Nach Entnahme des Probenmaterials und bei hinreichendem Infektionsverdacht kann, wenn es der Zustand des Patienten erfordert, die antimikrobielle Chemotherapie veranlat werden. Von einer Blindtherapie spricht man, wenn der Infektionserreger vllig unbekannt ist, von einer kalkulierten Therapie, wenn sich die Wahl des Antibiotikums an dem Spektrum der wahrscheinlichsten Infektionserreger ausrichtet. Je unklarer die Infektionserreger sind, desto breiter sollte das Wirkspektrum der verordneten Antibiotika sein. Bei dem Eintreffen des mikrobiologischen Befundes sollte bewertet werden, ob es sich bei dem nachgewiesenen Erreger auch um den wirklichen Infektionserreger handelt, der durch eine gezielte Antibiotikatherapie erfat werden soll. Miverstndlich positive Befunde (es sind ja richtig" positive Befunde, die nur hinsichtlich der Interpretation miverstanden werden knnen) entstehen bei dem kulturellen Nachweis von Erregern der Standortflora und bei Kontaminationen, bei der serologischen Untersuchung durch polyklonale Mitreaktionen, unspezifische anamnestische Reaktionen, Leihimmunitt oder nach Impfung. Falsch-negative Befunde knnen auftreten, wenn der Patient zuvor behandelt war, die Untersuchungsprobe den Infektionserreger nicht enthielt, dieser whrend des Transportes abgestorben ist, durch Begleitflora berwuchert wurde oder wenn der Infektionserreger durch den Untersuchungsauftrag nicht erfat wurde.

1.1.3 Allgemeine Infektionslehre


Der Mensch ist nur bis zu seiner Geburt frei von Mikroorganismen, anschlieend wird er von verschiedensten Arten besiedelt, so da normalerweise ein kologisches Gleichgewicht zwischen Mikroorganismus und Makroorganismus entsteht, bei dem der Mikroorganismus zwar auf der Haut oder den Schleimhuten des Wirts lebt, ihn jedoch nicht schdigt. Mikroorganismen, die den Wirt schdigen, werden als krankmachend (pathogen) bezeichnet. Die auf bzw. im Wirt wachsenden Mikroorganismen werden als Kommensale (Mitesser) benannt und bilden die Standortflora. Sie knnen Infektionen verursachen, wenn sie entweder durch Verletzungen in normalerweise keimfreie Bereiche des Krpers gelangen oder wenn die Infektabwehr des Wirts beeintrchtigt ist. Man nennt sie deshalb auch fakultativ pathogene Mikroorganismen oder Opportunisten. Der Wirt verfgt ber Mechanismen der unspezifischen und der spezifischen Abwehr (natrliche Resistenz und erworbene Immunitt). Es stehen sich also die infektionserzeugenden (pathogenen) Eigenschaften eines Mikroorganismus und die Abwehrfunktionen eines Wirts gleich den hochbewaffneten Armeen verschiedener Vlker gegenber. Das Gast/Wirtverhltnis befindet sich im instabilen Gleichgewicht: Gelangen pathogene Mikroorganismen in den Krper und kann die Infektabwehr berwunden werden oder kommt es zu einer spezifischen Minderung der Infektabwehr, so werden aus harmlosen Kommensalen Infektionserreger. Die Besiedlung des Wirts durch die mikrobielle Flora erfolgt normalerweise whrend der Geburt und durch Kontakt mit der belebten und unbelebten Umwelt. Man spricht von Kolonisation. Diese Mikroorganismen sind in charakteristischer Weise an ihren Standort angepat. Es wird zwischen der residenten Standortflora, welche in einem gewissen Lebensalter regelmig an einem Ort vorgefunden wird, und der transienten Flora, welche aus Mikroorganismen zusammengesetzt ist, die nur fr kurze Zeit Haut oder Schleimhute besiedeln, unterschieden. Eine Infektion bedeutet, da sich ein pathogener oder fakultativ pathogener Mikroorganismus im Wirt oder auf Haut- und Schleimhaut angesiedelt hat. Viele Infektionen zeigen klinisch keine Symptome, sie werden im Gegensatz zu den apparenten Infektionen als inapparent bezeichnet. Inapparente Infektionen knnen

Allgemeine Infektionslehre

gleichwohl ber eine Stimulation des Immunsystems zu einer stillen Feiung fhren, also zu einem Schutz des Wirts gegenber einer erneuten Infektion mit dem gleichen Erreger. Im Anschlu an eine Infektionskrankheit kann der Krper vor weiteren Infektionen mit demselben Erreger geschtzt sein. Es entsteht eine Immunitt, die, wie manche Impfung auch, einen lebenslangen Schutz verleihen kann. Erkrankungen, die eine hohe Kontagiositt (Ansleckungsfhigkeit) besitzen und zu einer lang anhaltenden Immunitt fhren, imponieren meist als Kinderkrankheiten, weil bereits der allererste Kontakt mit dem Erreger ber die ausgelste Erkrankung vor weiteren Infektionen praktisch ein Leben lang schtzt. Nach berstehen einer Krankheit wie z.B. Typhus. Paratyphus oder Diphtherie kommt es bei einigen Menschen nicht zu einer restlosen Eliminierung der Erreger. Diese leben noch in bestimmten Nischen des Krpers und werden von dort aus mehr oder minder lange ausgeschieden. Solche Personen werden Dauerausscheider oder Ausscheider genannt und sind epidemiologisch von groer Bedeutung. Werden pathogene Mikroorganismen nur vorbergehend ausgeschieden, spricht man von Keimtrgern. Ein Beispiel dafr sind Personen, die mit Staphylococcus aureus kolonisiert sind (meist im Naseneingangsbereich), nicht erkrankt sind, jedoch diese Mikroorganismen an Dritte weitergeben. Infektionen knnen ihren Ausgang von sehr verschiedenen Bereichen nehmen. Exogene Infektionen stammen aus der belebten und unbelebten Umwelt; bei endogenen Infektionen ist die Standortflora Ursprung der Infektion. Als nosokomiale Infektionen bezeichnet man Infektionen, die im Krankenhaus oder in der rztlichen Praxis erworben werden. Sie knnen als endogene oder als exogene Infektion entstehen. Begnstigt werden nosokomiale Infektionen durch Erkrankungen (z.B. Krebserkrankungen, AIDS), diagnostische und therapeutische Verfahren (z.B. Zytostatikatherapie, Fremdkrperimplantationen), welche die Infektabwehrfunktionen beeintrchtigen. Wegen der bestehenden Grunderkrankung verlaufen nosokomiale Infektionen hufig besonders schwer; viele der nosokomialen Infektionserreger sind darber hinaus durch eine besonders hohe erworbene oder natrliche Resistenz gegenber Antibiotika ausgezeichnet. Entscheidend fr eine erfolgreiche Infektion ist das Eindringen des Mikroorganismus in den

Wirt. Als wichtigste Eintrittspforte dienen die Schleimhute des Respirations-, Magen-Darmund des Urogenitaltraktes. Desweiteren sind die Bindehaut des Auges und die manchmal mikroskopisch kleinen Verletzungen der Haut oder Insektenstiche als Eintrittspforte zu nennen. Nur ganz wenige Krankheitserreger knnen direkt durch die intakte Haut eindringen. Ist der Mikroorganismus in den Krper gelangt, dann mu er sich an Zellen oder extrazellulre Matrixsubstanzen binden, um im Wirt zu berleben und um nicht weggeschwemmt zu werden. Nach erfolgler Bindung kann der Infektionserreger in manchen Fllen Toxine bilden, welche das Gewebe schdigen, so da sich der Infektionserreger einen Weg in den Makroorganismus bahnt. Die Infektionskrankheit ist ein Ergebnis der Invasion des Erregers und der Infektabwehrreaktionen. Verstrkte Blutzufuhr, Einwandern von Entzndungszellen, Strungen der Kapillarpermeabilitt, Zeil- und Gewebsuntergang und sich aufbauende reparative Prozesse erklren die Lokalsymptomatik von Schwellung, Rtung, Schmerz und Eiterbildung. Die Allgemeinsymptomatik wird von Interleukin-1, Interleukin-6 und Tumornekrosefaktor vermittelt. Das Zeitintervall zwischen der Aufnahme eines Krankheitserregers und der Ausbildung von Krankheitssymptomen wird als Inkubationszeit bezeichnet. Ihre Dauer ist vielfach charakteristisch fr bestimmte Krankheiten, sie kann sich insbesondere bei vielen Viruserkrankungen und klassischen Infektionskrankheiten in einem sehr engen zeitlichen Rahmen bewegen und ist somit fr die Diagnose und die Aufklrung epidemiologischer Zusammenhnge bedeutsam. Epidemiologisch besonders wichtig ist, da ein Mensch bereits whrend der Inkubationszeit Erreger ausscheiden und somit zur Infektionsquelle fr andere werden kann (z.B. Hepatitis A). Schlielich ist darauf hinzuweisen, da nicht bei allen Infektionskrankheiten die Inkubationszeiten angegeben werden knnen, besonders bei inapparent verlaufenden und bei primr chronischen Infektionskrankheiten (z.B. Tuberkulose). Viele pathogene Mikroorganismen haben im Krper bevorzugte Besiedlungsgebiete, so z.B. Meningokokken in den Hirnhuten, Shigellen im Dickdarm, Streptococcus mutans im Zahnschmelz. Dieses Verhalten wird als Tropismus bezeichnet. Die molekularen Grundlagen des Tropismus sind fr einige wichtige Infektionserreger bekannt.

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

Die sich vermehrenden Infektionserreger knnen sich jedoch, insbesondere wenn sie keinen ausgeprgten Zeil- oder Gewebstropismus aufweisen, im Wirtsorganismus hmatogen oder lymphogen ausbreiten. Man unterscheidet dann zwischen Lokalinfektionen und systemischen AHgemeininfektionen. Bei der Lokalinfektion bleibt der Erreger auf die Eintrittspforte und ihre Umgebung beschrnkt (z.B. Diphtherie, Gonorrhoe, Tetanus, Staphylococcus aureusAbsze). Fernwirkungen auf den Gesamtorganismus sind dann zu beobachten, wenn die Infektionserreger Toxine wie z.B. das Diphtherieoder Tetanustoxin freisetzen. Auch bei einer Lokalinfektion kann es zu einem Fortschreiten des Krankheitsprozesses im Gewebe kommen (z.B. Phlegmone durch -hmolysierende Streptokokken der Gruppe A oder Gasbrand durch Clostridium perfringens). Es handelt sich dabei um eine kontinuierliche Ausbreitung ausgehend von der Eingangspforte. Dieser Vorgang wird durch vorgeformte Kanle wie z.B. Gallengngc, Bronchiola, Faszienschichten begnstigt. Im Bereich der Eintrittspforte knnen die Erreger auch durch den Flssigkeitsstrom in die Lymphbahnen oder Blutgefe gelangen. Bei der systemischen oder der Allgemeininfektion gelangen die Mikroorganismen in das die Eintrittspforte drainierende lymphatische Gewebe. Nach einer erregertypischen Periode der Vermehrung treten dann die Bakterien in die Blutbahn ber (Generalisationsstadium) und gelangen anschlieend in die Organe (Stadium der Organmanifestation). Durchbricht nach einer Lokalinfektion der Infektionserreger die lokalen Abwehrbarrieren, so kann sich eine Sepsis entwickeln (s. Kapitel 11.7).

1. der Keim regelmig im erkrankten Organismus nachweisbar ist, 2. der Keim aus dem Infizierten isoliert und in Reinkulturen gezchtet werden kann, 3. mit der Reinkultur beim Versuchstier die Krankheit wieder experimentell erzeugt werden kann und 4. in den Versuchstieren der Mikroorganismus nachgewiesen und isoliert werden kann.

1.1.4 Pathogenitt und Virulenz der Bakterien


In der zweiten Hlfte des 19. Jahrhunderts stand die Frage im Raum, ob die nachgewiesenen Mikroorganismen Krankheitsursache oder nur bedeutungslose Begleiterscheinung darstellen. Von verschiedenen Forschern wurde daher eine Art Katalog von Kriterien entwickelt, die erfllt sein sollten, um einen Mikroorganismus als Krankheitserreger bezeichnen zu knnen. Diese spter als KOCHsche Postulate bezeichneten Bedingungen lauten: Um einen Mikroorganismus als Krankheitserreger bezeichnen zu knnen, ist es erforderlich, da

Die Postulate 1 bis 3 finden sich explizit formuliert erstmals in FRIEDRICH LOEFFLERS Diphtheriearbeit 1884; in KOCHS Publikationen (1878 Wundinfektionskrankheiten, 1884 TuberkuloseArbeit) sind sie enthalten, aber nicht als Postulate formuliert. Vor KOCH hat EDWIN KLEBS, nach dem die Bakteriengattung Klebsieila benannt wurde, 1877 drei Forderungen aufgestellt, die exakt den Postulaten 1 bis 3 entsprechen. Bei JAKOB HF.NLE findet sich 1840 nur die Bemerkung Da sie [die Mikroorganismen] wirklich das Wirksame sind, wre empirisch nur zu beweisen, wenn man .... [das] Kontagium isolieren [und seine Wirkung] beobachten knnte, ein Versuch, auf den man wohl verzichten mu". Davon wird - zu Unrecht - die Bezeichnung HENLE-KocH-Postulate abgeleitet (siehe auch bei MOCHMANN und KHLER). Die KoCHschen Postulate waren auerordentlich befruchtend fr das Verstndnis von Infektionskrankheiten. Am Beispiel dieser Postulate konnte erstmalig unter Anwendung naturwissenschaftlicher Verfahren nachgewiesen werden, da es sich bei der Tuberkulose nicht um eine Erbkrankheit handelt, obwohl die Tuberkulose familir auftritt, sondern um eine Infektionskrankheit. Es steht jedoch auer Zweifel, da fr viele sichere Krankheitserreger die KoCHschen Postulate nicht erfllbar sind, weil diese Krankheitserreger entweder in vitro nicht kultivierbar sind (z.B. Treponema paldiim) und/oder ein auf eine einzige Spezies beschrnktes Wirtsspektrum aufweisen (z.B. HIV). Da die ernsthafte Befassung mit den KoCHschen Postulaten auch heutzutage noch Bedeutung besitzt, zeigt exemplarisch die Entdeckung der Borreliose, bei der das erste Postulat dank sorgfltiger epidemiologischer Analyse von einer selbst betroffenen Hausfrau erfllt wurde (Abb. 1.3). Davon ausgehend konnten gezielte Untersuchungen, die zur Entdeckung des Erregers der Borreliose (Borrelia burgdorferi) fhrten, veranlat werden.

Allgemeine Infektionslehre

Die Entdeckung der Borreliose - von der Schwierigkeit, eine Infektionskrankheit zu diagnostizieren
Im Stdtchen Lyme, Connecticut, USA, kam es zu Beginn der 60iger Jahre zu einer Zunahme von unklaren Erkrankungen mit Arthritiden, Erythem, neurologischen Strungen, chronischer Mdigkeit, Gewichtsverlust, die, erst nachdem die Hausfrau Polly Murray die entsprechenden Daten zusammengestellt und am 20. November 1975 einem Epidemiologen an der Yale Rheumatology Clinic, Dr. A. C. Steere, prsentiert hatte, kausal geklrt werden konnte. Bis dahin hatte Frau Murray mehr als zwanzig rzte konsultiert, die meistens Diagnosen aus den Kategorien Hypochonder, Depression, Psychose stellten. Die lokalen Cesundheitsbehrden nahmen die Klagen von Frau Murray auf die leichte Schulter und sahen in ihr eine notorische Querulantin. Erst als es auch zu einer Epidemie von Erkrankungen mit juveniler rheumatoider Arthritis kam, wurden die Behrden hellhrig. Sie stellten den Kontakt zwischen Frau Murray und Dr. Steere her, der gerade vom Center for Disease Control kam und auf der Suche nach einem neuen Forschungsgebiet war. Die sorgfltige klinische und epidemiologische Bewertung der Erkrankungen widerlegte die Diagnose der juvenilen rheumatoiden Arthritis und ergab Hinweise auf eine Umweltexposition. Aufgrund der hnlichkeiten der Hauterscheinungen mit dem seit 1908 aus Europa bekanntem Erythema chronicum migrans und der in diesem Zusammenhang diskutierten Zeckengenese wurden die Untersuchungen auf Ektoparasiten gelenkt. In der Tat konnten die Bewohner von Lyme ber eine Zunahme von Zecken seit ca. 1960 berichten, und es wurde im Vergleich mit einer benachbarten, von der rtselhaften Erkrankung nicht befallenen Region ein um den Faktor 16 hherer Zeckenbefall von Damwild gefunden. 1981 konnte schlielich Dr. W. Burgdorfer, Rocky Mountain Laboratories, Montana, USA, die Spirochten nachweisen, die spter als Borrelia burgdorferi benannt und als eindeutige Ursache der in Lyme beobachteten Erkrankung identifiziert wurden. ARONOWITZ, P. B.: A Connecticut housewife in Francis Bacon's court: Polly Murray and Lyme disease. ThePharos52:9-12(1989) Abb. 1.3 Wie wird eine Infektionskrankheit entdeckt?

Die KocHschen Postulate wurden in den letzten Jahren auf die molekulare Pathogenittsforschung bertragen und wurden als molekularbiologische Postulate oder KocH-FALKOWsche Postulate bezeichnet, da der amerikanische Forscher STANLEY FALKOW erstmalig den Begriff Virulenzfaktor" definierte. Die drei molekularbiologischen Postulate lauten:
1. Die der Pathogenitt zugeordneten Eigenschaften eines Mikroorganismus mssen ausschlielich bei den pathogenen Vertretern eines Genus oder den pathogenen Stmmen einer Spezies nachweisbar sein. 2. Die Inaktivierung der putativen Virulenzgene mu zu einer erkennbaren Abnahme der Pathogenitt fhren. 3. Die Wiedereinfhrung der ursprnglichen Gene mu die Pathogenitt des Erregers wiederherstellen.

Pathogenitt beschreibt die Gesamtheit der Eigenschaften eines Mikroorganismus, die es diesem erlauben, eine Infektion hervorzurufen. Sie

ist die Folge der Wirkung von meist mehreren Pathogenittsfaktoren, die in charakteristischer Weise von einem Mikroorganismus produziert werden und deren koordiniertes Zusammenwirken zur Infektion des Wirts fhrt. Dabei haben sie die Fhigkeit, sich an Wirtszellen anzuheften (Adhrenz), sich an der Eintrittspforte zu vermehren (Kolonisation), in den Wirtsorganismus einzudringen (Invasivitt) sowie Zellen und Gewebe zu zerstren (Toxizitt). Diese Faktoren besitzen zentrale Bedeutung fr das Infektionsgeschehen. Unter Virulenz versteht man das Ausma der Pathogenitt eines bestimmten Krankheitserregers. Pathogenitt ist folglich eine Spezieseigenschaft, whrend Virulenz das Merkmal eines Stammes ist. So gibt es beispielsweise Diphtheriebakterien, die kein Toxin bilden und daher avirulent sind. Die Virulenz eines Mikroorganismus wird, hnlich wie die Toxizitt eines Toxins, definiert als die Zahl von Bakterien, die notwendig ist, um 50% einer Gruppe infizierter Wirtsorganismen zu tten. Man bezeichnet dies als die Letale Dosis50 oder LD50.

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

Allgemeine Prinzipien der Pathogenitt und Virulenz


Die am Infektionsgeschehen beteiligten mikrobiellen Faktoren lassen sich in die Adhsine, Invasine, Evasine und Toxine einteilen.

Die mikrobielle Adhrenz an Zellen, extrazellulre Matrixsubstanzen oder Sekrete sind fr den Infektionsproze von zentraler Bedeutung, weil andernfalls die Mikroorganismen von Haut, Schleimhaut und Endolhel wieder abgeschwemmt oder wegtransportiert werden. Die Adhrenz ist gleichzeitig die Vorbedingung und Vorbereitung fr das Entstehen von Mikrokolonien und die anschlieende Kolonisation. Die Bakterien verfgen daher ber eine Reihe verschiedener, z.T. hochspezialisierter Adhsine, die sensiblen Regulationsprozessen unterworfen sind (Tab. 1.1). Die Adhsine sind entweder zellstndig (nicht-fimbrielle Adhsine) oder bilden die Kappe von z.T. 2-3 um. langen, tentakelhnlichen Proteinanhngseln (Abb. 1.4). die im europischen Schrifttum als Fimbrien, im amerikanischen Schrifttum als Pili bezeichnet werden.
Die Nomenklatur der Adhsine ist historisch gewachsen und folgt daher keiner Einordnung in ein logisches System. Bei Escherichia coli sind die verschiedenen Adhsine im Detail bekannt. Sie werden meist nach denjenigen Wirtszcllstrukturen bezeichnet, an die sie binden. P-Fimbrien binden an das Disaccharid u-DTab. 1.1 Bakterielle Adhsine und Rezeptoren (modifiziert nach DOMANN) Adhsine Lektine Fimbrien (Pili) typische Beispiele Glykanbindungslektine von
Streptococcus sobrinus

Galaktose-(l-4)-Galaktose. Bestandteil der Blutgruppensubstanz P, die auf Erythrozyten, aber auch auf Epithelzellen des Harntraktes vorkommt. Die S-Fimbrien hingegen erkennen sialylsurehaltige Rezeptoren. Darber hinaus gibt es M-Adhsine, Dr-Adhsine. Typ-1-Fimbrien und CFA-Adhsine fr colonization factor antigen. Typische uropathogene E.-coliStmme bilden in mehr als 90% P-Fimbrien, whrend E. co/i-Stmme bei der neonatalen Meningitis mit S-Fimbrien verschen sind. Auch Gonokokken sind auf die Bildung von Fimbrien angewiesen, um pathogen zu sein. Daraus hatte sich die Vorstellung entwickelt, da ein Fimbrien-basierter Impfstoff Schutz vor einer Gonorrhoe vermitteln mte. Dieses Ziel lie sich jedoch nicht erreichen, weil, wie molckulargenetische Studien zeigten, die Fimbrienbildung einer Phasenvariation unterworfen ist. also ber einen genetischen Ein/Ausschalter reguliert wird. Darber hinaus werden die antigenen Eigenschaften der Fimbrien durch homologe Rekombination verndert, so da das durch eine Impfung aktivierte Immunsystem gleichsam ins Leere luft.

Einige Adhsine steuern auch Funktionen der Wirtszelle und bereiten die bakterielle Aufnahme in Zellen vor, indem sie an Integrine binden, die in der zellulren Kommunikation eine Rolle
spielen (z.B. Yersinia enterocolitica, Shigella flex-

neri\ Tab. 1.2). Auch grampositive Bakterien verfgen ber Adhsine. Hierbei handelt es sich beispielsweise um Lipoteichonsure, einen Be-

Filamentse P-, S-, Typ 1, K88, K99 und CFA1 -Fimbrien pathogener Escherichia co//-Stmme; Typ 4-Fimbrien von Neisseria gonorrhoea; Tcp-Fimbrien von Vibrio cholerae Pertactin von Bordetella pertussis; Fibronektin-Bindungsprotein von Treponema pallidum; Lipoteichonsuren von Streptococcus
pyogenes

Nicht-FimbrienAdhsine

Glykosaminglykane

Heparansulfat-hnliches Clykosaminglykan von Chlamydia trachomatis

Abb. 1.4 Fimbrielle und nicht-fimbrielle Adhsine (modifiziert nach SALYERS und WHITT).

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Allgemeine Infektionslehre

Tab. 1.2 Bekannte Invasionsmechanismen (modifiziert nach DOMANN) Bakterium bakterieller Ligand Wirtszellrezeptor Bemerkungen Yersinia enterocolitica
YadA

Invasin Intemalin A IpaB-D

1-lntegrine 1-Integrine E-Cadherin


5 1

Zipper-Mechanismus"'; effizient weniger effizient als das Invasin Zipper-Mechanismus"; effizient Trigger-Mechanismus" ; effizient Trigger-Mechanismus"; effizient Zipper-Mechanismus" ?; Invasion zur berwindung von Epithelbarrieren durch Transzytose?
2

Listeria monocytogenes Shigella flexneri

lntegrin?

Salmonella Typhimurium SipB-D Neisseria gonorrhoeae


1

unbekannt CD66a, CGM1

Opa/Opc

Zipper-Mechanismus": Die Wechselwirkung zwischen Ligand und Rezeptor fhrt in der Regel zur Aufnahme einzelner Bakterien 2 Trigger-Mechanismus": Durch die Induktion von Signaltransduktionsketten kommt es zu dramatischen Umorganisationen des lokalen Zytoskeletts, und induzierte Membranausstlpungen der Wirtszelle nehmen in der Regel mehrere Bakterien in einem Pinozytose-hnlichen Proze auf

standteil der Zellwand, oder um Oberflchenmolekle wie z.B. das M-Protein von Streptococcus pyogenes. Streptokokken, Staphylokokken, Enterokokken binden auch an extrazellulre Matrixsubstanzen wie z.B. Fibronektin, was die Haftfhigkeit im Gewebe erklrt. An dieser Bindung sind bei Staphylococcus aureus das Fibronektin-bindende Protein, welches auch kloniert und sequenziert wurde, und bei Enterococcus faecas die Aggregationssubstanz beteiligt. Invasine erlauben das Eindringen bzw. die Aufnahme in Zellen des Wirtsorganismus. Sie sind wichtig, damit die pathogenen Mikroorganismen nicht auf der Epithelschicht verbleiben, wo sie gleichsam Wind und Wetter ausgesetzt sind. Invasine sind mikrobielle Faktoren, die der Vermeidung der Infektabwehr dienen. Die intrazellulre Phase kann bei obligat intrazellulren Mikroorganismen die Sicherung des berlebens bedeuten und erschwert die Erkennung als fremd durch den Wirtsorganismus. Bei den fakultativ intrazellulren Bakterien (z.B. Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis) ist die Zelle eine Art Lebensabschnittsgefhrte. Zu den Wirtszellen gehren sowohl professionelle Phagozyten, die eigentlich trainiert sind, eindringende Bakterien effizient abzuwehren, als auch Epithelien oder Endothelien. Das erfolgreiche intrazellulre berleben von Mykobakterien oder Legionellen in Makrophagen ist besonders bemerkenswert. Bei dem bergang in die intrazellulre Lebensphase werden entweder natrliche Phagozytoseprozesse benutzt (z.B. bei den von Makrophagen phagozy-

tierten Mykobakterien und Legionellen) oder eine Art Reiverschlusyslem oder ein Triggermechanismus (Beispiele s. Tab. 1.2). Die Vermeidung der intrazellulren Bakterizidie erreichen Mikroorganismen z.T. dadurch, da sie sich in atypischen Vakuolen aufhalten, die nicht mit den Lysosomen fusionieren (z.B. Legionella in replikativen Vakuolen, die nicht mit dem Lysosomenmarker LAMP-1 dekoriert sind) oder von dem endozytotischen in den exozytotischen Pfad wechseln (Chlamydien). Da das intrazellulre Leben den Bakterien in bestimmten Phasen ntzt, knnen einige Bakterien vorbergehend das normalerweise ausgelste zellulre Selbstmordprogramm (Apoptose; programmierter Zelltod), welches zur Freisetzung der Bakterien fhren wrde, unterbinden. Andere Bakterien hingegen (z.B. Shigella) induzieren die Apoptose, damit anschlieend die aus der Zelle befreiten Bakterien an die basal lokalisierten plntegrine von Darmepithelien binden und diese von der Basis ausgehend zerstren knnen.
Toxine

Die Fhigkeit von Bakterien, Krankheiten zu verursachen, ist in vielen Fllen das Ergebnis ihrer Toxinproduktion.
Man unterscheidet zwischen Exotoxinen, die von den Bakterien sezerniert werden, und den Endotoxinen, die biologisch hochaktive Zellwandbestandteile gramnegativer Bakterien darstellen.

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

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Hufig werden Exotoxine, Enterotoxine (s.u.) und Endotoxine verwechselt. Die grundlegenden Eigenschaften beider Toxingruppen sind in der Tab. 1.3 zusammengefat. Die verschiedenen Toxine zeigen eine sehr unterschiedliche und z.T. sehr spezifische Toxizitt. Tetanus- oder Botulinus-Toxine sind bakterielle Proteine mit der hchsten Toxizitt, die wir kennen. Schon 100 ng reichen aus, um einen Menschen zu tten und 1 g, um die gesamte Menschheit zu vernichten, wenn nicht das Verteilungsproblem wre.
Exotoxine

Aufbau und Wirkmechanismus vieler Exotoxine sind dank der modernen Methoden der Zell-und Molekularbiologie im Detail gut bekannt (Tab. 1.4). Die Gene fr Exotoxine sind entweder in temperenten Phagen (Scharlach-, Diphtherieund Botulinusloxin), in Plasmiden (Staphylokokken-Entcrotoxin und -Exfoliatin, E.coliEnterotoxine) oder im bakteriellen Chromosom lokalisiert. Die Exotoxine sind hufig sehr effizient an den Infektionsproze adaptiert. So ist z.B. das Staphylokokken-Enterotoxin sehr resistent gegenber Magen- oder Darmenzymen, so da es bei oraler Aufnahme seine Toxizitt nicht

verliert. Eines der Bolulismus-Toxine hingegen ist in der vom Bakterium sezernierten Form inaktiv, es mu zuvor von Enzymen des Magens oder Darmes aktiviert werden. Die Wirkung anderer Toxine ist daran gebunden, da die entsprechenden Rezeptoren auf der Zelloberflche vorhanden sind. So gibt es beispielsweise im Suglingsalter kaum Flle von pseudomembranser Enterokolitis, weil das entsprechende Zytotoxin nur vom ausgereiften Darm aufgenommen wird. Umgekehrt gibt es einen Suglingsbotulismus, der entsteht, wenn Suglinge mit Honig gefttert werden, der die Sporen von Clostridium botulinum enthlt. Im Suglingsdarm keimen diese Sporen aus und produzieren das Botulinus-Toxin. Im Erwachsenenalter hingegen bedarf es der Aufnahme des prformierten Botulinus-Toxins, um an Botulismus zu erkranken. Die Erkenntnis, da es Exotoxine sind, die eine Infektionskrankheit verursachen, war die Basis fr die Entwicklung von Impfstoffen, bei denen entweder das Toxoid als aktive Impfung oder spezifische Antikrper als passive Impfung verabreicht werden. Das Toxoid ist ein chemisch modifiziertes Toxin, welches nicht mehr toxisch, jedoch unverndert immunogen

Tab. 1.3 Eigenschaften von Exotoxinen und Endotoxinen Exotoxine Sekretionsprodukte gram-positiver und -negativer Bakterien Polypeptide Relativ instabil, meist temperaturempfindlich (60 C) hoch immunogen, induzieren neutralisierende Antikrper hochtoxisch, LD50 im Mikrogramm-Bereich durch Formalin in nichttoxische, aber immunogene Toxoide umwandelbar (z.B. Diphtherie- oder Tetanus-Toxoid) binden an spezifische Zeil-Rezeptoren Endotoxine Zellwandbestandteile gram-negativer Bakterien, die bei Zellteilung oder Zelltod freigesetzt werden Lipopolysaccharide, Lipid A-Teil fr Toxizitt verantwortlich ber 2,5 h hitzestabil (100 C) wenig immunogen, induzieren neutralisierende Antikrper weniger toxisch, LD50 im Milligramm-Bereich nicht in Toxoide umwandelbar bindet an CD14 Rezeptoren und an das LPS-bindende Protein induzieren neben anderen unspezifischen Effekten die Freisetzung von Interleukin 1 und 6 sowie Tumornekrosefaktor aus Makrophagen und verursachen Fieber Synthese chromosomal kodiert

verursachen meist kein Fieber, Ausnahmen sind die Exotoxine mit Superantigenwirkung

Synthese oft Plasmid- oder Phagen-kontrolliert

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Allgemeine Infektionslehre

Tab. 1.4 Bakterielle Toxine Toxin A-B-Typ Diphtherie-Toxin Bakterienart Corynebacterium diphtheriae V. cholerae Wirkungsweise ADP-ribosyliert den Wirtszell-ElongationsFaktor-2, beendet die Proteinsynthese Auswirkung in der Erkrankung Schdigung des Herzmuskels und anderer Organe wrige Durchflle

Cholera-Toxin

Shiga-Toxin Tetanus-Toxin

Shigella dysenteriae Clostridium tetani Clostridium botulinum

ADP-ribosyliert ein regulatorisches Protein der Wirtszelle und unterbricht 1 dadurch die Kontrolle des cAMP spaltet rRNA der Wirtszelle und beendet die Proteinsynthese Endopeptidase-Aktivitt beeinflut die Kontrolle der Reizbertragung im Nervensystem Endopeptidase-Aktivitt beeinflut die Kontrolle der Reizbertragung im Nervensystem porenbildendes Toxin

unklar spastische Lhmung

Botulismus-Toxin

schlaffe Lhmung

Membranschdigung Listeriolysin Listeria monocytogenes a-Toxin Superantigen Toxic-Shock-Toxin (Toxic-ShockSyndrom)


1

erlaubt den Bakterien aus phagozytischen Vakuolen zu entkommen ttet Phagozyten, verursacht Gewebeschden Fieber und Schock

Clostridium perfringens Stapbylococcus aureus (grampositiv)

Phospholipase verstrkt Zytokin-Produktion von T-Zellen

cAMP, zyklisches AMP

ist. so da es als Impfstoff eingesetzt werden kann. Aufgrund ihrer biologischen Wirkungen lassen sich die Exotoxine in verschiedene Wirkgruppen einteilen, die im folgenden exemplarisch besprochen werden: Mein branschdigende Toxine 1. Enzymatische Wirkung. Das a-Toxin von Clostridium perfringens ist eine Phospholipase C, die das Lezithin der Zellmembran hydrolisiert und damit die Zelle abttet (Abb. 1.5b). Es ist die Hauptursache fr den oft tdlichen Ausgang des Gasbrandes. 2. Physikalische Wirkung. Das a-Toxin von Staphylococcus aureus fhrt zu einer funktionellen Pore der Wirtszellenmembran und dadurch zur Lyse der Zelle (Abb. 1.5a). 3. Durch Thiolgruppen aktivierbare Zytolysine. Diese Zytolysine (z.B. Streptolysin O, Pneumolysin, Tetanolysin, Listeriolysin und das

theta-Toxin von Clostridium perfringens) sind sauerstofflabil, durch Cholesterin hemmbar, werden durch reduzierende Agenzien aktiviert und wirken auf Erythrozyten hmolysierend. Jedoch knnen sie auch andere Zellen schdigen. 4. Andere membranschdigende Toxine. Staphylokokken--Toxin (Hmolysin), Staphylokokken-y-Hmolysin, Staphylokokken-Leukozidin, das O2-stabile Streptolysin S der Streptokokken, a-Toxin von Clostridium novyi. Neurotoxine Zu den Neurotoxinen gehren die biologisch hochwirksamen Tetanus- und Botulinus-Toxine. Obschon die biologische Wirkung beider Toxine auerordentlich unterschiedlich ist, bestehen erhebliche hnlichkeiten. Bei beiden Toxinen handelt es sich um zinkabhngige Endopeptidasen, welche die Freigabe von Neurotransmittern unterbinden. Das Tetanustoxin blockiert inhibi-

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

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Abb. 1.5 a-b Wirkungsweise oberflchenschdigender


Toxine. a) Einbau des Hmolysins beispielsweise von Staphylococcus au reu s in die Zellmembran, Entstehung einer funktionellen Pore, b) Destabilisierung der Zellmembran durch Abspaltung von Phosphatresten der Phospholipide (modifiziert nach SALYERS und WHITT).

torische Zwischenneurone (RENSHAW-Zellen) im Rckenmark, was zu unkontrollierter Aktivierung der motorischen Vorderhornzellen fhrt. Die spezifische neurotoxische Wirkung besteht in der enzymatischen Inaktivierung des Synaptobrevin/Vesicular Associated Membrane Complcx und damit in einer Blockierung der Freisetzung von Neurotransmittern ber die Exozytose. Klinisch bewirkt dies eine spastische Kontraktion und tonisch-klonische Anflle bei erhaltenem Bewutsein. Das Botulinus-Toxin inhibiert die Erregerbertragung an cholinergen Synapsen und fhrt daher zu schlaffen Lhmungen von Skelettmus-

keln und zu einer Gleichgewichtsstrung zwischen dem sympatischen und dem parasympatischen Nervensystem. Das Botulinus-Toxin ist ein Neurotoxin, welches die Freisetzung von Azetylcholin verhindert. Es handelt sich um eine Metalloprotease, die in die Exozytose der neurotransmitterhaltigen Vesikel inhibierend eingreift. Enterotoxine Enterotoxine wirken auf Darmepithelien und fhren zu einer verstrkten Sekretion von Flssigkeit im Darm. Beispiele fr Enterotoxine sind das Cholera-Toxin, Enterotoxine von Staphylo-

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Allgemeine Infektionslehre

coccus aureus und E. coli. Letztere werden auch als enterotoxische E. coli bezeichnet, sie sind fr die sog. Reisediarrhoe verantwortlich. Superantigene Superantigene sind Proteine, die direkt an HLA-Molekle der Klasse II, z.B. HLA-DR von Monozytcn und Makrophagen und an den variablen Teil der -Kettc (V) des T-Zellrezeptors binden. Dies bewirkt eine massive Freisetzung von Intcrleukin 2 und Interferon-y aus TZellen, welches dann eine Freisetzung von Interleukin 1, Tumornekrosefaktor und weiteren Zytokinen zur Folge hat. Klinisch manifestiert sich der Zytokin-GAU" als Schock. Superantigene sind beispielsweise das Toxic-Shock-Syndrom Toxin 1 und die Enterotoxine von Staphylococcus aureus bzw. die erythrogenen Toxine A und C von -hmolysierenden Streptokokken der Gruppe A (Ursache des streptococcal toxic shock syndrome) (s. auch Kapitel 4.2). AB-Toxine: Viele bakterielle Toxine gehren dem sog. AB-Typ an (Diphtherie-Toxin, Cholera-Toxin, Shiga-Toxin, Tetanus-Toxin, Botulinus-Toxin), welches aus einem Heterodimer mit

einer A- und einer oder mehreren B-Untereinheiten besteht (Abb. 1.6a). Beide Untereinheiten sind durch eine Disulfid-Brcke verknpft. Die B-Untereinheit bindet an die Zelle, whrend die A-Untereinheit fr die toxische Wirkung verantwortlich ist (Abb. 1.6b). Bei einigen Toxinen vom AB-Typ wurde eine enzymatische Wirkung nachgewiesen. Dazu gehrt die Endopeptidase-Aktivitt des Tetanus- und des Botulismus-Toxins (s.o.) und die Fhigkeit der ADPRibosylierung von Proteinen. Die ADP-ribosylyierenden Toxine knnen unterschiedliche biologische Aktivitten entfalten, weil sie verschiedene Proteine ribosylieren (Abb. 1.7). So fhrt die ADP-Ribosylierung des Diphtherie-Toxins zu einer Inaktivierung des Elongationsfaktors 2, ein Faktor, der bei der Translation wichtig ist, whrend das Cholera-Toxin ein regulalorisches Protein der Wirtszelle ribosyliert und damit die Flssigkeitssekretion auslst.
Zellwandbestandteile mit toxischer Wirkung

Endotoxine sind hitzestabile Komplexe aus Lipopolysacchariden (LPS), die sich in der ueren Zellmembran von gramnegativen Bakterien

Abb. 1.6 a-b Wirkungsweise von A-B-Toxinen. a) Einfache und komplexe A-B-Toxine. b) Bindung des Toxins ber die B-Untereinheit und Translokation der A-Untereinheit, die die toxische Domne aufweist, in das Zellinnere (modifiziert nach SALYERS und WHITT).

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

15

Variabilitt und Adaptationsfhigkeit sind daher auch bei Bakterien fr das berleben und den (Infektions-)Erfoig wichtige Eigenschaften. Grundstzlich verfgen die Bakterien ber die in Abb. 1.8 gezeigten Mglichkeiten, sich zu verndern (s. Kapitel 3.3). Die Kommunikation der Bakterien mit ihrer Umwelt bedient sich, je nach Bakterienart, verschiedener Sensoren, die pHWerte, Temperatur, Sauerstoffdruck. Nhrstoffund Metabolitkonzentrationen wahrnehmen knnen. Wichtig ist fr Bakterien auch, die eigene Populationsdichtc zu berwachen. Eine hohe Populationsdichte knnte als Signal verstanden werden, in eine mobile Phase einzutreten, um Biotope zu finden, in der die Konkurrenz um Nhrstoffe geringer ist. Auch lohnt nur bei hoher Populationsdichte die Ausbildung von Systemen, die der bertragung genetischer Informationen dienen. Fr die Kommunikation miteinander benutzen die Bakterien hufig Botenstoffe, die ber globale Regulatoren Regulationskaskaden in Gang setzen. Einige gramnegative Bakterien verfgen ber ein Kommunikationssystem, das Bakteriendichte mit und auch als Quorum Sensing bezeichnet wird (Abb. 1.9).
Abb. 1.7 ADP-ribosylierende Toxine. Abspaltung der ADP-Ribosylgruppe von NAD und Ribosylierung eines Proteins, welches dadurch in die inaktive Form bergefhrt wird (modifiziert nach SALYERS und WHITT).

befinden. Das LPS verursacht viele der fr Infektionskrankheiten typischen Symptome und ist fr schwere Schockzustnde bei Infektionen durch gramnegative Bakterien verantwortlich (s. Kapitel 11.7). Peptidoglykane, die Hauptbestandteile der Zellwand von grampositiven Bakterien, haben allem Anschein nach viele Eigenschaften, die denen von Endotoxin hnlich sind. Allerdings sind diese weit weniger gut charakterisiert.
Bakterielle Adaptation, Kommunikation und Interaktion
Umweltsignale Eine wichtige Voraussetzung fr die erfolgreiche Invasion und berwindung der Infektabwehr ist nicht nur das Vorhandensein von Pathogenittsmerkmalen sondern auch die Fhigkeit, diese Merkmale koordiniert, auf die Situation angepat, zu exprimieren.

Unter Quorum" wird die fr eine Abstimmung geringste Zahl an stimmberechtigten Mitgliedern verstanden. Das Quorum Sensing der Bakterien wurde erstmalig an Vibrio fischen und anderen Vibrio-Arten untersucht, die in hohen Konzentrationen als leuchtende Bakterien in den Lichtorganen einiger Fischarten vorkommen. Die bakterielle Luminiszcnz entsteht (vernnftigerweise) nur. wenn die Vibrionen in hohen Konzentrationen (highdensity) wie z.B. im Lichtorgan der Fische zusammenleben. Die Luminiszenz wird durch Autoinducer. die von den Bakterien abgegeben werden, in Gang gesetzt. Bei geringen bakteriellen

Abb. 1.8 Mikrobielle Mglichkeiten, sich zu verndern (modifiziert nach SALYERS und WHITT).

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Allgemeine Infektionslehre

Abb. 1.9 Wie stimmen Bakterien ab? Quorum sensing. Produktion einer Autoinducersynthetase, die zur Bildung von Autoinducern (Homoserinlakton) fhrt. Homoserinlakton diffundiert durch die bakterielle Zellwand. Bei hoher Populationsdichte kommt es zu einer Rckdiffusion gengender Mengen, so da der zunchst inaktive transkriptionelle Aktivator aktiviert wird und die Promotoraktivitt erhht. Damit wird gleichzeitig die Transkriptionsaktivitt zahlreicher weiterer Gene, zu denen auch das lux-Operon gehrt, erhht (modifiziert nach GREENBERC).

Dichten ist die Konzentration der Autoinducer so niedrig, da sie intrazellulr keine Effekte verursachen knnen. Von einer Schwellenkonzentration an kommt es zur Autoinduktion, verstrkter Produktion des Autoinducers und erhhter Transkription anderer Gene. Die Autoinducer der verschiedenen gramnegativen Bakterien gehren alle der chemischen Gruppe der Homoserinlaktone an. Pathogene Bakterien, bei denen Homoserinlakton-Signale nachgewiesen wurden, sind beispielsweise Pseudomonas aeruginosa, Aeronwnas, Citrobactei; Prnteus, Serratia und Yersinia.

Bei grampositiven Bakterien gibt es nur wenige detaillierte Vorstellungen ber die Messungen der Bakteriendichte. Anstelle von Homoserinlaktonen einiger gramnegativer Bakterienarten werden Peptide von 5-10 Aminosuren Lnge produziert, die, wegen ihrer geringen Wahrnehmungskonzentration, z.T. auch als Sexpheromone bezeichnet werden. Bei Enterokokken bewirken die Sexpheromone, da sich die bakterielle Oberflche verndert und eine sog. Aggrcgationssubstanz gebildet wird. Die Bakterien verklumpen, so da sie ihre Plasmide an den plasmidfreien Sexpheromon-produzierenden Stamm weitergeben knnen. Bemerkenswerterweise besitzen auch Peptide des Wirtsorganismus Scxpberomon-Eigcnschaften, so da bei einer Infektion die Aggregationssubstanz gebildet wird. Diese wiederum besitzt Erkennungsmotive fr Integrine, so da eine Bindung an Integrin-positive Wirtszellen mglich ist.
Eisenaufnahmesysteme

Bei vielen Krankheitserregern spielt die ausrei-

chende Versorgung mit Eisenionen eine fr die Pathogenitt wichtige Rolle. Unter anaeroben Bedingungen liegt Eisen in der leicht wasserlslichen zweiwertigen Form vor, unter aeroben Bedingungen bilden sich schwerlsliche Fc3*Komplexe, die von Bakterien nicht direkt aufgenommen werden knnen. Innerhalb des Wirts kompetieren die Mikroorganismen um Eisen, das von Laktoferrin oder Transferrin mit hoher Affinitt gebunden wird. Um an das wertvolle Eisen heranzukommen, bilden einige Mikroorganismen Siderophore, das sind Eisenbindeproteine mit Bindungskonstanten von 102"-10M). Die Siderophore gehren der Gruppe der Katecholate oder Hydroxamate an und knnen polyzyklisch aufgebaut sein. Verschiedene Bakterienarten knnen auch Siderophore anderer Spezies zur Eisengewinnung verwenden (Eisenschmarotzer). Die Fev-beladenen Siderophore binden sich an Rezeptoren, werden in das Zytoplasma transportiert, wo dann das dreiwertige Eisen zum zweiwertigen Eisen umgewandelt wird. Eine alternative Mglichkeit, Eisen aufzunehmen, besteht in der Bindung von Hmoproteinen (z.B. Hmoglobin) an bakterielle Rezeptoren. Mit Hilfe von ATP-abhngigen Permeasen wird Hm aus dem Komplex gelst und in das Zytoplasma transportiert, wo es an Hmproteine wiedergebunden wird. Das Eisen kann auch aus dem Porphyrinkomplex freigesetzt werden und in den Eisenpool der Bakterienzelle bergehen.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

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Sekretionssysteme - Biochemischer Cross-talk

Neben den bakteriellen Stoffwechselprodukten, die toxische Wirkungen ausben, besitzen einige gramnegative Bakterien eine Gruppe von sezernicrten Pathogenittsmerkmalen, die genetisch hufig in Clustern, sogenannten Pathogenittsinseln, organisiert sind und als Sekretionssysteme bezeichnet werden. Unter Sekretion wird hierbei der aktive Transport vom Zytoplasma ber die innere und uere Membran in den Kulturberstand verstanden. Proteine, die ber den Typ-IF und den Typ-IV- Sekretionsweg transportiert werden, besitzen eine ca. 30 Aminosuren lange, meist hydrophobe Signalsequenz, die von einer periplasmatischen Peptidase abgespalten wird und den Proteintransport durch die innere Membran untersttzt. Der Proteintransport ist energieabhngig und erfordert zahlreiche akzessorische Proteine. Typisch fr das TypIV-Syslem ist, da im Gegensatz zum Typ-II-System alle Informationen, die fr den Transport durch die uere Membran erforderlich sind, bereits auf dem sezernierten Protein enthalten sind. Es wird daher auch als Autotransporter bezeichnet. ber diesen Weg werden beispielsweise die Gonokokken-Protease (IgG-Protease) und ein Toxin von Helicobacterpylori sezerniert. Die Sekretion ber den Typ-I-Weg erfordert keine proteolytische Spaltung des Proteins, sie bentigt insgesamt auch nur drei Proteine: ein Protein fr den Transport durch die innere Membran (inner membrane transport ATPase), ein Protein der ueren Membran und ein Membranfusionsprotein, welches den periplasmatischen Spalt berbrckt. Typ-III-Sekretionssysteme sind, ebenso wie das Typ-I-Sekretionssystem, nicht auf eine periplasmatische Peptidase angewiesen, auerdem ist eine sekretorische Signalsequenz nicht erkennbar. Der Sekretionsapparat besteht aus ca. 20 Proteinen, die in der inneren Membran lokalisiert sind und Homologien mit dem Flagella-Biosynthesesystem aufweisen. Proteine, die auf dem Typ-III-Sekretionsweg sezerniert werden, sind offensichtlich dazu gedacht, da sie direkt in das Zytoplasma der Wirtszclle transloziert werden, wo sie in die zellulre Signaltransduktion eingreifen, immunologische Funktionen stren, eine Reorganisation des Zytoskeletts verursachen und damit die intrazellulre Aufnahme des Bakteriums in effizienter Weise vorbereiten. Beispiele fr Bakterien, die ber ein Typ-III-Sekretionssystcm verf-

gen, sind Yersinien, Salmonellen, Pseudomonas aeruginosa, mglicherweise auch die obligat intrazellulre Bakterienart Chlamydia trachomatis und eine Reihe pflanzenpathogener Bakterien. Eine Zusammenstellung der mikrobiellen Abwehrmechanismen zeigt Tabelle 1.5. Literatur
D OMANN , E.: Pathogenittsfaktorcn bakterieller Krankheitserreger. Dtsch. Med. Wochenschr. 123:229-236 (1998). GRUNBERG . P.: Quorum sensing in Gram-negative bacleria. ASM News 63: 371-377 (1997). Hucck, C. J.: Type TTI protein secretion Systems in bacterial palhogens of animals and plants. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:379-433 (1998). MOCHMANN, H., und W. KHLER:. Meilensteine der Bakteriologie. 2. Aufl., Wtzel, Frankfurt/M 1997, pp. 300, 324ff. SALYERS. A. A.. and D. D. WIIITT: Baeterial Pathogenesis. American Society for Microbiology. Washington. USA, 1997.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr


BERNHARD FLEISCHER, BARBARA M. BROKER

1.2.1 Das Immunsystem Vielzeller sind eine attraktive Umwelt fr Mikroorganismen. Die komplexen Organismen investieren einen Groteil ihrer Energie in die Homostase, die Aufrechterhaltung des inneren Milieus mit seinen konstanten Parametern wie z.B. Temperatur. pH-Wert, Osmolaritt und Angebot an Nhrstoffen. Fr Mikroorganismen ist die Anpassung an diese stabile Umgebung einfacher als berleben und Vermehrung unter den stark wechselnden Bedingungen in der freien Natur. Um ihre Integritt zu wahren und den Befall durch Mikroorganismen auf ein vertrgliches Ma zu beschrnken, haben die vielzelligen Wirtsorganismen ein breites Spektrum von Abwehrmechanismen entwickelt. Hierbei lassen sich Mechanismen der angeborenen Resistenz von solchen der adaptiven Immunitt unterscheiden. Die Resistenzmechanismen haben sich im Laufe der Phylogenese an ihre Aufgaben angepat. Sie sind sofort funktionsbereit, knnen aber nicht weiter fr die Infektionen opti-

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Allgemeine Infektionslehre

BSSIlIll Mikrobielle Mechanismen zur Vermeidung einer Infektionsabwehr (modifiziert nach DOMANN) Mechanismus Toleranz allgemein bakterielle Antigene induzieren schwache Immunantworten (z.B. durch molekulares Mimikry) Mikroorganismus schwcht Immunantwort (z.B. durch Tten infizierter Zellen des Immunsystems) intrazellulrer Lebensstil induzierte Antikrper besitzen geringe Affinitt oder sind gegen unwichtige" Epitope gerichtet freigesetzte Antigene fangen zirkulierende Antikrper ab Kapselpolysaccharide Vortuschen wirtseigenen Gewebes typische Beispiele M-Protein (Streptokokken); Syphilis (Treponema pallidum)

Immunsuppression

HIV

Ausweichen vor einer Immunantwort Induktion unwirksamer Antikrper lsliche mikrobielle Antigene schwach wirksame Antigene Camouflage

Bruceila Plasmodium; Trypanosoma Trypanosoma cruzi; Candida albicans tscherkhla coli; Gruppe B Meningokokken Wirtsfibrin nach Hydrolyse durch Koagulase (Staphylococcus aureus) Neisseria gonorrhoeae Erreger von Scrapie, Kuru, CREUTZFELDT-JAKOB,BSE

Antigenvariation Induktion einer Immunantwort unterbleibt

Vernderung von Pili und ueren Membranproteinen typischerweise bei lang persisitierenden Erregern

miert werden, denen der Wirt im Laufe seines Lebens tatschlich ausgesetzt ist. Die Mechanismen der adaptiven Immunitt haben sich in der Evolution spter entwickelt. Sie werden erst mit einer Latenz von 4-5 Tagen nach Infektion wirksam, sind dann aber spezifisch fr den jeweiligen Infektionserreger. Auerdem entsteht dabei ein Immungedchtnis, welches ebenfalls spezifisch fr den Infektionserreger ist. Dieser kann dann bei einem zweiten Kontakt mit dem Wirtsorganismus viel effizienter abgewehrt werden. So kann sich die adaptive Immunitt in der Ontogenese des Wirtsorganismus an dessen individuelle Infektionsrisiken anpassen. Resistenz und Immunitt sind eng miteinander verzahnt: Resistenzmechanismen sind an der Initiierung der adaptiven Immunitt beteiligt und die adaptive Immunitt setzt viele Resistenzmechanismen als Effektorfunktionen ein, wodurch deren Wirkung zielgcnauer und auch effektiver wird. Deshalb erscheint die Trennung von Resistenz und Immunitt oft knstlich. Fr dieses Kapitel whlen wir eine breite Definition von Immuiisystem: Das Immunsystem umfat sowohl die angebore-

ne Resistenz als auch die adaptive Immunitt. Entsprechend der Bedeutung der Abwehr ist das Tmmunsystem eines der grten Organe des Krpers. Dies wird jedoch nicht auf den ersten Blick deutlich, weil die Zellen und Organe des Immunsystems ber den ganzen Krper verteilt sind.
Mechanismen der angeborenen Resistenz

Die Keratinschicht der Haut bildet fr viele Mikroorganismen bereits eine unberwindliche Barriere. Mucopolysaccharide, welche von den Schleimhuten abgegeben werden, haben eine hnliche Funktion, da sie die Anheftung von Erregern verhindern. Hinzu kommen Selbstreinigungssysteme wie z.B. das Flimmerepithel der Atemwege. Auch die kommensale Flora, welche innere und uere Krperoberflchen besiedelt, verhindert durch Konkurrenz um Ressourcen und durch anti-mikrobiell wirkende Sekretionsprodukte viele Infektionen. Ein intensiver Kontakt mit potentiell pathogenen Erregern findet ber die Nahrung im Magen-Darmtrakt statt. Der niedrige pH des Magens bietet hier einen Schutz.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

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Wenn Mikroorganismen die Epithelien der Krperoberflchen berwunden haben, werden sie mit weiteren Abwehrmechanismen konfrontiert. Verschiedene Frezellen (Phagozyten),
nmlich Makrophagen und Granulozyten tragen

auf ihrer Oberflche Rezeptoren fr konservierte Oberflchenstrukturen von Bakterien, z.B. fr LPS. Damit binden sie die Erreger, um sie danach aufzunehmen und zu verdauen. Die Phagozytose wird erheblich effizienter, wenn die Erreger durch Proteine des Komplementsystems markiert sind (Opsonisierung). Dieses Abwehrsystem besteht aus einer komplizierten Kaskade von Proteasen. nach deren sequentieller Aktivierung Zellen mit Proteinen beladen und lysiert werden (s. Kap. 1.2.5). Viele Mikroorganismen aktivieren mit ihrer Zelloberflche direkt dieses System. Lt sich eine Infektion durch diese Mechanismen nicht innerhalb von Stunden eliminieren, wird die nicht-adaptive Abwehrreaktion intensiviert: Es ensteht eine Entzndung. Blutgefe werden weitgestellt (calor und rubor) und fr Flssigkeit und hochmolekulare Substanzen permeabel, so da ein lokales dem entsteht. Auerdem werden mehr Phagozyten an den Infektionsherd gelockt (tumor). Aktivierte Makrophagen setzen Zytokine frei, die Hormone des Immunsystems. Die Zytokine Interlcukin (IL)-l und Tumornekrosefaktor

(TNF)-a erweitern und permeabilisieren die lokalen Kapillaren, aktivieren deren Endothelzellen und lsen dadurch die Extravasation weiterer Entzndungszellen aus, zunchst von neutrophilen Granulozyten, spter auch von Monozyten. Die Kapillaren exprimicren zunchst Selektine, Adhsionsmolekle fr Monozyten und neutrophile Granulozyten. Hierdurch entsteht ein lockerer, reversibler Membrankontakt zwischen den Endothelzellen und den Phagozyten, so da die Zellen klebrig" werden und im verlangsamten Blutstrom an der Gefwand entlangrollen. Hierbei tauschen sie weitere Signale mit den Endothelzellen aus, welche darauf mit der zustzlichen Expression von weiteren Adhsionsmoleklcn, z.B. CD54 (dem intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1) reagieren. Auf der Oberflche der Phagozyten wird dessen Ligand CDlla/CD18 aktiviert. Die Zellen hren nun auf zu rollen und binden fest an das Endothelium. Sie quetschen sich daraufhin zwischen zwei Epithelzcllcn hindurch {Diapedese), lsen mit proteolytischen Enzymen die Basalmembran auf und wandern dann orientiert an Konzentrationsgradienten von chemotaktischen Faktoren durch das Gewebe zum Infeklionsort (Abb. 1.10). Chemotaktisch wirken sog. Chemokine, Produkte verschiedener Zellen des Immunsystems, aber auch Spaltprodukte des Komplementsystems.

Abb. 1.10 Stadien der Wanderung eines Granulozyten ins Gewebe.

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Allgemeine Infektionslehre

Die Zytokine der Makrophagen gelangen auch ins Plasma und haben dann systemische Effekte. Interleukin (IL)-l, Tumomckrosefaktor (TNF)a und IL-6 induzieren als starke endogene Pyrogene Fieber, sie lsen in der Leber die Akutphasereaktion aus, eine vermehrte Sekretion der Akutphase-Proteine, unter anderem von C-reaktivem Protein und Mannan-bindendem Lektin. Das C-reaktive Protein kann an die Oberflche mancher Bakterien binden und sie fr die Aufnahme durch Phagozyten opsonisieren, ebenso opsonisiert das Mannan-bindende Lektin, das an freies Mannan auf Bakterienoberflchcn bindet. Ferner induzieren diese Zytokine eine verstrkte Freisetzung von Granulozyten im Knochenmark. Bei einer Generalisicrung der Infektion, gerade mit gramnegativen Bakterien, kommt es zur systemischen Aktivierung der Makrophagen mit massiver Ausschttung von entzndlichen (proinflammatorischen) Zytokinen wie TNF-a. Als Konsequenz einer solchen systemischen Entzndung" kommt es zur allgemeinen Geferweiterung und -permeabilisierung, die zum Blutdruckabfall, zu demen in allen Organen und damit zu Multiorganversagen und Schock fhren kann. Auf Befall mit Viren und auch anderen Erregern reagieren viele Krperzellen mit der Sekretion von Interferon-a (IFN-a) und IFN- (nicht zu verwechseln mit IFN-y, einem T-Zellzytokin). Diese Intcrferone induzieren einen antiviralen Status in den benachbarten Zellen. Auerdem aktivieren IFN-a und IFN- die Natural-KillerZellen (NK-Zellen), die als wichtige Zellen der natrlichen Resistenz ohne vorherige Immunisierung in der Lage sind, infizierte und transformierte Zellen des Krpers zu zerstren (s. Kap. 1.2.9). Interferone frdern auch die adaptive Immunantwort. Alle diese angeborenen Resistenzmechanismen stehen dem Organismus jederzeit sofort zur Verfgung (first line of defense). Sehr viele Infektionen werden durch sie verhindert, sehr frh eliminiert oder stark abgeschwcht. Die adaptive Immunantwort Die adaptive Immunantwort setzt erst mit einer Latenz von einigen Tagen ein. Sie ist spezifisch fr die Molekle, die diese Immunantwort auslsten (Antigene), und wird von Lymphozyten getragen, den einzigen Zellen, die zu dieser Anligen-spezifischen Erkennung befhigt sind. Je-

der einzelne Lymphozyt besitzt Erkennungsstrukturen (Rezeptoren) mit der Spezifitt fr nur ein einziges bestimmtes Epitop. Auf die Erkennung ihres spezifischen Antigens reagieren einzelne Lymphozyten mit Zellteilung (klonale Expansion). In der Immunantwort whlen Antigene also aus einem vorhandenen Repertoire von Zellen mit vorgeformten Rezeptorspezifitten diejenigen Zellklone aus, die spezifisch reagieren knnen (klonale Selektion; Abb. 1.11). Diese Rezeptoren sind auf B-Lymphozyten Antikrper, d.h. Immunglobuline (Ig), und auf T-Lymphozyten T-Zellrezeptoren (TcR). Es gibt eine sehr groe Vielfalt von Antikrpern und TcR. ja man kann individuelle B-Zellen und T-Zellen und ihre Nachkommen an den feinen Unterschieden zwischen ihren Rezeptoren erkennen. Jede Zelle exprimicrl nur einen Antikrper bzw. einen T-Zcllrezeptor. Die Vielfalt der Rezeptoren, das Repertoire, entsteht also auf der Ebene der B- und T-Zellpopulationen. Die individuellen (klonotypischen) Rezeptoren jedes Klons unterscheiden sich besonders jeweils

Abb. 1.11 Prinzip der klonalen Selektion am Beispiel der Differenzierung eines B-Lymphozytenklones zur Plasmazelle. Nicht dargestellt ist die Bildung von Gedchtniszellen.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

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in ihrer Antigen-Spezifitt. In der Regel binden sie nur an einen kleinen Bereich der antigenen Molekle, die antigenen Determinanten oder Epitope. Mit Hilfe der groen Populationen der antigen-spezifischen Zellen kann das Immunsystem feine Unterscheidungen zwischen verschiedenen Antigenen treffen, hierauf beruht die Spezifitt der adaptiven Immunantwort. Die Adaptivitt entsteht durch vielfltige Vernderungen, welche beim ersten Kontakt mit einem Antigen im Verlauf der primren Immunantwort eingeleitet werden. Sie fhren dazu, da der wiederholte Kontakt mit demselben Antigen eine sekundre Immunantwort auslst. Hierbei ist die Reaktion wesentlich schneller, intensiver und an den Erregertyp angepat. Dieses Phnomen bezeichnet man als Immungedchtnis. Das Immungedchtnis ist spezifisch: Nur die Antigcne, mit denen sich das Immunsystem bereits auseinandergesetzt hat, knnen eine sekundre Immunantwort auslsen; alle anderen werden mit einer primren Immunreaktion beantwortet, selbst wenn sie das Immunsystem gleichzeitig mit einem bereits bekannten Antigen treffen.
Die Theorie der klonalen Selektion wurde von McFARLANF, BUR.NET in den 50er Jahren entwickelt, bevor die Natur der B-Zellen, T-Zellen und ihrer Rezeptoren bekannt war. Auch heute noch ist sie die beste Erklrung fr die Ablufe der adaptiven Immunantwort und fr viele Fragen der immunologischen Selbsttoleranz. Grundstzlich erkennen aus einem breiten Repertoire von Zellen mit jeweils einem spezifischen Rezeptor nur wenige Klone ein gegebenes Antigen. Auf Reaktion mit dem Antigen proliferieren diese Klone stark (positive Selektion). Sie bilden einen Klon von Tochterzellen mit derselben Spezifitt, die dann bei B-Lymphozyten zu Antikrper-produziercnden Plasmazellen differenzieren oder bei T-Lymphozyten zu Zytokin-produzierenden Helferzellen oder zytotoxischen Killerzellen. Bei der sekundren Immunantwort steht daher eine vergrerte Zahl an Zellen mit dieser Spezifitt zur Verfgung. Das Repertoire an spezifischen Lymphozytenklonen ist bei der Geburt bereits fertig. Es ist im Prinzip gro genug, um mit allen mglichen Antigenen reagieren zu knnen. Im Laufe der Entstehung des Immunsystems werden Lymphozyten mit Rezeptoren, die mit krpereigenen Strukturen reagieren (autoreaktive Zellen), durch negative Selektion eliminiert. Dies fhrt zur zentralen Toleranz (Abb. 1.11).

Die adaptive Abwehrreaktion besitzt zwei verschiedene Modi, die miteinander vernetzt sind: 1. Die humorale Immunantwort wird hauptschlich durch Antikrper getragen, welche von B-Zellen und ihren Nachkommen in die Extrazellulrflssigkeit sezerniert werden. Antikrper binden an lsliche Antigene in

nativer Form. Wichtig ist besonders die 3-dimensionale Struktur ihrer Epitope. Diese knnen chemisch sehr heterogen sein, Proteine, Zucker, Lipide u.a. Niedermolekulare, lsliche Molekle, welche ein B-Zellepitop bilden und von Antikrpern spezifisch gebunden werden knnen, sind meist nicht in der Lage, eine Immunantwort auszulsen. Solche unvollstndigen" Antigene weiden als Haptene bezeichnet. Erst nach chemischer Kopplung an einen Trger (Carrier), meist ein groes Protein, knnen Haptene eine Antikrperantwort auslsen. 2. Dagegen sind T-Zellen die Effektoren der zellulren Immunantwort. Ihre Antigen-spezifischen Rezeptoren sind zellgebunden und erkennen als Epitope fast ausschlielich lineare Peptide, welche von anderen Zellen auf der Oberflche aktiv prsentiert werden (Antigenprsentation). Die Prsentationsstrukturen fr diese Peptide sind Peptid-bindende Transportmolekle, die MHC-Molekle (s. Kap. 1.2.7). Nur auf diesen Komplex von Peptid und prsentierendem Molekl knnen T-Zellen reagieren, nicht auf das lsliche Peptid allein. Antigene, welche eine humorale und/oder eine zellulre Immunantwort auslsen, bezeichnet man auch als Immunogene. Das Immunsystem kann aber auch mit Toleranz auf Antigene reagieren, d.h. weder eine humorale noch eine zellulre Immunantwort gegen ein bestimmtes Antigen findet statt. Toleranz ist ein aktiver Proze: entweder werden Zellen mit bestimmter Spezifitt bei der Entstehung des Immunsystems eliminiert (zentrale Toleranz), oder, wenn sie der zentralen Toleranz entkommen sind, im reifen Immunsystem unterdrckt oder zerstrt (periphere Toleranz). Toleranz ist ebenfalls spezifisch fr das jeweilige Antigen. Sie verhindert eine Immunantwort gegen Antigene des Organismus selbst (Autoantigene). Lymphozyten sind morphologisch nicht voneinander unterscheidbar. Wie die anderen Zellen des Immunsystems besitzen sie jedoch charakteristische Muster von Oberflchemnolcklen, welche sich mit Hilfe von spezifischen Antikrpern aus anderen Spezies, insbesondere mit monoklonalen Antikrpern, nachweisen lassen. Deshalb wurden funktioneil wichtige Zelloberflchenmolekle zunchst durch die Bindungsprofile von monoklonalen Antikrpern charakterisiert, bevor ihre molekulare Identitt aufgeklrt werden konnte. Alle monoklonalen Anti-

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Allgemeine Infektionslehre

krpcr, welche dasselbe Molekl binden, bilden einen ..dster of differentiation" (CD). Diese Cluster werden fortlaufend numeriert. Das durch den Antikrpcr-Cluster charakterisierte Oberflchenmolekl bekommt als cluster determinant" dieselbe CD-Nummer. Die CD-Nomenklatur fr Leukozytcn-Oberflchenmoleklc hat die Verstndigung unter den Immunologen stark vereinfacht. Sie wird deshalb auch in diesem Kapitel verwendet (Tab. 1.6).
Monoklonale Antikrper werden von monoklonalcn

de System rekonstituieren. Aus den Stammzellen entwickeln sich spezialisiertere Stammzellen, welche ein begrenztes Differenzierungspotential aufweisen, die myeloischen Vorluferzellen und lymphoiden Vorluferzellen (Abb. 1.12). Zellen der nicht-adaptiven Resistenz Die Zellen der nicht-adaptiven Resistenz entstammen fast alle der myeloischen Reihe. Es ist bemerkenswert, da T-Lymphozyten die Bildung dieser Zellen durch Bildung von Koloniestimulierenden Faktoren stimulieren knnen. 1. Die Monozyten des peripheren Blutes knnen in die Gewebe einwandern und sich dort zu Makrophagen differenzieren, spezialisierten Phagozyten. Makrophagen prsentieren Antigen fr T-Zellen und sind Effcktorzellen gegen Infektionserreger. Typische Oberflchenmolekle sind CDllb, CD14 und MHC-II Molekle. 2. Neutrophile Granulozyten sind ebenfalls potente Phagozyten, welche u.a. aufgenommene Bakterien abtten knnen und eine zentrale Rolle in der akuten Entzndungsreaktion spielen. 3. Eosinophile Granulozyten greifen vielzellige Parasiten an, wenn diese durch Antikrper markiert sind.

Hybridomzcllen produziert, die durch Fusion einer defekten Plasmozytomzelle mit einem normalen B-Lymphozyten hergestellt wurden. Da sie zu 100% aus einem einzigen Typ molekularidentischer Antikrpermolekle bestehen, sind sie nur gegen ein einziges F.pitop des Antigens gerichtet. Die meisten monoklonalen Antikrper stammen aus Hybridomzellen von Maus oder Ratte.

1.2.2 Zellen der Immunabwehr


Die meisten Zellen des Immunsystems stammen aus dem Knochenmark und zirkulieren in bestimmten Phasen ihrer Entwicklung als weie Blutzellen in den Gefen. Im Knochenmark entstehen sie, wie auch die Erythrozyten und Thrombozyten, aus selbsterneuernden Stammzellen. Nach einer Transplantation dieser Stammzellen kann sich das gesamte blutbilden-

Abb. 1.12 Schematische Darstellung der Hmatopoese. Die Differenzierung der Vorluferzellen wird durch koloniestimulierende Faktoren gesteuert.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

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Tab. 1.6 CD - Nomenklatur wichtiger Oberflchenmolekle CD-Nr. Verteilung (vorwiegend) CD1a,b,c,c i Thy, LC CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD10 CD11a,b,c CD14 CD15 CD! 6 CD18 CD! 9 CD20 CD21 CD23 CD25 CD28 CD32 CD40 CD44 CD45 CD54 CD55 CD56 CD58 CD64 CD72 CD74 CD79a,b CD80 CD86 CD95 CD122 CD132 CD152 CD154 Thy, T, NK T T Subset, Mo T T T Subset T, B, u.a. Leukoz. Mo, (B) Mo, Gr. NK, Mo, Gr. Leukoz. B, FDC B B, FDC B, Mo, Eo akt. T, B, NK T Subset B, Mo, Gr B, DC Leukoz. Leukoz. breit breit NK, akt.T breit Mo, DC B B, Mo, DC B B,DC B, DC breit akt. T, B, NK akt. T, B akt.T akt.T 45 50 16-25 55 67 40 32 100 MHC Klasse l-hnliche Molekle, 4 versch. Gene Adhsionsmolekl, Ligand fr CD58 TCR-assoziierte Transmembran-Glykoproteine (y, , t, , >i) Rezeptor fr MHC-Il-Molekle, assoz. mit Tyrosinkinase Lck Rezeptor fr CD72 frher T-Zell-Marker Rezeptor fr MHC-I-Molekle, a-Heterodimer, assoz. mit Tyrosinkinase Lck Neutrale Endopeptidase, CALLA MW bekannte Eigenschaften

150-180 Integrin a-Ketten, assoz. mit CD18, Rezeptoren fr ICAM bzw. C3b 55 LPS-Rezeptor Lewis X 50-80 FcyRHI, niedrig affin, versch. Isoformen 95 95 35 145 45 55 44 40 50 Integrin 2 Untereinheit, assoz. mit CD11 gibt Signale an B-Zelle Regulation der B-Zellaktivierung und -proliferation Rezeptor fr C3d und Epstein-Barr-Virus, reguliert B-Zellproliferation FCER mit niedriger Affinitt a-Kette des IL-2 Rezeptors Adhsions- und Signalmolekl, Ligand fr CD80, CD86 FcyRH, versch. Isoformen Rezeptor fr CD154 auf aktiv. T-Zellen, induziert Klassenwechsei, TNF-R homolog 80-95 Lymphozyten, verschiedene Isoformen 180-240 versch. Isoformen auf versch. Leukozyten, Tyrosin-Phosphatase, ntig fr TCR-Funktion 85 ICAM-1 (Intercellular adhesion molecule-1), Ligand fr CD1 1abc/CD18-lntegrine, Rezeptorf. Rhinoviren 60-70 Decay-accelerating factor (DAF), schtzt vor Komplement-Lyse 185 N-CAM Isoform 55 Lymphocyte function associated antigen (LFA)-3, Ligand fr CD2 72 42 33-43 33, 39 60 60 42 70 64 33 39 hoch-affiner FcyRI Ligand fr CD5, Signalfunktion an B-Zelle invariante Kette der MHCII-Molekle Iga, Ig, Membran-Ig assoziierte Proteine, Signaltransduktion sog. B7.1 -Molekl, Ligand fr CD28 und CD152 sog. B7.2-Molekl, Ligand fr CD28 und CD152 Fas oder Apo-1, induziert Zelltod, Ligand fr Molekl auf zytotox. Zellen IL-2R-Kette gemeinsame y-Kette der Rezeptoren fr IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 und IL-15 CTLA-4, Ligand fr CD80 und CD86, gibt inhibitorisches Signal Ligand fr CD40, gibt Signal an B-Zelle

B: B-Zellen, DC: interdigitierende dendritische Zellen, Eo: Eosinophile, f DC: follikulre dendritische Zellen, Gr: Cranulozyten, LC: Langerhans-Zellen, Leukoz: Leukozyten, Mo: Monozyten/Makrophagen, NK: natrliche Killerzellen, T: T-Zellen,

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Allgemeine Infektionslehre

4. Basophile Granulozyten und 5. Mastzellen kommen im Bindegewebe und den Schleimhuten vor, sezernieren vasoaktive Substanzen und sind u.a. wichtig fr den Schutz der Schleimhute. 6. Interdigitierende dendritische Zellen, oft einfach dendritische Zellen" (DC) genannt, befinden sich besonders in den T-Zellarealen der lymphatischen Organe. Vorlufer dieser Zellen sind in fast allen Organen zu finden; die in der Haut nachweisbar sind die Langerhans-Zellen. Die Vorlufer nehmen Antigen auf, wandern in die lymphatischen Organe und prsentieren es dort T-Zellen. DC sind weitaus am besten in der Lage, T-Zellen zu aktivieren; sie sind professionelle" Antigenprsentiercnde Zellen (APC). Sie tragen CD80 und MHC-Il-Molekle (s. Kap. 1.2.7). 7. Follikulre dendritische Zellen (FDC) befinden sich in den Keimzentren der peripheren lymphatischen Organe. Sie binden dort Antigen/Antikrperkomplexc und prsentieren die Antigene den B-Zellen. Follikulre dendritische Zellen stammen nicht aus dem Knochenmark wie die DC, sondern sie sind wahrscheinlich mesenchymalen Ursprungs. 8. Natural-Killer-Zellen (NK-Zellen) sind groe granulre Lymphozyten. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Frhphasc von Virusinfektionen und bei der Abwehr von Tumorzellen. Sie tragen CD2 und CD16, aber keinen TcR und nicht CD3. Zellen der adaptiven Immunantwort Die Trger der adaptiven Immunreaktion sind die B- und T-Lymphozyten. Im Blut erscheinen sie als kleine, ruhende Lymphozyten, welche man ohne Bestimmung der Oberflchenmarker nicht voneinander unterscheiden kann. 1. B-Zellen entstehen in der ftalen Leber und im Knochenmark (bei Vgeln in einem speziellen Organ, der Bursa), sie tragen Immunglobulin (Ig) auf ihrer Oberflche und knnen nach ihrer Differenzierung zu Plasmazellen Antikrper sezernieren, die Effektormolekle der spezifischen humoralen Immunitt. Sie sind erkennbar am Oberflchen-Ig, tragen MHC-Il-Molekle und spezifische Marker wie CD19. CD2, CD40. Eine Subpopulation von B-Lymphozyten exprimiert zustzlich das CD5-Molekl (sog. Bl-Zellen). Diese Zellen scheinen sich in einer separaten Linie zu entwickeln und im Gegensatz zu nor-

malen B-Lymphozyten zur Selbsterneuerung fhig zu sein. Die von Bl-Zellen produzierten Antikrper, blicherweise nur vom IgM-Typ, reagieren prferentiell mit mikrobiellen Antigenen wie Polysacchariden oder Phosphorylcholin. Die Funktion der CDS-positiven B-Zellen ist noch unklar. Manche von ihnen produzieren Antikrper gegen Autoantigene. Chronisch-lymphatische B-Zell-Leukmien scheinen vorwiegend von diesen Zellen zu stammen. 2. T-Zellen reifen im Thymus, sie sind CD2\ CD3~, TcR+. Die meisten T-Zellen tragen einen TcR aus ex- und -Kctte auf ihrer Membran. Zu ihnen gehren die CD4+ T-Helfcrzellen, welche die adaptive Immunantwort steuern, und die CD8+ zytotoxischen T-Zellen. welche als Effektoren der adaptiven zellulren Immunantwort infizierte Zellen lysieren knnen. Alle T-Zellsubpopulationen ben auch wichtige Regulatorfunktionen durch die Sekretion von Zytokincn aus. Eine Subpopulation von etwa 5% besteht aus Zellen mit einem TcR aus y- und 6-Kcttcn, diese y-Zellen spielen eine Rolle in der Frhphase der Infektabwehr (s. Kap. 1.2.8).

1.2.3 Anatomie des Immunsystems


Das Immunsystem besteht berwiegend aus beweglichen Zellen, die im Blut und in fast allen Geweben zirkulieren. Hierdurch wird sichergestellt, da Erreger, welche meist ber die Krperoberflchen in den Organismus eindringen, vom Immunsystem sofort wahrgenommen werden. Bei einer Immunreaktion mssen jedoch viele verschiedene Zeil-Populationen zusammenwirken; diese komplexen Kommunikationsvorgnge finden in spezialisierten lymphatischen Organen statt. Man unterscheidet zentrale und periphere lymphatische Organe. In den zentralen lymphatischen Organen reifen die Lymphozyten, Phagozyten und dendritischen Zellen, die peripheren lymphatischen Organe sind die Schaltstellen der adaptiven Immunitt. Zu den zentralen lymphatischen Organen gehren das Knochenmark (beim Ftus die Leber als blutbildendes Organ) und der Thymus. Im Knochenmark entstehen die meisten Zellen des Immunsystems aus Stammzellen; die B-Zellen reifen hier auch. Dagegen knnen T-Zellen nur in einem spezialisierten Organ, dem Thymus, differenzieren (s. Kap. 1.2.7). Zu den peripheren lymphatischen Organen gehren die Lymphknoten.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

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die Milz und das Mucosa-assoziierte lymphatische Gewebe: Tonsillen, Peyersche Plaques und Appendix. Hier treffen die migratorischen Zellpopulationen des Immunsystems mit Antigen und residenten Zellen zusammen und orchestrieren die Immunantwort.
Lymphknoten

AUS den Epitheloberflchen der Haut, der Atemwege und des Verdauungstrakts sowie aus den meisten soliden Organen wird die Extrazellulrflssigkeit durch ein Netz von Lymphgefen drainiert. Die Lymphe transportiert dabei Antigene und Zellen des Immunsystems zu den Lymphknoten (Abb. 1.13). Lymphknoten sind kleine, von einer Bindegewebskapsel umgebene Organe, welche sich in Gre und Aufbau dynamisch an die Anforderungen der Immunantwort anpassen knnen. Dabei halten sie jedoch eine regelmige Organisation aufrecht. Die Lymphgefe mnden in einen Randsinus, der sich direkt unter der Kapsel des Lymphknotens befindet. Von hier sickert die Lymphe von auen erst durch den Cortex und danach durch die Mcdulla, bevor sie den Lymphknoten durch ein zentrales efferentes Lymphgef verlt. Lymphknoten besitzen eine eigene Blutversorgung mit zufhrender Arterie und ableitender Vene. Diese Gefe haben eine Besonderheit: die postkapillren Venolen in der Medulla tragen ein kuboides Endothel (high endothelial venules). Durch diese Strukturen knnen Lymphozyten die Blutzirkulation verlassen und in den Lymph-

knoten einwandern. So knnen Lymphozyten sowohl aus den Geweben als auch aus dem Blut in die Lymphknoten gelangen. Im Cortex der Lymphknoten befinden sich die B-Zell-Areale: primre B-Zellfollikel, in denen sich ruhende B-Zellen und follikulr-dendritische Zellen aufhalten, und die wesentlich greren sekundren B-Zellfollikel. welche im Verlauf einer Immunreaktion entstehen und nach einigen Wochen wieder verschwinden. Sekundre Follikel enthalten Keimzentren, hochorganisierte dynamische Strukturen mit starker B-Zellaktivierung und -prohferation. Hier treten aktivierte B-Zellen in intensiven Kontakt mit Antigen auf follikulr-dendritischen Zellen und mit antigenspezifischen T-Zellen. Dabei reift die Antikrperantwort (s. Kap. 1.2.4). Terminal differenzierte B-Zellen, welche Antikrper sezernieren (Plasmazellen), halten sich meist in der Medulla auf. Auerhalb der B-Zellfollikel, im parafollikulren Cortex sowie in der Medulla, findet man bevorzugt T-Zellen. Sie haben dort engen Kontakt mit einem dichten Netzwerk aus interdigitierenden dendritischen Zellen (DC) und Makrophagen. Milz Whrend die Lymphknoten darauf spezialisiert sind, Antigene aus den Geweben zu filtern, erfllt die Milz diese Aufgabe fr das Blut. Die Milzarterie verzweigt sich vielfach, und aus den feinen Arteriolen ergiet sich das Blut in die Milzsinus, ein Maschenwerk aus Bindegewebs-

Abb. 1.13 Schematische Darstellung der Struktur eines Lymphknotens. In dem von T-Zellen angefllten Cortex des Lymphknotens liegen Lymphfollikel, die vorwiegend aus B-Zellen bestehen. Innerhalb des Follikels bilden sich Keimzentren als Ort der Proliferation und Differenzierung von B-Lymphozyten.

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Allgemeine Infektionslehre

zollen und Makrophagen. Dort werden gealterte oder vernderte (z.B. Plasmodien-infizierte) Erythrozyten entfernt, und das Blut wird in den Milzvenen wieder gesammelt. Die Milzarteriolen sind umgeben von periarteriolren lymphatischen Scheiden, dichten Ansammlungen von Lymphozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen. Sie sind hnlich organisiert wie ein Lymphknoten: Hier gibt es ebenfalls B-Zellfollikel, zum Teil mit Keimzentren, und T-Zellareale. Dieses lymphatische Gewebe wird in seiner Gesamtheit auch als weie Pulpa bezeichnet. Die Milzsinus, welche von Blut durchstrmt werden, heien rote Pulpa. Eine wesentliche Aufgabe der Milz bei der Infektabwehr ist die Entfernung von opsonisierten Erregern aus dem Blut. Dies erklrt die hohe Anflligkeit fr Infektionen mit kapseltragenden Bakterien nach Milzentfernung.
Mucosa-assoziiertes lymphatisches Gewebe

erregern; entsprechend sind in den Peyerschen Plaques B-Zellen besonders zahlreich. Sie machen 70% der Lymphozytenpopulation aus. Da das Immunsystem nicht mit den mit der Nahrung aufgenommenen Antigenen reagieren soll, ist neben der Bekmpfung von Mikroorganismen die Entwicklung und Erhaltung der Nahrungsmitteltolcranz eine wichtige Aufgabe des mucosalen Immunsystems. Deshalb fhren oral aufgenommene Antigene oft zur spezifischen Toleranz (orale Toleranz).
Rezirkulation

Viele Antigene gelangen mit der Atemluft oder mit der Nahrung in den Krper, deshalb ist die Immunberwachung der Mucosa besonders intensiv. T-Zellen befinden sich direkt im Epithel oder aber zusammen mit Plasmazellen und Makrophagen unmittelbar darunter in der Lamina propria; Lymphgefe leiten Antigene und Zellen in die regionren Lymphknoten. Darberhinaus gibt es noch weitere spezialisierte Organe: den lymphatischen Rachenring mit den Tonsillen und die Peyerschen Plaques im Dnndarm. Tonslen hneln im Aufbau den Lymphknoten, allerdings gelangen Antigene nicht durch Lymphgefe in das Organ, sondern direkt durch das Epithel. Dies geschieht besonders effektiv in den Krypten der Tonsillen, denn dort gibt es Bereiche, in denen das nicht verhornende mehrschichtige Plattenepithel des Mund- und Rachenraumes von einem einschichtigen Lymphoepithel abgelst wird. hnlich verhlt es sich bei den Peyerschen Plaques: auch hier bernehmen spezialisierte Epithelzellen, die M-Zellen, den Transport der Antigene aus dem Darmlumen in das lymphatische Gewebe. M-Zellen tragen keine Mikrovilli; aber sie pinozytieren auf der Seite des Darmlumens, und sezernieren in Richtung der lymphozytenreichen Areale. Das Immunsystem des Verdauungstraktes ist sehr gro und weist im Vergleich mit den Lymphknoten noch weitere Besonderheiten auf: Antikrper der Klasse IgA spielen eine zentrale Rolle beim Schutz der Schleimhute vor Krankheits-

Dynamik ist die herausragende Eigenschaft des Immunsystems. Lymphozyten und Phagozyten sind bewegliche Zellen, die mit dem Blut im Gefsystem zirkulieren. Zustzlich besitzen sie mit den Lymphgefen ein eigenes Kanalsystem. Die Rezirkulation dieser Zellen zwischen Geweben, lymphatischen Organen und Gefsystem ist ein geordneter Vorgang, der durch den Austausch von Signalen zwischen Immunzellen und Endothel gesteuert wird. Die Auswanderung von Lymphozyten aus den Gefen verluft hnlich wie die Granulozytenextravasation bei der Entzndung. Homing-Rezeptoren und Chemokinrezeptoren auf der Oberflche der Lymphozyten sorgen dafr, da die Zellen ihr Ziel, ihre Heimat", finden, welche sie an komplementren Rezeptoren auf den Endothelzellen und am Muster der im Gewebe exprimierten Chemokine erkennen: Naive T-Zellen wandern z.B. bevorzugt in die Lymphknoten ein. um dort ihr Antigen zu erwarten. Dagegen steuern aktivierte T-Zellen die Gewebe an, wo sie ihre Effektorfunktionen ausben. Die typischen Rezirkulationswege der Lymphozyten werden hier am Beispiel einer naiven T-Zelle beschrieben, welche gerade den Thymus verlassen und sich in den Blutstrom begeben hat. Aus den groen Arterien wird die T-Zelle durch eine Lymphknotenarterie in einen Lymphknoten getragen. Nach Passage der Kapillaren erkennt sie dann auf dem kubischen Epithel der postkapillren Venolen ihre Homing-Signale und wandert in den Lymphknoten ein. Dort hat sie die Chance, auf interdigitierenden dendritischen Zellen ihr Antigen zu treffen. Nun wird die TZelle aktiviert, und sie verlt den Lymphknoten wieder durch das efferente Lymphgef am Hilus. Die efferenten Lymphgefe sammeln sich z.T. nach mehreren Lymphknotenstationen in groen Lymphgefen, welche schlielich in

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

27

den Ductus Ihoracicus mnden. Mit dem Lymphstrom gelangt die aktivierte T-Zelle nun ber die Vena subclavia in den Blutkreislauf zurck. In Reaktion auf den Antigenkontakt hat sie ihre Ausstattung mit Homing-Rezeptoren verndert. Jetzt kann sie an das Epithel von Kapillaren binden und in das Gewebe auswandern. Trifft die aktivierte T-Zelle dort wieder auf ihr Antigen, bt sie fr eine bestimmte Zeit ihre Effektorfunktionen aus. Danach folgt sie dem Lymphstrom, welcher sie durch ein afferentes Lymphgef wieder in einen Lymphknoten trgt. Auch T-Zellen, welche in der Peripherie ihr Antigen nicht finden, kehren regelmig in einen Lymphknoten zurck. Wenn Lymphozyten mit dem arteriellen Blut in die Milz gelangen, werden sie nach Passage der Arteriolen in die Milzsinus gesplt. Von hier aus knnen sie in die periarteriolren lymphatischen Scheiden (weie Pulpa) einwandern. Dort werden ihnen auf dendritischen Zellen Antigene prsentiert, welche aus dem Blut stammen. Aus der weien Pulpa migrieren die Lymphozyten zurck in die Milzsinus und gelangen durch die Milzvenen wieder in den zentralen Blutkreislauf.

plementsystem, das direkt durch Bakterienoberflchen aktiviert werden kann. Neben der Lyse des Erregers durch Porenbildung in seiner Membran fhrt die Komplementaktivierung zur Opsonisierung der Erreger. Der humorale Arm der adaptiven Immunitt besteht aus den Antikrpern, die von B-Lymphozyten und Plasmazellen sezerniert werden. Bindung dieser Antikrper an Erreger lst verschiedene Effektormechanismen aus, viele werden durch T-Zellen vermittelt. Diese sind wichtige Schnittstelle zwischen dem humoralen und dem zellulren Arm der Immunabwehr. Antikrper Antikrper (Immunglobuline, Ig) kommen in hoher Konzentration lslich in der Extrazellulrflssigkeit und im Serum vor. Sie sind das Substrat des humoralen Arms der adaptiven Immunitt. Als ein typischer Vertreter soll zuerst das IgG-Molekl vorgestellt werden (Abb. 1.14). Es handelt sich beim IgG um ein Heterotetramer bestehend aus zwei gleichen Dimeren aus jeweils einer leichten L-Kette (ca. 24 kD) und einer schweren H-Kette (ca. 55 oder 70 kD). Es gibt zwei Typen von leichten Ketten: K-Ketten, welche beim Menschen auf etwa 80% der Antikrper vorkommen, und /.-Ketten, welche die restlichen 20% ausmachen. Schwere und leichte Kette sowie die beiden schweren Ketten sind durch Disulfidbrcken kovalent miteinander verbunden. Das IgG-Molekl gleicht einem Y mit einem Stamm und zwei gleichen Armen. Ein solches Y wird auch als Antikrper-Monomer"

1.2.4 Humorale Abwehrmechanismen


Die humorale Abwehr wird durch lsliche Molekle vermittelt, welche im Plasma und in der Extrazellulrflssigkeit entzndeter Gewebe zirkulieren. Zum humoralen Teil der natrlichen Resistenz gehrt das phylogenetisch alte Kom-

Abb. 1.14 Schematische Darstellung der Struktur eines menschlichen IgC-Molekls.

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Allgemeine Infektionslehre

bezeichnet. An den Enden der beiden Arme befinden sich die Antigenbindungsstellen, auch Paratope genannt, whrend der Stamm die meisten Effektorfunktionen des Molekls vermittelt. Die beiden Arme knnen fast beliebige Winkel ausbilden, weil die Peptidsequenzen am bergang hnlich wie ein Gelenk wirken und auerordentlich flexibel sind. Diese Aminosuren sind deshalb auch besonders exponiert und durch Proteasen leicht angreifbar. Es gibt zwei klassische Spaltstellen im Ig-Molekl: Pepsin trennt den Stamm des Y unterhalb der verbindenden Disulfidbrcken ab; es entsteht ein F(ab')2-Fragment mit den beiden Antigenbindungsstellen, der Stamm wird zu kleinen Peptidfragmenten verdaut. Papain spaltet die beiden Arme einzeln ab; es entstehen zwei monovalente Fab-Fragmente mit jeweils nur einer Antigenbindungsstelle, der Stamm bleibt als FcFragment erhalten. Diese beiden Enzymreaktionen haben die Aufklrung der Ig-Struktur ermglicht und werden heute noch hufig eingesetzt, weil bei vielen Anwendungen von Antikrpern kleine oder monovalente Molekle bentigt werden. Die Ig-Ketten bilden unabhngig gefaltete Domnen aus, welche durch interne Disulfidbrcken stabilisiert werden. Von diesen besitzt die leichte Kette 2, die schwere Kette 4. Die N-terminalen Domnen beider Ketten unterscheiden sich stark zwischen verschiedenen Ig-Moleklen, sie werden deshalb als variable Domnen (VL bzw. VH) bezeichnet. Die Kontaktstellen zwischen den variablen Domnen der leichten und der schweren Kette befinden sich an den Enden der beiden Arme des Y, hier liegen die Antigenbindungsstellen des Antikrpers. Ein Sequenzvergleich zwischen verschiedenen Ig-Moleklen ergab, da sich in den variablen Domnen Abschnitte von besonders ausgeprgter Polymorphie befinden, die hypervariablen Regionen. Die Aminosuren der hypervariablen Regionen bilden Schleifen, welche mit dem Antigen in der Bindungstasche Kontakt aufnehmen und daher auch als complementarity determining regions'" bezeichnet werden. Da ein IgG-Molekl aus zwei identischen Paaren aus leichter und schwerer Kette besteht, besitzt es auch zwei gleiche Antigenbindungsstellen. Die C-terminalen Domnen sind dagegen konstant und charakteristisch fr die jeweilige Ig-Subklasse. Sie heien konstante Domnen: CL bei der leichten Kette und CH1, CH2 und CH3 bei der schweren Kette. Die konstanten Domnen eines Antikrpers vermitteln seine

Effektorfunktionen (s.u.), whrend die variablen Domnen fr die Erkennung des Antigens zustndig sind. Die Antigen-Antikrper-Reaktion Antikrper binden ihre Antigene in nativer Form, d.h. sie erkennen die drei-dimensionale Struktur von antigenen Moleklen. Dabei ist die Antikrperbindungsstelle des Antigens, das Epitop, in der Regel ein recht kleiner Bereich des Molekls. Peptide, Kohlenhydrate, Lipide, ja sogar knstliche Molekle, welche in der Natur nicht vorkommen, knnen Epitope fr Antikrper sein. Dabei ist die Antigen-Antikrperbindung sehr spezifisch fr die dreidimensionale Oberflche des Epitops. Es handelt sich nicht um eine chemische Bindung, sondern um eine reversible physikalische Interaktion, welche sehr hochaffin sein kann. Die Bindungsstrke wird bestimmt durch die rumliche Paform zwischen Antigen und Antikrper sowie durch elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrcken, van der Waals-Krfte und hydrophobe Interaktionen zwischen den beiden Moleklen. Die Antikrper-Klassen Der Fc-Teil (Stamm) des Antikrpes vermittelt die Effektorfunktionen des Molekls. Er wird durch konstante Domnen der schweren Ketten gebildet. Es gibt beim Menschen schwere Ketten verschiedener Isotypen; \i, , y, et und E. Nach ihnen teilt man die Antikrper in Klassen, z.T. mit Subklassen, ein: IgM, IgD, IgG (4 Subklassen), IgA (2 Subklassen), und IgE. Identische Antigenbindungsstellen knnen auf verschiedenen Isotypen vorkommen, so da das gleiche Antigen verschiedene immunologische Konsequenzen auslsen kann. IgM ist der Membranrezeptor der naiven B-Zellen. IgM wird daher im Verlauf einer Immunreaktion als erster Isotyp sezerniert. Der Nachweis von spezifischen IgM-Antikrpern gegen einen Erreger ist deshalb ein Zeichen fr eine frische Infektion. Da B-Zellen fr einen Klassenwechsel zu anderen Isotypen unbedingt T-Zellhilfe bentigen, wird IgM ber lange Zeitrume gebildet, wenn diese T-Zellhilfe fehlt. Dies ist charakteristisch fr eine Antikrperreaktion gegen bestimmte Polysaccharide. Auf der B-Zellmembran kommt IgM in hoher Dichte als Monomer vor, sezerniert wird es dagegen als Penta- oder

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

29

Hexamer, die einzelnen Monomere durch eine J-Kette (joining-chain) verbunden (Abb. 1.15). Lsliches IgM hat also 10 oder 12 Antigenbindungsslellcn, und es bindet deshalb multivalente Antigene mit besonders hoher Aviditt. IgM ist zu gro, um die Plazenta zu passieren. Dies ist ein Grund dafr, da eine Erstinfektion der Mutter in der Schwangerschaft oftmals ein besonders hohes Risiko fr den Ften mit sich bringt. IgM im Serum von Ften und Neugeborenen ist von diesen selbst gebildet und gibt deshalb einen Hinweis auf eine konnatale Infektion. IgM interagiert mit verschiedenen angeborenen Resistenzmechanismen: Ein einziges gebundenes IgM-Molekl kann bereits Komplement aktivieren. Dadurch kann IgM auch sehr effizient opsonisieren, d.h. die Phagozytose stimulieren. IgD kommt auf der B-Zellmembran der reifen B-Lymphozyten zusammen mit IgM als Rezeptor vor und ist dort ein wichtiger Regulator. Es wird praktisch nicht lslich abgegeben.

IgG ist das hufigste Immunglobulin im Serum (ca. 15 mg/ml). IgG wird nach einer Erstinfektion spter gebildet als IgM, denn es kommt auf naiven B-Zellen nicht vor. Als einziger Isotyp passiert IgG die Plazenta und hat deshalb eine wichtige Funktion beim Schutz des Ften und Neugeborenen vor Infektionen. Bei ungnstigen Konstellationen, z.B. bei Rhesusinkompatibilitt zwischen Mutter und Kind, kann der Ftus durch mtterliches IgG jedoch auch geschdigt werden. Die Serumkonzentrationen und Effektorfunktionen der verschiedenen IgG-Subklassen unterscheiden sich stark voneinander (Tab. 1.7). Gegen Proteine werden vorwiegend Antikrper der IgGl- und IgG3-Subklassen aber auch IgG4 produziert. Gegen Kohlenhydrat-Antigene werden besonders lgG2- (und auch IgG4) Antikrper gebildet, allerdings erst im zweiten Lebensjahr. Ein selektiver Mangel an Immunglobulin der IgG2- und IgG4-Subklasse ist nicht selten. Fr diese Individuen sind ebenso wie fr Klein-

Abb. 1.15 Schematische Struktur unterschiedlicher Immunglobulin-Isotypen. Die leichten Ketten sind nicht mitgezeichnet.

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Allgemeine Infektionslehre

Tab. 1.17 Eigenschaften von Immunglobulinisotypen des Menschen Serumkonz. (mg/ml) IgM 1.5 Halbwertzeit (Tage) 10 Valenz Bindung an C1q Bindung an CD16 Opsonisierung +++ (ber Komplement) ++

10,12

+++

IgG, lgG2 lgC3 lgG4 IgA, lgA2 IgD IgE

8 4 0.8 0-4 3 0.5 0.03 0.0003

22 22 8 22
6 6 2-8

2 2 2 2 2,4, (6) 2, 4, (6) 2 2

++ (+) ++ -

+++ +++ + _ -

+
+ + + +

1-5

-: keine Bindung; (+): schwache Bindung; + bis +++: zunehmende Bindungsstrke

kinder Infektionen mit Kapsel-tragenden Bakterien besonders gefhrlich. IgG4 wird auch besonders in allergischen Situationen und bei Wurmerkrankungen gegen Proteine gebildet. Mil den angeborenen Resistenzmechanismen kann igG auf zwei Arten zusammenwirken: Erstens aktivieren die Subklassen IgGl und IgG3 die Komplementkaskade sehr effizient, und zweitens besitzen Phagozyten und NK-Zellen spezifische Rezeptoren fr IgG (Fcy-Rezeptoren), so da diese Zellen durch gebundenes IgG aktiviert werden. IgA ist das hufigste Immunglobulin berhaupt. Im Serum stellt es zwar nur etwa 15% der Antikrper dar, aber es wird in groen Mengen auf die Schleimhautoberflchen sezerniert und verhindert dort die Adhrenz von Bakterien. So kommt IgA in hoher Konzentration auf den Schleimhuten der Atemwege, des Verdauungstraktes, im Speichel, in der Trnenflssigkeit und in der Milch vor. Die dominante Form von IgA im Serum sind Monomere (80%), aber IgA kann mit Hilfe einer J-Kette auch Dimerc bilden. Diese Dimere werden bevorzugt sezerniert. wobei sie die Epithelicn wie folgt durchqueren: Nachdem IgA-Dimere von der Plasmazelle in den extrazellulren Raum abgegeben wurden, binden sie an einen Poly-Ig-Rezeptor, welcher sich auf der basalen Seite der Epithelzellen befindet. Nun werden sie von den Epithelien in kleine Vesikel aufgenommen, an die apikale Seite transportiert und auf die luminalc Oberflche gebracht. Hier wird der Poly-Ig-Rezeptor gespalten, das IgA gelangt an die Schleimhaut-

oberflche, immer noch gebunden an ein 70 kD Fragment des Poly-Ig-Rezeptors, die sekretorische Komponente. IgA kann Komplement ber den alternativen Weg aktivieren und ber spezielle Fca-Rezeptoren an die Oberflche von Makrophagen binden. IgE kommt im Serum nur in Spuren vor. Es wird von Mastzellcn und basophilen Granulozyten mit sehr hoher Affinitt an Fce-Rczeptoren gebunden und so aus dem Serum entfernt. Bindung von Antigen an das gebundene IgE stimuliert dann diese Zellen zur Exozytose von vorgeformten Granula, und es kommt zur Ausschttung von Histamin und anderen Mediatoren sowie von biologisch aktiven Proteinen. Dieser Mechanismus spielt eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Parasiten und in der Pathogenese von allergischen Erkrankungen. Bei diesen Erkrankungen ist IgE im Serum erhht.
Effektorfunktionen der Antikrper

Wesentliche Schutzfunktionen der Antikrper werden durch die reine Bindung an Antigene vermittelt. Die am lngsten bekannte Wirkung ist die Neutralisation von Exotoxinen verschiedener Bakterien, die besonders von IgGl- und IgG3-Antikrpern bernommen wird, auf den Schleimhuten von IgA. In gleicher Weise wird die Infektiositt von Viren neutralisiert oder die Adhrenz von Bakterien oder Parasiten, die Voraussetzung fr das Eindringen in Zellen oder Organe ist. Die Invasion von Erregern durch Schleimhautbarrieren oder ihre Ausbreitung im Gewebe ist oft von Enzymen abhngig, wie z.B.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

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Hyaluronidase, Proteinasen, Desoxyribonukleasen, gegen die ebenfalls funktionshemmende Antikrper gebildet werden knnen. Die spezifische Aktivierung des klassischen Weges des Komplementsystems durch den FcTeil ist ein wichtiger Abwehrmechanismus gegen extrazellulre Infektionserreger. Sie fhrt einerseits zur Lyse des Mikroorganismus durch Porenbildung, zum anderen aber zur Opsonisierung als erleichterte Phagozytose. Der Fc-Teil des Antikrpers kann auch zellulre Mechanismen in Gang setzen. Diese Mechanismen werden bestimmt von der Verteilung von Fc-Rezeptoren auf verschiedenen Effektorzellen, sie fhren zur Aufnahme von Antikrper-bedeckten extrazellulren Erregern in Phagozyten oder zur Abttung oder Schdigung von Erregern durch entsprechend armierte Zellen (Tab. 1.8). Eine durch Antikrper erleichterte Phagozytose durch neutrophile Granulozyten und Makrophagen ist ein wichtiger Mechanismus zur Abwehr von extrazellulren Bakterien. Dieser Mechanismus arbeitet im Konzert mit der erleichterten Phagozytose ber Komplement-Rezeptoren nach Komplementaktivierung. Zytotoxische Effektorzellen, die den Fcy-Rezeptor III (CD16) tragen, knnen durch eine Anhufung von IgGMoleklen auf Zellen oder Parasiten zur Lyse aktiviert werden. Die Zellen, die das CDI6-M0lekl tragen, gehren dem nicht-adaptiven Immunsystem an, die Spezifitt wird durch den Antikrper vermittelt. Natural-Killer-Zellen, neutrophile und eosinophile Granulozyten ben
diese Antikrper-abhngige zellulre Zytotoxi-

Aktivierung von Mastzellcn, eosinophilen und basophiien Granulozyten ber den hochaffinen Rezeptor fr IgE. Die Zellen werden aktiviert, den Inhalt ihrer Granula freizusetzen und so Parasiten zu schdigen oder eine Entzndungsreaktion auszulsen.

B-Lymphozyten Als Teil der adaptiven Immunitt ist die Antikrperantwort hoch spezifisch fr die Antigene, mit denen der Organismus sich auseinandersetzt. Dabei ist die Flexibilitt des Immunsystems erstaunlich: selbst gegen knstliche Materialien, denen die Spezies in der Evolution niemals begegnet sein kann, knnen spezifische Antikrper gebildet werden. Das Immunsystem scheint auf das Unvorherschbare vorbereitet zu sein. Tatschlich wird vom Immunsystem bereits vor jedem Kontakt mit Antigen eine sehr groe Vielfalt von Antikrpcrspezifitten gebildet: Man schtzt das Repertoire auf 10910'' verschiedene Spezifitten.
Eine sinnvolle Immunantwort entsteht daraus aber erst durch die genaue Regulation dieser Vielfalt. Dabei wird das Immunsystem mit schwierigen Problemen konfrontiert: 1. Auf konventionelle Weise hintereinander kodiert, wrden die Gene fr die Antikrper den gesamten Platz auf der DNA verbrauchen. 2. Es wre unkonomisch, ja unmglich, alle Antikrperspezifitten in der Konzentration zu produzieren, wie sie fr die Errcgerkontrolle notwendig wre. Antikrper sollten in hoher Konzentration nur gegen die Mikroorganismen erzeugt werden, mit denen sich der Organismus tatschlich auseinandersetzen mu. 3. Der Beitrag der adaptiven Immunitt zur Infektabwehr ist ihre Lernfhigkeit, das Immungedchtnis. Bei wiederholter Auseinandersetzung mit demselben Er-

zitt (ADCC) aus. Sie wird besonders durch igGl- und IgG3-Antikrper aktiviert und fhrt zur Zerstrung von Antikrper-bedeckten Zellen. Ein hnlicher Mechanismus besteht in der Tab. 1.8 Fc-Rezeptoren
Rezeptor FcyRI (CD64) FcyRIl A(CD32) Affinitt zum Fc-Teil hoch mittel

Expression vorwiegend auf Makrophagen, interdig. dendritische Zellen Makrophagen, Granulozyten B-Lymphozyten NK-Zellen Granulozyten Mastzellen, eosinophile und basophile Granulozyten

Funktion Aufnahme von Immunkomplexen Aufnahme von Immunkomplexen negative Regulation der Antikrperproduktion Zytotoxizitt Zytotoxizitt, Mediatorausschttung Degranulation, Mediatorausschttung

FcyRIl B (CD32) mittel FCYRIM (CD16) niedrig niedrig FaRI sehr hoch

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Allgemeine Infektionslehre

reger mu die Antikrperantwort schneller, intensiver und mit hherer Affinitt erfolgen. 4. Mit dem groen Repertoire der Anlikrperspezifitten entsteht auch eine groe Gefahr: Das Antikrperrepertoire wird unabhngig vom Antigenkontakt angelegt. Dabei ist nicht zu verhindern, da Spezifitten entstehen, welche an Epitope des Organismus selbst binden: autoreaktive Antikrper. Solche Antikrper gefhrden den Organismus; ihre Produktion mu verhindert werden, damit die Selbsttoleranz erhalten bleibt.

Die Kontrolle der Antikrperantwort wird durch Regulation ihrer Produzenten, der B-Zellen, ermglicht. Wenn die Antikrper auf der BZelloberflche an ihre Epitope binden, erhalten die B-Zcllen Signale, die Wachstum, Differenzierung zu Antikrper-sezernierenden Plasmazellen, Klasscnwechsel oder auch den Tod der BZelle zur Folge haben knnen. Aus dem Konzert der Reaktionen individueller B-Zellen auf ihre Antigene entsteht so die Antikrperantwort. Entstehung des Antikrperrepertoires Whrend ihrer Reifung im Knochenmark mu sich jede B-Zelle auf eine Antikrperspezifitt festlegen. Die Gene fr ihren Antikrper findet sie jedoch nicht fertig vor; vielmehr mu sie diese durch somatische Rekombination (oder Rearrangement) von verschiedenen Genelementen erst zusammenstellen. Hierbei werden bei dem Zusammenbau der schweren Kette je ein V (variable")-, ein D (diversity")- und ein J (joining")-Element zufllig ausgewhlt und zusammengefgt (Abb. 1.16). Bei den leichten Ketten fehlen die D-Elemente. Die rekombinierten V, D und J-Elemente kodieren fr die variable Domne der Antikrper. Auf RNAEbene wird dieser Genabschnitt an das jeweilige C-Element angesetzt (gespleit"), die fr die konstanten Domnen des AK kodieren. Die Organisation der Ig-Genloci ist in Abb. 1.16a dargestellt. Durch die kombinatorische Verknpfung der V-, D- und J-Elemente und durch die stochastische Paarung von schwerer und leichter Kette in jeder B-Zellen wird bereits eine beachtliche Vielfalt von Antigenspezifitten erreicht. Es knnen z.B. durch die Rekombination etwa 104 verschiedene VH-Domnen erzeugt werden, jedoch in jeder B-Zelle nur eine. Darberhinaus gibt es zwei Mechanismen, die diese Mglichkeiten noch wesentlich erweitern: 1. Die Rekombination der V-, D- und J-Ele-

mente ist nicht przise; durch Leserasterverschiebungen ergeben sich neue Aminosuresequenzen. Auerdem fgt das Enzym terminale Desoxyribonukleotidyl-Transferase nach einem Zufallsprinzip an den Verknpfungsstellen weitere Basen ein. Hierdurch entstehen Nukleotidsequenzen (N-Regionen), welche auf der DNA nicht vorhanden waren. 2. Nachdem das Rearrangement beendet ist. kann der Antikrper eines B-Lymphozyten im Laufe der Immunantwort in der Peripherie noch weiter reifen. Hierbei werden im variablen Teil der rearrangierten DNA Punktmutationen (somatische Mutationen) eingefgt. Diese Mutationen werden insbesondere in den hypervariablen Regionen gefunden, welche die Kontaktpunkle mit dem antigenen Epitop sind; sie erhhen die Affinitt des Antikrpers. Zwar spielt der Zufall eine groe Rolle bei der Erzeugung des Antikrperrepertoires, aber trotzdem handelt es sich um einen geordneten Proze. Damit die Spezifitt der Antikrperantwort ber die Aktivitt der B-Zellen reguliert werden kann, mu gewhrleistet sein, da jede individuelle B-Zelle nur eine Antikrperspezifitt ausbildet. Sie hat aber zwei Genloci fr schwere und vier Genloci fr leichte Ketten. Mechanismen des Allelausschlusses (allelic exclusion) verhindern, da eine B-Zelle mehr als eine Antikrper-Spezifitt produziert. Allerdings kann die Rekombination der leichten Kette wieder aufgenommen werden (RezeptorEdition), wenn der entstandene B-Zellrezeptor den Anforderungen nicht gengt, weil er z.B. ein Autoantigen bindet. Bei der Rezeptor-Edition wird eine bereits rearrangierle K-Kette erneut rearrangiert. Ist dies unmglich oder nicht erfolgreich, wird das zweite K-Allel oder sogar eine X-Kette rearrangiert. Schlagen alle Versuche fehl und kann die B-Zelle endgltig keinen ntzlichen" Antikrper bilden, dann mu sie sterben. Eine reife naive B-Zelle bildet gleichzeitig membrangebundenes IgM und IgD mit gleichem VH durch eine lange mRNA fr u-Kette und gleichzeitig -Kette. Wird die Zelle aktiviert, erfolgt ein bergang von membrangebundenem Immunglobulin zur sezernierten Form (nur noch IgM), ebenfalls durch Prozessierung der RNA. Durch das Herausspleien der Kodons fr die C-terminalen hydrophoben Aminosuren entstehen schwere Ketten, welche sich nicht mehr in der Membran verankern knnen und deshalb sezerniert werden.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

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Abb. 1.16 a-c ) Organisation der Gene fr die verschiedenen Ketten humaner Immunglobuline auf den Chromosomen. b) Rekombination der humanen Immunglobulingene. In der Keimbahnkonstellation liegen VH-, D- und J-Gene getrennt. Nach DJ-Rekombination und VDJ-Rekombination liegt ein vollstndig rekombiniertes Antikrper-Gen in der B-Zell-DNA vor. Es wird hier zunchst ein Transkript fr IgM und IgD abgelesen, die die Membranrezeptoren des Lymphozyten bilden. c) Immunglobulin-Klassenwechsel. Der Wechsel des Isotyps des produzierten Antikrpers erfolgt durch Rekombination, indem der VDJ-Komplex an ein anderes CH-Gen herangebracht wird.

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Allgemeine Infektionslehre

Klassenwechsel Im Laufe der klonalen Expansion des B-Lymphozyten nach Antigenkontakt kommt es zu einem Wechsel der Klasse des produzierten Immunglobulins. Hierbei findet eine weitere Rekombination der Antikrpergene statt: das rekombinierte VDJ-Gensegment der schweren Kette wird an ein Gen fr einen anderen konstanten Teil der schweren Kette gesetzt (s. Abb. 1.16c). wobei die dazwischen liegende DNA mit anderen C-Genesegmenten deletiert wird. Somit produziert der B-Lymphozyt den Antikrper der gleichen Spezifitl erst als membranstndige IgM- und IgD-Molekle, dann als sezerniertes IgM, schlielich als igG, igA oder IgE. Der Klassenwechsel ist abhngig von der Interaktion der B-Zelle mit T-Helferzellen. Er ist irreversibel, da die dazwischen liegenden Gensegmente fr andere H-Ketten deletiert werden. Ablauf der B-Zellantwort In ihrer Art, B-Lymphozyten zu aktivieren, unterscheidet man zwei Arten von Antigenen: TZeil-abhngige (oder auch Thymus-abhngige) und T-Zell-unabhngige Anligene. Bei T-Zell-abhngigen Antigenen, die blicherweise Proteine sind und wenig repetitive Epitope haben, gibt die Bindung an Immunglobuline auf der Membranoberflche das erste Signal fr die B-Zcllaktivierung. Dieses erste Signal ist notwendig aber in der Regel noch nicht hinreichend: ein zweites Signal mu erfolgen, um B-Zellproliferation und -Differenzierung auszulsen. Das zweite Signal erhalten B-Zellen von T-Helferzellen, welche dasselbe Antigen (jedoch ein anderes Epitop) erkennen und dadurch aktiviert werden. Auf molekularer Ebene besteht das zweite Signal fr B-Zellen in der Ligation ihres Oberflchenmolekls CD40 durch seinen Liganden, CD40-L (CD154), der auf der Oberflche der T-Zelle exprimiert wird. Hinzu kommen Signale durch Zytokine, wie z.B. Interleukin-4, welche von aktivierten T-Zellen sezerniert werden. Nach heutigen Vorstellungen luft die T-Zellabhngige Antwort wie folgt ab: Nachdem sie auf ihr Antigen gestoen sind, hren die naiven B-Zellen auf zu wandern und nehmen in den T-Zellarealen der sekundren lymphatischen Organe Kontakt mit T-Helferzellen auf. Danach wandern einige von ihnen in die

Nhe primrer B-Zellfollikel und die Keimzentrumsreaktion beginnt. Die aktivierten B-Zellen bilden einen Fokus von proliferierenden Zellen und verdrngen dabei die ruhenden follikulren B-Zellen aus dem Netzwerk der follikulr-dendritischen Zellen. Die ruhenden B-Zellen bilden nun eine Mantelzone um das entstehende Keimzentrum. Auerdem wandern aktivierte T-Zellen in das Keimzentrum. Ein Teil der Zellen differenziert zu Plasmazellen. die fr einige lge hohe Mengen an IgM produzieren und dann absterben. Die weiter proliferierenden B-Zellen nehmen weiter Antigen auf, prsentieren es T-Helferzellen und erhalten weitere Signale, die sie zum Klassenwechsel zu IgG, IgA oder IgE befhigen. Nach dem Klassenwechsel tragen die B-Zellen ihren spezifischen Antikrper entsprechend als IgG. IgA oder IgE auf der Oberflche. Gleichzeitig kommt es in den Genen fr die variablen Teile des Antikrpers zu somalischen Mutationen, die den Antikrper (den die B-Zellen auf der Oberflche tragen) verndern. Durch die starke Vermehrung der B-Zellen und die allmhliche Eliminierung des Antigens mssen individuelle B-Zellen jetzt um das Antigen konkurrieren. Natives Antigen befindet sich als Immunkomplex auf der Oberflche der follikulrdendritischen Zellen gebunden an Fc-Rezeptoren oder Komplement-Rezeptoren. Es wird in kleinen Mengen freigesetzt. Solche B-Zellen, deren Antikrper durch die Mutationen besser Antigenmolckle binden knnen, knnen Antigen besser aufnehmen und prsentieren. Sie haben dann eher eine Chance, Hilfe von T-Helferzellen zu erhalten und werden bevorzugt proliferieren. Dies ist wiederum eine klonale Selektion, durch die sich im Lauf der Immunantwort B-Zellen anreichern, bei denen die somatischen Mutationen zu einer hheren Affinitt gefhrt haben (Affinittsreifung). Diese B-Zellen durchlaufen weitere Runden von Proliferation, Mutation und Selektion oder sie differenzieren sich zu Plasmazellen oder zu Gedchtnis-B-Zellcn und hren auf zu proliferieren. Offenbar konkurrieren die einzelnen B-Zellen eines Keimzentrums heftig um die Ressourcen, und diejenigen mit der hchsten Affinitt zum Antigen haben dabei groe Vorteile. Nur so ist es vorstellbar, da nach wenigen Wochen sehr viele B-Zellen in den Keimzentren die uerst seltenen Punktmutationen tragen, welche eine hhere Affinitt zum Antigen vermitteln. Ist der Antikrper aber durch die Mutationen ungnstig verndert und

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr Regulation der B-Zellen durch Antikrper Antikrper knnen selbst Antigene sein. Die Antikrper einer Spezies lsen in einer anderen eine starke Immunantwort aus, die bevorzugt gegen den Fc-Teil des Antikrpers gerichtet ist, gegen seinen Isotyp. Aber auch innerhalb derselben Spezies sind Antikrper immunogen: Es gibt allele Varianten der konstanten Bereiche der Immunglobuline, so da sich bei zwei Individuen die Antikrper desselben Isotyps geringfgig unterscheiden knnen. Diese Unterschiede charakterisieren den Allotyp eines Antikrpers. Schlielich ist die Antigenbindungsstelle jedes Antikrpers eine einzigartige Struktur, sein Idiotyp, und kann ebenfalls eine Antikrperantwort provozieren.
Bei Therapien mit monoklonalen Antikrpern kann die Immunantwort des Patienten gegen den Antikrper limitierend sein, denn sie neutralisiert die therapeutische Wirkung oder lst eine bcrcmpfindlichkeitsreaktion aus. Bisher wurden die meisten therapeutischen Antikrper in der Maus gewonnen. Um die starke Antikrperantwort gegen die Speziesunterschiede zu vermeiden, kann man die Antigenbindungsstellen der murinen Antikrper gentechnisch abtrennen und auf humane Antikrper ..transplantiercn". Nach einer solchen Humanisierimg der murinen Antikrper wird die Immunreaktion der Patienten dagegen schwcher. Allerdings lt sich das Problem auch durch diese Humanisierung der Antikrper nicht ganz lsen, weil die Bindungsstelle, der Idiotyp, selbst immunogen ist. Bei manchen Immunreaktionen dominieren wenige Antikrperspezifitten. Dann knnen die Idiotypen der Antikrper genau charakterisiert werden und man stellt fest, da im selben Individuum mit zeitlicher Latenz auch anti-idiotypische Antikrper gebildet werden. Gegen diese anti-idiotypischen Antikrper knnen nun anti-anti-idiotypische Antikrper gebildet werden u.s.w. In experimentellen Systemen beeinfluten anti-idiotypische Antikrper die idiotypischen BZcllen; meist wurden diese gehemmt. Diese Beobachtungen fhrten NILS JERNE zur Formulierung der Netzwerkhypothese. Sie postuliert, da sich das Immunsystem im Gleichgewicht hlt durch ein Netz interner Idiotyp/anti-Idiotyp-Reaktionen. Da aber das hypothetische Netz von Beziehungen zwischen Antikrpern und B-Zellen sehr komplex ist, lie sich bis heute nicht experimentell klren, ob diese Form der B-Zellkommunikation tatschlich eine wichtige Funktion in der Regulation des Immunsystems hat.

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kann Antigen nicht mehr binden, erhalten diese B-Zellen keine Hilfe mehr und mssen sterben. Ebenso werden B-Zellen, deren Antikrper-Rezeptor autoreaktiv geworden ist, keine T-Zellhilfe erhalten und auch sterben. Da im Laufe einer Infektion die Antigene des Erregers lange und in groen Mengen im Organismus vorhanden sind, fuhren diese molekularen Vorgnge dazu, da die meisten fr diesen Erreger spezifischen B-Zellen den Klassenwcchsel durchfhren. Bei einer Zweitreaktion gegen diese Erreger ist in der Regel spezifisches IgM nicht nachweisbar. Auerdem reagiert durch die hhere Zahl an Gedchtniszellen das Immunsystem bei der sekundren Immunantwort schneller, der Antikrperanstieg erfolgt ohne Latenz. Schlielich ist die durchschnittliche Affinitt der IgG-Antikrper zum Antigen deutlich grer als zu Beginn der primren Immunantwort. Klassenwechsel und Affinitlsreifung gibt es nur bei der Immunreaktion auf Thymus-abhngige Antigene. da diese Vorgnge auf die Kooperation von antigenspezifischen T-Zellen angewiesen sind . T-Zell-unabhngige (oder auch Thymus-unabhngige) Antigene sind in der Lage, B-Zellen ohne die Hilfe von T-Lymphozyten zu aktivieren und zur Sekretion von Immunglobulin zu bringen. Sie bestehen typischerweise aus sehr repetitiven Strukturen wie z.B. den Polysacchariden auf der Oberflche bekapselter Bakterien. Hier sind in regelmiger Anordnung viele gleichartige Epitope exponiert, welche beim Kontakt mit der spezifischen B-Zelle viele Membranantikrper gleichzeitig engagieren. Dadurch werden die Antikrper auf der Zelloberflche vernetzt, und diese rumliche Ballung der Immunglobuline auf der B-Zellmembran lst im Zytoplasma die Aktivierungsvorgnge aus. Die T-zellunabhngige Antikrperantwort wird insbesondere von CD5+ Bl-Zellen hervorgebracht. Da keine T-Zellhilfe zur Verfgung steht, findet kein Klassenwechsel statt, es werden nur IgM-Antikrper gebildet. Diese Antikrper enthalten auch keine oder kaum somatische Mutationen, es findet keine Affinittsreifung statt. Solche Antikrper schtzen insbesondere gegen extrazellulre Bakterien, die durch Polysaccharidkapseln die Phagozytose verhindern. Die Antigene dieser Bakterien knnen deshalb auch nicht gut prozessiert oder prsentiert werden, so da T-Zellen ebenfalls nicht aktiviert werden knnen. Hier schliet die Thymus-unabhngige Antikrperantwort eine Lcke.

Antikrper, welche als Antwort auf ein Antigen gebildet werden, knnen die Immunantwort spezifisch hemmen, wenn sie mit diesem Antigen multivalente Komplexe bilden. Die Antigen-Antikrperkomplexe exponieren nmlich sowohl Epitope als auch Fc-Teile und knnen

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Allgemeine Infektionslehre

damit auf der Oberflche von spezifischen BZellen die Antigenrezeptoren mit CD32-Moleklen (Fcy-Rezeptoren) vernetzen. Durch diese Vernetzung erhlt die B-Zelle ein negatives Signal. Dieser Mechanismus erlaubt der B-Zelle die Entscheidung, ob sie mit ihren Membran-Ig freies Antigen erkennt (Aktivierung) oder solches, gegen das bereits gengend Antikrper vorhanden sind (Hemmung).

1.2.5 Das Komplementsystem


Es wurde frh entdeckt, da spezifische Antikrper die Lyse von Bakterien induzieren knnen. CHARLES BRDET stellte 1895 fest, da die Antikrper dies nicht allein bewirken. Sie muten komplementiert werden durch weitere hitzelabile Plasmabestandteile: das Komplement. Durch diese Beobachtung wurde die Erforschung eines hochdifferenzierten Abwehrsystems eingeleitet, welches phylogenetisch viel lter ist als die Antikrperantwort. Es hat sich aber in der Evolution eine Schnittstelle zwischen beiden entwickelt, so da in der humoralen Immunantwort nun die breite aber spezifische Antigenerkennung durch Antikrper mit den Effektormechanismen des bewhrten Komplementsystems eng verknpft ist. Das Komplementsystem besteht aus einer groen Vielfalt lslicher Proteine. Ein Teil von ihnen ist im MHC-Genlocus kodiert (s. Kap. 1.2.7). Werden sie auf Oberflchen aktiviert, kann dies folgende Konsequenzen haben:

1. Opsonisierung zur Phagozytose 2. Lyse durch Membranporen 3. Chemotaxis und dadurch Verstrkung der Entzndungsreaktion. Der Angelpunkt der Komplementreaktion ist die Aktivierung der Komponente C3 durch proteolytische Spaltung zu C3a und C3b (Abb.1.17). C3b besitzt eine interne hochreaktive Thioesterbindung, so da es schnell kovalent an Zelloberflchen bindet. Dies gengt bereits zur Opsonisierung. Es gibt zwei wesentliche Proteasekaskaden, welche zur Aktivierung von C3 fhren knnen: 1. Der klassische Weg wird durch Antikrper induziert. 2. Der Lektinweg wird durch Assoziation des Mannan-bindenden Lektins mit Bakterienoberflchen initiiert. 3. Der phylogenetisch lteste alternative Weg kann direkt durch die Oberflchenstruktur von Bakterien aktiviert werden. Der klassische Weg wird durch Bindung der Komplementkomponente Cl an IgM, IgGl, IgG2 oder IgG3 induziert. Hierzu mssen die Immunglobuline mit einer festen Oberflche assoziiert sein, denn eine multimere Bindung von Cl ist notwendig. Dies wird bei IgG durch die benachbarte Bindung mehrerer Molekle erreicht; IgM erfhrt durch Bindung an eine Oberflche eine Konformationsnderung, wodurch seine Cl-Bindungsstellen exponiert werden. Weil IgM bereits selbst ein Multimer ist, kann ein einziges Molekl gengend Bindungsstellen

Abb. 1.17 Schematische Darstellung der Aktivierung des Komplementsystems und der daraus resultierenden Effektormechanis-

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

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fr die Aktivierung von Cl bereitstellen, fr IgG ist eine relativ hohe Beladung ntig, um die erforderliche Nhe der Molekle zu gewhrleisten.
Cl ist ein multimolekularer Komplex von etwa 750 kD. Es besteht aus Clq, der Bindeeinheit, und jeweils 2 Proenzymen Clr und Cls. Cl q seinerseits besteht aus 6 identischen Heterotrimeren, welche ber ihre Collagen-hnlichen Tripelheliccs multimerisieren und mit ihren globulren Domnen an [mmunglobuline binden. Wenn Clq eine multivalente Bindung eingeht, bewirkt dies eine Konformationsnderung, welche sich den Proenzymen mitteilt. Diese werden jetzt durch autokatalytische Proteolyse aktiviert, und sie spalten dann weitere lsliche Komponenten des Komplementsystems, die C2 und C4 genannt werden. Die Spaltprodukte C2b und C4b binden kovalent an die Erregeroberflche und bilden gemeinsam die C3-Konvertase, welche schlielich C3 durch Proteolyse aktiviert. Es gibt noch weitere Mglichkeiten, Clr und Cls zu aktivieren, z.B. durch C-reaktives Protein oder bestimmte Lektine.

Beim Lektinweg fhrt die Anlagerung des Mannan-bindenden Lektins (eines Akut-PhaseProteins) zur Aktivierung von spezifischen Serumproteasen, welche die Komplementkomponenten C2 un C4 proteolytisch zu einer C3Konvertase aktivieren. Der alternative Weg der Komplementkaskade wird durch eine langsame spontane Aktivierung von C3 auf mikrobiellcn Zelloberflchen ausgelst. Es entsteht oberflchengebundenes C3b, welches das lsliche Komplementprotein Faktor B bindet und dessen Spaltstelle fr Faktor D exponiert. Faktor D ist eine Protease, welche in sehr geringer Konzentration im Plasma vorkommt und bereits spontan aktiv ist. Das Produkt dieser Protease, Bb, bildet gemeinsam mit C3b die C3-Konvertase des alternativen Wegs. Die C3-Konvertase spaltet C3 zu C3a und C3b, so da eine positive Rckkopplung entsteht. Aktivierung von C3 leitet die Bildung der Membranporen ein, des lyrischen Komplexes. Durch Assoziation von C3b mit den C3-Konvertascn (C2bC4b aus dem klassischen Weg, C3bBb aus dem alternativen Weg) entstehen C5-Konvertasen, welche C5 zu C5a und C5b spalten. C5b bleibt zunchst mit seiner Konvertase assoziiert und rekrutiert C6, C7 und C8 aus dem Plasma. C7 und C8 verankern dann diesen Komplex durch lipophile Ketten stabil in der Zellmembran. Dieser Komplex kann bereits manche Zellen lysieren; besonders effektiv wird er aber durch die Rekrutierung von mehreren Einheiten von C9, welche in der Zellmembran polymerisieren und dadurch eine Pore bilden, welche die Doppelmembran durchspannt. Faktor C9 hat

hnlichkeit mit Perforin, welches zum Arsenal zytotoxischer Zellen gehrt und auf der Zielzelle ebenfalls Membranporen bilden kann. Durch die Poren kommt es zum Verlust des intrazellulren Milieus. Die Phagozyten exprimieren auf ihrer Membran Komplementrezeptoren, mit denen sie die mit C3b opsonisierten Erreger aufnehmen knnen. Die kleinen Fragmente der Komplementfaktoren, besonders C3a und C5a, sind chemotaktisch sehr aktiv. Sie diffundieren ins Gewebe und locken dadurch Phagozyten an, welche sich an den Konzentrationsgradienten dieser Fragmente orientieren. Dadurch wird die Entzndungsreaktion verstrkt. Viele Defekte des Komplementsystems fhren zu Immunkomplex-GJomerulonephritis. Dies zeigt, da eine sehr wichtige Aufgabe des Komplementsystems die Eliminierung von AntigenAntikrperkomplexen aus dem Plasma ist, weil sich diese sonst auf der Basalmembran der Glomeruli ablagern und dort die Ultrafiltration beeintrchtigen. Hierfr ist der Komplementrezeptor Typ 1 (CR1, CD35) entscheidend, welcher auf Phagozyten, aber auch auf Erythrozytcn exprimiert wird. Weil die Erythrozyten im Blut mit Absland der hufigste Zelltyp sind, tragen sie am meisten zum Abbau von Immunkomplexen bei. Mit CR1 knnen sie Immunkomplexe binden und zu Leber oder Milz transportieren. Dort werden die Komplexe von den residenten Makrophagen aufgenommen. Es ist klar, da das Komplementsystem sehr stringent reguliert sein mu, damit die Zellmembranen des Organismus selbst vor seinem Angriff geschtzt sind. Endothelien und Leukozyten sind ja in stndigem direkten Kontakt mit dem Komplementsystem. Die Komplementreaktion kann auf vielen Ebenen reguliert werden, durch lsliche Faktoren oder durch Membranproteine auf den krpereigenen Zellen. Lsliche Faktoren sind der Cl-Inhibitor, Faktor H und Faktor I. Der Cl-Inhibitor fhrt zur irreversiblen Hemmung der Proteasen Clr und Cls. Faktor H dissoziiert Bb von C3b und inaktiviert dadurch die C3-Konvertase des alternativen Wegs. Faktor I inaktiviert C3b und C4b durch eine weitere proteolytische Spaltung. Viele Membranproteine beschleunigen den Zerfall der C3-Konvertasen und schtzen dadurch die Zellmembran vor den Effektorstadien der Komplementreaktion. Eine solche Wirkung haben CR1, das Membran-Kofaktorprotein (CD46) und der Decay accelerating factor. Aber auch nach Konver-

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Allgemeine Infektionslehre

sion von C3 und C5 ist die Zelle noch nicht wehrlos: Der homologe Restriktionsfaktor sowie CD59 blockieren die Bildung des lytischen Komplexes. Die Wirkung dieser Faktoren ist spezies-spezifisch, d.h. nur das Komplementsystem des Organismus selbst kann gehemmt werden.

1.2.6 Phagozyten
Ein lebenswichtiger Resistenzmechanismus ist die Aufnahme. Abttung und Verdauung von Erregern durch Phagozyten. Dies leisten vor allem die neutrophilen Granulozyten, die Monozyten und die aus ihnen differenzierten Makrophagen. Zunchst mssen die Phagozyten an den Ort der Infektion gelangen. Dies geschieht durch Interaktion mit aktivierten Endothelzellen gefolgt von der Extravasation der Phagozyten und ihrer Migration zum Infektionsherd (s. Abb. 1.10). Meist kommen die Granulozyten zuerst an und verhindern durch ihre Aktivitt bereits die weitere Ausbreitung der Infektion. Phagozyten knnen viele Bakterien mit ihren nicht-polymorphen Rezeptoren fr LPS oder Mannose erkennen. Monozyten besitzen keinen Mannoserezeptor; hier vermittelt das Mannosebindende Lektin, ein Akutphase-Protein. Die Aufnahme von Erregern wird aber sehr viel effizienter, wenn die Partikel durch Bindung von Antikrpern und/oder Komplement an ihre Oberflche opsonisierl sind. Die Bindung der Fc-Rezeptoren (s. Tab. 1.8) der Phagozyten an ein mit IgG bedecktes Bakterium fhrt zu einer gewissen Aktivierung des Phagozyten. Komplement wird entweder ber den alternativen Weg direkt auf der Bakterienoberflche aktiviert oder ber den klassischen Weg, angestoen durch gebundene Antikrper oder z.B. Mannose-bindendes Lektin. Mit Hilfe der Komplementrezeptoren CR1 und CR3 binden Phagozyten dann an C3b oder dessen inaktivierte Form C3bi auf der Erregeroberflche. Nach der Bindung werden Bakterien oder Parasiten in ein membranumhlltes Phagosom aufgenommen. Dieses fusioniert mit Lysosomen zum Phagolysosom. Die Lysosomen besitzen einen niedrigen pH von 3-4 und enthalten antimikrobiell wirksame Peptide, degradierende Enzyme wie z.B. Lysozym sowie das Eisen-bindende Lactoferrin und ein Vitamin Bl2-bindendes Protein, welche den Erregern lebenswichtige Substanzen entziehen. In diesem Milieu sterben viele Erreger bereits ab. Zustzlich produzieren die Phagozyten reak-

tive Sauerstoffmetabolite und Stickoxide (respiratory burst), welche ebenfalls toxisch wirken. Zum Teil gelangen die toxischen Substanzen allerdings auch in die Umgebung der Zellen, besonders dann, wenn ein Partikel so gro ist, da es nicht phagozytiert werden kann (z.B. Helminthen oder Pilze). Dann wird der Lysosomeninhalt in den Kontaktspalt zwischen Phagozyt und Erreger abgegeben. Deshalb schdigen Entzndungsreaktionen bei starker Aktivierung der Phagozyten auch den Organismus selbst. Die adaptiven Abwehrsysteme beeinflussen die Phagozytose und nutzen sie als Effektormechanismus: B-Zellen durch die Opsonisierung von Erregern mit Antikrpern, T-Zellcn dadurch, da sie Makrophagen durch Zellkontakt und durch das Zytokin Interferon-y (IFN-y) stark aktivieren (siehe unten).

1.2.7 T-Lymphozyten mit a-T-Zellrezeptor


T-Zellen steuern das Immunsystem und erfllen zustzlich wichtige Effektorfunktionen. T-Zellen regulieren die Immunantwort einschlielich eines groen Teils der B-Zellantwort und der meisten zellulren Abwehrreaktionen. Sie sind auch an der Aufrechterhaltung von Toleranz beteiligt und mssen deshalb noch genauer kontrolliert werden als B-Zellen. Durch die Art ihrer Antigenerkennung sind T-Zellen auf die direkte Interaktion mit anderen Zellen angewiesen; durch die Sekretion von Zytokinen (Lymphokinen) wirken sie ber das direkte lokale Geschehen hinaus.
Der T-Zellrezeptor (TcR)

Der TcR hnelt einem Antikrper-Fab-Fragment; er besteht aus einem membranverankerten Heterodimer aus zwei Ketten von der Gre und Struktur von leichten Antikrper-Ketten. Bei der Hauptpopulation der T-Zellen wird der TcR aus einer ex- und einer -Kette gebildet aT-Zellen), bei etwa 5% aus einer y- und einer 5Kette (y-T-Zellen). Die TcR-Ketten bestehen jeweils aus einer variablen und einer konstanten Domne und sind durch Disulfidbrcken miteinander verbunden. Die Antigenbindungsstelle wird aus den variablen Domnen beider Ketten gebildet. hnlich wie bei den Immunglobulinen werden die Gene der TcR durch Rekombination von V-, D- und J-Elementen erzeugt, an die durch Splicing der RNA-Transkripte die Gen-

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

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Segmente fr die konstanten Domnen angefgt werden. Die Genorganisation der -Kette und der 6-Kette hnelt der der schweren Antikrperkette, whrend sie bei der TcR-a-Kette und der -y-Kette mit den leichten Antikrperketten vergleichbar ist. Die Genloci der TcR-Ketten sind in Abb. 1.18 dargestellt. Durch Rekombination knnen etwa 70.000 verschiedene a-TcR gebildet werden, hinzu kommt noch die Variabilitt durch Einfgung von zustzliche Nukleotiden (N-Regionen), die viel ausgeprgter ist als bei den Antikrpern. Im Vergleich zu Antikrpern ist der Antigenrezeptor der T-Zellen stabil: einmal gebildet, wird er nicht mehr verndert; Hypermutation und Rezeptoredition fehlen. Auch werden TcR nicht in den extrazellulren Raum abgegeben; sie bleiben membrangebunden. T-Zellen regulieren die gesamte Immunantwort einschlielich eines groen Teils der B-Zellantwort. Deshalb sind autoreaktive T-Zellen gefhrlicher als autoreaktive B-Zellen und mssen noch strenger kontrolliert werden. Die Stabilitt des TcR trgt dazu bei. Antigenprsentation durch MHC-Molekle T-Zellen erkennen ihr Antigen, meist ein Protein, nicht in lslicher Form sondern nur auf

Zelloberflchen, wo es ihnen gebunden an spezialisierte Molekle prsentiert wird. Das Antigen mu dazu aufbereitet, prozessiert werden. Der Genkomplex, der die Prsentationsmolekle kodiert, wurde bei Untersuchungen zur Transplantatabstoung entdeckt (siehe unten), und er heit deshalb Haupthistokompatibilittskomplex (major histocompatibiliiy complex, MHC), beim Menschen auch HLA (human leukocyte antigen). Der riesige Genkomplex von etwa 4 x 106 Basenpaaren auf dem menschlichen Chromosom 6 enthlt etwa 100 Gene. An der Antigenprsentation unmittelbar beteiligt sind zwei Klassen von MHC-Moleklen: Klasse-IMolekle (MHC-I) und Klasse-II-Molekle (MHC-II), welche jeweils aus zwei Proteinketten bestehen. Beim Menschen sind hierfr drei MHC-T-Loci wichtig, HLA-A, IILA-B und HLA-C, und drei MHC II-Loci, HLA-DR (2 Typen), HLA-DP und HLA-DQ (Abb. 1.19). Die Genloci zeichnen sich durch einen sehr ausgeprgten allelen Polymorphismus in der menschlichen Bevlkerung aus; z.B. gibt es mindestens 59 HLA-A-Allele und mindestens t l l HLA-B-Allele. MHC-Molekle werden kodominant exprimiert, und ihre Vererbung folgt den Mendelschen Regeln (Abb. 1.20). Dies fhrt dazu, da eine MHC-Identitt zweier Menschen extrem selten vorkommt (Ausnahme: monozy-

Abb. 1.18 Organisation der Gene, die fr die Ketten von a-und y-Zell-Rezeptoren kodieren (Keimbahnkonfiguration).

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Allgemeine Infektionslehre

Abb. 1.19 Organisation des menschlichen MHC auf Chromosom 6.

gote Zwillinge). Im riesigen MHC-Genlocus sind auch Gene fr andere wichtige Proteine des Immunsystems kodiert: TNF-a und Lymphotoxin sowie die Komponenten des Komplementsystems C2, C4 und Faktor B. Diese Gene werden als MHC-Klasse-III-Gene bezeichnet. MHC-I-Molekle werden auf allen Krperzellen exprimiert mit Ausnahme von Erythrozyten. Sie bestehen aus einer membranverankerten polymorphen ex-Kette (44 kD) mit 3 Domnen, welche assoziiert mit einer kleinen konstanten -Kette, dem 2-Mikroglobulin (2M, 12 kD). 2M ist nicht im MHC-Komplex kodiert. Der

polymorphe Teil der a-Kette bildet eine Grube, an den Rndern begrenzt durch zwei a-Helices, unten abgeschlossen durch eine -Faltblattstruktur. In diese Grube passen Peptide mit einer Lnge von meist 8-10 Aminosuren in linearer Formation genau hinein: dies sind die potentiellen T-Zellepilope. Auerdem besitzt die MHC-I-a-Kette in ihrem konstanten Teil eine Bindungsstelle fr das CD8-Molekl. Dies fhrt dazu, da MHC-I-gebundene Peptide von CD8+ T-Zellen erkannt werden. Die auf MHC-I prsentierten Peptide stammen hauptschlich aus dem Zyloplasma der Zelle. Zytotoxische

Abb. 1.20 Ko-dominante Vererbung der HLA-Merkmale. Vterliche und mtterliche Zellen enthalten je zwei Stze von HLA-Genen (Haplotypen). Die Zellen exprimieren alle diese HLA-Molekle (Phnotyp). ]e ein vterlicher und ein mtterlicher Haplotyp werden auf die Kinder vererbt.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

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T-Zellen knnen deshalb den Befall von jeder Krperzelle mit intrazellulren Erregern, besonders Viren, wahrnehmen und die infizierten Zellen lysieren. MHC-II-MoIekle werden konstitutiv nur auf spezialisierten Zellen des Tmmunsystems exprimiert: auf dendritischen Zellen, auf Makrophagen, auf B-Zellen sowie auf Thymusepithel. Erst die Stimulation mit Zytokinen wie IFN-y und TNF-a induziert MHC-II-Molekle auch auf der Oberflche mancher anderer Zellen. MHCII-Molekle sind Dimere aus jeweils einer a-Kette (35 kD) und einer -Kette (30 kD), welche nicht kovalent miteinander assoziiert sind. Beide Ketten besitzen 2 Domnen. Die Kristallstrukturen von MHC-I und MHC-II sind sehr hnlich; bei MHC-II sind jedoch ex- und -Kette gleichermaen am Aufbau der Antigenbindungsgrubc beteiligt. Die Grube der MHC-IIMolekle ist im Gegensatz zu MHC-I an den Enden offen, deshalb kann die Lnge der prsentierten Peptide variieren; die berlnge der Peptide hngt einfach an beiden Enden heraus. Auf der -Kette der MHC-11-Molekle befindet sich eine nicht-polymorphe Bindungsstelle fr das CD4-Molekl. MHC-II-positive Zellen prsentieren also Antigen fr CD4+ T-Helferzellcn. T-Helferzellen kontrollieren und orchestrieren die adaptive Immunantwort. Durch die begrenzte Expression von MHC-II auf spezialisierten Zellen des Immunsystems wird die Aktivitt dieser regulatorischen Zellen auf die lymphatischen Organe fokussiert. Antigene, welche im Kontext von MHC-II prsentiert werden sollen, werden von den Antigen-prsentierenden Zellen durch Endozytose aus dem Extrazellulrraum aufgenommen. So gewinnen CD4^ T-Hclfcrzellen Informationen ber extrazellulre Erreger, und sie knnen dann spezifischen BZcllen Hilfe zur Antikrperproduktion leisten.
Antigenprozessierung

Abb. 1.21 Intrazellulre Prozessierung und Prsentation von Antigen. Peptide zytoplasmatischer Proteine (gepunktet) werden von MHC-Klasse-I-Moleklen, Peptide exogen aufgenommener Proteine (rot) von MHC-Klasse-Il-Moleklen prsentiert. Das CD8-M0lekl der zytotoxischen T-Zelle bindet an das MHCKlasse-I-Molekl, das CD4 Molekl der T-Helferzelle bindet an das MHC-Klasse-Il-Molekl.

Sowohl MHC-I als auch MHC-II werden im endoplasmatischen Reticulum synthetisiert. Dort wird MHC-1 assoziiert mit 2M durch Calnexin solange stabilisiert, bis ein passendes Pcptid in der MHC-I-Bindungsgrube gebunden ist. Die beiden MHC-II-Ketten werden durch eine dritte, invariante Kette stabilisiert, welche sich durch die Antigcnbindungsgrube schlngelt und sie fr Peptide blockiert (Abb. 1.21). Antigene, welche im Zytoplasma synthetisiert werden, werden zum Teil auch dort wieder de-

gradiert. Dies geschieht durch einen multimolekularen Komplex mit Proteaseaktivitt, das Proteasom. Einige Komponenten des Proleasoms sind im MHC-Komplex kodiert. Nach ihrer Spaltung werden die Peptide durch den TAPTransporter (transporter associated with antigen processing) unter Energieverbrauch in das endoplasmatische Reticulum transportiert. Der TAP-Komplex ist ebenfalls im MHC-Komplex kodiert. Wenn ein Peptid im endoplasmatischen Reticulum mit hoher Affinitt an die Bindungsgrube einer MHC-I-a-Kette binden knnen, wird seine Assoziation mit 2M stabilisiert, der vollstndige Peptid/MHC-I-Komplex durchquert den Golgiapparat und wird an der Zclloberflche exprimiert. MHC-II-Komplexe werden gebunden an die invariante Kette in ein endosomales Kompartiment transportiert. Dorthin gelangen auch Peptide, welche nach Endozytose von extrazel-

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Allgemeine Infektionslehre

lulren Antigenen und durch partielle proteolytische Degradation in den Lysosomen entstanden sind. Die invariante Kette wird hier ebenfalls degradiert; dadurch wird die Peptidbindungsstelle des MHC-II-Dimers frei, und hochaffine Peptide knnen nun daran binden. Jetzt wird der Peptid/MHC-II-Komplex auf die Zelloberflche transportiert. Die Affinitt der antigenen Peptide zu den MHC-Moleklen ist auerordentlich hoch. Einmal gebunden knnen sie praktisch nicht mehr ausgetauscht werden. Dies ist wichtig, damit auf der Zelloberflche tatschlich die Peptide prsentiert werden, welche auf den Prozessierungswegen in die MHC-Molekle gelangt sind. Entstehung von T-Zell-Epitopen Wichtig ist bei MHC-I zunchst die Lnge der Peptide, da die Grube an den Enden verschlossen ist. Dies spielt bei MHC-1I eine geringere Rolle. Auerdem gibt es in jedem Peptid Aminosuren, deren Reste aus der Grube herausragen, und solche, deren Reste mit dem MHC-Molekl Kontakt aufnehmen. Auf diese Ankerpositionen kommt es an: jedes MHC-Molekl hat in der Peptidbindungsgrube 1-3 taschenartige Vertiefungen, welche mit bestimmten Aminosureresten hochaffine Interaktionen eingehen knnen, und nur Peptide mit den passenden Aminosuren in diesen Ankerposilionen binden mit ausreichender Affinitt. Die Ankerstellen befinden sich im polymorphen Teil der MHC-Molekle, deshalb sind auch die Ankerpositionen und damit die Peptidsequenzen, die prsentiert werden knnen, spezifisch fr die verschiedenen MHC-Allele. Die aus der Grube herausragenden Aminosurereste werden vom TcR gebunden. Jede Zelle prsentiert Peptide aller ihrer Proteine, selbst synthetisierte (MHC-I) und aufgenommene (MHC-II). Erst die T-Zellen knnen entscheiden, ob eines dieser Peptide erkannt werden soll. Durch Mechanismen der Toleranz sind in der Regel gegen krpereigene Peptide keine reagierenden T-Zellen vorhanden. Lngst nicht jedes Protein eines Erregers kann demnach von T-Zellen erkannt werden. Voraussetzungen sind, da es von den Proleasen im Proteasom oder im Lysosom zu einem passenden Fragment degradiert wird und schlielich mit hoher Affinitt an eines der MHC-Molekle der Zelle bindet. Das Spektrum der prsentierten T-Zellepitope hngt also wesentlich vom MHC-Genotyp eines Individuums ab, und jedes

Individuum prsentiert ein individuelles Repertoire an Peptiden. Eine dritte Voraussetzung ist, da es reagierende T-Zellen gegen das prsentierte Epitop gibt, denn ist dieses einem krpereigenen Epitop hnlich, sind durch Toleranzmechanismen keine reagierenden T-Zellen vorhanden. Daher gibt es in einem beliebigen Erregerprotein oft nur wenige oder gar keine vom T-Zellsytem erkannten Peptide. Es kommt in Einzelfllen sogar vor, da gegen keines der Proteine eines Erregers eine T-Zellantwort gebildet werden kann (Non-Responder). Manche MHC-Allele sind mit einem erhhten Risiko verbunden, eine Autoimmunerkrankung zu entwickeln. Ein bekanntes Beispiel ist die Assoziation von HLA-B27 mit der ankylosierenden Spondylitis (Morbus Bechterew), einer Autoimmunerkrankung unbekannter Pathogenese. Das Risiko, an M. Bechterew zu erkranken, ist fr HLA-B27-Trger im Vergleich zu HLA-B27negativen Personen um den Faktor 90 erhht. Man vermutet, da das HLA-B27-Molekl Peptide eines infektisen Erregers prsentiert, die krpereigenen hnlich sind und dadurch Toleranzmechanismen durchbrechen. T-Zellreifung im Thymus Der Thymus ist der wichtigste Ort der Reifung von T-Lymphozyten. obwohl T-Zellen auch im Knochenmark oder im Darm unabhngig vom Thymus heranreifen knnen. In den Thymuslppchen lassen sich morphologisch und funktioneil jeweils Rinde (Cortex) und Mark (Medulla) unterscheiden. Das Gerst des Thymus ist ein Netzwerk aus kortikalen Thymusepithelzellen ektodermalen Ursprungs und medullren Thymusepithelzellen entodermalen Ursprungs. Spter wandern aus dem Knochenmark drei Typen von Zellen ein: dendritische Zellen, welche sich bevorzugt in der Medulla ansiedeln, Makrophagen, welche sich in Cortex und Medulla niederlassen, und die Vorlufer der T-Zellen, welche zunchst in den Cortex eindringen. Hier durchlaufen diese Stammzellen eine Serie von Reifungsschritten, in denen die TcR-Gene rekombiniert und schrittweise die T-zellspezifischen Molekle erworben werden, a- und y-T-Zellen entstehen aus einer gemeinsamen Stammzelle, aber in separaten Linien unabhngig voneinander. Die Vorlufer der a-T-Zellen exprimieren weder einen TcR noch die Korezeptoren CD4 oder CDS; man nennt sie doppeltnegativ".

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

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Im Kontakt mit dem Thymusepithel rearrangieren die T-Zellvorlufer ihre -Kette und exprimieren diese zunchst zusammen mit einer Ersatz-a-Kette auf der Oberflche. Diese erfolgreiche Expression eines vorlufigen TcR ist ntig fr die weitere Entwicklung; erst dann kann die Umlagerung der a-Kcttc stattfinden. Allel-Exklusion gibt es bei der -Kettc, aber nicht bei der a-Kettc, so da etwa 30% der pcripheren T-Zellen eine -Kette und zwei a-Kcttcn und damit zwei TcR mit unterschiedlicher Spezifitat tragen. Zellen, die keinen funktionierenden T-Zellrezeptor produzieren, nehmen an der weiteren Entwicklung nicht teil und sterben ab. Die Zellen mit einem intakten TcR proliferieren stark und bringen nun sowohl CD4- als auch CD8-Molekle an die Oberflche. Diese sog. doppeltpositiven" Thymozyten stellen den grten Teil der Zellen im Thymus dar. Nur etwa 2 Prozent dieser Zellen reifen zu einzelpositiven" CD4+8" oder CD4"8+ T-Zellen heran und verlassen den Thymus (Abb. 1.22). Der grte Teil der CD4+8* stirbt innerhalb von wenigen Tagen nach Entstehung ab, da in diesem Stadium zwei Selektionsschrittc erfolgen. Nur Thymozyten, welche mit ihrem TcR Kontakt zum Thymusepithel aufnehmen knnen,

weil sie eine ausreichende Affinitt zu einem der dort exprimierten MHC-Molekle besitzen, bekommen ein Signal, welches sie dazu veranlat, sich weiter zu teilen und zu differenzieren (positive Selektion); die Thymozyten mit zu niedriger Affinitt sterben. In einem zweiten Selektionsschritt werden diejenigen T-Zellen eliminiert, die Peptide von krpereigenen Proteinen auf Antigen-prsenticrenden Zellen im Thymus erkennen (negative Selektion). Auf diese Weise werden im Thymus sowohl potentiell gefhrliche, autoreaktive als auch nutzlose T-Zellen, die nicht mit eigenen MHC-Moleklen reagieren knnen, beseitigt. Obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen nicht ganz klar sind, wird vermutet, da Thymozyten zum berleben und weiteren Differenzieren ein Signal ber den TcR von intermedirer Strke bentigen. Ein zu starkes Signal fhrt zum Tod der Zelle (negative Selektion), ein zu schwaches Signal erlaubt keine weitere Proliferation (fehlende positive Selektion) und fhrt letzlich auch zum Absterben der Zelle. Im Laufe dieser Selektionsvorgnge wird die Expression von entweder CD4 oder CDS abgeschaltet, so da einzelpositive Zellen entstehen. Fr die positive Selektion ist anscheinend die Bindung von CD4-

Abb. 1.22 Stadien der Reifung von T-Lymphozyten im Thymus. Die in den Thymus einwandernden Stammzellen aus dem Knochenmark differenzieren ber verschiedene Zwischenstadien zu reifen Helfer- oder zytotoxischen T-Zellen heran. Deletionsschritte erfolgen zu verschiedenen Zeiten im Reifungsproze.

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Allgemeine Infektionslehre

bzw. CD8-Moleklen an das vom TcR gebundene MHC-Molekl ntig. Eine positive Selektion kann nur stattfinden, wenn der T-Zellrezeptor einer CD4-positiven Zelle zusammen mit dem CD4-Molekl auch mit einem Klasse Il-Molekl reagiert, bzw. der TcR einer CDS'-Zelle mit einem Klasse I-Molekl. Nur etwa 2% der Thymozyten gelingt es, den Thymus als reife T-Zellen zu verlassen. Die meisten Thymozyten sterben bereits im Cortex infolge der positiven Selektion, weil ihre stochastisch zusammengebauten TcR keine ausreichende Affinitt zu den MHC-Moleklen des Organismus besitzen. Von den berlebenden werden durch negative Selektion noch einmal 75% vernichtet, weil ihre Affinitt zu MHC und den im Thymus prsentierten Selbstpeptiden zu hoch ist (autoreaktive Thymozyten). Die negative Selektion kann bereits beim ersten Antigenkontakt im Cortex oder beim bergang vom Cortex in die Medulla erfolgen. Das Repertoire der aus dem Thymus entlassenen T-Zellen enthlt also keine T-Zellen mehr, die mit den Peptiden reagieren, die im Thymus prsentiert worden waren, und ist beschrnkt auf die Erkennung von Peptiden auf denjenigen MHC-Moleklen, die im Thymus vorhanden sind (MHC-Restriktion). Alloreaktivitt Da also im Thymus T-Zellen auf die Erkennung von autologen MHC-Moleklen selektioniert werden, war das Phnomen der alloreaktiven TZellen lange Zeit schwer zu verstehen. Alloreaktive T-Zellen nehmen einen groen Teil des Repertoires ein; gegen manche allogenen MHCMolekle reagieren mehrere Prozent aller TZellen. Dies erklrt die Strke der Transplantatabstoung. Die wahrscheinliche Erklrung ist, da die alloreaktive Antwort darauf beruht, da der Komplex (Selbstpeptid + fremdes MHCMolekl) fr einen gegebenen TcR genauso aussieht" wie der Komplex aus seinem spezifischen Fremdpeptid + eigenem MHC-Molekl. Da die allogenen MHC-Molekle zahllose Selbstpeptide aus dem Zellinnercn prsentieren, fhrt diese Kreuzreaktion zur Aktivierung vieler, eigentlich selbst-restringierter T-Zellen. Aktivierung und Differenzierung von T-Lymphozyten Die reifen naiven T-Zellen, welche den Thymus

gerade verlassen haben, wandern durch das kubische Epithel der poslkapillren Venolen in die Lymphknoten ein. Dort nehmen sie Kontakt zu professionellen" Antigen-prsentierenden Zellen (APC) auf, z. B. den interdigitierenden dendritischen Zellen in den T-Zellarealen. Sie suchen deren Oberflche nach ihrem Antigen ab, den Peptid/MHC-Komplexen, welche sie mit ihrem spezifischen TcR binden knnen. Der Membrankontakt zwischen T-Zelle und APC wird durch Paare von Adhsionsmoleklen hergestellt und ber lngere Zeit aufrechterhalten: dabei ist die Bindung von CD2 auf der Oberflche der T-Zellen an seinen Liganden CD58 sehr wichtig. Das erste Signal fr die T-Zellaktivierung ist dann die Bindung des antigenspezifischen TcR an seinen Liganden. Auf ihr Antigen reagieren die T-Zellen uerst sensitiv: nur 10-300 Peptid-beladenc MHC-Molekle auf einer APC reichen aus, eine T-Zelle mit 50000 TcR zu triggern. Dieses erste Signal reicht aber nicht dazu aus, eine naive T-Zelle voll zu aktivieren. Im Gegenteil, die isolierte Ligation des TcR fhrt dazu, da die T-Zellen inaktiviert und gegen weitere TcR-vermittelte Signale resistent werden; man spricht von Anergie. Zur vollstndigen Aktivierung bentigen naive T-Zellen ein zweites Signal , das sie ebenfalls von den APC erhalten. Die Ligation des kostimulatorischen Molekls CD28 auf der T-Zelloberflche durch CD80- oder CD86-Molekle auf der Membran der APC spielt dabei eine zentrale Rolle. Auf die vollstndige Aktivierung durch erstes und zweites Signal reagieren die T-Zellen mit starker Proliferation, so da sich ein T-Zellklon mit derselben Antigenspezifitt bildet. Auerdem erwerben die T-Zellen neue Eigenschaften, sie differenzieren zu Effektorzellen und zu MemoryZellen. Zytotoxische Effektorzellen haben nicht so strenge Aktivierungsbedingungen wie naive T-Zellen; sie knnen bereits durch das erste Signal allein aktiviert werden (Abb. 1.23). Also knnen T-Zellen auf ihr Antigen mit Aktivierung oder Anergie reagieren; es kommt auf den Kontext an. Die meisten Zellen des Organismus exprimieren nicht CD80 und CD86, knnen naive T-Zellen nicht aktivieren und deshalb auch keine Immunreaktion in Gang setzen. Dies ist sehr wichtig fr die Erhaltung der Selbsttoleranz, denn nicht alle autoreaktiven T-Zellen werden durch negative Selektion bereits im Thymus entfernt. Das zweite Signal fr die TZellaktivierung vermitteln nur professionelle APC, besonders effizient interdigitierende den-

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

45

Abb. 1.23 Ein zweites Signal


ber CD28 (Ko-Stimulation) ist ntig fr die Aktivierung der TZelle zu autokrinem Wachstum.

dritische Zellen. Diese dendritischen Zellen befinden sich in fast allen Organen; als Langerhans-Zellen bilden sie ein dichtes Netzwerk im Epithel der Haut. Dort pinozytieren sie stndig und nehmen dabei Antigenc aus ihrer Umgebung auf. Erhalten sie bei einer Infektion ein Gefahrensignal, welches molekular noch nicht definiert ist, beenden sie die Pinozytoseaktivitt, wandern durch die Lymphgefe in die regionaren Lymphknoten und prsentieren dort eine Probe des Antigenspektrums, welches sie am Ort der Gefahr vorgefunden haben. In den Lymphknoten treffen also APC, ruhende T-Zellen und Antigen zusammen und bringen die adaptive Immunantwort in Gang. So kommt es, da eine antigenspezifische schtzende Immunantwort besonders dann entsteht, wenn auch die Mechanismen der natrlichen Resistenz provoziert werden, wie dies ein typischer Erreger tut, welcher z.B. ber eine kleine Verletzung der Haut in den Organismus eindringt. Werden die gleichen Antigene dagegen direkt i.v. injiziert oder oral aufgenommen und sind sie deshalb nicht mit einem Gefahrensignal assoziiert, reagiert das adaptive Immunsystem hufig mit Toleranz. Bei der Impfung wird eine immunogene Situation" durch die Applikationsweise und durch Adjuvantien erreicht, welche die APC antigen-!(spezifisch aktivieren sollen. Das erste Signal, die Ligation des TcR, induziert bereits viele Vernderungen in der T-Zelle: Erstens wird der Membrankontakt zur APC weiter intensiviert, unter anderem dadurch, da auf den T-Zellen ein weiteres Adhsionsmolekl, CDlla/CD18, aktiviert wird und nun an seinen Liganden CD54 auf der APC bindet. Zweitens exprimiert die T-Zelle nun hochaffine Rezeptoren fr den T-Zellwachstumsfaktor Interleukin-2 (IL-2). Erhlt eine T-Zelle gleichzeitig das

zweite Signal, sezerniert sie zustzlich den Wachstumsfaktor IL-2. IL-2 bindet nun an seinen Rezeptor auf derselben Zelle und induziert die Proliferration der Zelle (autokrines Wachstum; Abb. 1.23). Wie gelangen die Signale von der Membran in den Kern? Die Signalbertragung von der T-Zclltnembran in den Kern ist komplex und reflektiert die extreme Sensitivitt, mit der T-Zellen ihre Signale wahrnehmen, und die Flexibilitt, mit der sie auf die Vielfalt der Reize reagieren. Tatschlich reichen wenige MHC-Molekle mit dem spezifischen Peplid auf der Oberflche der antigenprsentierenden Zelle aus, um die T-Zellc zu aktivieren. Die ex- und -Ketten des antigenspezifischen TcR haben sehr kurze zytoplasmatische Teile, die fr sich allein das Signal nicht weiterleiten knnen. Durch seine Transmembranteile ist der TcR jedoch fest assoziiert mit anderen nicht-polymorphen Transmembranproteinen. dem sog. CD3-Moleklkomplex. Diese Molekle sind essentiell fr die Signalweitcrlcitung des TcR. sie sind daher nur auf T-Zellen vorhanden. Das erste mebare Ereignis nach Angenerkcnnung im Zcllinncrn ist die Phosphorylierung der Tyrosine in den CD3-Moleklen. Diese fhrt zur Aggregation von mullimolckularen Komplexen an der Innenseite der T-Zellmcmbran und zur Aktivierung mehrerer Signalwege, die schlielich zur Modifikation von zytoplasmatischcn Transkriptionsfaktoren fhren, welche sich nun in den Zellkern bewegen, dort an spezifische DNA-Sequenzmotive binden und die Transkription von Genen beeinflussen (Abb. 1.24). Einer dieser Signalwege wird durch die Immunsuppressiva Cyclosporin A und Fk506 blockiert, die daher eine selektive Blockade der T-Zcllreaktion hervorrufen, ohne das Immunsystem zu schdigen. Wie das TcRSignal und das ntige kostimulatorische zweite Signal von der T-Zelle verarbeitet werden, ist noch nicht voll verstanden. Die Signalbertragung in B-Zellen ist der in T-Zellen sehr hnlich, es gibt ebenfalls mit dem BZellrezeptor (Membran-Ig) assoziierte signalweiterleitende Proteine, welche in den B-Zellen die Rolle des CD3-Komplexes der T-Zcllen bernehmen.

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Allgemeine Infektionslehre

Abb. 1.24 Schematische Darstellung der Signaltransduktion im Laufe der T-Zell-Aktivierung. Die Bindung von Liganden an der Zellmembran durch T-ZellRezeptor und Ko-Rezeptor fhrt ber verschiedene Zwischenschritte zur enzymatischen Modifikation von Transkriptionsfaktoren im Zytoplasma. Im Zellkern werden die Signale integriert durch Bindung verschiedener Transkriptionsfaktoren an Promotoren, z.B. des IL-2-Gens.

1.2.8 T-Zelleffektorfunktionen
T-Helferzellen (CD4+)

Wenn naive CD4+ T-Zellen durch erstes und zweites Signal voll aktiviert werden, sezernieren sie IL-2, proliferieren und bilden einen T-Zellklon. Spter tritt unter dem Einflu uerer Signale hufig eine Spezialisierung oder Polarisierung der T-Helferantwort ein; die beiden Extreme des Spektrums werden T-Helfer-1- und T-Helfer-2-Antwort genannt. T-Helfer-1-Zellen (Till). Diese produzieren groe Mengen von IL-2 und IFN-Y. Die wichtigsten Differenzierungssignale fr eine Thl-Antwort sind IL-12 und IFN-Y. IL-12 wird von dendritischen Zellen und Makrophagen sezerniert und regt NK-Zellen zur Produktion von IFN-y

an. Dies stimuliert dann die Entwicklung von Th]-Zellen (Abb.1.25). Thl-Zcllen vermitteln die zellulre Immunantwort. Sie aktivieren Makrophagen, welche ihnen Antigen prsentieren, durch IFN-Y. Dadurch knnen die Makrophagen intrazellulre Erreger wie Mykobakterien, welche sich in endozytotischen Vesikeln. den parasitophoren Vakuolen, befinden, sehr viel effizienter abwehren und tten. T-Helfer-2-ZeIlen (Th2). Diese sind charakterisiert durch die Produktion von IL-4, IL-5 und IL-10. IL-4 ist das entscheidende Signal fr die Differenzierung der Th2-Zellen. Sobald Th2Zellen IL-4 sezernieren, frdern sie dadurch die Entwicklung weiterer Th2-Zellen (s. Abb.1.25). Es ist noch nicht endgltig geklrt, woher das IL-4 stammt, welches diese Vorgnge berhaupt in Gang bringt. Eine Th2-Antwort induziert

Abb. 1.25 Differenzierung von naiven T-Helferzellen zu Zellen vom Thl-, ThO- oder Th2-Typ. Verschiedene Zytokine beeinflussen diesen Proze, beispielhaft sind hier die wichtigsten angegeben.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

47

durch IL-4 bei B-Zellcn den Klassenwechsel zu IgE. welches an die Fee-Rezeptoren auf Mastzellen bindet. IL-5 induziert eosinophile Granulozyten. Diese Effektormechanismen dienen der Abwehr von extrazellulrcn Erregern und von Helminthen. Aber auch allergische Reaktionen werden von Th2-Zellen gesteuert. Wenn eine T-Zellantwort einmal polarisiert ist, kann sich ihr Profil selbst stabilisieren. Denn IFN-Y, das Sekretionsprodukt der Thl-Zcllcn. frdert die Differenzierung von weiteren ThlEffektoren, whrend es die Entwicklung von Th2-Zellen hemmt. Umgekehrt untersttzt das Th2-Zytokin IL-4 die Bildung von Th2-Zcllcn, whrend es zusammen mit IL-IO die Generation einer Thl-Antwort hemmt. Das berleben des Wirtsorganismus kann davon abhngen, ob auf eine Infektion hin das richtige Zytokinmuster produziert wird, ob also die Entscheidung, Thl- oder Th2-Zellen zu stimulieren, richtig oder falsch ist. Th2-Zellen sind nicht in der Lage, intrazellulre Erreger zu bekmpfen und behindern die Wirkung der Th l Zellen. Das Immunsystem verwendet daher bestimmte fr Klassen von Infektionserregern typische Molekle als Leitsubstanzen fr die Induktion der entsprechenden T-Zellantwort (z.B. Zellwandbestandteilc von Mykobakterien als Induktoren von IL-12 und damit der Thl-Antwort). Natrlich bedarf es fr die Ausrichtung einer polarisierten Antwort eines Zusammenspiels verschiedener derartiger Leitsubstanzen, um dem Wirt die Mglichkeit einer sicheren Induktion der richtigen Antwort zu geben. Entscheidend fr die Induktion einer Thl- oder Th2-Antwort im Laufe einer Infektion ist das lokale Zytokinmilieu zu Beginn der Infektion. Starke Induktoren einer Thl-Antwort sind IL12 sowie IL-18, die zur Interfcron-y- Produktion fhren. Die entscheidenden Induktoren der Th2-Antwort sind IL-4 und IL-10. Die meisten Immunantworten des Menschen bewegen sich allerdings auf einer Achse zwischen den beiden Polen Thl und Th2: Man findet dann sowohl Thl- als auch Th2-Zellen und zustzlich viele ThO-Zellen. welche ein breites Spektrum von Thl- und Th2-Zytokinen produzieren. Das Konzept der Polarisierung der TZellantwort auf ein Thl- oder Th2-Profil hat Konsequenzen fr die rationale Entwicklung von Impfstoffen: Nicht nur die richtigen Antigene sind fr den Erfolg wichtig, sondern man bentigt zustzlich Signale, welche die Differenzierung der richtigen Effektoren frdern.

T-Zellhilfe fr B-Zellen

Differenzierte CD41 T-Helferzellen knnen mit B-Zellen kooperieren. B-Zellen nehmen ber ihren Ig-Rezeptor lsliches natives Proteinantigen sehr effizient auf. Sie prozessieren es dann und bringen Peptide gebunden an MHC-II auf ihre Zelloberflche. So kann das Antigen von T-Zellen erkannt werden: auf diese Weise treffen sich T-Zellen mit B-Zellen, welche dasselbe Antigen (nicht jedoch dasselbe Epitop) erkennen (kognate Interaktion).
Auf dieser direkten Interaktion beruht der HaptenTrger-Effckt: Haptene sind kleine lsliche Molekle, die zwar ein B-Zellepitop darstellen knnen, die aber allein keine Antikrperantwort auslsen, denn sie sind ja Thymus-abhngige Anligene ohne T-Zellepitopc. Erst ihre Kopplung an ein Trger-Protein macht aus den Haptenen ein Immunogen: der Protein-Trger liefert T-Zellepitope. so da nun Helfer-T-Zcllen aktiviert werden. B-Zellen binden mit ihren Rezeptoren das Haplen, nehmen dadurch den Hapten-TrgerKomplex auf und prsentieren Pcptidc des Trgers mit MHC-II auf ihrer Oberflche (Abb. 1.26).

Die T-Zcllen werden durch ihren Kontakt mit den B-Zellen aktiviert und exprimieren den

Abb. 1.26 Interaktion von T-Helferzelle und B-Lymphozyt bei der Antikrper-Produktion. Die CD4 T-Zelle erkennt Antigen, das vom B-Lymphozyten prsentiert wird und erhlt ein ko-stimulierendes Signal ber CD28. Die T-Zelle exprimiert daraufhin den Liganden fr CD40, dessen Bindung an CD40 der BZelle das Signal zu Proliferation und Klassenwechsel gibt, und produziert Lymphokine, die den Klassenwechsel dirigieren. Die B-Zelle nimmt das Antigen ber ihren Oberflchenrezeptor auf, hier dargestellt als ein an einen Proteintrger gebundenes Hapten.

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Allgemeine Infektionslehre

CD40-Liganden (CD 154) auf ihrer Oberflche, welcher an CD40 auf den B-Zellen bindet. Dies ist das ntige zweite Signal fr die B-Zellen, welche nun zur Proliferation aktiviert werden und eine Keimzentrumsreaktion mit Klassenwechsel und Hypermutation einleiten. Das Signal ber CD40 ist fr den Klassenwechsel unverzichtbar. Angeborene Defekte in der Expression des CD40-Liganden auf den T-Zellen fhren zum Hyper-IgM-Syndrom. In den Lymphknoten der Patienten gibt es keine Keimzentren, und man findet als einziges Immunglobulin IgM in extrem hohen Konzentrationen. Die Zytokinc der TZellen steuern den Klassenwechsel: Thf-Zytokine frdern die Produktion von IgGf, whrend Th2-Zytokine den Klassenwechsel zu lgG4 begnstigen und den zu IgE erst ermglichen. T-Zellhilfe fr Phagozyten Wie bereits oben beschrieben, knnen Thl-Zellen durch Zellkontakt, aber besonders auch durch die Sekretion ihres Leitzylokins IFN-y Makrophagen stark aktivieren. Z.B. knnen die Phagozyten erst nach ihrer Aktivierung durch T-Zellen intrazellulre Erreger (z.B. Mykobakterien) abtten. Zytotoxische T-Zellen Die CD8" zytotoxischen T-Zellen (CTL) sind die wichtigsten Effektoren der adaptiven Immunabwehr von Viren und anderen Erregern, welche sich im Zytoplasma der Wirtszellen aufhalten. Alle viralen Proteine werden im Zytoplasma der befallenen Zelle synthetisiert. Einige werden im Proteasom sofort wieder degradiert, die Peptid-Fragmente werden ins endoplasmatische Reticulum transportiert und schlielich gebunden an MHC-I auf der Zelloberflche prsentiert. Zwar knnen alle Krperzellen von Viren befallen werden und virale Antigene im Komplex mit MHC-I auf ihrer Zelloberflche prsentieren; aber naive CD8+ T-Zellen bentigen zur Proliferation neben diesem ersten Signal ein zweites Signal durch CD28, das nur Zellen mit CD80 oder CD86 vermitteln knnen. Deshalb kann eine zytotoxische T-Zellantwort nur durch professionelle APC initiiert werden. In manchen Fllen gengt dieser Kontakt zwischen CD8r T-Zelle und APC, um die Proliferation der T-Zellen und ihre Differenzierung zu CTL zu induzieren. Oft ist jedoch die zustzliche Hilfe von CD4+ T-Zellen ntig. Die T-Helferzellen mssen

durch einen Peptid/MHC-II-Komplex von derselben APC aktiviert werden. Ihre Hilfe fr die CD8+ T-Zellen kann dann darin bestehen, da sie die APC zur vermehrter Expression von CD80 und CD86 aktivieren, oder darin, da sie den Wachstumsfaktor IL-2 in hohen Konzentrationen sezernieren. Vollstndig aktivierte CD8+ T-Zellen proliferieren und differenzieren zu CTL und Memory-T-Zellen. CTL besitzen zytoplasmatische Granula, welche das porenbildende Protein Perforin und Proteasen enthalten. Auerdem exprimieren sie auf ihrer Zelloberflche den Liganden fr CD95/Fas/APO-l (CD95L). Wenn CTL nun auf ihren antigenen Peptid/MHC-I-Komplex treffen, werden sie sofort getriggerf; sie bentigen jetzt kein zweites Signal mehr. Deshalb knnen CTL alle MHC-Ipositiven Zellen des Organismus lysieren, wenn diese z.B. von Viren befallen sind. Es gibt zwei Hauptmechanismen, durch die CTL ihre Zielzelle tten knnen: 1. CD95L kann an CD95 auf der Oberflche der angegriffenen Zelle binden. Dieses Signal lst in der Zielzelle ein Zelltodprogramm aus. Apoptose genannt. 2. Der Inhalt der zytotoxischen Granula wird in den Kontaktspalt zwischen CTL und Zielzelle abgegeben (Abb. 1.27). Perforin hnelt der Komplementkomponente C9, es kann ebenfalls in der Zellmembran Poren bilden. Dies fhrt zur Auslsung von Apoptose durch Proteasen aus den zytotoxischen Granula, z. B. Granzym B, welche durch die Poren ins Zytoplasma der Zielzelle gelangen und dort eine Proteasekaskade auslsen. Die CTL ist selbst gegen den Inhalt ihrer Granula resistent. Sie verlt die sterbende Zelle und macht sich auf die Suche nach weiteren Opfern. Da CTL so leicht getriggert werden, dann kaum noch kontrollierbar sind und viele Zielzellen lysieren knnen, sind sie potentiell sehr gefhrlich: Eine einzige autoreaktive CTL knnte erheblichen Schaden im Organismus anrichten. Der Schaden wird aber dadurch begrenzt, da CTL terminal differenzierte Zellen mit begrenzter Lebenszeit sind. Die Reifung neuer CTL aus naiven CD8+ T-Zellen ist jedoch, wie oben beschrieben, ein streng regulierter Vorgang.
Der Mechanismus der Apoptose ist gut charakterisiert: im [nnern der Zelle bildet sich um die zytoplasmatischen Teile von CD95 herum ein multimolekularer Komplex aus, der sogenannte DISC (death inducing signaling complex). Zentraler Bestandteil des DISC ist die Protease Caspase 3, welche in diesem

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

49

Proteasen, lytische Molekle

Abb. 1.27 S c h e m a t i s c h e Darstellung der Mechanismen der Zytotoxizitt durch CD8+ T-Zellen. Antigen-Erkennung durch den TCR fhrt zur Exozytose von Granula. Das hierin enthaltene Perforin (rot) bildet Poren, durch die zytolytische Molekle ins Innere der Zelle dringen knnen. Auerdem wird der Ligand fr CD95 auf der Oberflche der T-Zelle hochreguliert. Seine Bindung an CD95 auf der Zielzelle induziert ber die Aktivierung von Caspasen ebenfalls Apoptose.

Komplex durch autokatalytische Spaltung aktiviert wird. Dies setzt eine Proteasekaskade in Gang, welche schlielich zur Zerstrung lebenswichtiger Zellproteine fhrt. Auerdem wird DEDD (death effector domain-containing DNA-binding protein) aktiviert, welches im Nukleolus mit sehr hoher Affinitt an alle zugnglichen DNA-Sequenzen bindet und dadurch die Transkription blockiert. Schlielich kommt es zur Aktivierung einer Caspase-aktivierten DNAse (CAD), welche im Kern die DNA zwischen den Nukleosomen schneidet und sie dadurch in Fragmente mit charakteristischer Lnge (Vielfache von 200 Basenpaaren) zerlegt. Morphologisch scheint die Zellmembran der apoptotischen Zelle zu kochen", es entstehen kleine Blschen. Der Kern und die ganze Zelle schrumpfen, das Chromatin wird zu elektronendichten Massen kondensiert (Kcrnpyknose), der Zellkern wird fragmentiert. Schlielich fragmentiert die ganze Zelle und bildet sogenannte apoptotic bodies aus, welche sehr schnell von Makrophagen aufgenommen werden. Die apoptotic bodies sind noch von einer impermeablen Zellmembran umgeben, so da der Zellinhalt, z.B. die lysosomalen Enzyme, bei der Apoptose nicht in die Umgebung abgegeben werden. Auch Makrophagen werden durch die Aufnahme von apoptotische Zellen in der Regel nicht aktiviert, so da die Apoptose unauffllig und ohne Entzndung verluft. -T-Zellen

verstanden. Man schreibt ihnen eine Rolle bei der frhen Abwehr von Infektionen zu, weil sie sich bei Infektionskrankheiten wie Malaria oder Brucellose vermehren, und weil im Mausmodell manche Erreger nur in Anwesenheit von y6-TZellen abgewehrt werden knnen. Es sind y-TZellen beschrieben worden, die wie u-T-Zcllen ein Peptidantigen MHC-restringiert erkennen. Typischer scheinen jedoch y-T-Zellen zu sein, welche keine Peptide, sondern niedermolekulare, chemisch sehr diverse Liganden erkennen. So wurden Spezifitten fr Oligosaccharide, Nukleoside und phosphorylierte Fettsuren aus der Zellwand von Mycobacterium tuberculosis beschrieben. Diese Antigene scheinen nicht von MHC-Moleklen prsentiert zu werden. Dies steht im Einklang damit, da der y-TcR den Fab-Fragmenten der Immunglobulinmolekle strukturell hnlicher ist als dem a-TcR.

1.2.9 Natural-Killer-Zellen
Natrliche Killer-Zellen (NK-Zellen) sind Lymphozyten, welche in vieler Hinsicht zytotoxischen T-Zellen hneln: z.B. exprimieren sie CD2 und knnen Zellen lysieren; sie haben aber keinen TcR. Auch lysieren sie ihre Zielzellen sofort ohne eine Phase der Immunisierung und Differenzierung. NK-Zellen spielen deshalb eine wichtige Rolle in der frhen, nicht-adaptiven Phase der Abwehr einer Infektion durch intrazellulre Erreger. NK-Zellen tragen auf ihrer Oberflche sowohl stimulatorische Rezeptoren als auch die inhibitorischen KIR (killer cell inhibitory reeeptor). Die Mitglieder der groen KIR-Familie haben Spezifitt fr MHC-I-Allele; NK-Zellen werden also durch MHC-I ge-

Etwa 5% aller T-Zellen exprimieren einen y-TZellrezeplor. Im Epithel des Darmes sind sie angereichert. yS-T-Zellen exprimieren entweder eine geringe Dichte von CD8 oder sie kommen ganz ohne die CD4/CD8- Korezeptoren aus. In der Ontogenese entstehen die ersten y-T-Zellen bereits vor den ct-T-Zellen. ber ihre Reifung und Selektion ist wenig bekannt; y-T-Zellen knnen auch unabhngig vom Thymus entstehen. Die Funktion dieser Zellen ist nicht voll

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Allgemeine Infektionslehre

hemml. In der Ontogenese durchlaufen die NKZellen einen Selektionsproze, so da alle reifen NK-Zellen durch die MHC-I-Allele gehemmt werden, die normalerweise im Organismus exprimiert sind. Dies fhrte zur sog. Missing-selfHypothese: NK-Zellen werden aktiviert, wenn MHC-I-Molekle auf der Zelloberflche fehlen. Viele Viren haben Mechanismen zur Unterdrckung der MHC-I-Expression und der Antigenprsentation entwickelt, um den CTL zu entgehen. Hier springen NK-Zcllen ein. NK-Zellen wirken eng mit dem adaptiven Immunsystem zusammen: Erstens sezernieren aktivierte NK-Zellen IFN-y und treiben dadurch die T-Zellantwort in Richtung auf ein Thl-Profil. Dies ist sinnvoll bei einer Infektion mit intrazellulren Erregern. Zweitens werden NK-Zellen stark aktiviert durch IL-2, das Sekretionsprodukt voll aktivierter T-Zellcn. Drittens sind NK-Zellen auch Effektoren des humoralen Arms der Immunantwort. Sie exprimieren Fcy-Rezeptoren vom Typ III (CDJ 6) in hoher Dichte auf ihrer Oberflche. Damit binden sie an Zellen, welche durch Antikrper markiert sind, und lysieren sie (ADCC, s. Kap. 1.2.4). NK-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorabwehr (s. Kap. 1.2.15).

gehren z.B. IL-2, IFN-y, IL-4 und 1L-5 sowie koloniestimulierende Faktoren (CSF), welche die Hmatopoese regeln. Das Muster der sezernierten Zytokine charakterisiert funktioneil die verschienen T-Zcllsubpopulationen (ThO, Thl. Th2).
Proinflammatorische Zytokine wie IL-1, TNF-a

1.2.10 Interleukine und ihre Rezeptoren


Interleukine (IL) sind lsliche Mediatoren des Immunsystems. Viele IL knnen von mehreren Zelltypen produziert werden; die meisten haben ihrerseits Wirkungen auf eine Vielfalt von Zielzcllen, die die entsprechenden Rezeptoren tragen. Ein einzelnes Interleukin kann daher vielfltige (pleiotrope) Wirkungen haben. Die Komplexitt wird dadurch noch erhht, da verschiedene Interleukine synergistisch oder antagonistisch wirken knnen. Wahrscheinlich sind es Muster von Interleukinen, welche im Verlauf einer Abwehrreaktion immer wieder in sinnvoller Sequenz gebildet werden, die gemeinsam den beteiligten Zellen des Immunsystems die notwendigen Informationen ber den Stand der Dinge" vermitteln. Hierdurch sind die Interleukine an der Feinabstimmung der Immunantwort beteiligt. Viele Interleukine sind in diesem Kapitel bereits erwhnt worden. Hier soll noch einmal ein kurzer berblick gegeben werden (Tab. 1.9). Lymphokine. So werden Interleukine bezeichnet, die von T-Zellen produziert werden. Hierzu

und IL-6 werden von Monozyten und Makrophagen nach Aktivierung sezerniert. Sie induzieren und unterhalten die Entzndungsreaktion. Chemokine. Das sind kleine Proteine (8-10 kD). die auf verschiedene Zelltypen chemotaktisch wirken. Zur Zeit sind etwa 15 verschiedene Chemokine beschrieben und etwa 12 Chemokin-Rezeptoren bekannt. Einige Rezeptoren reagieren auf mehr als ein Chemokin, viele Rezeptoren sind auf mehreren Zelltypen vorhanden. So werden gleiche Chemokinrezeptoren oftmals von allen Zelltypen gebildet, welche bei einer bestimmten Abwehrreaktion zusammenwirken. Der Rezeptor CCR5 ist z.B. spezifisch auf ThlZellen und Monozyten zu finden, CCR3 auf Th2-Zellen und eosinophilen und basophilen Granulozyten. Deshalb sorgen die Chemokine anscheinend fr die richtige Zusammensetzung des Zellinfiltrats am Ort einer Immunantwort, damit an einer gegebenen Immunreaktion alle Zellen teilnehmen, die bentigt werden. Die Chemokinrezeptoren CCR5 (auf Monozyten) und CXCR4 (auf T-Zellen) sind als Ko-Rczeptoren fr HIV identifiziert worden. Die Vielfalt der Rezeptor-Molekle fr die verschiedenen Zytokine spiegelt die Komplexitt des Interleukinsystems wider. Man findet hier Mitglieder der lmmunglobulin-Superfamilie (z.B. IL-1R), Rezeptoren mit 7 Transmembranabschnitten (Chemokinrezeptoren) und Fashnliche Rezeptoren mit death domains (TNFR). Andere Rezeptoren bilden eigene Familien: die Rezeptorfamilie der hmatopoetischen Wachstumsfaktoren (z.B. die - und y-Ketten des IL-2-R) und die Familie der Interferon-Rezeptoren. Viele Interleukinrezeptoren bestehen aus mehreren Ketten. Manche Rezeptoren werden sezerniert und inaktivieren in lslicher Form das entsprechende Zytokin.

1.2.11 Die Begrenzung und Beendigung einer Immunreaktion


Jede Abwehrreaktion durch die Effektormechanismen des Immunsystems birgt die Gefahr der Schdigung des Organismus selbst. Die Begren-

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr


Zytokin IL-1

51

vorwiegend produzierende Zellen Makrophagen, fast alle Zellen CD4 und CD8- T-Zellen + CD4 -T-Zellen CD4 -T-Zellen (vorw. Th2), Mastzellen T-Lymphozyten viele verschiedene Zellen, besonders Makrophagen Monozyten, T-Zellen, Thrombozyten, Endothelzellen T-Lymphozyten Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen Makrophagen, dendrit-Zellen T-Lymphozyten T-Zellen, NK-Zellen
+ +

hauptschliche Wirkungen inflammatorisch, pyrogen, aktivierend fr fast alle Zellen des Immunsystems Wachstum von T-Zellen, NK-Zellen und B-Zellen Wachstum von hmatopoetischen Vorluferzellen (Multi-CSF) und Mastzellen Proliferation von B-Lymphozyten, Klassenwechsel zu IgE, Wachstum von Mastzellen, Wachstum von Th2-Zellen, Klassenwechsel zu lgG4, Hemmung der Bildung von Th1 -Zellen Wachstum und Aktivierung von eosinophilen Granulozyten, Wachstum von B-Lymphozyten Wachstum von B-Lymphozyten, Induktion von AkutphaseProteinen" in der Leber Mitglied der Familie der Chemokine, inflammatorisch, chemotaktisch fr verschiedene Zellen, aktivierend fr verschiedene myeloide und lymphoide Zellen Wachstum von T-Lymphozyten, Mastzellen und bestimmter hmatopoetischer Vorluferzellen Unterdrckung von Wachstum und Interferon-y-Produktion bei Th1 -Zellen, Hemmung der Wirkung von Interferon-y, Hemmung der Antigenprsentation von Makrophagen Aktivierung von NK-Zellen zur Interferon-y-Produktion, Stimulation von Thi-Zellen, Differenzierung von CTL Wirkungen denen des IL-4 sehr hnlich Aktivierung von Makrophagen zur Abttung intrazellulrer Bakterien und Parasiten und zur Produktion von Mediatoren wie IL-1, Tumornekrosefaktor-a, IL-6; verstrkte Expression von MHC-Moleklen, Verstrkung der Phagozytose, Hemmung des Wachstums von TH2-Zellen, Klassenwechsel zu IgGI, Hemmung des Klassenwechsels zu IgE Inflammatorisch, pyrogen, zytotoxisch, aktivierend fr Granulozyten, Makrophagen, B-Zellen, synergistisch mit vielen Zytokinen. Freisetzung von PGE2, Hypotension, AkutphaseAntwort"

IL-2 IL-3 IL-4

IL-5 IL-6 IL-8

IL-9 IL-10

IL-12 IL-13 Interferon-y

Tumornekrosefaktor-a

Monozyten, T-Zellen

zung und Beendigung der Immunreaktion sind deshalb fr den Organismus lebenswichtig. Diese Mechanismen sind an verschiedenen Stellen schon erwhnt worden und sollen hier noch einmal zusammengefat werden. Immunreaktionen drfen nur dort ausgelst werden, wo Gefahr droht. Gegen Antigene des Organismus selbst mu das System tolerant sein. Bei T-Zcllen entsteht whrend ihrer Reifung zunchst die zentrale Toleranz, welche durch negative Selektion und Apoptose autoreaktiver TZellen im Thymus etabliert wird. Aber nicht alle Autoantigene werden im Thymus prsentiert. Deshalb mu die zentrale Toleranz durch periphere Toleranzmechanismen ergnzt werden. In

der Regel treffen autoreaktive T-Zellen, welche

den Thymus berlebt haben, ihr Autoantigen als erstes auf einer Krperzelle. Diese gibt ihnen das erste, nicht aber das zweite, fr die Aktivierung erforderliche Signal. Dadurch werden diese autoreaktiven T-Zellen anerg oder sterben. Auch das B-Zellrepertoire unterliegt whrend der Reifung der Zellen einer Selektion, wobei die zentrale B-Zelltoleranz etabliert wird. In der Peripherie ist diese Toleranz jedoch stets gefhrdet durch die somalische Mutation der Immunglobulin-Genc. Die periphere B-Zellfoleranz wird nun durch die T-Zelltoleranz garantiert: BZellen mit mutierten Immunglobulinen sind fr ihr berleben und fr ihre Differenzierung zu Antikrper-sezernierenden Plasmazellen unbedingt auf T-Zellhilfe angewiesen. Wenn die B-

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Allgemeine Infektionslehre

Zellen in den Keimzentren autoreaktiv geworden sind, prsentieren sie den T-Helferzellen Autoantigen. Hierfr sind die T-Zellen jedoch tolerant, und sie verweigern die Hilfe. Ist eine Immunreaktion jedoch einmal in Gang gekommen, bewirken vielfltige positive Feedback-Mechanismen, da sie schnell ein hohes Niveau erreicht. Der Vorteil der adaptiven Immunitt fr den Organismus besteht ja gerade darin, da Schnelligkeit und Intensitt bei einer wiederholten Infektion mit demselben Erreger noch wesentlich gesteigert werden knnen. Welche Mechanismen dmpfen diesen Ausbruch dann wieder? Zunchst sind die Effektorzellen lerminal differenziert, d.h. sie knnen sich nicht mehr teilen und haben eine begrenzte Lebenszeit. So klingen die Antikrper-Sekretion durch Plasmazellen und die CTL-Antwort von allein ab, sofern sich nicht permanent neue Zellen differenzieren. Die Rekrutierung und Differenzierung von Effektorzellen hrt aber auf, sobald das Antigen eliminiert ist. Aber das Immunsystem besitzt darberhinaus Mittel, eine Immunreaktion aktiv zu beenden: 1. IL-10, ein Sekretionsprodukt aktivierter Th2Zellen und Makrophagen hemmt die Funktionen der APC. 2. Nach ihrer Aktivierung kann in T-Zellen selbst leicht Apoptose ausgelst werden. 3. Aktivierte T-Zellen exprimieren auf ihrer Oberflche CTLA-4 (CD 152), ein Homodimer mit Sequenzhomologie zum kostimulatorischen Rezeptor CD28. CTLA-4 bindet ebenfalls CD80 und CD86-Molekle auf der Oberflche der APC, gibt der T-Zelle jedoch ein negatives Signal, welches ihre Proliferation beendet. 4. B-Zellen tragen auf ihrer Oberflche den FcyRezeptor CD32. Wenn ihr spezifisches Antigen bereits mit Antikrper komplexiert ist, knnen diese Komplexe gleichzeitig den spezifischen Antigen-Rezeptor und den Fcy-Rezeptor binden. Hierdurch wird die B-Zelle abgeschaltet.

wehrmechanismen gegen alle verschiedenen Erreger ist an dieser Stelle nicht mglich. In diesem Kapitel sollen anhand von Beispielen wesentliche Prinzipien der spezifischen Abwehr erklrt werden, die gegen exemplarische Erreger angewendet werden. Die meisten Kenntnisse dieser Abwehrmechanismen stammen aus experimentellen Infektionen, im allgemeinen der Maus. Nur relativ wenige Daten wurden aus klinischen Beobachtungen gewonnen oder aus der Untersuchung von Patientenmaterial. Da sich die Immunsysteme von Maus und Mensch in wesentlichen Einzelheiten unterscheiden, mu dies bei der Beurteilung der Abwehrmechanismen bercksichtigt werden. Abwehr von intrazellulren Erregern
Viren

1.2.12 Spezielle Infektabwehr


Das Immunsystem ist mit einer Vielfalt von Erregern konfrontiert, die eine Vielzahl von verschiedenen Strategien der Infektion verwenden. Fr jeden Erregertyp, fast fr jeden Erreger selbst, gibt es spezifische Kombinationen von Abwehrmechanismen. Eine vollstndige enzyklopdische Auflistung aller molekularen Ab-

Mechanismen der unspezifischen Resistenz wehren Viren vor oder zu Beginn der Infektion ab. Physikalische Barrieren bestehen z.B. in Epithelien wie Flimmerepithel oder Haut, oder im Magensaft. Frh nach Infektion werden Interferone gebildet (IFN-a aus vorwiegend mesenchymalen Zellen und IFN- vorwiegend aus Leukozyten), welche die Ausbreitung der Virusinfektion durch Schutz nicht infizierter Zellen verhindern. Ihre antivirale Wirkung beruht auf verschiedenen Mechanismen, u.a. einer Degradation von RNA in der Zelle und einer Hemmung der Proteinsynthese. Weitere Wirkungen dieser Interferone sind eine Aktivierung von Natural-Killer-Zellen, die virusinfizierte Zellen lysieren knnen und IFN-y produzieren, das neben anderen Wirkungen auch antivirale Wirkung besitzt. Auerdem induzieren diese Interferone eine verstrkte Expression von MHC-IMoleklen, die infizierte Zellen leichter erkennbar fr T-Zellen macht und nicht-infizierte Zellen vor dem Angriff von NK-Zellen schtzt. Wenige Tage nach der Infektion sind die Mechanismen der spezifischen adaptiven Abwehr, Antikrper und T-Zellen, nachweisbar. Die drei wesentlichen Effektormechanismen sind Neutralisierung von Viruspartikeln durch Antikrper, Zerstrung der infizierten Zellen durch zytotoxische T-Zellen und das von diesen Zellen produzierte IFN-y. Als Neutralisation wird die Hemmung der Infektion durch Viren bezeichnet. Viren besitzen spezifische Rezeptoren fr Wirtskomponenten. Diese Rezeptoren knnen, wie im Falle der Myxoviren, spezifische Lektine fr Neuramin-

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

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sure oder hnliche Zuckerstrukturen sein. Sie knnen auch ber Protein-Protein-Wechselwirkung mit Zeiloberflchenmoleklen reagieren, wie im Falle des Glykoproteins des HIV mit CD4 und Chemokin-Rezeptoren oder im Falle des Rhinovirus mit dem intercellular adhesion molecule-I (CD54). Antikrper-Bindung an die Rezeptorstrukturen der Viren verhindert die Infektion der Zelle. Neutralisierende Antikrper sind daher ein wichtiger Schutzmechanismus gegen eine Reinfektion (insbesondere in Form von IgA-Antikrpern an den Eintrittspforten) und auch whrend der Infektion. Freigesetzte Viruspartikel werden durch Antikrper gegen externe Virusproteine, wie z.B. das Hmagglutinin des Influenzavirus, neutralisiert. Dies geschieht entweder direkt durch molekulare Blockade in verschiedenen Stadien der Zellinfektion oder indirekt durch Mitwirkung von Komplement oder Fc-Rezeptor-tragenden Phagozyten. Da virale Proteine wie zellulre Proteine im ER synthetisiert werden, werden virale Antigene vorwiegend durch MHC-I prsentiert. Daher sind CD8+ T-Zellen, die virale Peptide auf MHC-Klasse-I-Moleklen erkennen, die klassischen antiviralen Effektorzellcn. Durch die weite Verbreitung der MHC-I-Molekle knnen CD8T Zellen prinzipiell alle durch eine Infektion vernderten Zellen des Organismus zerstren. Sowohl zytopathische als auch nicht-zytopathische Viren werden durch diese Zellen abgewehrt. Die virusinfizierte Zelle kann frh (in der Eklipse) erkannt werden, zu einem Zeitpunkt, an dem zwar frhe Virusproteine hergestellt werden, aber noch kein infektises Virus gebildet wird. Sogenannte immediate early"- und early"-Proteine sind daher bei zytopathischen Viren die entscheidenden Zielantigene. Ein Problem der spten Zerstrung virusinfizierter Zellen ist die Freisetzung dann schon gebildeter infektionstchtiger Viruspartikel durch die Zytolyse. In diesem Fall kommt die Zellzerstrung als entscheidender Schutzmechanismus zu spt. Die schtzende Wirkung der CD8-positiven Zellen wird dann durch Zytokine (insbesondere IFN-y) vermittelt, das sie nach Antigenerkennung produzieren. Daher schtzt die Zytotoxizitt gegen eine virusinfizierte Zelle spt im Infektionszyklus nur bei nicht-zytopathogenen Viren, die in infizierten Zellen persistieren und infektise Virionen ohne Zelltod dauernd freisetzen. Auch CD4+ T-Zellen spielen eine wichtige Rolle. Als Helferzellen sind sie entscheidend fr die

Produktion von neutralisierenden Antikrpern. Im Keimzentrum prsentieren B-Lymphozyten, die mit ihrem Antigenrezeptor gegen ein externes Virusprotein Viruspartikel aufgenommen haben, virale Antigene mit MHC-11-Moleklen fr CD4-Zellen. Da Peptide aus allen viralen Antigenen prsentiert werden, knnen auch THelferzellen, die Peptide von internen Virusproteinen erkennen, mit den B-Zellen interagieren. CD4-Zellen sind auch wichtig fr die Aufrechterhaltung der CD8-Antwort. Sie knnen auch selbst, durch die Produktion von Zytokinen. als Effektorzellen wirken und mglicherweise in begrenztem Umfang auch als zytotoxische Effektorzellcn.
Intrazellulre Bakterien und Parasiten

Fakultativ intrazellulre Erreger, die auch auerhalb ihrer Wirtszellen wachsen knnen, sind z.B. Mykobaktcrien , Salmonellen, Brucellen. Legionellen, Listerien, Toxoplasmen oder Leishmanien. Alle diese Erreger nutzen den eigentlich fr sie gefhrlichen Makrophagen als wichtigste oder oft einzige Wirtszelle. Sie werden durch eine erleichterte Phagozytose aufgenommen, indem sie Rezeptoren der Makrophagen binden, und werden dann in ein Phagosom verbracht. Hier knnen sie entweder verbleiben oder ins Zytoplasma entkommen (Listerien). Obligat intrazellulr wachsen z.B. Rickettsien und Chlamydien. Sie benutzen vorwiegend Endothclzellen oder Epithelzellen als Wirtszellen, in die sie ber Rezeptoren gelangen. Chlamydien bleiben im Phagosom, Rickettsien entkommen ins Zylosol. Der Schutz gegen diese Erreger ist vollstndig T-Zell-abhngig. Im Gegensatz zu anderen Mikroorganismen knnen diese Erreger im ruhenden Makrophagen berleben, da sie die Fusion des Phagosoms mit dem Lysosom verhindern oder resistent gegen die intrazellulren Abttungsmechanismen des Phagolysosoms (lysosomale Enzyme und niedrigen pH, Sauerstoffmetaboliten) sind. Erst nach Aktivierung" durch Zytokine von T-Zellen erhalten Makrophagen die Fhigkeit, die meisten intrazellulren Parasiten abzutten oder in ihrem Wachstum zu hindern. Das entscheidende Zytokin in dieser Hinsicht ist IFN-y, das u.a. die Produktion bakterizider reaktiver Saucrstoffmetabolite bewirkt, durch Induktion der NO-Synthase reaktive Stickstoffmetabolite entstehen lt und durch den Abbau von Tryptophan intrazellulre Erreger aushungert. Die Effektor-Zellen, die die Makrophagen zur

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Allgemeine Infektionslehre Abttung befhigen, sind in erster Linie CD4"1" T-Zellen vom Thl-Typ, die in der Lage sind, IFN-Y zu sezernieren. Daher ist fr die Abwehr dieser Erreger von grter Bedeutung, da frh die Immunreaktion auf die Bildung von ThlZellen gerichtet wird. Entscheidend ist die frhe Bildung von IL-12, das NK-Zellen zur Bildung von IFN-y anregt und die Reifung von Thl-Zellen bewirkt. IL-12 und IFN-Y bewirken gleichzeilig eine Unterdrckung der Bildung von Th2Zellen. Das von Th2-Zellen gebildete IL-4 wirkt auf den Makrophagen direkt antagonistisch zur aktivierenden Wirkung des IFN-y. Das klassische Beispiel fr die Bedeutung der Thl-Zellen ist die Infektion der Maus mit Leishmania major. Schutz gegen dieses in Makrophagen ansssige, obligat intrazellulre Protozoon wird nur durch IFN-Y vermittelt, das von CD4+ Thl-Zellen produziert wird. Muse, die eine Immunantwort vom Th2-Typ generieren, knnen das Wachstum des Parasiten nicht kontrollieren und sterben an der Infektion. hnlich scheint bei der lepromatsen Lepra des Menschen eine Immunreaktion vom Th2-Typ mit IL-4 Produktion vorzuliegen, whrend bei der tuberkulsen Form IFN-Y gefunden wird. Die typische histologische Struktur, die bei der Thl-Reaktion entsteht, ist das Granulom mit TZellen und Makrophagen in verschiedenen Differenzierungstadien, inklusive Epitheloidzellen und Riesenzellen. Es ist essentiell fr die lokale Begrenzung der Infektion. Allerdings fhrt die Bildung von Granulomen meist zu einer Strung der Gewebefunktion bis hin zur Gewebezerstrung wie z.B. bei der tuberkuloiden Lepra. CD8-positive Zellen stellen auch einen effizienten Effektormechanismus gegen diejenigen Erreger dar, denen es gelingt, ins Zytoplasma zu entkommen. Dies ist z.B. der Fall bei Listeria monocytogenes, das durch das porenbildende Listeriolysin die phagozytische Vakuole aktiv verlassen kann. Die Proteine, die der Erreger dort synthetisiert, knnen damit auch von MHC-Klasse-I-Moleklen prsentiert werden. Es werden aber auch Antigene von Mycobacteriuni tuberculosis oder von Yersinien und Salmonellen durch Klasse-I-Molekle prsentiert. CD8-positive T-Zellen wirken sowohl durch Zytolyse als auch ber sezernierte Zytokine, in erster Linie IFN-Y. Zwei unabhngige Mechanismen der zellulren Zytotoxizitl stehen ihnen zur Verfgung. Der wichtigste Mechanismus ist die Sekretion des porenbildenden Proteins Perforin und das Eindringen von Esterasen (Gran-

zymen) und lytischen Peptiden durch die Perforinpore. Dieser Weg scheint auch zu einer direkten Schdigung der intrazellulren Erreger zu fhren. Der zweite Weg ist die Hochregulation des Liganden fr Fas (CD95), das in der Zielzelle Apoptose induziert. CD8-Zellen spielen auch eine Rolle gegen Erreger in anderen Zellen als Makrophagen. Ein typisches Beispiel ist die Lyse der mit Plasmodien-Sporozoiten infizierten Hepatozyten durch CDS* CTL. Nach entsprechender Immunisierung knnen durch Zerstrung der infizierten Leberzellen die Sporozoiten nicht zu den Blutformen heranreifen und es kommt zu einer sterilen Immunitt bei einer Reihe von Versuchstieren.

Abwehr von extrazellulren Erregern


Bakterien und Protozoen

Extrazellulre Bakterien knnen nur im Wirt berleben, wenn sie den entscheidenden Abwehrmechanismus, die Zerstrung durch professionelle Phagozyten, Granulozyten und Makrophagen, umgehen. Sie tun dies, indem sie die Phagozytose durch Polysaccharid-Kapseln oder antiphagozytre Proteine wie das M-Protein von Streptococcus pyogenes verhindern. Daher ist eine durch Antikrper und Komplement erleichterte Phagozytose (Opsonisierung) ein wichtiger Mechanismus zur Abwehr dieser Bakterien, bedeutender als die Lyse der Bakterien durch die terminale Komplementsequenz. Defekte der frhen Komponenten des Komplementsystems fhren ebenso wie Granulozytendefekte zur Hufung eitriger Infektionen. Die besonders gegen Kohlenhydrat-Antigene gebildeten IgG2- (und auch IgG4-) Antikrper werden erst im zweiten Lebensjahr produziert. Daher sind Infektionen mit Kapsel-tragenden Bakterien, wie Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae oder Neisseria meningitidis fr Kleinkinder besonders gefhrlich. Ein selektiver Mangel der Immunglobuline der IgG2- und IgG4-Subklasse ist ein nicht seltener Immundefekt. Diese Patienten sind besonders anfllig fr Infektionen mit Kapsel-tragenden Bakterien. Typischerweise produzieren viele extrazellulre Bakterien Toxine und Enzyme, die entscheidende Pathogenittsfaktoren sind und sich oft gegen Bestandteile des Immunsystems richten. Die Neutralisation von Exotoxinen verschiedener Bakterien, die besonders von IgGl- und IgG3Antikrpern bernommen wird (auf den

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

55

Schleimhuten von IgA), ist die am lngsten bekannte Wirkung der Antikrper. Die Adhrenz von Bakterien durch spezifische Adhsine ist eine Voraussetzung fr die Infektion von Zellen oder fr die Anheftung an die Oberflche von Epithelien. Das extrazellulre Bakterium Neisseria gonorrhoeae adhriert an Epithelzellen des Urogenitaltraktes durch ein spezifisches Oberflchenprotein, das als Pilin" bezeichnet wird. Antikrper gegen Pilin hemmen die Adhrenz und verhindern die Infektion. Durch die Hemmung der Adhrenz kann der Erreger ber mechanische Reinigungsmechanismen entfernt werden. Fr die Hemmung der Kolonisierung auf Schleimhuten sind TgA-Antikrper von besonderer Wichtigkeit, allerdings erst bei Sekundrinfektionen, da ihre Bildung beim primren Kontakt mit dem Erreger zu spt kommt. Als Evasionsmechanismus bilden dieser und andere Erreger spezifische IgA-Proteasen, um dieser Adhrenzinhibition zu entgehen. Die einzigen Protozoen, die dauernd extrazellulr leben und dem Immunsystem immer zugnglich sind, sind die afrikanischen Trypanosomen, die Erreger der Schlafkrankheit. Durch die dauernde Variation ihrer Antigene sind sie fr das Immunsystem nicht erreichbar (s.u.). Plasmodien sind als Blutformen nur fr Sekunden frei im Blut zugnglich, sonst sind sie in den infizierten Erythrozyten verborgen. Die Antikrper-abhngige Sequestration und Phagozytose dieser an der Oberflche durch ein Parasitenprotein vernderten Erythrozyten in der Milz ist der wesentliche Abwehrmechanismus gegen Plasmodien.
Pilze

be toxischer Molekle zu aktivieren. Dies geschieht meist durch Antikrper-abhngige zellulre Abwehrmechanismen. Gegen viele Wrmer ist eine IgE-abhngige Aktivierung von eosinophilen, basophilen und neutrophilen Granulozyten und auch Mastzellen ber ihre hochaffinen Fc-Rezeptoren fr IgE entscheidender Effektormechanismus. Der Wirt bildet hierzu blicherweise eine T-Zellantwort vom Th2-Typ mit Produktion von 1L-4 und 1L-5 aus, die zur Bildung von spezifischem IgE und einer Eosinophilie fhrt. Auch IgG-Antikrper gegen Wurmantigene knnen neutrophile und eosinophile Granulozytcn ber den Fcy-Rezeptor (CD16) aktivieren. Die Aktivierung dieser Zellen fhrt zur Freisetzung von Mediatoren und Proteinen aus Granula der Zellen und damit einerseits zur direkten Schdigung der Parasiten, andererseits auch zu einem lokalen entzndlichen Milieu, das ungnstig fr den Wurm ist und seine Fruchtbarkeit reduziert. Dieser Mechanismus trifft sowohl fr Wrmer im Gewebe als auch fr intestinalc Helminthen zu.
Evasionsmechanismen

Infektionserreger haben eine Vielzahl von Strategien entwickelt, dem Angriff des Immunsystems zu entgehen. Dies umfat sowohl ein Ausweichen vor der Immunantwort als auch eine aktive Interferenz mit Mechanismen der Immunabwehr. Einige Beispiele sollen hier beschrieben werden.
Antigenvariation

Die Abwehr von Pilzinfektionen ist komplex und abhngig vom jeweiligen Erreger. Generell ist, trotz ihrer extrazellulren Lokalisation, die Resistenz abhngig von IFN-y-produzierenden Thl-Zellen. Daher sind Infektionen mit Pilzen bei HlV-Infizierten hufig. Jedoch spielen bei manchen Pilzen, z.B. bei Hefen, Opsonisierung und Phagozytose oder Angriff durch Granulozyten eine wichtige Rolle, C. albicans bietet daher Probleme bei neutropenischen Patienten.
Helminthen

Bei der Wurminfektion ist der Wirt mit einem vielzelligen Erregerorganismus konfrontiert, der nur in Teilen und oberflchlich zu attackieren ist. Daher besteht die Abwehr dieser Parasiten darin, an ihrer Oberflche Zellen zur Abga-

Antigenetische Heterogenitt ist eine der hufigsten Ursachen fr eine fehlende Immunitt gegenber Mitgliedern einer bestimmten Spezies von Mikroorganismen. Die meisten Beispiele fr Heterogenitt bei Mikroorganismen betreffen eine Variabilitt durch antigenetisch unterschiedliche Stmme derselben Spezies. Beispiele sind die Kapselserovare bei Pneumokokken und vielen Enterobacteriaceae, die M-Proteine bei Streptokokken oder die LPS-Variabilitt der O-Seitenkette bei Enterobacteriaceae. Ein besonderer Selektionsvorteil ist jedoch die Antigenvariation, d.h. die Variation der antigenetischen Struktur von Oberflchenmoleklen innerhalb eines Klones eines bestimmten Erregers. Viele Krankheitserreger sind in der Lage, ihre Antigenitt stark zu verndern, indem sie durch

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Allgemeine Infektionslehre

Mutationen oder Rekombination von Genen anligene Determinanten ersetzen. Das klassische Beispiel sind die Antigenvariationen der afrikanischen Trypanosomen, der Erreger der Schlafkrankheit. Die Parasitmie durch Trypanosoma brucei verluft wellenfrmig, indem immer wieder eine neue Subpopulation entsteht, die eine antigenetisch neue Form des Haupt-Oberflchenglycoproteins VSG auf ihrer Oberflche trgt. Daher knnen diese Erreger frei im Blut vorliegen; eine Antikrperantwort ist, durch die Vielzahl der Variationsmglichkeiten des Glykoproteins, nicht in der Lage, die Infektion dauerhaft zu kontrollieren. hnliche Vernderungen gibt es bei den Pili von Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae. Sie werden von virulenten Stmmen gebildet und ermglichen die Anheftung an das Wirtsepithel. Plasmodium falciparum exprimiert das Protein PfEMPl, das auf der Oberflche von infizierten Erythrozyten erscheint und fr deren Sequestration in der Mikrozirkulation verantwortlich ist. Es bestimmt die Antigenilt des infizierten Erythrozyten. Es wird von Mitgliedern der varGenfamilie kodiert, wobei individuelle Parasiten nur ein var-Gcn aus einem groen Repertoire von Genen exprimieren. Antigene Variation ist sehr hufig bei Viren anzutreffen, sie beruht hier blicherweise auf Mutationen. Die antigenetischen Vernderungen betreffen entweder die Oberflchenproteine, die von neutralisierenden Antikrpern erkannt werden (besonders bekannt als anligener Drift beim Influenza-Virus), oder die Sequenz von Epitopen, die an MHC-I-Molekle binden und von CD8" T-Zellen erkannt werden. Diese sog. Escape-Varianten knnen sich dann im Organismus verbreiten, bis der Wirt wieder passende Antikrper und T-Zellen produziert hat. Ein solches Entkommen eines Virus vor der CTLAntwort wurde fr das HIV, das Hepatitis B-Virus und das Hepatitis C-Virus beim Menschen beschrieben. Derartige Mutationen knnen dazu fhren, da entweder das Epitop nicht mehr vom Klasse-I-Molekl gebunden wird, oder es wird zwar gebunden, aber nicht mehr vom T-Zellrezeptor erkannt. Es knnen durch die Mutation auch sogenannte antagonistische Peptide entstehen, die in der Lage sind, zytotoxische T-Zellen zu inaktivieren und damit diese Immunantwort zu unterdrcken.
Hemmung der Antigen-Prsentation

finden, die Antigen-Prsentation durch MHCKlasse I-Molekle in infizierten Zellen verhindern, um der Kontrolle durch CD8-Zellen zu entgehen. Whrend Viren mit kleinem Genom durch die Geschwindigkeit ihrer Replikation der Zellyse durch CTL zuvorkommen, haben Viren mit grerem Genom, wie z.B. Herpesviren, die bis zu 200 verschiedene Proteine whrend ihres Replikationszyklus exprimieren, Mechanismen entwickelt, um die Antigen-Prsentation viraler Epitope zu hemmen. Virale Proteine degradieren MHC-I-Moleklc oder hemmen den TAPTransporter, der Peptide ins ER transportiert. Diese infizierten Zellen tragen nur wenige MHC-I-Molekle, sind aber dann durch NKZellcn lysierbar, da MHC-1-Molekle die Lyse durch NK-Zellen verhindern. Das Zytomegalievirus kann wiederum die Lyse durch NK-Zellen verhindern, indem es ein MHC-I-artiges Molekl auf die Oberflche von infizierten Zellen bringt, das die NK-Zellen abschaltet. Auch eine Hemmung der Antigen-Prsentation durch Klasse II ist fr einige Erreger, z.B. fr Leishmanien, beschrieben worden. Manche Erreger knnen auch die Stimulation der T-Zellen durch Herabregulation von kostimulierenden Moleklen auf infizierten Zellen beeintrchtigen.
Interferenz mit Abwehrmechanismen

Bei Viren sind verschiedene Mechanismen zu

Um sich gegen Effektormechanismen der Immunantwort zu schtzen, knnen Erreger diese direkt stren. So zerstren das a-Toxin und Toxin von Staphylococcus aureus prferenziell die fr das Bakterium gefhrlichen phagozytierenden Zellen. Die M-Proteine von Streptococcus pyogenes interferieren mit den Phagozytosemechanismen. Zudem sind sie Rezeptoren fr eine Reihe von Plasmaproteincn, die durch Bindung an die M-Proteine die Streptokokken maskieren. Kapseln von Bakterien wie Neisseria meningitidis oder Haemophilus influenzae haben ebenfalls Phagozytose-hemmende Eigenschaften. Erst durch Opsonisierung knnen diese bekapselten Erreger von Phagozyten aufgenommen werden. Daher sind Kapseln essentielle Virulenzfaktoren. Auch Interferenz mit dem Komplementsystem ist hufig zu beobachten. Es ist bemerkenswert, da Herpes- und Poxviren fr Komplement-regulierende Proteine kodieren, deren Gene von homologen Genen des Wirtes abstammen drften. Die Induktion einer fehlerhaften oder ungeeigneten Immunantwort ist im Interesse des Erregers. Daher kodieren eine Reihe von Viren im-

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

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munregulatorische Proteine. Das Epstein-BarrVirus z.B. kodiert ein virales IL-10, das eine hohe Sequenzhomologie zum menschlichen IL10 und identische Wirkungen besitzt. Gene fr weitere immunregulatorische Proteine (z.B. fr Zytokine, Zytokinrezeptoren und Komplementregulatorische Proteine), mit hoher Sequenzidentitt zu homologen humanen Genen, wurden bei der Sequenzierung u.a. verschiedener Herpesviren und von Pox-Viren gefunden. Eine weitere Methode, der Immunantwort zu entkommen, ist die Persistenz an sog. iminunprivilegierten Orten. Viele Erreger persistieren im zentralen Nervensystem, weil dieses keine immunologischen Strukturen besitzt und daher vom Immunsystem nur unzureichend kontrolliert wird.
Superantigene

Grampositive Kokken produzieren T-Zell-stimulierende Exotoxine wie die Enterotoxine und das Toxic-Shock-Syndrom-Toxin-1 von Staphylococcus aureus und die erythrogenen Toxine von Streptococcus pyogenes. Diese sogenannten Superantigene benutzen als molekularen Wirkmechanismus die Vernetzung von variablen Teilen des T-Zellrezeptors mit MHC-Klasse-TI-Moleklen auf Antigen-prsentierenden Zellen (Abb. 1.28). Damit stimulieren sie eine betrchtliche Fraktion der peripheren T-Zellen, die groe Mengen von Zytokinen produzieren, was eine koordinierte Immunantwort erschwert. Eine immunsuppressive Wirkung dieser Molekle ist beschrieben worden. Superantigene werden auch von weiteren Erregern gebildet (z.B. von Y. pseudotuberculosis), sie sind anscheinend mehrfach in der Evolution unabhngig voneinander entwickelt worden. Eine massive Ausschttung von immunologischen Mediatoren kann zu schwersten Symptomen bis hin zum Schock fhren. Dem toxischen Schock, der durch die Superantigene ausgelst wird, liegt eine berproduktion von Zytokinen zugrunde. Wahrscheinlich ist die aktive Endstrecke letztlich die gleiche wie beim gramnegativen Schock. Im Rahmen gramnegativer Infektionen kann ein Schocksyndrom durch eine massive Stimulation der Makrophagen durch Lipopolysaccharid der Bakterien entstehen. Von den Makrophagen werden verschiedene biologisch aktive Mediatoren freigesetzt, insbesondere TNF-a, IL-1, IL-6 und IL-12. Diese Zytokine setzen eine Kaskade in Gang, die weitere Zytokine freisetzt, darunter auch IFN-y und Lipid-

Abb. 1.28 Mechanismus der Aktivierung von

T-Zellen durch Superantigen.

mediatoren, und die letztlich zu Fieber, Hypotonie und Organversagen fhrt. Der wesentliche Unterschied zwischen grampositivem und gramnegativem Schock liegt in der Quelle der Zytokine: der Supcrantigen-induzierte Schock ist auf die Produktion von Lymphokinen durch T-Lymphozyten zurckzufhren. Das toxische Schocksyndrom ist also ein T-Zell-abhngiges, immunpathologisches Ereignis.

1.2.13 Pathologische Auswirkungen der Immunreaktion


Immunreaktionen knnen zu schweren Schden im Organismus fhren. Historisch werden nach den zugrundeliegenden Mechanismen immunpathologische Reaktionen in die Typen I bis IV eingeteilt. Typ I. So wird die anaphytaktische Reaktion" bezeichnet, die unmittelbar nach Vernetzung zellgebundener IgE-Molekle auf Mastzellen durch die Freisetzung von Mediatoren eintritt (Beispiel: Heuschnupfen, anaphylaktischer Schock). Typ II. So werden Reaktionen bezeichnet, die durch die Bindung von Antikrpern an zellgebundene Antigene ausgelst werden. Der FcTeil des Antikrpers vermittelt durch Bindung von Komplement oder Fc-Rezeptoren Entzn-

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Allgemeine Infektionslehre

dngen oder Gewebsschden. Ein Beispiel ist die Schdigung der Basalmembran beim Goodpasture-Syndrom. Auch der Antikrper-abhngige Abbau durch Phagozyten z.B. bei autoimmunhmolytischen Anmien oder AutoimmunThrombopenien wird als eine Typ IT Reaktion betrachtet. Typ III. Diese Reaktionen werden durch Immunkomplexe ausgelst. Klassisches Beispiel mit eher historischer Bedeutung sind die sog. ..Serumkrankheit" (Injektion einer greren Menge von xenogenem Serum) und das Arthus-Phnomen" (lokale Injektion eines Antigens in einen vorimmunisierten Wirt). Gleichzeitige Anwesenheit von Antigen und spezifischen Antikrpern fhrt zur Bildung von Immunkomplexen, die dann systemisch (Serumkrankheit) oder lokal (Arthus-Phnomen) Entzndungsreaktionen hervorrufen. Typ IV. So oder als berempfindlichkeitsreaktion vom Spttyp (Delayed Type Hypersensitivity, DTH) wird die T-Zell-vermittelte Entzndung durch Infiltration mit mononukleren Zellen bezeichnet. Typisches Beispiel ist die Tuberkulinreaktion; eine Typ I V-Reaktion ist bei den meisten T-Zellvermittelten Entzndungen beteiligt, z.B. beim Kontaktekzem. Die Typ IV-Reaktion wird von Thl-Zellen vermittelt, entscheidendes Zytokin ist IFN-y. Da aus der Aktivierung von ThlZellen eine Entzndungsreaktion resultiert, werden diese auch als inflammatorische T-Zellen bezeichnet. Wird eine Immunantwort von Th2-Zellen vermittelt, entsteht keine Typ IVReaktion, Th2-Zellen sind daher anti-inflammatorisch. Diese Einteilung der immunpathologischen Reaktionen in isolierte Typen ist heute nicht mehr angebracht, sie wird der Komplexitt der Immunreaktion nicht gerecht und ist nicht vollstndig. Sie erfat nicht die pathogenetisch direkt (ohne Beteiligung von Komplement oder Zellen) wirksamen Autoantikrper, wie z.B. bei Myasthenia gravis gegen den Acetylcholinrezeptor und bei Pemphigus gegen Desmosomen, und auch nicht die zytotoxische Aktivitt von CD8+ T-Zellen.
Immunpathologische Konsequenzen von Infektionen
Immunpathogenese durch CD8* T-Zellen

jeder normalen Antwort gegen Infektionserreger. Die Zerstrung von Virus-infizierten Zellen durch CD8+ CTL fhrt zwar zur Eliminierung des Virus, kann aber auch ausgedehnte GewebsZerstrungen hervorrufen. Daher ist der Schaden durch die CTL-Antwort in vielen Fllen ausgeprgter als durch die eigentliche Infektion mit dem Virus selbst. Insbesondere bei Viren, die keinen zytopathischen Effekt hervorrufen, sondern in befallenen Zellen eine persistierendc Infektion etablieren, fhrt erst die CTL-Antwort zur Pathologie. Dies wurde zuerst bei der Infektion der Maus mit dem LCM-Virus gefunden, dem nun klassischen Experimentalmodell fr die Interaktion von Virus-und Immunsystem. Ein Ausbleiben der CTL-Antwort durch z.B. Toleranz bei neonataler Infektion fhrt zur persistierenden Infektion ohne Pathologie, die infizierte Maus wird Trger und Ausscheider des Virus. Ein typisches Beispiel beim Menschen ist die Infektion der Leberzellen durch Hepatitis A-Virus, das Zellen in vitro produktiv und persistierend infiziert, ohne sie zu zerstren. Die Hepatitis wird erst durch die Zerstrung infizierter Hepatozyten hervorgerufen. Zur Zeit der maximalen Virusproduktion und Virusausscheidung ist noch keine Hepatitis festzustellen, der Anstieg der Transaminasen erfolgt erst, wenn die Virusproduktion durch die zytotoxischen T-Zellen erniedrigt wird. hnliche Verhltnisse gelten fr die Mumps-Erkrankung des Menschen, die Hepatitis B und viele andere mehr.
Immunpathogenese durch CDA* T-Zellen

Immunpathologische Reaktionen sind nicht nur Konsequenzen einer Immunantwort gegen Selbstantigene, sondern entstehen auch bei fast

Die Eigenschaft der inflammatorischen" ThlZellen, Mediatoren der Entzndung zu sezernieren, fhrt bei Stimulation dieser Zellen regelmig zu begleitenden Entzndungen. Dieser Tatsache liegen die Gewebszerstrungen z.B. bei Tuberkulose und bei tuberkuloider Lepra zugrunde, whrend die Infektion mit Mycobakterien im immunsuppremierten Patienten nicht die ausgeprgten Zeichen der Entzndung und Fieber zeigt. Die lokale Persistenz von Antigenen eines Erregers, der ThJ-artige CD4+-Zellen stimuliert, fhrt ebenfalls zu lokaler Entzndung. Ein Beispiel ist die u.a. durch Enterobakterien. wie Yersinien oder Salmonellen, ausgelste sog. Reaktive Arthritis. Nach einer gastrointestinalen Infektion gelangen diese Bakterien in die Zirkulation, die Aufnahme des Erregers fhrt ber noch unklare Mechanismen (Transport durch Makrophagen?) zur Ablagerung von Proteinen

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

59

des Erregers im Gelenk, die dann von IFN-y produzierenden CD4+-Zellen erkannt werden. Dies fhrt zur lokalen Entzndung. Es ist dabei umstritten, ob berhaupt eine Replikation des Erregers im Gelenk stattfinden mu, oder ob nur Erregermaterial ins Gelenk transportiert wird. Die Eliminierung des Antigens fhrt dann zum Sistieren der Entzndung. Die Ausprgung einer Th2-Antwort hat daher anti-inflammatorische Konsequenzen. Bei der lepromatsen Form der Lepra ist IL-4, aber kein IFN-y in der befallenen Region zu finden, begleitet von einer massiven Vermehrung der Mykobakterien. Entzndungszeichen und Gewcbszerstrung fehlen, allerdings zerstren die Bakterien ihre speziellen Wirtszellen.
Auslsung von Autoreaktivitt

Im Rahmen einer Infektion kann es auch zu einer spezifischen Sensibilisierung des Immunsystems gegen krpereigene Strukturen kommen. In den meisten Fllen ist dies auf eine Kreuzreaktion zwischen Epitopen des Erregers und Moleklen des Wirtes zurckzufhren. Entweder handelt es sich um sehr konservierte Proteine, die hohe Sequenzhomologien zwischen Wirt und Erreger aufweisen, wie z.B. die HeatShock-Proteine", oder um Epitope, die zufllig sonst nicht verwandten Proteinen gemeinsam sind. Beispiele fr solche Kreuzreaktionen fr Antikrper sind die M-Proteine von Streptococcus pyogenes, bei denen bestimmte Serotypen Epitope besitzen, die mit menschlichem Herzmuskel und anderen Geweben kreuzreagieren. Fr die Stimulation autoreaktiver T-Zellen mssen Toleranzmechanismen durchbrochen werden.

1.2.14 Immundefizienz
In dem komplexen System verschiedener Zellen, multipler Interaktionen und mannigfaltiger Rezeptoren knnen einzelne Defekte starke Auswirkungen auf das Funktionieren des Ganzen haben. Angeborene Immundefekte sind auf der Ebene fast aller Zellen und vieler Rezeptoren gefunden worden (s. Kap. 11.11). Fast alle wurden inzwischen molekular definiert. Die Untersuchung von Immundefekten hat entscheidend zum Verstndnis des Immunsystems beigetragen. Beim schweren kombinierten Immundefekt (SCID) sind sowohl T-Zell- als auch B-Zellsystem betroffen. Dies kann mehrere Ursachen haben. Ein Defekt in den sog. Rekom-

binase-aktivierenden Genen, der die Rekombination der Immunglobulin- und TcR-Gene nicht erlaubt, fhrt zum Ausbleiben der T-Zcll- und B-Zelldifferenzierung. Defekte sind auch in einzelnen Linien beschrieben worden, sie betreffen sowohl Defekte in der Expression einzelner Membranrezeptoren als auch in Signal-transduzicrenden Moleklen in Lymphozyten. Die Xchromosomale Againmaglobulinmie beruht z.B. auf der fehlenden Expression der Tyrosinkinase btk, die in einer frhen Phase der B-Zellreifung bentigt wird. Defekte sind auch beschrieben worden in verschiedenen Komponenten des TCR, die dann zu Ausfllen des T-Zellsystems fhren. Beispiele von Defekten, die die Kommunikation der Zellen betreffen, sind z.B. der Defekt des CD40-Liganden (fhrt zum Hyper-IgM-Syndrom) oder der Defekt der signaltransduzierenden y-Kette, die den Rezeptoren fr IL-2, IL-4, IL-7 und IL-13 gemeinsam ist (fhrt zum X-chromosomalen SCID). Viele Immundefekte verlaufen ohne klinische Manifestationen. Ein typisches Beispiel ist der sog. angeborene selektive totale IgA-Mangel, ein relativ hufiger Defekt, bei dem IgM die Funktionen des IgA bernehmen kann. Die Mglichkeit, gezielt Gene aus der Keimbahn von Musen durch genetische Rekombination zu entfernen (k.o.Muse"), hat interessante Einblicke in die Funktion vieler immunologisch wichtiger Molekle gegeben und erlaubt es, Modelle fr angeborene Immundefekte zu etablieren. Immundefekte knnen auch erworben werden, am bekanntesten bei der Infektion mit dem HIV. Hier ist zwar der Verlust der CD4+ T-Zellen besonders auffllig, es darf aber nicht vergessen werden, da andere Komponenten des Immunsystems, z.B. die dendritischen Zellen, ebenfalls betroffen sind. Ein Immundefekt liegt auch bei Mangelernhrung, konsumierenden Erkrankungen oder schweren Infektionen vor, wie z.B. bei der Masernerkrankung oder der Malaria.

1.2.15 Immunabwehr von Tumoren


Tumorzellen sind in vieler Hinsicht pathogenen Infektionserregern hnlich und das Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle bei ihrer Bekmpfung. Sie enthalten Antigene, die vom Immunsystem erkannt und gegen die humorale und zellulre Effektoren gebildet werden knnen. Das Konzept der Immunberwachung (immunological surveillance) besagt, da die immer

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Allgemeine Infektionslehre

wieder im Organismus entstehenden malignen Zellen vom Immunsystem kontrolliert und an der Expansion gehindert werden. In der Tat entstehen unter Immunsuppression hufiger Tumoren. Tumorzellen enthalten verschiedene Arten sogenannter Tumorantigene. Einerseits produzieren sie Proteine, die nur oder vorwiegend in embryonalen Zellen vorkommen (onkofetale Antigene) oder eine sonst ganz eingeschrnkte Gewebsverteilung haben, z.B. exprimieren viele Tumorzellen sonst nur in Spermatogonien exprimierte Gene (MAGE). Auch gewebsspezifische Antigenc, wie die Tyrosinase beim Melanom, knnen vom Immunsystem erkannt werden. Diese Antigene sind meist bei allen Tumoren der gleichen Art vorhanden. Da manche dieser Molekle sezerniert werden, sind sie fr die Tumordiagnostik wertvoll. Tumorantigene auf der Zelloberflche knnen ber Antikrper erkannt werden, dies lt sich fr therapeutische und diagnostische Zwecke nutzen: Toxin-gekoppelle monoklonale Antikrper werden zur Zerstrung der Tumorzellen eingesetzt oder radioaktiv markierte Antikrper zur Lokalisierung des Tumors. Als besonders wichtig hat sich die spezifische Abwehr von Tumorzellen durch CD8+ zytotoxische T-Zcllen herausgestellt. Durch die hohe Teilungsrate hufen sich Punktmutationen in verschiedenen Genen der Tumorzellen an, die resultierenden Proteine tragen dann Aminosureaustausche und enthalten so vernderte Peptide, die von MHC-I-Moleklen prsentiert werden. Diese vernderten Peptide sind spezifische Tumorantigene, spezifisch allerdings nur fr diesen individuellen Tumor, und knnen prinzipiell wirkungsvoll zur Immunisierung gegen den Tumor ausgenutzt werden. Daneben erkennen CTL auch bestimmte gewebsspezifische Proteine, z.B. unvernderte Epitope der Tyrosinase beim Melanom. Eine erfolgreiche Melanomabstoung nach Immunisierung mit Tyrosinasepeptiden wird oft von Vitiligo begleitet, da die Tyrosinase auch in Melanozyten vorkommt. Hier wurde anscheinend die Toleranz gegen die krpereigene Tyrosinase durchbrochen. Einen weiteren wichtigen Mechanismus stellen die NK-Zellen dar. Die CTL-Antwort selektioniert fr Tumorzellen, die ihre MHC-I-Molekle herunterregulieren, um nicht von CTL erkannt zu werden. Da NK-Zellen nur durch ihre inhibitorischen Rezeptoren fr MHC-I-Molekle an der Lyse gehindert werden, ist ihre Aufgabe ge-

rade die Zerstrung dieser Tumorzellen, die den CD8+ T-Zellen entkommen sind. Literatur
ABBAS, A. K., A. H. L. LICHTMAN and J. S. POBER: Cellular and Molekular lmmunology, 4th. ed., W. B. Saundcrs. Philadelphia (2000). JANEWAY, C. A., P. TRAVERS and M. WALPORT: Immunobiology. The Immune System in Health and Disease, 4th ed. Elsevier London (1999). PAUL W. E.: Fundamental lmmunology, 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia, (1999). Einzelheiten zu den angesprochenen Themen sind in Zeitschritten mit bersichtsartikcln zu finden, z.B. Current Opinion in lmmunology, Immunological Reviews, Trends in lmmunology.

1.3 Epidemiologie bertragbarer Krankheiten


GOTTFRIED MAUFF Zu den ltesten medizinischen berlieferungen zhlen die groen Seuchen, die als epidemische Ereignisse die Menschheit heimgesucht haben. Unter ihnen waren Aussatz (Lepra) und Pocken bereits vor unserer Zeitrechnung bekannt; im Alten Testament wird die Pestilenz" als eine der sechs Plagen der gypter erwhnt. Prventivmedizinische Manahmen sind vermutlich ebenso alt. Aus dem China der Sung-Dynasc (961-1126) wird ber die Variolation durch Einblasen von pulverisiertem Pustelinhalt Pockenkranker in die Nase als die f'rheste Form einer gezielter Schutzimpfung berichtet. Quarantnemanahmen sollten durch Absonderung der Kranken einer Verbreitung von Infektionen vorbeugen. Mittelalterliche Handschriften berichten ber Leprse, denen der Zugang zu ffentlichen Gebuden verboten war; bei Annherung muten sie zur Warnung gesunder Personen eine Rassel schwingen (Abb. 1.29). Mangels mikrobiologischer Erkenntnisse waren die Schutzmanahmen jedoch zum Scheitern verurteilt. So wurde in der dritten groen Pestepidemie zwischen 1347 und 1352 mit schtzungsweise 25 bis 42 Millionen Toten die europische Bevlkerung um etwa ein Viertel dezimiert. Die moderne Epidemiologie der letzten zwei Jahrhunderte beschftigt sich mit der Beziehung zwischen Umwelt, krankheitsverursachendem Agens und dem Menschen (oder Tier) als Wirt. Zu ihren bedeutenden Fortschritten zhlen u.a. die 1796 erstmalig dokumentierte Pockenschutzimpfung mit dem Kuhpocken-Virus, die Einfhrung antiseptischer Manahmen im 19. Jahrhundert oder die Einfhrung der moderneren Trinkwasserver- und Abwasserentsorgung. Obwohl die Epidemiologie zunchst auch ohne Kenntnis der spezifischen tiologie auskam, haben erst die zahlreichen Entdeckungen von Infektionserregern etwa ab 1880 moderne epidemiologische Verfahren ermglicht.

1.3 Epidemiologie bertragbarer Krankheiten

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Abb. 1.29 Der Leprse. Miniatur aus einer Handschrift des Buches von den Eigenschaften der Dinge von Bartholomus dem Englnder (Paris, Bibliotheque Nationale; aus SOURNIS et al., 1980).

1.3.1 Grundbegriffe der Epidemiologie


Die Epidemiologie (gricch. epi, demos, logos: Wissenschaft von dem, was in einem Volk vorkommt") ist als die Wissenschaft vom Auftreten der Krankheiten in einer Bevlkerung" definiert. Dabei wird die Erforschung von Ursachen nicht-bertragbarer Volkskrankheiten des Menschen (z.B. Tumoren, Diabetes, Herz-KreislaufErkrankungen) von der Wissenschaft der klassischen bertragbaren Seuchen in der Humanund Veterinrmedizin sowie in neuerer Zeit der Nosokomialinfektionen (Krankenhausinfektionen") unterschieden. Beiden ist als Ziel die Prvention der in einer Bevlkerung gehuft zu beobachtenden Erkrankungen gemeinsam. Das vorliegende Kapitel befat sich ausschlielich mit der Epidemiologie bertragbarer Krankheiten. Hinsichtlich der Bedeutung der Epidemiologie fr nicht bertragbare Volkskrankheiten wird auf die entsprechende Fachliteratur verwiesen. Die Epidemiologie bentigt zunchst deskriptive Verfahren und statistische Erhebungen. Auf einen definierten Bevlkerungsumfang bezogen werden ermittelt: 1. Hufigkeit oder Morbiditt (absolute Zahl der Erkrankten auf 10000 oder 100000 Personen pro Zeiteinheit; meist 1 Jahr)

2. Inzidenz (Zahl der Neuerkrankungen) 3. Prvalenz (Bestand an Erkrankten, Anzahl der Erkrankten an einem Stichtag) 4. Mortalitt (Zahl der Verstorbenen in % bezogen auf eine bestimmte Gruppe, Gesamtbevlkerung, 1000 oder 10000 Personen, in einer Zeiteinheit, meist 1 Jahr) und 5. Letalitt (Prozentzahl der Todesflle bei den Erkrankten) als relatives Ma der Sterblichkeit. Die epidemiologische Analyse induktiv gewonnener Daten, als Summe der retrospektiven Beobachtungen, und deduktiver Daten, als Summe der Kenntnisse ber Agens, Wirtsorganismus und Umwelt, gestatten eine effiziente prventivmedizinische Epidemiologie. Aus der Verteilung bertragbarer Infektionskrankheiten knnen fr die zeitlichen und rtlichen Ablufe wichtige Rckschlsse gezogen werden. Der Begriff Epidemie bedeutet im engeren Sinne das gehufte, zeitlich und rumlich begrenzte Ereignis einer bestimmten Infektionskrankheit, die jeweils nach ihrem Manifestationszeitraum als Explosivepidemie oder bei protahiertem Verlauf als Tardivepidemie auftreten kann. Beispiele fr beide Epidemieformen finden sich unter den zahlreichen, bis in die zweite Hlfte des 20. Jahrhunderts hinein zu beobachtenden Typhusepidemien. Endemien finden sich dagegen bei rtlich umschriebenen, aber zeitlich unbegrenzten Infektionskrankheiten, wie z.B. bei Malaria oder Bilharziose. Pandemien kommen sowohl zeitlich begrenzt als auch unbegrenzt als globale Infektionskrankheiten vor. Beispiele sind die Influenzavirus-Grippe oder die sich von Asien bis nach Sdamerika ausbreitende Cholera. Sporadische Hufungen von Infektionskrankheiten sind als unregelmig, aber wiederholt vorkommende Ereignisse mit bestimmter rtlicher Bevorzugung zu beobachten. Solche Verlaufsformen sind typisch fr Meningokokkeninfektionen. Wichtige Kriterien eines epidemischen Ereignisses sind ihre Extensitt (Anzahl der Erkrankten in einer definierten Bevlkerung), sowie die Intensitt (Anzahl der Verstorbenen). Als Kontagionsindex bezeichnet man die Erkrankungswahrscheinlichkeit nach Erstinfektion, d.h. das Verhltnis Erkrankter auf 100 exponierte, empfngliche, nicht-immune Personen. Ein Kontagionsindex von 1,0 bedeutet, da 100% der erstmalig Infizierten erkrankt. Infektionen mit hohem Kontagionsindex sind z.B. Windpocken oder Masern (0,95), mit niedrigem Kontagions-

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Allgemeine Infektionslehre

index Diphtherie, Poliomyelitis oder bakterielle Ruhr (0,15).

1.3.2 Epidemiologische Methoden


Die erfolgte Exposition lt sich fr viele Infektionserreger durch den Erregernachweis oder die Immunantwort (Antikrpertiter oder Hauttests) belegen. Da fr die Epidemiologie alle an der Entstehung und Verbreitung einer Erkrankung beteiligten Einflsse von Bedeutung sind, wird der Begriff der Risikofaktoren dem der Krankheitsursachen vorgezogen. Als relatives Risiko lt sich die Wahrscheinlichkeit, an einer Krankheit beim Vorliegen bestimmter Risikofaktoren in bezug auf eine Vergleichspopulation zu erkranken, berechnen. Zur frhzeitigen Beurteilung epidemiologischer Ereignisse ist die Zusammenarbeit zwischen dem behandelnden Arzt, dem Mikrobiologen und dem Epidemiologen eine entscheidende Voraussetzung. Das rechtzeitige Erkennen einer Epidemie beruht oft schon auf der klinischen Verdachtsdiagnose. Der behandelnde Arzt mu bei Verdacht auf eine meldepflichtige Erkrankung umgehend entsprechende Untersuchungen einleiten. Bei Infektionskrankheiten, die aufgrund von Rechtsvorschriften bereits bei Verdacht meldepflichtig sind, darf der behandelnde Arzt nicht auf das mikrobiologische Laborergebnis warten, ehe er das zustndige Gesundheitsamt informiert. Die Erfassung von Infektionsdaten ist die entscheidende Voraussetzung fr die epidemiologische Analyse. Sie erfolgt sowohl fr das Infektionsgeschehen in der Gesamtbevlkerung, einer Bevlkerungsstichprobe als auch bei Nosokomialinfektionen aufgrund der Meldedaten zentral am Robert Koch Institut, Berlin. Die Meldekriterien sind einerseits durch gesetzliche Regelungen (z.B. Infektionsschutzgesetz, Tierseuchengesetz, Lnderverordnungen), andererseits durch vereinbarte Empfehlungen festgelegt. Zur experimentellen Aufklrung epidemiologischer Zusammenhnge von Infektionskrankheiten ist die komplexe Typisierung, d.h. die gleichzeitige Anwendung mehrerer Methoden zur Charakterisierung eines Erregertyps erforderlich. Zur Anwendung kommen je nach Erregerart verschiedene technische Verfahren (Serotypie, Lysotypie. Biotypie, Bakteriozinotypie, Antibiogramm, Typisierung uerer Membranproteine OMP, Typisierung von Plasmiden und chromosomalen DNA-Fragmenten). Die mit

diesen Methoden gewonnenen Ergebnisse werden zu einer Klonformel zusammengefat. Serologische Untersuchungen beim Menschen oder bei Erregerisolaten knnen dem Epidemiologen einen Einblick in die immunologische Situation geben fr die Erfolgsbeurteilung von Schutzimpfungen (z.B. Diphtherie, Tetanus, Poliomyelitis), die Bewertung der optimalen Zusammensetzung der Immunogene von Impfstoffen (z.B. Influenzavirus-Impfstoffe) und die Einschtzung zuknftiger Trends und Risiken bei bestimmten bertragbaren Krankheiten. Biomathematische Methoden sind fr die epidemiologische Analyse eine wichtige Voraussetzung. Neben den grundlegenden statistischen Verfahren (Normalverteilung, Prfverteilung, Varianzanalyse, Regression und Korrelation) sind fr die Planung und Durchfhrung von epidemiologischen Erhebungen Stichprobendefinitionen, Risikobewertungen, Schtzungen von Fehlern erster und zweiter Art, Tendenzen und Assoziationen von entscheidender Bedeutung fr die Schlufolgerungen. Nheres findet sich in der entsprechenden Fachliteratur.

1.3.3 Epidemiologische Faktoren


Die Beziehungen zwischen Erreger, Wirtsorganismus und Umweltfaktoren bestimmen das epidemische Vorkommen von Infektionskrankheiten. Sowohl fr ihre akute Bekmpfung als auch fr prophylaktische Manahmen sind daher spezielle Kenntnisse ber mgliche Infektionsquellen, bertragungswege und Infektionsketten sowie potentielle Eintrittspforten erforderlich. Jede Infektionskrankheit weist darber hinaus ihre eigenen epidemiologischen Gesetzmigkeiten auf. die im speziellen Teil des Buches beschrieben sind. Infektionsquellen Zum natrlichen Erregerreservoir zhlen infizierte Personen bzw. Ausscheider (sogenannte Keimtrger) von Erregern, in der Inkubation befindliche Personen, manifest oder abortiv Erkrankte, Kontaktkeimtrger, die selbst nicht erkrankt sind, ferner rekonvaleszente Patienten. Dauerausscheider nach erfolgter Heilung. Auch Tiere als Ausscheider oder Zwischenwirte bleiben als Infektionsquelle hufig unerkannt, wenn sie nicht selbst erkranken. Zoonosen sind Infektionen, an denen gleichermaen Wirbeltiere und der Mensch erkranken, und die auf

1.3 Epidemiologie bertragbarer Krankheiten

63

natrliche Weise zwischen beiden bertragen werden knnen. Anthropozoonosen werden vom Menschen auf Wirbeltiere, Zooanthroponosen vom Wirbeltier auf den Menschen bertragen (Tab. 1.10). Die Aufnahme virulenter Mikroorganismen kann zu einer Infektion, d.h. zu deren Ansiedlung und Vermehrung fhren und damit zur biologischen Auseinandersetzung des Wirtsorganismus mit dem Erreger. Menschen und Tiere, welche Krankheitserreger aufgenommen haben, d.h. in oder an sich tragen, bezeichnet man als infiziert, Stoffe und Gegenstnde, die mit ihnen behaftet sind, als kontaminiert. Tierische Le-

bensmittel knnen infiziert oder kontaminiert sein, je nachdem, ob sie von infizierten Tieren stammen oder mit Krankheitserregern sekundr verunreinigt sind. Sekundre Infektionsquellen sind z.B. kontaminierte Gegenstnde oder infizierte Lebensmittel. Bieten sie Vermehrungsmglichkeiten (z.B. Milch), knnen sie zu Massenerkrankungen fhren. Bei manchen Infektionen ist das primre Erregerreservoir auerhalb von Mensch und Tier zu suchen (z.B. Legionellen in Warmwasserleitungen: Erde kann Sporen von Tetanus- und/oder Gasbrandbazillcn enthalten, die ber Wunden in den Krper gelangen).

Tab. 1.10 Beispiele von Zooanthroponosen und Vektor-bertragenen Infektionen


Erkrankung beim Menschen Erreger tierisches Reservoir Ektoparasiten als Vektor

bakterielle Infektionen
Campylobakteriose enterale Salmonellose Fleckfieber Leptospirosen Lyme-Borreliose Maltafieber, Morbus Bang Ornithose (Psittakose) Pest Q-Fieber Tularmie Yersiniose (enteral) Milzbrand thermophile Campylobacter spp. Salmonella enterica Rickettsia spp. Leptospira spp. Borrelia spp. Bruceila spp. Chlamydia psittaci Yersinia pestis Coxiella burnetii Francisella tularensis Geflgel, Schweine u.a. Rinder, Schweine, Geflgel u.a. Nagetiere Ratten, Hunde, Feldmuse u.v.a. Rotwild, Muse,Vgel u.v.a. Rinder, Schafe, Ziegen Papageien u.a. Vgel Ratten u.a. Nagetiere, Hunde Rinder, Schafe, Ziegen, Nagetiere Feldhasen u.a. Nagetiere u.v.a. Flhe Zecken Zecken u.a. Arthropoden _ Luse, Flhe, Milben Zecken -

Yersinia enterocolitica Schweine, Hunde, Katzen u.a. Rinder, Schweine, Schafe, Ziegen Bacillus anthracis

parasitre Infektionen
Chagas-Krankheit Echinokokkose Leishmaniasen Malaria Schlafkrankheit Toxoplasmose Trypanosoma cruzi Echinococcus spp. Leishmania spp. Plasmodium spp. Trypanosoma brucei Toxoplasma gondii Hunde, Katzen, Ratten u.v.a. Hunde, Fchse Hund, Nagetiere u.a. Affen Wildtiere, Rinder Schweine, Katzen u.v.a. Raubwanzen Phlebotomen Anopheles Clossina -

virale Infektionen
Frhsommer-Meningoenzephalitis Gelbfieber Tollwut FSME-Virus Celbfiebervirus Rabiesvirus Vgel, Rehe Affen Fchse u.a. Wildtiere, Hunde, Katzen Zecken Aedes u.a. Mckenarten _

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Allgemeine Infektionslehre

bertragungswege Die von Menschen und Tieren mit Krperflssigkeiten (Blut), mit Sekreten oder Exkreten ausgeschiedenen Erreger gelangen ber das kontaminierte Material direkt oder von der jeweiligen Austrittspforte (Mund, Nase, Haut, Schleimhaut, Wunden, After, Harnrhre) zur Eintrittspforte des Menschen. Eine direkte bertragung ist die Inokulation des Erregers durch den Bi blutsaugender Arthropoden. Die bertragungswege beeinflussen die Ausbreitung einer Infektionskrankheit ebenso wie die Infektionsquellen. Sowohl die direkte bertragung durch Kontakt von Mensch zu Mensch, von Tier zu Mensch oder von Tier zu Tier ist so bedeutsam wie indirekte Wege ber ein Infcktionsvehikel (z.B. kontaminierte Lebensmittel. Staubpartikel, Gebrauchsgegenstnde u.a.). Manche Erreger sind auf eine unmittelbare bertragung angewiesen, da sie in der Auenwelt nicht lange berlebensfhig sind (z.B. Gonokokken. Meningokokken, Immundefizienzviren u.a.). Eine vertikale bertragung erfolgt diaplazentar von der Mutter auf den Ften (z.B. Toxoplasmose, Syphilis, Listeriose, Rteln, Varizellen). Auf die iatrogene bertragung von Infektionen infolge rztlicher oder medizinischer Manahmen (z.B. unsterile Instrumente, Bluttransfusion) wird im Abschnitt Nosokomialinfektionen ausfhrlicher eingegangen.

Pathogenitt der Erreger Die Erreger tragen zum Ausbreitungsmuster einer Infektionskrankheit mit konstanten und variablen Eigenschaften bei. Diese lassen sich unter dem Begriff der Pathogenitt zusammenfassen, wobei zwischen obligat und fakultativ pathogenen Erregern unterschieden wird. Der Grad der Pathogenitt wird auch als Virulenz definiert. Weitere fr die Ausbreitung wichtige Erregereigenschaften sind Umweltresistenz und Wirtsadaptation. Gemeinsam mit den Pathogenittsfaktoren bestimmen sie die bertragbarkeit einer Infektionskrankheit, die Lokalisation der Eintrittspforten, die Ausbreitung der Erreger im Wirtsorganismus sowie ihre Ausscheidung. Es lassen sich daher kontagise (ansteckende; z.B. Varizellen) von nicht-kontagisen (nicht-ansteckenden; z.B. Borreliose) Infektionskrankheiten unterscheiden, wobei epidemiologische Vernderungen vom Wandel in der Virulenz eines spezifischen Erregers beeinflut werden.

Resistenz des Wirtsorganismus

Infektionsketten Sie bestimmen den Weg der epidemischen Ausbreitung von Infektionskrankheiten durch zufllige Ausbreitungsmuster, insbesondere bei sekundren Infektionsquellen und indirekten bertragungswegen, oder durch typische Grundmuster bei belebten Infektionsquellen. Sie lassen sich als homogen-homonome Infektketten klassifizieren (d.h. bertragung von Mensch zu Mensch, z.B. Influenzavirusgrippe), oder innerhalb einer Tierart als homogen-heteronome Infektketten zwischen zwei verschiedenen Wirtsspezies (Tier - Mensch, z.B. Tollwut), als heterogen-homonome Infektkette, bei der die Infektion auf verschiedenen Wegen auf nur eine Warmblterspezies bertragen wird (z.B. enterale Salmonellosen) oder als heterogen-heteronome Infektketten bei bertragung auf verschiedene Arten (z.B. Brucellose).

Der Wirtsorganismus hat dem Infektionserreger die natrliche Resistenz, und die erworbene Immunitt entgegenzusetzen. Die Empfnglichkeit (oder Disposition) des Wirts bezeichnet den Grad seiner Resistenz. Neben unspezifischen (natrlichen) Abwehrmechanismen (anatomische Barrieren, humorale und zellulre Faktoren) spielt die spezifische (erworbene) Abwehr unter Beteiligung des Immunsystems nicht nur bei der Ausbreitung, sondern auch fr die Prvention von Infektionskrankheiten eine wichtige Rolle. Genauso wie die Vernderungen von Erregereigenschaften beeinflut daher das Ausma der erworbenen Immunitt in einer Population das epidemiologische Geschehen, sei es durch berstehen einer klinisch inapparenten stillen Feiung'", einer manifesten Erkrankung oder aber aufgrund einer gezielten Immunprophylaxe (aktive Schutzimpfung). Darber hinaus knnen angeborene Merkmale der Wirtsdisposition gegenber speziellen Infektionen (erhhte Malariaresistenz bei Sichelzellanmie) oder Lebensalter die Krankheitsdisposition bestimmen (z.B. Haemophilus influenzae-Infektionen bei Kleinkindern, Pneumokokken-Pneumonien bei lteren Menschen).

1.3 Epidemiologie bertragbarer Krankheiten

65

Umweltfaktoren Die rtliche Disposition umfat die speziellen klimatischen und geographischen Verhltnisse, die Lebensbedingungen fr tierische Vektoren und menschliche bertrger, besonders aber die Lebensbedingungen innerhalb einer Bevlkerung, wie Bevlkerungsdichte, Lebensgewohnheiten und Gebruche, Wohnverhltnisse, die berufliche Exposition am Arbeitsplatz, Bevlkerungswanderung, Tourismus und Verkehr. Dazu gehren aber auch die soziokonomischen und soziomedizinischen Verhltnisse und der Ernhrungszustand innerhalb einer Population. Die Ausbreitung bertragbarer Infektionskrankheiten wird bestimmt durch das Zusammenwirken typischer Merkmale der Erreger und der Wirtsorganismen und Umweltfaktoren. Dabei fhren der Wandel der Erregervirulenz und/oder die Lebensbedingungen in der Umwelt zu epidemischen Verdichtungswellen. Hierbei kann es sich um gelegentliche oder um kontinuierliche, progrediente Ereignisse handeln; hufiger aber treten diese Verdichtungswellen mit einer jahreszeitlichen (saisonalen) oder ber Jahre verteilten Periodizitt (skularer Rhythmus) auf. Als typische Beispiele seien das epidemisch progredient verlaufende erworbene (engl. acquired") Immundefizienz Syndrom (AIDS), die saisonalen Influenza-Pandemien oder das skulare Auftreten der Diphtherie erwhnt. Der Sptsommer-Herbstgipfel bei enteralen Infektionen oder das Auftreten der Cholera in subtropischen und tropischen Entwicklungslndern sind weitere Beispiele fr klimatisch bedingte epidemische Infektionskrankheiten.

So verstarben etwa whrend der Pest des Thukydides" 429 v. Chr. im antiken Athen angeblich 50000 Personen (es handelte sich aber nicht um die Pest nach heutigem Verstndnis, sondern vermutlich um eine Fleckfieberepidemie) oder whrend der verheerenden Pockenepidemien im 18. und teilweise bis Anfang des 19. Jahrhunderts noch Hunderttausende von Menschen. Typhus und Diphtherie nehmen, wie bis vor kurzem auch die Tuberkulose, in Mitteleuropa an Hufigkeit ab. An ihre Stelle sind in den Industrielndern als typische Zivilisationsseuchen andere Infektionen getreten, wie die enteralen Infektionen oder die infektisen Hepatitiden. Obwohl man auch ihre bertragungswege inzwischen aufgeklrt hat, sind diese im Einzelfall hufig so komplex, da eine Verfolgung der Glieder innerhalb der Infektionskette kaum mglich ist.

Infektionsepidemiologie in Deutschland Betrachtet man die geschtzte Inzidenz aller Infektionskrankheiten, so stellen in Deutschland die akuten respiratorischen Erkrankungen mit mehr als 80% den berwiegenden Anteil dar. gefolgt von den endemischen bertragbaren Kinderkrankheiten Masern, Mumps, Windpocken, Rteln, Keuchhusten, Scharlach sowie von den Nosokomialinfektionen und Parasitosen. Die meldepflichtigen Infektionskrankheiten folgen mit kaum mehr als 300000 gemeldeten Fllen. Die relativen epidemiologischen Verhltnisse, von lokalen Besonderheiten abgesehen, sind weitgehend vergleichbar mit denen anderer Industrielnder. Unter den bis zum Inkrafttreten des Infektionsschutzgesetzes meldepflichtigen Infektionskrankheiten (Abb. 1.30) berwiegen nach der Anzahl der gemeldeten Flle die enteralen Salmonelloscn, die Gonorrhoe, die Tuberkulose und die Virushepatitiden. Bei den akuten Infektionskrankheiten, insbesondere den Lebensmittel-bedingten enteralen Infektionen und Intoxikationen, fhrt wegen der meist kurzen Krankheitsdauer und Selbstheilungstendenz eine den Umfang der gemeldeten Flle um ein vielfaches bersteigende Dunkelziffer weder zu einer diagnostischen Abklrung noch zur Meldung. hnliches mu fr die Geschlechtskrankheiten angenommen werden, insbesondere fr die nicht mehr meldepflichtige Gonorrhoe. Die seit 1980 nicht mehr meldepflichtigen Schar-

1.3.4 Spektrum der Infektionskrankheiten


Die bemerkenswerteste Tatsache in der Epidemiologie bertragbarer Infektionskrankheiten ist ihr Wandel in den Industrielndern innerhalb der vergangenen 150 Jahre. Er fllt zusammen mit der Aufklrung ihrer tiologie, mit der Verbesserung der Lebensbedingungen und der medizinischen Versorgung. Den historischen Seuchen lagen als primre Risikofaktoren die Empfnglichkeit weiter Bevlkerungsgruppen gepaart mit dem Auftreten virulenter Erreger zugrunde. Sie fhrten zu hohen Morbiditts- und Mortalittsraten. Heute bestimmen dagegen die vernderten Lebensgewohnheiten berwiegend das Bild epidemischer Infektionen.

66

Allgemeine Infektionslehre

Abb. 1.30 Die hufigsten meldepflichtigen bertragbaren Infektionskrankheiten in Deutschland; bis 1990 alte Bundeslnder, ab 1991 Gesamtdeutschland; rechte Ordinate: enterale Salmonellosen ab 1991 (Meldungen nach dem alten Bundesseuchengesetz bis 1998).

lacherkrankungen liegen einschlielich der neuen Bundeslnder vermutlich auch heute bei jhrlich mehr als 50000 Fllen. Parallel zum Rckgang der klassischen epidemischen Infektionskrankheiten in den Industriestaaten hat in noch strkerem Mae ihre Mortalitt abgenommen. Sie betrgt in den Industrienationen kaum mehr als 1 % aller Todesflle. Dies gilt besonders fr die Tuberkulose, aber auch fr andere Infektionskrankheiten. An Hufigkeit zugenommen haben dagegen die Ausbrche von Lebensmittel-bedingten Infektionen. Eine groe Herausforderung sind die neuen" bertragbaren Infektionskrankheiten. Als Beispiele seien die Hepatitis B und C und das erworbene Immundefizienz-Syndrom" (AIDS) genannt. Selbst wenn die jhrlichen Fallzahlen in den entwickelten Lndern bisher begrenzt bleiben, so stellt die Bekmpfung dieser Infektionskrankheiten weltweit ein zunehmend ungelstes Problem dar.

Infektionsepidemiologie in Entwicklungslndern Anders als in den Industrienationen sieht dagegen das Infektionsspektrum in den Entwicklungslndern aus, wo neben den in fast unvorstellbarem Ausma anzutreffenden parasitren Infektionen, den enteralen und respiratorischen Infektionen, nach wie vor Tuberkulose, Lepra, Cholera, Ruhr, Poliomyelitis, Meningitiden, um nur einige zu nennen, regelmig zu greren epidemischen Ausbrchen fhren oder aber endemisch etabliert sind. Die Situation der bertragbaren Infektionskrankheiten in den Entwicklungslndern wird im wesentlichen von fnf Faktoren bestimmt: 1. den soziokonomischen Umstnden, welche aufgrund des Miverhltnisses zwischen Bevlkerungswachstum und Nahrungsmittelproduktion denen im Europa vergangener Jahrhunderte vergleichbar ist

1.3 Epidemiologie bertragbarer Krankheiten

67

2. den soziokulturellen Eigenheiten, die z.T. eine wirksame Bekmpfung bertragbarer Krankheiten behindern 3. den soziomedizinischen Verhltnissen, durch den Mangel an zeitgemen medizinischen Einrichtungen sowie der traditionellen Inanspruchnahme von Medizinmnnern" 4. den klimatischen und geographischen Besonderheiten in tropischen und subtropischen Lndern, welche spezielle Vektoren oder Erreger begnstigen, anderen dagegen kein geeignetes Reservoir bieten

5. dem von den Industrielndern abweichenden Durchseuchungsgrad. Spektrum und Umfang der Infektionskrankheiten, Manifestationsalter und Empfnglichkeit unterscheiden sich daher z.T. erheblich von denen der Industrielnder, besonders der nrdlichen Hemisphre. Die Mortalitt betrgt mehr als 42%. Eine Schtzung weltweit hufiger Infektionskrankheiten findet sich in Tab. 1.11. Es sind jedoch nur fr solche Erkrankungen verlliche Zahlen erhltlich, die unter langfristige nationa-

Tab. 1.11 Jhrliche Inzidenz und Prvalenz der hufigsten bertragbaren Infektionskrankheiten (nach Meldungen bzw. Schtzungen derWHOfr 1997, World Health Report, 1998)

Erkrankung/Erreger - enterale Infektionen und Intoxikationen (akut, einschlielich Shigellosen, - Ascariasis - Hakenwurm-Erkrankungen (Ancylostoma/Necator) - Trichuriasis/Trematoden - Malaria - Infektionen der unteren Atemwege (akut) - Geschlechtskrankheiten Syphilis brige - Hepatitis B - Ambiasis - Pertussis - Masern - Filariasis - Tuberkulose - HIV/AIDS - Dengue (alle Formen) - Leishmaniasen (alle Formen) - Hepatitis C - Lepra - endemische Treponematosen - Chagas (amerik. Trypanosomiasis) - Poliomyelitis - Schistosomiasis (beide Formen) - Trachom - Onchocerciasis * langfristige Behinderung

Inzidenz (In Mio) 4000 1330 1250 > 1000 500 395 365 (12) (373) 67,7 48 45,1 31,1 8 7,3 5,8 3,1 2 1 0,6 0,5 0,3 0,04 -

Prvalenz (In Mio)

Vorkommen weltweit

250 151 85,5 _ 251 (28) (223) _ 119 16,3 30,6 12 170 1,2 2,6 18 10,6* 200 152

weltweit weltweit weltweit weltweit (Subtropen und Tropen) weltweit weltweit weltweit weltweit weltweit weltweit Subtropen, Tropen weltweit weltweit Subtropen, Tropen Afrika, Sdamerika weltweit westl. Pazifik, Sdostasien, stl. Mittelmeer, Afrika, Sdamerika Subtropen, Tropen Zentral- und Sdamerika weltweit Ostasien, naher Osten, Afrika, Sdamerika Naher Osten, Nordafrika, Nordindien trop. Afrika, Mittel- und Sdamerika

7,7

68

Allgemeine Infektionslehre

le oder internationale berwachungsprogramme der Weltgesundheitsorganisation (WHO) fallen und von den Mitgliedslndern gemeldet werden. Fr die zwlf hufigsten Infektionskrankheiten liegen dagegen nur unzuverlssige Zahlen zur Inzidenz bzw. zur Prvalenz vor. Zu ihnen zhlen vor allem parasitre Erkrankungen wie Askariasis, Ankylostomiasis, Trichuriasis, Ambenruhr, Lamblienruhr, Malaria, Schistosomiasis mit weltweit mehr als acht Milliarden Infizierten (d.h. mindestens ein Drittel der Weltbevlkerung ist mit mehr als einem parasitren Erreger infiziert). Unter den bakteriellen und viralen Infektionen stehen an erster Stelle die Geschlechtskrankheiten, Hepatitis B und C, Tuberkulose und die HIV-Infektion, allen voran aber die akuten enteralen Infektionen und Intoxikationen (s. Tab. 1.11), mit einer fr die Lnder der Dritten Welt allein bei Kindern unter fnf Jahren geschtzten Fallzahl von jhrlich 1 Milliarde Erkrankter. Von diesen versterben in der Folge ca. 4,5 Millionen. Eine vllig neue und erschreckende Dimension ergibt sich aus den gegenwrtigen Zahlen zur HIV-Infektion. Es wird geschtzt, da weltweit mehr als 35 Millionen Personen mit HIV infiziert sind, > 25 Millionen davon allein in Afrika (WHO, 2000). Erhebungen aus Ost- und Zentralafrika weisen Hufigkeiten bis zu 30% HIVInfizierter in stdtischen und 18% in lndlichen Gebieten aus. Diese Zahlen verdeutlichen, wo zuknftige epidemiologische Bekmpfungsmanahmen ihren Schwerpunkt finden mssen. Darber hinaus werden, bedingt durch die mit dem Luftverkehr weltweit zunehmende Mobilitt, knftig auch sogenannte exotische Infektionen hufiger ber groe Entfernungen transportiert werden und als eingeschleppte Infektionen in nicht endemischen Gebieten zu beobachten sein.

1.3.5 Nosokomialinfektionen
Als sogenannte Krankenhausinfektionen" oder korrekter Nosokomialinfektionen bezeichnet man die in einem zeitlichen, rumlichen und kausalen Zusammenhang mit einem Krankenhausaufenthalt aufgetretenen Infektionen. Diese Definition umfat nach heutigem Verstndnis auch Heime, Ambulanzen und Arztpraxen. Systemische oder lokale Symptome einer Infektion mssen dabei erkennbar sein. Eine klinische Erkrankung kann aber auch nach dem Kranken-

hausaufenthalt manifest werden (IfSG 2, 23; CDC Definitionen). Epidemische Nosokomialinfektionen mit dem gleichen Erregerstamm sind besonders gefrchtet. Die Hufigkeit von Nosokomialinfektionen wird in den USA auf 5,5% aller Krankenhausaufenthalte geschtzt, was einer Absolutzahl von ca. 2 x 106 Infektionen pro Jahr entsprechen wrde. Die Verhltnisse sind in Deutschland sicher vergleichbar, wobei mit 500000 bis 1 Million Nosokomialinfektionen pro Jahr zu rechnen ist. Die Erreger von Nosokomialinfektionen lassen sich in mindestens drei unterschiedliche Gruppen einteilen: 1. Virulente Erreger. Sie knnen auch auerhalb der Krankenhuser eine hohe Kontagiositt aufweisen und epidemisch verlaufen. Sie betreffen, nachdem sie in Krankenhuser eingeschleppt worden sind, Patienten und Personal gleichermaen. Reservoir sind bereits erkrankte Menschen, Inkubationsausscheider oder unbelebte Vehikel (z.B. Hustentrpfchen, Lebensmittel). Als berichtete Beispiele seien Influenzaviren, Hepatitisviren, oder Shigellen genannt. 2. Weniger virulente, fakultativ pathogene Erreger exogener Infektionen. Diese knnen direkt oder indirekt von kranken Patienten, von klinisch inapparent befallenen Patienten und gesunden Keimtrgern oder evtl. von einem unbelebten sekundren Reservoir in der Umgebung des Kranken ausgehen. Da berwiegend abwehrgeschwchte Patientengruppen erkranken, sind diese Erreger fr das Krankenhauspersonal selbst harmlos. Als Beispiele sind multiresistente gramnegative Bakterien, sogenannte ESBL (extendedspectrum-beta-lactamase")-produzierende Angehrige der Enterobacteriaceae (E.coli, Klebsieila spp., Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, u.a.), Vertreter der nichtfermentierenden gramnegativen Bakterien (Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter spp., u.a.) oder multiresistente Korynebakterien (C. jeikeium, u.a.), Nocardia spp., aber auch Zytomegaloviren, Pilze und viele andere Nosokomialerreger anzufhren. Eine besondere Rolle fllt zunehmend den multiresistenten, betalaktamaseproduzierenden und isoxazolylpenicillinresistenten Staphylococcus-aureus-Stmmen zu (sog. MRSA = Methicillin-resistente S. aureus). 3. Fakultativ pathogene Erreger der normalen

1.3 Epidemiologie bertragbarer Krankheiten

69

Oberflchenflora der Haut und Schleimhute

des Menschen. Diese fhren auf endogenem Wege zur Infektion, da ihr Reservoir primr im Patienten selbst liegt. Medizinische Eingriffe erfllen die Funktion einer Infektionsbahnung, z.B. Besiedlung von Kathetern, knstlichen Herzklappen u.a. Hierunter finden sich Koagulase-negative Staphylokokken (vor allem Staphylococcus epidermidis als wichtiger Erreger von Implantatinfcktionen, s. Kap. 11.12), ferner auch fakultativ aerobe und obligat anaerobe Vertreter der normalen Darmflora. Aus dieser Klassifizierung ergeben sich unterschiedliche Infektionsverlufe, wobei besonders in der ersten Gruppe epidemische Hufungen vorkommen. Voraussetzung fr die Einstufung gehufter Infektionen als zusammenhngende Nosokomialinfektionen ist ein bei allen Fllen einheitlicher Erregertyp. Es gengt in diesen Fllen nicht nur die Artdiagnose (z.B. Staphylococcus aureus), vielmehr mu eine Stammidentifizierung mit phnolypischen oder molekularen Methoden vorgenommen werden. Neben einer ungezielten Chemotherapie und der damit zusammenhngenden Verbreitung von Resistenzfaktoren sind als weitere Ursachen fr das vermehrte Auftreten von Nosokomialinfektionen die durch den medizinischen Fortschritt verursachte Zunahme resistenzgeminderter Patienten mit malignen Erkrankungen oder immunologisch bedingter Abwehrschwche, hheres Lebensalter der Patienten, Vernachlssigung Krankenhaus-hygienischer Mastbe, und die mit der fortschreitenden medizinischen Technologie komplexer gewordenen Eingriffe zu nennen. Die bertragungswege sind vielfltig und manchmal unerwartet, wenn neue medizinische Verfahren zur Anwendung gelangen. Als Risikofaktoren kommen auer der Besiedlung der Haut und der Schleimhute besonders invasive Eingriffe im perioperativen Umfeld, in der intensivmedizinischen, endoskopischen und intravasalen Diagnostik und Therapie in Frage. Gelegentlich werden kritische Punkte in der Infektionskeltc erst durch epidemische Ereignisse entdeckt. Als Beispiel lt sich hierzu aus einer Kinderklinik eine Serratia marcescens-Epidemie anfhren, die von einem Transportinkubator fr Frhgeborene ihren Ausgang nahm. Der Inkubator wurde von einem unabhngigen Hilfsdienst betrieben und bis zum Eintritt dieses Vorfalls bei den hausinternen Vorsorgemanahmen

gegenber Nosokomialinfektionen nicht bercksichtigt.

1.3.6 Verhtung und Bekmpfung bertragbarer Erkrankungen


Die Bekmpfung bertragbarer Infektionskrankheiten hat erst nach Entdeckung der wesentlichen Risikofaktoren und der spezifischen Erreger ihre heutige Effektivitt erlangen knnen, obwohl empirische Methoden (wie Variolation, Absonderung der an kontagisen Infektionen Erkrankten) lange zuvor erfolgreich angewandt wurden. Aus praktischen und methodischen Grnden werden die Manahmen zum Schutz gegen bertragbare Krankheiten in Vorbeugungsmanahmen und Manahmen zur Verhtung und

Bekmpfung unterteilt. Vorbeugungsmanahmen beruhen primr auf Schutzimpfungen (individuelle Dispositionsprophylaxe) whrend die Bekmpfung und die prospektive Verhtung auf der Expositionsprophylaxe beruhen. Expositionsprophylaxe Die Manahmen zur Expositionsprophylaxe werden in der Umwelt des Menschen wirksam. Zu diesen zhlen u.a.: Ausschaltung von Infektionsquellen und endemischen Herden, Unterbrechung der bertragungswege und Einschrnkung der bertragungsmglichkeiten. Als Beispiele lassen sich anfhren die Bekmpfung von Gesundheitsschdlingen, Manahmen zur Vernichtung des Lebensraumes von Ungeziefer bzw. Vektoren, Sanierung von Tierbcstnden, Raubwildbekmpfung; Erfassung und Betreuung von Ausscheidern; Sterilisation von Gegenstnden und Materialien, gezielte Desinfektion in bestimmten Bereichen; Erhaltung einer ununterbrochenen Khlkette beim Transport von leicht verderblichen Lebensmitteln, Pasteurisierung von Milch und Konservierung von Lebensmitteln; Hygienevorschriften fr Wschereien, Reinigungsanstalten, Wasch- und Duschrume, Saunaanlagen, Badeanstalten und ffentliche Toiletten; Schutzmanahmen der berwachung und Vorbeugung im nationalen und internationalen Reise- und Gterverkehr, z.B. Expositions- und Chemoprophylaxe zur Malariaverhtung.

70

Allgemeine Infektionslehre

Dispositionsprophylaxe Die individuelle Dispositionsprophylaxe durch Schutzimpfungen hat mehr zur Eliminierung einzelner bertragbarer Infektionskrankheiten beigetragen als die Verminderung zahlreicher Risikofaktoren in der Umwelt oder die Verbesserung der Lebensbedingungen. Beispiele sind die Ausrottung der Variola major, die sich auf die weltweit konsequent und gezielt durchgefhrte Pockenschutzimpfung zurckfhren lt, oder die Eliminierung der Poliomyelitis. Zu den bereits im Kindes- und Jugendalter durchzufhrenden Schutzimpfungen zhlen heute nach den Empfehlungen der Stndigen Impfkommission (STIKO) am Robert Koch Institut die Impfungen gegen Diphtherie, Tetanus, Pertussis (mit azellulrem Impfstoff), Poliomyelitis (inaktivierter Impfstoff), Haemophilus-influenzae-BInfektion, Hepatitis B, Masern, Mumps und Rteln. Der Rckgang der klassischen Seuchen ist jedoch nicht allein auf Schutzimpfungen zurckzufhren, da im Ablauf jeder Infektionskrankheit eigene Gesetzmigkeiten erkennbar sind. Ein Vergleich von drei Infektionskrankheiten im Verlauf von viereinhalb Jahrzehnten findet sich in Abb. 1.31. Whrend sich das eindrucksvolle Verschwinden der Poliomyelitis aus dem epidemiologischen Spektrum in Deutschland auf die Einfhrung der oralen Schutzimpfung zurckfhren lt, folgen die Erkrankungen an Meningokokken-Meningitis einem unregelmigen skularen Rhythmus. Schwieriger zu begrnden ist dagegen der Rckgang der Diphtherie. Zwei-

felsfrei hat dazu jedoch die seit Jahrzehnten durchgefhrte aktive Schutzimpfung einen wesentlichen Beitrag geleistet. Betrachtet man die Fortschritte durch die Entwicklung rekombinanter Impfstoffe, so wird deutlich, da auch fr die Zukunft die individuelle Resistenzsteigerung durch Schutzimpfungen von weitgehend allen Bevlkerungskreisen einen wesentlichen Bestandteil der Bekmpfung von Infektionskrankheiten bilden wird. Infektionsschutzgesetz und Tierseuchengesetz Eine wirksame Infektionsbekmpfung erfordert gesetzliche Vorgaben, welche die schutzwrdigen Belange der Allgemeinheit im Fall eines Seuchenausbruchs regeln, aber auch Interventionen im Bereich der Individualrechte ermglichen. Diese Voraussetzungen werden gegenwrtig durch das seit 01.01.2001 wirksame Infektionsschutzgesetz (Seuchenrechtsneuordnungsgesetz" SeuchRNeuG) erfllt, das das Bundesseuchengesetz (Gesetz zur Verhtung und Bekmpfung bertragbarer Krankheiten beim Menschen = BSeuchG) und das Gesetz zur Bekmpfung der Geschlechtskrankheiten abgelst hat. sowie das Tierseuchengesetz erfllt. Im Infektionsschutzgesetz sind der zu erfassende Personenkreis und die unter die gesetzliche Regelung fallenden Infektionserreger und Krankheiten definiert sowie die im Einzelfall zu treffenden Manahmen vorgeschrieben. Die Meldung hat fr bestimmte Infektionskrankheiten im Verdachtsfall, bei Erkrankung und/oder im Todes-

Abb. 1.31 Der Einflu von Bekmpfungsmanahmen, Umwelt- und Erregerfaktoren auf den Verlauf bertragbarer Infektionskrankheiten am Beispiel der Hufigkeit von Po2 liomyelitis (xiO ), Diphtherie 3 (x10 ) und MeningokokkenMeningitis in Deutschland 2 (xlO )(bis 1990 alte Bundeslnder, ab 1991 Gesamtdeutschland).

1.3 Epidemiologie bertragbarer Krankheiten

71

fall zu erfolgen, u.a. bei Botulismus, Diphtherie, nicht-hereditrer humaner spongioformer Enzephalopathie, akuter Virushepatitis, enterpathischem hmolytisch-urmisehem Syndrom, Masern, Meningokokken-Meningitis/Sepsis, Poliomyelitis, Tollwut. Eine grere Zahl weiterer Erreger bzw. Erkrankungen sind seit Inkrafttreten des Infektionsschutzgesetzes knftig von den diagnostischen Laboratorien bei akuten Erkrankungen zu melden. Zur Meldung verpflichtet sind rzte/Tierrzte, Krankenhuser, Untersuchungslaboratorien oder sonstige Personen mit verantwortlichen Aufgaben, die Kenntnis von einer der in den Gesetzen genannten Infektionen erhalten. Die Schutzmanahmen umfassen im wesentlichen die Verpflichtung zur Meldung an die berwachenden Institutionen (Gesundheitsmter, Lnderbehrden, das Robert Koch Institut in Berlin, ggf. Lnder- und Bundesgesundheitsminister) und die Ermittlungs- und Bekmpfungspflicht. Zu diesen zhlen u.a. die Untersuchung von Kontaktpersonen, Berufsverbot bzw. -einschrnkungen von Ausscheidern, die im Lebensmittelgewerbe ttig sind, oder Desinfektionsmanahmen zur Beseitigung von sekundren Infektionsquellen und bertragungswegen. Przisiert wurden ferner die Rechtsvorschriften zur Durchfhrung von Schutzimpfungen, Impfstoffen und Impfdokumentation (KSG 20, 21, 22). Die prophylaktischen Aufgaben der Gesundheitsorgane bei der Verhtung von Seuchen basieren in Grundzgen ebenfalls auf den gesetzlichen Regelungen. Sie erfordern die Erfassung der Morbiditts- und Mortalittsraten, deduktive Erhebungen ber Virulenzeigenschaften der Erreger und Risikofaktoren in Bevlkerung und Umwelt. Zu den vorbeugenden Vorschriften zhlen u.a. die Manahmen zur Verhtung einer Ausbreitung von bertragbaren Infektionskrankheiten (Untersuchungspflicht, Quarantne. Behandlungspflicht usw., Beseitigung und Desinfektion), die berwachung von potentiellen sekundren Infektionsquellen (z.B. Trinkwasser, Wasser in lebensmittelverarbeitenden Betrieben, Schwimm- und Badewasser, Abwasser), die Kontrolle und Bekmpfung von tierischen bertrgern und von Vektoren Die Zunahme von Nosokomialinf'ektionen hat ebenfalls die gesetzliche Regelung zu ihrer Verhinderung und Bekmpfung erforderlich gemacht ( 23, IfSG). Durch das Robert Koch Institut sind darber hinaus Empfehlungen und Richtlinien fr die Krankenhaushygiene und In-

fektionsprvention sowie zur Erfassung multiresistenter Infektionserreger herausgegeben worden. Die Empfehlungen befassen sich mit der rechtzeitigen Feststellung von Nosokomialinfektionen und Epidemien. Sie ergnzen und aktualisieren die Richtlinien fr die Erkennung, Verhtung und Bekmpfung von Krankenhausinfektionen des ehemaligen Bundesgesundheitsamtes, welche die funktioneilen und baulichen Einrichtungen und Anforderungen an die Ausstattung von Krankenhuser sowie den organisatorischen Ablauf des Krankenhausbetriebes regeln. Nach ihnen lassen sich die Krankenhausberciche ihrem Infektionsrisiko entsprechend einteilen. Ferner sind die krankenhaushygienischen Aufgaben des rztlichen und sonstigen medizinischen Personals definiert und die Einrichtung von Hygienebeauftragten und Hygienekommissionen festgelegt worden. Darber hinaus behandeln die Richtlinien die hygienischen Belange im Versorgungs- und technischen Bereich der Krankenhuser (Sterilisation und Desinfektion. Wscheentsorgung und Aufbereitung, Abfallbeseitigung, Klimaanlagen usw.), aber auch in Arztpraxen und sonstigen medizinischen Einrichtungen.

Literatur
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Mikrobiologische Diagnostik

2
95 97 97 98 98 99

2.1

Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial fr die mikrobiologische Diagnostik KLAUS PETER SCHAAL, JOACHIM KHN Transportgefe Transportmedien und -Systeme Gewinnung und Handhabung verschiedener menschlicher Untersuchungsmaterialien Probenzustellung zum Laboratorium Umgang mit infektisem Material EDELTRUD DIETLEIN, MARTIN EXNER Einflufaktoren der Keimabttung

74 74 75 75 84 87 87

2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3

Sterilisation berprfung der Desinfektion und Sterilisation Desinfektion und Sterilisation beim CREUTZFELDT-JAKOB(CJ)Erreger Schlubemerkung Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren KLAUS PETER SCHAAL, JOACHIM KHN Mikrobiologische Untersuchungsverfahren Serologische Untersuchungsverfahren Schnellverfahren zur Diagnose von Infektionskrankheiten Molekularbiologische Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik

2.1.1 2.1.2 2.1.3

2.1.4 2.2

122 136

2.2.1

2.2.2 Indikation Desinfektion Sterilisation 2.2.3 Desinfektion

88 88

2.3.4

139

74

Mikrobiologische Diagnostik

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial fr die mikrobiologische Diagnostik


KLAUS PETER SCHAAL, JOACHIM KHN Einleitung

nisatorischer Abstimmung mit dem Mikrobiologen treffen.

2.1.1 Transportgefe
Gefe zur Aufnahme von Untersuchungsproben fr die Diagnostik von Infektionskrankheiten mssen eine Reihe obligatorischer Anforderungen erfllen, um bei ihrer Benutzung weder die Aussagekraft der Befunde zu beeintrchtigen noch unbeteiligte Personen zu gefhrden. Wichtigste Voraussetzung ist ihre Sterilitt. Sterile Transportgefe sollten auch zur Einsendung von Blut oder Serum fr serologische Zwecke verwendet werden, da besonders bei hohen Umgebungstemperaturen bakterielle Kontaminationen zu Zersetzungserscheinungen fhren knnen, die serologische Reaktionen stren. Weiterhin sind chemische Reinheit und Korrosionsbestndigkeit unerllich, um unkalkulierbare chemische Einflsse auf den Inhalt (Desinfektionswirkung, antikomplementre Wirkung) auszuschlieen. Zur Verhtung von Laboratoriumsinfektionen und zum Schutz unbeteiligter Personen whrend des Transports mssen die Transportgefe sicher, das heit fliissigkeitsdicht und verschliebar sein. Auerdem sollten Form und Fassungsvermgen dem vorgesehenen Verwendungszweck mglichst gut entsprechen. Die mikrobiologischen Untersuchungsstellen geben blicherweise auf Anforderung einen Satz geeigneter Transportgefe - heute in der Regel aus Kunststoff mit Schraubverschlu - ab. die alle genannten Anforderungen erfllen (Abb. 2.1a-d). In Deutschland werden traditionsgem vier verschiedene, vor der Abgabe sterilisierte Geftypen verwendet: 1. einfache Rhrchen mit Schraubverschlu und einem Fassungsvermgen von 5-10 ml fr flssige
Untersuchungsstoffe (Liquor, Punklate, Blut, Urin) 2. Rhrchen gleicher Abmessung, an deren Deckel ein Lffelchen aus Metall oder Kunststoff befestigt ist, fr Stuhlproben 3. weitlumigere Rhrchen (10-15 ml Inhalt) fr Sputum 4. Abstrichtupfer in 12-15 cm langen Rhrchen, deren Stiel ebenfalls am Schraubverschlu befestigt ist. Stieltupfer aus weichem Metall lassen sich leicht unter sterilen Kautelen abwinkein, um Abstriche an schwer zugnglichen Stellen (z.B. Rachenmandel) vornehmen zu knnen; solche aus Holz knnen im unteren Drittel abgebrochen werden, um ohne Kontaminalionsgeiahr in Kultur- oder Transportmedien eingebracht zu werden.

Der diagnostische Aussagewert mikrobiologischer und serologischer Untersuchungsergebnisse wird nicht nur durch den jeweiligen Leistungsstand der Laboratoriumstechnik, sondern hufig in viel mageblicherer Weise von der Beschaffenheit des Materials beeinflut, das dem Mikrobiologen fr die Durchfhrung seiner Untersuchungen zur Verfgung gestellt wird. Denn auch eine organisatorisch und methodisch optimale Arbeit des Laboratoriums vermag Fehler bei der Auswahl des richtigen Untersuchungsstoffes, bei der Probenentnahme, bei der Bestimmung des Enlnahmezeitpunktes und beim Probentransport nur unvollkommen oder gar nicht auszugleichen. Der behandelnde Arzt sollte deshalb alle Manahmen im Vorfeld der mikrobiologischen Diagnostik in enger Zusammenarbeit und nach mglichst detaillierter orga-

Abb. 2.1 Transportgefe fr mikrobiologische


Untersucnungsmaterialien. a) Rhrchen fr flssige Untersuchungsmaterialien (Blut fr serologische Untersuchungen); b) Stuhlrhrchen; c) Abstrichtupfer; d) Sputumrhrchen.

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial

75

2.1.2 Transportmedien und -Systeme (Verschiedene Transportmedien in guter Qualitt sind im Handel erhltlich.) Einige Krankheitserreger des Menschen sind so eng an ihren Wirt angepat, da sie in der Auenwelt rasch absterben. Um solche Erreger trotzdem zur tiologischen Diagnostik zuverlssig anzchten zu knnen, mu man sie entweder unmittelbar vom Kranken in geeignete Nhrmedien einbringen oder whrend des Transports durch spezielle Manahmen lebens- und vermehrungsfhig halten. Andererseits knnen sich Kontaminantcn zwischen Entnahme und Verarbeitung erheblich im Untersuchungsmaterial vermehren, wodurch die mikrobiologische Untersuchung selbst und die Beurteilung ihrer Ergebnisse oft wesentlich erschwert werden. Zur Umgehung dieser Schwierigkeiten werden Transportmedien in geeigneten Gefen eingesetzt, die speziell an die jeweiligen Untersuchungsziele angepat sind. Nach ihrer Zusammensetzung und Handhabung lassen sich fr die Bakteriologie und Mykologie vier Haupttypen unterscheiden: 1. Flssige, meist reichhaltige Nhrlsungen (in der Regel in Flaschen), in denen schon whrend des Transports eine Mikrobenvermehrung stattfinden kann und die durch ihren Verdnnungseffekt strende Nachwirkungen von antimikrobiellen Substanzen oder zellulren und humoralen Abwehrmechanismen ausschalten (z.B. Blutkulturflaschen, s. Kap. 2.1.3). Ihr Nachteil ist die Anflligkeit fr sekundre Verunreinigungen", die zu Fehldiagnosen Anla geben knnen. Diese Medien sollten whrend des Transports bei Umgebungstemperatur gehalten oder, wenn die berstellung an das Laboratorium nur mit Verzgerung erfolgen kann, eventuell auch bei 361 C vorbebrtet werden. 2. Selektive Transport- und Kulturmedien (in Flaschen oder Reagenzglsern), welche den gesuchten Erregern gute Vermehrungsbedingungen bieten und gleichzeitig ihre berwucherung durch Mikroben aus der Umwelt oder von den Krperoberflchen unterdrcken sollen (z.B. Transgrow-Medium). Auch diese Medien sollten schnellstens bei Umgebungstemperatur transportiert oder nach der Beimpfung bei 361C gehalten werden. 3. Selektive und nicht-selektive Agarmedien (auf speziellen Trgern in sterilen Gefen), die quantitative Rckschlsse auf die Mikro-

benkonzentrationen im Ausgangsmaterial erlauben, sofern ihre Beimpfung standardisiert wird (z.B. Objekttrgerkultur). Objekttrgerkulluren knnen am Entnahmeort bebrtet werden; nur die bewachsenen Medien werden dann bei Umgebungstemperatur zur weiteren Bearbeitung an das untersuchende Laboratorium geschickt. Alternativ kann die beimpfte Objekttrgerkultur ohne Vorbebrtung versandt werden. 4. Medien ohne Nhrstoff- und Energiequellen (in Flschchen, Reagenzglsern oder Kunststoffrhrchen), die schdliche Milieuvernderungen (pH-Verschiebungen, Sauerstoffzutritt) verhindern oder verzgern knnen (z.B. STUART-Medium. CARY-BLAIR-Medium). Diese Medien knnen bei Umgebungstemperatur oder gekhlt transportiert werden. Manche Anaerobier sind allerdings klteempfindlich. Auch in der Virologie hat sich zur Anzucht umweltlabiler viraler Erreger der Einsatz spezieller Transportmedien bewhrt. Diese enthalten neben Puffersubstanzen Proteine (Gelatine, Rinderserumalbumin) als Schutzkolloide" sowie Antibiotika bzw. Antimykotika. Sie sind fr die Aufnahme und den Transport von Tupferabstrichen, Blschenflssigkeiten, Exsudaten. Splflssigkeiten und Biopsaten geeignet. Fr die parasitologische Diagnostik, bei der es berwiegend um den mikroskopischen Nachweis der diagnostischen Stadien der Parasiten geht, spielen Transportmedien keine nennenswerte Rolle. In den Fllen, in denen die diagnostische Kultur von Parasiten (etwa von Trichomonas vaginalis) mglich und sinnvoll ist, ergibt die unmittelbare Vcrimpfung des frischen Untcrsuchungsmaterials die besten Ergebnisse.

2.1.3 Gewinnung und Handhabung verschiedener menschlicher Untersuchungsmaterialien


Die Qualitt menschlichen Untersuchungsmaterials hngt einerseits ab von seiner Art, Beschaffenheit und Menge sowie dem Ort, dem Zeitpunkt und der Technik seiner Entnahme, andererseits von der Geschwindigkeit und den Umstnden seines Transports zum untersuchenden Laboratorium. Die optimale Art des Untersuchungsstoffes. Sie wird durch die Lokalisation des Infektionsherdes, die Form der vorliegenden Entzndungsvorgnge sowie die Gewinnungsmglichkeiten

76

Mikrobiologische Diagnostik

bestimmt. Wenn irgend mglich und dem Patienten zumutbar, sollten Verunreinigungen der Untersuchungsmaterialien durch die krpereigene Haut- oder Schleimhautoberflchenflora vermieden werden, da die Anwesenheit fakultativ pathogener Vertreter der Normalflora nahezu unausweichlich zu Interpretationsschwierigkeiten fhrt. Die entnommene Materialmenge sollte ausreichend gro sein, um falsch-negative Befunde zu vermeiden. Tupferabstriche aus Hohlrumen, aus denen unmittelbar vorher grere Eiter- oder Exsudatmengen entleert wurden, sind grundstzlich als inadquat zu bewerten. Der Entnahmeort. Er sollte mglichst immer an der Stelle oder in der Region des Krpers liegen, wo das Infektionsgeschehen auch tatschlich abluft.
Leider ist der primre Infektionsherd aber nicht immer bekannt oder liegt in inneren Organen, die ohne eingreifende operative Manahmen nicht erreichbar sind. In diesen Fllen mu man sich gegebenenfalls mit Materialien begngen, in die die Erreger erfahrungsgem vom Parenchymherd aus bertreten oder ber die sie ausgeschieden werden und die technisch einfach und gefahrlos zu gewinnen sind. Man mu sich dabei aber vergegenwrtigen, da dieses Vorgehen hufig nur indirekte Rckschlsse auf die pathogenetischen Vorgnge im betroffenen Organsystem erlaubt und deshalb zu diagnostischen Fehlschlssen fhren kann, insbesondere wenn es sich um Ex- oder Sekrete handelt, die per vius naturelles ausgeschieden werden. Deshalb lassen sich in manchen Fllen eingreifende Entnahmctcchnikcn nicht umgehen, wenn eine eindeutige diagnostische Aussage erzielt werden soll. Dies gilt z.B. fr die transtracheale Sekretaspiration oder die transthorakalc Lungenpunktion bei Verdacht auf pulmonale Anaerobierinfektion, die perkutane Nadelbiopsie zur Diagnostik tief gelegener Abszesse oder die suprapubische Blasenpunktion zur exakten Diagnose von Harnwegsinfektionen.

serung, kann auch einmal eine Untersuchung unter der antibiotischen Behandlung sinnvoll sein. Allerdings mu dann der Mikrobiologe ber Art und Dosierung der angewandten Pharmaka ausreichend informiert werden. Akute virale Erkrankungen. In diesem Fall sind Proben fr den Virusnachweis mglichst in der Frhphase der klinischen Erscheinungen zu entnehmen. Im Gegensatz zu Bakteriologie und Mykologie haben in der virologischen Diagnostik Tupferabstriche (Nasen-, Konjunktival-, Mundschleimhaut-, Rachenabstriche) sowie Splflssigkeiten und Gurgelwasser groe praktische Bedeutung. Parasitologischen Diagnostik. Dabei ist fr die Auswahl geeigneter Untersuchungsstoffe auch noch die Entwicklung des Parasiten im menschlichen Wirt (Mensch als End- und/oder Zwischenwirt) mit Ort und Zeitpunkt des Auftretens diagnostischer Stadien zu bercksichtigen. Auerdem werden z.T. spezielle Materialien (z.B. Hautstanzen) oder Entnahmeverfahren (z.B. Klebestreifenabklatsch von Analregion) bentigt. Die wichtigsten Gesichtspunkte und Fehlerquellen, die bei der Gewinnung und Handhabung der verschiedenen Materialarten im einzelnen zu bercksichtigen sind, werden im folgenden kurz dargestellt. Biopsie-, Operations- und Sektionsmaterial Operations- und Biopsiematerial. Ganze Organe, Organteile oder mehrere Gewebeproben aus verschiedenen Organbezirken, die intra vitam unter aseptischen Bedingungen erhalten werden knnen, werden zur Vermeidung akzidenteller Verunreinigungen unverzglich in sterile Gefe (bei kleineren Gewebsproben in eines der genannten Transportgefe, bei Organen oder greren Organteilen in sterile Weithalsflaschen oder sterile Plastikbeutel) gegeben und ohne Zustze gut verschlossen und mglichst rasch (autolytische Vernderungen!) zur Untersuchungsstelle gebracht. Fr lngeren Transport ist eine Khlung mit Eiswrfeln empfehlenswert. Sehr kleine Gewebsproben sollten durch Zugabe von einigen Tropfen steriler Kochsalzlsung feucht gehalten werden oder auf die Oberflche eines STUART-Transportmediums (in Rhrchen mit Schraubverschlu) aufgebracht werden (Tab. 2.1). Sektionsmaterial. Die Probenentnahme sollte in jedem Falle bald nach Todeseintritt erfolgen

Der optimale Entnahmezeitpunkt. Er ist fr verschiedene Untersuchungsstoffe in Abhngigkeit von der vorhandenen Erregerart (siehe z.B. Typhus abdominalis) zum Teil recht unterschiedlich und kann deshalb nicht generell oder schematisch festgelegt werden. Jede Erstentnahme, gerade bei hochakuten Krankheitsbildern, sollte jedoch unbedingt vor Beginn einer antimikrobiellen Chemotherapie erfolgen, um falsch-negative Kulturergebnisse zu vermeiden. Dadurch darf natrlich die vielleicht lebensrettende Sofortbehandlung nicht verzgert werden, mit der unmittelbar nach der Materialentnahme begonnen werden kann. Nur in bestimmten Fllen, etwa zur Kontrolle der Wirksamkeit eines Therapeutikums oder bei Ausbleiben jeglicher Bes-

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial

77

Tab. 2.1 Transportbedingungen fr verschiedene menschliche Untersuchungsmaterialien Transportmedien/ -verfahren keine (nativ) + 4 C

Transporttemperatur + 25 C (Umgebungstemperatur) Liquor (auf Bakterien), Synovialflssigkeit

Sektionsmaterial, Bronchialsplflssigkeit, Katheterspitzen, Liquor (auf Viren), Lungenbiopsat, Perikardergu, Sputum, Urin

anaerober Transport oder anaerobes Transportmedium

Exsudate aus Bauchhhle, Amnionflssigkeit, Punktate, Galle, IUP auf Aktinomyzeten, transthorakale und transtracheale Aspirate, Plazenta, Nebenhhlenaspirate, Gewebe, Blasenpunktionsurin Hornhautgeschabsel, Blutkulturen, Material zum Nachweis von . pertussis, Material zum Nachweis von N. gonorrhoeae, Augenkammerwasser Verbrennungswunden-iopsate, Rektalabstriche auf Campylobacter spp., Shigella spp., Vibrio spp., Yersinia spp., Abstriche bei Otitis externa Knochenmark, Material zum Nachweis von Bordetella spp., Zervixabstriche, Bindehautabstriche, Material zum Nachweis von Corynebacterium spp., Innenohrabstriche, Material aus Genitaltrakt, Nasopharynx und oberem Respirationstrakt, Material zum Nachweis von Neisseria spp. oder Salmonella spp.

unmittelbare Beimpfung von Kulturmedien aerobe Transport2 medien

1 2

modifiziert nach MILLER und HOLMES, 1999; z.B. StuART-Medium, AMIES-Medium, CARY-uiR-Medium

(kritischer Zeitraum etwa 6 Stunden), da es spter zu einer Ausbreitung von Zersetzungsbakterien aus dem Verdauungstrakt des Toten kommt. Um trotz der groen Kontaminationsgefahr bei der Sektion zu brauchbaren Untersuchungsergebnissen zu kommen, knnen zwei Wege zur Materialgewinnung beschritten werden: 1. Man verzichtet auf jede Dekontamination am Sektionstisch, entnimmt ein greres (wenigstens 2 x 2 x 2 cm) zusammenhngendes Gewebestck, khlt sofort auf 0 bis +4 C und lt die Probe ohne Unterbrechung der Khlkette durch Boten dem Laboratorium berstellen. Es obliegt dann dem Mikrobiologen, unter besonderen Vorkehrungen nicht verunreinigtes Gewebe aus dem Zentrum des Stckes herauszuprparieren. 2. Man versucht durch Abbrennen, Abglhen oder kurzes Eintauchen (einige Sekunden) in kochendes Wasser eine Desinfektion der Organoberflche zu erreichen, exzidiert dann unter mehrfachem Wechsel steriler Instru-

mente mehrere kleinere Gewebsstcke aus dem Zentrum und handhabt die Probe anschlieend wie bioptisch gewonnenes Material (s. Tab. 2.1). Blut und Sternalmark Blutkulturen. Da die Erreger von septischen oder zyklischen (polysystemischen) bakteriellen oder pilzlichen Infektionskrankheiten hufig nur in geringer Zahl und/oder intermittierend in die Blutbahn ausgeschwemmt werden, darf das Volumen der einzelnen Blutprobe nicht zu klein sein (beim Erwachsenen 10-20 ml), bei Kindern 1-10 ml, und es sind mehrere (3 in 24 Stunden), zu verschiedenen Zeitpunkten und eventuell an verschiedenen Orten entnommene Proben zu untersuchen, um die Erreger sicher aufzufinden. Als gnstigster Entnahmezeitpunkt gilt der Beginn eines Fieberanstiegs. Da er aber oft nicht bestimmbar ist, verpat wird oder die Mikrobeneinschwemmung in die Blutbahn dem Fieberanstieg deutlich vorausgehen kann, hat sich, ins-

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Mikrobiologische Diagnostik

besondere nach amerikanischen Erfahrungen, folgendes Vorgehen bewhrt: Bei Patienten mit Verdacht auf akute bakterielle Endokarditis reichen in der Regel 3 separate Blutproben zur Sicherung der Diagnose aus, die innerhalb von 1-2 Stunden an 3 verschiedenen Stellen abgenommen werden. Zur Diagnose der subakuten Endokarditis werden 3 Proben im Abstand von wenigstens 15 Minuten entnommen. Bleiben diese nach 24stndiger Bebrtung negativ, werden weitere 3 Proben untersucht. Bei akuter Sepsis werden 3 Blutproben von 3 verschiedenen Enlnahmcstellen innerhalb von 10 Minuten gewonnen. Wurde der Patient bereits antibiotisch behandelt, sind hufig 4 bis 6 separat entnommene Blutproben erforderlich, um den Erreger doch noch aufzufinden. Bleibt Venenblut trotz klinischer Sepsiszeichen in der Kultur wiederholt steril, gelingt die Anzchtung der Erreger manchmal noch aus arteriellem Blut oder Sternalpunktat. Zur tiologischen Abklrung von Fieber unklarer Ursache" werden 3 Proben von verschiedenen Entnahmestellen im Abstand von wenigstens einer Stunde entnommen; bei negativem Kulturergebnis nach 24 Stunden werden weitere 3 oder mehr Proben bentigt. Hufiger als allgemein angenommen kommt es bei der Gewinnung von Blutproben zu sekundren Verunreinigungen". Diese lassen sich nur durch streng aseptisches Arbeiten vermeiden. Dazu gehren die zuverlssige, zweiphasige Hautdesinfektion an der Punktionsstelle (erst Anwendung von Alkoholen, dann von Jodtinktur, PVP-Jod oder Jodcrsatzmitteln mit jeweils ausreichender Einwirkungszeit), die sorgfltige chirurgische Hndedesinfektion des Entnehmenden oder der Gebrauch steriler Handschuhe, die Vermeidung unntiger Manipulationen (z.B. Umfllen des Blutes) nach der Entnahme und die Verwendung sterilen Instrumentariums. Um ein ungewolltes Absterben der Erreger whrend des Transportes zu verhindern (bei generell empfindlichen Mikroben, durch Antibiotika-Nachwirkung oder Blutbakterizidie). sind heute spezielle Transportmedien, die sogenannten Blutkulturflaschen, unerllich. Diese enthalten zumeist Liquoid (Na-Polyanetholsulfonat, das die Blutbakterizidie hemmt, manche Antibiotika in ihrer Wirkung abschwcht und Blut ungerinnbar macht) und eine hochwertige Nhrlsung. Sie bewirken gleichzeitig eine Verdnnung und Hemmung bakterienschdigender Faktoren im Blut, wenn das Verhltnis von Blut

zu Nhrmedium in der Grenordnung von 1:10 liegt. Im Laboratorium dienen diese Blutkulturflaschen unmittelbar zur Primrkultur. Die im Handel erhltlichen Systeme (z.B. der Firmen Becton Dickinson, Biotest, Organon Teknika) sind in der Regel evakuiert, so da sie mit einem sterilen Entnahmebesteck direkt beschickt werden knnen. Verhindert man Luftzutritt bei der Fllung, lassen sich mit ihnen Anaerobier recht zuverlssig nachweisen, wenn die Kulturflssigkeit, wie meist der Fall, ausreichende Qualitt besitzt und unter CDs abgefllt wurde. Es gibt aber auch spezielle Medien fr Anaerobier, die auf Na-Polyanetholsulfonat verzichten, da es das Wachstum von Peptostreptocoecus anaerobius hemmt, und die gegebenenfalls Organstckchen analog der TAROZZI- oder RosnNOw-Bouillon enthalten. Zur Anzchtung obligater Aerobier mssen evakuierte Flaschen nach der Blutzugabe ber ein bakteriendichtes Filter mit Luft geflutet werden. blicherweise werden pro Entnahme je eine aerobe und eine anaerobe Flasche beschickt; die oben genannten Zahlen beziehen sich jeweils auf ein solches Prchen als Probe". Neuerdings wird von einigen amerikanischen Autoren aber empfohlen, eine zweite aerobe oder eine mit einem Pilznhrmedium gefllte Flasche anstelle der anaeroben zur Erzielung einer optimalen diagnostischen Aussage zu verwenden. Einige moderne kommerzielle Blutkultursysteme enthalten zustzlich Harze, die Antibiotika binden sollen
und deshalb auch bei bereits eingeleiteter Chemotherapie noch brauchbare Kulturergebnisse liefern knnen. Zur Beschleunigung und konomisicrung der Blutkulturdiagnostik werden heute berwiegend Blutkulturautomaten verwendet, in denen die Bebrtung der Flaschen erfolgt und die mikrobielles Wachstum frhzeitig. z.B. an vermehrt freigesetztem CO2 oder an pH-Verschiebungen des Mediums, erkennen und dies auch akustisch und optisch anzeigen.

Blutkulturflaschen sind auch als Transport- und Zchtungsmedien fr andere flssige Untersuchungsmaterialien, insbesondere Sternalpunktate und Knochenmarkstanzen bei Verdacht auf Brucellose oder generalisierende Pilzinfektion, geeignet, wenn es um den Nachweis sehr empfindlicher Erregerarten geht und wenn eine Quantifizierung der Mikroben nicht erforderlich ist. Auch bei Verdacht auf Sepsis durch schnell wachsende Mykobakterien oder Nocardien sollten Blutkulturflaschen beimpft werden. Leishmania donovani, Trypanosomen und Plasmodien werden dagegen in gefrbten Ausstrichprparaten von Sternalpunktat nachgewiesen.

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial

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Der Transport der Blutproben sollte, schon wegen der Gefhrlichkeit septischer oder zyklischer Infektionskrankheiten, grundstzlich so schnell wie mglich vorgenommen werden. Wenn lngere Zeiten zwischen Entnahme und Verarbeitung unvermeidbar sind, werden Blutkulturflaschen schon am Entnahmeort bei 361 C vorbebrtet (bei den Verfahren mit COyNachweis nicht so gnstig), um das Kulturergebnis zu beschleunigen. Aber auch Umgebungstemperatur fhrt in den meisten Fllen nicht zum Absterben der Erreger (s. Tab. 2.1). Blut zum Antikrpernachweis. Fr serologische Untersuchungen wird in der Regel Venenblut in einer Menge von 5 bis 8 ml bentigt, das ohne Zustze nativ in ein steriles Blutrhrchen" (Abb. 2.1a) gefllt wird. Entnahme und Transport sind meist nicht kritisch. Nur bei hohen und sehr niedrigen (Frost) Auentemperaturen ist es zur Vermeidung von Hmolysevorgngen gnstiger, das Serum unter sterilen Bedingungen abzutrennen und dem Laboratorium allein zuzustellen. Liegt der Verdacht auf eine akute Erkrankung vor, sollte eine Serumprobe mglichst bald nach Krankheitsbeginn und eine weitere 10-14 Tage spter entnommen werden, um Bildung und Anstieg spezifischer Antikrper zuverlssig erfassen zu knnen. Ist das Vorliegen von Strfaktoren bekannt, die hufig zu Verflschungen der Ergebnisse serologischer Tests fhren, sollte die Untersuchungsanforderung Hinweise darauf enthalten. Strungen serologischer Teste (z.B. falsch-positive Ergebnisse) knnen auftreten bei Gammopathien, dem Vorhandensein von Klteagglutininen, Kryoglobulinen, Rheumafaktoren und Autoantikrpern sowie nach Gabe von Immunglobulinprparaten, aber auch nach Transfusionen und Verabreichung grerer Mengen von Blutprodukten. Katheterspitzen. Vor allem bei Verdacht auf kathelerassoziierte Sepsis (z.B. durch Staphylococcus epidermidis) ist es sinnvoll, die Spitze des nach Desinfektion der Insertionsstellc gezogenen Katheters (4-6 cm) abzuschneiden und in einem sterilen Gef zum Laboratorium zu bringen (s. Tab. 2.1).
Andere Krperflssigkeiten

und Gramfrbung), die oft eine Schnelldiagnose und allein eine sofortige Beurteilung des Zellbefundes erlauben. Da mit sehr empfindlichen Erregern zu rechnen ist, mu der Transport des nativen restlichen Liquors (in einem gut verschlossenen Gef) rasch erfolgen, wenn die Kultur sichere Ergebnisse erbringen soll. Bei Verdacht auf bakterielle Meningitis wird die Probe bei Raum-(LJmgebungs-)Temperatur gehalten; sie sollte keinesfalls gekhlt werden. Eine parallel gewonnene Blutkultur kann die diagnostische Aussage zuweilen erheblich verbessern oder beschleunigen (s. Tab. 2.1). Lngere Transportzeiten berstehen empfindliche Meningitis-Erreger zuweilen besser, wenn das Material in nicht zu geringer Menge in eine Blutkulturflasche gegeben wird. Allerdings sind konventionelle Blutkulturmedien fr einige der besonders anspruchsvollen, bakteriellen Meningitiserreger nur bedingt brauchbar. Bei Verdacht auf Meningitis luberculosa kommt dieses Vorgehen berhaupt nicht in Betracht. Zum Nachweis von Protozoen (Toxoplasmen, Amben) und Viren sind ebenfalls besondere Gesichtspunkte zu beachten. Parasiten und Anaerobier lassen sich eher aus Abszeaspirat oder Biopsieproben nachweisen als aus Liquor. Gerade nach lngerer Transportdauer oder bei Proben, die nach Antibiotikagaben abgenommen wurden, kommt dem Antigennachweis groe praktische Bedeutung zu. Wird eine Liquorprobe zum Nachweis erregerspezifischer Antikrper entnommen, sollte stets parallel eine Blut- bzw. Serumprobe gewonnen werden. Pleura-, Perikardial-, Peritoneal- und Synovialtlssigkeiten. Fr diese Materialien gelten grundstzlich dieselben Gesichtspunkte wie fr Liquorproben. Vor allem bei Peritoneal- oder Pleurapunktaten sollte aber beachtet werden, da hier Anaerobierinfektionen zu erwarten sind (ftider Geruch!), die nach speziellen Transportverfahren verlangen (s. Tab. 2.1).
Eiter und Wundsekrete

Liquor. Von dem durch Lumbai- oder Subokzipitalpunktion unter sterilen Kautelen aspirierten Liquor sollte eine Portion sogleich nach der Gewinnung zentrifugiert werden; aus dem Sediment fertigt man zwei Prparate. (Methylenblau-

Eiter aus geschlossenen Prozessen. Bei geschlossenen Einschmelzungsherden sollte die Materialgewinnung, wenn irgend mglich, vor der therapeutischen Inzision durch Punktion und Aspiration mit einer Spritze unter aseptischen Bedingungen erfolgen. Bei schleimhautnahen Prozessen versuche man ebenfalls, den Herd von der ueren Haut aus zu erreichen, da

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Mikrobiologische Diagnostik

es bei Punktionen durch die Mukosa fast immer zu einer massiven Einschleppung von Mikroben der Schleimhautflora kommt, die das Ergebnis der Untersuchung verflschen kann.
Besteht kein Verdacht auf Anaerobierbeteili-

gung, wird eine nicht zu kleine Portion des Eiters in ein steriles Rhrchen gefllt und so zur Untersuchung wcitergeleitet. bliche aerob wachsende Eitererreger berstehen meist auch verlngerte Transportzeiten relativ gut. Anaerobier sind vor allem bei Eiterungen zu erwarten, die vom Verdauungskanal und vom weiblichen Genitale ausgehen. Hier ist jeder unntige Kontakt des Probenmaterials mit Luft zu vermeiden, sowohl whrend der Entnahme als auch whrend des Transports. Der Eiter wird deshalb mglichst ohne Luftbeimengung mit der Spritze aspiriert. Der Transport, der immer ohne Verzgerung erfolgen sollte, kann auf folgende Weise geschehen: 1. Das Material wird unter sterilen Kautelen in ein sauerstofffreies, reduzierendes Transportmedium mit Redoxindikator (z.B. Port-ACul. Portagerm(1<)) bertragen (lngerer Transport prinzipiell mglich). 2. Das Eitersekret wird in ein normales, steriles Rhrchen umgefllt; letzteres wird geffnet in einen tragbaren Anaerobier-Topf gestellt und, nachdem der Sauerstoff entfernt wurde, per Boten zur Untersuchungsstelle gebracht. 3. Aus Sicherheitsgrnden (erhhte Verletzungs- und Infektionsgefahr) kann der Transport (durch Boten) in der Entnahmespritze heute nur noch empfohlen werden, wenn die Kanle vorher durch eine sterile Kappe ersetzt wird. Auch bei Anaerobierverdacht ist Khlung der Probe grundstzlich kontraindiziert (s. Tab. 2.1). Eiter aus offenen Wunden. Tupferabstriche von der Wundoberflche oder von an der Austrittsffnung erscheinendem Fistelsekret sind fr die mikrobiologische Untersuchung wenig geeignet, da sie blicherweise stark kontaminiert sind. Bessere Ergebnisse liefern Gewebeteilchen, die nach Reinigung der Wundoberflche oder Fistelffnung mit einem scharfen Lffel vom Wundrand, der Abszewand oder mglichst tief aus dem Fistelkanal abgekratzt werden. Bei tiefen Wunden oder Fisteln kann auerdem versucht werden, Sekret ber einen sterilen Venenkatheter aus der Tiefe anzusaugen. Ist die Abstrichentnahme nicht zu umgehen, sollte der Tupfer unbedingt in einem konservierenden Transportmedium (z.B. nach STUART, S. Kap.

2.1.2) transportiert werden. Gewebeteilchen werden am besten in ein Rhrchen mit einer geringen Menge Nhrbouillon bertragen (Kochsalzlsung weniger geeignet). Bei Verdacht auf Anaerobier gelten die oben erwhnten Gesichtspunkte; fr Tupferabstriche, die hier allerdings nur ausnahmsweise gengen, gibt es spezielle reduzierende Transportmedien (z.B. PortA-Cul-Rhrchen mit Schraubverschlu). Vor allem um berwucherung des Erregers durch Mikroben, welche die Wunde sekundr besiedelt haben oder bei der Entnahme eingebracht wurden, zu vermeiden, sind kurze bersendungszeiten unbedingt anzustreben. Bindehautsekrete, Trnenflssigkeit Materialgewinnung mittels Tupfer fhrt oft zu unbefriedigenden Ergebnissen; auf jeden Fall sind Tupfer vorher mit steriler Kochsalzlsung anzufeuchten. Besser ist das Aufsaugen von Sekreten mit einer Glaskapillare oder die Gewinnung von Haut- oder Bindehautgeschabsel. Da oft sehr empfindliche Erreger vorliegen, sollten geeignete Kulturmedien unmittelbar nach Materialentnahme beimpft werden oder der Transport hat schnell und unter Verwendung von Transportmedien (z.B. STUART-Medium) zu erfolgen. Auch wenn nur an einem Auge Krankheitszeichen erkennbar sind, sollten Proben von beiden Augen gewonnen werden, da das nicht infizierte Auge als Negativkontrolle" zur Beurteilung der natrlichen Besiedlungsverhltnisse dienen kann. Bei Verdacht auf Gonoblennorrhoe ist wie bei den brigen Manifestationen von Gonokokken-Infcktionen zu verfahren (s. Tab. 2.1). Gehrgangs- und Mittelohrsekrete Material wird mit einem Tupfer unter Sicht direkt von den Lsionen bzw. aus dem entzndeten Bereich gewonnen. Die weitere Handhabung entspricht der bei offenen Wundeiterungen, auch im Hinblick auf eine mgliche Anaerobierbeteiligung. Materialien aus dem Respirationstrakt
Sekrete aus Mund, Rachen, Nase. Wie bei den

Ohrerkrankungen wird unter Sicht ein Tupferabstrich vom entzndeten Bereich durchgefhrt, nachdem die Entnahmestelle vorher mit einem anderen Tupfer gereinigt worden war. Dabei ist

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial

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ein flexibler Stieltupfer hilfreich, um auch schwerer zugngliche Stellen einfach erreichen zu knnen. Finden sich membranse Belge, mssen diese zur Materialgewinnung von ihrer Unterseite oder vom Grund der Lsion angehoben werden. Zu lange Transportzeiten sind bei Tupfereinsendungen die wichtigste Ursache fr negative oder irrefhrende Kulturergebnisse, da die Krankheitserreger hier besonders leicht durch Austrocknung und/oder Oxidation geschdigt werden knnen. Zur bakteriologischen Diagnostik von Gingivitis, Parodontitis oder Stomatitis ulcerosa ist die Entnahmestelle zunchst sorgfltig zu reinigen. Dann wird infiziertes Gewebe abgetragen und sofort in ein Anaerobiertransportsystem berfhrt. Nasennebenhhlensekrete. Material aus den Nebenhhlen wird meist durch Splung gewonnen. Da Kochsalzlsung manche Erreger schdigt, ist als Splflssigkeit eher Ringer-Lsung mit Laktatzusatz zu empfehlen. Die schnelle kulturelle Weiterverarbeitung der Probe im Laboratorium ist eine weitere Voraussetzung fr ein verwertbares Ergebnis. Bei kurzen Transportzeiten gengen dann auch die normalen Materialgefe (s. Tab. 2.1). Sputum, Bronchialsekrete. Sputum ist an sich ein wenig geeignetes Untersuchungsmaterial, da es selten eindeutige Ergebnisse liefert. Entscheidend fr eine aussagefhigere Sputumdiagnostik ist, den Patienten anzuhalten, morgens den ersten Auswurf durch krftiges Abhusten aus den tieferen Atemwegen und nicht nur Speichel zutage zu frdern. Der Auswurf wird entweder direkt in das dafr vorgesehene, weitlumige Versandgef (Abb. 2.1d) abgegeben oder zunchst in eine sterile Glasschale entleert, aus der dann unter sterilen Bedingungen eitrige oder flockige Bestandteile in das Transportgef umgefllt werden. Wenn bei Tuberkulose-Verdacht Sputum ber einen lngeren Zeitraum gesammelt werden soll, ist jede Einzelportion bis zur berstellung an das untersuchende Laboratorium bei 4 C zu khlen. Die Transportzeiten sollten generell kurz sein, da sonst erhebliche Vernderungen der mikrobiologischen Ausgangssiluation eintreten (s. Tab. 2.1). Da Sputum praktisch immer mit Mundbakterien kontaminiert ist, erhlt man klarere Aussagen, wenn Sekret aus den tieferen Atemwegen direkt durch Bronchoskopie (geschtzte Brste) oder transtracheale Aspiration gewonnen wird. Bei Anaerobierinfektionen der Lunge ist letzteres

Vorgehen nahezu die einzige Mglichkeit, zu einer verllichen Diagnose zu kommen.


Untersuchungsmaterial aus dem Verdauungskanal

Magen-, Duodenal-, Gallensaft. Eine direkte bakteriologische Diagnostik von Infektionen der Magenschleimhaut hat bis auf den Nachweis von Helicobacter pylori aus Biopsiematerial keine praktische Bedeutung. Magennchternsaft wird aber zum Nachweis verschluckter, aus der Lunge stammender Tuberkelbakterien benutzt. Kann dieser Magensaft nicht alsbald fr die Kultur oder den Tierversuch aufgearbeitet werden, sollte man die Probe vor dem Versand unter sterilen Bedingungen neutralisieren. Duodenal- und Gallensaft (A-, B- und C-Galle) werden nach der Gewinnung ber die Duodenalsonde getrennt in sterilen Rhrchen aufgefangen. Ihr Transport ist meist nicht bermig kritisch (Ausnahme: Lamblien). Stuhl und Rektalabstriche. Stuhl fr die mikrobiologische Diagnostik wird nicht in ein Toilettenbecken, sondern in ein sauberes Gef (Bettpfanne) ohne Urinbeimengung abgesetzt. Bei geformten Exkrementen wird mit dem Lffelchen eine etwa bohnengroe Portion aus dem mittleren Teil der Faeces in ein Stuhlrhrchen bertragen. Bei dnnflssigem Stuhl gengen 0,5 bis 1 ml. In manchen Fllen ist es gnstiger, mit einem Tupfer unter Drehung aus der Region proximal des Sphincter ani Material fr die Untersuchung abzustreichen. Obwohl die meisten darmpathogenen Bakterien relativ widerstandsfhig sind, knnen sie doch durch die bei Abkhlung und Saprophytenwucherung in der Stuhlprobe entstehenden Vernderungen (z.B. pH-Vernderung) geschdigt werden. Trotzdem haben sich bis auf die Flle mit Cholera-Verdacht (alkalisches Peptonwasser) in Deutschland konservierende Transportmedien fr Stuhleinsendungen kaum durchsetzen knnen. Man sollte deshalb wenigstens fr eine schnelle Probenzustellung sorgen oder alternativ bzw. gleichzeitig einen Rektalabstrich verwenden, der in STUART- oder CARYBLAIR-Medium transportiert wird (s. Tab. 2.1). Im Vergleich zum letztgenannten Vorgehen leistungsfhiger bleibt aber der Einsatz einer flssigen Konservierungslsung, die zum Beispiel aus 0,033 M Phosphatpuffer und Glyzerin, zu gleichen Teilen gemischt, bestehen kann (fr Enterobacteriaceae). Fr Salmonellen und Shi-

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Mikrobiologische Diagnostik

gellen speziell eignet sich das Medium nach HAJNA. Untersuchungsmaterial aus dem Urogenitalsystem Urin. Urin passiert bei seiner Ausscheidung per vias naturales in der vorderen Harnrhre ein Gebiet, das eine natrliche mikrobielle Besiedlung aufweist, die sich qualitativ nicht vom Erregerspektrum der Harnwegsinfektionen unterscheiden mu. Dadurch kommt es oft zu einer starken sekundren Beladung des Harns mit diesen Schleimhautmikroben, welche die bakteriologische Diagnostik der echten" Infektionen erheblich stren. Bei der Entnahme von Urinproben mu deshalb diese sekundre Verunreinigung soweit wie mglich vermieden werden. Dazu sind die folgenden Techniken gebruchlich: 1. Mittelstrahlurin (der Patient splt mit seiner ersten Harnportion die Harnrhre aus; aus der mittleren Portion wird ohne Anhalten des Strahls die Probe gewonnen).
Vorgehen beim Mann (in der Regel vom Patienten selbst auszufhren): Hnde sorgfltig mit Wasser und Seife waschen, mit frischem oder Einweghandtuch abtrocknen: Vorhaut mit der einen Hand vollstndig zurckziehen, mit der anderen Hand Glans penis mittels eines mit sauberem (sterilem) Wasser befeuchteten, sterilen Tupfers reinigen, mit zweitem Tupfer nachreinigen; Umgebung des Orificium urethrae mit drittem Tupfer trocknen; erste Urinportion (ca. 50 ml) in die Toilette oder ein Gef entleeren, dann - ohne den Harnstrahl zu unterbrechen - 5 bis 10 ml Harn in dem vorher griffbereit gestellten Transportgef auffangen, und zwar unter strikter Vermeidung einer Verunreinigung des Gefrandes durch Hand. Kleidung etc.; Verschlu sofort aufsetzen; Gef beschriften und bis zur Weiterleitung an das Laboratorium sofort in den Khlschrank stellen; alternativ Urin in sterilem Einwegbechcr auffangen und sofort einen Eintauchobjekttrger beimpfen (s.u.). Vorgehen bei der Frau (gegebenenfalls unter Hinzuziehung eines Hilfsperson): Unterwsche ausziehen, Rock hochschlagen; Hnde sorgfltig mit Wasser und Seife waschen und wie oben trocknen; mit einer Hand die Labien spreizen und so lange geffnet halten, bis die Uringewinnung abgeschlossen ist: Vulva mit der anderen Hand mit angefeuchtetem Tupfer durch Wischen von vorn nach hinten reinigen und mit zweitem Tupfer nachreinigen; Bereich des Orificium urethrae mit drittem Tupfer trocknen und diesen in den Introitiis vaginae einlegen; weiteres Vorgehen wie beim Mann bis auf die Empfehlung, grundstzlich sterile Einwegbecher zu verwenden, aus denen der Urin gegebenenfalls anschlieend in ein Transportgef umgefllt wird; abschlieend Tupfer aus der Scheide entfernen.

Trotz aller Vorsicht bleibt der Gehalt des Urins an Kontaminanten bei dieser Technik leider hufig noch hoch. Ein oder mehrere Kontrolluntersuchungen knnen aber zustzliche Sicherheit fr die Beurteilung der Untersuchungsergebnisse geben. 2. Katheterisieren der Harnblase bringt gegenber dem obigen Vorgehen keinen prinzipiellen Vorteil, es kann aber den Patienten zustzlich durch die mit dem Katheter hochgeschobenen Erreger belasten. Nur wenn aus anderen Grnden die Katheterisierung indiziert ist, kann Urin ber diesen Weg - dann aber auch nach der Mittelstrahltechnik - fr die bakteriologische Analyse gewonnen werden. 3. Suprapubische Blasenpunktion. Die einzige Mglichkeit, einen weitgehend kontaminationsfreien Harn zu erhalten, ist die Umgehung der Harnrhre durch diese Methode, die sich insbesondere zur Abklrung unklarer Flle eingebrgert hat. Da sich, auer bei der letztgenannten Entnahmetechnik, Verunreinigungen der Urinprobe nicht sicher vermeiden lassen, mu alles getan werden, um eine sekundre Vermehrung dieser Mikroben whrend des Transportes zu verhindern, oder man mu wenigstens eine Aussage ber die Mikrobenkonzentrationen bei der Entnahme machen knnen. Eine sekundre Mikrobenvermehrung bis zur Ankunft der Probe im Laboratorium lt sich ausschlieen, wenn der Urin innerhalb einer Stunde nach Gewinnung zur Untersuchung kommt oder wenn man ihn von der Entnahme bis zur Ankunft im Labor ununterbrochen auf 4 C khlt (s. Tab. 2.1). Einfacher ist es allerdings, unmittelbar am Patienten einen nhrbodenbeschichteten Objekttrger (Objekttrgerkultur, EintauchobjekttrgerTechnik, Dip-Slide-Verfahren) in den Urin einzutauchen und das so beimpfte System als Transportmedium zu verwenden, dessen berstellung an das Laboratorium bei richtiger Handhabung nicht kritisch ist. Genitalsekrete. Harnrhren-, Prostata-, Zervikal- oder Vaginalsekrete knnen meist unter Sicht (Spekulum bei der Frau!) mit dem Tupfer entnommen werden. Versendung dieses Tupfers ohne besondere Vorkehrung wird aber meist negative Ergebnisse bringen, da gerade im Genitaltrakt mit empfindlichen Erregern zu rechnen ist. Auch wenn kein Gonorrhoe-Verdacht besteht, sollten deshalb Transportmedien wie das STUART-Medium, das Port- A-Cul-Medium, das Portagerm-Medium oder das Transmed-Me-

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial

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dium eingesetzt werden. Zum Nachweis der Gonokokken sind diese Medien jedoch nur bei nicht zu langen Transportzeiten geeignet. Sonst ist die direkte Verimpfung des Eiters oder Sekretes (mit Herstellung eines Originalprparates) auf die entsprechenden Spczialnhrbden (s. Kap. 2.1.2) oder auf das selektive, in der Gasatmosphre abgestimmte, fr Zchtung und Transport geeignete Transgrow-Medium (modifiziertes THAYER-MARTIN-Medium als Schrgagar in Flaschen mit Schraubverschlu; die Luft in der Flasche enthlt 20% CO2) vorzuziehen. Alle Materialien aus dem Genitaltrakt sollten, wenn mglich grundstzlich, durch Boten oder den Patienten selbst im Laboratorium angeliefert werden (s. Tab. 2.1).
Spezielle Gesichtspunkte fr Mykoplasmen, Chlamydien und Rickettsien

werden, bis sie zur Untersuchungsstelle gelangen (Vorsicht: Infektionsgefahr!) oder im Saccharose-Phosphat-Glutamat-Medium mit Zusatz von Rinderserumalbumin transportiert werden. Sind verdchtige Arthropoden (Luse, Zecken, Milben) vorhanden, die untersucht werden sollen, werden diese in einem dicht verschlossenen Gef transportiert, das etwas angefeuchtete Watte enthlt.
Spezielle Gesichtspunkte fr die Virusisolierung

Mykoplasmen. Mykoplasmen sind auffllig empfindlich gegenber Austrocknung. An Tupfern aufgenommene Untersuchungsmaterialien mssen deshalb sofort weiterverarbeitet oder in ein Transportmedium (z.B. Trypticase-SojaBrhe mit 0,5% Rinderalbumin und Penicillin G) eingebracht werden. Gewebe- und Sputumproben knnen nativ transportiert werden. Erwartet man stark verlngerte Transportzeiten, sollte das Transportmedium bei -70 "C eingefroren werden. 24- bis 48stndige Intervalle zwischen Entnahme und Verarbeitung des Materials knnen in der Regel auch durch Khlung auf +4 C berbrckt werden. Chlamydien. Zum Nachweis von Chlamydien sind Epithelgeschabsel, zellhaltige Sekrete, Sputum, Blut oder Biopsiematerial (Leber, Milz) geeignet. Sie sollten grundstzlich sofort in ein Transportmedium gelangen (z.B. SaccharosePhosphat-Glutamat-Transportmedium), das hyperton ist und z.B. folgende Antibiotika bzw. Antimykotika enthalten kann: Streptomycin, Vancomycin und Nystatin. Wenn die Proben innerhalb von 24 Stunden verarbeitet werden knnen, sollten sie bei Khlschranktemperatur gehalten werden. Verzgert sich die Bearbeitung voraussichtlich lnger, ist Einfrieren bei -60 C zu empfehlen. Rickettsien. Materialien (z.B. Blut, Gewebe), aus denen Rickettsien isoliert werden sollen, mssen innerhalb von 30 Minuten weiterverarbeitet werden. Wenn dies nicht mglich ist, sollten sie sofort in einem Alkohol-Trockeneis-Bad eingefroren und konstant bei -70 C gehalten

Virusisolierungsversuche sind meist nur erfolgreich, wenn Untersuchungsmaterial zu Beginn der klinischen Krankheitserscheinungen (am besten innerhalb der ersten drei Tage, allenfalls bis zum 7. Tag) gewonnen wird. Der Transport dieses Materials sollte rasch, d.h. innerhalb weniger Stunden, und wenn notwendig (z.B. bei sommerlich hohen Auentemperaturen) gekhlt bei +4 C (auf Naeis) erfolgen. Eintrocknen oder Erwrmung des Probenmaterials ber physiologische Temperaturen ist ebenso wie unbeabsichtigtes Einfrieren auf alle Flle zu vermeiden. Sind lngere Transportzeiten zu erwarten, sind die Proben bei -70 C oder weniger einzufrieren und in gefrorenem Zustand (z.B. auf Trockeneis) zu transportieren. Bei umweltlabilen viralen Erregern kommen die oben genannten Transportmedien (s. Kap. 2.1.2) zum Einsatz. Typische, fr die Virusanzucht brauchbare Untersuchungsmaterialien sind Nasenabstriche und -splflssigkeiten (physiologische Kochsalzlsung), Konjunktivalabstriche, Abstriche von Mundschleimhaut und Rachen sowie Rachengurgelwasser (physiologische Kochsalzlsung), Sputum, Bronchiallavage, Hautabstriche, Blscheninhalte und Hautgeschabsel, Urin und Urogenitalabstriche, Stuhl und Analabstriche, Liquor, Gewebeproben und Biopsate, Augenkammerwasser und Fruchtwasser. Zur Anzucht viraler Erreger aus dem peripheren Blut eignet sich Vollblut mit gerinnungshemmenden Zustzen, in einigen Fllen lassen sich nicht-zellassoziiertc Erreger auch aus Serumproben anzchten. Fr die Elektronenmikroskopie brauchbare Materialien zum Virusnachweis mssen reichlich intakte Viruspartikel enthalten. Dies trifft insbesondere auf Blschenflssigkeiten und -abstriche sowie Stuhlproben zu, seltener auf Liquor, Urin und Abstriche bzw. Splfssigkeiten aus den Atemwegen.

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Mikrobiologische Diagnostik

Probenmaterial fr den Nukleinsurenachweis sollte ebenfalls rasch und gekhlt transportiert werden, wenn virale RNA nachgewiesen werden soll. DNA ist im Gegensatz zu RNA wesentlich stabiler und meist auch noch ber einen lngeren Zeitraum im Probenmaterial nachweisbar, z.B. auch in angetrockneten Blutresten in Injektionsnadeln bei Stichverletzungen. Zu beachten ist aber auch, da lange Transportzeiten und Lagerung des Untersuchungsmaterials vor der Aufarbeitung im Labor bei quantitativen Nukleinsurenachweisen stets vermieden werden sollten, da es zu unkontrollierbaren Effekten auf die viralen Nukleinsurekonzentrationen kommen kann. Geeignete Probenmaterialien fr Nukleinsurenachweise sind Serum, Vollblut mit gerinnungshemmenden Zustzen (Heparinzusatz kann zur Hemmung der PCR fhren, HeparinBlut ist daher meist ungeeignet fr den PCRNachweis), Liquor, aber auch Abstrichmaterialien und Biopsate. Ferner kann auch aus bereits fixierten histologischen Materialien erregerspe-

zifische Nukleinsure freigesetzt und nachgewiesen werden. Virale Antigene lassen sich direkt in Rachensplflssigkeiten oder Bronchiallavagen, Abstrichen, Serum und Vollblut (Leukozytenprparationen) nachweisen. Eine bersicht ber geeignete Untersuchungsmatcrialien fr den direkten Virusnachweis durch Anzucht, Antigen- und Nukleinsurenachweis gibt Tab. 2.2.

2.1.4 Probenzustellung zum Laboratorium


Deklarierung der Untersuchungsproben Jede einzelne Materialprobe ist mit Vor- und Zunamen des Patienten, Datum und mglichst auch Uhrzeit unmittelbar nach der Gewinnung zu kennzeichnen. Werden mehrere verschiedene Stoffe gleichzeitig vom selben Kranken oder die gleiche Malerialart kurz hintereinander mehrfach entnommen, ist es zwingend erforderlich.

Tab. 2.2 Geeignete Probenmaterialien fr einige der hufiger angeforderten Virusdirektnachweise Material Serum EDTA- oder Zitratblut Heparinblut Abstriche und Splflssigkeiten der oberen Atemwege Bronchiallavage, tiefe Atemwege Konjunktivalabstriche Augenkammerwasser Hautabstriche und Biopsate, Blscheninhalt Urin Urogenitalabstriche Analabstriche Stuhl Liquor Augenkammerwasser Fruchtwasser Erreger HBV (Ag, NAT, Hyb), HCV (NAT, Hyb), HIV (Ag, NAT, Hyb), HCMV (NAT), Parvovirus B19 (NAT) HIV (Ag, NAT, Iso), HCV (NAT, Hyb), HCMV (NAT, Hyb, Iso), HHV-6 (NAT, Iso), HHV-7 (NAT) HCMV (Ag, Iso) Influenza A und B (Ag, Iso), Parainfluenza 1-3 (Iso), RSV (Ag, Iso), Adenoviren (Iso), Enteroviren (Iso), HSV (Iso), Masern (Iso), Mumps (Iso) CMV (Iso, NAT), HSV (Iso, NAT), VZV (Iso, NAT), RSV (Iso, Ag) Adeno- (Iso), Enteroviren (Iso) CMV (NAT) HSV (iso, NAT, EM), VZV (iso, NAT, EM), Molluscum contagiosum (Iso, EM), HHV-8 (NAT), HPV (NAT) CMV (Iso, NAT), Rtelnvirus (Iso), Mumpsvirus (Iso) HSV (Iso, Ag, NAT), HPV (NAT, Hyb) HSV (Iso, Ag, NAT), HCMV (Iso, NAT), Enteroviren (Iso), Adenoviren (Iso) Rotaviren (EM), Adenoviren (Iso, EM), Enteroviren (Iso, EM), HAV (Ag), Caliciviren (EM), Norwalkviren (EM), Coronaviren (EM), Astroviren (EM) Enteroviren (Iso, NAT), HSV (NAT), VZV (NAT), HCMV (NAT), HIV (Iso, NAT), Masernvirus (NAT) HCMV (NAT) HCMV (NAT, Iso), Rtelnvirus (NAT, Iso), Parvovirus B19 (NAT)

Ag: Antigennachweis, EM: Elektronenmikroskopie, NAT: Nukleinsureamplifikationstechniken, Hyb: Nukleinsurehybridisierung, Iso: Virusanzucht

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial

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auch Materialart und Entnahmezeitpunkt zu vermerken. Auerdem mu jeder Probe ein Begleitschreiben beigefgt werden, das mglichst alle der folgenden Informationen enthalten sollte: Personalien des Patienten (Name, Vorname, Geburtsdatum, Wohnanschrift, Krankenkassenmitgliedschaft, Patienten-Nr.), Art des Untersuchungsmaterials, Entnahmezeitpunkt (Tag, u.U. Uhrzeit), gewnschte Untersuchung(en) (z.B. Stuhl auf Salmonellen), Datum und eventuell Buchungsnummer frherer Einsendungen von demselben Patienten, Hinweise auf klinische Symptomatik und/oder Verdachtsdiagnose, Haupt- und Nebenlokalisationen des Krankheitsprozesses, bisheriger Verlauf (Beginn der klinischen Erscheinungen oder des Krankenhausaufenthaltes), Art und Dauer einer schon erfolgten antimikrobiellen Chemotherapie, genaue Anschrift des einsendenden Arztes mit Telefonnummer, bei Krankenhusern auch Station. Personalien des Patienten (Probanden), Bezeichnung der Materialprobe, Entnahmezeitpunkt, Arztstempel und Unterschrift sind unabdingbare Voraussetzungen fr Untersuchung und Befundmitteilung. Von den Untersuchungsstellen werden blicherweise Begleitscheinvordrucke ausgegeben, die einfach auszufllen sind und den Einsender an die genannten wichtigen Punkte erinnern.
Rechtsvorschriften fr Transport und Versand von Untersuchungsmaterial und Erregerkulturen

bei mehreren Proben das Gesamtvolumen der Proben im Schutzgef 500 ml nicht berschreitet, in der Probe keine ansteckungsfhigen Stoffe vorhanden sind oder eine verhltnismig geringe Wahrscheinlichkeit besteht, da ansteckungsfhige Stoffe vorhanden sind. Die Norm gilt deshalb formal fr Untersuchungsgut im Rahmen von Routine-berwachungsuntersuchungen oder im Rahmen der Erstdiagnosc. Transportverpackungen fr Untersuchungsgut, das bekanntermaen ansteckungsgelhrliche Stoffe der Risikogruppen 2 bis 4 nach WHO bzw. Biostoffverordnung enthlt oder wahrscheinlich enthlt, unterliegen den Regelungen fr Gefahrguttransport.

Fr den rechtskonformen Transport und Versand von menschlichem Untersuchungsmaterial und Erregerkulturen sind eine Reihe verschiedener nationaler und internationaler Vorschriften zu beachten. Die fr deutsche Verhltnisse wichtigsten unter ihnen sind:
die europische Norm CEN EN 829 Transportverpackungen fr medizinisches und biologisches Untersuchungsgut - Anforderungen, Prfung" von 1996; die Gefahrgutverordnung Strae - GGVS - mit Anlagen A und B des ADR (ADR-Rahmenrichtlinie 94/55/EG) von 1996; die Dangerous Goods Regulations der International Air Transport Association (IATA) von 1998; sowie die Regelungen ber den Poslversand von medizinischem und biologischem Untersuchungsgut von 1996. Der Anwendungsbereich der Norm CEN EN 829 beschrnkt sich dabei auf Proben, bei denen das Nennvolumen der Probengefe 100 ml nicht berschreitet.

Unter Transport versteht die CEN EN 829 die Ortsvernderung von Untersuchungsproben auerhalb des Grundstcks des Absenders oder Empfngers des Untersuchungsgutes. Sie gilt demnach nicht fr den Probentransport auf dem Gelnde eines Krankenhauses oder Klinikums! Die zusammengesetzte Transportverpackung nach CEN EN 829 besteht aus B einem oder mehreren flssigkeitsdichten Probengefen aufsaugendem Material, das ausreichen mu, die gesamte aus den Probengefen austretende Flssigkeit aufzunehmen einem Schutzgef, das ebenfalls flssigkeitsdicht sein und mechanischen Belastungen. Temperaturschwankungen und einem Abfall des Auendrucks standhalten mu einer kistenfrmigen Verpackung oder Versandhlle, die den blichen Transportbelastungen standhalten mu. Die kistenfrmige Auenverpackung oder Versandhlle mu mit dem graphischen Symbol nach Abb. 2.2 in den Maen 62 mm x 44 mm gekennzeichnet sein. Begleitpapiere sollten nicht in das Schutzgef, sondern in die Versandhlle gegeben werden.

Abb. 2.2 Graphisches Symbol zur Kennzeichnung


menschlichen Untersuchungsgutes.

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Mikrobiologische Diagnostik

Die Gefahrgutverordnung Strae (GGVS) unterschei det in der Anlage A zwischen A. Ansteckungsgefhrlichen Stoffen mit hohem Gefhrdungspotential" und B. Sonstigen ansteckungsgefhrlichen Stoffen". Zur Kategorie A gehren Stoffe, die den Risikogruppen 3 oder 4 zugeordnet sind (oder diese enthalten); die Kategorie B umfat Stoffe, die der Risikogruppe 2 zugeordnet sind (oder diese enthalten), oder unspezifizierte klinische Abflle, die wahrscheinlich keine Stoffe der Risikogruppen 3 oder 4 enthalten. Verpackungen nach Kategorie A mssen aus folgenden, wesentlichen Teilen bestehen: a) einer Innenverpackung, bestehend aus: - einem wasserdichten Gef als erster Verpackung, - einer wasserdichten zweiten Verpackung, - absorbierendem Material zwischen der ersten und zweiten Verpackung; b) einer in Bezug auf ihren Fassungsraum, ihre Masse und den Verwendungszweck ausreichend widerstandsfhige Auenverpackung, deren geringste Auenabmessung mindestens JO cm betragen mu. Der wesentliche Unterschied dieser Bestimmungen zu den Vorschriften der CEN EN 829 besteht in den hheren Anforderungen an die Widerstandsfhigkeit der Auenverpackung gegen mechanische Belastungen. Durchfeuchtung und Temperaturschwankungen. Fr Stoffe nach Kategorie B der GGVS gelten Verpackungsvorschriften hnlich CEN EN 829, auer da nur Kisten und keine Versandhllen verwendet werden drfen. Die Dangerous Goods Regulations der IATA, die auch fr jeden Postversand gelten, da die Deutsche Post AG Lufttransport grundstzlich nicht ausschlieen kann, definieren als infektise Substanzen" alle Materialien, die aus Organismen der Risikogruppen 2 bis 4 bestehen oder diese wahrscheinlich enthalten. Fr diese gelten ebenfalls hhere Anforderungen an die Widerstandsfhigkeit der Auenverpackung und sie schlieen somit auch Erreger der Risikogruppc 2 ein. Auerdem ist das Formblatt Shipper's Declaration for Dangerous Goods" vollstndig auf Englisch auszufllen und in doppeller Ausfertigung vorzulegen, und die Auenverpackung ist u.a. mit dem Namen und der Telefonnummer der Person zu beschriften, die fr den Versand verantwortlich ist. Hinsichtlich der vielen weiteren Details sei auf die Broschre Shipping of Infectious, Non-lnfectious and Genetically Modified Biological Materials: International Regulations" der DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 1999 (Autorin: Dr. Christine Rohde) - verwiesen. Die Regelungen ber den Postversand von medizinischem und biologischem Untersuchungs-

EN 829; nicht-flssiges Untersuchungsgut mu nur den allgemeinen Verpackungsvorschriften (keine Beschdigung durch Bruch, Sto, Fall) entsprechen. Infektises Untersuchungsgui ist generell wie flssiges Untersuchungsmaterial zu handhaben. Darber hinaus ist es unter Wertangabe (in der Regel als Wertbrief) zu versenden, um die Bearbeitung mit automatischen Sortieranlagen zu umgehen. Fr den Frachtdienst sind solche Sendungen nicht zugelassen. Schlielich mu die Sendung auf der Aufschriftseite links neben der Anschrift den aufflligen Vermerk ..Untersuchungsgut - Vorsicht infektis!" tragen. Ist die Versandhllc bereits mit den Bildzeichen nach Abb. 2.2 versehen, gengt der Zusatz Vorsicht infektis!"
Postversand. Postversand von Materialproben fr mikrobiologische Untersuchungen ist wegen der hufig schlecht kalkulierbaren Transportzeit die am wenigsten geeignete Form des Materialtransportes. Dennoch lt er sich in vielen Fllen nicht umgehen und mu auch nicht notwendigerweise zu einer Verflschung des Befundes fhren.

gut" der Deutschen Post AG unterscheiden zwischen Sendungen mit Untersuchungsgut ohne oder mit geringem Infektionsrisiko" und Sendungen mit infektisem Untersuchungsgut". In der ersten Kategorie werden weiterhin flssige und nicht-flssige Untersuchungsmaterialien unterschieden. Fr flssiges Untersuchungsgut gelten die Verpackungsvorschriften nach CEN

Transport durch Boten. Der Materialtransport durch Boten ist dann obligatorisch, wenn Verdacht auf eine der gefhrlichen, hochkontagisen Seuchen (z.B. Pest) besteht. Fr ein brauchbares Untersuchungsergebnis ist er auerdem bei sehr hinflligen Erregern (z.B. Gonokokken) dringend angezeigt. Zwischen Krankenhusern und Praxen, in denen tglich grere Mengen von Materialproben anfallen, und der Untersuchungsstelle sollte deshalb, wenn irgend mglich, ein regelmiger Botendienst eingerichtet werden, der dann natrlich die berstellung smtlicher anfallender Materialproben bernehmen kann. Dabei sind die Bestimmungen der GGVS einzuhalten. Bessere und schnellere Befunderhebung und -mitteilung rechtfertigen diesen Mehraufwand ohne Frage. In manchen Fllen und hchstens bei geringem Infektionsrisiko knnen der Patient selbst oder seine Angehrigen mit der berbringung der Probe beauftragt werden; auch Taxiunternehmen lassen sich fr diesen Zweck heranziehen. In Ausnahmesituationen (z.B. Pest-Verdacht) kann selbst die Polizei fr die Zustellung des Materials eingeschaltet werden.
Unmittelbare Probenverarbeitung. Durch die heute erhltlichen Transportmedien ist eine Sofortverarbeitung des Untersuchungsstoffes unmittelbar nach Entnahme nur noch in bestimmten Einzelfllen erforderlich (s. Tab. 2.1). Zum Teil handelt es sich dann auch

2.2 Umgang mit infektisem Material

87

um den mikroskopischen Direktnachweis sehr labiler Erreger (z.B. Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis, Entamoeha histolytica), der vom erfahrenen Kliniker oft selbst durchgefhrt wird. Sonst ist eine intervallfrcie Verarbeitung des Materials nur mglich, wenn der Patient das mikrobiologische Laboratorium aufsucht oder wenn, bei gegebenen Voraussetzungen. der Mikrobiologe zum Krankenbett gerufen wird. Nur bei ausreichender Einbung kann auch einmal die Beimpfung entsprechender Spezialnhrbden vom Personal der Krankenabteilung vorgenommen werden. Die beimpften Nhrbden mssen dann unter Warmhaltung durch Boten zum Laboratorium transportiert werden. Literatur BURKHARDT, F. (Hrsg.): Mikrobiologische Diagnostik, Thieme, Stuttgart-Ncw York 1992. MAUCH, H.. R. LvncKEN und S. GATERMANN (Hrsg.): MiQ - Qualittsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik, Fischer, Stuttgart-Jena-Lbeck-Ulm 1997 -2000ff. MURRAY, P. R.. E. J. BARON, M. A. PFALLFR, F. C. TENOVER and R. H. YOLKF.N (Eds.): Manual of Clinical Microbiology, 7th ed., American Society for Microbiology, Washington, D. C. 1999. SCHAAL, K. P.: Entnahme und Transport von Untersuchungsmaterial zur mikrobiologischen, parasilologischen und serologischen Diagnostik von Infektionskrankheiten. Krankenhausarzt 49. Hefte 6-12 (1976). WERNER. H.: Anaerobier-Infektioncn: Pathogencse, Klinik, Therapie, Diagnostik, 2. Aufl., Thieme, Stuttgart-New York 1985.

fr Luft, Instrumente und Haut ein und bewirkte hierber eine Reduktion der postoperativen Wundinfektionen. Der Chirurg HAESTED registrierte, da trotz antiseptischer Manahmen die Hnde nicht komplett von Bakterien befreit werden knnen und fhrte 1889 die Benutzung von Gummihandschuhen beim Operationsteam ein. Die letzten 100 Jahre fhrten - nicht zuletzt vor dem Hintergrund des Wissens um die mikrobiclle tiologic von Infektionen (ROBERT KOCH) - zur Strukturierung und Verbesserung der Techniken und Mittel der Desinfektion und Sterilisation, die in der modernen Medizin unentbehrlich geworden sind.

2.2.1 Einflufaktoren der Keimabttung Bei der Desinfektion und Sterilisation werden, bezogen auf eine bestimmte Keimart, in gleichen Zeitspannen jeweils 90% der berlebenden Keime abgettet. Fr jede Keimart existiert ein spezieller D-Wert (dezimale Reduktionszeit). Es ist der Zeitwert, der bentigt wird, um eine Reduktion der Keimzahl um eine 10er Potenz bzw. 90% zu erreichen. Die graphische Darstellung der Abttung von Mikroorganismen ergibt eine logarithmische Kurve. Dies zeigt die Bedeutung von Zeil, Ausgangskeimzahl und Keimart fr den Effekt einer Desinfektionsbzw. Sterilisationsmanahme. Die Aktivitt der meisten Desinfektions- und Sterilisationsmanahmen steigt mit der Temperatur (Ausnahme: NaOH, Peressigsure): der /7/7-Werfanstieg steigert den Desinfektionserfolg von Glutaraldchyd und quaternren Ammoniumverbindungen, aber vermindert ihn von Phenolen, Chloriden und Jod. Wasserhrte-bildende Ionen (Magnesium und Kalzium) reduzieren den Effekt von oberflchenaktiven Verbindungen, weil sie mit ihnen unlsliche Przipitate bilden. Die Expositionsdauer gegenber Desinfektions- und Sterilisationsverfahren bestimmt deren Wirksamkeit. Bis auf wenige Ausnahmen (Jod. Alkohol) verkrzen steigende Konzentrationen des Desinfektionsmittels die notwendige Einwirkzeit. Die Notwendigkeit einer mechanischen Reinigung, beispielsweise im Rahmen der ScheuerWisch-Desinfektion, zur Erzielung eines adquaten Desinfektionseffektes ergibt sich nicht zuletzt aus dem Problem der Biofilmbildung durch viele Mikroorganismen. Prionen (Erreger der CREUTZFELT-JAKOB-EI-krankung) haben die hchste natrliche Resistenz neben Bakteriensporen; hiernach folgen

2.2 Umgang mit infektisem Material


EDELTRUD DIETLEIN, MARTIN EXNER Der Umgang mit infektisem Material erfordert Kenntnisse in den Gebieten Desinfektion und Sterilisation. Wie zahlreiche Fallbeschreibungen von Infektionen im Zusammenhang mit fehlerhafter Aufbereitung und Entsorgung zeigen, haben alle Teilbereiche in dem Gesamtgefge der Prophylaxe von Infektionserkrankungen einen wichtigen Stellenwert. Ende des 19. Jahrhunderts ermglichten physikalische und chemische Methoden der Keimabttung die Bereitstellung keimfreier chirurgischer Materialien sowie steriler Arzneimittel. SEMMELWEIS (1847) bewirkte durch Einfhrung der Waschung der Hnde mit Chlorkalklsung in der Geburtshilfe eine drastische Reduktion der Wchnerinnensterblichkeit. LISTER (1876) fhrte in der Chirurgie Phenol als antiseptisches Mittel

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Mikrobiologische Diagnostik

Mykobakterien, hllenlose (hydrophile) Viren (z.B. Polio, Coxsackie), Hepatitis B-Viren, Pilze, Viren mit Lipidhlle (z.B. HIV, Herpes) und vegetative Bakterien, mit abnehmender Resistenz von Enterokokken/Staphylokokken zu Colibakterien/Salmonellen, wobei allerdings Pseudomonas aeruginosa resistenter ist als die meisten brigen fakultativ-pathogenen Bakterien.

2.2.2 Indikation Desinfektion Sterilisation


Eine exakte Abgrenzung der Notwendigkeit von Desinfektion und Sterilisation ist aus wirtschaftlichen wie aus praktikablen Grnden unbedingt erforderlich. Die Centers for Disease Control and Prevention (CDC/USA) stellten 1985 eine Einteilung der medizinischen Gertschaften und Ausstattungen in verschiedene Kategorien auf. Kritische Objekte. In diese Gruppe fallen Objekte, die in steriles Gewebe oder in das Gefsystem eingehen und steril sein sollten. Hierzu zhlen chirurgische Instrumente, Herz- oder Blasenkatheter, Implantate, Nadeln, Laparoskope und Arthroskope. Zu diesen Utensilien knnen auch Hand- und Winkelstcke sowie Luft- und Absaugansatzstcke in der Zahnmedizin zhlen. Wenig kritische Objekte. Diese kommen in Kontakt mit der Schleimhaut oder nicht intakten Haut. Sie sollten frei sein von Mikroorganismen mit Ausnahme einer kleinen Anzahl an Sporen. Hierzu zhlen Ansthesie- und Beatmungsgertschaften, Endoskope und Thermometer. Nachfolgende hochpotente Mittel sind hierzu geeignet: Aldehyde, Wasserstoffperoxid, Peressigsure und Chlorverbindungen. Zum Absplen der Desinfektionsmittelreste sollte

nur steriles Wasser benutzt werden, damit es nicht zu einer Rekontamination durch atypische Mykobakterien, Legionellen, Pseudomonas u.a. kommt. Nicht kritische Objekte. Diese kommen nur mit intakter Haut in Kontakt, die eine effektive Barriere gegen die meisten Mikroorganismen bildet. Hierzu zhlen Bettpfannen, Urinflaschen, Gehhilfen, Blutdruckmanschetten, Bettwsche, Geschirr, Krankenzimmermobiliar und Fuboden. Aufgrund des geringen bertragungsrisikos gengt hier in der Regel eine grndliche Reinigung oder Desinfektion (letztere insbesondere bei multiresistenten Mikroorganismen) mit weniger breit wirksamen Desinfektionsmitteln. Abb. 2.3 gibt eine bersicht ber verschiedene Dekontaminationsverfahren.

2.2.3 Desinfektion
Definition

Ziel der Desinfektion ist es, die Zahl an Infektionserregern auf einer Flche oder einem Gegenstand soweit zu reduzieren, da eine bertragung von Infektionserregern im Sinne einer Infektion nicht mehr mglich ist.
Die Desinfektion fhrt zur Abttung oder Inaktivierung der meisten bzw. aller pathogenen Mikroorganismen mit Ausnahme der Bakteriensporen.

Ein Desinfektionsverfahren mu eine Reduktion der Keimzahl um 5 logm-Stufen, entsprechend um 99,999%, bewirken. Vergleichsweise fhrt eine Reinigung nur zu einer Reduktion um 2-3 log,o-Stufen. Das RoERT-KocH-Institut/Berlin (RK1) gibt hierzu 4 Wirkungsbereiche an:

Abb. 2.3 Wirksamkeit von Dekontaminationsverfahren.

2.2 Umgang mit infektisem Material

89

A: Zur Abttung von vegetativen bakteriellen Keimen einschlielich Mykobakterien sowie von Pilzen einschlielich ihrer Sporen geeignet. B: Zur Inaktivierung von Viren geeignet. C: Zur Abttung von Sporen des Erregers des Milzbrandes geeignet. D: Zur Abttung von Sporen der Erreger von Gasdem und Wundstarrkrampf geeignet (hierzu mssen Sterilisationsverfahren angewendet werden).

Die Liste der DGHM (Liste der nach den Richtlinien fr die Prfung chemischer Desinfektionsmittel geprften und von der Deutschen Gesellschaft fr Hygiene und Mikrobiologie als wirksam befundenen Desinfektionsverfahren, mhp-Verlag/Wiesbaden) ist eine Liste ber Desinfektionsmittelprparate unter Angabe von Wirksubstanz, Hersteller, Einsatzbereich, Konzentrations- und Einwirkungszeit. Sie dient der Auswahl fr die routinemige und prophylaktische Desinfektion, insbesondere zur Verhtung von Infektionen im Krankenhaus und in der rztlichen/zahnrztlichen Praxis. Die Liste des RoBERT-KocH-Institutes fhrt die vom RKI geprften und anerkannten Mittel und Verfahren fr Entseuchung gem 18 SeuchRNeuG auf. Hier werden neben Prparatenamen auch Gertschaften mit Temperatur und Einwirkungszeit aufgelistet. Entseuchungen sind behrdlich durch den Amtsarzt angeordnete Desinfektionsmanahmen bei meldepflichtigen Infektionserkrankungen oder bei nicht nur vereinzeltem Auftreten von ansteckungsfhigen Erkrankungen. Die RKI-Liste wird in der jeweils gltigen Neufassung im Bundesgesundheitsblatt verffentlicht. Aufgrund der Auflistung spezieller Prparate, hherer Konzentrationen und Einwirkungszeiten sollte auf die Liste wirklich nur im Seuchenfall zurckgegriffen werden. Fr den Lebensmittelbereich existiert die Desinfektionsmittelliste der Deutschen veterinrmedizinischen Gesellschaft (DVG) zur Desinfektion von Flchen und die Liste der DGHM fr die Hndedekontamination, einer kombinierten Desinfektion und Waschung der Hnde, die in der Wirksamkeit zwischen Reinigung und Desinfektion steht.
Verfahren Thermische Desinfektion

infektionsverfahren und die Desinfektion in vollautomatischen Reinigungs- und Desinfektionsmaschinen. Ausglhen und Abdmmen finden praktisch als nichtstandardisierbare Verfahren ausschlielich in Laboratorien Anwendung. Das RKI gibt fr das Kochen mit Wasser bei einer Mindcsteinwirkungszeit von 3 min den Wirkungsbereich AB, bei 15 min ABC an. Das Dampfdesinfektionsverfahren kommt bei gegenber Feuchtigkeit empfindlichen Materialien - z.B. Bettdecken, Bettkissen und Matratzen - zur Anwendung. Verfahren der Wahl ist das sogenannte VDV-Verfahren (fraktioniertes Vakuumverfahren); fr Wirkungsbereich AB auer Virushepatitis werden 75 C/20 min angewendet, fr Wirkungsbereich ABC 105 C/ 5 min. Vollautomatische Reinigungs- und Desinfektionsautomaten arbeiten thermisch mit 93 C und einer Einwirkungszeit von 10 min (Wirkungsbereich AB). Neuere Gerte verfgen zur Verbesserung der Reinigungsleistung ber ein Vorsplprogramm mit < 45 C. Sie werden fr die adquate Reinigung und Desinfektion von chirurgischem Instrumentarium, Ansthesie- sowie Intensivgertschaften aus Personal- wie Patientenschutzgrnden eingesetzt. Fr die thermische Wschedesinfektion und -reinigung gibt das RKI 85 C/15 min Einwirkungszeit bzw. 90 C/10 min (Wirkungsbereich AB) an. Die Desinfektion von Steckbecken und Urinflaschen erfolgt vorzugsweise in sogenannten thermischen Steckbeckensplen, die nach einer Reinigungsphase von einigen Minuten mittels Dampf oder Heiwasser mit 90-95 C/l-2 min desinfizieren.
Chemothermische Desinfektion

Verbrennen (Wirkungsbereich ABC), Ausglhen, Ab flammen, Erhitzen in Wasser, Dampfdes-

In den Waschmaschinen kann bei thermolabilen Materialien auch eine chemothermische Desinfektion durchgefhrt werden. Laut RKI-Liste sollten hier vorwiegend Temperaturen von 60-70 C in Kombination mit Perverbindungen oder aktivem Chlor als Wirkstoff bei Einwirkungszeiten zwischen 10-20 min fr den Wirkungsbereich AB eingesetzt werden. Mit Ausnahme des Seuchenfalles kann eine chemothermische Desinfektion von Utensilien in vollautomatischen Reinigungs- und Desinfektionsmaschinen mit speziellen maschinenkompatiblen Instrumentendesinfektionsmitteln durchgefhrt werden (z.B. fr OP-Schuhe oder andere thermolabile Materialien).

90

Mikrobiologische Diagnostik

Chemische Verfahren

Desinfektionsmitte] (Tab. 2.3) reagieren nicht nur mit Mikroorganismen, sondern auch mit Begleitmaterialien wie organischen Substanzen. Halogene, Schwermetalle und Oxidationsmittel werden durch organische Substanzen, Formaldehyd durch Ammoniak inaktiviert (sog. Eiweifehler), quaternre Ammoniumverbindungen durch anionische Seifen vollstndig neutralisiert (sog. Seifenfehler). Dies bedeutet, da eine sorgfltige Vorreinigung unerlliche Voraussetzung fr einen adquaten Desinfektionserfolg ist. Ein Zumischen von Reinigungszustzen - es sei denn durch den Hersteller werden kompatible Prparate angegeben - ist unbedingt zu vermeiden.
Grundstzlich ist der Scheuer-Wisch-Desinfektion gegenber der Sprhdesinfektion der Vorzug zu geben.

Die Sprhdesinfektion ist nur punktuell, besitzt keine mechanische Reinigungskomponente, fhrt zu erhhter Raumluftbelastung mit Desinfektionsmittel und sollte beispielsweise nur bei unzugnglichen Flchen zur Anwendung kommen. Da eine Unterdosierung der hufigste Fehler in der Desinfektionspraxis ist (sogenannte Schu"Methode), ist auf die exakte Dosierung von Desinfektionsmitteln zu achten; bei den empfohlenen Angaben handelt es sich um Mindestkonzentrationen und -Einwirkungszeiten. Alkohole Es kommen Ethanol (77-80%), Isopropanol (60-70%) und n-Propanol (42-60%) zum Einsatz. Hhere Konzentrationen sind infolge starker Entwsserungen der Bakterien weniger wirksam. Ihre Vorteile sind: schnelle Wirkung,

Tab. 2.3 bersicht ber Desinfektionsmittelgruppen und deren Wirksamkeit auf verschiedene Bakterien, Pilze, Viren und Bakteriensporen (modifiziert nach R UTALA 1997, DASCHNER 1997) Wirkstoffgruppe Effektivitt Bakterien Pilze behllte Viren Alkohole Aldehyde Formaldehyd Glutaraldehyd Glyoxal Halogene Chlor unbehllte Viren Mycobacterium tuberculosis Bakteriensporen -

mittel

+
-t-

(+)

hoch hoch mittel hoch mittel hoch

+ + +
+

+
+

+ + + (+)

+
+

+ + +
(+)

+ +

(+) (+)

Jod
Peroxidverbindungen Ozon Peressigsure Wasserstoffperoxid Phenole Oberflchenaktive Verbindungen Glucoprotamin quaternre Verbindungen amphotere Verbindungen Chlorhexidin Octenisept

+ (+)

(+) (+)

+ +
+

+ + + (+)

+ + + +

+ + + -

+ + + +

(+) (+) (+) -

niedrig

hoch niedrig niedrig niedrig mittel

+ (+) (+) (+) +

+ + + (+) +

(+) , -

+ -

(+)
(+)

(+)

(+) +

+: Wirksamkeit; (+): eingeschrnkte Wirksamkeit-: keine Wirksamkeit

2.2 Umgang mit infektisem Material

91

gutes Eindringvermgen, gute Vertrglichkeit, schnelle Trocknung. Anwendungsgebiete sind: Hndedesinfektion (hygienisch und chirurgisch), Hautdesinfektion, Wunddesinfektion, Flchendesinfektion (cave: Brennbarkeit und Explosionsgefahr wegen starker Flchtigkeit bei groflchiger Anwendung).
Das Wirkungsspektrum umfat:

lngerfristige Besiedlung mit ortsfremden Bakterien.


Fr jede Manahme, bei der eine mikrobielle Kontamination der Hnde zu erwarten ist, soll der Grundsatz gelten Hnde sauberhalten", denn das ist einfacher, als die Hnde wieder effektiv zu reinigen.

Bakterien (vegetative Formen; bei Tuberkelbakterien lngere Einwirkungszeit und hhere Desinfektionsmittelmenge erforderlich) Pilze und deren Sporen Viren (bei unbehllten Viren und Hepatitis-BViren lngere Einwirkungszeit und hhere Desinfektionsmittelmenge erforderlich)

Wegen der fehlenden Sporizidie mssen fr die Hautdesinfektion geschlossene Gebinde (Sprhflaschen") bzw. properativ sterile sporenfreie Lsungen verwendet werden, weil sonst die Mglichkeit der bertragung von Gasbrandund Tetanus-Sporen besteht. Ethylalkohol hat die beste Gewebevertrglichkeit und ist der potenteste viruzide Alkohol, der auch unbehllte Viren wie Polio-, ECHO-, Coxsackie- und Rotavircn erfat. Die RKI-Liste gibt fr die meisten Alkohole nur den Wirkungsbereich A an. Bei der Hautdesinfektion betrgt die Mindesteinwirkungszeit 15-30 sec je nach Hersteller. Das Desinfektionsmittel wird mit sterilisierten Tupfern (Tupfer, die einer Sterilisation unterzogen und geschlossen gelagert wurden, z.B. Rolle in Trommel) gleichmig aufgetragen. Bei der properativen Hautdesinfektion mssen sterile Tupfer verwendet werden; die Einwirkungszeit betrgt 5 min. Bei Lumbaipunktion, Arthroskopie werden ebenfalls sterile Tupfer verwendet, die Einwirkungszeit sollte mindestens 3 min betragen. Die Effektivitt der Hautdesinfektion ist durch Studien dokumentiert, die nach Desinfektion nur noch 6-12% der Hautflora ber Hauthiopsien nachwiesen. Es ist zu unterscheiden zwischen der residenten und transienten Hautflora. Die Residentflora ist die stndig vorhandene sogenannte Normalflora der Haut und umfat Mikrokokken, Staphylokokken, Corynebakterien und Propionibakterien; sie hat eine ungefhre Populationsdichte von 102-103/cm2. Die Transientflora ist die nur zeitweise vorhandene Flora; hierzu zhlen beispielsweise Staphylococcus aureus und Enterobakterien. Verletzungen der Haut frdern die

Deshalb sollten vorzugsweise die sogenannte non-touch-Technik und die grozgige Anwendung von Einmalhandschuhen, die selbstverstndlich nach jedem Patienten gewechselt werden sollten, zur Anwendung kommen. Eine Desinfektion der Handschuhe ist nicht zu befrworten, da in Studien nachgewiesen wurde, da hier die Entfernung von Mikroorganismen weniger effektiv ist und nicht selten auftretende Leckagen in den Handschuhen darber hinaus eine Hndedesinfektion nach Ablegen der Handschuhe erforderlich machen. Die Hndedesinfektion ist 400-800 mal effektiver bezglich der Reduktion der Hautflora im Vergleich zum einmintigen Waschen der Hnde mit Seife; der Effekt der Hndedesinfektion kann auch nicht durch Verlngerung der Waschphase erreicht werden. Darber hinaus fhrt das Hndewaschen nicht zur Abttung der Mikroorganismen, so da die Gefahr der Keimverbreitung ber Waschutensilien und Waschbecken besteht. Zur Verbesserung der Hautvertrglichkeit bei der Hndedesinfektion enthalten die Prparate in der Regel rckfettende Substanzen; zur Erzielung eines Remanenzeffektes (Verlngerung der Wirkung, insbesondere bei der chirurgischen Hndedesinfektion erwnscht) finden sich Zustze wie Chlorhexidin. Bei Unvertrglichkeitsreaktionen sollte das Prparat gewechselt werden; selbst Prparate mit den gleichen Wirksubstanzen knnen aufgrund verschiedener Zustze eine unterschiedliche Hautvertrglichkeit zeigen. Bei der hygienischen Hndedesinfektion wird zunchst mindestens 30 sec (je nach Prparat) desinfiziert, hierbei werden mindestens 3 ml Hndedesinfektionsmittel (3 Hbe aus Wandspender) gleichmig in beide Hnde unter besonderer Beachtung der Fingerkuppen und Nagelfalze eingerieben, bis die Hnde trocken sind. Gegebenenfalls werden die Hnde anschlieend gewaschen. Bei starker Kontamination werden die Hnde zunchst vorsichtig abgesplt, mit Desinfektionsmittel-getrnkten Einmaltchern grob vorgereinigt, danach gewaschen und zum

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Mikrobiologische Diagnostik

Schlu desinfiziert. Die Reihenfolge soll einer Verbreitung von Infektionserregern vorbeugen. Die hygienische Hndedesinfektion fhrt zur Entfernung der transienten Hautflora und zu einer Keimzahlreduktion um bis zu 5 logm-Stufen. Bei der chirurgischen Hndedesinfektion werden zunchst die Hnde und Unterarme bis zum Ellbogenniveau gewaschen (3 min; zuletzt nur noch die Hnde; cave: Hnde hochhalten, um ein Zurckflieen von Wasser und Seife zu vermeiden). Nach sorgfltigem Abwaschen und Abtrocknen mit sterilisierten Handtchern (cave: Verdnnungseffekt durch Wasser, Seifenfehler) werden je nach Prparat die Hnde und Unterarme 3-5 min desinfiziert; dabei soll die Haut ber die gesamte Einwirkungszeit mit Alkohol vllig benetzt sein. Auch hier werden zum Schlu nur noch die Hnde eingerieben. Die adquat durchgefhrte chirurgische Hndedesinfektion fhrt zur Beseitigung der transienten und deutlichen Reduktion der residenten Hautflora. Aldehyde Zur Anwendung kommen vorwiegend Formaldehyd und Glutaraldehyd. Ihre Vorteile sind: breites Wirkungsspektrum, gute Materialvertrglichkeit und geringer Eiweifehler (insbesondere Glutaraldehyd). Anwendungsbereiche sind: Instrumentendesinfektion, Flchendesinfektion.
Das Wirkungsspektrum umfat: Bakterien einschlielich einem Teil der Sporen; Tuberkelbakterien Pilze und deren Sporen Viren (behllte und unbehllte)

gise, aerogen bertragene Krankheiten, wie z.B. virusbedingtes hmorrhagisches Fieber) zur Anwendung kommen. Oxidationsmitlel Ozon. Ozon wird bei der Desinfektion von Trink- und Badewasser angewendet. Da es in der notwendigen Konzentration toxisch ist, wird es nach der Desinfektion wieder aus dem Wasser entfernt. Peressigsure. Vorteile sind: breites Wirkungsspektrum, unschdliche Desinfektionsmittelrckstnde, geringer Eiweifehler.
Das Wirkungsspektrum umfat: Bakterien und deren Sporen; Tuberkelbakterien Pilze und deren Sporen Viren (behllte und unbehllte)

Nachteilig ist die Korrosion von Metallen; dieser Effekt kann jedoch reduziert werden durch Zustze und pH-Modifikationen. Die gebrauchsfertige Lsung ist instabil. Anwendungsgebiete sind: Wschedesinfektion. Instrumentendesinfektion in Verbindung mit korrosionshemmenden Substanzen. Wasserstoffperoxid. Anwendungskonzentrationen sind 3-6%.
Das Wirkungsspektrum umfat: Bakterien einschlielich Tuberkelbakterien und ein Teil der Sporen Pilze und deren Sporen Viren (behllte und unbehllte)

Formaldehyd ist im Vergleich zu Glutaraldehyd langsamer gegen Sporen wirksam. Nachteilig sind die Schleimhautirritation, der stechende Geruch und das allergisierende Potential. Die sorgfltige Absplung nach Desinfektion zwecks Entfernung von Desinfektionsmittelresten ist besonders wichtig (Glutaraldehydproktitis nach Endoskopie, Keratopathie ber Tonometer). Die Desinfektion mit Aldehyden sollte nur in gut belfteten Rumen bzw. in abgedeckten Desinfektionsmittelwannen erfolgen. Beim Umgang mit Desinfektionslsungen sind langschaftige Gummihandschuhe zu tragen. Die Raumdesinfektion mittels Verdampfung oder Verneblung von verdnnten FormaldehydLsungen mittels spezieller Apparate sollte nur noch in Ausnahmesituationen (seltene konta-

Anwendungsbereiche sind: Wunddesinfektion, Mundsplungen, Instrumentendesinfektion (z.B. Tonometer, weiche Kontaktlinsen). Halogene Jod. Zum Einsatz kommen sogenannte Jodophore, d.h. Kombinationen aus Jod mit einem lslichen Carrier-Molekl (z. B. Polyvinylpyrrolidon), die nur geringe Mengen freien Jodes freisetzen, infolge dessen geringe toxische, allergisierende, reizende und frbende Nebenwirkungen zeigen.
Das Wirkungsspektrum umfat: Bakterien (gramnegative Bakterien zum Teil nicht; Mykobakterien eingeschrnkt) Viren (behllte und bedingt unbehllte) eingeschrnkt Pilze sowie Sporen (unter verlngerter Einwirkungszeit, hherer Konzentration)

2.2 Umgang mit infektisem Material

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Anwendungsbereiche sind: Schlcimhautdcsinfektion, Hautdesinfektion. In der Schwangerschaft, bei Neugeborenen und Suglingen (transienle Hypothyreose) und Schilddrsenerkrankungen (Hyperthyreose) sowie vor Untersuchungen und Therapien mit radioaktivem Jod sollen Jodprparate nicht eingesetzt werden. Chlor. Beispielsweise kommen Natriumhypochlorit (Chlorbleichlauge), Kalziumhypochlorit (Chlorkalk), Chloramin und Chlorgas sowie Chlordioxid zur Anwendung. Ihre Vorteile sind: breites Wirkungsspektrum, schnelle Wirkung; Nachwirkung beispielsweise noch im Wasscrleitungsnetz, Preisgnstigkeit.
Das Wirkungsspektrum umfat: einschlielich Tuberkelbakterien und ein Teil der Sporen Pilze und deren Sporen Viren (behllte und unbebllte)

Bakterien

Anwendungsbereiche sind: Desinfektion von Trink- und Badewasser, Desinfektion von Hydrotherapie-Gertschaften, Flchendesinfektion (z.B. Fuboden, Tonometerkpfe), Desinfektion von Ausscheidungen (Chlorkalk), Hndedesinfektion (nur in Ausnahmefllen wegen guter Viruzidie, aber schlechter Hautvertrglichkeit). Nachteilig ist ihre starke Korrosivitt sowie ihre relative Instabilitt. Die Reaktion mit organischen Stoffen fhrt zur sogenannten Chlorzehrung, bedingt aber auch die Bildung von toxischen oder krebserzeugenden Substanzen (sog. Trihalogenmethane). Wegen der Persistenz im Abwasser werden chlorhaltige Desinfektionsmittel zur Wschedesinfektion nicht mehr eingesetzt. Oberflchenaktive Verbindungen (Tenside) Vertreter dieser Gruppe sind nichtionische, anionische, kationische (z.B. quaternre Ammoniumsalze, Fettamine, Octenidinhydrochlorid, Biguanide), amphotere Tenside. Desinfizierende Wirksamkeit ist bei den nichtionischen und anionischen Verbindungen (handelsbliche Seifen und Haushaltswaschmittcl) allerdings so gut wie nicht vorhanden. Vorteilig ist ihre gute Reinigungswirkung, relativ gute Hautvertrglichkeit sowie geringe Geruchsbelstigung und Toxizitt. Nachteilig ist ihre Wirkstofflcke gegenber gramnegativen Bakterien, Mykobakterien und unbehllten Viren.

Biguanide. Chlorhexidin findet berwiegend als Zusatz zu anderen Desinfektionsmitteln (Remanenz) oder als Schleimhautdesinfektionsmittel Verwendung, weil es nur zu einer Keimzahlreduktion von 2 Logarithmusstufen fhrt. Octenidinhydrochlorid (Octenisept). Octenisept ist eine kationenaktive Verbindung, die etwa lOfach wirksamer ist als Chlorhexidin, ohne Wirkungslcken im gramnegativen Bereich, mit antiviraler Wirksamkeit berwiegend gegen behllte Viren, aber auch Hepatitis-B-Viren. Es wird vorwiegend zur Schleimhautdesinfektion eingesetzt. Quaternre Ammoniumverbindungen. Hierzu zhlt u. a. Benzylammoniumchlorid. Nachteilig ist ihr begrenztes Wirkungsspektrum. Beispielsweise wurde Wachstum von gramnegativen Bakterien in ihnen wie auch in Phenol nachgewiesen. Darber hinaus besitzen sie einen groen Eiwei- und Seifenfehler; Zusatz von Reinigungsmitteln oder hartes Wasser fhren zu einer starken Reduktion ihrer Desinfektionswirkung.
Das Wirkungsspektrum umfat: Bakterien (bedingt nur gram-negative Bakterien, keine Tuberkelbakterien und keine Sporen) Pilze und deren Sporen Viren (nur behllte)

Anwendungsbereich: Desinfektion nichtkritischer Flchen, insbesondere im Kchenbereich. Glucoprotamin. Es handelt sich um ein Alkylamin bzw. Fettamin, ein Reaktionsprodukt aus der Aminosure Glutaminsure und Cocospropylen-l,3-diamin. Das Wirkungsspektrum kommt dem der Aldehyde nahe (Bakterien einschlielich Tuberkelbakterien, Pilze und teilweise Viren). Amphotere Tenside. Wirkungslcken bestehen gegenber gram-negativen Bakterien, Mykobakterien und unbehllten Viren. Vorteilhaft ist ihr geringer Eiweifehler und ihre geringe Humantoxizitt, weswegen sie vorrangig in der Lebensmittelindustrie verwendet werden. Phenole Nachteilig ist die Aufnahme der Phenole durch porse Materialien, was trotz grndlicher Nachsplung zu Gewebeirritationen fhren kann. Von Vorteil ist ihr geringer Eiweifehler, weswegen ihr Haupteinsatzgebiet die Desinfektion von Ausscheidungen ist. Ansonsten finden sie sich

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Mikrobiologische Diagnostik

berwiegend nur noch in Kombinationsprparaten mit anderen Desinfektionsmitteln.


Das Wirkungsspektrum umfat: Bakterien, einschlielich Tuberkelbakterien begrenzt Pilze Viren (nur behllte)

Anwendungsgebiete sind: Desinfektion unkritischer Flchen, Desinfektion von Ausscheidungen. Vorsicht ist bei der Anwendung in der Pdiatrie wegen mglicher Hypcrbilirubinmien geboten. Nicht zuletzt deswegen sollten Flchen nach adquater Einwirkungszeit sorgfltig mit Wasser abgesplt werden und Gertschaften wie Inkubatoren nicht mit Phenol desinfiziert werden. Weitere Desinfektionsgruppen
Es gibt weitere Substanzen, die antimikrobielle Wirksamkeit besitzen, die aber bisher nicht oder nur begrenzt in den Bestand der Krankcnhausdesinfeklionsmittel bernommen wurden. Hierzu zhlen Metalle, Ether, Aceton, Chloroform, NaOH/KOH, Suren. Teils hat dies toxikologische Grnde (z.B. Quecksilber, Kaliumpermanganat), teils bestehen bisher zu wenig Studien und Erfahrungen mit diesen Mitteln, so da vor ihrer breiten Anwendung Forschungsarbeit notwendig ist. Suren sind oft materialaggressiv. Kalilauge (KOH) hat einen unsicheren keimabttenden Effekt (u.a. Wirkungslcken im gramnegativen bakteriellen Bereich). Kalkmilch mu frisch zubereitet werden und kann zur Desinfektion von Fkalien (lt. RKIListe Wirkungsbereich AB auer Tbc) eingesetzt werden. Hoffnungstrchtige Versuche wurden bereits unternommen, Wasser mit Silber. Kupfer oder Eisen zu desinfizieren oder intravasale Katheter weniger anfllig gegenber der bakteriellen Besiedlung durch Inkorporation der genannten Metalle zu machen. Silbernitrat findet sich in Augentropfen zur sogenannten CKLDF.schen-Prophylaxc bei Neugeborenen. Da bereits sehr geringe Konzentrationen von Metallionen eine Wirkung entfalten knnen, sprich! man von oligodynttmischer Wirkung. Anwendungsbereiche der Desinfektion und praktische Anwendung

Entweder wird aus einem Reinigungsgert Desinfektionslsung aufgetragen oder es wird stets nur ein frischer Lappen in die Desinfektionsmittellsung eingetaucht und nach Auftragen auf einen bestimmten Bereich (z.B. ein Raum) durch einen frischen ersetzt. Dies dient der Verhinderung der Keimverschleppung ber die kontaminierte Desinfektionslsung. Fr jeden Pflegebereich (z.B. Patientenzimmer, reiner Pflegedienst, Sanitr) wird ein gesonderter Eimer mit Desinfektionslsung und Tuch, jeweils farblich gekennzeichnet, eingesetzt. Die genannten Verfahren sind der 2-Eimer-Methode berlegen. Die Wisch- und Reinigungsutensilien sind anschlieend durch thermische Waschverfahren zu desinfizieren und trocken zu lagern. berwiegend kommen die 4-Slunden- und 1-Stunden-Werte (letztere insbesondere in Risikobereichen, wie z.B. Intensiv, OP) der Desinfektionsmittel zur Anwendung. Die Instrumentendesinfektion erfolgt bevorzugt thermisch in Desinfektionsmaschinen. Sollte eine manuelle Aufbereitung erforderlich sein, ist darauf zu achten, da die Instrumente vollstndig zerlegt sowie luftblasenfrei eingelegt werden und komplett mit Desinfektionslsung bedeckt bzw. gefllt sind. Insbesondere bei starker Verschmutzung und englumigen Instrumenten (z.B. Endoskopen) ist zustzlich eine mechanisch untersttzende Reinigung z.B. durch Brsten erforderlich. Die Desinfektionsmittclwannen sind zur Vermeidung erhhter Luftkonzentrationen von Desinfektionsmittel dicht abzudecken. Es sind langschaftige Handschuhe zu tragen.
Resistenz gegenber Desinfektionsmitteln

In der Praxis werden viel hhere Konzentrationen angewendet als die minimale Hemmkonzentration bestimmter Desinfektionsmittel bei resistenteren Bakterienstmmen betrgt, so da im Desinfektionsmittclbereich bei adquater Prparateauswahl und Anwendung nicht mit Versagerquoten zu rechnen ist.
Der sicherste Weg zur Vermeidung von Resistenzen ist die ausreichend hohe Dosierung, der regelmige Wechsel verunreinigter Lsungen und die Vermeidung der chemischen Aufbereitung von Reinigungs-/Desinfektionsutensilien (bevorzugt thermische Desinfektion).

Bei der Desinfektion von Flchen ist eine Scheuer-Wisch-Desinfektion durchzufhren.


Moderne Reinigungssysteme gewhrleisten eine sichere Trennung von reiner Desinfektionslsung und schmutzigen Reinigungstchern und verhindern eine Kontamination der Desinfektionslsung.

2.2 Umgang mit infektisem Material

95

2.2.4 Sterilisation
Definition Die Sterilisation bewirkt die komplette Eliminierung oder Zerstrung aller Mikroorganismen einschlielich deren Sporen.

Numerisch ausgedrckt mu sie zu einer Keimzahlreduktion von mindestens 6 logm-Stufen fhren. Statistisch ist mit einer Kontaminationswahrscheinlichkeit von 1:1 Mio. sterilisierter Einheiten zu rechnen. Ein fr jedes Sterilisiergut geeignetes Sterilisationsverfahren gibt es nicht. So mssen fr empfindliche Sterilgter suboptimale, materialschonende Verfahren angewendet werden. Dieser unvermeidbare Kompromi darf jedoch nicht dazu verleiten, da aus Grnden der Wirtschaftlichkeit weniger sichere Verfahren angewendet werden.
Thermische Sterilisation Dampfsterilisation

Beim Autoklavieren mittels gesttigtem, gespanntem Wasserdampf handelt es sich um das mit Abstand sicherste Verfahren. Die Verfahren zur Dampfstcrilisation unterscheiden sich durch die Art der Luftentfernung aus der Kammer. Beim Strmungsverfahren ist zu unterscheiden zwischen dem Gravitationsverfahren (der leichtere Sattdampf verdrngt die schwerere Luft nach unten aus der Kammer) und dem fraktionierten Strmungsverfahren (Verdrngung der Luft durch mehrere Ste mit Sattdampf). Zur sichersten Entfernung von Restluft als hufigster Fehlerquelle bei der Dampfsterilisation, fhrt das fraktionierte Vakuumverfahren, bei dem die Kammer mehrfach im Wechsel aktiv evakuiert und mit Dampf geflutet wird. Unter der Voraussetzung, da der Dampf vllig luftfrei ist, kann aus dem Druck auf seine Temperatur geschlossen werden und umgekehrt. Die Sterilisation erfolgt durch Kondensation des Wasserdampfes an dem klteren Material, worber eine Erwrmung des zu sterilisierenden Gutes erreicht wird. Textilien und andere porse Gegenstnde sind schwerer zu erwrmen als Metallwcrkstoffe. Wegen der Gefahr der Rekontamination darf Sterilgut nur in eindeutig trockenem Zustand dem Sterilisator entnommen werden. Eine langsame Abkhlung des Sterilgutes vermeidet Kondenswasserbildung. Die

Luftentfernung aus dem Gut wird durch seine Verpackung nachhaltig beeinflut. So kommen beim Gravitationsverfahren nur Verpackungen in Betracht, die oben und unten fr Dampf durchlssig sind, wie z.B. Behlter mit Lochung in Deckel und Boden oder Sterilisationspapier. Die DIN-Norm 58946 gibt Auskunft ber spezielle Fragestellungen der Dampfsterilisation. Die Richtlinie des RoBERT-KotH-Institutcs fr Krankenhaushygiene und Infektionsprvention empfiehlt zur Sterilisation mit Dampf: 120 C bei 2 bar und eine Mindesteinwirkungszeit von 20 min; 134 "C bei 3 bar und eine Mindesteinwirkungszeit von 5 min. Die Einwirkungszeit entspricht der Zeit, die die Temperatur auf das gesamte Sterilisiergut einwirken mu und das bis ins Zentrum des Sterilisiergutes. Die Sterilisierzeit setzt sich zusammen aus der Ausgleichszeit (Zeitspanne zwischen Erreichen der Temperatur am Auenthermometer des Autoklaven und dem Erreichen der Temperatur in allen Sterilisiergtern) plus Einwirkungszeit. Sogenannte Blitzsterilisatoren (Gravilationsverfahren 132 C, 3 min) sollten wegen des geringen Sicherheitsspielraumes und der Schwierigkeit der Validierung (Dampfsterilisations-Bioindikatoren nicht kompatibel) nur in Notfallsituationen bei unverpacktem Sterilgut zur Anwendung kommen.
Heiluftsterilisation

Die Resistenz von Mikroorganismen gegen trockene Hitze ist wesentlich hher als gegen feuchte Hitze, bedingt durch die schlechtere Wrmeleitfhigkeit der Luft. Im Heiluftsterilisator treten an verschiedenen Punkten sowohl niedere als auch hhere Temperaturen auf als zum gleichen Zeitpunkt am Thermometer des Gertes angezeigt wird. Da Heiluftsterilisatoren ber eine temperaturgeregelte Heizung verfgen, kann es zu erheblichen Unsicherheiten bei diesem Sterilisierverfahren kommen. Durch entsprechende Betriebszeiten knnen die Temperaturdifferenzen meist ausgeglichen werden; zumindest grere Sterilisatoren (>40 1) sollten mit einer mechanischen Luftumwlzung ausgestattet sein. Bei der Beschickung ist darauf zu achten, da die Luft ungehindert zirkulieren kann. Eine zu volle Beschickung oder eine Beladung der Kammer bei bereits laufender Sterilisation ist unbedingt zu vermeiden. Die bestehenden Mglichkeiten der Wirksamkeitsberprfung sind bei der Heiluftsterilisation im

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Mikrobiologische Diagnostik

Vergleich zur Dampfsterilisation begrenzt und unzuverlssiger. Deshalb wird dieses Verfahren bevorzugt im Laborbereich eingesetzt. Darber hinaus knnen nur Materialien sterilisiert werden, die eine Temperatur bis 200 C tolerieren wie z.B. Metall, Porzellane, Glas, Pulver, le und Fette. Seitens des RoBERT-KocH-Institutes wird folgende Empfehlung bei Betrieb von Heiluftsterilisatoren zu Einwirkzeiten in Abhngigkeit von der Temperatur gegeben:160 C, 200 min Mindesteinwirkungszeit;180 C, 30 min Mindestein wirkungszeit.
Gassterilisation

Die Gassterilisation sollte nur zur Anwendung kommen, wenn eine thermische Sterilisation beispielsweise bei thermolabilem Material nicht mglich ist. Sterilisation mit Ethylenoxid (EO). EO liegt bei Raumtemperatur als Gas vor. Es ist giftig, brennbar, explosiv, kanzerogen und teratogen. Nach Evakuierung der Kammer des EO-Sterilisators erfolgt die Einwirkung des EO-Gases bei 50-60 C auf das Sterilisiergut bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40-90%.
Da kleinste Schmutz-, Eiwei- oder Salzkristallumhllungen den Sterilisationserfolg beeintrchtigen, mu das Sterilisiergut zuvor sorgfltig gereinigt und mit destilliertem Wasser gesplt werden.

Lumina mssen freien Durchgang haben und drfen nicht durch Wassertropfen blockiert werden. Instrumente mssen, soweit mglich, zerlegt sein. Das zu sterilisierende Material mu absolut sauber und trocken sein. Vor Entnahme des Sterilisiergutes aus der Kammer ist durch Desorptionsprogramme sicherzustellen, da die technische Richtkonzentration fr EO in der Luft aus Personalschutzgrnden eingehalten wird. Darber hinaus ist zu beachten, da unterschiedliche Materialien verschiedene Auslftungszeiten bentigen, weil auch beim Patienten EO durch direkten Kontakt mit dem sterilisierten Gut zu gesundheitlichen Schden fhren kann. Rume, in denen Sterilgut aus Gassterilisaloren entnommen wird, mssen einen mindestens achtfachen stndlichen Luftwechsel besitzen. Der Leiter der Sterilisationsabteilung bentigt einen Befhigungsschein, der in anerkannten Lehrgngen erworben werden kann. Sterilisation mit Formaldehyd (FA). Die Formaldehydsterilisation wird bei 60-75 C mit einer

relativen Luftfeuchtigkeit von 100% durchgefhrt. Beim sogenannten Pendelverfahren wird vor der eigentlichen Einwirkungsphase ein fraktioniertes bzw. pulsierendes Vorvakuum aufgebaut, bei dem Kammerevakuierung und Einspeisung des Formaldehyd-Wasserdampfgemisches abwechseln. Hierdurch soll das Eindringen in porses und englumiges Material erleichtert werden. Durch ein pulsierendes Nachvakuum wird die Desorption erreicht. Obgleich die FA-Sterilisalion nicht in dem Ma durch Salze beeinflut wird wie die EO-Sterilisation, ist eine grndliche Vorreinigung und Splung sehr wichtig. Nachteilig ist das gegenber EO geringere Penetrationsvermgen, vorteilig die geringere Gefhrdung des Personals. Niedrigtemperatur-Plasmasterilisation. Bei der Plasmasterilisation wird zunchst ein Hochvakuum in der Sterilisierkammer erzeugt, anschlieend Wasserstoffperoxid injiziert, das in das zu sterilisierende Gut diffundiert. Durch Anlegung eines hochfrequenten elektromagnetischen Feldes wird die Bildung des sogenannten Plasmas (4. Aggregrationszustand) mit mikrobizid wirkenden Radikalen erzeugt. Die Sterilisation verluft bei 37-44 C ber ca. 75 min. Vorteilig ist die Rckstandsfreiheit von toxischen Substanzen, es bleiben nur Sauerstoff und Wasser brig. Nachteilig ist, da Papier, Stoffe und Flssigkeiten nicht sterilisiert werden knnen. Fr einen festgelegten Indikationsbereich stellt die Plasmastcrilisation eine interessante Alternative zum EO- oder FA-Sterilisationsverfahren dar. Wie bei allen Sterilisationsverfahren ist auch hier eine vorhergehende grndliche Reinigung und Trocknung erforderlich.
Das bisher einzige kommerziell erhltliche Gert Sterrad* 100 der Firma JOHNSON & JOHNSON wurde 1993 in den USA durch die Food and Drug Administration zugelassen. Leistungsgrenzen bei Instrumenten mit lngeren inneren Hohlrumen scheinen durch sogenannte Diffusionsverstrker und durch die Entwicklung einer neuen Gerteversion (Sterrad8 100 S) mit Verdoppelung der Wirkstoffmenge und verbesserter Diffusion mittels Druckerhhung zu bewltigen zu sein. Als Verpackung kommt nur papierfreie spezielle Kunststoffolie in Betracht, weil Zellulose H2O2 absorbiert und somit seinen Zutritt zum Sterilgut behindert. Es sind spezielle Polypropylen- oder Edelstahlbioindikatoren mit Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 fr die berwachung erforderlich. Lagerung von Sterilgut

Sterilgut soll bevorzugt geschtzt (in Schrnken, Schubladen etc.) gelagert werden, um mechani-

2.2 Umgang mit infektisem Material


sehe Belastungen sowie eine Kontamination der Verpackung durch Staub oder Feuchtigkeit zu vermeiden. In der Regel erfolgt eine ZweifachVerpackung in Klarsichtsterilisier-Verpackungsmaterial, speziellem Sterilisierpapier oder eine Verpackung in Metallcontainern mit Vliespapier und speziellen dampfdurchlssigen Filtereinstzen bei der Dampfsterilisation. Bei der Heiluftsterilisation kann eine Verpackung in Aluminiumfolie (dreifach) oder Laborkartuschen, bei der Gassterilisation in speziellem Klarsichtsterilisier-Verpackungsmaterial stattfinden. Die Lagerung kann nach DIN 58953 in der Zweifachverpackung geschtzt ber 6 Monate erfolgen; bei ungeschtzter Lagerung sollte das Sterilgut alsbaldig verbraucht werden (Lagerung in der Zweifach Verpackung 6 Wochen, Einfach Verpackung 24 h). Industriell gefertigte Produkte haben in wiederverschliebaren Sterilgut-Lagerverpackungen vom Hersteller angegebene Verfallsdaten. Darber hinaus sollten sogenannte Chemoindikatoren bei jeder Charge mitgefhrt werden, die anzeigen, ob die Charge einer Sterilisation unterzogen wurde (sogenannte Behandlungsindikatoren) und Chemoindikatoren, die aufgrund des Farbumschlages eine chargenbezogene orientierende Aussage zur Effektivitt der Sterilisation ermglichen. Fr jedes Sterilisiergert besteht eine chargenbezogene Dokumentationspflicht ber Chemo-, Bioindikatoren sowie physikalische Parameter. Auerdem ist arbeitstglich vor Beginn der Sterilisation bei Autoklaven eine sogenannte Leercharge zur berprfung des ordnungsgemen Programmablaufes zu fahren, ein Vakuumtest sowie ein BOWIE-DICKTest (Dampfdurchdringungs- oder Entlftungstest mittels spezieller Indikatorbgen) durchzufhren. Selbstverstndlich ist die korrekte Beschriftung des Sterilgutes mit Sterilisations- und Verfallsdatum, Gertebezeichnung. ChargenNummer und Inhaltsangabe. Das System der subtilen engmaschigen berprfung, insbesondere bei der Sterilisation, gewhrleistet, da nahezu jeder Sterilisationsfehler rechtzeitig erkannt wird und Chargen nicht ausgeliefert oder zurckgezogen werden knnen.

97

2.2.5 berprfung der Desinfektion und Sterilisation


Die regelmige Kontrolle von Desinfektionsbzw. Sterilisationsgerten ist eine wichtige Manahme im Sinne der Qualittssicherung. Es ist zu unterscheiden zwischen dem biologischen (sogenannte Bioindikatoren), chemischen und physikalischen Monitoring (z.B. Zeit, Temperatur, Druck). Bioindikatoren sind spezielle Aufbereitungen von Testorganismen, die den Desinfektions- bzw. Sterilisationsverfahren unterzogen werden und die bei einwandfreier Funktion eine bestimmte Keimzahlreduktion erfahren bzw. nicht mehr anzchtbar sind. Sie dienen dem Nachweis der korrekten Funktion von Desinfektions- und Sterilisationsgerten unter Praxisbedingungen.
Der berprfung von Desinfektionsmaschinen (z.B. Instrumenten-, Ansthesie-, Steckbecken- und Waschmaschinen) dient als Bioindikator Enterococcus faecium ATCC 6057 (siehe DIN Norm 58949). Autoklaven werden nach DIN berprft mit Bacillus stearothermophilus ATCC 7953, Heiluftsterilisatoren mit B. sublilis ATCC 9372 nach DIN 58947, Formaldehydsterilisatoren mit B. stearothermophilus ATCC 7953 und Ethylenoxidsterilisatoren mittels B. subtilis ATCC 9372. Weitere Angaben zur Validierung der Sterilisation finden sich in den europischen DIN EN-Normen. Die berprfung sollte in der Regel routinemig mindestens lA-jhrlich erfolgen bzw. abhngig von der Chargen-Zahl. Die CDC empfehlen die berprfung mittels Bioindikatoren bei Sterilisatoren sogarwchentlich und bei Implantaten je Charge.

2.2.6 Desinfektion und Sterilisation beim CREUTZFELDT-JAKOB(CJ)Erreger


Prionen (infektise Eiweie) als Erreger der CJ-Erkrankung, zeichnen sich durch eine besondere Resistenz gegen Desinfektions- und Sterilisationsmanahmen aus. Infolgedessen sollten bevorzugt Einmalmaterialien bei Patienten mit CREUTZFELDT-JAKOB-Erkrankung - insbesondere bei Eingriffen an Gehirn, Rckenmark oder Auge - verwendet werden. Das RKI gab nachfolgende Empfehlungen. Zur effektiven Sterilisation ist Autoklavieren bei 134 C ber 1 h erforderlich. Zuvor ist bei Instrumenten nach Eingriffen auerhalb von ZNS und Auge eine Desinfektion mit 1-2 M NaOH oder 2,5-5% Natriumhypochlorit fr 1 h mit mechanischer Zwischenreinigung und anschlieendem Aufbereitungszyklus in einem Desinfektions- und Reinigungsapparat bei 93 C durchzufhren. Nach neurochirurgischen Eingriffen ist vor der Dampfsterilisation eine Desinfektion mit 1-2 M NaOH oder 2,5-5% Natriumhypochlorit ber 24 h durchzufhren. Oberflchen, die mit Liquor kontaminiert wurden, sollten mit 2,5% Natriumhypochlorit oder

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Mikrobiologische Diagnostik

1-2 M NaOH 1 h desinfiziert werden. Abflle, die mit erregerhaltigem Material kontaminiert sein knnen, sind als Abfall der Gruppe C (sog. infektiser Abfall) durch Verbrennen zu entsorgen. Schnitt- und Stichverletzungen bei der Liquor-Entnahme oder bei der Probenentnahme und Weiterverarbeitung von Material auerhalb von ZNS/Auge sollten nach ausgiebigem Splen mit Wasser mittels 2,5% Natriumhypochlorit fr 5 min desinfiziert und anschlieend erneut mit Wasser gewaschen werden. Nach Verletzung an Instrumenten/Material, die mit Hirn, Rckenmark oder Augengewebe in Berhrung gekommen sind, sollte nach intensivem Splen mit Wasser die Wunde mit 2,5% Natriumhypochlorit fr 5 min desinfiziert, danach exzidiert und chirurgisch versorgt werden. Nach Spritzern von potentiell mit CREUTZFELDT-JAKOB-Erregern kontaminiertem Material ins Auge oder auf Schleimhute sollte unverzglich ausgiebig mit Wasser gesplt werden. Nach Kontamination der unverletzten Haut mit Geweben hoher Infektiositt sollte eine Desinfektion mit 1 M NaOH bzw. 2,5% Natriumhypochlorit-Lsung fr 5 min mit nachfolgendem Abwaschen mit Wasser erfolgen. Ansonsten gengt das grndliche Abwaschen mit Seife. Die Natriumhypochlorit-Lsung ist max. 4 Wochen in einer geschlossenen Plastikflasche aufzubewahren.

Desinfektionsmittelliste der Deutschen Veterinrmedizinischen Gesellschaft (DVG) fr den Lebensmittelbereich. Schlter'sche GmbH. Hannover 2/1999 und 10/2000. DKTTENKOKER, M. und F. DASCHNER: Umweltschonende Sterilisation und Desinfektion In: Praktische Krankenhaushygiene und Umweltschutz (Hrsg.: F. DASCHNHR), Springer, Berlin 1997. Liste der vom RoBERT-KoCH-Institut geprften und anerkannten Desinfektionsmittel und -verfahren. Bundesgesundheitsbl. 9. 1997. Richtlinie fr Krankenhaushygiene und Infektionsprvention des RoBERT-Koc'H-Institutes. Fischer, Stuttgart 2000. RUTALA, W. A.: Disinfection. Sterilisation and waste disposal. In: Prevention and control of nosocomial infections. (Ed. R. P. WENZEL), Williams & Wilkins. Baltimore 1997.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren


KLAUS PETER SCHAAL, JOACHIM KHN

2.2.7 Schlubemerkung
Grundstzlich gelten Blut/Sekrete von allen Patienten als potentiell infektis, so da alle benutzten Instrumente/Gertschaften aus Personal- wie Patientenschutzgrnden vorsichtig und sorgfltig gehandhabt und wiederaufbereitet bzw. entsorgt werden sollen. Desinfektionsund Sterilisationsmanahmen knnen bei korrekter Anwendung die sichere Nutzung von invasiven und nichtinvasiven medizinischen Utensilien garantieren. Dies setzt die strikte Einhaltung der Arbeitsanleitung, die in Hygiene- und Desinfektionsplnen schriftlich fixiert sein sollten, sowie die regelmige fachgerechte Schulung des medizinischen Personals voraus. Literatur
Desinfektionsmittelliste der Deutschen Gesellschaft fr Hygiene und Mikrobiologie (DGHM).mhp-Verlag, Wiesbaden 2000.

Die mikrobiologische Diagnostik, d.h. die Diagnostik von Infektionskrankheiten mittels mikrobiologischer, serologischer und molekularbiologischer Untersuchungsverfahren, ist ihrem Wesen nach immer tiologisch ausgerichtet; sie versucht also, die Ursache einzelner Infektionsprozesse durch den Nachweis der jeweils verantwortlichen Erregerart(en) individuell aufzuklren. Dazu bedient sie sich traditionell mikroskopischer und kultureller Techniken, denen Proben des entzndeten oder nekrotischen Gewebes oder Krperflssigkeiten, Ex- und Sekrete unterworfen werden und mit denen die Anwesenheit pathogener Mikroorganismen am unmittelbarsten belegt oder ausgeschlossen werden kann. Zuweilen gelingt die tiologische Abklrung einer Infektionskrankheit aber zuverlssiger und gegebenenfalls schneller durch die gezielte biochemische oder serologische Suche nach typischen Stoffwechsel- (z.B. Exotoxinen. niederen Fettsuren) oder Zerfallsprodukten (z.B. Kapselantigenen) der verdchtigen Erreger, durch den Nachweis erregerspezifischer Nukleinsuren oder durch den diagnostischen Tierversuch. Angezchtete Mikroben, die nicht a priori als Kontaminanten oder Vertreter der physiologischen Krperoberflchenflora erkennbar sind, bedrfen grundstzlich der anschlieenden genauen Identifizierung (Tab. 2.4)

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

99

Tab. 2.4 Identifizierung von Bakterien


Merkmale (Auswahl) Zellmorphologie Zellform und -lagerung Frbeverhalten Kapselbildung Sporenbildung, -Form, -Position Beweglichkeit Begeielung Kulturmorphologie Kolonieform Wachstum in flssigen Medien Molekularbiologische Merkmale Chemotaxonomische Merkmale Peptidoglykan-Bausteine Lipide Physiologische Eigenschaften enzymatische Leistungen Assimilationsvermgen Stoffwechselendprodukte Antigen Struktur Toxinbildung Pathogenitt/Virulenz
1 5

Nachweisverfahren (Auswahl) Nativprparat, Phasenkontrast- oder Dunkelfeldmikroskopie verschiedene Frbungen, Hellfeldmikroskopie Tuscheprparat Einfachfrbung oder Sporenfrbung Hngender Tropfen" 1 Geielfrbung oder EM

Lupenbetrachtung, Stereoauflichtmikroskopie makroskopische Betrachtung DNA-Sonden, rRNA-Sonden mit und ohne PCR DC , CLC DC, CLC
3 4 2

Bunte Reihe", miniaturisierte Identifizierungssysteme Auxanogramm 5 GLC, HPLC verschiedene serologische Verfahren Toxin-Antitoxin-Tierversuch, Gewebekulturtests, serologische Nachweisverfahren Tierversuch, evtl. Gensonden

Elektronenmikroskopie;2 Polymerase-Ketten-Reaktion; 3 Dnnschichtchromatographie;" Gaschromatographie; Hochdruckflssigkeitschromatographie

und, in Abhngigkeit von der Natur des Erregers, der Empfindlichkeitsprfung gegenber geeigneten antimikrobiellen Chemotherapeutika. Aufgabe dieses Kapitels ist es nicht, detaillierte Kenntnisse mikrobiologischer Untersuchungsverfahren zu vermitteln, wie sie erst im Rahmen der Weiterbildung zum Facharzt fr Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie erworben werden mssen. Die folgenden Ausfhrungen sollen vielmehr Verstndnis fr die Mglichkeiten und Grenzen der mikrobiologischen Diagnostik wecken. Sie sollen dem nicht mikrobiologisch ttigen (angehenden) Arzt soviel an Basiswissen an die Hand geben, da er in die Lage versetzt wird, geeignete Untersuchungsmaterialien auszuwhlen und technisch einwandfrei zu gewinnen, mikrobiologische Befunde sachgerecht zu bewerten und - am besten im Dialog mit dem Mikrobiologen - das optimale therapeutische Vorgehen festzulegen und eventuell geeignete Manahmen zur Ausbreitungskontrolle einzuleiten.

2.3.1 Mikrobiologische Untersuchungsverfahren


Untersuchungsdauer

Die im mikrobiologischen Laboratorium eingetroffene Materialprobe mu oft mehrere verschiedene Arbeitsgnge durchlaufen, bevor eine endgltige und fachgerechte Beurteilung abgegeben werden kann. Dies ist an sich schon ein zeitfordernder Proze. Darber hinaus haben aber insbesondere Erregerkultur und Tierversuch auch einen eigenen, charakteristischen Zeitbedarf, der, in Abhngigkeit von der individuellen Generationszeit - oder Virulenz - der jeweiligen Mikrobenart, in Stunden, Tagen oder Wochen (z.B. zum Nachweis von Tuberkelbakterien) zu bemessen ist. Damit wird verstndlich, da ein verllicher mikrobiologischer Befund, von den seltenen Ausnahmen einer rein

100

Mikrobiologische Diagnostik

mikroskopischen Diagnosestellung oder von den modernen Verfahren zum Antigen- oder Nukleinsure-Nachweis abgesehen, frhestens nach ein bis zwei Tagen, zuweilen aber auch erst nach einer oder mehreren Wochen erbracht werden kann. Sogenannte Schnellverfahren, auch solche auf der Basis von Nukleinsure-Amplifikations-Techniken (NAT), auf deren Entwicklung in letzter Zeit vermehrt Gewicht gelegt wurde, haben daran bisher grundstzlich wenig gendert, da sie in der Regel nur einen sehr speziellen Einsatzbereich haben und die kulturellen Verfahren in vielen Fllen eher ergnzen als ersetzen knnen.
Zur eigentlichen Untersuchungsdauer addieren sich hufig noch die Transportzeiten fr die Proben und die Zeit fr die bermittlung des schriftlichen Befundes, so da der behandelnde Arzt gerade bei akuten oder gar lebensbedrohenden Infektionen das mikrobiologische Untersuchungsergebnis selbst bei Verwendung von Schnellverfahren fr die Planung der erforderlichen Sofortbchandlung oft nicht abwarten kann. Wegen dieser Problematik sollte er aber nicht auf die mikrobiologische Untersuchung verzichten, sondern sie unbedingt zur Besttigung seiner klinischen Verdachtsdiagnose und zur oft notwendigen, ja lebensrettenden Korrektur der Primrtherapie einsetzen. Auerdem lt sich durch organisatorische Manahmen wie Botentransport und telefonische, Fax- oder E-Mail-bermittlung vorlufiger Befunde das informatorisch leere Intervall zwischen Materialentnahme und erstem Untersuchungsergebnis in der Regel erheblich verkrzen. Eine do-it-yourself -Mikrobiologie in Klinik oder Praxis, die heute mit dem Argument der Zeit- und Kostenersparnis vermehrt propagiert und praktiziert wird, hat sich aus unserer Sicht als Ausweg aus den genannten Schwierigkeiten nicht als sinnvoll erwiesen. Denn die medizinische Mikrobiologie hat sich inzwischen wie viele andere medizinische Disziplinen zu einem so komplexen und methodisch so aufwendigen Fach entwickelt, da sie, wie die Ergebnisse der externen Qualittssicherung ber Ringversuche belegen, nur der erfahrene Spezialist in einem gut ausgersteten Laboratorium mit optimalen Ergebnissen, ohne Verste gegen ethische und rechtliche Normen kostengnstig ausben kann. Die unabdingbaren Kenntnisse und Erfahrungen knnen verstndlicherweise auch nicht durch industriell vorgefertigte, einfache Nachweis- und Identifizierungssysteme ersetzt werden, selbst wenn Gebrauchsanleitungen und umfangreiche Auswertungsschemata einschlielich der zuge-

hrigen EDV-Datensammlungen und Auswertungsprogramme dies nahezulegen scheinen.

Allgemeine mikrobiologische Arbeitsbedingungen Alle mikrobiologischen Untersuchungsgnge erfordern Arbeitsbedingungen, welche die Gefhrdung des im Laboratorium ttigen Personals so gering wie mglich halten, Kontaminationen von klinischem Material und Kulturmedien vermeiden und beste Mglichkeiten bieten, vorhandene Erreger auch tatschlich nachzuweisen. Dazu wurden aus der Erfahrung heraus und gesttzt durch den Erkenntnisfortschritt Instrumente, Methoden und Verhaltensweisen entwickelt, die in ihrer Anwendung und Zielsetzung dem strengen Ritual der Antiseptik in der Chirurgie hnlich sind. Wichtigstes Instrument in der Bakteriologie ist seit Jahrzehnten die Impfnadel oder Impfse aus Platindraht (Abb. 2.4), die in einem geeigneten Halter (z.B. nach KOLLE) befestigt ist. Vor und nach jedem Gebrauch wird sie in der nichtleuchtenden, also besonders heien Bunsenbrennerflamme zur Sterilisation ausgeglht. Mit einer solchen sterilen se werden Untersuchungsmaterialien auf Objekttrger und verschiedene Kulturmedien bertragen oder bereits gewachsene Kulturen von einem Nhrboden auf den anderen berimpft. Das vom Erfahrenen automatisch vorgenommene Ausglhen der se verhindert die ungewollte Verbreitung von Krankheitserregern im Laboratorium und die irrefhrende Verunreinigung von Lsungen und Kulturanstzen. Heute werden hufig sterile Einmalsen aus Kunststoff verwendet, bei denen sich das Ausglhen erbrigt, das bei unsachgemer Ausfhrung zu einer erhhten Infektionsgefahr beim technischen Personal fhren kann. Funktionen sind die Einmalsen allerdings den Platinsen eindeutig unterlegen. Kontaminationen von Instrumenten, Medien und Kulturen durch luftgetragene, mikrobenhaltige Teilchen knnen durch rasches Arbeiten gering gehalten werden. Sicher lassen sich aerogene Verunreinigungen aber nur durch Arbeiten an einer reinen Werkbank" verhin-

Abb. 2.4 Bakteriologische Impfse mit Halter.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

101

dern, die eine bis auf einen Spalt zur Einfhrung der Hnde abgeschlossene Kabine ist, welche mit keimfrei gefilterter Luft durchstrmt wird. Bei entsprechender Fhrung der turbulenzarmen Luft sichert ein solches System auch das Personal vor Infektionen durch infektise Aerosole {Sicherheitswerkbank"). Eine weitere Reduktion der Infektions- und Kontaminationsgefahr wird durch eine hufige desinfizierende Reinigung der Arbeitstische und durch die Desinfektion und anschlieende Sterilisation der Werkzeuge (z.B. Pipetten, Spritzen. Reagenzglser) unmittelbar nach jedem Gehrauch erreicht.
Mikroskopische Untersuchungsverfahren

pie nher eingegangen, weil diese Verfahren auch auerhalb des mikrobiologischen Laboratoriums in Klinik und Praxis sinnvoll einsetzbar sind:
Nativprparate

Mikroskopische Untersuchungsverfahren knnen zur Auffindung, Zhlung, morphologischen Beurteilung und (seltener) Identifizierung von Mikroorganismen eingesetzt werden. In der medizinischen Bakteriologie dienen sie hauptschlich der vorlufigen Orientierung ber den Baktericngehalt klinischer Materialproben und der Prfung der Zellformen, Beweglichkeit, Frbeeigenschaften und Einheitlichkeil von Kulturen; eine mikroskopische Artdiagnose bakterieller Krankheitserreger ist nur in Verbindung mit serologischen Methoden (Immunfluoreszenztechnik) zuverlssig mglich. Protozoen und viele Pilze lassen sich demgegenber oft allein anhand ihres mikroskopischen Erscheinungsbildes identifizieren; das Mikroskop besitzt daher fr die Untersuchung dieser Kleinstlebewesen einen deutlich hheren Stellenwert als fr die bakteriellen Mikroorganismen.
Wegen der Grenordnung und Lichtbrechungseigenschatten der meisten Bakterien mssen Lichtmikroskope mit leistungsfhigen Objektiven und Einrichtungen zur Erhhung des Kontrastes (z.B. verstellbaren Blenden und Kondensoren) ausgerstet sein. Die Gestalt dieser Mikroorganismen lt sich am besten mit Immersionsobjektiven prfen, die bei hohem Auflsungsvermgen eine Endvergrerung zwischen 500- und lOOOfach ermglichen. Eine Verstrkung der Lichtbrechung kann durch Anfrben oder Spezialverfahren wie die Dunkelfeld- oder Phasenkontrast-Mikroskopie erreicht werden. Zur Detaildarstellung von Oberflchen- oder Innenstrukturen bakterieller Zellen ebenso wie zur Darstellung von Viren mssen allerdings raster- oder transmissionselektronenmikroskopische Techniken herangezogen werden, welche freilich nicht zum Routineprogramm des mikrobiologischen Laboratoriums gehren.

Bei mittlerer bis starker Vergrerung, ausreichender Abblendung des Hellfeldes oder Verwendung der Dunkelfeld- oder Phasenkontrasttechnik lassen sich Bakterien und andere, wenigstens gleich groe Mikroorganismen nativ, das heit ohne vorausgehende abttende und eventuell formverndernde Fixierung und Frbung, unter dem Lichtmikroskop sichtbar machen. Da aus optischen und physiologischen Grnden meist wrige Aufschwemmungen untersucht werden, kann man in solchen Nativprparaten besonders einfach den Nachweis der Beweglichkeit fhren.
Deckglasprparate. Ein Tropfen bewachsener Kulturflssigkeit oder bakterienhaltiger Ex- und Sekrete wird mit der sterilen se unmittelbar auf einen sauberen Objekttrger aufgebracht, mglichst ohne Luftblaseneinschlsse mit einem Deckglas bedeckt und mil einem Objektiv ausreichender Auflsung (mit oder ohne l- oder Wasserimmersion) mikroskopiert. Dieses Verfahren wird z.B. zum Nachweis lebender Syphilisspirochten im Reizserum, von Leptospiren in Kulturflssigkeiten oder von Rckfallfiebererregern (Borrelien) im Zitratblut unter Zuhilfenahme des Dunkclfeldmikroskopes eingesetzt. Deckglasprparate mit Vitalfrbung. Morphologisch differenziertere Mikroorganismen wie Aktinomyzeten, Pilze oder Protozoen lassen ihre verschiedenen diagnostisch wichtigen Strukturen besser erkennen, wenn man der Suspensionsflssigkeit einen Farbstoff zugibt, der von den lebenden Zellen rasch aufgenommen wird. Fr Pilze und Aktinomyzeten erfllt diesen Zweck Laktophenol-Baumwollblau-Lsung; Protozoen frben sich mit gepufferter Methylenblau-Lsung typisch an. Auerdem kann man fr die Pilzdiagnostik undurchsichtiges, verhorntes Material (Hautschuppen, Haare, Nagelgeschabsel) durch Einbetten in etwas Kalilauge aufhellen. Bei myzelial wachsenden Mikroorganismen (Aktinomyzeten, Pilzen), deren Geflechtstruktur und Fruchtformen in der Originalanordnung beobachtet werden sollen, kann eine Modifikation des Deckglasprparates, die Deckglaskultur, ntzlich sein. Dabei lt man den zu untersuchenden Mikroorganismus von einem geeigneten Agarnhrboden auf die Oberflche des verwendeten Deckglases hinberwachsen, das dann vorsichtig abgenommen und, mit der Schichtseite z.B. in Laktophenol-Baumwollblau-Lsung eingebettet, mikroskopiert wird. Hngender Tropfen". Die Beweglichkeit bakterieller und anderer Kleinstlebewesen lt sich unter Routinebedingungen bequem und zuverlssig mit der Methode des hngenden Tropfens" prfen. Dazu bentigt

Im folgenden wird nur auf die einfacheren Prparationsmethoden fr die Lichtmikrosko-

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Mikrobiologische Diagnostik

man ein Deckglas, einen Hohlschliffobjekttrger und etwas Vaseline oder dickflssiges Paraflinl, welche ringfrmig um die Aushhlung des Objekttrgers gestrichen werden. Ein Tropfen der zu untersuchenden mikrobenhaltigen Suspension wird in die Mitte des Deckglases gegeben und der Hohlschliffobjekttrger wird so daraufgesetzt, da der Tropfen in der Mitte der Vertiefung liegt und das Deckglas durch die Vaseline luftdicht fixiert wird. Das Prparat kann nun ohne Mhe umgedreht und durch das Deckglas, von der Rckseite des Tropfens, mikroskopiert werden. Die Beweglichkeit vorhandener Mikroorganismen lt sich vor allem im Randbereich des Tropfens zuverlssig beurteilen (cave: Verwechslung mit BROWNscher Molckularbewcgung!). Negativdarstellung (Tuscheprparat). Zur exakteren Darstellung der ueren Konturen mikrobiellcr Zellen und zum Nachweis von Kapseln empfiehlt sich das Tuscheprparat nach BURRI: Die mit schwarzer Tusche vermischte Mikrobensuspension (Untersuchungsmaterial. Bouillonkulluren oder Kolonieaufschwemmungen) wird wie ein Blutausstrich auf dem Objekttrger ausgezogen, luftgetrocknet und gegebenenfalls schonend fixiert. Sodann wird das Prparat ohne Deckglas mit limmersion mikroskopiert. Wenn man den Ausstrich vorher mit einem der in der Mikrobiologie blichen Farbstoffe (s.u.), die nur vom Zellkrper, nicht aber von den Kapselsubstanzen aufgenommen werden, anfrbt, kann man mikrobielle Schleimkapseln als farblose Aussparungen im Tuschefilm, die den Zelleib umgeben, besonders einfach und deutlich erkennen.

Gefrbte Prparate Die Frbung mikroskopischer Prparate dient zur besseren Sichtbarmachung und Differenzierung von Mikroorganismen, aber auch zur gezielten Darstellung bestimmter Zelleinschlsse und Organellen. Vorbereitung der Prparate. Das zu untersuchende Material wird in einem vorher mit Fettstift (an der Unterseite) oder Diamantschreiber (an der Oberseite) markierten Bezirk mit se oder Tupfer dnn und gleichmig auf den Objekttrger aufgetragen. Nach vollstndiger Lufttrocknung wird es fixiert, was fr alle Routinefrbungen durch dreimaliges langsames Durchziehen durch die leuchtende Bunsenbrennerflamme (mit der Schichtseite nach oben) geschieht. Diese Hitzefixierung ist notwendig, damit die Bakterien bei den nachfolgenden Frbeund Waschvorgngen am Objekttrger haften bleiben. Einfachfrbungen. Bei den Einfachfrbungen wird in einem Arbeitsgang eine Farbstofflsung, die nur eine frbende Komponente enthlt, auf den Objekttrger aufgebracht; die Mikroorganismen nehmen dabei den Farbton der verwen-

deten Lsung an. Solche Einfachfrbungen erlauben eine bessere Unterscheidung der Mikroorganismen von unbelebtem organischen Material und eine gute Beurteilung ihrer Gestalt und Gre. Am gebruchlichsten ist die LOEFFLERsche Frbung mit alkalischem Methylenblau; vergleichbare Ergebnisse kann man aber auch mit anderen basischen Farbstoffen erzielen. Zur Durchfhrung der Frbung wird das fixierte Prparat mit der Schichtseile nach oben auf eine Frbebank gelegt und reichlich mit Farblsung berdeckt. Alternativ kann es in eine Frbekvette, welche die entsprechende Farblsung enthlt, eingetaucht werden. Nach einer Einwirkungszeit von etwa 1 min wird der Objekttrger mit Leitungswasser abgesplt und unter leichtem Andrcken zwischen Fliepapier getrocknet. Anschlieend wird das Prparat ohne Deckglas mit limmersion mikroskopiert. Differentialfrbungen. Differentialfrbungen arbeiten mit mindestens zwei verschiedenen Farbstoffen, deren Lsungen nacheinander oder gemischt verwendet werden. Hufig liegen zwischen den einzelnen Frbeschritten Waschvorgnge, welche die zuerst applizierte Farbe aus manchen Mikroorganismen oder Strukturen wieder herauslsen, so da sich diese am Ende nur im Farbton der zweiten Farblsung (Gegenfrbung) darstellen, whrend die brigen Mikroben oder Mikrobenbestandteile eine Frbung zeigen, welche der ersten, meist strkeren Komponente oder einer Mischung aus beiden Farbstoffen entspricht. Die sich auf diesem Wege ergebenden unterschiedlichen Reaktionsausflle knnen zur Differenzierung und Identifizierung von Bakterien und anderen Mikroorganismen herangezogen werden. Differentialfrbung nach GRAM. Im Jahre 1884 wurde von dem dnischen Internisten, Pathologen und Pharmakologen HANS CHRISTIAN JOACHIM GRAM (1853-1938) eine Frbemethode angegeben, die er zur besseren Sichtbarmachung von Bakterien in Gewebeschnitten entwickelt halte. Erst spter stellte sich heraus, da dieses Verfahren eine weit ber seinen ursprnglichen Zweck hinausgehende praktische und taxonomische Bedeutung besitzt. Es erlaubt nmlich, das Bakterienreich einfach und schnell in zwei groe Gruppen zu unterteilen, deren Mitglieder sich hinsichtlich ihres Zellwandaufbaus (s. Kap. 3.1.2) und einiger anderer Eigenschaften grundlegend unterscheiden. Zur Durchfhrung einer GRAM-Frbung, die seit langem zu einem der wichtigsten Verfahren

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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in der diagnostischen Mikrobiologie geworden ist, gehren die folgenden Arbeitsgnge: Hitzefixiertc Prparate werden zunchst auf der Frbebank fr 1 bis 2 min mit einer frisch filtrierten, wrig-alkoholischen Lsung (eventuell mit Zusatz von Ammoniumoxalat, Anilinl und/oder Phenol) einer der basischen Pararosanilinfarben (Gentianaviolett, Methylviolett, Kristallviolett. Hexamethylviolett) bedeckt. Anschlieend wird die Farbe mit LuGOLscher Lsung (Jodjodkalilsung) abgesplt, und das Prparat bleibt zur Beizung fr weitere f bis 2 min mit dieser Lsung berflutet. Nach Abkippen der Beize entfrbt man mit mehreren Portionen 95%igen thylalkohols (oder mit Azeton oder einer Alkohol-Azeton-Mischung, die rascher entfrbend wirken), bis keine sichtbaren Farbwolken mehr abgehen. Unmittelbar anschlieend wird der Entfrbungsproze durch kurzes Absplen mit Leitungswasser unterbrochen (dieser Schritt der Frbung bzw. Entfrbung ist kritisch und mu genau terminiert werden), und das Prparat wird fr 1/2 bis f min mit verdnnter Safraninlsung gegengefrbt. Bakterien, deren Zellwand aus mehreren, miteinander vernetzten Peptidoglykanschichten besteht, halten die eingebeizte GRAM-Farbe (z.B. Phenol-Gentianaviolctt) im Inneren, nicht in der Zellwand, trotz der entfrbenden Wirkung des Alkohols oder Alkohol-Azeton-Gemisches fest; sie werden als gram-positiv bezeichnet und

stellen sich unter dem Mikroskop blau-schwarz bis dunkel-violett dar (Abb. 2.5; Abb. 2.6-2.11, Farbtafeln). Bakterien, deren Zellwand demgegenber nur ber eine dnne, einzelne Murcinschicht verfgt, geben den violetten Farbstoff unter Alkohol- bzw. Azetoneinwirkung schnell und vollstndig ab und nehmen die rosa bis rote Farbe der Gegenfrbung an. Diese Bakterien nennt man gram-negativ (Abb. 2.5; Abb. 2.12-2.14, Farbtafeln).
Der Ausfall der GRAM-Frbung wird allerdings nicht nur von der chemischen Zusammensetzung und Struktur der Zcllwndc der untersuchten Bakterien bestimmt, sondern er wird zustzlich auch durch das Alter der Kulturen, den Vitaliltszusland der Organismen, die Schichtdicke des Prparates und die bung und Erfahrung des Untersuchers beeinflut. Unter ungnstigen biologischen und/oder technischen Bedingungen knnen deshalb gram-positive Bakterien flschlich gram-negativ erscheinen und umgekehrt. Differentialfrbung nach ZIKHI und NKKI.SF.N.

Die meisten Bakterien lassen sich mit den erwhnten und vielen anderen Farbstofflsungen einfach und schnell anfrben. Einige Arten, insbesondere solche der Gattungen Mycobacterium und Nocardia, nehmen die blichen Farbstoffe jedoch nur schlecht oder langsam an; dies ist auf die Anwesenheit von Lipidcn (Wachsen, freien Mykolsuren) zurckzufhren, die in der ueren Zellwand lokalisiert sind und eine Penetrationsbarriere fr wrige Lsungen bilden. Haben sich solche Mikroben allerdings einmal

Abb. 2.5 Schematische


Darstellung des Frbeverhaltens bei der GRAMFrbung.

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Mikrobiologische Diagnostik

angefrbt, geben sie den Farbstoff selbst bei Behandlung mit drastischen Entfrbungsmitteln nur schwer wieder ab. Sogar starke Suren wie Salz- oder Schwefelsure oder Salzsure-Alkohol-Gemische vermgen auch bei relativ langer Einwirkung keine Entfrbung herbeizufhren. Diese Mikroorganismen werden deshalb als surefest, oder in diesem Zusammenhang besser frberisch-surefest, bzw. sure-alkohol-fest, bezeichnet.
Der Entdecker dieses Phnomens ist PAUL EHRLICH, der 1882 zur Darstellung des Tubcrkelbakteriums die Frbung mit Anilin-Methylviolett, die Differenzierung mit Salzsure und die anschlieende Gegenfrbung mit Bismarck-Braun empfahl. Der Lbecker Neurologe FRANZ ZIF.HL (1857-1926) und der Dresdner Pathologe FRIEDRICH KARL ADOLF NEELSEN (1854-1894) haben das EHRLiCHsche Verfahren 1882 und 1883 durch Einfhrung anderer Farben und Entfrbungsmittel soweit vervollkommnet, da es im Prinzip trotz verschiedener, geringfgiger Modifikationen bis heute unverndert unter dem Namen ,.ZIKHL-NEKLSEN-/W/}II" erhalten geblieben ist. Methodisch geht man bei der ZlEHL-NEELSEN-Frbung wie folgt vor: Der hitzefixierte Bakterienausstrich wird vollstndig mit wrig-alkoholischer Karbolfuchsinlsung bedeckt. Um den Farbstoff rasch in die Bakterien eindringen zu lassen, wird der Objekttrger auf der Frbebank von unten mit der leuchtenden Bunsenbrennerflamme dreimal vorsichtig bis zum Dampfen (nicht Kochen!) erhitzt. Dann wird er mit Leitungswasser kurz abgesplt und anschlieend mit 3%igcm Salzsurealkohol krftig entfrbt. Nach erneutem Absplen wird mit 0,3-1.0%iger, wriger Methylenblaulsung gegengefrbt.

Polkrnchenfrbung nach NEISSER. Die Zellen


mancher gram-positiver Bakterien, vor allem von Corynebacterium diphtheriae, enthalten metachromatische Granula, sogenannte Polkrnchen, die fr die mikrobiologische Diphtheriediagnostik groe praktische Bedeutung besitzen. Ein spezielles Frbeverfahren, welches diese Granula blau-schwarz hervorhebt, wurde 1897 von dem Bakteriologen MAX NEISSEK (1869-1938) in Frankfurt am Main entwickelt und wird nach ihm heute NEiSSER-Frbung genannt. Bei der NRISSER-Frbung wird das hitzefixierte Prparat zunchst fr 2 min mit einer frisch hergestellten Mischung aus 2 Teilen einer wrig-alkoholischen Eisessig-Methylenblau-Lsung und 1 Teil einer wrig-alkoholischen Kristallviolettlsiing bedeckt und anschlieend fr 1 min mit wriger Chrysoidinlsung gegengefrbt. Polkrnchen stellen sich schwarz-blau in einem gelb-braun gefrbten Baklerienkrper dar. Weitere in der Mikrobiologie gebruchliche Fr-

Surefeste Bakterien erscheinen unter dem Mikroskop rot (s. Abb. 2.16, 2.17, Farbtafeln), whrend alle anderen Bakterien sowie Schleim, Leukozyten und Epithelzellen blau aussehen. Die Frbung ist von auerordentlichem Wert bei der Suche nach Mykobakterien, insbesondere Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium leprae, in klinischen Untersuchungsmaterialien und fr die Differenzierung von verdchtigen Kulturen. Die Surefestigkeit von aeroben Aktinomyzeten (z.B. Nocardia- und RhodococcusArten) ist meist schwcher ausgeprgt und wird nur nach kurzer Entfrbung mit l%iger Schwefelsure zuverlssig nachweisbar. Auf dem Prinzip der ZiEHL-NEELSEN-Frbung beruhen auch die Fluoreszenzfrbungen, bei denen sich Mykobakterien selektiv mit fluoreszierenden Farbstoffen (z.B. Auramin oder Auramin-Rhodamin) anfrben und dadurch auch bei schwcheren Vergrerungen mit dem Fluoreszenzmikroskop einfach und zuverlssig auffindbar werden.

bungen. Fr besondere Fragestellungen knnen bakterielle Geieln, Kapseln oder Endosporen zur lichtoptischen Darstellung angefrbt werden. Die GRAM-Frbung von Gewebeschnitten kann nach der von KARL WEIGERT angegebenen Modifikation erfolgen. Aktinomyzeten, Pilze oder Spirochten lassen sich im Gewebe besonders deutlich durch die GROCOTT-GOMORI-Versilberungsmethode sichtbar machen. Zur Untersuchung von Protozoen und zum Nachweis von Chlamydien oder Dermatophilus eignet sich die GiEMSA-Frbung. Auf die fluoreszenzserologischen Methoden, die einen vielschichtigen Einsatzbereich haben, wird im serologischen Kapitel eingegangen.
Spezielle mikroskopische Techniken

Verfahren wie die bereits erwhnte Phasenkontrast- und Dunkelfeld-Mikroskopie werden in erster Linie zur genaueren Beurteilung der Gestalt ungefrbter, lebender Bakterien, zur Darstellung bestimmter Zelleinschlsse, zur Sichtbarmachung sehr dnner Mikroben (Spirochten) und sogar zur lichtoptischen Erkennung von Geieln eingesetzt. Polarisations- und Interferenz-Mikroskopie werden bisher in der Mikrobiologie relativ selten verwendet, knnen aber vor allem zur Klrung wissenschaftlicher Fragestellungen ntzlich sein. Fluoreszenzmikroskopie. Fluoreszenzfarbstoffe - Fluorochrome - sind chemische Verbindungen, die kurzwelliges Licht oder UV-Strahlen absorbieren und dabei Licht lngerer Wellenln-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

105

ge emittieren. Sie knnen einerseits, in Analogie zu den bereits genannten Farbstoffen, zur unmittelbaren Fluorochromierung von Mikroorganismen und anderen biologischen Strukturen verwendet werden (z.B. Auramin); sie lassen sich aber auch an Immunglobulinmolekle koppeln (z.B. Fluoreszeinisothiocyanat), ohne da ihre Fluoreszenzeigenschaften und die spezifische Bindungsfhigkeit der Antikrper verlorengehen, und dienen dann der serologischen Charakterisierung oder Lokalisierung der entsprechenden Antigene.
Um den Effekt der Fluorochromierung mikroskopisch sichtbar zu machen, mu das Mikroskop mit einer speziellen Fluoreszenzeinrichtung ausgerstet sein. Fr die klassische Durchlicht-Fluoreszenzmikroskopie bestehl diese aus einer Hochleistungslichtqueile (z.B. Hochdruck-Quecksilberdampflampe), die auch kurzwelliges Licht und UV-Strahlen ausreichender Intensitt emittiert, einem Erregerfilter, welches nur fr ein schmales Band kurzwelliger Strahlen durchlssig ist. und einem Sperrfilter, das kurzwellige Strahlen vollstndig zurckhlt, whrend es das lngerwellige Fluoreszenzlicht ungehindert zum Okular durchtreten lt. Das abzubildende Objekt leuchtet bei mehr oder weniger dunklem Hintergrund in der jeweiligen Farbe des verwendeten Fluorochroms (meist rot oder gelbgrn) auf. Kontrastreichere Darstellungen ohne strende Hintergrundhelligkeit lassen sich mit dem 1967 von PLOEM entwickelten Auflichtilluminator erzielen. Im Unterschied zur Durchlichtfluoreszenz wird hierbei die kurzwellige Erregerstrahlung von oben, durch das Objektiv, auf den Objekttrger geleitet. Dazu wird ein dichroischer Spiegel bentigt, der so im Mikroskoptubus angeordnet ist. da er die ber das Erregerfilter seitlich eintretenden, kurzwelligen Strahlen nach unten, zum Objektiv, umlenkt, von wo sie gebndelt auf das Prparat gelangen. Das entstehende Fluoreszenzlicht tritt zusammen mit reflektierten Errcgcrstrahlen ber dasselbe Objektiv ins Mikroskop zurck und erreicht, von der Gegenseite, wieder den dichroischen Spiegel, der aus dieser Einfallsrichtung lngerwelliges Licht ungebrochen durchtreten lt. Dieses Licht, eventuell gereinigt" durch ein zustzliches Sperrfilter, bildet die Untersuchungsobjekte uerst kontrastreich vor in der Regel vllig dunklem Hintergrund ab. Wegen ihrer problemloseren Darstellungseigenschaften wird die Auflichtfluoreszenztechnik heute in der Mikrobiologie meist dem Durchlichtverfahren vorgezogen.

Elektronenmikroskopie. Anstelle der Lichtstrahlen bedient sich die Elektronenmikroskopie eines Elektronenstrahls (Kathodenstrahls), der im Vakuum von einer erhitzten Kathode ausgesandt wird, sich beschleunigen lt und, analog zum lichtoptischen Strahlengang, mit elektromagnetischen Linsen" und metallischen Lochblenden so geleitet werden kann, da sich

auf einem fluoreszierenden Bildschirm oder auf der photographischen Platte Abbilder der untersuchten Objekte erzielen lassen. Entsprechend der Wellenlnge der Elektronenstrahlen ist das Auflsungsvermgen des Elektronenmikroskops bis zu KPmal grer als das des Lichtmikroskops. Deshalb ist es unersetzlich zur Aulklrung der Ultrastruktur von Mikroorganismen, zur Darstellung von Viren und zur Sichtbarmachung von Makromoleklen. Bei der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) macht man sich hnlich wie bei der Durchlichtmikroskopie die unterschiedliche Brechung und Absorption von Elektronenstrahlen an biologischen und anderen Strukturen zunutze. Damit ein greres Objekt (z.B. eine Bakterienzelle) allerdings berhaupt von Elektronen durchdrungen werden kann, mu es in extrem dnne Schnitte (Ultradnnschnitte: 20-80 nm dick) zerlegt werden, was technisch aufwendig ist und Artefakte verursachen kann. Trotzdem hat dieses Verfahren unsere Kenntnisse ber den Feinaufbau der mikrobiellen Zellen auerordentlich erweitert. Sollen dagegen sehr kleine Objekte (z.B. Makromolekle wie DNA oder auch Viren, Bakteriophagen) zur Darstellung gebracht werden, mssen sie in der Regel zunchst mit kontrastierenden Verfahren vorbehandelt werden. Diese knnen entweder in einer Negativ-Kontrastierung mit Uranylazetat (s. Abb. 5.1) oder Phosphorwolframsure oder in einer Bedampfung mit Schwermetallen (z.B. Gold) bestehen. Auerdem knnen die Gefriertztechnik, welche die Untersuchung von subzellulren Feinstrukturen (z.B. Membranaufbau) anhand einer Platin-Kohlenstoff-Kopie der durch Einfrieren und Aufbrechen freigelegten Strukturbestandteile erlaubt, oder immunchemische Verfahren (z.B. mit Ferritin-markierten Antikrpern) den Anwendungsbereich der TEM erweitern. Ein ganz anderes Einsatzgebiet hat die Rasterelektronenmikroskopie (REM). Technisch beruht sie auf der Tatsache, da ein mit Metall (gewhnlich Gold oder Platin) bedampftes Objekt unter Besch mit Kathodenstrahlen (primren Elektronen) sekundre Elektronen aussendet, die mit hnlichen Mitteln wie beim Fernsehen visualisiert werden knnen und zu einem Abbild des Untersuchungsgegenstandes fhren.
Das Auflsungsvermgen der REM ist geringer als das der TEM; dafr lassen sich mit der REM aber dreidimensionale Darstellungen in einem weiten Vergrerungsbereich erzielen, so da sie z.B. zur Unter-

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Mikrobiologische Diagnostik

suchung der Oberflchen- und Koloniestruktur von morphologisch komplexen Mikroorganismen (z.B. Pilzen, Aktinomyzeten), aber auch zur detailreichen Darstellung von Endo- und Ektoparasiten herangezogen werden kann (s. Abb. 4.1, 4.2).

Kulturelle Untersuchungsverfahren fr Bakterien und Pilze Die meisten Bakterien und Pilze knnen mit vergleichsweise einfachen Mitteln in chemisch mehr oder weniger gut definierten, unbelebten Nhrmedien zur Vermehrung gebracht werden. Obligat intrazellulre Parasiten wie Chlamydicn, Rickcttsien und alle Viren bentigen demgegenber zur Vermehrung lebende Zellen und bedrfen aus diesem Grunde zur Anreicherung und Weiterzucht des Versuchstiers, des embryonierten Hhnereis oder der Zellkultur (s. Kap. 5.1.6).
Allgemeine Kulturbedingungen fr Bakterien und Pilze

nem universellen Stickstofflieferanten fr Mikroorganismen mit unterschiedlichsten Nhrstoffbedrfnissen. Ein weiterer, uerst wertvoller und vielfltig verwendbarer Nhrmedienzusatz ist Fleischextrakt. Er ist ein dehydriertes Konzentrat von wrig abgekochtem magerem Rindfleisch und enthlt unter anderem Kreatin, Xanthin, Hypoxanthin, Harnsure, Adenylsure, Inosinsure, Glykokoll, Harnstoff und Glutamin als Stickstoffverbindungen sowie Glykogen, Hexosephosphate, Milchsure, Bernsteinsure und
wasserlsliche Lipidderivate als stickstoffreie Komponenten. Darber hinaus besitzt der kufliche Fleischextrakt einen merklichen Vitamingehalt und bietet den Mikroben so ein breites Spektrum verschiedenartiger Wuchs- und Nhrstoffe. Wenn es speziell um die Bereitstellung von Wachstumsfaktoren geht, wird allerdings gewhnlich Hefeextrakt eingesetzt, der aus kontrolliert autolysierten Hefezellen hergestellt wird und besonders reich an Vitaminen des BKomplexes ist. Viele mikrobiologische Nhrmedien enthalten Kochsalz. Natriumchlorid-Zusatz in Konzentrationen von 1-10% wird zur Anzchtung halophiler Bakterien bentigt; in isotonischen Konzentrationen dient er der Stabilisierung osmotisch fragiler Mikroorganismen (z.B. Mykoplasmen) und roter Blutkrperchen, die manchen Medien zugemischt werden. Darber hinaus gehren zur Rezeptur der meisten Kulturmedien Puffersalze (Phosphate oder Karbonate), die den pHWert des bewachsenen Systems trotz Anhufung saurer oder basischer Stoffwechselschlacken mglichst lange konstant halten sollen.

Alle menschen- und tierpathogenen Bakterien sowie die Pilze sind heterotroph oder wenigstens Kohlenstoff-heterotroph (s. Kap. 3.2.1); das Nhrmedium mu ihnen deshalb organische Kohlcnstoffvcrbindungen zur Deckung ihres Kohlenstoff- und Energiebedarfs und zuweilen auch organisch gebundenen Stickstoff fr ihre Eiweisynthese zur Verfgung stellen. Auerdem bentigen sie wie alle lebenden Zellen Wasser in ausreichender Menge und von Fall zu Fall zustzlich Mineralien, Spurenelemente und Wachstumsfaktoren (Vitamine). Fr Routinezwecke werden diese Ingredienzien dem Nhrmedium nicht einzeln und individuell zugegeben (vollsynthetisches Nhrmedium), sondern es werden komplexe biologische Substrate verwendet, von denen man annehmen darf, da sie eine natrliche Mischung wichtiger Nhr- und Wachstumsfaktoren enthalten.
Gebruchliche Bestandteile bakteriologischer

Nhrmedien. Zu den gngigsten Bestandteilen bakteriologischer Nhrmedien gehren Peptone. Dies sind Spaltprodukte tierischer oder pflanzlicher Eiweie, die durch partielle Surehydrolyse oder enzymatische Verdauung gewonnen werden. Die kommerziellen Peptonzubcreitungen fr die Bakteriologie sind chemisch nicht genau definiert, sondern setzen sich aus vielen verschiedenen, vor allem stickstoffhaltigen Komponenten einschlielich der Aminosuren zusammen. Diese Heterogenitt macht sie zu ei-

Auch Kohlenhydrate (Mono-, Di-, Tri- und Polysaccharide), Alkohole (z.B. Glyzerin, Mannit) oder Glykoside (z.B. Salizin) verbessern hufig die Qualitt von Nhrmedien, da sie fr viele Mikroorganismen besonders leicht verwertbare Kohlenstoff- und Energiequellen darstellen. Auerdem unterliegt ihr Abbau artspezifischen Unterschieden, so da sie zur Differenzierung und Identifizierung von Bakterien und Pilzen herangezogen werden knnen (s.u.). Eine wrige Lsung der genannten Ingredienzien in wechselnden Kombinationen und Konzentrationen bildet, nach Sterilisation im Autoklaven, eine flssige Nhrlsung, die traditionsgem auch als Nhrbouillon oder Nhrbrhe

bezeichnet wird. Durch Zugabe gelierender Substanzen lassen sich solche Brhen zu einer Gallerte verfestigen, die dann Nhrboden heit. Feste Nhrbden waren schon fr die Pilzzch-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

107

tung verwendet worden, als ROBERT KOCH ihren Wert fr die Bakteriologie entdeckte und damit erstmals die methodischen Voraussetzungen schuf, schnell, einfach und sicher Reinkulturen zu erzielen. Denn auf dem stark wasserhaltigen Gel vermehren sich Bakterien ebensogut wie in der Bouillon; aufgeimpfte lebende Zellen bleiben aber, von Ausnahmen abgesehen (Schwrmphnomen), mit all ihren Nachkommen ortsstndig, so da sich schlielich Bakterienhaufen bilden, die mit bloem Auge sichtbar werden und die man Kolonien nennt. Diese Kolonien sind Ansammlungen weitgehend erbgleicher Individuen (Klone), da sie, wenigstens im Idealfall, durch viele Teilungsschritte aus einer einzigen Zelle hervorgegangen sind. berpflanzt man Material einer Kolonie auf einen frischen Nhrboden, erhlt man eine weitere starke Vermehrung derselben erbgleichen Mikrobenpopulation, die Reinkultur.

Flssigkeiten mit einem gelierfhigen Nhrmedium vermischt, bevor die Gelbildung einsetzt, wachsen vermehrungsfhige Organismen nach dem Erstarren zu einzeln stehenden Tiefenkolonien aus, deren Zahl einen unmittelbaren quantitativen Rckschlu auf den Mikrobengehalt des Ausgangsmaterials erlaubt: Keimzahlbestimmung im KoCHschen Plattengu verfahren, aus-

gedrckt in koloniebildendcn Einheiten (KBE = colony forming units, CFU) pro Volumen- oder Gewichtseinheit des Ausgangsmaterials.
Als ersten gallertigen Nhrboden verwendete KOCH ab 1881 mit Gelatine verfestigte Nhrbrhe (Nhrgelatine). Gelatine hat allerdings fr den Einsatz als Geliermittel in der medizinischen Mikrobiologie zwei entscheidende Nachteile: 1. Viele Mikroorganismen knnen diesen einfachen Eiweikrper enzymatisch (Gelatinasen) abbauen; dadurch wird das Gel verflssigt, und die Kolonicbildung geht verloren. 2. Gallertc auf Gelatincbasis schmelzen" bei Temperaturen ber 28 C und knnen deshalb zur Zchtung vieler Krankheitserreger nicht benutzt werden, da deren optimale Vermehrungstemperatur um 37 C liegt.

Die Einfhrung fester Nhrbden stellt nicht nur die eigentliche Geburtsstunde der medizinischen und naturwissenschaftlichen Mikrobiologie, sondern auch die der mikrobiologischen Diagnostik dar: denn die Kolonien verschiedener Mikrobenarten unterscheiden sich oft in Gre, Oberflchen- und Randbeschaffenheit, Farbe und Konsistenz (Abb. 2.18a1) und erlauben deshalb die rasche Erkennung von Mischkulturen oder liefern wichtige Hinweise fr die Identifizierung. Wenn man mikrobenhaltige

Auf der Suche nach besser geeigneten Nhrbodenverfestigern stie KOCH 1882, durch einen Hinweis der Ehefrau seines Mitarbeiters HESSE, auf ein aus Ostasien stammendes Geliermittel, das aus roten Meeresalgen (Rhodophyzcen) gewonnen wird und das den malaiischen Namen Agar-Agar trgt. Agar-Agar, oder einfach Agar,

Abb. 2.18 Typische Kolonieformen. I. a) rund, glattrandig; b) unregelmig; c) amboid; d) wurzelig; e) filaments-myzelial II. f) glatt, halbkugelig; g) flach; h) flach mit zentralem Htchen; i) glatt und mit zentraler Delle; k) rauh und unregelmig aufgehuft; I) myzelial mit Luft- und Substratmyzel.

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Mikrobiologische Diagnostik

besteht aus hochmolekularen Galaktose-Schwefelsure-Estern und ist fast geschmack-, geruchund farblos und nach Reinigung atoxisch fr Mikroorganismen. Er ist unlslich in kaltem Wasser, lst sich jedoch in kochendem Wasser und erstarrt noch in 0,5-1,0%iger Lsung zu einer Gallerte, wenn die Temperatur unter 45^18 C absinkt. Einmal verfestigt lt sich das Agargel erst bei Temperaturen zwischen 80 und 100 C wieder verflssigen. Auerdem wird die Substanz von bakteriellen Enzymen nur ausnahmsweise angegriffen. Damit besitzt sie Eigenschaften, die sie zu einem bis heute unersetzbaren Hilfsmittel fr die Mikrobiologie werden lieen. Einige besonders anspruchsvolle Krankheitserreger bentigen fr ihre optimale Vermehrung zustzlich noch Blut (hmophile Bakterien) oder Serum im Nhrmedium. In Agarnhrbden dient die Zugabe von defibriniertem Schafblut (seltener Kaninchen-, Pferde-, Menschenblut) vor dem Erstarren oft nicht nur der Wachstumsfrderung, sondern auch der Beurteilung des Hmolyseverhaltens (s.u.) bestimmter Bakterienarten. Komplexe natrliche Proteingemische (Serum, Hhnereier) knnen neben ihrer Funktion als Nhrstofflieferanten auerdem zur Verfestigung bestimmter Nhrmedien verwendet werden, da sie bei Erhitzung gerinnen und dann hnlich wie Geliermittel wirken (z.B. LOEFFLER-Serumnhrboden zur Diphtheriediagnostik; LWENSTEiN-JENSEN-Eiernhrboden fr Mykobakterien).
Einfache bakteriologische Nhrmedien. Ein einfaches flssiges Nhrmedium und Grundbestandteil vieler Spczialsubstrate ist die Nhrbouillon nach ROBERT KOCH. Sie enthlt Fleischwasser (500 g fettfreics, gehacktes Rindfleisch in 1 1 Wasser kochen und nach dem Erkalten durch Papierfilter filtrieren) oder Fleischextrakt, 0,5% Kochsalz und 1% Pepton. Durch Zusatz von 12% Gelatine oder 1-3% Agar erhlt man die einfachsten festen Nhrbden (Nhrgelatine und Nhragar nach KOCH). Nhrmedien, die gelierende Substanzen enthalten, werden nach dem Autoklavieren auf etwa 50 C abgekhlt und dann in sterile Kulturgefe abgefllt. Dazu dienen berwiegend Petrischalen und Reagenzglser. In Petrischalen lt man das Medium in etwa 5-7 mm hoher, gleichmig dicker Schicht erstarren (Nhrbodenplatte"; frher wurden anstelle der Kulturschalen Glasplatten verwendet, der Name hat sich erhalten); Reagenzglser bleiben nach Einfllen des noch flssigen Nhrbodens senkrecht stehen (fr Stich-Kulturen) oder werden bis zum Gelieren leicht (fr Stich-Schrg-Kulturen) oder stark geneigt (fr Schrg-Kulturen) gehalten. Kultivierung in flssigen Nhrmedien. Flssige

von Mikroorganismen, die im Untersuchungsmaterial in geringer Zahl oder in vorgeschdigtem Zustand vorhanden sind. Reinkulturen lassen sich allein ber Nhrbrhen nicht oder nur unsicher erreichen. Dies ist der Grund fr den groen Fortschritt, welchen die Einfhrung der Geliermittel durch ROBERT KOCH im Vergleich zu den Arbeitsmethoden von Louis PASTEUR mit sich brachte. Liegen Reinkulturen bereits vor, kann die Bouillon zur Prfung physiologischer Leistungen oder der Antibiotikaempfindlichkeit sowie zur Beurteilung des Wachstumsverhaltens herangezogen werden.
Folgende Wuchsformen werden bei Bakterien, die in flssigem Milieu kultiviert werden, beobachtet: 1. Vermehrung mit diffuser Trbung der Brhe (z.B. bei den meist beweglichen Mitgliedern der Familie Enterohacteriaceae) 2. Bildung eines Obcrflchenhutchens (Kahmhaut) durch obligat aerobe Bakterien wie Pseudomonaden, Mykobakterien oder Nocardien 3. Wachstum in Form eines krnigen Bodensatzes ohne nennenswerte Trbung der Bouillon bei Arten mit fermentativem Stoffwechseltyp, die bei der Vermehrung grere, mehr oder weniger fest zusammenhngende Zcllaggregate ausbilden (z.B. Streptokokken, anaerobe Aktinomyzeten). In flssigen Kulturen knnen auerdem charakteristische Merkmale wie Gasbildung oder Produktion wasserlslicher Pigmente besonders gut geprft werden. Um Kontaminationen aus der Luft zu vermeiden, werden Nhrbrhen unter Schrghaltung des Kulturgefes beimpft, und dessen oberer Rand wird vor dem Aufsetzen des Verschlusses und dem Aufrichten in der Bunsenbrennerflamme abgeflammt. Zur Inokulation knnen Platinsen oder sterile Pipetten verwendet werden. Kultivierung auf festen Nhrbden. Wie bereits

Nhrmedien dienen vor allem der Anreicherung

erwhnt, dienen feste Universalnhrbden an erster Stelle zur Herstellung und berprfung von Reinkulturen. Dabei ist die Morphologie der entstehenden Kolonien ein wichtiges Hilfsmittel (s. Abb. 2.6a-l). Diese lt sich am einfachsten bei Lupenbetrachtung (6 x) beurteilen und erlaubt dem Erfahrenen unter Bercksichtigung weiterer Eigenschaften wie Vorhandensein diffusibler oder koloniestndiger Pigmente, Hmolyseverhalten, Konsistenz und Gre der Kolonien eine rasche, vorlufige Einordnung der gewachsenen Mikroben, ihre gezielte Abimpfung sowie den konomischen Einsatz der erforderlichen Differenzierungsreaktionen. Um unterschiedliche Kolonieformen in der Oberflchenkultur sicher erkennen zu knnen, mssen mikrobenreiche Materialien allerdings so aufgeimpft werden, da sie einzeln stehende

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

109

Kolonien entwickeln knnen. Unter Routinebedingungen bedient man sich dazu des sogenannten fraktionierten (Verdnnungs-) oder Dreisen-Ausstrichs (Abb. 2.19). Dieser verteilt das Tnokulum in drei Arbeitsschritten so auf der Agarplatte, da selbst Untersuchungsstoffc hoher Mikrobendichte ausreichend ausgednnt werden, um Einzelkolonien entstehen zu lassen.
Spczialnhrmedien. Die meisten Nhrbden werden heute auch kommerziell hergestellt (Fertignhrbden), oder ihre jeweiligen Ingredienzien sind fertig gemischt in Trockenform im Handel erhltlich. Hinsichtlich der Einzelheiten wird auf die Broschren der in Frage kommenden Firmen wie z.B. Becton Dickinson, bioMerieux, Biotest, Merck, Oxoid verwiesen.

Die bisher besprochenen Universalmedien ermglichen einer Vielzahl verschiedener Mikroorganismen ungehinderte Vermehrung. Sie sind deshalb weniger geeignet, aus Materialien, die gleichzeitig mehrere unterschiedliche Mikrobenarten enthalten (z.B. Sputum-, Stuhlproben), bestimmte wichtige Spezies (z.B. Krankheitserreger) gezielt nachzuweisen, insbesondere wenn letztere nur in geringer Menge vorhanden sind. Fr diesen Zweck bentigt man vielmehr Spezialnhrmedien, die das Wachstum unerwnschter Mikroben unterdrcken (Selektivmedien), die Vermehrung der gesuchten Arten berproportional frdern (Elektivmedien) oder biologische Unterschiede innerhalb der wachsenden Mischflora erkennbar machen (Differentialmedien). Anreicherungsmedien (Elektivmedien). Werden mehrere Mikrobenarten gleichzeitig in eine Nhrbrhe eingeimpft, kann es zu einem Wettstreit um vorhandene Nhrstoffe und zu gegenseitiger Behinderung durch anfallende Stoffwechselschlacken kommen. Dabei werden langsam wachsende oder zahlenmig unterlegene Spezies hufig berwuchert und entziehen sich so dem Nachweis. Durch Zugabe bestimmter selektiver Hemmstoffe oder durch Vernderung des pH-Wertes und der Kulturbedingungen kann man jedoch die an sich benachteiligten Mikroorganismen so begnstigen, da sie sich gegen ihre Konkurrenten in der Nhrlsung durchsetzen knnen und dadurch anreichern lassen. Beispiele fr Elektivmedien, die mit chemischen Inhibitoren arbeiten, sind die TetrathionatBrhe nach MLLER und die Selenit-F-Brhe nach LEIFSON zur Anreicherung von Salmonellen aus Stuhlproben. Die Nhrlsungen, die der Anzchtung von Mykoplasmen dienen, werden

Abb. 2.19 Technik des Drei-sen-Austrichs: 1. Auftragen des Untersuchungsmaterials mit se oder Tupfer. 2. Verdnnungsausstrich mit frisch ausgeglhter se durch das Ende von 1. 3. Verdnnungsausstrich mit frisch ausgeglhter se durch das Ende von 2.

zur Unterdrckung anderer Bakterien mit Penicillin G (20 IE/ml) und/oder Thalliumazetat (0,0033%) versetzt. Weitere clektive Anreicherungsprinzipien sind vom Neutralpunkt stark abweichende pH-Werte (alkalisches Pcptonwasser pH 9,5 fr Vibrionen; saure Pilznhrmedien pH 5,6), extreme Bebrtungstemperaturen (Klteanreicherung bei +4 C von Listerien; Anzucht thermophiler Bakterien bei 55 C und mehr), hoher Kochsalzgehalt (z.B. fr Staphylokokken 7,5%, Enterokokken 6,5% und halophile Vibrionen 7-10%) oder die Bereitstellung ungewhnlicher Nhrstoffe in Mangelmedien (z.B. Paraffin-Kder-Methode fr Nocardien). Selektivnhrbden. Das oben genannte Prinzip der selektiven Unterdrckung unerwnschter Mikroben durch verschiedene Inhibitoren kann auch in festen Nhrbden zur Anwendung kommen. Solche reinen Selektivmedien sind u.a. der Malzagar nach GRtz und der SABOURAUDAgar mit Chloramphenicol- und/oder Streptomycin-Zusatz, die beide durch saures Milieu und ihren Antibiotikagehalt eine Herauszchtung von Pilzen aus bakteriell stark verunreinigten Untersuchungsproben gestatten, der Kanamycin-Vancomycin-Blutagar zum kulturellen Nachweis gramnegativer Anaerobier sowie das

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Mikrobiologische Diagnostik

LWENSTEIN-JENSEN- und das STONEBRINK-MCdium, die durch ihren Malachitgrngehall das Wachstum anderer grampositiver Bakterien zugunsten von Mykobakterien unterdrcken. Diffcrentialnhrbden. Mit Differential- oder Differenzierungsmedien werden bestimmte, diagnostisch relevante physiologische (biochemische") Leistungen von Mikroorganismen geprft und durch primre oder sekundre Zugabe geeigneter Indikatorreagenzien sichtbar gemacht. berwiegend dienen derartige Nhrbden der Charakterisierung und Identifizierung bereits vorliegender Reinkulturen (s.u.); zuweilen werden sie aber auch zur Erkennung und Quantifizierung einzelner Komponenten einer natrlichen, ohne Selektionsmechanismen angezchteten Mischflora herangezogen (z.B. Zhlung von Gelatineverflssigern oder LLS-bildenden Clostridien in Trinkwasserproben).
Kombinierte Differential- und Selektivmedien. Kulturmedien, die gewisse Mikrobengruppen selektiv anwachsen lassen und gleichzeitig innerhalb der gewachsenen Arten Unterscheidungen erlauben, haben fr die medizinische Mikrobiologie grte praktische Bedeutung. Dies soll an folgenden Beispielen verdeutlicht werden: Einer der Standardnhrbden fr die kulturelle Diagnostik entcraler Infektionen - und allgemein fr Selektion und Differenzierung anspruchsloser, gramnegativer Bakterien - war der Fuchsin-Sulfit-LaktoseAgar nach ENDO. Er unterdrckt das Wachstum der meisten gram-positiven Bakterien, whrend sich Enterobakteriazeen und einige obligat aerobe gram-negative Bakterien ungehindert vermehren knnen und nach ihrem Laktose-Spaltungsvermgen differenziert werden. Beim fermentativen Abbau der im Medium enthaltenen Laktose entstehen nmlich intermedir Aldehyde, welche aus der farblosen, bei der Nhrbodenzubereitung entstandenen fuchsinschwefligen Sure den Farbstoff Fuchsin freisetzen, der die entsprechenden Kolonien und ihre Umgebung rot frbt und auf manchen von ihnen als ..Fuchsinglanz" auskristallisiert (typisch fr normale Darmbakterien wie z.B. Escherichin-, Enterobacter-, Citrobacter-Aitcn). Bakterien ohne die Fhigkeit zur Laktosevergrung (z.B. Krankheitserreger wie Salmonellen und Shigellen) bilden demgegenber auf ENDO-Agar farblose oder bla-rosa Kolonien. Einen hnlichen Einsatzbereich hat der MAC-CoNKEY-Agar, der heute dem ENDOAgar wegen der krebserzeugenden Wirkung von Fuchsin vorgezogen wird. Nhrbden mit strkerer Selektivitt fr Salmonellen sind der WiLSON-BLAiR-Agar (Hemmstoff: Brillantgrn: Differenzierungsreaktion: ELS-Bildung: Indikatorreaktion: Bildung von schwarzem Wismutsulfid) und fr Salmonellen, Shigellen und Yersinien der LF.IFSON-Agar (Hemmstoff: Na-Desoxycholat: Differenzierungsreaktion: Laktose-Spaltung und HiS-Bil-

dung: Indikatorreaktion: Fllung von Dcsoxycholat und Eisensulfid-Bildung) oder der Salmonella-Shigella-Agar (SS-Agar) mit 2% Desoxycholat. Hufig verwendete Differential- und Selektivnhrbden sind ferner der Kaliumtellurit enthaltende CLAUBERG-II- bzw. -III-Nhrboden sowie der TINSDALEAgar zur Isolierung und Differenzierung von Corynebaktcrien. Auf weitere Differential- und Selektivnhrbden wird im speziellen Teil bei den einzelnen Bakterienarten hingewiesen.
Kulturverfahren fr Anaerobier

Obligate (strikte) Anaerobier knnen sich in Gegenwart von Luftsauerstoff nicht in Oberflchenkultur vermehren, hufig werden sie sogar durch Sauerstoff oder, wahrscheinlich eher, durch Anhufung seiner toxischen Reaktionsprodukte, z.B. Wasserstoffperoxid und das Superoxid-Radikal, rasch abgettet, offenbar weil ihnen die entgiftenden" Enzyme SuperoxidDismuta.se und/oder Katalase bzw. Peroxidase

fehlen (s. Kap. 3.2.1). Zur erfolgreichen Anzchtung anaerober Bakterien ist deshalb eine Gasatmosphre erforderlich, aus der auf physikalischem, chemischem oder biologischem Wege der Luftsauerstoff mehr oder weniger weitgehend entfernt worden ist. Darber hinaus sollten die verwendeten Kulturmedien ein ausreichend niedriges Redoxpotential (Eh) aufweisen, was durch Zugabe von geeigneten Reduktionsmitteln, anaerobe Sterilisation" und Verhinderung sekundrer Aufoxidation erreicht wird.
Nhrmedien fr Anaerobier. Die einfachsten

Nhrbden zur Zchtung anaerober Krankheitserreger bestehen aus hochwertigen, komplexen Universalmedien (z.B. Hirn-Herz-Glukose-Medium, Hefeextrakt-Blutagar), denen Reduktionsmittel (z.B. Zystein, Na-Thioglykolat, Askorbinsure) und eventuell ein Redoxindikator (z.B. Resazurin) zugesetzt werden. Beim Autoklavieren wird der gelste Sauerstoff ausgetrieben und die Ingredienzien liegen in reduziertem Zustand vor. Um eine sekundre Aufoxidation gering zu halten, mssen sie alsbald verbraucht oder unter Sauerstoffabschlu gelagert werden. Beispiele fr diese Art von Anaerobiermedien sind die Thioglykolat-Boillon als flssiges Anreicherungsmedium oder der Glukose-Hefeextrakt-Zystein-Blutagar nach BEHRENS.
Fr besonders sauerstoffempfindliche Arten werden allerdings aufwendigere Herstellungstechniken bentigt, bei denen der Nhrboden in luftdicht verschliebaren Rhrchen in sauerstofffreier Atmosphre sterilisiert wird (PRAS-Medien = Pre-Reduced

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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Anaerobically Sterilized). Eine Reihe klinisch wichtiger Anaerohier vermag sich nur dann ausreichend zu vermehren, wenn das Kulturmedium mit bestimmten Wuchsstoffen supplementiert wird. Dazu gehren u.a. Bikarbonat (als CO^-Licfcrant), Hmin. Vitamin K. Succinat und/oder Pyruvat.
Methoden zur Schaffung der sauerstoffreien Gasatmosphre bzw. zur Erhaltung des niedrigen Redoxpo-

topf verbleibenden Luftsauerstoff mit Wasserstoffgas katalytisch zu Wasser verbrennen. Umgang mit Anaerobiern im Routinelaborato-

tentials. Flssige Anreicherungsmedien, in hoher Schicht" in Reagenzglser abgefllt, werden beim Stehen an der Luft nur langsam von oben nach unten aufoxidiert. Besonders mit Zugabe einer geringen Agarmenge, die diesen Proze weiter verlangsamt, erlauben sie deshalb vielen Anaerobiern Tiefenwachstum (Tiefenkulturcn). wenn vor der Beimpfung durch Erhitzen im Dampftopf der Sauerstoff entfernt, ein groes Inokulum eingebracht und das Medium whrend der Bebrtung nicht aufgeschttelt wird. Durch berschichten mit fest werdendem, sterilem Paraffin oder steriler Vaseline nach der Beimpfung kann weiterer Luftzutritt unterbunden werden, so da anaerobe Verhltnisse auch fr lngere Bebrtungszeiten erhalten bleiben. Besonders leistungsfhige Anreicherungsmedien, die nach diesem Prinzip arbeiten, enthalten zustzlich Gewebestckchen, welche, etwa durch die SulfhydrylGruppen ihrer Proteine, eine ausgeprgte Sauerstoffbindungsfhigkeit besitzen und verschiedenste Nhrstoffe bereitstellen. Verwendet werden Leberstckchen (TAROZZi-Bouillon). Hirnbrei oder -Stckchen (VON HiBLER-Medium: RosENOW-Bouillon) oder Muskelfleisch (chopped/cooked meat medium"). Anaerobe Obcrflchenkulturen auf Agarnhrbden erfordern die Entfernung des Luftsauerstoffs aus der umgebenden Atmosphre. Dies kann individuell fr jedes Kulturgef einzeln oder fr mehrere gleichzeitig erfolgen. Einfache Verfahren zur Bindung des Sauerstoffs in Reagenzglsern (mit Schrg- oder Stichagar) oder Petrischalen sind das Pyrogallol-Verfahren nach BUCHNER (Pyrogallol in alkalischer Lsung bindet in geschlossenen Gefen den Luftsauerstoff) und das FORTNER- Verfahren (Sauerstoffzehrung durch Serratia marcescens. die in Kokultur mit den Anaerobiern auf einer mit Plastilin luftdicht verschlossenen Agarplatte wchst). Wesentlich aufwendiger, aber auch leistungsfhiger ist die Roll-Tube-Methode nach HUNGATE, die PRAS-Medien in Reagenzglsern mit Schraubverschlu benutzt und bei der alle Arbeitsgnge unter einem sauerstoffreien Gasstrom erfolgen. Fr anaerobe Oberflchenkulturen am meisten verwendet werden heute aber sogenannte Anaerobiertpfe (Anaerostaten) und Anaerobier-Brutschrnke. Im einfachsten Falle werden diese mit Kulturschalen beschickten Behltnisse nur evakuiert, um die Sauerstoffspannung abzusenken (ZEISSEER-Topf). Sie knnen aber auch, nach Evakuieren, mit sauerstoffreien Gasgemischen (z.B. 10% H,, 5% CO2. 85% N2) geflutet werden, was die Austrocknung der Nhrbden verringert und die Zufuhr von wachstumsfrderndem Kohlendioxid erlaubt. Modernere kommerzielle Verfahren (z.B. GasPak*-System) knnen auf die vorherige Evakuierung verzichten, da sie den im verschlossenen Anaerobier-

rium. Die kulturelle Diagnose einer Anaerobierinfektion wird um so zuverlssiger, je weniger das klinische Untersuchungsmaterial, die Nhrmedien und die Primrkulturen mit Luft in Kontakt kommen. Die meisten anaeroben Krankheilserreger vertragen es allerdings durchaus, kurzfristig dem Luftsauerstoff ausgesetzt zu werden. Fr Routinezwecke gengt es deshalb in der Regel, wenn die Materialproben rasch oder in reduzierenden Transportmedien transportiert und im Laboratorium baldigst verarbeitet werden. Auerdem sollten frisch hergestellte oder vor der Verwendung nochmals erhitzte Nhrmedien zum Einsatz kommen, und die Kultivierung mu natrlich in Sauerstofffreier oder -armer Atmosphre erfolgen. Anlage und Beurteilung der Primrkulturen sowie berimpfungen werden meist an der Luft vorgenommen. Um die Dauer dieser Luftexposition bei vertretbarem Arbeits- und Materialaufwand nicht zu lange werden zu lassen, werden vielfach sogenannte holding jars" eingesetzt. Dies sind Gefe, die kontinuierlich mit Stickstoff und/oder Kohlendioxid durchstrmt werden und in denen Untersuchungsproben, Kulturen und beimpfte Nhrbden so lange aufbewahrt werden, bis sie weiterverarbeitet oder in Anaerostaten bertragen werden knnen. Die viel aufwendigere HuNGATE-Technik oder die Anaerobier-Kammer (glove box), bei denen alle Arbeitsgnge in einem O2-freien Gasgemisch ablaufen, werden zwingend fr kologische Studien, aber nicht unbedingt fr die Routinediagnostik bentigt.
Zchtung von karboxiphilen und mikroaerophi-

len Bakterien. Bakterien mit fermentativem Stoffwechseltyp, die durch Sauerstoff nicht oder nur unwesentlich beeintrchtigt werden, aber eine erhhte CO2-Spannung fr optimale Vermehrung bentigen, werden als fakultativ anaerob-karboxiphil oder kapnophil bezeichnet (z.B. Actinomyces viscosus, Capnocytophaga spp.). An der Luft zeigen sie kein oder nur stark gehemmtes Wachstum; dasselbe gilt fr eine O2und CO2-freic Atmosphre. Dagegen vermehren sie sich gut, wenn sie in Anwesenheit von 5-10% CO2 mit und ohne Sauerstoff bebrtet werden. Ein einfaches Verfahren, um diese Kulturbedingungen zu schaffen, ist der sogenannte Kerzentopf, ein luftdicht verschliebares Gef aus

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Mikrobiologische Diagnostik aktivem 14C markierten Verbindungen von allen oder doch allen blichen zu erwartenden Bakterien metabolisiert werden. Die radiometrischen Kulturverfahren haben sowohl die Blutkulturdiagnostik als auch die Tuberkulosediagnostik erheblich verbessert und beschleunigt. Der Zeitbedarf fr die Tuberkulosediagnostik konnte von im Mittel 4 bis 6 Wochen bei Anwendung der konventionellen Kulturverfahren (z.B. Eiernhrbden) auf durchschnittlich 9 bis 14 Tage bei Anwendung des BACTEC-Systems gesenkt werden. Auch der Zeitbedarf der hufig lebensrettenden Blutkultur-, das heit Sepsisdiagnostik, konnte deutlich verkrzt werden.
Leider haben die radiometrischen Verfahren aber zwei wichtige Nachteile: Der erste Nachteil ist die Notwendigkeit, den Verschlustopfen der Kulturflasche immer wieder zu punktieren, um die Gasphase auf Radioaktivitt prfen zu knnen. Dadurch kann es zu Kontaminationen, vor allem zu Kreuzkontaminationen zwischen schon bewachsenen und nicht bewachsenen Kulturflaschen kommen. Ein zweiter, heute besonders kritisch zu sehender Nachteil ist der Anfall recht groer Mengen schwach radioaktiven Abfalls, dessen Entsorgung immer teurer geworden ist und der natrlich auch kologisch nicht unbedenklich ist. Folgerichtig wurden sehr bald, auch von der Firma Becton Dickinson. Versuche unternommen, andere, nicht-radioaktive Indikatoren des mikrobiellen Wachstums zu verwenden. Gleichzeitig wurde versucht, die erforderlichen Arbeitslufe so weit wie mglich zu automatisieren. Automatische Blutkultursysteme. Vollautomatische Blutkultursysteme haben den entscheidenden Vorteil, beimpfte Blutkulturen kontinuierlich auf Erregerwachstum berwachen zu knnen. Sie haben sich deshalb, auch in Deutschland, praktisch in allen Laboratorien durchgesetzt. Die gebruchlichsten Systeme sind gegenwrtig das BacT/Alert-Systcm (Organon Teknika Corporation, Durham, USA), das BACTEC 9240-System (Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks. USA) und das Vital-System (BioMerieux, Marcy LEtoile, Frankreich). Als mikrobieller Wachstumsindikator dient bei allen drei Systemen das aus dem Nhrmedium freigesetzte Kohlendioxid. Nicht radiometrisch kann dieses spektrophotomelrisch bzw. fluorometrisch oder auch manometrisch am entstehenden berdruck nachgewiesen werden. Fr die automatische berwachung ist erforderlich, da die Gerte ber eine Inkubationseinheit verfgen, in der die Blutkulturflaschen ber die gesamte Kulturdauer gehalten und unter Schtteln bebrtet werden. Auerdem gehrt zum Gert eine Meeinheit sowie ein PC, der die Mewerte sammelt und in geeigneter Weise auswertet. Eine unmittelbare Online-bertragung der erhaltenen Ergebnisse in die oft vorhandenen Labor-EDV-Systeme ist in der Regel ebenfalls mglich. Aufgrund der unterschiedlichen CO2-Detektionstechnik weisen die genannten kom-

Glas oder Kunststoff, in welches vor Aufsetzen des Deckels zusammen mit den beimpften Nhrbden eine brennende Kerze gestellt wird, die von selbst verlscht, wenn ein Teil des Luftsauerstoffs verbraucht und die CCVSpannung angestiegen ist. Alternativ knnen Gefe oder gasdichte Brutschrnke verwendet werden, die mit einem 10%igen CO2-Luft-Gemisch begast werden. Die Bezeichnung mikroaerophil" wird hufig noch als Synonym fr karboxiphil" gebraucht. Dies widerspricht aber dem eigentlichen Wortsinn und auch der wissenschaftlichen Definition des Begriffes. Denn danach gelten nur solche Bakterien als mikroaerophil, die Sauerstoff als terminalen Elektronenakzeptor bentigen, aber bei dem natrlichen Sauerstoffgehalt der Luft von etwa 21 vol% ebensowenig wachsen knnen wie bei vollstndiger OvFreiheit (z.B. Campylobacter-Arten). Sie bentigen deshalb speziell abgestimmte Gasgemische (z.B. 5% O2,10% CO2, 85% N2), die in geeigneten Gefen oder Inkubatoren bereitgestellt werden.
Halb- und vollautomatische Kultursysteme

Zur Arbeitserleichterung und Ergebnisbeschleunigung wird seit Jahren von verschiedenen Firmen an der Entwicklung von Flssigkulturverfahren gearbeitet, die grundstzlich fr eine teilweise oder weitgehende Automatisierung der wichtigsten Arbeitsgnge geeignet sind. Ausgangspunkt und Vorreiter dieser Entwicklung waren die radiometrischen Kultursysteme der Firma Becton Dickinson, Sparks, USA, die unter dem Namen BACTEC in den Handel kamen. Diese Systeme, die sowohl fr die Blutkulturdiagnostik als auch fr die kulturelle Diagnostik der Tuberkulose und anderer Mykobakteriosen angeboten wurden und teilweise noch werden, haben zum Prinzip, da wachsende Bakterien aus radioaktiv markierten Nhrstoffen im Kulturmedium radioaktives Kohlendioxid in die Gasphase der mit einem Durchstichstopfen luftdicht verschlossenen Kulturflasche abgeben. Durch periodische Punktion des Durchstichstopfens kann jeweils ein kleines Volumen der Gasphase aus der Blutkulturflasche abgesaugt und hinsichtlich seiner Radioaktivitt gemessen werden. Aktiv wachsende und damit stoffwechselaktive Kulturen erzeugen zunehmende Mengen von radioaktivem CO2, dessen Konzentration damit ein direktes Ma der bakteriellen Vermehrung darstellt, sofern gewhrleistet ist, da die eingesetzten, mit radio-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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merziellcn Systeme gewisse Unterschiede in Handhabung und Fehlermglichkeiten auf. Grundstzlich sind sie aber alle fr den Routineeinsatz geeignet und tragen dazu bei, die Blutkullurdiagnostik erheblich zu beschleunigen.
Automatische Kultursysteme fr Mykobakterien.

Auch in der Diagnostik von Mykobakterieninfektionen. die von der Einfhrung der radiometrischen Verfahren besonders profitiert hat, ist die Entwicklung inzwischen in Richtung nicht-radioaktiver Verfahren weitergegangen, obwohl das klassische, radiometrische BACTEC-System fr Mykobakterien immer noch vielerorts im Einsatz ist und auch als Standardverfahren gilt. Im BACTEC-9000-MB-System der Firma Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems wird als Wachstumsindikator ein Sauerstoffsensor verwendet. Dieser besteht aus einem Ruthenium-Metall-Komplex, dessen Fluoreszenz in Anwesenheit von Sauerstoff unterdrckt wird. Mit zunehmendem Wachstum der obligat aeroben Mykobakterien wird Sauerstoff verbraucht, was eine zunehmend strker werdende Fluoreszenz des Indikators auslst, wenn die Flaschen mit UV-Strahlen von 365 nm Wellenlnge bestrahlt werden. Im Gegensatz zu den Blutkulturen bentigen die Mykobakterien-Flssigkultursysteme komplexe hemmende Zustze, die das Wachstum anderer Bakterien und das Pilzwachstum so weil wie mglich unterdrcken sollen. Das resultierende Elektivmedium ist aber natrlich nicht in der Lage, auch das Wachstum aller phylogenetisch nahe verwandten Baktcrienartcn und ggf. multiresistenter Stmme anderer Arten zuverlssig zu unterdrcken. Deshalb gilt fr alle flssigen Mykobakterien-Kullursysteme, da ein Bewuchs immer hinsichtlich der Identitt der vorhandenen Mikroorganismen zu berprfen ist, bevor auch nur eine Verdachtsdiagnose gestellt werden kann. Das MB/BacT-System der Firma Organon Teknika verwendet demgegenber einen kolorimetrischen Kohlendioxidscnsor, der im Boden jeder Kulturflasche angebracht ist und Wachstum an der Konzentrationszunahme von Kohlendioxid mit. Andere Systeme, die bisher in Deutschland weniger gebruchlich sind, verwenden auch zum Mykobakterien-Wachstumsnachweis Druckvernderungen in der luftdicht verschlossenen Kulturflasche.

weist, reichen morphologische Kennzeichen bei diesen Mikroben in der Regel zur Artdiagnose nicht aus (s.o.). Diese erfordert vielmehr die Untersuchung zustzlicher molekularbiologischer, chemischer, physiologischer oder ggf. antigenetischer Eigenschaften, deren Zahl und Art von der Erfahrung und Intuition des Bakteriologen und von den biologischen Besonderheiten der jeweils bearbeiteten Bakteriengruppe abhngen (s. Tab. 2.4). Alle fr die Identifizierung herangezogenen Merkmale sollten zuverlssig bestimmbar und konstant ausgeprgt sein.
Molekularbiologische Identifizierungsverfahren

Moderne molekularbiologische Verfahren wie die Bestimmung des Guanin- und Zytosingehaltes der chromosomalen DNA, DNA-DNAoder DNA-rRNA-Hybridisierungen oder die Sequenzierung grerer Teile des DNA-Gens der ribosomalen RNA (rRNA) sind das methodische Rstzeug, mit dessen Hilfe die Taxonomie der Bakterien inzwischen zunehmend auf eine przisere phylogenetische Basis gestellt werden konnte. Viele dieser Methoden sind prinzipiell auch fr den diagnostischen Einsatz geeignet, sind aber fr diesen Zweck meist immer noch recht aufwendig und kostenintensiv. Ihre methodischen Grundlagen ebenso wie ihre Einsatzbereiche werden im Abschnitt Molekularbiologische Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik" (Kap. 2.3.4) ausfhrlich besprochen.
Chemotaxonomische Identifizierungsverfahren

Identifizierung von Bakterien Der Vorgang der Identifizierung besteht in der Beschaffung mglichst umfassender Informationen (s. Tab. 2.4) ber die Eigenschaften einer unbekannten Reinkultur, im Vergleich der erhaltenen Merkmale mit denen gut definierter Taxa und in der Benennung des Isolates nach demjenigen Taxon, mit dessen Beschreibung sich eine vollstndige oder nahezu vollstndige bereinstimmung feststellen lt. Da die zellulre und kulturelle Morphologie der Bakterien nur eine vergleichsweise geringe Vielfalt auf-

Aufbau und Struktur der bakteriellen Zellwndc, Komponenten der Zytoplasmamembran und des Zytoplasmas selbst sowie Inhaltsstoffe der ueren Zellumhllungen stellen taxonomische Merkmale dar, welche der Aussagekraft der spter zu besprechenden molekularbiologischen Marker nur wenig nachstehen (s. Kap 3.1.2). Die entsprechenden Untersuchungsverfahren konnten inzwischen, wenigstens teilweise, so stark vereinfacht und standardisiert werden, da sie sich auch fr die Identifizierung von Krankheitserregern unter Routinebedingungen hervorragend nutzen lassen. Dies gilt z.B. fr den relativ einfachen, dnnschicht- oder papierchromatographischen Nachweis der Isomeren der Diaminopimelinsure aus bakteriellen Zellwnden, fr die gaschromatographische Analyse von zellulren Fettsuren oder fr die dnnschichtoder gaschromatographische Bestimmung der Mykolsuren von Mykobakterien, Nocardien

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Mikrobiologische Diagnostik

und Corynebakterien, denen allen erhebliche differentialdiagnostische Bedeutung zukommt.


Physiologische Identifizierungsverfahren

Bakterien unterscheiden sich vielfltig in ihrer Enzymausstattung und damit in ihren Fhigkeiten, organische und anorganische Verbindungen ab- oder umzubauen. Vor allem die leicht mebaren physiologischen (biochemischen") Leistungen ihres katabolcn und Atmungsstoffwechsels haben sich seit langem fr Identifizierungszwecke bewhrt. Da viele dieser Stoffwechselleistungen durch verschiedene Indikatorreaktionen sichtbar gemacht werden knnen und da in der Regel mehrere Eigenschaften gleichzeitig in einer Reihe von Reaktionsanstzen berprft werden, entsteht wegen der unterschiedlichen Farbreaktionen der einzelnen Indikatoren bei der Ablesung ein buntes Bild: Man spricht von einer Bunten Reihe". Nachweis von Atmungskettenenzymen. Vorhandensein oder Fehlen von Katalase, Zytochromoxidase und Peroxidasen haben groe differcntialdiagnostische Bedeutung. Die Katalase-Aktivitt einer Kultur lt sich einfach
prfen, indem man sie direkt (auf einem blutfreien Nhrboden) oder nach bertragung einer kleinen Menge Koloniemassc auf einen Objekttrger mit 3%iger H2C>2-Lsung bergiet. Aufsteigende Gasblasen (O2) zeigen die Anwesenheit des Enzyms an. Zytochromoxidase kann z.B. durch bergieen der Kultur mit einer l%igen Tetramcthyl-p-phenylendiamin-Lsung nachgewiesen werden. Im positiven Falle entwickelt sich innerhalb von Sekunden bis Minuten eine dunkel-violette Verfrbung der Kolonien. Nitratreduktasen reduzieren Nitrat zu Nitrit, welches im Kulturmedium nach Zugabc von sulfanilsaurem Naphthylamin (GRiFSsches Reagenz) durch die Bildung eines roten Azo-Farbstoffes sichtbar gemacht wird. Weitere Reduktion des Nitrits wird an der N2Gasbildung oder am Verschwinden des Nitrits aus dem Medium gemessen.

zymmusters der Bakterien gehren diese Vergrungstests zu den einfachsten und wichtigsten Identifizierungsverfahren. Assimilation von Kohlenhydraten, Alkoholen, Glykosiden und Fettsuren. Bakterien mit oxidativem Energiestoffwechsel bilden beim Abbau von Kohlenhydraten, wenn berhaupt, nur wenig Sure. Eine pH-Absenkung tritt deshalb nur dann ein, wenn das Zchtungsmedium wenig Pepton enthlt, aus dem alkalische Valenzen freigesetzt werden knnen. Dieses Prinzip findet im OF-Medium nach HUGH und LEIFSON Verwendung, mit dem oxidative und fermentative Bakterien unterschieden werden knnen. Hufig prft man die Verwertung von organischen Kohlenstoff- (und Stickstoff-) Verbindungen aber im sogenannten Auxanogramm.
Hierbei wird ein Mangelmedium eingesetzt, das - im Falle des C-Quellen-Auxanogramms - eine anorganische Stickstoffquelle (z.B. Ammoniumsulfat), die zu testende Kohlenstoffverbindung und Puffersalze enthlt. Wenn der eingeimpfte Mikroorganismus in der Lage ist. die angebotene Kohlenstoffverbindung zu assimilieren, tritt makroskopisch sichtbares Wachstum ein; im anderen Falle bleibt das Medium unbewachsen. Auxanographische Verfahren werden sowohl zur Identifizierung obligat aerober (Nocardien, schnell wachsende Mykobakterien, Pseudomonaden) und fakultativ aerober Bakterien (z.B. Serratien) als auch verschiedener Pilze, insbesondere Candida-AxXcn. verwendet.

Vergrung von Kohlenhydraten, Alkoholen und Glykosiden. Fermentative, saccharolytische Bakterien vergren Kohlenhydrate und hnliche Verbindungen unter Bildung saurer Stoffwechselendprodukte. Diese fhren zu einer Absenkung des pH-Wertes in flssigen und festen Nhrmedien, welche mit Indikatoren oder pHmetrisch festgestellt wird. Indikatoren wie Phenolrot oder Bromthymolblau sind fr die meisten Bakterien nicht toxisch, so da sie den Differenzierungsmedien schon vor der Beimpfung zugesetzt werden knnen. Wegen der Vielzahl der verfgbaren, geeigneten Kohlenstoffverbindungen und wegen des unterschiedlichen En-

Dasselbe Verfahren ist auch bei fermentativen Bakterien zur Prfung der Zitrat-Verwertung gebruchlich (SiMMONS-Zitrat-Nhrboden). Nachweis von Enzymen des EiweistofTwechsels. Die Produktion proteolytischer Enzyme kann einfach, aber relativ grob durch Prfung des Gelatine- (Verflssigung), Kasein- (Klrung von milchhaltigen Agarmedien) oder Serumabbaus (Verflssigung von LFFLHR-Medien) nachgewiesen werden. Eine hnliche Technik (Klrung der durch das Testsubstrat getrbten Nhrbden) findet auch fr die Untersuchung der Hydrolyse" von Tyrosin und Purinen Anwendung. Im weiteren Sinne gehrt zu den Identifizierungsreaktionen, die auf Enzymen des Eiweistoffwechsels basieren, auch die Indolbildung aus Tryptophan: Indol ergibt mit EHRLICHSoder Kov'ACs-Reagenz eine Rotfrbung, wodurch es leicht in bewachsenen Kulturen erkennbar wird. Freisetzung von Schwefelwasserstoffgas aus SH-Gruppen-haltigen Aminosuren (oder anderen Schwefelverbindungen) durch bakterielle Desulfhydrasen wird mit Me-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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tallsalzen (z.B. Eisen-, Bleisalzen) nachgewiesen, die entweder dem Nhrmedium zugegeben (Eisen) oder in Filterpapier (Bleiazetat) ber der Nhrbodenoberflche aufgehngt werden und mit H2S schwarze Niederschlge von Sulfiden ergeben. Polytrope Differenzierungsmedieii. Zur Arbeits- und Materialeinsparung wurden sogenannte polytrope Differenzierungsmedien entwickelt, in denen gleichzeitig mehrere Stoffwechselleistungen geprft werden knnen. Ein typisches Beispiel dafr ist der Zwei-Zucker-Eisen-Agar nach KLIGLER, mit welchem die Vergrung von Glukose und Laktose, die H2S-Bildung und die Gasbildung untersucht werden knnen. Wie der Triple-Sugar-Iron-Agar (Glukose, Laktose, Saccharose, H?S, Gas) hat sich dieses Medium besonders zur Identifizierung von Enterobakteriazeen bewhrt. Weitere polytrope Medien mit hnlichem Einsatzbereich sind u.a. der Lysin-Eisen(Iron)-Agar (LIA) zum Nachweis von Lysindekarboxylase. Lysindesaminase und H2S-Bildung oder das MotilittsIndol-Ornithin-Medium (MIO), mit dem auf Beweglichkeit, Indolbildung und Ornithindekarboxylase geprft wird. Nachweis von Desaminasen und Dekarboxylasen. Lysin- und Ornithindekarboxylasen, Arginindihydrolase und Phenylalanindesaminase liefern wertvolle Kriterien zur Differenzierung von Enterobakteriazeen und Vibrionazeen. Einen breiteren Einsatzbereich haben die Medien zur Prfung der bakteriellen f//'ef<?-Aktivitt: Bei der Spaltung von Harnstoff wird wie bei der Desaminierung von Aminosuren Ammoniak freigesetzt, der zu einer Alkalisierung der Nhrbden fhrt (Nachweis mit pH-Indikatoren wie z.B. Phenolphthalein) oder mit NESSLERs-Reagenz sichtbar gemacht werden kann. Mykobakterien knnen mit der Amidreihe nach BNICKE in hnlicher Weise differenziert werden. Kommerzielle Identifizierungssysteme. Seit einigen Jahren kommen laufend neue kommerzielle Testsysteme auf den Markt, die einige der oben genannten und ggf. zustzliche Reaktionen zu vorgefertigten Bunten Reihen" fr einen jeweils definierten Anwendungsbereich zusammenstellen. Teils handelt es sich dabei um eine Aneinanderreihung konventioneller Differenzierungsmedien in Makroausfhrung (z. B. Enterotube II, Oxi/Ferm-Tube II), berwiegend aber um miniaturisierte Verfahren, die sich der Mikrotiterplatte oder davon abgeleiteter Trger mit vielen kleinen Reaktionsvertiefungen bedie-

nen (z.B. API 20E, API 20 Strep, Crystal E/NF, Rap 1D ANA II) und die neben den klassischen Differenzierungsreaktionen auch chromogene oder fluorogene Substrate zum Nachweis mikrobieller Enzymprofile enthalten. Fr Bakterien mit oxidativem Kohlenhydratmetabolismus (API 20 NE, Rap ID NF Plus) und fr Pilze (API 20 C AUX, Uni-Yeasl Tek, YT Biolog) werden darber hinaus inzwischen auch miniaturisierte Testkits fr Assimilationsprfungen (Auxanogramme) kommerziell angeboten. Einige dieser Systeme werden manuell beimpft, weiterbearbeitet und mit bloem Auge anhand des Farbumschlags verschiedener beigegebener Indikatoren oder anhand anderer makroskopisch sichtbarer Indikatorreaktionen abgelesen. Es gibt aber auch schon mechanisierte und teilweise oder vllig automatisierte Identifizierungssysteme (z.B. Cobas-Bact ID, V1TEK, NEG ID Type 2, Rapid Anaerobe, Micronaut), bei denen sowohl Schritte der Beimpfung und die Inkubation der Reaktionsanstze als auch die (photometrische oder nephelometrische) Ablesung der Ergebnisse einem Gert berlassen werden, das zuweilen sogar ber eine in einen Elektronenrechner eingespeicherte Datenbank das fertige Identifizierungsergebnis (Spezies-Diagnose) auswirft.
Manuelle kommerzielle Systeme zur Identifizierung von Mitgliedern der Familie Enterobacteriaceae haben inzwischen besonders weite Verbreitung gefunden. Darber hinaus werden auch Testkits zur Identifizierung von nicht-fermentierenden und Oxidase-positiven, fermentierenden Bakterien, von Anaerobiern sowie von Streptokokken, Staphylokokken, Corynebakterien. Bazillen, Neisserien, Haemophilus spp. und Hefen angeboten. Die meisten mechanisierten und/ oder automatisierten Identifizierungssysteme verwenden ebenfalls klassische Differenzierungsreaktionen (z.B. Surebildung aus Kohlenhydraten, Zitratverwcrtung, H2S-Bildung usw.), berlassen aber die Bcimpfung bzw. die gleichmige Verteilung des Inokulums, die Bebrtung und/oder Ablesung (und gegebenenfalls Auswertung) der Ergebnisse dem Automaten.

Beurteilung dieser kommerziellen Identifizierungssysteme. Ein Vorteil dieser Systeme ist ohne Zweifel ihre gleichbleibende Qualitt, die sich in industrieller Groserie besser gewhrleisten lt als in einer kleineren Nhrbodenkche. Auerdem sind sie wegen der Miniaturisierung und Vorfertigung arbeits- und materialsparend und knnen mit speziell dazu gelieferten Auswertungscodes oder Auswertungsprogrammen einfach und schnell beurteilt werden. Einige Automaten nehmen dem Untersucher sogar diese

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Mikrobiologische Diagnostik

Arbeit ab und werfen ein fertiges Identifizierungsergebnis aus. Nachteilig ist jedoch, neben dem vergleichsweise hohen Preis, der besonders bei Automaten und Halbautomaten erheblich ins Gewicht fllt, da der Benutzer entwhnt wird oder berhaupt nicht mehr in der Lage ist, Einzelreaktionen abzulesen und auf Plausibilitt bzw. technische Fehler (Nichtbeimpfung, Kontamination einzelner Reaktionskammern) zu berprfen. Dadurch entsteht ein Black-boxEffekt", der einen vermehrten Aufwand an Kontrollen erfordert, um die Fehlerhufigkeit auf einem akzeptablen Niveau zu halten. Als annehmbar gilt international eine durchschnittliche bereinstimmung der Identifizierungsergebnisse von etwa 95% mit denen einer anerkannten Referenzmethode. Unter Routinebedingungen darf die so verstandene Richtigkeitsquote hchstens auf 90% absinken. Dabei sollten Aufwand und Kosten der erforderlichen Besttigungs- und berprfungsuntersuchungen so niedrig wie mglich gehalten werden. Von entscheidender Bedeutung fr die Qualitt der erhaltenen Identifizierungsergebnisse sind neben praktikablen Anwendungsvorschriften und grundstzlicher Funktionssicherheit des jeweiligen Systems in erster Linie die Vollstndigkeit, Fehlerarmut und Aktualitt der zugrunde liegenden Datenbasis. Gerade im Hinblick auf die stetig und rasch wachsende Zahl pathogener Bakterien ist die Pflege und laufende berprfung dieser Datenbank von zentraler Bedeutung fr den Gebrauchswert kommerzieller Identifizierungssysteme. Auerdem darf auch die Angabe einer hohen Wahrscheinlichkeit fr die Richtigkeit eines Identifizierungsergebnisses den Benutzer nicht dazu verfhren, dem Befund blindlings zu glauben. Das Fehlen wichtiger Schlsselreaktionen in praktisch allen kommerziellen Systemen kann zu gravierenden Fehldiagnosen fhren, die sich nur korrigieren lassen, wenn die fachkundige Bewertung aller verfgbaren taxonomischen Informationen einschlielich der zellulren und kulturellen Morphologie, aber auch anderer Basismerkmale wie Katalase- und Oxidaseaktivitt sowie Stoffwechseltyp grundstzlich in das Endergebnis einfliet. Sind Lcken oder Schwchen eines Systems bekannt, ist der Mikrobiologe verpflichtet, die mit ihm zusammenarbeitenden Kliniker und Praktiker darber zu informieren, damit diese bestimmte Untersuchungsauftrge gegebenenfalls an andere Laboratorien vergeben knnen.

Nennenswerte Fchlermglichkeiten bzw. die Notwendigkeit einer lckenlosen Kontrolle der Ergebnisse durch qualifiziertes Fachpersonal sind auch der Grund dafr, da die Benutzung kommerzieller Idenlifizierungssysteme mit und ohne Mechanisierung oder Automatisierung eine do-it-yourself-Bakteriologie" im Praxis- oder Krankenhauslaboratorium ohne entsprechende Fachkenntnisse des Personals keinesfalls rechtfertigt. Denn einerseits kann das Arbeiten mit Krankheitserregern auerhalb der dafr vorgesehenen und eingerichteten Untersuchungsstellen zu einem nicht unerheblichen Sicherheitsrisiko werden, wenn die Grundregeln guter mikrobiologischer Technik nicht beherrscht oder nicht beachtet werden. Andererseits ist nur der erfahrene Mikrobiologe in der Lage, die kuflichen Systeme ber eine qualifizierte Verdachtsdiagnose entsprechend ihrem recht begrenzten Anwendungsbereich einzusetzen, die unbeabsichtigte Untersuchung von Mischkulturen zu vermeiden oder zu erkennen und die erhaltenen Ergebnisse abschlieend kritisch zu werten. Wo dies nicht gewhrleistet ist, kann es, wie Ringversuche immer wieder zeigen, zu zum Teil grotesken Fchlidentifizierungcn kommen, die dem betroffenen Patienten erheblichen Schaden zufgen knnen und die in sich selbst oder wegen erforderlicher Folgeuntersuchungen Unkosten verursachen, die gerade in der heutigen Zeit nicht vertretbar sind. Nachweis weiterer, diagnostisch relevanter bakterieller Stoffwechselleistungen. Einige weitere,

bisher nicht genannte bakterielle Stoffwechselleistungen haben diagnostische (und ggf. pathogenetische) Bedeutung. Unter den dafr verantwortlichen extrazellulren Stoffwechselprodukten sind die Hmolysine praktisch besonders wichtig (s. Kap. 4.1). Diese Enzyme lsen rote Blutkrperchen, z.T. in Abhngigkeit von der Spenderspezics, ganz oder teilweise auf und knnen auch das Hmoglobin chemisch verndern (-Hmolyse). Andere diagnostisch und pathogenetisch relevante, extrazellulre Stoffwechsclprodukte von Bakterien sind Lipasen, Lezithinasen, Hyaluronidasen, Koagulasen, Kollagenasen und Desoxyribonukleasen.
Nachweis von bakteriellen Stoffwechselendprodukten mit Hilfe der Gaschromatographic (GLC) oder Hochdruckfliissigkeitschroniato-

graphie (HPLC). Fermentierende Bakterien, insbesondere Anaerobier, bilden als Endprodukte ihres Kohlenstoff- und Energiestoffwechsels verschiedene, vom Grsubstrat abgeleitete organische Verbindungen, die sich im Nhrmedium wie auch in Eiter oder Exsudaten anhufen und mit GLC- oder HPLC-Verfahren nachweisen lassen. Art und Menge dieser Endprodukte (vor allem niedere Fettsuren und Alkohole) sind spezies- oder gruppenspezifisch; sie

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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stellen damit ein wichtiges Diagnostikum dar, auf das gerade bei der Identifizierung von Anaerobiern nicht verzichtet werden kann. Bei entsprechend modifizierter Anwendung sind GLC und HPLC auch fr die Bestimmung chemotaxonomischer Merkmale (zellulrer Fettsuren, Chinone, Kohlenhydrate, Proteine, Peptide, Aminosuren) hervorragend geeignet.
Typisierung von Krankheitserregern

Die Identifizierung eines mglichen Krankheitserregers bis zur Speziesebene reicht in der Regel fr eine zuverlssige diagnostische Bewertung aus; nur in Einzelfllen ist darber hinaus die Bestimmung der Pathovariett oder des spezifischen Toxinbildungsvermgens erforderlich. Fr die Aufklrung von epidemiologischen Zusammenhngen, etwa bei Tnfektionshufungen in Krankenhusern, Schulen, Kindergrten oder Altenheimen, reicht die exakte Feststellung der Spezieszugehrigkeit der urschlichen Erreger dagegen meist nicht aus, insbesondere dann nicht, wenn es sich um ubiquitre Arten wie z.B. Staphylococcus aureus, Enteritis-Salmonellen, opportunistische Enterobakteriazeen oder Pseudomonaden handelt. Um hier Infektionsketten und Infektionsquellen nachvollziehen bzw. aufklren zu knnen, sind feinere Differenzierungen erforderlich, die Spezies oder Subspezies in eine mehr oder weniger groe Zahl kleinerer Untereinheiten unterteilen. Diesen Vorgang nennt man Typisieren" und die erhaltenen Untereinheiten werden als Typen oder, moderner, als Varietten (var) bezeichnet. Typisierungen lassen sich mit einer Reihe verschiedener Methoden erreichen. So kann man durch die Prfung einer greren Zahl stoffwechselphysiologischer Leistungen innerhalb des stoffwechselphysiologischen Basismusters einer Spezies Biovarietten unterscheiden. Serologische Verfahren erlauben eine ggf. sehr feine Differenzierung ansonsten phnotypisch recht einheitlicher Spezies wie z.B. der Spezies Salmonella enterica oder Yersinia enterocolitica in verschiedene Serovarietten. Neuerdings werden vermehrt molekularbiologische Verfahren zur Typisierung eingesetzt (z.B. Pulsfeldgelelektrophorese der durch Restriktionsenzyme geschnittenen chromosomalen Gesamt-DNA eines Bakteriums, Elektrophorese der durch Restriktionsenzyme gespaltenen Teile des mikrobiellen Genoms, die vorher ber PCR amplifiziert wurden). Die molekularbiologischen Typisierungsverfahren erfreuen sich inzwischen groer

Beliebtheit, weil sie praktisch universell einsetzbar sind und bei entsprechender Erfahrung und apparativer Ausrstung zuverlssige Ergebnisse liefern. Neben der Bio- und Serotypisierung hat in der Vergangenheit vor allem die Lysotypie, d.h. die Typisierung von Bakterien mit Hilfe spezifischer Bakteriophagcn, groe praktische Bedeutung gehabt und hat sie teilweise auch heute noch. Prinzip der Lysotypie ist, da es Bakteriophagen (Bakterien-befallende Viren) mit so schmalem Wirtsspektrum gibt, da sie jeweils nur bei einzelnen Stmmen einer Art eine lytische Infektion hervorrufen. Bei geschickter Auswahl von Tcstphagen mit unterschiedlichem Wirtsspektrum lt sich ein System aufbauen, dessen Phagensatz zu unterschiedlichen Lysisbildern oder Lysismustcrn (phage patterns) fhrt. Stmme, die das gleiche Lysismuster zeigen, gehren einem Lysotyp oder einer Phagovar an. Voraussetzung fr die praktische Nutzbarkeit der Lysotypie ist einerseits, da sich eine Spezies auch tatschlich hinsichtlich der Empfnglichkeit ihrer Mitglieder fr eine lytische Phageninfektion unterscheidet und andererseits, da es gelingt, ein gengend breites Spektrum von Bakteriophagen mit unterschiedlicher Spezifitt zu finden. Dies setzt jhre- oder jahrzehntelange Arbeit voraus, so da praktisch funktionierende Lysotypiesysteme nur fr einzelne Bakterienarten existieren. Dies sind in erster Linie Salmonella Typhi (S. enterica subsp. enterica Serovar Typhi), Salmonella Paratyphi B (S. enterica subsp. enterica Serovar Paratyphi B), Salmonella Enteritidis (S. enterica subsp. enterica Serovar Enteritidis), Salmonella Typhimurium (S. enterica subsp. enterica Serovar Typhimurium) und Staphylococcus aureus. Bei allen genannten Bakterienarten, insbesondere aber vor allem bei S. aureus, hat die internationale Standardisierung der Lysotypie (internationaler Bakteriophagenbasissatz) in der Vergangenheit wie heute wieder erheblich zur Erkennung von epidemischen Hufungen, zur Aufklrung der Infektionsquellen und -ketten und damit zur Bekmpfung der Ausbrche beigetragen. Lysotypieverfahren wurden auch fr eine ganze Reihe anderer Bakterienarten entwickelt, haben aber bei weitem nicht die Verbreitung und Bedeutung erlangt, die sie bei den vorher genannten Bakterien besaen oder immer noch besitzen. Neben der Typisierung, also der Differenzierung unterhalb der Speziesebene, knnen lytische

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Mikrobiologische Diagnostik

Bakteriophagen mit breiterem Wirtsspektrum auch zur Identifizierung auf Gattungs- oder Speziesebene verwendet werden. Besondere Bedeutung hat dieser Anwendungsbereich z.B. bei der Unterscheidung der Biovarietten cholerae und cltor von Vibrio cholerae erlangt.
Diagnostische Tierversuche

Mit der Entwicklung leistungsfhiger ln-vitroMethoden fr die Mikrobiologie hat die Bedeutung des diagnostischen Tierversuchs abgenommen. Fr bestimmte Fragestellungen ist er aber auch heute noch nicht oder nicht vllig ersetzbar. Dies gilt insbesondere fr die folgenden drei Anwendungsbereiche: Nachweis von pathogenen Bakterien und Viren. Krankheitserreger mit hoher Virulenz fr bestimmte Tierarten und schlechter oder fehlender /-v/fra-Zchtbarkeit mssen oder knnen ber geeignete Versuchstiere aus klinischem Untersuchungsmaterial nachgewiesen werden. Seit Einfhrung der radiometrischen Kulturverfahren hat der diagnostische Tierversuch auf Mvcobacterium tuberculosis (Tbc-Tierversuch), der sich die maximale Empfnglichkeit des Meerschweinchens fr diesen humanpathogenen Erreger nutzbar macht, erheblich an Boden und Berechtigung verloren. Er wird deshalb gegenwrtig praktisch nicht mehr verwendet. Auerdem kann der Tierversuch z.B. zur Erkennung von Legionellosen, Rattenbifieber (Sodoku), Dermatophilosen, Borreliosen, Tularmie, Leptospirosen oder Enterovirus-Infektionen hilfreich sein. Pathogenitts- und Virulenztests. Bei Erregern wie Erysipelothrix rhusiopathiae, Bacillus anthracis, pathogenen Clostridien, Pneumokokkcn. Mycobacterium bovis oder Listerien kann die Diagnose durch Einimpfung der Reinkulturen in geeignete Versuchstiere abgesichert bzw. die Virulenz des jeweiligen Isolates berprft werden. Nachweis bakterieller Toxine. In Lebensmitteln oder menschlichen Untersuchungsstoffen vorhandene bakterielle Toxine (z.B. Botulinus-, Tetanus-Toxin) sowie die Fhigkeit von angezchteten Bakterien, Toxin zu produzieren (z.B. Diphtherie-Toxin), werden hochspezifisch im Toxin-Antitoxin-Tierversuch untersucht.
Dabei handelt es sich um einen Neutralisationstest (s. Kap. 4.20) nach folgendem Schema: Ein Tier (meist Maus oder Meerschweinchen) erhlt eine Injektion des verdchtigen Materials oder des Kulturfiltrats ei-

ner verdchtigen Kultur, ein zweites Tier wird zustzlich vorher mit einer ausreichenden Dosis des jeweiligen Antitoxins (Antiserums) behandelt, und einem dritten Tier werden zur Kontrolle (z.B. thermisch) inaktiviertes Untersuchungsmaterial oder toxinfreie Kulturflssigkeit verabreicht. Erkrankt oder stirbt nur das erste Versuchstier, ist die Anwesenheit des gesuchten Toxins sehr zuverlssig bewiesen. Zeigen zwei oder alle drei Tiere Intoxikationserscheinungen, handelt es sich um andere als die erwarteten Giftstoffe. Bleiben alle Tiere gesund, kann die Anwesenheit von Toxinen in wirksamen Konzentrationen ausgeschlossen werden.

Mechanisierung und Automation in der Medizinischen Mikrobiologie


Wie bereits in den vorstehenden Abschnitten mehrfach angesprochen, gibt es in Analogie zur klinischen Chemie auch in der Medizinischen Mikrobiologie immer strker werdende Bestrebungen, die diagnostischen Arbeitsgnge zu mechanisieren und automatisieren. Dabei ist allerdings zu bercksichtigen, da die Medizinische Mikrobiologie wie etwa die Histologie eine primr berwiegend analysierend-interpretierendc und weniger eine wgend-messendc Disziplin ist. Der diagnostische Arbeitsablauf im mikrobiologischen Laboratorium als Ganzes von der Verarbeitung des Untersuchungsmaterials bis zur Befundcrstellung ist deshalb einer Automation auch aus grundstzlichen Erwgungen heraus kaum zugnglich; entsprechende Versuche muten deshalb scheitern und werden wohl auch nicht mehr unternommen. Einzelne Arbeitsschritte des mikrobiologischen Arbeitsspektrums sind dagegen, wie oben ausgefhrt, grundstzlich durchaus einer Automation zugnglich. Uneingeschrnkt positiv mssen in diesem Zusammenhang die Blutkulturautomaten und die Automaten zur Mykobakteriendiagnostik gesehen werden, die tatschlich einen groen Fortschritt gegenber manuellen Vorgehensweisen gebracht haben. Ebenso positiv sind Automalen oder Halbautomaten fr die serologische Diagnostik, etwa die sogenannten ELISAProzessoren oder die Wcstcrn-blot-Automaten zu werten, die zur Arbeitsentlastung des Personals beitragen, die Arbeitsgnge besser standardisieren und u.U. auch grere Sicherheit vor Laborinfektionen bieten, die aber, auer den Gertekoslen, keine aufflligen Nachteile gegenber der manuellen Testdurchfhrung aufweisen. Vergleichbar in der Bewertung sind auch noch Gerte zur mehr oder weniger weitgehend automatischen Empfindlichkeitsprfung, obwohl sich bei diesen schon als Nachteil bemerkbar machen kann, da Kontaminationen selbst bei Anwendung eines sog. Expertensystems zur berprfung der Ergebnisse nicht immer so leicht und zuverlssig erkannt werden knnen, wie das bei manuellen, insbesondere den Makroverfahren, mglich ist. In verstrktcrem Mae gilt diese etwas zurckhaltendere Einschtzung auch fr die automatisierten Identifizierungssysteme, bei denen das Black-box-Phnomen" der ganz oder berwiegend fehlenden, unmiltel-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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baren berprfbarkeit der Ergebnisse besonders strend ins Gewicht fallen kann. Auf der anderen Seite kann der Einsatz von Computerprogrammen zur Auswertung einer greren Anzahl von Identifizierungsmerkmalen zweifellos zur Vereinfachung und Objektivierung der Ergebnisse beitragen. Denn diese, von der numerisch-phenetischen Klassifizierung abgeleitete Methode der Computer-gesttzten Identifizierung erlaubt es. Datenmengen vergleichend zu bewerten, welche die Gedchtnis- und Verarbeitungskapazitt des Durchschnittsmenschen erheblich bersteigen. Auch bei den grundstzlich leistungsfhigen automatischen Systemen ist die Automalion kein Vorteil an sich. Ihr Einsatz mu deshalb in jedem Einzelfalle im Sinne einer Kosten-Nutzen-Rechnung geprft werden, bei der auch die Aufwendungen fr zwingend erforderliche Kontrollen und Back-up-Systeme nicht vergessen werden drfen.

Empfindlichkeitsprfung von Krankheitserregern gegenber antimikrobiellen Chemotherapeutika Neben dem mglichst raschen und zuverlssigen Nachweis und der genauen Identifizierung der Erreger menschlicher Infektionskrankheiten kommt in vielen Fllen auch der Bestimmung ihrer individuellen Empfindlichkeit fr potentiell wirksame antimikrobielle Pharmaka (Empfindlichkeitsprfung, Resistenzbestimmung, Antibiogrammerstellung) entscheidende Bedeutung fr die rasche und folgenlose Ausheilung des Krankheitsgeschehens zu. Dabei ist die Empfindlichkeitsprfung ein in-vitro-Verfahren, dessen Ergebnisse nur unter bestimmten Voraussetzungen und mit Einschrnkungen auf die Verhltnisse beim Menschen bertragen werden knnen. Die hierbei zu beachtenden Gesichtspunkte sind im Kapitel 3.5 (Antibakterielle Chemotherapie") ausfhrlich dargestellt; im folgenden sollen deshalb nur die wichtigsten methodischen Aspekte der Resistenzbestimmung kurz dargestellt werden. Vom methodischen Vorgehen her lassen sich unter den traditionellen Techniken Reihenverdnnungsverfahren von Diffusionstesten unterscheiden. Man kann aber auch hinsichtlich der Qualitt der Ergebnisse zwischen weitgehend oder vollstndig quantitativen und semiquantitativen Methoden differenzieren. Die Basis fr die Beurteilung der Wirksamkeit eines antimikrobiellen Pharmakons gegen einen bestimmten Erregerstamm stellen grundstzlich die verschiedenen Modifikationen des Reihenverdnnungstests dar. Diese liefern prinzipiell ein

quantitatives Ergebnis und erlauben wenigstens die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK), unter bestimmten Bedingungen auch die Bestimmung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBK). Voraussetzung fr einwandfreie und reproduzierbare Ergebnisse der Empfindlichkeitsprfung mittels kultureller Verfahren ist die Verwendung geeigneter Nhrmedien, die einerseits den zu prfenden Erregern ein gutes Wachstum erlauben mssen und andererseits mglichst wenig oder besser keine Antagonisten enthalten drfen, welche die Wirksamkeit einzelner Chemotherapeutika behindern knnen. Weiterhin wichtig ist die Standardisierung des Inokulums (der Mikrobeneinsaat), da strkere Schwankungen der Einsaatdichte erhebliche Schwankungen des Ergebnisses der Empfindlichkeitsprfung zur Folge haben knnen. Weitere Parameter, die zu beachten und zu standardisieren sind, sind Bebrtungszcit und -temperatur (letztere ist besonders kritisch bei der Prfung von Staphylokokken auf Methicillin-Resistenz!).
Empfindlichkeitsprfung schnell wachsender Bakterien

Rouillon-Reihenverdnnungstest (Bouillon-Dilutionstest). Die am lngsten gebruchliche, traditionelle Methode zur quantitativen Resistenzbestimmung schnell wachsender Bakterien ist der Makro-Bouillon-Verdnnungstest (Rhrchenreihenverdnnungstest). Sein Prinzip ist in Abb. 2.20 dargestellt: Mehrere Rhrchen (Reagenzglser) enthalten jeweils gleiche Volumina einer geeigneten Bouillon mit geometrisch verdnntem Gehalt des jeweiligen Chemotherapeutikums. Nach Beimpfung und anschlieender Bebrtung wird anhand makroskopisch sichtbarer Trbung festgestellt, bis zu welcher Konzentration des eingesetzten Chemotherapeutikums (in mg/l) noch Wachstum des eingeimpften Bakterienstammes feststellbar ist. Die niedrigste Konzentration des Wirkstoffs (A/4 in Abb. 2.20), bei der makroskopisch kein mikrobielles Wachstum feststellbar ist, wird als minimale Hemmkonzentration (MHK) bezeichnet. Die Unterdrckung sichtbaren Wachstums ist primr nur Zeichen einer wachstumshemmenden (bakteriostatischen), nicht unbedingt aber auch einer bakterienttenden (bakteriziden) Wirkung des Chemotherapcutikums. Um die letztere festzustellen, werden nach Ablesung der MHK definierte Bouillonmengen der Rhrchen mit nicht getrbter Kulturflssigkeit und ggf. zur

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Mikrobiologische Diagnostik

Abb. 2.20 Bouilllon-Reihenverdnnungstest (Bouillon-Dilutionstest) und Bestimmung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBK) - schematische Darstellung. A: Ausgangskonzentration, MHK: A/4, MBK: A, K: Kontrolle ohne Chemotherapeutikum.

Kontrolle der ersten getrbten Rhrchen auf chemotherapeutikafreie Medien subkultiviert und fr etwa einen Tag bebrtet. Als minimale bakterizide Konzentration (MBK) gilt nach Abb. 2.20 dann diejenige Konzentration (A in Abb. 2.20), welche die hchste Verdnnung des Wirkstoffs darstellt, bei der in der Subkultur kein Bakterienwachstum erkennbar ist. Das Prinzip des Bouillon-Reihenverdnnungstestes kann auch in miniaturisierter Form als Mikro-Bouillon-Verdnnungstest zur Anwendung kommen. Dabei erfolgt die Kultur nicht in Reagenzglsern, sondern in den Kavitten von Mikrotiterplatten oder analogen Kunststofftrgern in Volumina von 0,05 bis 0,1 ml. Prinzip und Ablesung entsprechen denen des Makro-BouillonVerdnnungstestes. Bei den miniaturisierten Versionen kommt aber der Konstanthaltung des Inokulums auf relativ niedrigem Niveau (1 x 103 koloniebildende Einheiten - KBE/ml) besonders groe Bedeutung zu.
Mit der Miniaturisierung wurde der Bouillon-Reihenverdnnungstest auch der Mechanisierung und Automation zugnglich. Sowohl die Beschickung der Systeme als auch vor allem die Ablesung der bebrteten Tests lassen sich besonders leicht automatisieren (z.B. Micronautl!'-System, Merlin, Bornheim). Weitere, heute bereits im Einsatz befindliche Automalen fr die

Identifizierung und Empfindlichkeitsprfung oder allein die Empfindlichkeitsprfung von Bakterien weichen hinsichtlich der Methodik fr letzleren Zweck z.T. erheblich von dem Prinzip der Standardverfahren ab. Die Abweichungen bestehen einerseits in speziellen Beimpfungstechniken und daraus resultierenden Kulturkammern (z.B. COBAS MICRO0, Hoffmann-La Rche. MD-ABAC*. Madaus Diagnostic, VITEK'S-System, BioMcricux), andererseits in der Verwendung z.B. von Fluoreszenzreaktionen als Wachstumsindikatoren (SENSITITRES;-System, Radiometer Deutschland), die schneller bakterielles Wachstum anzeigen als die Trbungsmessung oder die visuelle Beurteilung der Flssigkulturen. Dabei darf man allerdings nicht bersehen, da die groe Empfindlichkeit der Fluoreszenzreaktion ein grundstzlich anderes Ma fr das bakterielle Wachstum darstellt als die Bewertung der Trbung, so da die Ergebnisse solcher automatischer Verfahren nicht ohne weiteres und bei allen Arten mit denen der Standard-Dilutionstcchniken zur Deckung zu bringen sind.

Agar- Verdnnungstest (Agar-Dilutionstest). Das Prinzip des Agar-Dilutionstestes entspricht dem des Bouillon-Dilutionstestes mit dem Unterschied, da geometrisch abfallende Konzentrationen eines Chemotherapeutikums mit einem flssigen Agar-Medium vermischt werden. Nach Erstarren dieses Mediums in Petrischalen werden die zu prfenden Bakterienstmme jeweils zu mehreren auf die Oberflche jedes der

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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Agarmedien mit unterschiedlichen Antibiotikakonzentrationen aufgeimpft. Nach Bebrtung wird wiederum auf makroskopisch sichtbares Wachstum geprft und die MHK analog dem Vorgehen beim Bouillonverdnnungstest festgelegt. Mit dem Agarverdnnungstest lt sich die MBK nicht feststellen; auf der anderen Seite lassen sich nur ganz vereinzelt vorhandene resistente Varianten einer Population (als ganz wenige Einzelkolonien im Inokulationsbereich) erkennen, was fr die Gesamtbewertung des Ergebnisses bedeutsam sein kann. Agardiffusionstest. Beim Agardiffusionstest (Abb.2.21 )werden mit einer bestimmten Menge von Chemotherapeutika beschickte, runde Filterpapierblttchen auf die Oberflche eines zuvor mit dem zu testenden Bakterienstamm beimpften Agarmediums aufgelegt. Durch Diffusion der Wirkstoffe entsteht ein Konzentrationsgeflle, das sich radir um das Testblttchcn entwickelt. Empfindliche Bakterien wachsen unter Ausbildung eines kreisrunden Hemmhofs, dessen Durchmesser ein Ma fr die Empfindlichkeit des jeweiligen Stammes ist. Die Bewertung der Hemmhofdurchmesser erfolgt durch vergleichende Untersuchungen entsprechender Stammkollektive im Dilutions- und Diffusionstest, so da im Idealfall eine Beziehung zwischen MHK-Werten und ihren Bewertungsgrenzen und entsprechenden Hemmhofdurchmessern herzustellen ist.

Wegen seiner vergleichsweise einfachen Durchfhrbarkeit war der Agardiffusionstest lange Zeit das Routineverfahren der Wahl fr die Empfindlichkeitsprfung schnell wachsender Bakterien, auch wenn er die Genauigkeit der Dilutionstests bei weitem nicht erreicht. Wegen der mglichen Mechanisierung und Automatisierung hatten miniaturisierte Bouillondilutionstests, eventuell nach der sogenannten Breakpoint-Methode auf die beiden Grenzkonzentrationen fr die Bewertung empfindlich/intermedir" bzw. intermedir/resistent" verkrzt, begonnen, den Agardilutionstest aus den Routinelaboratorien zu verdrngen. Wegen des immer schrfer werdenden Kostendrucks ist hier aber leider - krzlich wieder eine Umkehr eingetreten, da der Agardilutionstest im Vergleich zu den anzusetzenden Gebhren wesentlich kostengnstiger ist als der Bouillondilutionstest.
Empfindlichkeitsprfung von langsam wachsenden oder besonders anspruchsvollen bakteriellen Erregern

Abb. 2.21 Agardiffusionstest - schematische Darstellung.

Die vorstehend kurz dargestellten Techniken eignen sich zunchst nur fr schnell, d.h. ber Nacht, wachsende, nicht allzu anspruchsvolle Bakterienarten. Bei langsamerem Wachstum und deshalb erforderlicher, lngerer Bebrtung kann es zu kaum kontrollierbaren spontanen Zerfallserscheinungen der antibakteriellen Chemotherapeutika kommen, die eine zuverlssige Beurteilung des Ergebnisses erheblich stren. Komplexe Nhrmedien fr anspruchsvolle Erreger enthalten zudem hufig groe Mengen von Antagonisten, die wenigstens bestimmte antibakterielle Pharmaka in ihrer Wirkung nennenswert beeintrchtigen knnen. Dennoch lassen sich einige der hier in Frage kommenden bakteriellen Krankheitserreger bei entsprechender Modifikation der Testmethodik durchaus prfen. Dies gilt insbesondere fr Anaerobier, die besonders zuverlssig mit Hilfe eines anaerob bebrteten Agardilutionstestes hinsichtlich ihrer Antibiotikaempfindlichkeit untersucht werden knnen. Auch miniaturisierte Bouillondilutionstests knnen grundstzlich so standardisiert werden, da sie zur Resistenzbestimmung wenigstens der robusteren Anaerobierarten geeignet sind. Der Agardilutionstest hat allerdings gegenber dem Bouillondilutionstest bei Anaerobiern den Vorteil, da man ihn schon nach vergleichsweise kurzen Bebrtungszeiten (nicht

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Mikrobiologische Diagnostik

mehr als maximal 48 Stunden) zuverlssig mit der Lupe ablesen kann, was bei Bouillontests nicht immer ohne weiteres mglich ist. Bei den langsamer wachsenden aeroben und anaeroben Aktinomyzeten hat sich ein Agardilutionstest mit mikroskopischer Ablesung als besonders aussagekrftig erwiesen. Auch die z.T. sehr langsam wachsenden Mykobakterien lassen sich prinzipiell mit einer Modifikation der Dilutionstests hinsichtlich ihrer Chemotherapeutikaempfindlichkeit prfen. Frher dienten hierzu als Nhrbden die genannten Eiernhrmedien, denen entsprechende Chemotherapeutikakonzentrationen zugesetzt wurden. Heute werden zunehmend die Flssigmedien eingesetzt, die bei den automatisierten Kulturverfahren fr Mykobakterien beschrieben wurden.
In analoger Weise lassen sich ggf. auch noch anspruchsvollere bakterielle Erreger wie etwa Chlamydien in einem Gewebekullurassay prfen. Auerdem wird bei schlecht kultivierbaren Erregern neuerdings zunehmend ein molekularbiologischer Ansatz zur Resistenzbestimmung durch Nachweis entsprechender Resistenzgene verfolgt. Soweit es sich dabei um konstitutiv exprimierte Genprodukte handelt, lt sich durch den gezielten Nachweis eines Resistenzgens durchaus eine Aussage zur therapeutischen Brauchbarkeit des entsprechenden Chemotherapeutikums machen. Allerdings kann man gegenwrtig molekularbiologisch noch keineswegs ein Antibiogramm. also einen berblick ber die gesamte Chemotherapeutikaempfindlichkeit eines Stammes, erstellen, zumal dies auch beim gegenwrtigen Entwicklungsstand wirtschaftlich kaum vertretbar wre. Bestimmung des Chemotherapeutikumgehaltes in menschlichem Untersuchungsmaterial

Je nach zu analysierender Substanzgruppe und apparativer Ausrstung des Labors kommen mikrobiologische Methoden (Bioassay), enzymatische Methoden, immunologisch-serologische Methoden und chromatographische Methoden zur Konzentrationsbestimmung in Betracht. Wegen der Stranflligkeit bei Kombinationstherapie werden Bioassays heute kaum mehr eingesetzt. Durchgesetzt haben sich demgegenber vor allem serologische Verfahren im Sinne von Enzym- oder Fluoreszenzimmunassays, vereinzelt aber auch chromatographische Techniken, etwa mit der Hochdruck-Flssigkeitschromatographie.
Empfindlichkeitsprfung bei anderen menschlichen Krankheitserregern

Die Bestimmung des Gehaltes an antimikrobiellen Chemotherapeutika in menschlichen Untersuchungsmaterialien, die sogenannte Antibiotikaspiegelbestimmung, verfolgt im wesentlichen zwei Zwecke: Sie dient einerseits der therapiebegleitenden berwachung des Blutspiegels (Drug-monitoring) und wird andererseits zur Analyse der Pharmakokinetik neuer Wirkstoffe bentigt. Aus Grnden der Praktikabilitt und der problemlosen Gewinnbarkeit werden in der Regel Serumspiegel gemessen, und zwar vor allem bei Chemotherapeutika mit geringer therapeutischer Breite, d.h. mit geringem Abstand zwischen den notwendigen therapeutischen und den ggf. toxischen Konzentrationen. In der Praxis hat das vor allem bei der Therapie mit Aminoglykosiden, Peptidantibiotika und dem Fungistatikum Fluorcytosin Bedeutung.

Die Bestimmung der Wirksamkeit von Antimykotika kann grundstzlich mit denselben Verfahren, die oben fr Bakterien beschrieben wurden, vorgenommen werden. Dabei ist allerdings der Einsatzbereich des Agardiffusionstestes deutlich begrenzter und kommt im wesentlichen nur zur Prfung von 5-Fluorcytosin in Betracht. Ansonsten sind Reihenverdnnungstests zur Prfung sowohl von Spropilzen als auch von Fadenpilzen vorzuziehen oder unverzichtbar. Auch in der Virologie ergibt sich inzwischen zunehmend die Notwendigkeit einer individuellen Resistenzbestimmung einzelner Erregerstmme, insbesondere im Zusammenhang mit der HIV-Infektion. Hinsichtlich der methodischen Einzelheilen sei hier auf die entsprechenden Kapitel des virologischen Teils dieses Lehrbuchs verwiesen. In der Medizinischen Parasitologie haben Sensibilittsprfungen unter Routinebedingungen bisher keine praktische Bedeutung erlangt.

2.3.2 Serologische Untersuchungsverfahren


Basis aller serologischen Untersuchungsverfahren ist die Antigen-Antikrper-Reaktion (AgAk-Reaktion), welche nicht nur in vivo, sondern unter geeigneten Bedingungen auch in vitro abluft. Dabei bleibt die spezifische Bindung von Antigen und Antikrper (Primrreaktion) solange unsichtbar, bis es in einer zweiten Phase (Sekundrreaktion) zur Aggregatbildung oder Komplementaktivierung kommt oder die AgAk-Bindung auf anderem Wege sichtbar gemacht wird. Die hohe Spezifitt der Ag-Ak-Reaktionen und ihre vergleichsweise einfache

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

123

Nachweisbarkeit im Laboratorium machen es mglich, sie - mit bekanntem Antigen - zur Suche nach Antikrpern im Patientenserum einzusetzen (Prinzip der serologischen Krankheits-

diagnose). Mit bekannten Antikrpern kann andererseits auch eine serologische Identifizierung unbekannter, an Korpuskeln gebundener oder gelster Antigene herbeigefhrt werden (Prinzip der serologischen Identifizierung oder Typisierung von Krankheitserregern, Toxinen und anderen Antigenen).

- richtiger - als deren Kehrwert (z.B. 260) angegeben werden. Bei entsprechender Standardisierung des Reaktionsablaufs kann daraus die Antigen-bindende Kapazitt des Serums in mg/ml Serum oder Einheiten" errechnet werden.
Bei der Austitrierung von Agglutinationsreaktionen wird manchmal folgende Erscheinung beobachtet: Die Reaktion bleibt bei geringen Serumverdnnungen aus, wird dann bei strkerer Verdnnung sichtbar und verschwindet schlielich bei berschreiten des Endtiters wieder. Ein solcher Reaktionsausfall wird als Prozonenphnomen bezeichnet. Er kann auftreten, wenn im Serum gleichzeitig komplette" (IgM) und inkomplette" (z.B. IgG) Antikrper vorliegen. Letztere knnen die antigenen Determinanten besetzen, ohne zur Sekundrreaktion zu fhren. Auerdem blockieren sie die Antigene fr die Bindung der kompletten Antikrper. Da bei gleichzeitigem Vorkommen blicherweise mehr komplette" als inkomplette" Antikrper vorhanden sind, kann durch strkere Scrumverdnnung doch noch eine sichtbare Reaktion herbeigefhrt werden. Dasselbe gilt, wenn die inkomplette Reaktion durch einen starken Antikrper-berschu ausgelst ist. Prozonenphnomene knnen auerdem durch Vernderung der Serumproteinc (Erhitzung) oder durch die Anwesenheit groer Mengen kolloidalen Frcmdmaterials hervorgerufen werden. An die Mglichkeit des Auftretens eines Prozoncnphnomens mu beim serologischen Arbeiten gedacht werden; gegebenenfalls mu die abgelaufene Primrreaktion mit Hilfe des COMS-Testes oder des Blocking-Testes gezielt aufgedeckt werden (s.u.).

Die Empfindlichkeit serologischer Untersuchungsverfahren ist in der Regel wesentlich hher als die chemischer Nachweisreaktionen. Das hat aber auch zur Folge, da die Ag-AkReaktion potentiell anfllig fr methodische Strungen ist. Aus diesem Grunde mu jeder serologische Test durch positive und negative Kontrollanstze abgesichert und berprft werden. Dies gilt grundstzlich auch fr die Verwendung monoklonaler Antikrper (s. Kap. 1.2.1), obwohl deren Homogenitt hinsichtlich Immunglobulin-Klasse, Idiotyp, Spezifitt und Affinitt manche Fehlermglichkeiten, die dem Umgang mit polyklonalen Antiseren eigen sind, vermeidet.
Zum diagnostischen Antikrpernachweis wird

gewhnlich menschliches oder tierisches Serum benutzt. Bei manchen Krankheiten kann es aber auch zweckmig sein, die jeweiligen Antikrper in anderen Krperflssigkeiten wie Liquor, Gclcnkpunktaten, Augenkammerwasser, Urin und verschiedenen Ex- und Transsudaten zu suchen. Einige serologische Reaktionen erfordern bestimmte Mischungsverhltnisse von Antigen und Antikrper, um sichtbar zu werden. Je nach gewhltem Verfahren ist dieser kritische Konzentrationsbereich unterschiedlich gro. Verdnnt man antikrperhaltige Krperflssigkeiten, dann nimmt natrlich die vorhandene Antikrpermenge entsprechend dem jeweiligen Verdnnungsfaktor ab. In einer schrittweisen, meist geometrischen Verdnnungsreihe mu also der Antikrpergehalt schlielich so gering werden, da sich die Folgen der Ag-Ak-Reaktion nicht mehr erkennen lassen. Die hchste Verdnnungsstufe, bei der noch eine eindeutige Reaktion ausgelst wird, gibt den Titer (Endtiter) der antikrperhaltigen Flssigkeit an. Der Titer stellt also ein indirektes Ma fr die Antikrpermenge dar, die in dem komplexen Gemisch von Serumkomponenten enthalten ist. Er kann entweder als Verdnnungsstufe (z.B. 1:260) oder

Beurteilung Fllt ein serologischer Test mit einem Patientenserum positiv aus, darf man folgern, da der Patient spezifische Antikrper gegen das verwendete Antigen gebildet hat, sofern technische Fehler und Kreuzreaktionen ausgeschlossen werden knnen. Ob diese Antikrperbildung allerdings auf unmittelbar vorausgegangenen oder noch bestehenden Kontakt mit dem Antigen zurckgeht oder ob sie nur als Ausdruck einer frher abgelaufenen Auseinandersetzung des Immunsystems mit diesem Antigen zu werten ist (Antikrper knnen zuweilen nach berstehen einer Infektionskrankheit lebenslang persistieren), kann von einer einzigen Untersuchung meist nicht abgeleitet werden. Es ist vielmehr notwendig, den Titerverlauf zu kontrollieren. Zeigen eine oder mehrere Folgeuntersuchungen im Abstand von je ein bis drei Wochen deutlich ansteigende Titer (mindestens um 2 Stufen), hat wahrscheinlich zum Zeitpunkt der ersten Probenentnahme eine frische Infektion vorgelegen. Ein gleichbleibender oder leicht abfallender Ti-

124

Mikrobiologische Diagnostik

terverlauf spricht demgegenber fr einen lnger zurckliegenden natrlichen Kontakt mit dem Erreger oder fr den Folgezustand nach einer vorausgegangenen Schutzimpfung. Eleganter lt sich die Frage, ob es sich um eine floride oder in der Vergangenheit abgelaufene Infektion handelt, hufig durch Nachweis erregerspezifischer IgM- oder IgA-Antikrper (s.u.) beantworten. Agglutinationsreaktionen Unter Agglutination versteht man die Zusammenballung (Aggregation) und Sedimentation in wrigem Milieu suspendierter, Antigen-tragender Zellen oder Partikel (z.B. Erythrozyten, Bakterien, Latex-Partikel) als Folge einer Immunkomplexbildung durch Bindung spezifischer Antikrper. Die Entstehung makroskopisch sichtbarer Agglutinate geht dabei sowohl auf eine Vernderung der negativen Oberflchenladung (Z-Potential) der Partikel als auch auf eine Vernetzung der Antigcn-tragenden Elemente durch makromolekulare Antikrper zurck (Abb. 2.22). Das makroskopische Erscheinungsbild der Agglutinate kann dabei variieren und hngt vor allem von der Beschaffenheit der Antigen-tragenden Teilchen ab. Der Ablauf der Erythrozyten- ebenso wie der der Bakterien-Agglutination wird offenbar durch eine Reihe weiterer Faktoren beeinflut. Diese umfassen die Gre der Antikrpermolekle (IgM-Molekle wirken mehr als lOOfach strker agglutinierend als IgG-Molekle), die Anzahl bzw. Dichte antigener Epitope auf der Zeil- oder Partikeloberflche, den Expositions-

grad der antigenen Determinanten in bezug auf diese Oberflche, das Summenpotential der Auenladung der Partikel sowie Viskositt und Ionenstrke des Testmediums. Bakterien, die zur Bildung von Kapseln befhigt sind, werden darber hinaus nicht selten bei Anwesenheit dieser Kapselsubstanzen in ihrer Agglutinabilitt verndert. Komplement ist fr den Ablauf der Agglutinationsreaktionen nicht erforderlich; neben den genannten Faktoren mssen aber auch noch Mindestreaktionszeit und geeignete Reaktionstemperaturen bercksichtigt werden. Wie bei allen anderen serologischen Verfahren hngt die Zuverlssigkeit der Ergebnisse entscheidend von der exakten Durchfhrung und sorgfltigen Ablesung des Testes ab. Agglutinationsreaktionen kann man sowohl auf dem Objekttrger als auch im Reagenzglas oder als Mikroagglutination" in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten durchfhren. Typische Beispiele der Objekttrgeragglutination sind die Blutgruppenhestimmung oder die serologische Identifizierung bzw. Typisierung von Salmonellen und Shigellen.
Bakterienagglutinationen

Abb. 2.22 a-c Schematische Darstellung der Agglutinationsreaktion (modifiziert nach KELLER,1977). a) Antigen-tragende Zellen oder Partikeln; b) spezifischer IgM-Antikrper; c) Agglutinat.

Agglutinationsreaktionen mit lebenden oder toten Bakterien finden sowohl bei der Diagnostik von Infektionskrankheiten als auch zur Identifizierung angezchteter Bakterien Verwendung. Je nach Zielsetzung und Erregerarten werden die folgenden Verfahren unterschieden: Reaktion nach GRUBER und DURHAM. Schon 1896 entdeckten GRUBER und DURHAM, da Bakterien durch die Seren von Tieren, denen Zellen der entsprechenden Bakterienart einige Zeit vorher injiziert worden waren, spezifisch zusammengeballt werden knnen. Auf dieser Beobachtung aufbauend lassen sich spezifische tierische Antiseren herstellen, mit denen man unbekannte Bakterien identifizieren kann. Die GRUBER-Reaktion wird meist als ObjekttrgerAgglutination, vielfach mit Hilfe abgesttigter", d.h. durch Absorption spezifischer gemachter Antiseren, durchgefhrt und dient zur detaillierten serologischen Bestimmung von Salmonellen (Serovarbestimmung), Shigellen, Listerien und vielen anderen Bakterien. Reaktion nach WIDAL. Kurz nach der Entdeckung GRUBERS und DURHAMS fand WIDAL, da diese Reaktion auch umgekehrt verwendbar ist. Setzt man z.B. dem Serum eines Patienten mit Typhusverdacht in vitro Typhusbakterien zu, dann kommt es im Falle einer tatschlich und

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

125

gengend lange bestehenden oder ggf. frher durchgemachten Typhuserkrankung zur Agglutination der Bakteriensuspension. Bei diesem Test wird demnach ein unbekannter Antikrper mit Hilfe eines bekannten Antigens bzw. einer bekannten, Antigene tragenden bakteriellen Zelle nachgewiesen. Fr die Reaktion sind abgettete Suspensionen der jeweiligen Bakterienarten geeignet. Neben Antikrpern gegen Krperantigene (O-Antigene) lassen sich mit der WiDAL-Reaktion auch Antikrper gegen Geiel- (H-Antigene) und Kapsel-Antigene (K-Antigene) nachweisen (s. Kap. 4.4).
WEiL-FELix-Reaktion. 1915 zchteten WEIL

durch Verminderung der Oberflchenladung, feststellen. Darber hinaus kann die erfolgte Bindung inkompletter" Antikrper unter Ausnutzung des Agglutinationsprinzips aber noch mit folgenden, in der Praxis wichtigen Verfahren nachgewiesen werden: Antiglobulin-(CoOMBS-)Test. Der CooMBS-Test beruht auf der Zugabe eines zweiten, im Tier erzeugten Antikrpers, der gegen menschliche Immunglobuline gerichtet ist (Antihumanglobulinserum: Coo.MBS-Serum) und am Fc-Stck des inkompletten" Antikrpers angreift. Darber hinaus spielen Antikrper gegen C3- und C4-Fragmente des Komplementsystems, die sich in den meisten Anliglobulinseren linden, eine Rolle, da bei der Bindung der inkompletten" Antikrper ber die Komplementaktivierung auch C3 und C4 an die Zellmembran bzw. die Hllstrukturcn der Mikroorganismen angelagert werden. Sind Antigentragende Zellen oder Partikel mit inkompletten" menschlichen Antikrpern besetzt, knnen sie somit durch Zugabe des CoOMBS-Serums zur Agglutination gebracht werden, da letzteres die erforderliche Quervernetzung herbeifhrt. Ein positives Ergebnis des CooMBS-Tests besagt also, da vorher die zu beweisende Ag-Ak-Rcaktion mit inkompletten" Antikrpern abgelaufen ist. Blocking-Test. Beim Blocking-Test geht man von derselben Annahme wie beim CooMBS-Test aus: Man erwartet, da die antigenen Oberflchendeterminanten korpuskularer Elemente durch inkomplette" Antikrper besetzt wurden. Ist dies der Fall, knnen die Antigen-tragenden Partikel durch nachfolgende Zugabe spezifischer, kompletter" Antikrper nicht zur Agglutination gebracht werden, da fr letztere nicht mehr gengend Bindungsstellen zur Verfgung stehen. Hier entspricht demnach das negative Resultat des zweiten Versuchsschritts (Zugabe kompletter" Antikrper) einem positiven Ausfall der ursprnglich zu prfenden Ag-Ak-Reaktion.

und FELIX aus dem Urin von Fleckfieberpatienten Proteus-SVdmmc, die mit dem Serum dieser Patienten eine Agglutination ergaben. Der Protefw-Stamm OX 19 erwies sich als besonders reaktionsstark. Heute wissen wir, da dieses Bakterium und der Fleckfiebererreger Rickettsiu prowazekii gemeinsame Antigen-Determinanten besitzen, so da die WEiL-FELix-Rcaktion auf einer echten Kreuzreaktion (heterophilen Reaktion) und nicht auf Unspezifitt beruht. Der Erreger des murinen Fleckfiebers zeigt dieselbe Antigengemeinschaft, whrend Proteus OX 2 beim Rocky-Mountain-Spotted Fever und Proteus OX K beim Tsutsugamushi-Fieber bessere Ergebnisse liefern. Agglutinations-Lysis-Reaktion. Die Agglutinations-Lysis-Reaktion ist ein mikroskopischer Agglutinationstest zur Identifizierung von Leptospiren oder zum Nachweis gegen sie gerichteter Antikrper. Zur Lysis der Leptospiren kommt es trotz des Namens der Reaktion nicht, sondern nur zu einer besonders dichten und formverndernden Zusammenballung der fragilen Erreger zu kleinen Krnchen, die unter dem Dunkelfeldmikroskop eine partielle Auflsung vortuschen.
Nachweis inkompletter" Antikrper. Soge-

nannte komplette Antikrper sind Immunglobuline, mit denen sich Agglutinationen ohne besondere Kunstgriffe auslsen lassen; sie gehren, wie oben ausgefhrt, nahezu ausschlielich der IgM-Klasse an. Antikrper anderer Immunglobulinklassen fhren dagegen unter den blichen, einfachen Reaktionsbedingungen nur ausnahmsweise zu einer Agglutination. Diese Antikrper werden deshalb auch als inkomplett'" bezeichnet. Da nach ihrer Bindung an das spezifische Antigen die spontane Sekundrreaktion meist ausbleibt, lt sich die abgelaufene Primrreaktion nur durch Kunstgriffe, z.B.

Beide Verfahren sind in der serologischen Diagnostik von Brucellosen von praktischer Wichtigkeit, da bei diesen Infektionskrankheiten charakteristischerweise mit der Anwesenheit grerer Mengen inkompletter" Antikrper zu rechnen ist. Der Antiglobulin-Test findet darber hinaus in der Transfusionsmedizin und bei der Schwangerenvorsorge (jeweils Nachweis inkompletter", antierythrozytrer Antikrper) verbreitete und unersetzliche Anwendung.
Hmagglutinationen

Bei der Hmagglutination ist das rote Blutkrperchen Antigen-tragendes korpuskulares Element. Sind die reagierenden Antigene Bestandteil der Oberflche der Erythrozytenmembran, spricht man von aktiver oder direkter Hmagglutination. Man kann die Erythrozyten aber auch sekundr, oft nach geeigneter Vorbehandlung,

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Mikrobiologische Diagnostik
infektionen) nur verwerten, wenn hhere Titer vorliegen oder ein deutlicher Titeranstieg zu beobachten ist. Weitere indirekte Agglutinationsreaktionen

mit Fremdantigenen beladen, die dann durch Bindung spezifischer Antikrper eine Agglutination der Trgcrerythrozyten herbeifhren knnen (passive oder indirekte Hmagglutination). Typisches Beispiel fr die Anwendung der direkten Hmagglutination ist die Bestimmung der klassischen Blutgruppeneigenschaften. Weitere diagnostische Einsatzbereiche der Hmagglutinalion sind im folgenden kurz beschrieben.
Passive Hmagglutinationsreaktionen. Eines der ersten Verfahren, welches auf dem Prinzip der passiven Hmagglutination beruhte, war die Reaktion nach M IDDLEBROOK und D UBOS (1948), die mit Tuberkulinantigenen beladene Erythrozyten verwendete und entsprechend zur serologischen Tuberkulose-Diagnostik entwickelt worden war, aber keine nennenswerte praktische Bedeutung erlangt hat. Wesentlich gebruchlicher und von hoher Aussagesicherheit ist aber heute der TPHA-Test (Treponemaprt///rfi7?-Hmagglutinationstest), der mit Erythrozyten arbeitet, deren Oberflchen mit Treponema-pallidum-Antigcncn besetzt sind (s. Kap. 4.24). Dieser Test hat die Lues-Serologie im Vergleich zu frher erheblich einfacher und sicherer gemacht. Weitere analoge Methoden existieren u.a. auch fr den Nachweis von Antikrpern gegen Tetanus- oder Diphtherie-Toxin sowie fr die serologische Erkennung von Pilzund Protozoeninfektionen oder von Erkrankungen durch hher organisierte Parasiten. Heterohmagglutination. Unter Heterohmagglutination versteht man die Fhigkeit mancher Antikrper, artfremde Erythrozyten zusammenzuballen, ohne da diese das spezifische Immunogen darstellen. Diagnostisch auswerten lassen sich solche heterophilen Antikrper bei der infektisen Mononukleose und bei der Serumkrankheit nach therapeutischen oder prophylaktischen Tierserumgaben, wo sie typischerweise in grerer Menge auftreten (PAUL -B UNNELL Reaktion bzw. FfANGANUTZiu-DEiCHER-Reaklion). Kltehamagglutination. Bei atypischen Pncumonien. insbesondere solchen durch Mycoplasma pneumoniae. und bei Blutkrankheiten treten im Serum der Patienten Antikrper auf, die in der Lage sind, die krpereigenen Erythrozyten und Erythrozyten der Blutgruppe 0 bei Temperaturen um 4 bis 6 "C zu agglutinieren. Diese Kllcagglutinine sind Autoantikrper, die auch in vivo bei Temperaturen unter 20 C zu einer intravasalcn Aggregation der Blutkrperchen fhren und dadurch Krankheitserscheinungen auslsen knnen (Kltehmagglutinationskrankhcit). Wegen ihrer Unspezifitt lt sich die Reaktion diagnostisch (Lungen-

Neben Erythrozyten knnen auch andere homogen suspendierbare Trgerpartikel geeigneter Gre (z.B. solche aus Bentonit, Latex, Kollodium. Aktivkohle oder Bakterienzellen) mit Antigenen oder Antikrpern beladen werden und dann zur Sichtbarmachung einer serologischen Reaktion durch Aggregation dieser Partikel dienen.
Latex-Agglutinationen. Besonders breiten und vielfltigen Einsatz haben inzwischen Reaktionssysteme gefunden, bei denen Latexteilchen (Polystyrol) von etwa 0,8 (im Durchmesser mit Antigenen, auch solchen mit Haptcncharaktcr, oder Antikrpern adsorptiv beladen werden. Wegen der daraus resultierenden Teilchenvergrerung'" lassen sich mit den homologen Reaktionspartnern Agglutinationen erzielen, die als Flockung der sonst homogen milchigen Latexsuspension makroskopisch sichtbar werden. Derartige Latextests werden heute fr verschiedenste Zwecke kommerziell angeboten. Bei ihrer Verwendung sollte man aber bercksichtigen, da sie relativ stranfllig sind und deshalb der Mitfhrung und sorgfltigen Beurteilung von Kontrollanstzen unbedingt bedrfen. Latextests zum Antikrpernachweis: Werden mikrobielle oder andere Antigene an Latexpartikel adsorbiert, lassen sie sich zum Nachweis spezifischer Antikrper verwenden. Dieses Prinzip liegt z.B. dem viel gebrauchten Latex-Rhcumafaktor-Test zugrunde. Der Rheumafaktor ist ein bei primr chronischer Polyarthritis, anderen Kollagenosen und chronischen Erkrankungen gebildetes Anti-Gammaglobulin, das mit normalem IgG auf den Latexteilchen (als Antigen) reagiert. Darber hinaus finden analoge Testsysteme z.B. zum Antikrpernachweis gegen Histoplasma capsulatum oder Trichinella spiralis Anwendung. Latextests zum Antigennachweis: Latex-Testsysteme, bei denen die Partikel mit spezifischen Antikrpern beladen sind (umgekehrte passive Agglutination), finden zum Nachweis mikrobieller Antigene in Krperflssigkeiten immer weitere Verbreitung. Besonders zur Beschleunigung der Meningitis-Diagnostik haben sie sich bewhrt, knnen aber auch zur Untersuchung anderer Krperflssigkeiten eingesetzt werden. Inzwischen gibt es kommerzielle Latex-Reagenzien zum Antigennachweis einer ganzen Reihe

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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verschiedener Mikroorganismen; dazu gehren u.a. Streptokokken verschiedener Serogruppen, Strepiococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Serovare A, B, C. Y und W 135, Haemophilus influenzae Typ b. Cryptococcus neoformans und Hepatitis-B-Virus. Auerdem kann auch der Clumping-Faktor von Siaphylococcus aureus, ggf. zusammen mit Protein A. mit Hilfe der Latex-Agglutination nachgewiesen werden. Koagglutination. Die meisten Stmme von Staphylococcus aureus, insbesondere aber der Stamm COWAN I, besitzen das Zclloberflchenprotein Protein A. Dieses ist in der Lage, IgGMolekle ber ihr Fc-Stck zu binden, so da wie beim umgekehrten Latex-Test Antikrperbeladene Teilchen entstehen, deren serologische Reaktionsfhigkeit durch Exposition der FabStcke der angelagerten Immunglobuline vollstndig erhalten ist. Bei Kontakt mit dem homologen Antigen kann es so zu einer Agglutination dieser sensibilisierten" Staphylokokken kommen (Abb. 2.23). Der Einsatzbereich der Koagglutination entspricht dem der umgekehrten Latex-Agglutination. Kufliche Koagglutinations-Rcagenzien umfassen u.a. Tests zum Nachweis von Streptokokken der serologischen Gruppen A, B, C, G und H, Streptococciis pneumoniae, Neisseria meningitidis und Haemophilus influenzae.
Agglutinations-Hemmtests

Antikrper im Testmedium mit lslichem Antigen, wodurch die anschlieende Agglutination von Indikatorpartikeln oder -zellen gehemmt wird. Als inzwischen klassischer Anwendungsbereich der spezifischen Agglutinationshemmung kann der Nachweis von menschlichem Choriongonadotropin (HCG) im Urin zur Feststellung einer Schwangerschaft gelten. Bei diesem Schwangerschaftstest wird zunchst der zu untersuchende Urin mit Antikrpern gegen HCG zusammengebracht. Enthlt der Urin HCG. knnen anschlieend zugegebene LatexPartikel oder Erythrozylen, die mit HCG beladen sind, nicht zur Agglutination gebracht werden. Ist der Urin HCG-frei. fhrt der Testantikrper zu einer Agglutination der sensibilisierten Partikel oder Zellen. Ein hnliches Prinzip liegt dem Ilmagglutinations-Hemmtest (HHT) zugrunde, der zur serologischen Diagnostik bestimmter Viruskrankheiten gebruchlich ist (s. Kap. 5.1.13). Dieser Test beruht auf der Tatsache, da Erythrozytenmembranen ber spezifische Virusrezeploren verfgen, die bei Zugabc dieser Viren (z.B. Influenza-, Rteln-Virus) als Reaktionspartner eine Agglutination der Erythrozyten herbeifhren. Die Anwesenheit spezifischer anliviraler Antikrper hemmt diese Hmagglutination. Przipitationsreaktionen Bei der Immunprzipitation werden gelste oder kolloidal gelste Antigene durch ihre homologen Antikrper zu einem makroskopisch

Die Hemmung von Ag-Ak-Reaktionen als Teslprinzip wurde zuerst von K. LANDSTEINER angewendet. Bei derartigen Verfahren reagiert der

Abb. 2.23 Schematische Darstellung der Koagglutinationsreaktion.

128

Mikrobiologische Diagnostik

sichtbaren Niederschlag ausgefllt. Die Ursache fr die berschreitung der Lslichkeitsgrcnze der Ag-Ak-Komplexe ist wahrscheinlich die Entstehung eines Netzwerks aus multivalenten Antigenen und wenigstens bivalenten Antikrpern, wodurch Aggregate erheblicher Gre entstehen knnen (s.o.). Auerdem haben pHWert und Ionenstrke einen Einflu auf das Zustandekommen der Przipitation. Strker als bei der Agglutination ist die Bildung sichtbarer Przipitate vom richtigen Mengenverhltnis von Antigen und Antikrper abhngig. Bei grerem Antigen- oder Antikrperberschu bleiben die Ag-Ak-Komplexe in Lsung, oder die bereits gebildeten Niederschlge lsen sich wieder auf.
Ringtest

Gel aufeinander zu. An den Stellen optimaler Konzentrationsverhltnisse von Antigen und Antikrper bilden sich Przipitationsbanden oder -linien aus, die mit bloem Auge gegen dunklen Hintergrund sichtbar werden und sich durch Anfrbung deutlicher darstellen lassen.
Eindimensionaler, einfacher Agardiffusionstest. In ih-

Die methodisch einfachste Form der Immunprzipitation wird im Reagenzglas oder in dnnen Glaskapillaren durchgefhrt. In ihnen werden Antigen- und Antikrper-haltige Lsungen vorsichtig berschichtet; an der Berhrungsflche beider Lsungen bilden sich dann im positiven Falle Przipitate aus, die als weiliche Scheibe oder Trbungsring erkennbar werden und spter im Reaktionsgef zu Boden sinken. Im Rahmen der mikrobiologischen Diagnostik wird diese einfache Technik zum Nachweis von Milzbranderregern in tierischen Organen (Thermoprzipitation" nach Ascou: Milzbrandimmunserum wird mit Kochextrakten der Organe berschichtet) und zur serologischen Gruppierung von Streptokokken nach LANCEFIELD verwendet (s. Kap. 4.2).
Immunprzipitationen in Gelen

rer einfachsten Modifikation wird die Geldiffusion als eindimensionaler einfacher Agardiffusionstest nach OUDIN im Reagenzglas durchgefhrt. Dazu wird Antiserum mit flssigem Agar vermischt und das Gemisch in ein Glasrhrchen gefllt. Nach der Verfestigung des Gels wird mit Antigenlsung berschichtet. Nach Stunden bis Tagen entstehen im Agar Przipitationsbanden. die bei lngerer Beobachtung nach unten zu wandern scheinen, da sich bei zunehmendem Antigenberschu die Przipitate wieder auflsen und in etwas weiterer Entfernung von der Oberflche des Gels neu ausbilden. Die Przipitationsprobe auf Milzbrand kann mit Vorteil nach dieser Technik ausgefhrt werden.
Zweidimensionalcr, einfacher Agardiffusionstest. Fr

den zwcidimensionalen, einfachen Agardiffusionstest wird mit Antiserum vermischter Agar in einer Petrischale in gleichmiger Schichtdicke ausgegossen. Aus dem erstarrten Gel werden Lcher ausgestanzt, in welche Antigenlsung eingefllt wird. Bei passendem Mengenverhltnis von Antigen und Antikrper entwickeln sich kreisfrmige Przipitationshfe. deren Durchmesser bei Standardisierung des Verfahrens zur quantitativen Bestimmung des Antigens herangezogen werden kann (quantitative radiale Immundiffusion [RID] nach MANCINI). Die Methode wird vor allem zur Quantifizierung menschlicher Serumproteine verwendet. Doppeldiffusion in einer Dimension. 1953 haben OAKLKY und FULTHORPE eine Methode zur AntigenAnalyse angegeben, bei der Antigen und Antikrper in zwei aufeinander stehenden Agarsulen im Reagenzglas gegeneinander diffundieren.

Immunprzipitationen kommen nicht nur in flssigen Medien, sondern auch in Gelen zustande. Die Przipitate sind hier sogar meist bestndiger und deshalb besser zu beurteilen. Auerdem knnen Gemische aus mehreren Antigenen und Antikrpern analysiert werden, da die homologen Ag-Ak-Komplexe jeweils eigene Przipitationsbanden ausbilden. Als Geliermittel werden berwiegend Agar-Agar oder Agarose verwendet. Zur besseren Sichtbarmachung knnen die Przipitationslinien mit Protein-Frbeverfahren angefrbt werden.
Passive Immunprzipitationsverfahren

Bei den passiven Immunprzipitationsverfahren bewegen sich die Reaktionspartner, lsliches Antigen und Antikrper, durch Diffusion im

Doppeldiffusion in zwei Dimensionen. Bei der 1948 von RJAN OUCHTERLONY eingefhrten Agargel-Doppeldiffusionstechnik werden Antigen- und Antikrperlsungen in Stanzleher gefllt, die vorher aus einer gleichmig dicken Agar- oder Agaroseschicht ausgehoben wurden. Im Bereich der aufeinander zu diffundierenden Reaktionspartner bilden sich Przipitationslinien aus, wenn optimale Konzentrationsverhltnisse erreicht sind. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, da Antigene und Antikrper direkt miteinander verglichen werden knnen. Denn bei immunologisch identischen Antigenen und Antikrpern vereinigen sich die Przipitatlinien zweier benachbarter Einfllcher, gegen die der andere Reaktionspartner aus einem gemeinsamen Stanzloch diffundiert, in einem Bogen vollstndig miteinander (Identittsreaktion). Bei

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

129

Kreuzreaktionen entsteht ein sogenannter Sporn (partielle Identitt) und bei unterschiedlichen Antigenen oder Antikrpern kommt es zur berschneidung der Banden. Die OUCHTERLONY-Technik hat sich auerordentlich zur Identifizierung verschiedener Plasmaeiweikrper und zum Vergleich tierischer und mikrobieller Antigene sowie zur Charakterisierung tierischer und mikrobieller Toxine bewhrt. Als Sonderform der Doppeldiffusionstechnik kann der ELEK-OucHTERLONY-Test zum Nachweis des Toxinbildungsvermgens von Corynebacterium diphtheriae gelten (s. Kap. 4.17).
Aktive Immunprzipitationen

Radioimniunelektrophorese. Die Radioimmunelektrophorese wird als empfindliches Verfahren zum qualitativen Nachweis von Antikrpern gegen Antigene benutzt, die in reiner Form mit einem gammastrahlenden Isotop markiert sein mssen. Nach elektrophoretischer Auftrennung des Testserums wird das radioaktiv markierte Antigen zusammen mit einem komplexen Antiserum gegen Globuline des Testserumspenders in die Rinnen gefllt und der Diffusion berlassen. Nach deren Abschlu wird das vollstndig gewaschene Gel mit einem empfindlichen Rntgenfilm in Kontakt gebracht. Die erhaltene Autoradiographie zeigt an, in welcher oder welchen Przipitationsbanden das markierte Antigen vorhanden ist. Rein aktive Immunprzipitationsverfahren. Als

Bei den sogenannten aktiven Immunprzipitationsverfahren erfolgt die Fortbewegung von Antigen und/oder Antikrper im Gel nicht durch Diffusion, sondern durch die Antriebskrfte einer elektrischen Potentialdiffcrenz. Je nachdem, ob nur einer der Reaktionspartner oder beide elektrophoretisch aufgetrennt werden, spricht man von kombiniert aktiv-passiven oder rein aktiven Verfahren.
Kombinierte aktiv-passive Immiinprzipitationsver-

Beispiele fr die aktiven Immunprzipitationsverfahren seien die Gegenstromimmunelcktrophorese (Counter[current]immunoelectrophoresis, CIEP) und der Elektroimmunassay (Rocket Immunoclcctrophoresis") erwhnt.
Gegenstromimmunelektrophorese. Unter den verschiedenen Modifikationen der immunelektrophoretischen Technik hat die CIEP besondere praktische Bedeutung fr die medizinische Mikrobiologie. In Analogie zur Doppeldiffusion nach OUCHTKRLONY werden Antigen- und Antikrperlsung in zwei Stanzlcher eines Agarose-Gels eingefllt, aber in diesem Fall nicht durch Diffusion, sondern elektrophoretisch aufeinander zu getrieben. Antigen wird in die kalhodenwrts gelegene Vertiefung und das Antiserum in das anodale Stanzloch gegeben. Bei Anlegen einer elektrischen Spannung wandert das negativ geladene Antigen anodenwrts; die Antikrper werden durch den Ionenflu zur Kathode mitgerissen (Elektroendoosmose). Im Bereich optimaler Konzentrationsverhltnisse beider Reaktionspartner bilden sich Przipitationslinien aus. Die CIEP hat sich besonders zur Auffindung mikrobieller Antigene in Krperflssigkeiten bewhrt: zum Antikrpernachweis ist sie wegen geringer Empfindlichkeit weniger geeignet. Da die Ergebnisse vergleichsweise schnell verfgbar sind, gehrt sie zu den diagnostischen Schnellmethoden. Ihr Anwendungsbereich ist unter anderem der Nachweis von HBs-Antigen sowie von Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis-, Pneumokokken- und Streptokokken-Oberflchenantigenen. Auerdem kann sie zur Auffindung von Clostridium diffkile-Toxin verwendet werden. Elektroimmunoassay - Rocket Immunelectrophoresis: Der von LAURELL in den sechziger Jahren entwickelte Test ist mit der radialen Immundiffusion verwandt mit der Abweichung, da ein elektrisches Potential benutzt wird, um die Antigene in das Antikrper-haltige Agarose-Gel zu treiben. Die resultierenden dreieckfrmigen oder felsnasenhnlichen Przipitate erlauben eine quantitative Auswertung, da die Antigenkonzentrationen direkt proportional zur Hhe bzw. Flche der Dreiecke sind. Eine Modifikation des Elektroimmunoassays ist die Crossed Immunoelectrophorcsis", bei welcher die Primrauftrennung durch Elektrophorese oder isoelektrische Fokussierung erfolgt.

fahren. Zu den kombinierten Verfahren gehren z.B. die klassische Immunelektrophorcse (IEP) nach GRABAR und WILLIAMS, die Immunfixationselektrophorese (1FE) und die Radioimmunelektrophorese. Immunelektrophorese. Die IEP, die 1953 von GRAB AR und WILLIAMS eingefhrt wurde, ist eine Kombination der Doppeldiffusionstechnik mit der elektrophoretischen Auftrennung komplexer Antigengemische. Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, wird in der Laufrichtung ein Graben im Gel ausgehoben, der mit entsprechendem Antiserum gefllt wird. Die Antikrper diffundieren in Richtung auf die getrennt vorliegenden Antigene und bilden mit diesen Przipitationslinien, wenn optimale Konzentrationsverhltnisse erreicht sind. Mit dieser Methode wird eine sehr genaue Analyse auch uerst vielschichtiger biologischer Systeme mglich. So kann sie z.B. Humanserum in mehr als dreiig antigenetisch unterschiedliche Proteinkomponenten auftrennen. Inimunfixationselektrophorese. Die IFE (ALPER und JOHNSON, 1969) hnelt der IEP: im Gegensatz zu letzterer wird das Antiserum aber nach elektrophoretischer Auftrennung der Antigene auf die Oberflche des Gels aufgebracht. Dabei kann das Antiserum auch in Zelluloseazetat- oder Fterpapierstreifen enthalten sein, in welche ihrerseits die Antigene hineindiffundieren knnen, so da im Gel ebenso wie in den Antiserum-haltigen Streifen (Immunoprint") Ag-Ak-Reaklionen ablaufen. Der Einsatzbereich der IFE ist hnlich dem der IEP. nur da die erstere ein deutlich besseres Auflsungsvermgen, erheblich krzere Reaktionszeiten und direkte Vergleichbarkeit mit rein elektrophoretischen Auftrennungen besitzt.

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Mikrobiologische Diagnostik

Western-Blot-Technik (Immunoblot). Mit Hilfe der Immunoblot-Technik werden heute z.B. sehr spezifisch Antikrper gegen verschiedene Bestandteile der AIDS-Erreger, von Borrelia burgdorferi (B. afzelii) oder von Yersinia enterocolitica nachgewiesen. Bei dieser Methode werden zunchst die Proteinantigene mit Hilfe der SDS-Gradienten-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt. Die getrennten Proteine werden dann durch Elektrotransfer (Elektroblotting) auf eine geeignete Membran (z.B. Nitrozelluloscfiltermembran) bertragen und hier mit dem zu untersuchenden Patientenserum zur Reaktion gebracht. Haben sich Antikrper an die auf die Membran bertragenen Proteine gebunden, knnen diese mit der Technik eines Enzymimmunassays z.B. mit Meerrettich-Peroxidase-markiertem Antihumanglobulinscrum oder eines Radioimmunassays (s. Kap. 5.1.13) z.B. mit 12M-markiertem Protein A (nach Autoradiographie) sichtbar gemacht werden. Seinem Wesen nach ist der Immuno(elektro)blot ein qualitatives, aber sehr spezifisches serologisches Verfahren. Patientenseren, in denen Antikrper gegen den jeweils gesuchten Erreger enthalten sind, bringen im Western Blot eine Reihe verschiedener Proteinbanden zur Darstellung. Nur bei Anwesenheit von Antikrpern gegen mehrere verschiedene Erregerproteine kann man sicher davon ausgehen, da der Patient tatschlich mit dem Erreger Kontakt gehabt hat. Reaktivitt mit einzelnen Banden erfordert demgegenber groe Vorsicht bei der Interpretation des Ergebnisses (spezifische" und unspezifische"' Banden) und die Durchfhrung von Kontrolluntersuchungen. Immerhin gilt der Western Blot als Besttigungsverfahren, mit dessen Hilfe positive Reaktionsausflle z.B. des ELISA und der Immunfluoreszenztechnik berprft werden knnen. Im Zusammenhang mit Yersinia enterocolif/cfl-Infektionen dient er vor allem der diagnostischen Abklrung von postinfektisen Gelenkentzndungen.
Lysisreaktionen

In der praktischen bakteriologisch-serologischen Diagnostik spielt die direkte Anwendung der Immunbakteriolyse keine wesentliche Rolle. Historisch hat aber der PFEiFFERsche Versuch (1896), hei dem es nach Injektion virulenter Cholera-Vibrionen in die Bauchhhle vorher gegen Cholera immunisierter Meerschweinchen zu einer mikroskopisch nachweisbaren Lysc der Vibrionen kommt, groe Bedeutung fr die Entwicklung der Immunittsforschung gehabt. Der gleiche Effekt der Vibriolyse lt sich im umgekehrten PFFJFFF.R.VC/H; Versuch auch dann erzeugen, wenn die Vibrionen zusammen mit spezifischem Antiserum bei nicht immunisierten Versuchstieren in die Peritoncalhhle eingespritzt werden. Das Phnomen der Bakteriolyse, das sich analog bei anderen gramnegativen Bakterien beobachten lt, kommt, wie wir heute wissen, durch Aktivierung des in der Pcritonealflssigkcit des Meerschweinchens vorhandenen Komplcmentsystems (s. Kap. 1.2.5) zustande.

Komplernentbindungsreaktion (KBR). Das 1901 von BORDET und GENGOU erarbeitete Prinzip der Komplementbindungsreaktion beruht darauf, da Ag-Ak-Komplexe das im Blutplasma gesunder Tiere und Menschen vorkommende Komplementsystem binden", d.h. unter Verbrauch der aktivierbaren Komponenten aktivieren knnen. Abgesehen von Zytolysevorgngen bei Zellen und Frderung der Phagozytose und Immunadhrenz wird diese Komplementaktivierung in der Regel nicht direkt sichtbar; das Komplement wird jedoch fr weitere immunolytische Vorgnge im selben Versuchsansatz verbraucht. Dadurch kann man durch nachtrgliche Zugabe eines Indikatorsystems aus Schaferythrozyten und gegen sie gerichteten Kaninchenantikrpern (Ambozeptor"), das ebenfalls zu einer komplementabhngigen Zytolyse (Immunhmolyse) befhigt ist, Aussagen ber die erfolgte oder nicht erfolgte Komplementaktivierung im ersten Teil der Reaktion machen (Abb. 2.24).
Voraussetzung fr das einwandfreie Gelingen des gesamten Testablaufs ist natrlich eine sorgfltige mengenmige Abstimmung aller Reaktionspartner aufeinander, die in Vorversuchen vorgenommen wird. Vor allem der Komplementgehalt des Systems ist dadurch zu standardisieren, da es zunchst aus den verwendeten Seren (bekanntes Antiserum oder Patientenserum, Ambozeptorserum) durch Erwrmen auf 56 CC entfernt wird (einige Komplementkomponenten sind hitzelabil). Anschlieend wird es dann dosiert, in vorher ausgetesteter Menge, mit frischem Mecrschweinchenserum oder aus kuflichen, durch Lyophilisation haltbar gemachten Prparationen zugegeben.

Zellulre Antigen-tragende Elemente wie Blutkrperchen, andere menschliche oder tierische Zellen sowie Bakterienzellen knnen in einem spezifischen immunologischen Proze, bei dem Antikrper ber ihr Fc-Stck das Komplementsystem aktivieren, zur Auflsung gebracht werden.

Nach Abb. 2.24 sind die mglichen Reaktionsausflle wie folgt:

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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Abb. 2.24 Schematische


Darstellung der Komplementbindungsreaktion (KBR); oben: positiver Reaktionsausfall; unten: negativer Reaktionsausfall.

1. Die Hmolyse im Indikatorsystem bleibt aus. In diesem Fall darf angenommen werden, da eine Komplement-verbrauchende Ag-AkReaktion zwischen den primr eingesetzten Reaktionspartnern stattgefunden hat. Das Ergebnis des Testes ist positiv. 2. Tritt eine Lyse der Schaferythrozyten ein, ist das Komplement im ersten Teil des Reaktionsablaufes nicht aktiviert worden. Es hat also die gesuchte Ag-Ak-Reaktion nicht stattgefunden, der Test ist negativ. Manche, vor allem bakteriell kontaminierte Seren binden Komplement unspezifisch, ohne da Antigen hinzugefgt wurde. Die KBR fllt dadurch falsch-positiv aus (keine Hamolyse). Man spricht in einem solchen Fall von Eigenhemmung. Hier mu die Untersuchung mit einer anderen Serumprohc wiederholt werden. Aus der Mglichkeit des Vorkommens einer Eigenhemmung ergibt sich die Notwendigkeit, fr jedes Serum neben dem eigentlichen Versuchsansatz eine Kontrolle ohne Antigenzugabe mitzufhren. Methodisch lt sich die KBR im Laboratorium unterschiedlich handhaben. Die frher bliche Durchfhrung im Reagenzglas (Kot.MHR-Technik) ist arbeits- und materialaufwendig und heute weitgehend zugunsten einer Mikromethode in Mikrotiterplatten verlassen worden, bei der sich auch die Herstellung der Verdnnungsreihen zur Austitrierung mechanisieren lt. Grundstzlich kann die KBR sowohl zur Identifizierung unbekannter Antigene als auch zum Nachweis unbekannter oder gesuchter Antikr-

per verwendet werden. Letzterer Einsatzbercich hat im Rahmen der serologischen Diagnostik von Infektionskrankheiten die weitaus grere praktische Bedeutung erlangt. Das klassische Anwendungsgebiet der KBR war die SyphilisDiagnostik, bei der sie als WASSERMANNscheReaktion (WaR) (WASSERMANN, NF.ISSER und B RCK , 1906) jahrzehntelang unschtzbare Dienste geleistet hat. Darber hinaus erwies sie sich auch bei vielen anderen bakteriellen, pilzbedingten, parasitren und vor allem viralen Erkrankungen als hervorragendes serologisch-diagnostisches Hilfsmittel und wurde erst in neuerer Zeit zunehmend durch modernere serologische Untersuchungsverfahren ersetzt. Die heute blichen Komplement-unabhngigen Lysisreaktionen dienen im wesentlichen der berprfung der Funktionsfhigkeit des zellulren Immunsystems (z.B. T-Lymphozyten, natrliche Killerzellen).

Immunfluoreszenzmikroskopische Verfahren Immunglobuline lassen sich chemisch mit bestimmten fluoreszierenden Farbstoffen - Fluorochromen - (z.B. Fluoreszeinisothiocyanat FITC oder Tctramethylrhodaminisothiocyanat TMRI) markieren, ohne da ihre spezifische Bindungsfhigkeit an das homologe Antigen verlorengeht. Auf dieser Erkenntnis basierend haben COONS und Mitarbeiter (1941/42) eine se-

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Mikrobiologische Diagnostik

rologische Technik entwickelt, die sowohl zur Identifizierung unbekannter Antigene und Antikrper als auch zum topographischen Nachweis von Antigenen in Zellen und Geweben geeignet ist. Das Prinzip dieser mikroskopischen Immunfluoreszenzverfahren besteht darin, da auf einem Objekttrger fixierte Antigen-tragende zellulre Elemente, die mit Fluorochrommarkierten Antikrpern besetzt sind, unter einem Fluoreszenzmikroskop als farbig leuchtende Objekte oder Strukturbestandteile gegen dunklen Hintergrund sichtbar werden. Hat keine Ag-Ak-Reaktion stattgefunden, bleibt die Anfrbung" aus, vorausgesetzt da berschssiges markiertes Antiserum sorgfltig abgewaschen wurde. Die mikroskopische Immunfluoreszenztechnik kann in verschiedenen Modifikationen zur Anwendung kommen.
Direkter mikroskopischer Immunfluoreszenztest

gitidis, Burkholderia pseudomallei, Salmonellen, Shigellen, Staphylokokken, Pneumokokken, Streptokokken verschiedener serologischer Gruppen, Treponema pallidum, Chlamydia trachomatis, Candida albicans, Kryptosporidien, sowie fr eine ganze Reihe von Viren (Adeno-, Cytomegalie-, EPSTEIN-BARR-, Herpes-simplex-, Influenza-, Rteln-, Mumps-, Parainfluenzaund Tollwut-Viren).
Indirekter mikroskopischer Immunfluoreszenztest

Die direkte Immunfluoreszenztechnik dient zur Identifizierung von Mikroorganismen oder zur Lokalisation verschiedener Antigene in Zellen und Gewebe. Sie benutzt fluorochromierte, in der Regel im Tier hergestellte spezifische Antikrper gegen das erwartete Antigen (Abb. 2.25, Farbtafeln). Neben der Identifizierung von Erregerkulturen kann die direkte Immunfluoreszenz auch zum Erregernachweis in klinischen Untersuchungsmaterialien herangezogen werden und gehrt damit zu den spezifischen Schnellmethoden der mikrobiologischen Diagnostik. Kufliche, Fluorochrom-markierte Antiseren sind u.a. zum Nachweis folgender Erreger erhltlich: Bordetella pertussis und parapertussis, Escherichia coli (K- und O-Antigene). Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Klebsiella-Arten, Legionella-Arten, Leptospiren, Listerien, Neisseria gonorrhoeae und menin-

Zur Suche nach unbekannten Antikrpern wird die indirekte Technik eingesetzt (s. Abb. 2.25. Farbtafeln): In einem ersten Arbeitsschritt werden auf dem Objekttrger fixierte Zellen mit bekannter Antigenstruktur mit Serum (z.B. Patientenserum), in dem nach Antikrpern gegen diese Antigene gesucht werden soll, berschichtet und inkubiert. Nach sorgfltigem Waschen des Prparates wird anschlieend ein fluorochromiertes Antigammaglobulin (z.B. Antihumangammaglobulin) aufgebracht. Letzteres kann die Antigen-tragenden Zellen nur zum Aufleuchten bringen, wenn in dem untersuchten Serum (z.B. Patientenserum) spezifische Antikrper vorhanden waren, die sich im ersten Schritt der Methode an die homologen Antigene gebunden haben und nun als Antigen mit dem markierten Antigammaglobulin reagieren. Aufleuchten des Antigens unter dem Fluoreszenzmikroskop bedeutet also, da das untersuchte Serum (z.B. Patientenserum) den gesuchten Antikrper enthlt; das Testergebnis ist positiv. Ein negativer Reaktionsausfall, d.h. das Fehlen des gesuchten Antikrpers, wird am Ausbleiben der Fluoreszenz erkennbar. In gleicher Weise kann auch ein unbekanntes Antigen mit Hilfe von bekannten Antiseren er-

Abb. 2.25 Schematische


Darstellung des direkten und indirekten mikroskopischen Immunfluoreszenztests.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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mittelt werden. Werden tierische Antiseren im Testsystem benutzt (z.B. im Kaninchen erzeugte Antiseren), mu ein fluorochromiertes Antigammaglobulinserum gegen das Gammaglobulin der betreffenden Tierart (z.B. Anti-Kaninchen-Gammaglobulinserum) verwendet werden. Der Vorteil des indirekten Verfahrens (Doppelschichttechnik) liegt in seiner greren Empfindlichkeit im Vergleich zur direkten Technik und in der Tatsache, da man mit wenigen markierten Antigammaglobulinseren auskommt. Unter den indirekten diagnostischen Immunfluoreszenzverfahren hat der FTA-Test (Fluoreszenz-Treponema-Antikrper-Test), heute meist als FTA-ABS-Test mit Vorabsorption des Patientenserums zur Entfernung kreuzreagierender Antikrper, besonders weite Verbreitung gefunden. Ebenso bewhrt haben sich inzwischen auch indirekte Immunfluorcszenzmethoden zum Nachweis von Antikrpern gegen Legioncllcn, Chlamydia Irachomatis, Toxoplasma gondii (Ablsung des wegen Infektionsgefahr nicht ungefhrlichen Serofarbtestes nach SABIN und FELDMAN), Plasmodien, Spropilze und viele Viren. Als weitere Modifikation kann zum Nachweis erfolgter Komplementbindung ein fluorochromiertes Antikomplemcntserum verwendet werden, mit dessen Hilfe speziell Komplement-bindende Ag-Ak-Reaktionen nachgewiesen werden knnen.
Immunperoxidase- Tests

Neutralisationsreaktionen

Mit den Neutralisationsreaktionen prft man die Fhigkeit spezifischer Antikrper, die lnfektiositt von Mikroorganismen oder die Toxizitt ihrer Stoffwechselprodukte fr lebende biologische Objekte aufzuheben, zu neutralisieren"'. Damit stehen diese Untersuchungsverfahren in direkter Beziehung zu den Schutzmechanismen, die auf diese Antikrper in vivo zurckgehen.
Toxin-Antitoxin-Tierversuche

Wie im Kap. Diagnostische Tierversuche'" ( in Kap. 2.3.1) besprochen, dienen Toxin-Antitoxin-Tiervcrsuche zum Nachweis mikrobieller Giftstoffe in menschlichem Untersuchungsmatcrial, Lebensmitteln oder Kulturberstnden, oder sie werden zur Standardisierung therapeutischer oder prophylaktischer Antiseren (z.B. Diphtherie-Antitoxin) benutzt.
Weitere Toxin-Neutralisationsreaktionen

Analog der Immunfluoreszenztechnik lassen sich Antikrper anstatt mit Fluorochromen auch mit Enzymen wie der Meerrettich-Peroxidase markieren. Haben sich derartig markierte Antikrper an ein Antigen angelagert, kann ihre Anwesenheit durch die nachfolgende Reaktion mit einem Entwicklungsreagenz sichtbar gemacht werden. Bei Verwendung von 3,3-Diaminobenzidin oder 4-Chloro-l-naphlhol tritt z.B. im positiven Falle eine Braunfrbung auf; im Negativfall bleibt die Frbung aus. Die aufgetretene Farbreaktion kann sowohl mikroskopisch mit Hilfe eines einfachen, laborblichen Durchlichtmikroskops als auch sogar makroskopisch festgestellt werden. Wegen der einfacheren Durchfhrbarkeit und Auswertbarkeit gewinnen Immunperoxidase-Teslverfahren zunehmend an Bedeutung. Ihr Einsatzbereich entspricht vllig dem der Immunfluoreszenztechnik: Sie knnen sowohl zur Identifizierung oder Lokalisierung von Antigenen als auch zum Antikrpernachweis eingesetzt werden. Anwendungsgebiete sind u.a. der Antigennachweis von Treponema pallidum, Chlamydien oder Herpes-simplex-Virus bzw. der Antikrpernachweis gegen diese Antigene.

Ihrem Wesen nach ebenfalls Neutralisationsreaktionen sind die Antistreptolysin-O-Reaktion (ASL-O) und der AntidesoxyribonukleaseB-Test (ADB), die beide zur Diagnose einer durchgemachten oder noch laufenden Infektion mit Streptococcus pyogenes dienen. Das von diesen Bakterien gebildete, gewebstoxische Stoffwechsclprodukt Strcptolysin O besitzt die Fhigkeit, Erythrozyten aufzulsen. Bei Infektionen mit Streptokokken bildet der menschliche Krper spezifische Immunglobuline gegen das Streptolysin, welche seine hmolysierende Wirkung in vitro zu neutralisieren vermgen. hnlich hemmen im ADB-Test neutralisierende Antikrper die Aktivitt des Streptokokkenenzyms Desoxyribonuklease B (Streptodornase).
Neutralisationsreaktionen in der Virologie

Fr die Virologie haben Neutralisationsreaktionen (Neutralisation der Infektiositt) nur noch begrenzte praktische Bedeutung (s. Kap. 5.1.13). Sie dienen dabei einerseits zur Identifizierung von Viren oder zur Bestimmung von Antigenverwandtschaften; andererseits werden sie zum Nachweis spezifischer Antikrper, also zur serologischen Krankheitsdiagnose, eingesetzt.
Immobilisationsreaktionen

Bei einzelnen beweglichen Bakterienarten fhrt der Kontakt mit den gegen sie, vor allem aber mit den gegen ihre Geielantigene gerichteten

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Mikrobiologische Diagnostik

Antikrpern zu einer raschen Hemmung ihrer Beweglichkeit im mikroskopischen Nativprparat. Darauf aufbauend wurden Verfahren zur schnellen Identifizierung von Bakterien und zur serologischen Krankheitsdiagnostik entwickelt. Wichtigstes Beispiel fr den letzteren Anwendungsbereich ist der Treponema pallidum-lmmobilisationstest (TPI-Test), der 1949 von NELSON und MAYER eingefhrt wurde und den Durchbruch zu einer spezifischen Lues-Scrodiagnostik darstellte, inzwischen aber durch den FTA-ABS- und den TPHA-Test abgelst wurde. Gute Dienste zur Schnellerkennung der Cholera leistet der Vibrio c/io/erae-Immobilisationstest, der sowohl mit nativem Reiswassersluhl der Kranken als auch mit kurz bebrteten, flssigen Anreichcrungskulturen durchgefhrt werden kann und eine vorlufige Erregeridentifizierung erlaubt.
Kapselquellungsreaktionen

Antikrper knnen bei bekapselten Bakterienarien mit der Kapselsubstanz als homologem Antigen reagieren, was unter dem Mikroskop, auch wegen eintretender nderung des Brechungsindex, als erhebliche Verbreiterung und Abrundung der Schleimkapsel in Erscheinung tritt (sogenannte Kapselquellung). Hauptschlich gebruchlich ist dieses Verfahren zur serologischen Typisierung von Pneumokokken (NEUEELDschc Kapselquellungsreaktion), KlebsiellaSpczies und Haemophilus influenzae.
Radio-, Enzym- und Fluoreszenzimmun(o)assays

des quilibriums werden gebundene und ungebundene Anteile des Analyten voneinander getrennt (z.B. durch Przipitation des Ag-Ak-Komplexes oder durch primre Adsorption des Antikrpers an die Wand des Reaktionsgefes) und die Radioaktivitt der Ag-AkKomplexe wird gemessen. Je hher die Konzentration des gesuchten (unmarkierten) Analyten im Untersuchungsmaterial war, desto geringer wird die Radioaktivitt der Ag-Ak-Komplexe sein. Die zweite Modifikation des RIA wird als Reagenzberschu- oder Sandwich-Technik bezeichnet. Zu ihrer Durchfhrung wird gewhnlich der Antikrper radioaktiv markiert und in berschukonzentrationen eingesetzt. Der Analyt wird aufgrund seiner Bindung an den radioaktiv markierten Antikrper gemessen. Seinem Wesen nach ist der RIA ein quantitatives Verfahren; er erlaubt also die Mengenbestimmung des gesuchten Analyten (Anligcn oder Antikrper). In der medizinischen Mikrobiologie wurde er frher hauptschlich zur Bestimmung von Aminoglykosid-Konzentrationen im Patientenserum und zum Nachweis bakterieller oder viralcr (z.B. HBsAg) Antigene in Krperflssigkeiten eingesetzt. Die Entwicklung einfacherer (z.B. Latex-Agglutination, Koagglulination, Gegenstromclektrophorese) oder analoger Verfahren, die ohne radioaktiv-markierte Reagenzien auskommen, keine Entsorgungsprobleme machen und fr denselben Anwendungsbereich geeignet sind, hat allerdings in jngster Zeit den RIA wieder weitgehend aus den diagnostischen mikrobiologischen Routinelaboratorien verdrngt. Enzymimmun(o)assay (EIA)

In neuerer Zeit haben Radio-, Enzym- und Fluorcszcnzimmun(o)assays immer strkere Verbreitung gefunden, da sie, obwohl methodisch recht aufwendig, auerordentlich empfindliche Nachweisreaktionen fr gesuchte Antigene oder Antikrper sind.
Radioimmun(o)assay (RIA) Der RIA vereinigt die Spezifitt der immunologischen Reaktion mit der Empfindlichkeit der Radiochemie. Im Prinzip kann er in zwei Modifikationen ausgefhrt werden: Bei der ersten Modifikation handelt es sich um ein kompetitives Proteinbindungsverfahren, bei dem der gesuchte Analyt (meist das Antigen) radioaktiv markiert wird (z.B. mit I2M) und mit demselben, im Untersuchungsmaterial enthaltenen, unmarkicrlcn Analytcn in Konkurrenz um die Bindungsstellen auf einem spezifischen Antikrper tritt. Nach Erreichen

Enzymimmunassays basieren auf der Mglichkeit, Antigene oder Antikrper mit Enzymen so zu koppeln, da weder die immunologische noch die enzymatische Aktivitt verlorengehen. Die immunologisch spezifische Bindung des Enzymmarkierten Reaktionspartners wird am Ende des Versuchsablaufs durch eine Enzym-SubstratReaktion gemessen und kann, entsprechende Standardisierung des Tests vorausgesetzt, ebenfalls quantitative Ergebnisse liefern. Von besonderer praktischer Bedeutung ist heule der Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) in seinen verschiedenen Modifikationen. Prinzip und Ablauf einer der Modifikationen des ELISA sind in Abb. 5.33 schematisch dargestellt.
ELISA-Methoden zum Antikrpernachweis.

Zum Antikrpernachweis und zur Antikrperquantifizierung bei nahezu allen Infektionskrankheiten hat die indirekte Methode des Festphasen-ELISA besonders weite Verbreitung gefunden. Sie beruht auf folgendem Prinzip: Die Vertiefungen von Plastik-Mikrotitcrplatten werden durch passive Adsorption mit dem jeweiligen Antigen beladen (sensibilisiert"). Nach Auswaschen des berschssigen Antigens wird

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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die zu uniersuchende Serumprobe in den sensibilisierten" Vertiefungen inkubiert, um etwa vorhandene Antikrper an das immobilisierte Antigen zu binden. Dann werden alle Serumbestandteile, die nicht reagiert haben, ausgewaschen und ein Enzym-markiertes Antihumanimmunglobulin (Konjugat) wird zugegeben, welches sich an den vorher gebundenen spezifischen Antikrper anlagert. Nach erneutem Waschen wird eine Lsung der Substanz, die dem zur Markierung verwendeten Enzym als Substrat dient, zugegeben, die Reaktion wird nach ausreichender Inkubationszeit unterbrochen und die Umsatzleistung des Enzyms wird, gewhnlich anhand einer Farbreaktion, gemessen. Diese indirekte Methode lt sich nur durchfhren, wenn ausreichend gereinigtes Antigen zur Verfgung steht. Wenn das nicht der Fall ist, kann die feste Phase (z.B. Plastikoberflche der Vertiefungen in den Mikrotiterplatten) mit dem spezifischen Antikrper beladen werden. Im weiteren Tcstablauf werden dann zugegeben: ungereinigtes Antigen, zu untersuchendes Serum, Enzym-markiertes Antihumanglobulin (Konjugat), Substrat. Eine weitere Modifikation ist, zunchst nichtmarkiertes Antihumanglobulin nach folgendem Schema einzusetzen: Antigen auf der festen Phase, zu untersuchendes Serum, nicht-markiertes Antihumanglobulin, Enzym-markiertes Antihumanglobulin, Substrat. Bei der SandwichMethode wird die feste Phase mit Anligen beladen, dann werden das zu untersuchende Serum, dann Enzym-markiertes Antigen und schlielich Substrat zugegeben. ELISA-Methoden zum Antigennachweis. Zum Antigennachweis hat die Sandwich-Methode mit berschu an markiertem Antikrper die weiteste Verbreitung gefunden. Sie luft nach folgendem Schema ab: Spezifische Antikrper an der festen Phase, zu untersuchende Probe (Antigen), Enzym-markierter spezifischer Antikrper, Substrat. Unter Einfgung eines zustzlichen Versuchsschrittes kann auch mit Antikrpern von zwei verschiedenen
Spender-Spezies gearbeitet werden: Festphasen-Antikrper (z.B. vom Schaf), zu untersuchende Probe (Antigen), spezifischer Antikrper (z.B. vom Kaninchen). Enzym-markiertes Anti-Kaninchen-Immunglobulinserum, Substrat. Weitere Modifikationen sind erforderlich, wenn es um den Nachweis von kleinmolekularcn Haptenen geht.

umfat inzwischen u.a. folgende Gebiete: Nachweis von mikrobiellen und viralen Antigenen in Krperflssigkeiten; Nachweis von Toxinen (Aflatoxinen, Clostridium difficile-Toxm); Nachweis von Parasitenantigenen (z.B. Schistosoma mansoni, Toxoplasma gondii); Konzentrationsbestimmungen von Aminoglykosiden; Nachweis von Antikrpern gegen viele verschiedene Krankheitserreger.
Fluoreszenzimmun(o)assay (FIA) FIA-Techniken finden gegenwrtig in klinischen Laboratorien breite Anwendung zum Nachweis und zur Quantifizierung von Arzneimitteln, Hormonen, Proteinen und Peptidcn in Krperflssigkeiten. Diese Verfahren sind schnell, empfindlich und automatisierbar und stellen Alternativen zum RIA ebenso wie zum ELISA dar. Der Versuchsaufbau ist hnlich wie beim RIA und ELISA, nur da hier Fluorochrome zur Markierung verwendet werden und die Bindung der fluorochromierten Reaktionspartner, gegebenenfalls nach vorheriger enzymatischer Abspaltung, ber ein Fluorometer nachgewiesen und quantifiziert wird. In die Mikrobiologie hat der kompetitive FIA vor allem zur Konzentrationsbestimmung von Aminoglykosiden oder Peptidantibiotika im Patientenserum Eingang gefunden.

Nachweis von IgM-Antikrpern Wegen ihrer Gre knnen die makromolekularen IgM-Antikrper den Kreislauf kaum verlassen und werden deshalb auch nicht diaplazentar von der Mutter auf den Ften bertragen. Auerdem werden sie im Verlauf einer Infektion als erste ausgebildet, verschwinden aber whrend der Heilungsphase bald (in Wochen oder Monaten) und werden gegenlufig durch IgG-Antikrper ersetzt. Diese beiden Eigenschaften verleihen ihnen spezielle diagnostische Bedeutung: Einerseits kann man sie dazu benutzen, auf serologischem Wege zwischen floriden und abgelaufenen Infektionskrankheiten zu unterscheiden; andererseits erlauben sie festzustellen, ob beim Neugeborenen vorhandene Antikrper von der Mutter stammen (Leihimmunitt - IgG) oder im Rahmen einer intrauterin erworbenen Infektion vom Kind selbst gebildet wurden (IgM) und damit auf eine behandlungsbedrftige Erkrankung des Kindes hinweisen. Methodisch ist der IgM-Nachweis relativ aufwendig, da er in der Regel, obwohl grundstzlich mit mehreren der genannten serologischen Verfahren durchfhrbar, zunchst eine Entfernung des IgG und des Rheumafaktors erfordert (z.B.

Der Anwendungsbereich der ELISA-Technik in der Mikrobiologie erweitert sich stndig und

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Mikrobiologische Diagnostik

durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, [gG-Immunprzipitation, Serumabsorption mit Protein A bzw. Staphylococcus aureus, Gel-Ionenaustauscher-, Affinitts- oder HochdruckFlssigkeitschromatographie). Monoklonale Antikrper in der diagnostischen Mikrobiologie Monoklonale antivirale, antibakterielle und antiparasitre Antikrper haben sich besonders zur raschen und zuverlssigen Identifizierung verschiedener Mikroben in der Kultur auerordentlich bewhrt. Dabei kann man sowohl Antikrper mit sehr enger Spezifitt zur Identifizierung auf Subspezies- und Typenebene einsetzen; man kann aber auch monoklonale Antikrper breiterer Reaktivitt verwenden, die dann zur Erkennung von Mikrobengruppen (z.B. Genera) oder zur phylogenetischen Klassifizierung von Mikroorganismen herangezogen werden knnen. Gerade wegen ihrer hohen und definierten Spezifitt sind monoklonale Antikrper darber hinaus besonders gut zum unmittelbaren Erregernachweis in klinischen Untersuchungsmaterialien geeignet. In Kombination mit empfindlichen immunoassays bieten sie sich zur automatisierten Analyse von Blut und anderen Krperflssigkeiten auf mikrobielle Antigene an. Schlielich eignen sie sich auch als hochspezifische Reaktionspartner fr chromatographische Trennungen und mglicherweise sogar zur Immuntherapie mikrobieller oder neoplastischer Erkrankungen. Der Vorteil des monoklonalen Antikrpers ist seine hohe und definierte Spezifitt sowie, wenn die hybridisierte Zellinie einmal etabliert ist, seine theoretisch unbegrenzte Verfgbarkeit in gleichbleibender Qualitt. Dem stehen allerdings auch Nachteile gegenber: Die HybridomTechnik (Fusion einer Myelom-Zelle mit einer Antikrper-bildenden Zelle) ist immer noch arbeitsintensiv, nicht billig und zeitaufwendig. Auerdem stellt jeder monoklonale Antikrper nur einen in einer groen Zahl von Antikrpern dar, welche die gesamte Immunantwort ausmachen, so da er auch nur einen kleinen Teil der Eigenschaften eines konventionellen Anliserums besitzen kann. Es darf deshalb nicht angenommen werden, da ein polyklonales Antiserum automatisch und in jedem Falle durch einen monoklonalen Antikrper ersetzt werden kann.

2.3.3 Schnellverfahren zur Diagnose von Infektionskrankheiten


Der Zeitbedarf der konventionellen mikrobiologischen Diagnostik, die auf die Anzchtung und Identifizierung des jeweiligen Krankheitserregers abzielt, lt sich wegen der vorgegebenen Generationszeit der Mikroorganismen nicht beliebig verringern und ist zumindest in Stunden, meist in Tagen und zuweilen sogar in Wochen zu messen. Daraus resultieren notwendigerweise Schwierigkeiten fr den Arzt am Krankenbett, der gerade bei hochakuten oder lebensbedrohenden Krankheitszustnden mglichst bald wissen mchte, ob es sich um eine Infektionskrankheit handelt, welche Erreger gegebenenfalls vorliegen und wie er sie am besten behandeln kann. Um diesem verstndlichen Anliegen nach rascher Information Rechnung zu tragen, wurden sogenannte Schnellverfahren entwickelt. Unter Schnellverfahren verstehen wir in diesem Zusammenhang solche Techniken, die mindestens innerhalb einiger Stunden nach Eintreffen des Untersuchungsmaterials im Laboratorium, also am gleichen Tag, ein verwertbares Ergebnis liefern. Einige der bereits angesprochenen Methoden knnen grundstzlich diesem Anspruch gerecht werden. Ihre diagnostische Aussagekraft reicht aber nicht ohne weiteres an die Sicherheit und Genauigkeit der Erregerkultur heran, und sie ermglicht auch keine individuelle Prfung der Wirksamkeit geeigneter Therapeutika. In der Tabelle 2.5 sind einige wichtige, heute gebruchliche Schnellverfahren mit ihrem hauptschlichen Einsatzbereich und ihrem Zeitbedarf zusammengestellt. In der Spalte Diagnostische Zuverlssigkeit" haben wir versucht, anhand der Empfindlichkeit, Spezifitt und Stranflligkeit der jeweiligen Methode eine Bewertung ihrer praktischen Brauchbarkeit vorzunehmen. Dabei wird eingerumt, da sich einige Techniken noch verbessern oder feiner adaptieren lassen, so da sie in Zukunft vielleicht einen hheren Stellenwert einnehmen knnen. Der in Tab 2.5 angegebene Limulus-Test wurde bisher nicht besprochen und soll deshalb zum besseren Verstndnis hier noch kurz beschrieben werden: Das Ambozytenlysat (Blutzcllysat) des Pfcilschwanzkrebses Limulus polyphemus (Knigskrabbe) wird dureh Endotoxin zum Gelieren gebracht. Diese Reaktion beruht darauf, da Lipopolysaccharid eine Serinprotease aktiviert, die lsliches Protein in einen

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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Mikrobiologische Diagnostik

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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unlslichen Komplex umwandelt, und sie ist so empfindlich, da sie zum Nachweis sehr kleiner Endotoxinmengen in menschlichen Krperflssigkeiten, vor allem im Blut und im Liquor. geeignet ist. Bei der Diagnostik von Meningitiden, die durch gram-negative Bakterien (z.B. Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Haemophilus Influenza?) hervorgerufen sind, hat sich das Verfahren recht gut bewhrt. Dagegen kommt es bei Blutuntersuchungen hufig zu positiven Reaktionsausfllen, ohne da sich eine Sepsis mit gram-negativen Erregern verifizieren lt. Inzwischen gibt es kommerzielle Varianten des Limulus-Testes, die einfacher anzuwenden sind und deshalb heute meist eingesetzt werden.

logischen Nachweisverfahren gegeben werden. ]n der Tabelle 2.6 sind die Ersatzmglichkeiten molekularbiologischer Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik zusammengefat.
Nachweis erregerspezifischer Nukleinsuren

2.3.4 Molekularbiologische Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik


In den vergangenen Jahren haben sich eine ganze Reihe von molekularbiologischen Techniken, die ursprnglich fr die Grundlagenforschung geschaffen worden waren, zu wichtigen Werkzeugen der mikrobiologischen Diagnostik weitercntwickelt. Unter dem etwas unscharfen Oberbegriff .,molekularbiologische Verfahren" werden in der diagnostischen Medizinischen Mikrobiologie Techniken fr den Nachweis und die weitere Charakterisierung erregerspezifischer Nukleinsuren zusammengefat (sog. Nukleinsurediagnostik). Da die entsprechenden Techniken sich derzeit hinsichtlich ihres Einsatzgebietes und ihrer methodischen Durchfhrung rasant weiterentwickeln, kann in diesem Abschnitt naturgem nur ein kurzer methodischer Abri der momentan gebruchlichsten molekularbio-

Nukleinsurenachweisverfahren weisen eine hohe Spezifitt und meist auch eine hohe bis sehr hohe Sensitivitt auf. Dies erlaubt es in vielen Fllen, Mikroorganismen direkt aus klinischem Untersuchungsmaterial nachzuweisen, ohne da eine vorherige Erregeranzucht notwendig wird. Dabei knnen auch solche Mikroorganismen erfat und quantitativ bestimmt werden, die entweder nicht oder nur mit unverhltnismig groem Aufwand kultivierbar sind oder deren Kultur mit erheblichen Sicherheitsrisiken verbunden ist. Schlielich kann der Nachweis erregerspezifischer Nukleinsuren auch in Probenmaterialien durchgefhrt werden, die aufgrund ihrer Vorbehandlung, beispielsweise durch histologische Fixierungs- und Einbettungstechniken, keine vermehrungsfhigen Erreger mehr enthalten. Die in diesem Abschnitt zu besprechenden Verfahren knnen neben dem alleinigen Nachweis von Erregern auch zur Identifizierung und Charakterisierung bereits vorhandener Isolate eingesetzt werden. Bei den Techniken des Nukleinsurenachweises lt sich prinzipiell zwischen Verfahren, die auf der in-vitro-Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsuresequenzen basieren (Nukleinsureamplifikationstechniken, NATs) und sol-

Nachweis und Charakterisierung erregerspezifischer Nukleinsuren

- qualitativer und quantitativer Erregernachweis - Therapieberwachung - Identifizierung von Isolaten - Erregertypisierung und taxonomische Untersuchungen - epidemiologische Untersuchungen, Aufklrung von Infektketten - Mutationsanalyse - Resistenztestungen - Transkriptionsanalyse - Klonierung und Sequenzierung von Erregergenomen - Herstellung von Gensonden - Produktion rekombinanter Proteine als diagnostische Antigene - Erzeugung poly- und monoklonaler Antikrper gegen Erregerbestandteile

Tab. 2.6 Einsatz molekularbiologischer Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik

Gentechnologie (rekombinante DNA-Technologie)

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Mikrobiologische Diagnostik

chen, die ohne In-vitro-Amplifikationsschritt auskommen, unterscheiden.


Nachweis von erregerspezifischen Nukleinsuren ohne in-vitro-Amplifikationsschritt

Der direkte Nachweis erregerspezifischer Nukleinsuren im Probenmaterial durch Anfrbung bzw. Anreicherung und die nachfolgende gclelektrophoretische Auftrennung hat nur in Ausnahmefllen praktische Bedeutung. So kann beispielsweise die im Stuhl Infizierter in groen Mengen vorhandene Rotavirus-spezifische doppelstrngigc RNA nach Aufreinigung und Gelclcktrophorese direkt dargestellt und anhand ihrer Wanderungseigenschaften (fragmentiertes Genom, vergleiche auch Kap. 6.10 ber Rotaviren) identifiziert werden. Ganz berwiegend werden jedoch zum Nachweis erregerspezifischer Nukleinsuren Gensonden (sog. GensondenanaIvtik) eingesetzt. Hierbei wird die Eigenschaft von Nukleinsuren ausgentzt, sich aufgrund der Ausbildung einer spezifischen asenpaarung unter geeigneten experimentellen Bedingungen reversibel an fr sie komplementre Nukleinsuresequenzen zu binden. Diesen Vorgang bezeichnet man als Hybridisierung (Abb. 2.26).
Gensonden knnen durch Klonierung von Erregernuklcinsurefragmenten oder in Form synthetischer Oligonukleotide erhalten werden. Da die meisten Erreger neben konservierten, spezies- bzw. genusspezifischen Nukleinsuresequenzcn auch ber variable Genomabschnitte verfgen, kann durch die Wahl geeigneter Gensonden festgelegt werden, ob die Nachweisgenauigkeit bis zur Genus-, Spezies- oder Erregerstammebene gehen soll.

Vor Durchfhrung der eigentlichen Hybridisierungsreaktion wird in den meisten Fllen ein Aufschlu des Probenmaterials mit schonender Freisetzung und anschlieender Extraktion der gesuchten Nukleinsuren notwendig sein. Die nachzuweisende Erregersequenz wird hierbei als Zielsequenz bezeichnet. Handelt es sich bei der Zielsequenz um doppelstrngige DNA oder RNA, so mssen die im Probenmaterial vorliegenden Nukleinsurestrnge zunchst durch thermische oder alkalische Denaturierung voneinander getrennt werden, um eine Anlagerung der Gensonde zu ermglichen. Im Falle von RNA ist zudem die hohe Instabilitt der Zielsequenzen durch ubiquitr vorhandene RNAsen bei der Wahl von Extraktionsverfahren zu bercksichtigen. Nach der Anlagerung der Gensonde an ihre Zielsequenz wird nichtgebundenes Sondenmaterial durch Auswaschen entfernt. Die Spezifitt der Hybridisierungsreaktion wird mageblich bestimmt durch die Basenzusammensetzung und Lnge der Gensonde sowie durch die Inkubationsbedingungen, insbesondere Temperatur, Salzgehalt und das Vorhandensein chaotroper Substanzen (wie Formamid) whrend der Hybridisierungsreaktion und dem anschlieenden Auswaschen nichtgcbundcncr Nukleinsure. Als Ma fr die whrend der Hybridisierung gewhlten Reaktionsbedingungen wurde der Begriff Stringenz eingefhrt. Je hher die Stringenz einer Hybridisierungsreaktion gewhlt wird, desto weniger Basenfehlpaarungen zwischen Gensonde und Zielsequenz werden toleriert. Umgekehrt gilt, da bei niedriger Strin-

Abb. 2.26 Bindung einer Gensonde an ihre Zielsequenz. Zwischen Censonde und Zielsequenz kommt es zur Ausbildung einer spezifischen Basenpaarung. Dargestellt ist eine Hapten-markierte Gensonde (Einbau von dUTP-Haptenkonjugat [U-*-H] statt dTTP), die den nichtradioaktiven Nachweis hybridisierter Sonden erlaubt. Die Bindung der Gensonde an die Zielsequenz wird in einer nachgeschalteten Enzymimmunreaktion dargestellt. Dies kann mittels eines Enzym-markierten Hapten-spezifischen Antikrpers (>-E) und einer nachfolgenden Farbreaktion geschehen.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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genz eine Bindung zwischen Gensonde und lediglich teilweise zu ihr komplementren Zielsequenzen ermglicht wird. In der Praxis kann dies beispielsweise bedeuten, da Nukleinsuresequenzen einer anderen Spezies des gleichen Genus von der Gensonde erkannt werden. Um eine stattgefundene Hybridisierung mit der Zielsequenz sichtbar zu machen, werden Gensonden spezifisch markiert. Dies kann durch Einbau radioaktiver Isotope (meist !2P oder 35S, aber auch 12:>J) oder von Haptenen in die Gensonde geschehen. Bei Verwendung radioaktiv markierter Gensonden erfolgt der Nachweis einer stattgefundenen Hybridisierung ber die Messung der an die Zielsequenz gebundenen Radioaktivitt. Der Trend geht heute verstndlicherweise zu nichtradioaktiven Nachweisverfahren. In der Praxis genutzt wird hier insbesondere der Einbau Biotin- oder Digoxigenin-markierter Nukleotide in die Gensonde. Die als Haptcn wirksamen Biotin- bzw. DigoxigeninSeitengruppen fhren zu keiner nennenswerten Einschrnkung der Bindungsfhigkeit der Gensonde. Nach Durchfhrung der Hybridisierungsreaktion knnen sie in einem nachgeschalteten Versuchsschritt, der im wesentlichen einem Enzymimmun(o)assay entspricht, hochempfindlich nachgewiesen werden. Ein weiteres, ebenfalls nichtradioaktives Verfahren zum Nachweis gebundener Gensonden bedient sich monoklonaler Antikrper, die spezifisch mit Doppelstrang-DNA (z.B. spezifisch an ihre DNA-Zielsequcnz gebundene DNAGensonde) oder aber mit DNA:RNA-Hybridmoleklen (z.B. spezifisch an ihre DNA-Zielsequenz gebundene RNA-Gensonde) reagieren.

Da die Abgrenzung gebundener von freier Gensonde bei Hybridisierungsreaktionen, die frei in Lsung stattfinden, sich als methodisch schwierig erweisen kann, wird die nachzuweisende Nukleinsure meist in einem vorgeschalteten Versuchsschritt an ein Trgermaterial, typischerweise eine Nylon- oder Nitrocellulose-Filtermembran, fixiert. Die nachfolgende Bindung der Gensonde findet dann auf der Oberflche der Filtermembran statt. Diese Art der Reaktion bezeichnet man als Blotverfahren. Seit einigen Jahren kommen zunehmend Techniken zur Anwendung, bei der die Zielsequenz entweder nach spezifischer Hybridisierung an eine Fangsonde (engl. capture probe) oder ber Bindung von monoklonalen Antikrpern, die spezifisch an den doppelstrngigen Nukleinsurekomplex aus Zielsequenz und Gensonde binden (z.B. DNA:RNA-Hybrid-spezifischer monoklonaler Antikrper, vergleiche auch oben), an die Oberflche von Reaktionsgefen fixiert wird und somit fr den Nachweis in nachgeschalteten Versuchsschritten verfgbar gemacht wird (sog. hybrid-capture-Verfahnzn). Diese Vorgehensweise erlaubt eine weitgehend automatisierbare Bearbeitung der Proben (Abb. 2.27).
Die Sensitivitt des DNA-Nachweises mittels Gensonden liegt bei Einsatz konventioneller Techniken, z.B. Blotverfahren mit radioaktiv-markierter Gensonde, bei etwa 14 Moleklen der Zielsequenz und ist somit um mehrere Grenordnungen niedriger als die theoretisch erreichbare, maximale Sensitivitt von in-vitroNukleinsureamplifikationstechniken (NATs; s.u.). Im Gegensatz zu NATs besteht jedoch keine Gefahr einer unbeabsichtigten Kontamination von Probenmaterial durch Amplifikationsprodukte, so da die Durch-

Abb. 2.27 Nukleinsurenachweis mittels HybridCapture- Verfahren.

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Mikrobiologische Diagnostik

fhrung von DNA-Nachweisen mittels Gensonden keine aufwendigen technischen und organisatorischen Manahmen zur Kontaminationsvermeidung erfordert (vergleiche auch unten). Der Einsatz von verzweigten Gensonden (engl. bremched DNA) in Verbindung mit weiteren Signalverstrkungsschritten und Einsatz von atypischen Basen (isoG und isoC in den Sonden) sowie Chcmolumineszcnzfarbstoffen erlaubt es. die Empfindlichkeit des direkten NukleinsurcNachweises mittels Hybridisicrungsverfahrcn auf ca. 100 Molekle der Ziclscquenz pro ml Probenmaterial zu steigern (Abb. 2.28, Farbtafeln, branched DNA Nachweisverfahren). Nukleinsureamplifikationstechniken (NATs)

Polymerase-Keenreaktion (PCR). Den Prototyp der Verfahren zur in-vitro-Amplifikation

von Nukleinsuresequenzen stellt die Polymcrase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) dar. Sie soll daher im folgenden detaillierter dargestellt werden. Die PCR lt sich als hochsensitives Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsureabschnitte einsetzen. Wie in Abb. 2.29a-c gezeigt, erfolgt in der PCR eine zyklische DNA-Neusynthese der Zielsequenzen in vitro mit Hilfe des Enzyms DNA-Polymerase, eines Paares synthetischer DNA-Oligonukleotide. die als Startermolekle (engl. primer) fr die Enzymreaktion dienen, und der vier Desoxyribonukleosidtriphosphate. Die gewhnlich in der PCR eingesetzten DNAPolymerasen sind DNA-abhngige DNA-Poly-

Abb. 2.28 Nukleinsurenachweis und Signalamplifikation mittels b (branched) DNA-Technik. In der rechten Hlfte der Abbildung sind die Einzelkomponenten des Verfahrens schematisch dargestellt, die linke Hlfte der Abbildung zeigt das vollstndige Nachweissystem. Zielsequenz und an die Zielsequenz bindende Anteile der Fangsonden sind rot dargestellt; Sonden, die fr die Bindung an die Festphase bentigt werden, Vorverstrker, bDNAund Detektionssonden sind schwarz dargestellt. AP: Alkalische Phosphatase.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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Abb. 2.29 a-c In-vitro-Amplifikation von DNA-Sequenzen mittels Polymerase-Kettenreaktion. a) zeigt die whrend des ersten PCR-Zyklus ablaufenden Reaktionsschritte, in b) und c) ist das exponentielle Anwachsen von PCR-Produkten whrend der ersten PCR-Zyklen dargestellt. Die im jeweiligen Zyklus neu synthetisierten PCR-Produkte sind rot markiert.

merasen, d.h. sie akzeptieren als Gegenstrang des neu zu synthetisierenden DNA-Stranges lediglich DNA. Viele virale Erreger besitzen jedoch ausschlielich RNA als genetisches Mate-

rial. Sollen virale oder andere RNA-Sequenzen in der PCR vervielfltigt werden, mssen diese zunchst in einem Proze, der als reverse Transkription bezeichnet wird, in komplementre

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Mikrobiologische Diagnostik

DNA-Strnge (engl. c-DNA = copy) umgeschrieben werden. Erst dann kann eine In-vitroVervielfltigung dieser Nukleinsuresequenzen in der PCR erfolgen. Zur reversen Transkription bedient man sich entweder einer retroviralen reversen Transkriptase (RT, RNA-abhngige DNA-Polymerase) oder nutzt die RT-Aktivitt einiger thermostabiler DNA-Polymerasen, die auch zur DNA-Vervielfltigung in der PCR eingesetzt werden (vergleiche auch Abb. 2.30). Die Sequenzen beider PCR-Primer werden so gewhlt, da sie jeweils komplementr zu gegenberliegenden Nukleinsurestrngen der

Zielsequenz sind, da sie den in der PCR zu vervielfltigenden Bereich flankieren und da die Richtung der durch die DNA-Polymerase neu synthetisierten DNA-Molekle gegenlufig ist. Der Einsatz der PCR in der Diagnostik setzt daher in der Regel voraus, da zumindest die Nukleinsuresequenzen der Primerbindungsstellen bekannt sind. Bis zu einem gewissen Ma knnen Sequenzvariationen der Primerbindungsstelle jedoch durch den Einsatz sogenannter degenerierter Primer, d.h. von Primern, die an einigen Positionen zufllige Basenfolgen enthalten, ausgeglichen werden.

Abb. 2.30 Amplifikation von RNA-Zielsequenzen mittels RT-PCR. RNA-Sequenzen sind rot, DNA-Sequenzen schwarz dargestellt; RT Reverse Transkriptase; cDNA zu der RNA-Zielsequenz komplementre copy DNA.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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DNA-Polymerase, Primer und Dcsoxyribonukleosidtriphosphate werden dem Reaktionsansatz in hohem berschu zugegeben. Um eine Bindung der Primer an ihre Zielsequenzen zu ermglichen, erfolgt als erster Schritt eine Trennung der in der Probe vorhandenen Nukleinsure-Doppelstrnge in Einzelstrnge durch thermische Denaturierung. Anschlieendes Abkhlen des Reaktionsansatzes erlaubt eine Anlagerung der Primer (typischerweise etwa 20 Basen lange DNA-Oligonukleotide) und die nachfolgende DNA-Synthese. Dieser Zyklus bestehend aus Denaturierung, Primer-Bindung und DNA-Synthese wird in der PCR vielfach wiederholt (meist 20-40fach). Der Einsatz einer thermostabilen DNA-Polymerase, beispielsweise der Taq-Polymerase, die aus dem thermophilen Bakterium Thermits aquaticus stammt, erbrigt die wiederholte Zugabe von Enzym nach jedem Denaturierungsschritt und erhht die Spezifitt der Reaktion. In jedem PCR-Zyklus erfolgt im Idealfall eine Verdopplung der Zielsequenz. Da die Syntheseprodukte ihrerseits als Zielsequenz nachfolgender Synthesen dienen, kommt es zu einer exponcntiellen Vermehrung von Syntheseprodukten. Mit steigender Zykluszahl berwiegen hierbei rasch diejenigen Syntheseprodukte, deren Lnge dem von den Primern begrenzten Nukleinsureabschnitt entspricht (s. Abb. 2.29c). Mangel an Primermoleklen und freiem Enzym begrenzt nach 20 bis 40 PCR-Zyklen schlielich die weitere exponentielle Vermehrung der Zielsequenz. In der Praxis lassen sich in der PCR Vervielfltigungsraten der Zielsequenz um den Faktor 108 bis 1010 erzielen.
Soll eine noch hhere Empfindlichkeit erreicht werden, kann eine weitere PCR der ersten Reaktion nachgeschaltet werden. Hierbei wird ein zweites Paar spezifischer Primer verwendet, deren Bindungsstelle innerhalb des Reaktionsproduktes der ersten PCR liegt (engl. nested PCR). Die Empfindlichkeit der Gesamtreaktion kann letztlich soweit gesteigert werden, da der Nachweis eines einzelnen Molekls der Ziclsequenz in einem 1012- bis 10l3-fachen berschu begleitender DNA-Sequenzen mglich wird. Da die spezifischen kurzen Syntheseprodukte nach Abschlu der PCR im Reaktionsansatz in hohen Konzentrationen vorliegen (0,5 bis 1 ^g DNA-Gesamtmenge oder lO'-lO11 Molekle pro \x\ Reaktionsgemisch), lassen sie sich anhand ihrer charakteristischen Gre und DNASequenz mit gngigen molekularbiologischen Verfahren wie Gelelektrophorese und/oder Nukleinsurehybridisierungsverfahren (s.o.) problemlos nachweisen.

Besondere methodische Anforderungen an die Durchfhrung der PCR stellt die quantitative

Bestimmung von erregerspezifischen Zielsequenzen im klinischen Probenmaterial. Quantitative Aussagen werden beispielsweise bentigt, um die Belastung mit Erregergenomen im peripheren Blut zu bestimmen oder Aussagen ber den Effekt einer antiviralen Therapie machen zu knnen. Aufgrund ihrer exponentiellen Vermehrungscharakteristik fhren jedoch bereits kleinste Schwankungen der Amplifikationseffizienz zwischen einzelnen Anstzen zu sehr groen Unterschieden in der Menge an Reaktionsprodukten nach Abschlu der PCR. Die Menge der nach der PCR vorhandenen Reaktionsprodukte erlaubt daher bestenfalls eine grobe Abschtzung der vor Durchfhrung der PCR in der Probe vorhandenen Ziclsequenzen. Ein bewhrtes Verfahren zur exakten Quantifizierung von Zielsequenzen im Probenmaterial ist die kompetitive PCR (Abb. 2.31). Hierbei wird dem Probenmaterial vor Durchfhrung der PCR eine definierte Menge eines internen Standards zugesetzt, der mit gleicher Effizienz zusammen mit der in unbekannter Menge in der Probe vorhandenen Zielsequenz in der PCR vervielfltigt wird. Nach Abschlu der PCR kann dann ber das Verhltnis vervielfltigter Zielsequenzen zu Standardsequenzen die Anzahl der ursprnglich in der Probe vor Durchfhrung der PCR vorhandenen Zielsequenzen berechnet werden. Gleichzeitig erlaubt die Mitfhrung eines internen Standards eine effektive Kontrolle der Probenvorbehandlung und den Ausschlu falsch-negativer PCR-Ergebnisse. Aufgrund ihrer extrem hohen Sensitivitt und der schnellen Verfgbarkeit von Ergebnissen bietet sich die PCR als Nachweisverfahren in der Medizinischen Mikrobiologie in allen Situationen an, in denen ein direkter Erregernachweis nicht mglich, zu gefhrlich oder zu zeitaufwendig wre. Weiterhin gewinnt die PCR als Methode zur Identifizierung von Erregerisolaten zunehmend an Bedeutung. Als generell problematisch ist jedoch die hohe Stranflligkeit der PCR gegenber Kontaminationen aus vorhergehenden Reaktionen oder stark positiven klinischen Proben anzusehen. Bei Einsatz der PCR zu diagnostischen Zwekken sind daher besondere Vorkehrungen zur Kontaminationsvermeidung zwingend erforderlich. Eine grundlegende Manahme zur Kontaminationsvermeidung ist die strikte rumliche, apparative und organisatorische Trennung derjenigen Bereiche, in denen Puffer- und andere Lsungen fr die PCR angesetzt werden, von

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Mikrobiologische Diagnostik

Abb. 2.31 Kompetitive RT-PCR.

denjenigen, in denen die klinischen Proben fr die PCR aufbereitet werden, die Amplifikationsrcaktion durchgefhrt wird und in denen die Nachweisreaktionen fr PCR-Produkte erfolgen. Ein weiteres bewhrtes Vorgehen zur Kontaminationsvermeidung besteht darin, dem PCR-Ansatz Desoxyuridintriphosphat zuzusetzen. Bei versehentlicher Verschleppung der hierdurch entstehenden Uracil-haltigen PCRProdukte in klinische Proben knnen diese durch Vorbehandlung des Probenmaterials mit dem Enzym Uracil-N-Glykosidase (UNG) spezifisch zerstrt und somit als Kontaminationsquelle ausgeschaltet werden.

Insgesamt hat sich das methodische Spektrum der PCR und ihrer Anwendungsmglichkeiten in den letzten Jahren ganz erheblich erweitert. Methodisch gehl der Trend zunehmend zu weitgehend automatisiert durchfhrbaren Anwendungen. Gleichzeitig wurden Verfahren entwickelt, mit denen sich die Synthese von PCR-Produkten im Reaktionsgef unmittelbar verfolgen lt, ohne da Produkte dem Reaktionsansatz zur weiteren Analyse entnommen werden mssen (sog. real-time-PCR). Hierdurch knnen Kontaminationen weitgehend vermieden und die Dauer der Gesamtreaktion deutlich verringert werden, auerdem wird eine Quantifizierung von Zielsequcnzen ermglicht. Ligase-Kettenreaktion (LCR). Die Ligase-Kettenreaktion (engl. ligase chain reuetion, LCR) ist ein weite-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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Abb. 2.32 a-c In-vitroAmplifikation von DNA-Sequenzen mittels LigaseKettenreaktion. a) zeigt die whrend des ersten LCR-Zyklus ablaufenden Reaktionsschritte, in b) und c) ist das exponentielle Anwachsen von LCR-Produkten whrend der ersten LCR-Zyklen dargestellt. Die im jeweiligen Zyklus ligierten Produkte sind rot markiert.

res Verfahren zur in-vitro-Vervielfltigung von Nukleinsuresequenzen, das sich zum Nachweis von erreger-

spezifischen Nukleinsuren nutzen lt. Abb. 2.32a-c zeigt schematisch das methodische Prinzip der LCR.

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Mikrobiologische Diagnostik

Wie bei der PCR luft die Reaktion zyklisch ab, wobei im ersten Teil des LCR-Zyklus eine thermische Denaturierung der Nukleinsurescquenzen stattfindet und im zweiten Teil des Zyklus sich zur Zielsequenz komplementre Oligonukleotide anlagern. Im Gegensatz zur PCR erfolgt jedoch im dritten Teil des Zyklus in der LCR normalerweise keine Neusynthese von DNA, sondern es werden die spezifisch an die Zielsequenz hybridisierten Oligonukleolide durch eine thermostabile DNA-Ligase miteinander kovalent verknpft. Jede LCR-Reaktion enthlt vier Oligonukleotide, von denen jeweils zwei sich nebeneinander und lckenlos an die beiden Nukleinsurestrnge der Zielsequenz anlagern. Unter den in der LCR gewhlten Bedingungen schliet die thermostabile DNA-Ligase ausschlielich Einzelstrangbrche in DNA-Doppelstrngen, d.h. katalysiert die Verknpfung von 5'-Phosphatresten mit den 3'-OH-Enden aneinandergrenzender, spezifisch hybridisierter Oligonukleotide. Aus der Ligationsreaktion mit vier Oligonukleotidcn resultieren zwei Ligationsprodukte, die der Zielsequenz entsprechen und wiederum als Gegenstrang fr weitere Ligationsreaktionen dienen knnen, wodurch es zu einer exponentiellen Vermehrung der spezifischen Ligationsprodukte kommt. Die Spezifitt der Reaktion wird dadurch sichergestellt, da unter den gewhlten Bedingungen keine Ligation freier oder fehlgepaarter Oligonukleotide staltfindet. Der Einsatz einer thermostabilen DNA-Ligase erlaubt zudem die Ligation unter Temperaturbedingungen, die die unspezifische Anlagerung von Oligonukleotiden verhindert. Der Nachweis der Ligationsprodukte der LCR kann ber gngige molekularbiologische Verfahren erfolgen, meist wird jeweils ein Oligonuklcotid Hapten- (z.B. Biotin) markiert, whrend dessen Ligationspartner z.B. mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiert wird. In diesem Fall erlaubt die Bestimmung der Menge des ber das Hapten an die Oberflche einer Festphase gebundenen Fluoreszenzfarbstoff-markierten Ligationsprodukts die Beurteilung der Reaktion. Wie bereits bei der PCR beschrieben, besteht auch bei der LCR die Gefahr von falsch-positiven Ergebnissen durch Kontamination des Probenmaterials mit verschleppten Ligationsprodukten aus vorhergehenden Reaktionen, so da auch bei der LCR entsprechende Manahmen zur Kontaminationsverhtung zu ergreifen sind. Da zur Erzielung eines positiven Ergebnisses in der LCR die perfekte Basenpaarung zwischen Oligonukleotidcn und Zielsequenz im Bereich des zu ligierenden Bereichs erforderlich ist. ist die LCR ein geeignetes Verfahren zum Nachweis von Punktmutationen in der Zielsequenz. Selbsterhaltcnde isothermische Sequenzreplikation. Neben den durch zyklische Temperaturvernderungen charakterisierten in-vitro-Vervielfltigungstechniken wie PCR und LCR wurden auch Methoden entwickelt, die eine kontinuierliche, isothermische invitro-Vervielfltigung von Nukleinsuren erlauben. Von diesen Anstzen haben derzeit lediglich die von ihrem Aufbau her sehr hnlichen und als NASBA (Abkrzung steht fr engl. micleic aeid sequence based

amplification), 3SR (Abkrzung steht fr engl. selfsustained sequence replication) und TMA (Abkrzung steht fr engl. transcription-mediated amplification) bezeichnete Verfahren praktische Bedeutung erlangt. Das Methodenprinzip der NASBA ist in Abb. 2.33 schematisch dargestellt. Die NASBA arbeitet mit einem komplexen Reaktionsgemisch, das neben den fr die RNA- und DNA-Synthese bentigten Nukleosidund Desoxynukleosidtriphosphatcn und Kationen zwei Zielsequenz-spezifische DNA-Oligonukleotidprimer sowie die Enzyme reverse Transkriptase (RT). RNase H und DNA-abhngige RNA-Polymerase enthlt. Ausgehend von einer RNA- oder auch DNAZielsequenz erfolgt zunchst in einer niehlzyklischcn Phase ber einen Primer (Primer 1), der zustzlich an seinem 3'-Ende eine RNA-Polymerase-Promotorsequenz (z.B. der DNA-abhngigen RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7, T7-RNA-Polymerase) trgt, die Neusynthese eines Gegenstranges mit Hilfe der RT. Die RT erzeugt hierbei an RNA-Zielsequenzen einen cDNA-Strang, kann aber auch einen komplementren DNA-Strang an DNA-Zielsequenzcn synthetisieren. Im nchsten Schritt erfolgt bei RNA-Zielsequenzen der Abbau der RNA-Zielsequenz der RNA:cDNA-Uybridmolekle ber das Enzym RNase H. DNA-Doppelstrnge, die aus einer DNA-Zielsequenz resultieren, mssen durch Denaturierung voneinander getrennt werden. Anschlieend kann sich der zweite Primer (Primer 2) anlagern und es kommt zur Synthese eines DNA-Doppelstranges durch die RT. Hierbei entsteht am 3'-Endc des ersten Primcrs ein funktioncllcr Promotor fr die RNA-Polymerase, die zahlreiche Kopien eines zur Zielsequenz komplementren RNA-Stranges (RNA-Minusstrang (-)) erzeugt. Diese RNA-Moleklc dienen nun in der zweiten, zyklischen Phase der NASBA als Zielsequenz fr Primer 2, nach dessen Bindung die RT einen komplementren DNA-Strang (cDNA-Plusstrang (+)) synthetisiert. Nach Verdauung der RNA-Anteile des RNA(-):cDNA(+)-Hybridmolekls durch die RNase H katalysiert nach Bindung von Primer 2 die RT die DNA-Gegenstrangsynthese und elongiert den cDNA (+)-Strang, so da wiederum ein funktioneller RNAPromotor entsteht. Mit der Neusynthese von zahlreichen RNA (-)-Moleklen schliet sich der Kreislauf, der letztendlich zur massiven Synthese der Zielsequenz fhrt. Der Nachweis der in vitro vervielfltigten Nuklcinsuresequenzen, die ein Gemisch aus RNA(-)und in geringerem Umfang vertretenen DNA-Sequenzen darstellen, erfolgt wiederum ber gngige molekularbiologische Verfahren. Aufgrund ihres Aufbaues eignet sich die NASBA insbesondere zum Nachweis von Einzelstrang-RNA-Zielsequenzen. Ihre Nachteile sind vor allem in ihrem aufwendigen Protokoll begrndet, das, um erfolgreich durchgefhrt werden zu knnen, ganz erheblichen, auf die jeweilige Fragestellung bezogenen Optimierungsbedarf beinhaltet, so da derzeit nur eine begrenzte Anzahl von NASBA-Protokollen zum Nachweis erregerspezifischer Nukleinsuren zur Verfgung steht.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

149

Abb 2.33 Isothermische Nukleinsureamplifikation mittels NASBA (Nucleic Acid Based Sequence Amplification). DNA-Sequenzen sind schwarz, RNA-Sequenzen rot dargestellt; die jeweiligen Reaktionswege sind durch rote Pfeile markiert, die daran beteiligten Enzyme sind unterlegt. RT: Reverse Transkriptase.

Charakterisierung erregerspezifischer Nukleinsuren Neben dem alleinigen Nachweis erregerspezifischer Nukleinsuren, der lediglich Aussagen ber die Prsenz, die Anzahl und ggf. auch die transkriptionelle Aktivitt von Erregern im Untersuchungsmaterial erlaubt, kommt der weitergehenden Charakterisierung von erregerspezifischen Nukleinsuren eine zunehmende diagnostische Bedeutung zu. Hierbei lassen sich anhand der Sequenz der entweder unmittelbar aus

Probenmaterial oder (in den meist Fllen) nach einem vorgeschalteten in-vitro-Amplifikationsoder Kulturschritt gewonnenen Nukleinsuren eine Reihe von weitergehenden Aussagen erhalten (zusammengefat in Tab. 2.6). Zu nennen sind an dieser Stelle insbesondere die Identifizierung und Bestimmung verschiedener Spezies bzw. Typen einer Erregergruppe oder -familie, die Erfassung von Varianten einer Erregerspezies bzw. eines Erregertyps und der Nachweis von Sequenzvariationen innerhalb eines Erregerstammes.

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Mikrobiologische Diagnostik

Die Charakterisierung von erregerspezifischen Nukleinsuren kann somit wertvolle Hilfe bei epidemiologischen Fragestellungen leisten (sog. molekulare Epidemiologie), sie erlaubt zudem in einigen Fllen Aussagen ber zu erwartende

Abb. 2.34 a-b Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen und Restriktionsfragment-Lngenpolymorphismus (RFLP). a) DNA-Spaltung durch Restriktionsendonukleasen. Die Abb. zeigt die Erkennungssequenzen (rote Basensymbole) und Spaltprodukte einiger typischer Restriktionsendonukleasen (Hindlll, EcoRV und Kpnl). Beachte, da die dargestellten Enzyme jeweils 6 Basenpaare lange Erkennungssequenzen aufweisen, die palindromisch auf beiden DNA-Strngen angeordnet sind. Die Restriktionsendonukleasen Hindlll und Kpnl erzeugen jeweils berlappende DNA-Enden, wogegen die Spaltung der DNA mit EcoRV zu nichtberlappenden DNA-Enden fhrt. b) Inkubation von zwei DNA-Moleklen mit den Restriktionsendonukleasen Hindlll (H), EcoRV (E) und Kpnl (K), die sich durch eine Punktmutation im Bereich der Erkennungssequenz von EcoRV (rot markiert) unterscheiden, fhrt zu charakteristischen Spaltprodukten, die sich mittels Agarose-Gelelektrophorese auftrennen und darstellen lassen; die entstehenden Spaltprodukte sind mit a, b, c, d bzw. bc markiert, ihre Wanderungsgeschwindigkeit in der Gelelektrophorese verhlt sich umgekehrt proportional zum Logarithmus ihres Molekulargewichts bzw. ihrer Fragment-Lnge.

Resistenzen gegen antimikrobielle Substanzen und ber das Auftreten von Erregermutanten (vgl. z.B. HIV). Ferner knnen durch Einsatz von konservierten PCR-Primern, d.h. von Primern, die eine in-vitro-Vervielfltigung von Zielsequenzen einer gesamten Erregergruppe oder -familie erlauben, und nachfolgende Charakterisierung der amplifizierten Sequenzen die Spezieszugehrigkeit unklarer Isolate oder die Prsenz von schwer- bzw. nichtkultivierbaren Erregern im Untersuchungsmaterial nachgewiesen werden. Methodisch bestehen zwischen den Verfahren des Nukleinsurenachweises und weiterfhrenden Untersuchungen, die der Charakterisierung von Nukleinsuren dienen, naturgem flieende bergnge. Ein relativ einfaches Verfahren zur Untersuchung von isolierten Nukleinsuresequenzen ist die Analyse mittels bakterieller Restriktionsendonukleasen. Diese Klasse von Enzymen erkennt auf DNA-Doppelstrngen eine fr die jeweilige Restriktionsendonuklease charakteristische - meist palindromische - Abfolge von Basen und verursacht an dieser Erkennungssequenz einen DNA-Doppelstrangbruch (Abb. 2.34a). Ausgehend von einer definierten DNA-Sequenz entsteht somit ein reproduzierbares und charakteristisches Muster an Spaltprodukten. Anzahl und Gre dieser DNA-Restriktionsfragmente knnen mittels gelelektrophoretischer Auftrennung leicht berprft werden (Abb. 2.34b). Zahlreiche Restriktionsendonukleasen mit unterschiedlichen Erkennungssequenzen wurden bislang beschrieben, ein groer Teil dieser Enzyme ist kommerziell erhltlich. Durch Einsatz von verschiedenen Restriktionsendonukleasen bzw. von Enzymkombinationen lassen sich Sequenzvarianten und Punktmutationen nachweisen, die durch Hinzukommen neuer Erkennungssequenzen oder durch Verlust bestehender Erkennungssequenzen zu Unterschieden von Gre und Anzahl der DNA-Restriktionsfragmente fhren (s. Abb. 2.34b). Die Lnge der Erkennungssequenzen von Restriktionsendonukleasen liegt typischerweise zwischen 4 und 8 Basenpaaren. Eine 4 Basenpaare lange Erkennungssequenz kommt statistisch alle 44 (= 256) Basenpaare in einer Zufalls-DNA-Sequenz vor. Somit erzeugen Restriktionsendonukleasen mit kurzen Erkennungssequenzen krzere DNA-Restriktionsfragmente als solche mit langen, z.B. 8 Basenpaare langen Erkennungssequenzen. Zustzlich beeinflut jedoch auch die Basenzusammenset-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

151

zung der Erkennungssequenz das Vorkommen von Schnittstellen in erregerspezifischen Nukleinsuren. Zur Analyse langer DNA-Abschnitte bzw. gesamter Erregergenome mittels Restriktionsendonukleasen (sog. Restriktionsfragmentlngenpolymorphismus, RFLP) eignen sich daher bevorzugt solche Restriktionsenzyme, die lange und verhltnismig seltene Erkennungsequenzen aufweisen (engl. rare cutters), wohingegen zur Analyse kurzer DNA-Abschnitte, z.B. von PCR-Produkten, Restriktionsendonukleasen mit hufig vorkommenden Erkennungsequenzen eingesetzt werden. Abhngig von der Gre der Spaitprodukte werden unterschiedliche elektrophoretische Auftrennungsverfahren verwendet. Fr die zuverlssige Auftrennung sehr groer DNA-Fragmente wird typischerweise die sog. Pulsfeldgelelektrophorese eingesetzt. Die Auftrennung kurzer DNA-Fragmente kann dagegen in einem konstanten Spannungsfeld mittels konventioneller Agarose- oder Acrylamidgelelektrophorese erfolgen. Ein weiteres Verfahren zur Charakterisierung von erregerspezifischen Nukleinsuren sind die bereits oben beschriebenen Techniken der Hybridisierung mit Gensonden. Im Kontext der Nukleinsurecharakterisierung lassen sich Sonden beispielsweise zur Identifizierung von Erregervarianten einsetzen, indem zunchst eine invitro-Vervielfltigung von erregerspezifischen Nukleinsuren mittels konservierter Primer in der PCR erfolgt und in einem nachfolgenden Schritt das PCR-Produkt mittels variantenspezifischer Gensonden analysiert wird. Indirekte Informationen ber die Sequenz von Nukleinsurefragmenten lassen sich auch durch Analyse ihres Schmelzverhaltens und ihrer Sekundrstruktur in denaturierenden Gelelektrophoresesystemen erhalten. Zur vollstndigen Bestimmung der Sequenz eines DNA-Fragmentes stehen heute eine Reihe unterschiedlicher Techniken zur Verfgung, die teilweise bereits einen sehr hohen Automatisierungsgrad erlangt haben. Die eigentliche Sequenzierungsreaktion basiert meist auf dem von SANGER entwickelten Didesoxynukleotid-Kettenabbruchverfahren. Sie kann sowohl bei Einzelstrang- als auch bei Doppelstrang-DNA-Moleklen durchgefhrt werden und erlaubt beispielsweise die direkte Sequenzierung von PCRProdukten (Abb. 2.35). Die Computer-gesttzte Auswertung der Sequenzierungsreaktion ist Voraussetzung fr weitergehende Analysen, wie

z.B. Vergleiche mit bereits verffentlichten Sequenzdaten durch Zugriff auf elektronische Datenbanken und die Erstellung von Stammbaumanalysen, Aussagen ber Mutationen und deren Effekte auf den Phnotyp (z.B. Chemotherapeutikaresistenzen) etc. Eine interessante Neuentwicklung in der Nukleinsureanalytik stellen Techniken dar, welche die gleichzeitige Testung eines Nukleinsuregemisches auf seine Reaktion mit einer Vielzahl verschiedener Gensonden ermglichen. Die sog. Gen-Chip-Technik ist ein typisches Beispiel dieses methodischen Ansatzes und basiert auf einer Kombination der fr die Mikroelektronik entwickelten Siliziumchip-Technologic und der oben beschriebenen Gensonden-Technologic. indem mittels photolithographischer Verfahren und kombinatorischer Nuklcinsurechemie in miniaturisierter Form Gensonden auf Siliziumchips synthetisiert werden. Die Gen-Chip-Technik ermglicht die gleichzeitige Testung eines Nukleinsuregemisches auf seine Reaktion mit zehntausenden definierter, synthetischer Gensonden. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgt auf mikrooptischem Weg. Die Strke diese Verfahrens liegt darin begrndet, da es eine Vielzahl von Parametern gleichzeitig zu erfassen und zu quantifizieren vermag. Hierdurch werden Aussagen ber komplexe Regulationsvorgnge ermglicht, die einer Analyse bislang nicht zugnglich waren. Die Interpretation der riesigen Datenmengen, die dieses Verfahren liefert, stellt jedoch hohe Anforderung an Computer-gesttzte Auswertungsprogramme. Derzeit wird dieses Verfahren eingesetzt, um Aussagen ber die zellulre Transkriptionsaktivitt und somit die Genregulation zu erhalten (parallele Genexpressionsdetektion). Weitere Anwendungen der Gen-Chip-Technologie bestehen in der Mutationsanalyse und der Sequenzierung von Nukleinsuren, beispielsweise um Aussagen ber mgliche Resistenzentwicklungen viraler Erreger zu erhalten (vgl. auch HIV und HCV), sowie in der raschen und spezifischen Detektion von Krankheitserregern im stark mikrobenbcladenen Materialien (z.B. Lebensmitteln) und der zuverlssigen Identifizierung einschlielich dem Nachweis spezieller Resistenzgene bei schwer zu handhabenden Bakterien (z.B. Mykobakterien).

Gentechnische Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik (s.a. Kapitel 3.3)


Grundlage gentechnischer Verfahren, die unmittelbare diagnostische Bedeutung in der Medizinischen Mikrobiologie aufweisen, ist die Klonierung von erregerspezifischen Nukleinsuren in extrachromosomale genetische Elemente, die zustzliche Frcmd-DNA-Sequenzen aufnehmen knnen und als Klonierungsvektoren bezeichnet werden. Am hufigsten werden bakterielle Plasmide als Klonierungsvektoren eingesetzt. Diese Plasmide sind kleine ringfrmige DNA-Mole-

152

Mikrobiologische Diagnostik

Abb. 2.35 DNA-Doppelstrangsequenzierung mittels Didesoxynukleotid-Kettenabbruchverfahren. Die zu bestimmende DNA-Sequenz ist dunkelrot dargestellt, der fr die Sequenzierungsreaktion eingesetzte Primer hellrot; dNTPs: Gemisch aus allen 4 Desoxynukleotidtriphosphaten, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP: Didesoxynukleotidtriphosphate. Wird ein Didesoxynukleotid bei der DNA-Synthese eingebaut, erfolgt Kettenabbruch. Im unteren Teil der Abbildung sind die durch Kettenabbruch jeweils resultierenden Syntheseprodukte der Sequenzierungsreaktion und ihr Wanderungsverhalten bei elektrophoretischer Auftrennung sowie die hieraus abzulesende DNA-Sequenz dargestellt.

kle, die in Bakterienzellen extrachromosomal vorliegen und einen Replikationsursprung aufweisen, welcher fr die Plasmidreplikation in der Bakterienzelle bentigt wird. Typischerweise tragen sie zudem ein Antibiotikarcsistenzgen, das die in-vitro-Selektion plasmidhaltiger Bakterien erlaubt, sowie an geeigneter Stelle Erkennungssequenzen einer Reihe von Restriktionsendonukleasen. die nach Restriktionsendonukleaseschnitt die Aufnahme von Fremd-DNAMoleklen mit geeigneten (sog. kompatiblen) DNAEnden erlauben. Die mit groem Abstand am hufigsten eingesetzten Wirtszcllen zur Aufnahme und Vermehrung rekom-

binanter Plasmide sind Laborstmme von Escherichia coli, die bestimmte Sicherheitskriterien, wie z.B. fehlende Pathogenitt und Rekombinationsaktivitt, erfllen mssen. Zur Aufnahme von Fremd-DNA-Sequenzen, z.B. aus aufgereinigten Erregern, aber auch von Produkten aus in-vitro-Vervielfltigungsreaktionen, wird typischerweise gereinigte, zirkulre PlasmidDNA mittels Restriktionsendonukleasen linearisiert. mit der aufzunehmenden Fremd-DNA, die kompatible DNA-Enden aufweisen mu (s. Abb. 2.34a), gemischt und die DNA-Strnge mit Hilfe des Enzyms DNA-Ligase wieder verknpft. Nach Aufnahme des Ligationsproduktes aus Plasmid-DNA und zu klonierender Fremd-DNA durch E. co/i-Zellen (sog. Trans-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

153

formation), die durch entsprechende Vorbehandlung aufnahmefhig fr Fremd-DNA gemacht wurden, erfolgt ein Antibiotikaselektionsschritt. Lediglich der Bruchteil von Zellen, der ein Plasmid mit intaktem Antibiotikaresistenzgen aufgenommen hat, ist in der Lage, auf einem festen Nhrboden mit entsprechendem Antibiotikazusatz in Kolonieform auszuwachsen. Die Identifikation derjenigen Kolonien, die neben den Plasmid- auch Frcmd-DNA-Sequenzen enthalten, erfolgt meist durch erneute Vermehrung antibiotikaresistenter Einzelkolonien in Flssigkulturen. Extraktion von Plasmid-DNA und deren Analyse mittels Restriktionsendonukleaseverdauung und nachfolgender gelelektrophoretischer Auftrennung der DNA-Fragmente. Durch den Vorgang der Klonierung stehen die entsprechenden Abschnitte erregerspezifischer Nukleinsuren reproduzierbar und in praktisch unbegrenzter Menge fr weitere Schritte, wie z.B. Sequenzierungsreaktionen, zur Verfgung. Erfolgt die Klonierung von DNA-Sequenzen, die fr Erregerproteine kodieren, in der Weise, da eine Plasmid-vermittelte Proteinexpression auch in vitro (z.B. in Bakterienzellen) ermglicht wird, lassen sich die hierdurch erzeugten rekombinanten Proteine nach ihrer Reinigung beispielsweise als diagnostische Antigene in der Serologie (aber auch als Impfstoffe) einsetzen. Plasmide, die eine Expression von rekombinanten Proteinen ermglichen, werden als Expressionsplasmide bezeichnet. Sie enthalten zustzliche Kontrollelemente (Promotoren), welche die Transkription der klonierten DNA-Sequenzen in der Wirtszelle ermgli-

chen. Um z.B. im Fall viraler Antigene mglichst authentische" Proteine bzw. Antigene zu erzeugen, die die Vielfalt von Proteinmodifikationen enthalten, die typisch fr Sugerzellen sind, aber bakteriell exprimierten Proteinen fehlen, wurden Vektoren entwickelt, die eine Expression rekombinantcr Proteine in eukaryonten Zellen (Hefezellen, Insektenzellen. Sugerzellen) erlauben (z.B. fr die Herstellung von Hepatitis-B-Virus-Impfstoff).

Literatur
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Allgemeine Bakteriologie
3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle HANS-GEORG SAHL 3.1.1 3 12 3.2 3.2.1 3 22 3.3 33 1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 336 337 3.3.8 3.3.9 3.3.10 3.4. Morphologie und systematische Einteilung der Bakterien Die Bakterienzelle Physiologie der Bakterien HANS-GEORG SAHL Wachstum von Bakterien Mechanismen des Stoffwechsels Genetik der Bakterien JRG HACKER Struktur der DNA Das bakterielle Genom Semikonservative Replikation der DNA Transkription Translation Mutationen Rekombination und Gentransfer Restriktion und Modifikation Genetische Regulationsmechanismen Grundlagen der Gentechnik Taxonomie der Bakterien WERNER KHLER Antimikrobielle Chemotherapie ADOLF BAUERNFEIND, GEORG PETERS Definition und Abgrenzung 156 157 171 3.5.7 171 176 3.5.8 180 3.5.9 182 182 184 184 185 186 188 192 192 194 197 3.5.10 3.6 156 3.5.2 3.5.3 3.5.4 3.5.5 3.5.6 Anfnge der antimikrobiellen Chemotherapie Mikrobiologische Grundlagen Pharmakologische Grundlagen Klassifizierung antimikrobieller Substanzen Charakterisierung einzelner Antibiotikagruppen Klinische Grundprinzipien der antibakteriellen Chemotherapie Antibiotika und krpereigene Abwehr Prophylaktische Antibiotikagabe Schlubemerkungen Mikrobielle Besiedlung des gesunden Menschen HELMUT MITTERMAYER Funktionen der physiologischen Flora Bedeutung der physiologischen Flora fr die mikrobiologische Diagnostik Zusammensetzung der physiologischen Flora nderungen whrend des Lebens und durch uere Einflsse Die physiologische Flora als Quelle endogener und nosokomialer Infektionen

3
200 200 210 215 215

233 236 236 238 238

36 1 3.6.2

239 240

3.6.3 3.6.4 3.6.5

241 244

3.5

199

244

3.5.1

199

156

Allgemeine Bakteriologie

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle


HANS-GEORG SAHL

Die genannten Pilze, Algen und Protozoen werden auch als hhere Protisten zusammengefat, denn sie besitzen
von Membranen umgebene Organellen (Chloroplasten, Mitochondrien) 80 S Ribosomen und vor allem eine arttypische Anzahl von Chromosomen, die zu einem von einer Membran umgebenen echten Zellkern organisiert sind.

Lebewesen, die meist einzellig sind und infolge ihrer Kleinheit nur mit mikroskopischen Verfahren erkannt werden knnen, werden unter dem Begriff Mikroorganismen zusammengefat. Man hat sie zu den Protisten subsummiert. Diese Einteilung beruht jedoch nur auf der geringen Gre der Organismen und bercksichtigt nicht den vllig unterschiedlichen Stoffwechsel und Zellaufbau. Fr ein natrliches System der Lebewesen, das im Idealfall auf ihren in der Evolution begrndeten verwandtschaftlichen Beziehungen aufbauen sollte, ist diese Einteilung deshalb nicht relevant. Man zhlt zu den Protisten:
einzellige Pilze (pflanzenhnlicher Zellaufbau, Kohlenstoff-heterotropher Stoffwechsel) einzellige Algen (Zellaufbau und Stoffwechseltyp der Pflanze, Kohfenstoff-autotroph) Protozoen (Zellaufbau und Stoffwechseltyp der Tiere, Kohlenstoff-heterotroph) Bakterien (einfacher, prokaryontischer Zellaufbau, verschiedene Stoffwechseltypen).

Sie gehren deshalb zu den Eukaryonten (griechisch: Karyos = der Kern). Diesen gegenber stehen die Prokaryonten (niedere Protisten, Bakterien). Sie zeichnen sich aus durch
das Fehlen von Organellen, die von Membranen umgeben sind kleinere Ribosomen (70 S) und durch ein Kemquivalent (Nukleoid), wobei die DNA als ein einziges groes Molekl (Bakterienchromosom genannt) frei im Zytoplasma liegt.

Im Hinblick auf eine korrekte Einordnung der Prokaryonten in ein natrliches System der Lebewesen wurden in den letzten Jahren durch Methoden der Hybridisierung und Sequenzierung von bestimmten Nukleinsuren (vor allem der I6S rRNA) groe Fortschritte erzielt. Das Schema eines darauf basierenden phylogenetischen Stammbaums zeigt Abb. 3.1. Dabei wird ein hypothetischer, primitiver Vorluferorganismus (Progenot) postuliert, aus dem sich drei Urreiche, die Eukaryonten, die Eubakterien und die Archaebakterien entwickelten. Die Viren knnen nicht in dieses System eingeordnet werden, da sie nicht die Organisationsform einer Zelle besitzen. Sie haben
nur einen Typ von Nukleinsure keinen eigenen Stoffwechsel und vermehren sich nicht durch Zweiteilung.

Sie sind nicht als eigenstndige Organismen zu betrachten, sondern in ihrer Existenz von Eukaryonten oder Prokaryonten abhngig.

3.1.1 Morphologie und systematische Einteilung der Bakterien


Abb. 3.1 Stellung der Bakterien im phylogenetischen Stammbaum.

Das bisherige, knstliche System beruht hauptschlich auf phnotypischen Eigenschaften, wie

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

157

z.B. Zellmorphologie, Frbeverhalten, Nachweis bestimmter Enzyme, Stoffwechselleistungen, chemische Zusammensetzung und Aufbau von Zellwnden, etc. Es ermglicht die eindeutige Identifizierung von unbekannten Isolaten und ist damit fr medizinisch-diagnostische Fragestellungen wertvoll und ausreichend. In der letzten Ausgabe von BERGEY'S HANDBUCH zur Bestimmung von Bakterien (1984-1988) wird das Reich der Prokaryonten noch in vier Abteilungen unterteilt, die sich haupschlich in Bezug auf die Zellwand unterscheiden: Bakterien mit starrer, dnner Zellwand, gramnegative Bakterien Bakterien mit starrer, dicker Zellwand, gram-positive Bakterien Bakterien ohne Zellwand, Mykoplasmen Bakterien mit einer Zellwand, die nicht aus Murein besteht, Archaebaktcricn. Durch die bereits erwhnten neuen Ergebnisse zur Phylogcnic der Prokaryonten und die dadurch vorhandenen Anstze zu einem natrlichen System werden weitreichende nderungen in der z.Zt. etablierten Baktcriensystematik notwendig. Es zeichnet sich eine komplette Neuordnung, wie sie z.B. in The Procaryotes" (2. Aufl., BALOWS et al, 1992) zugrunde gelegt wurde: Die Prokaryonten werden in zwei Reiche eingeteilt, Archaea (Archaebaktcricn) und Bacteria (Eubakterien).
Alle medizinisch relevanten Bakterien gehren in das Reich der Eubakterien.

Bakterien dar. Im systematischen Sinne, weder im knstlichen noch im sich abzeichnenden natrlichen System, reprsentieren sie aber keine einheitliche Gruppe; vielmehr fanden in allen Abteilungen der Eubakterien unabhngige Entwicklungen hin zu einer saprophytren bis parasitren Lebensweise statt.

3.1.2 Die Bakterienzelle


Bakterien sind einzellige Mikroorganismen, die vier Grundformen der Gestalt zeigen: runde oder kugelhnliche Zellen (Kokken) stbchenfrmige Zellen spiralige Zellen (Spirillen, Spirochten) oder solche, die Teil einer Schraubenwindung sind (Vibrionen, Campylobacter) fadenfrmige Bakterien {Actinomyces u.a.). Die Morphologie wird weitgehend durch die Form der relativ starren Zellwand bestimmt (Abb. 3.2).
Kokken

Dieses wird z.Zt. in wenigstens 12 Abteilungen (Divisionen) unterteilt, wobei pathogene Bakterien in den Abteilungen der Firmicutes (grampositive Bakterien), Proteobacteria (gram-negative Bakterien), Spirochten, Bacteroides-Gruppe und Chlamydien zu finden sind.
Die Archaebakterien spielen in der Medizin keine Rolle; sie werden hufig aus extremen Standorten (Temperaturen bis 110 C. hoher Druck, extreme pHWerte und Salzkonzentrationen) isoliert und knnen unter Normalbedingungen" nicht wachsen. Aber auch die groe Mehrzahl der Eubakterien sind medizinisch nicht relevant. Sie haben als freilebende Organismen durch ihre vielfltigen Stoffwechselleistungen in der Natur eine essentielle Bedeutung fr Aufbau und Abbau der Biomasse.

Die Kokken (Kugelbakterien), die entweder ganz rund oder leicht lnglich sein knnen, zeigen vielfach eine charakteristische Lagerung zueinander, so da bei der mikroskopischen Betrachtung eines gefrbten Ausstrichprparates eine Verdachtsdiagnose mglich ist. Man unterscheidet: haufenfrmig gelagerte Kokken. Dies sind die Staphylokokken (Haufen- oder Traubenkokken) und Peptokokken; kettenfrmig gelagerte Kokken: Streptokokken (Kettenkokken) und Peptostreptokokken; paarweise gelagerte Kokken (Diplokokken): Pneumokokken (Streptococcus pneumoniae), Neisserien {Neisseria meningitidis bzw. N. gonorrhoeae); relativ regelmige Lagerung von 4 Zellen (Tetrakokken); paketfrmige kubische Aggregate von 8 oder mehr Kokken (Sarcinen, ohne medizinische Bedeutung).
Stbchenfrmige Bakterien

Die Bakterien, die fr die medizinische Mikrobiologie interessant sind (z.B. Bakterien der physiologischen Krperflora, opportunistische oder fakultativ-pathogene Bakterien sowie pathogene Bakterien, deren Wirte der Mensch oder Tiere sind), stellen also nur einen sehr kleinen, aber bedeutungsvollen Teil im Reich der

Bei den stbchenfrmigen Bakterien sind die morphologischen Unterschiede gering. Die Zellen der einzelnen Arten weisen eine unterschiedliche Lnge und Dicke auf, so da die Stbchen gro oder klein sind, plumpe oder schlanke Formen haben. Manche BakterienGattungen umfassen Zellen, die eine Keulen-

158

Allgemeine Bakteriologie

Abb. 3.2 Schematische Darstellung verschiedener Bakterien: 1. Staphylokokken (Trauben- oder Haufenform), 2. Neisserien (Kaffeebohnenform), 3. Pneumokokken (Kerzenflammenform), 3a. Bekapselte Pneumokokken, 4. Streptokokken (Kettenform), 5. Tetrakokken, 6. Paketkokken (Sarcinen), 7. Enterobakteriazeen, 8. Kettenfrmig angeordnete Milzbrandbazillen mit mittelstndigen, nicht auftreibenden Sporen in einer Kapsel, 9. Corynebakterien (Keulenform), 9a. Pseudodiphtheriebakterien (palisadenfrmige Lagerung), 10. Fusobakterien, 11. Peritrich begeielte Typhusbakterien, 12. Monotrich begeielte Vibrionen (gekrmmte Stbchen), 13. Lophotrich begeielte Pseudomonas fluorescens, 14-16 Spirochten, 14. Borrelia recurrentis, 15. Treponema pallidum, 16. Leptospiren (Kleiderbgel-, Hakenform).

form zeigen (Gattung Corynebacterium) oder an den Enden zugespitzt sind (Spindelform; Fusobacterium). Andere haben Fadenform (Gattungen Actinomyces, Streptomyces). Wichtige Unterscheidungsmerkmale sind ferner die Sporenbildung (Gattungen Bacillus und Clostridiuni) sowie das Vorkommen von Geieln.
Schraubenfrmige Bakterien

mende Art (Spihllum minus, Rattenbikrankheit) keine medizinische Bedeutung haben. Eine Untergruppe bilden die gebogenen Stbchen (z.B. Vibrio) und gebogen bis schraubenfrmige Zellen in der Gattung Campylobacter. Flexible, spiralige Zellen mit nur geringer Dicke sind die Spirochten (Gattungen Treponema, Borrelia, Leptospira).
Bakterien ohne Zellwand

Die schraubenfrmigen Bakterien gliedern sich in solche mit starrer Zellwand und andere mit flexibler Zellwand. Starre Zellen weisen die Spirillen auf, die bis auf eine sehr selten vorkom-

Eine Sonderstellung nehmen die Mycoplasmen (s. Kap. 4.25) ein, denen im Gegensatz zu allen brigen Bakterien eine Zellwand fehlt. Sie haben

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

159

ein vielgestaltiges (pleomorphes) Aussehen in Form von vernderlichen, blschenfrmigen Gebilden.


Abweichungen von der typischen Gestalt

das Vorhandensein von Kapseln Geieln Fimbrien (Pili) Sporen (Gattung Bacillus und Clostridium).
Das Kernquivalent (Nukleoid) Das Nukleoid enthlt die Erbinformation (Genom). Es besteht aus einem in der Regel ringfrmig geschlossenen DNA-Molekl (dem sogenannten Bakterienchromosom), das in stark gefalteter und verdrillter Form ohne Abgrenzung durch eine Kemmembran frei im Zytoplasma liegt (Abb. 3.3, 3.4).

Aufgetriebene Formen, einseitige Anschwellungen, Fadenform, unterschiedliche Anfrbbarkeit entstehen durch degenerative Vernderungen. Sie werden durch uere Einflsse hervorgerufen und knnen z.B. durch Einwirkung von Chemotherapeutika zustande kommen. Dies mu bei der Beurteilung von Originalprparaten beachtet werden.
Gre der Bakterien

Die Lnge vieler Bakterien liegt im Bereich von 0,5 bis 5 [im (1 um = ICH' m). Die Dicke liegt meist unter 1 um. Kokken haben einen Durchmesser von etwa 1 [im (Hefezcllen sind grer und haben einen Durchmesser von 3-5 um). Das zur normalen Dickdarmflora gehrende Bakterium Escherichia coli hat eine Lnge von 1-3 [im und eine Dicke von 0,5 um. Milzbrandbazillen sind 3-10 um lang und 1-1,3 um dick. Spirochten sind 10-20 um lang (Erythrozyten-Durchmesser 7,5 um), aber sehr zart (Dicke etwa 0,1 um). Infolge ihrer geringen Dicke sind Spirochten lebend im Hcllfeldmikroskop nicht mehr darzustellen. Hierfr mu das Dunkelfeldmikroskop herangezogen werden. Fadenfrmige Bakterien, z.B. der Gattung Actinomyces, knnen erheblich lnger als Spirochten sein. Pilzfden unterscheiden sich von den fadenfrmigen Bakterien durch ihre wesentlich grere Dicke (2-10 um). Allgemein schwankt die Gre der Einzelzellcn stark mit dem physiologischen Zustand, (z.B. whrend der Wachstumsphase). Auerdem sind lebende Zellen grer als gefrbte, da Fixierung und Frbung zu starken Schrumpfungen fhren.
Die Anatomie der Bakterienzelle Eine Bakterienzelle (Abb. 3.3) besteht aus einer relativ starren Zellwand der Zytoplasmamembran dem Zytoplasma dem Kernquivalent.

Es besteht je nach Bakterienart aus 0.5 bis 10 Millionen Nukleotidpaaren. Eine nhere Beschreibung findet sich in Kap. 3.3.2. Das Chromosom liegt meist in mehreren Kopien vor (z.B. 2^1 bei E. coli). Auer dem Bakterienchromosom knnen im Zytoplasma von Bakterienzellcn noch meist ringfrmig geschlossene, kleinere DNA-Molekle vorkommen, die etwa 2000 bis 200 000 Nukleotidpaare gro sind (2 bis 200 kb); zur Grenbeschreibung von DNA hat sich der Begriff Kilobasen (kb) eingebrgert, wobei 1 kb 1000 Basen(Nukleotid)paaren entspricht. Diese Plasmide genannten DNA-Molekle liegen meist in viel hherer Kopienzahl vor (bis zu 100 pro Zelle). Das Nukleoid wird bei den gngigen Frbeverfahren fr Bakterien (z.B. nach Gramfrbung) optisch nicht hervorgehoben. Dies erreicht man jedoch durch Spezialfrbung z.B. nach GIEMSA, bei der ein basischer Farbstoff verwendet wird, der mit Nukleinsuren reagiert. Im elektronenmikroskopischen Bild hebt sich das Nukleoid in der Regel als heller, weniger dichter Bereich vom Zytoplasma ab (Abb. 3.4).
Zytoplasma

Zytoplasmamembran und Zellwand werden auch als Zellhlle (cell cnvelope) zusammengefat (Abb. 3.3: 3.5). Zustzliche morphologische Merkmale bei einer Reihe von Bakterienarten sind:

Das von der Zytoplasmamembran umschlossene Zytoplasma enthlt in Wasser gelst Salze, Enzyme, Ribosomen und Strukturproleine, Stoffwechselintermedirprodukte und Ribonukleinsuren (RNA); das Wasser macht etwa 80% des Zellgewichtes aus. Die RNA kommt in mindestens drei Arten vor (mRNA, rRNA, tRNA, s. Kap. 3.3.4). Die Ribosomen, an denen die Proteine synthetisiert werden, finden sich in groer Anzahl im Zytoplasma (bei E. coli bis 15 000 pro Zelle). Sie haben eine Gre von 16 x 18 nm und eine Sedimentationskonstantc von 70 S (S = SVEDBERG-

160

Allgemeine Bakteriologie

Abb. 3.3 Schematischer Aufbau einer Bakterienzelle mit Darstellung der wichtigsten Zellkomponenten; Lngsschnitt durch eine stbchenfrmige Zelle.

Einheiten), daher auch die Bezeichnung 70 S Rihosomen im Gegensatz zu den 80 S Ribosomcn der Eukaryonten. Ribosomen, die perlschnurartig an einem mRNA-Strang aneinandergereiht sind, bezeichnet man als Polysomen.
Die Ribosomen bestehen zu etwa 60% aus RNA und zu 40% aus Protein. Jedes Ribosom setzt sich aus einer groen und einer kleinen Untereinheit zusammen, deren Sedimentationskoeffizienten bei 50S und bei 30S liegen. In der groen Untereinheit findet sich je ein 23S und ein 5S rRNA-Molekl, sowie 31 verschiedene Proteine. Die kleine Untereinheit setzt sich aus einem 16S rRNA-Molekl und 21 Proteinen zusammen. Die Nukleotidsequenzen der rRNA-Molekle vieler Bakterien ist inzwischen aufgeklrt. Die rRNA, insbesondere die 16S rRNA ist von groem biologischen Interesse, da Sequenzvergleiche von RNA verschiedener Arten eine genaue Analyse von Verwandtschaftsbe-

ziehungen der Bakterien ermglichen und damit fr den Aufbau eines natrlichen Systems herangezogen werden knnen.

Die Ribosomen sind ferner wichtig als Angriffsort chemotherapeutisch bedeutender Antibiotika. Die Unterschiede im Feinbau zu den 80S Ribosomen der Eukaryonten ermglichen eine gezielte Hemmung der bakteriellen Proteinbiosynthese, ohne den Wirt zu beeintrchtigen. Antibiotika, die hier eingreifen, sind u.a. die Tetracycline, Chloramphenicol, Erythromycin und A minoglykoside. Im mikroskopischen Bild von Bakterien tauchen hufig im Zytoplasma eingelagert Granula auf, die aus Speicherstoffen bestehen (z.B. Polyhydroxybuttersure). Bei den Diphtheriebakterien findet man regelmig die Volutinkrperchen

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

161

Abb. 3.4 Elektronenmikroskopische Aufnahme


eines Ultradnnschnitts einer Zelle von Listeria monocytogenes im Stadium der Zellteilung. Elektronenmikroskop-Vergrerung 70.000:1. Die dreischichtige zytoplasmatische Membran, der nach auen die Zellwand aufliegt, ist sichtbar (s. Abb. 3.5). Die weniger kontrastierten, unscharf begrenzten Bereiche sind Nukleoide mit fdiger DNA-Struktur, die unmittelbar ohne Begrenzung durch eine Membran im Zytoplasma liegen. Im Bereich der Ausbildung des Querseptums ein Mesosom (Aufnahme W. LENZ).

pide sind in Form einer Doppelschicht gelagert, wobei die hydrophilen Kopfgruppen jeweils nach auen zu den wssrigen Phasen innerhalb und auerhalb der Zelle zeigen, whrend die hydrophoben Fettsureketten nach innen liegen und eine wasserundurchlssige Schicht bilden. In die Doppelschicht sind eine Vielzahl von Proteinen eingelagert, welche die Membran ganz durchkreuzen knnen (integrale Membranproteine) oder sich nur an einer Seite befinden (periphere Membranproteine). Sterole fehlen im Gegensatz zu den Pilzen in der Membran der Bakterien (mit Ausnahme von Mykoplasmen). Die Polyen-Antimykotika, wie Nystatin und Amphotericin, die sich an Sterole binden, haben daher keinen Angriffspunkt bei Bakterien. Als funktionsanaloge Substanzen zu den Sterolen kommen bei Bakterien Hopanoide vor. Ohne eine intakte Zytoplasmamembran ist eine Bakterienzelle nicht lebensfhig. Sie erfllt essentielle Funktionen: als Permeabilittsbarriere, die die Akkumulation von Nhrstoffen, Metabolitcn etc. ermglicht;

(der Namen leitet sich von Spirillum volutans her, wo diese Granula ebenfalls vorkommen), die aus Polyphosphaten bestehen.
Zytoplasmamembran Die zytoplasmatische Membran ist als Ort wichtiger Stoffwechselvorgnge fr die Lebensfhigkeit der Zelle von entscheidender Bedeutung.

Sie besitzt eine Dicke von 6-8 nm und begrenzt das Zytoplasma. Sie zeigt im fixierten und konstrastierten Dnnschnittprparat bei der Elektronenmikroskopie eine dreischichtige Struktur (Abb. 3.5, 3.9) und hat den typischen Aufbau aller biologischen Membranen. Im natrlichen Zustand ist die Membran ein Mosaik von Lipiden flssiger Phase und Proteinen. Die Proteine machen ber 60% des Trockengewichts der Membran aus, die Lipide (hauptschlich Phospholipide) 20-30%. Die Li-

Abb. 3.5 Ausschnitt aus Abb. 3.4. Die Zellhlle des gram-positiven Bakteriums, bestehend aus Zellwand (1) und Zytoplasmamembran (2) ist gut zu erkennen.

162

Allgemeine Bakteriologie

als Sitz von spezifischen Transportenzymen,

die die selektive Aufnahme und Abgabe von Substanzen steuert;


als Energie-transduzierende Membran, in der

die Elektronentransportsysteme und die ATPase organisiert sind, die die ATP-Synthese durch Atmungskettenphosphorylierung bewerkstelligen (s. Kap. 3.2.2); als Sitz von Enzymen und Multienzymkomplexen, die komplexe Biosynthesen katalysieren (z.B. Lipidbiosynthese, Zusammenbau von Zellwand- und Kapsclpolymeren, DNAReplikation, Export und Prozessierung von Exoproteinen etc.).
Periplasmatischer Raum

Zellwand auf- bzw. abbauende Enzyme sind im Periplasma lokalisiert. Bei den gram-positiven Bakterien liegen diese Proteine ebenfalls zwischen Zytoplasmamembran und Zellwand, jedoch lt sich hier im Elektronenmikroskop kein deutlich abgegrenzter periplasmatischer Raum erkennen.
Zellwand

Zwischen der Zytoplasmamembran und dem Peptidoglykan findet sich bei gramnegativen Bakterien ein periplasmatischer Raum (Abb. 3.9), der mit Enzymen und anderen Proteinen gefllt ist. Darunter sind z.B. Hydrolasen, Phosphatasen, Nukleasen und andere Enzyme, die den Abbau von Polymeren und Oligomeren bewerkstelligen, um sie in die Zelle aufnehmen zu knnen. Zahlreiche spezifische Bindeproteine leiten den Transport von Nhrstoffen (Aminosuren, Zucker, Nukleotidcn, Vitaminen etc.) durch die Zytoplasmamembran ein, indem sie diese binden und an Transportproteine in der Membran weitergeben. Auch Antibiotika-inaktivierende Enzyme, wie die -Laktamase sowie

Das Peptidoglykan als Grundstruktur Nach dem von GRAM (1884) eingefhrten Frbeverfahren (s. Kap. 2.3.1) werden Bakterien in gram-positive (blau-schwarz gefrbte Zellen) und gram-negative (rot gefrbte Zellen) unterteilt. Spter stellte sich heraus, da das unterschiedliche Frbeverhalten der beiden Gruppen auf Unterschiede im Zellwandaufbau zurckzufhren ist. Allerdings ist das Gerst der Zellwand bei gram-positiven und gram-negativen Bakterien im Prinzip bereinstimmend (Abb. 3.6, 3.9).
Es handelt sich hierbei um eine netzartige Struktur von Polysaccharidketten, dem Glykan, die ber kurze, meist vier Aminosuren lange Peptidketten miteinander verknpft sind.

Dieses daher Peptidoglykan (oder Murein) genannte Polymer bildet ein dreidimensionales Makromolekl, das sich ber die gesamte Zelloberflche erstreckt und die Zelle sackartig

Abb. 3.6 Schematische Darstellung der Zellhlle gram-positiver Bakterien und ihrer wichtigsten Komponenten. Lipoteichonsuren, Teichon- und Teichuronsuren sowie die Peptidquervernetzung (molekularer Aufbau s. Abb. 3.7) sind rot dargestellt.

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

163

Abb. 3.7 Struktur des


Mureins von Staphylococcus aureus. Zwei Glykanstrnge, bestehend aus N-Acetylglukosamin (G) und N-Acetyl-Muraminsure (M) sind durch Peptidbrcken quervernetzt. Die Spaltstellen des Zellwand-hydrolysierenden Enzyms Lysozym sind eingezeichnet. Weitere Erluterungen im Text.

einschliet (Murein-Sacculus, Abb.3.8). Es gibt der Zelle ihre Form und wirkt als Exoskclett, das die fluide Membran in osmotisch nicht stabilisiertem Milieu vor dem Zerplatzen schtzt. An dem Aufbau des Glykans sind zwei Aminozucker beteiligt, das N-Acetylglucosamin und die N-Acetylmuraminsure (Abb. 3.7), die sich alternierend ber eine -l,4-Bindung zu langen (etwa 200 Disaccharid-Einheiten), unverzweigten Ketten anordnen. An die Carboxylgruppe jedes Muraminsurerests ist ein Tetrapeptid gebunden, das bei vielen Bakterienarten folgende Aminosuresequenz hat: L-Alanin, D-Glutaminsure, meso-Diaminopimelinsure (diese Aminosure kommt nicht bei Eukaryonten vor) und D-Alanin. Bei den meisten gram-negativen Bakterien und den Bazillen sind die Tetrapeptidketten direkt durch Peptidbindungen untereinander verbunden, und zwar die 4. Aminosure (D-Alanin) des Tetrapeptids einer Glykankette mit der 3. Aminosure (wi-Diaminopimelinsure) der benachbarten Glykankette. Die Anzahl der Tetrapeptide, die kreuzgebunden sind, schwankt in Abhngigkeit von den einzelnen Bakterienarten (bei E. coli z.B. nur ca. 20%). Ferner knnen die Aminosuren (vor allem in der Position 3) variieren. So ist z.B. die mDiaminopimelinsure bei gram-positiven Bakterien (z.B. Staphylococcus aureus) meist durch L-Lysin ersetzt. Auch kann die Verbindung der beiden Tetrapeptidketten ber eine Interpeptidbrcke erfolgen, wie es z.B. durch eine Kette von 5 Glycinmoleklen bei Staphylococcus aureus der Fall ist (s. Abb. 3.7).

Angriffsort fr Antibiotika. Es ist bemerkenswert, da die Mureinstruktur der bakteriellen Zelle nicht bei Pflanzen und Tieren anzutreffen ist.
Dies ermglicht die Anwendung von Antibiotika (z.B. Penicilline, Cephalosporine, Vancomycin, Bacitracin).

Sie interferieren mit der Biosynthese des Peptidoglykans, ohne da die Zellen des Makroorganismus geschdigt werden (s. weiter unten). Zellwand der gram-positiven Bakterien Die Zellwand der gram-positiven Bakterien, die 30 bis 70% des Trockengewichts der Bakterienzelle ausmacht, stellt sich elektronenmikrosko-

Abb. 3.8 Elektronenmikroskopische Aufnahme isolierter Zellwnde von Staphylococcus aureus (Vergrerung 30.000:1; nach HAMMOND et al. 1984).

164

Allgemeine Bakteriologie

pisch als eine 20 bis 80 nm dicke, relativ einheitlich kontrastierte Schicht dar (Abb. 3.5, 3.6). Sie besteht aus vielen miteinander verknpften Lagen von Peptidoglykan. Die Aminosuren der Tetrapeptidketten variieren von Spezies zu Spezies; dies hat fr taxonomische Zwecke Bedeutung. Weiterhin sind bei gram-positiven Bakterien Teichon- und/oder Teichuronsuren kovalent in das Mureinnetz eingewoben. Durch die Teichonsuren (lineare Polymere aus repetitiven Einheiten von Glycerolphosphat oder Ribitolphosphat) und Teichuronsuren (Glucuronsureketten) erhlt das Mureinpolymer eine negative Gesamtladung, die offensichtlich fr die Versorgung der Bakterienzelle mit Kationen wichtig ist. Als weitere Komponenten der Zellwand, allerdings nicht kovalent verknpft mit dem Murein, sind die Lipoteichonsuren zu nennen. Diese stellen ebenfalls Polyglyccrolphosphatketten dar, die an einem Ende mit einem Glykolipid verestert sind und mit diesem in der Zytoplasmamembran verankert werden. Die Polyglycerolkette durchdringt die Zellwand und ist an der Oberflche mit Antikrpern nachweisbar. Die Lipoteichonsuren spielen eine Rolle bei der Adhsion der Bakterienzelle an der Oberflche, z.B. Epithclzellen. Die Mykobakterien-Zellwand zeichnet sich ferner durch einen hohen Gehalt an Mykolsureestern (hochmolekulare Lipide) aus, die fr die Surefestigkeit dieser Bakterien verantwortlich sind. Weiterhin kommt eine Anzahl von Zellwand-assoziierten, d.h. nicht kovalent gebundenen Proteinen vor, z.B. findet man bei A-Streptokokken als Oberflchenprotein das M-Protein, einen wichtigen Virulenzfaktor. Nahezu alle Stmme von Staphylococcus aureus bilden das sogenannte Protein A, das ebenfalls auen auf dem Murein-Sacculus abgelagert wird. Protein-A bindet IgG ber dessen Fc-Teil (s. Kap. 1.2.4). In der Zellwand und auch Membran-assoziiert kommen ferner Zellwand-hydrolysierende Enzyme (sog. Autolysine) vor, die u.a. bei der Zellteilung die Auftrennung in zwei Tochterzellen ermglichen. Sie bedrfen einer genauen Regulation, um keine unkontrollierte Zell-Lysis zu verursachen. Das in Eiklar, Speichel und Trnenflssigkeit vorkommende, von A. FLEMING 1922 entdeckte Enzym Lysozym spaltet die -l,4-glykosidische Bindung zwischen N-Acetylglucosamin und NAcetylmuraminsure (s. Abb. 3.7) und ist somit eine Muraminidase. Es wirkt auf gram-positive

Bakterien lytisch und damit bakterizid. Zellen gram-negativer Bakterien werden erst nach Vorbehandlung mit EDTA gelst, wodurch die uere Membran (s.u.) fr Lysozym permeabel wird. Zellwand der gram-negativen Bakterien Die Zellwand der gram-negativen Bakterien ist mit 15-20 nm dnner als die der grampositiven (Abb. 3.9). Im elektronenmikroskopischen Bild ist sie deutlich geschichtet. Bei nherer Betrachtung zeigt sich, da die Peptidoglykanschicht nur 2-3 nm dick ist und aus 2 bis 3 Lagen besteht, und da ihr auen eine weitere Membran aufliegt, die sogenannte uere Membran, die prinzipiell dem Aufbau einer Elementarmembran entspricht, jedoch eine deutlich andere Zusammensetzung und andere Funktionen hat als z.B die Zytoplasmamembran (s. Abb. 3.9). Die uere Membran ist viel strker asymmetrisch aufgebaut als andere Membranen, d.h. die beiden Lipidschichten unterscheiden sich stark in ihren Komponenten. Die innere, dem Peptidoglykan zugewandte Schicht besitzt in etwa die gleiche Phospholipidzusammensetzung wie die Zytoplasmamembran. In sie eingelagert ist der Lipidteil des sogenannten BRAUNSchen Lipoproteins. Dieses ist an dem anderen Ende kovalent mit dem Peptidoglykan verbunden und stellt so eine stabile Verbindung von uerer Membran und Murein her. In der nach auen zeigenden Lipidschicht der Membran ist das Lipid A das mengenmig dominierende Lipid. Das Lipid A stellt den lipophilen Anker der Lipopolysaccharide dar und hat stark toxische Eigenschaften (s.u.). In die uere Membran eingelagert, sowohl peripher als auch integral, sind zahlreiche Proteine, sogenannte outer membrane proteins (Omp) (Abb. 3.9). Einige davon, z.B. OmpA haben Struktur-stabilisierende Funktion, whrend andere, z.B. OmpC und OmpF Poren in der Membran bilden und deshalb Porine genannt werden. Die Poren entstehen dadurch, da sich meist drei identische Porinmolekle so in der Membran zusammenlagern, da ein wassergefllter Kanal entsteht, durch den gelste Substanzen mit Molekulargewichten bis zu 700 Dalton (z.B. Ionen, Aminosuren, Monosaccharide) relativ ungehindert in den periplasmatischen Raum gelangen. Die eben genannten Proteine kommen praktisch immer und in hoher Kopienzahl (bis

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

165

Abb. 3.9 Schematische Darstellung der Zellhlle gram-negativer Bakterien.

zu KP pro Zelle) in der Auenmembran vor, whrend andere nur unter bestimmten Wachstumsbedingungen oder nur in wenigen Kopien vorliegen. Diese haben spezielle Funktionen in der Nhrstoff aufnhme, z.B. als spezifische Maltose-Pore (LamB Protein), Phosphat-Pore (PhoE), oder als Rezeptorproteine fr Komplex-gebundenes Eisen (Fe3+-Chelate). Allein bei E. coli sind vier verschiedene Eisentransportsysteme mit spezifischen Rezeptorproteinen bekannt. Die zuletzt genannten Proteine der ueren Membran werden hufig von Bakterienviren (= Bakteriophagen) und Bacteriocinen (antibiotische Proteine mit engem Wirkungsspektrum) als Rezeptoren benutzt; diese mibrauchen also existierende Aufnahmesysteme, um in die Bakterienzelle zu gelangen.
Die uere Membran gramnegativer Bakterien hat also eine wichtige Molekularsiebfunktion; sie ist auch dafr verantwortlich, da viele Antibiotika, die grampositive Bakterien abtten, gegen gramnegative nicht wirksam sind, weil diese die Membran aufgrund ihrer Gre nicht penetrieren knnen.

der Lipidanker (Lipid A) toxische Eigenschaften besitzt und der Polysaccharidanteil wichtige Antigcndeterminanten enthlt. Die LPS sind mit dem Lipidanteil fest in der Lipidmatrix verankert und werden erst bei ZellLyse frei. Man bezeichnet sie daher als Endotoxine im Gegensatz zu den Exotoxinen, (z.B. Diphtherietoxin, Choleratoxin, Tetanustoxin etc.), die Proteine sind und von den Bakterien whrend des Wachstums produziert und aktiv sekretiert werden (zur pathogenetischen Bedeutung des Endotoxins s. Kap. 1.1.4). Das Lipopolysaccharid-Molekl (Abb. 3.10) kann man in drei Abschnitte (Regionen I-III) unterteilen: das Lipid A (Region III), das Kernpolysaccharid (Region II) und die variable Seitenkette (Region I).
Das Lipid A ist ein ungewhnliches Phospholipid.

Von groer medizinischer Bedeutung sind auch die Lipopolysaccharide (LPS) der Auenmembran, weil

An ein Glukosamindisaccharid sind ber die Hydroxy- und die Aminogruppen des Zuckers Fettsuren unterschiedlicher Kettenlnge verestert. Diese bilden die uere Lipidschicht der Auenmembran. Das Lipid A ist bei allen Enterobacteriaceae sehr hnlich und dadurch in seiner Toxizitt vergleichbar. An das Lipid A schliet sich die Kernzone (II) an: Sie besteht aus fnf basalen Zuckern (Keto-

166

Allgemeine Bakteriologie

Ausimpfung auf Nhrbden nicht in Form von Kolonien, sondern berziehen den ganzen Nhrboden mit einem zarten, hauchfrmigen Wachstum (H-Form, davon abgeleitet der serologisch-diagnostisch gebrauchte Begriff H-(Geiel-)Antigen). Geiellose Varianten wachsen dagegen in Kolonien, d.h. ohne Hauch (O-Form, davon abgeleitet O-(Krper-)Antigen.

Abb. 3.10 Aufbau des Lipopolysaccharids gramnegativer Bakterien am Beispiel der Enterobakteriazeen. Glc = Glukose, GIc-NAc = N-Acetylglukosamin, Gal = Galaktose, Hep = Heptose, KDO = 2-Keto-3desoxyoctonsure, Glc-N = Glukosamin.

desoxyoctonat, Heptose, D-Glukose, D-Galaktose und D-Glukosamin). Die Kernpolysaccharidzusammensetzung ist bei allen Salmonellen bereinstimmend. Bei anderen Genera gramnegativer Bakterien kann sie jedoch hiervon verschieden sein. Auf das Kernpolysaccharid folgt dann als uere Region (I) eine Kette von sich wiederholenden Oligosaccharid-Einheiten, meist Trisacchariden. Sie kann eine groe Variation in Zusammensetzung und Struktur zeigen und wird Ospezifische Seitenkette genannt. Diese O-spezifischen Seitenketten sind Bestandteile der Oberflche der Zellwand und stellen thermostabile antigene Determinanten dar, die als Krper- oder O-Antigene bezeichnet werden. Sie rufen im Makroorganismus die Bildung von O-spezifischen Antikrpern hervor. Derartige Zuckerstrukturen knnen auch spezifische Anheftungspunktc (Rezeptoren) fr Bakteriophagen sein. Die Bezeichnung O-Antigen leitet sich ursprnglich her von Beobachtungen bei Bakterien der Gattung Proleus. Stark begeielte Stmme wachsen bei

Die O-spezifische Seitenkette von Salmonella newington besteht z.B. aus 10-20 sich wiederholenden Trisaccharid-Einheiten (Mannose, Rhamnose und Galaktose). Infolge der groen Variationsmglichkeit in der Zuckerzusammensetzung, ihrer Sequenz und der Art ihrer Bindung gibt es bei E. coli, Salmonellen und anderen gramnegativen Bakterien eine groe Zahl von unterschiedlichen O-Antigenen mit verschiedener serologischer Spezifitt. Auf diese Weise lassen sich innerhalb einer Art viele Serovarietten (Serovare) unterscheiden, was fr epidemiologische Fragestellungen sehr ntzlich ist; darber hinaus korreliert in manchen Fllen die Fhigkeit von Stmmen, bestimmte Pathogenittsfaktoren auszubilden mit der Serovariett, so da deren Bestimmung auch direkte diagnostische Bedeutung hat: z.B. sind fr die Entstehung von Yers/n/a-Enteritiden nur die Serovare O:3, O:8 und O:9 relevant. Rauh- und Glattformen. Whrend Salmonellen und andere Enterobacteriaceen mit ausgebildeten O-Seitenketten des LPS mit runden, gewlbten, spiegelnden Kolonien wachsen und als Glattformen (oder S[smooth]-Form) bezeichnet werden, knnen Verlust-Mutanten auftreten, die flache, unregelmig begrenzte Kolonien mit gekrnter Oberflche aufweisen. Diese Mutanten werden als Rauhformen (R-|roughjForm) bezeichnet und haben die Fhigkeit, die O-spczifischc Seitenketten und/oder Teile des Kempolysaccharides zu synthetisieren, verloren. Die Rauhformen sind gegenber Serum empfindlich und nicht mehr pathogen. Die medizinische Bedeutung der Zellwand Die Zellwand ist der Teil der Bakterienzelle, der mit der Auenwelt, also auch mit dem Makroorganismus, in Wechselwirkung tritt. Sie enthlt Oberflchenkomponenten, die fr die spezifische Anheftung an Epithelien verantwortlich sind. Die antigenen Determinanten der Zellwand rufen im Makroorganismus die Bildung von Antikrpern hervor, die zur Agglutination oder in Gegenwart von Komplement und phagozytierenden Zellen zu einer Immunphagozytose oder Zellabttung fhren.

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

167

Die Zellwand gram-negativer Bakterien enthlt toxische Substanzen (Endotoxine). Unvollstndig abgebaute Fragmente des Peptidoglykans (vor allem gram-positiver Bakterien) sind pyrogen und spielen eine Rolle bei der Entstehung von Arthritiden. Die Zellwand ist Angriffspunkt wichtiger Antibiotika und von Lysozym.
Die -Laktam-Antibiotika (z.B. Penicilline, Cephalosporine) verhindern die Bildung einer funktionstchtigen Zellwand dadurch, da sie die Quervernetzung der einzelnen Pcptidoglykanstrnge beeintrchtigen. Die Quervernetzung erfolgt enzymatisch durch Transpeptidasen und Carboxypeptidasen. Diese binden die -Laktam-Antibiotika aufgrund sterischer hnlichkeit mit ihrem eigentlichen Substrat, dem D-AlanylD-Alanin-Ende der Peptidseitenkette des naszierenden, noch nicht quervernetzten Peptidoglykans. Dabei wird eine kovalente Bindung zwischen Enzym und Antibiotikum ausgebildet. Auf diese Weise werden die Enzyme weitgehend irreversibel inaktiviert. Aufgrund ihres Penicillin-Bindevermgens werden diese Enzyme, von denen bisher 7 bekannt sind, als penieillinbindende Proleine bezeichnet. Das Fehlen einer intakten Zellwand fhrt zu einer osmotischen Schdigung der Zelle. Aus diesem Zusammenhang ergibt sich, da Laktam-Antibiotika nur fr wachsende BakterienzelIcn eine bakterizide Wirkung besitzen und nicht, wenn die Peptidoglykan-Biosynthese ruht. Protoplastcn und L-Formen. Wie schon zuvor erwhnt, lst das Enzym Lysozym die Zellwand der meisten gram-positiven Bakterien leicht auf. Bei geeigneten osmotischen Verhltnissen entsteht hierdurch eine wandlose, noch lebensfhige Zelle, der Protoplast. Dieser besitzt ohne das sttzende Exosklett keine definierte Form und ist gegen physikalische Einflsse auerordentlich labil. Bei geeigneten Grenzkonzentrationen von Penicillin, d.h. bei gestrter Zcllwandbiosynthese. bilden sich bei stbchenfrmige Bakterien, wie z.B. E. coli oder Proteus, blschenfrmige Gebilde von 10 (.im Gre und darber. Dieses Gebilde, die auch als Sphroplasten bezeichnet werden, da sie im Gegensatz zu den Protoplastcn noch Reste der Zellwand besitzen, knnen sich in Gegenwart von Penicillin vermehren und bilden auch auf Nhragar kleine, etwa 0,5 mm groe Kolonien, die nur aus solchen blasigen Elementen bestehen. Diese blschcnfrmi-

gen Gebilde wurden von Emmy KLIENEBERGER-NOBEL als L-Formen (L = Abkrzung fr Lister-Institut in London) bezeichnet. KLIENEBERGER entdeckte 1935 zuerst L-Formen bei Kulturen von Streptobacillus moniliformis, bei dem diese L-Formcn bereits spontan, d.h. ohne Anwesenheit von Penicillin entstehen. Werden L-Formen in Abwesenheit von Penicillin weitergezchtet, entstehen wieder normale stbchenfrmige Bakterien. Allerdings knnen in seltenen Fllen die knstlich induzierten L-Formen auch in Abwesenheit von Penicillin stabil bleiben. Ob bakterielle LFormen bei Infektionen bzw. Krankheiten eine Rolle spielen, ist unklar.

Geieln, Pili, Kapseln, Sporen

Geieln
Die Zellen vieler Bakterienarten sind begeielt. Die Ceieln dienen der aktiven Fortbewegung der Bakterien.

Man kann also zwischen begeielten und beweglichen sowie unbegeielten und unbeweglichen Bakterien unterscheiden. Es handelt sich bei den Geieln um sehr feine Fden von etwa 20 nm Dicke und einer Lnge bis zu 20 um (Tab. 3.1). Grundbaustein der Geieln ist das Protein Flagellin; die einzelnen Proteinmolekle werden helical angeordnet, so da ein schraubenfrmiger, innen hohler Zylinder entsteht. Die Geieln treten durch die Zeilwand hindurch und sind mit einem basalen Krper in der zytoplasmatischcn Membran und auch der Zellwand verankert. Dieser basalc Anker wird in Rotation versetzt, so da die lange Geiel schraubenartige Wellenbewegungen durchfhrt; sie kann wie ein Propeller die Zelle ziehen oder analog zur Schiffschraube die Zelle schieben. Infolge des geringen Durchmessers sind Geieln nicht mit den blichen Frbemethoden (z.B. nach GRAM) lichtmikroskopisch darstellbar. Im Elektronenmikroskop sind Geieln nach Me-

Geieln Durchmesser Lnge Proteinbaustein Molekulargewicht Aufgabe 12-20 nm 15-20 um Flagellin 40,000 Beweglichkeit

Fimbrien (Typ 1) 3-10 nm 0,2-10 um Typ 1-Pilin 16,000 Adhsion

F-Pili 9-10 nm < 20 jxm F-Pilin 11,000 Zellkontakt fr DNA-Austausch

Tab. 3.1 Eigenschaften von Geieln, Fimbrien und Pili bei E. coli

168

Allgemeine Bakteriologie

Abb. 3.11 Elektronenmikroskopische Aufnahme von zwei Escherichia coli K12-Zellen mit Geieln und Pili. Elektronenmikroskop-Vergrerung 7000:1 (Aufnahme W. LENZ).

tallschrgbedampfung der Prparate oder Kontrastierung mit Schwermetallsalzen gut sichtbar zu machen (Abb. 3.11, 3.12). Fr die Taxonomie ist es wichtig, da bei den einzelnen Bakterienspezies die Art der Begeielung verschieden sein kann. Es gibt polar oder ringsum (peritrich) begeielte Bakterien. Bei der polaren Begeielung (s. Abb. 3.12) kann eine Geiel vorhanden sein (monotrich), wie

z.B. bei Vibrio cholerae, oder ein ganzes Geielbschcl (lophotrich), wie z.B. bei Pseudomonas fluorescens. Auch ist eine Begeielung an beiden Polen mglich (amphitrich, z.B. Spirillen). Peritrich angeordnete Geieln (s. Abb. 3.11) finden sich z.B. bei den Salmonellen, E. coli oder Proteus. Die Prfung der Beweglichkeit eines Bakterienisolates fr diagnostische Zwecke erfolgt durch Stichbeimpfung eines halbweichen (0,6%igcn) Nhragars, den bewegliche Bakterien durchwachsen, whrend unbewegliche sich nur lngs des Stichkanals vermehren. In seltenen Fllen, z.B. bei der Cholera, kann auch durch Mikroskopieren einer frischen Flssigkultur im hngenden Tropfen die Beweglichkeit geprft werden. Die Ausbildung der Geieln erfolgt nicht immer. Farbstoffe im Nhrboden wie z.B. Kristallviolett oder Brilliantgrn knnen die Geielausbildung phnotypisch unterdrcken. Durch Mutation kann es auch zu einem erblichen Verlust der Geielbildung kommen. Solche Zellen liegen dann in der O-Form vor. Zur WEIL-FELIXReaktion (s. Kap. 2.3.2) zum Nachweis von Antikrpern im Patientenserum bei Flcckficber wird z.B. der geiellose Proteus OX 19-Stamm (die Bezeichnung O deutet darauf hin, da es sich um einen Stamm in der O-Form, d.h. einer geiellosen Form, handelt; X 19 ist die Stammbezeichnung) benutzt. Bedeutung. Fr die krankmachenden Eigenschaften der Bakterien scheinen die Geieln keine groe Bedeutung zu haben. Sie sind aufgrund ihrer Proteinnatur gute Antigene. Bei den Salmonellen und anderen begeielten Bakterien werden die in den Geieln determinierten Antigene als Geiel (H)-Antigene bezeichnet. Salw7o/ie//-Bakterien rufen demnach im Organismus sowohl die Bildung von Antikrpern gegen Krper-(O)-Antigene als auch gegen H-Antigene hervor (s. Kap. 4.4). Fimbrien (Pili)
Die Zellen vieler Bakterienarten, insbesondere der gram-negativen, knnen Fimbrien, auch Pili genannt, besitzen, die krzer und dnner sind als Geieln (s. Abb. 3.3).

Abb. 3.12 Elektronenmikroskopische Aufnahme


einer Zelle von Pseudomonas aeruginosa; neben der Geiel liegen einige stbchenfrmige Pyocin-Partikeln. Elektronenmikroskop-Vergrerung 15 000:1 (Aufnahme W. LENZ ).

Sie knnen in groer Zahl (100 und mehr) vorhanden sein. Sie sind ebenfalls wie die Geieln aus einem Protein aufgebaut, das in diesem Fall Pilin genannt wird (s. Tab. 3.1).

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

169

Fimbrien spielen bei der Haftung von Bakterien, z.B. auf Schleimhuten, eine Rolle und sind fr die Kolonisation von Oberflchen wichtig.

Die Ausbildung von Fimbrien ist reversibel. ber die Bedeutung der Fimbrien s. auch Kap. 1.1.4. Neben den Fimbrien gibt es vor allem bei den Enterobacteriaceae die Fertilitts-Pili (Sex-Pili), die pro Zelle nur in wenigen Exemplaren (etwa bis 20) vorhanden sind und hohle Rhren darstellen. Die Sex-Pili finden sich bei Zellen, die einen Fertilittsfaktor, z.B. den F-Faktor, besitzen (s. in Kap. 3.3.7: Konjugation"), der den Zellen mnnliche" Eigenschaft verleiht. Die Sex-Pili sind ein Ausdruck dieser Eigenschaft. Die Zellen knnen mit Hilfe dieser Sex-Pili Kontakt mit einer weiblichen Zelle bekommen und durch diese beim Vorgang der Konjugation DNA und damit Erbmerkmale bertragen (s. Tab. 3.1).
Kapseln

Stmme einer Reihe von Bakterienarten bilden extrazellulre Polysaccharide oder andere Polymere, die der Zellwand nach auen aufliegen und Kapseln genannt werden (Tab. 3.2). Diese knnen in ihrer Dicke ein Mehrfaches des Bakteriendurchmessers ausmachen (s. Abb. 3.2. 3.3).
Die chemische Zusammensetzung der Kapseln ist bei den einzelnen Bakterienarten verschieden.

E. coli Kl und Neisseria meningitidis (Typen B und C) besitzen Kapseln aus Polymeren der NAcetylneuraminsure. Bei Streptokokken-Arten besteht die Kapsel aus Hyaluronsure, bei Klebsiellen, die schon durch ihre schleimigen, gewlbten Kolonien auffallen, aus komplexen Polysacchariden, bei Pneumokokken (Streptocoecus pneumoniae), die in der virulenten Form

immer bekapselt sind, aus stickstoffhaltigen Polysacchariden. Die Kapsel der Milzbrandbazillcn setzt sich aus einem D-Glutaminsure-Polypeptid zusammen. In einer Kapsel knnen mehrere Bakterienzellen liegen; bei den Pneumokokken ist meist ein Kokkenpaar von einer Kapsel umschlossen. Die Kapsel ist vor allem bei frisch isolierten Stmmen gut ausgeprgt. Bei manchen Bakterien wird ihre Produktion durch das Wachstumsmilieu gesteuert, so da sie bei der Anzchtung im Kulturmedium verlorengehen kann, whrend sie in Nativprparaten noch sichtbar ist. Sie lt sich nicht mit gewhnlichen Frbemethoden darstellen. Sehr geeignet zum Nachweis einer Kapsel ist das Tuscheprparat. Die Kapsel erscheint hell gegenber dem dunklen Hintergrund der Tusche. Bedeutung. In der Pathogenese von Infektionskrankheiten spielt die Kapsel eine wichtige Rolle, da sie die Bakterien vor phagozytierenden Zellen schtzt. Nicht-virulente, unbekapselte Pneumokokken-Stmme werden z.B. sofort phagozytiert. Kapseltypen. Auch innerhalb einer Spezies (z.B. Streptococcus pneumoniae, Klebsiella sp.) kann die chemische Zusammensetzung der Kapselpolysaccharide variieren. Stmme mit gleicher Kapselsubstanz bilden einen Typ. Diese Typen, die fr epidemiologische Fragestellungen Bedeutung haben, knnen mit Hilfe von spezifischen Antiseren z.B durch die Kapselquellungsreaktion nach NEUFELD (durch Anlagerung von homologem Antikrper wird im mikroskopischen Prparat gegenber den Kontrollen eine wesentlich grere Kapsel sichtbar) festgestellt werden. Bei Pneumokokken sind 83 und bei den Klebsiellen mehr als 80 Kapseltypen bekannt. Hufig ist die Virulenz einzelner Bakterienstmme mit einem bestimmten Kapseltyp korreliert. So ist z.B. von den sechs Kapseltypen des Haemophilus influenzae der Typ b bei der Meningi-

gram-positiv Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes (Gruppe A Streptokokken) Streptococcus agalactiae (Gruppe B Streptokokken) Ballus anthracis

gram-negativ Klebsiella pneumoniae Neisseria meningitidis Escherichia coli (K-Antigene) Salmonella typhi (Vi-Antigen) Haemophilus influenzae Bacteroides fragilis

Tab. 3.2 Medizinisch


wichtige kapselbildende Bakterien

170

Allgemeine Bakteriologie

der Spore vor; ihr Gehalt korreliert mit der Hitzebestndigkeit der Spore. Die Vorspore wird von der Zytoplasmamembran vollstndig umwachsen, so da eine Spore von zwei Membranen umgeben ist. Von diesen Membranen wird eine spezielle Sporenzellwand synthetisiert. Auerdem wird von der Sporenmutterzelle noch eine Proteinhlle aufgelagert. Diese mehrschichtige Umhllung, die etwa 50% der Trockenmasse der Sporen ausmacht, ist ebenfalls fr die Widerstandsfhigkeit der Spore sehr wichtig: auerdem ist bemerkenswert, da der Wassergehalt in der Spore auf ca. 15% reduziert wird, im Vergleich zu mehr als 80% in einer vegetativen Zelle. Wenn die Sporenbildung abgeschlossen ist, beginnt sich die Sporenmutterzelle durch Autolyse aufzulsen. Bakteriensporen behalten ber lange Zeitrume die Fhigkeit zur Wiederauskeimung; ber 100 Jahre alte Bodenproben enthalten noch lebensfhige Sporen.

Abb. 3.13 Elektronenmikroskopische Aufnahme


des Ultradnnschnitts einer versporten Zelle von Clostridium septicum. Elektronenmikroskop-Vergrerung 20.000:1. Spore mit mehrschichtiger Sporenhlle (Aufnahme W. LENZ).

Nachweis. Endosporen sind nur sehr schwer anfrbbar. Im mikroskopischen Prparat ungefrbter oder auch Gram-gefrbter Bakterien fallen sie jedoch sofort als stark lichtbrechende Zelleinschlukrper auf. Ihre Lage innerhalb der Sporenmutterzellc (zentral oder polar) und ihre Gre (kleinerer oder grerer Durchmesser als die Bakterienzelle) sind arttypisch und knnen fr die Diagnostik herangezogen werden.
Bedeutung der Sporen fr die medizinische Mi-

tis von Kleinkindern besonders hufig; bei Neisseria meningitidis sind vor allem die Typen A, B und C virulent. Sporen
Nur wenige akteriengattungen vermgen Sporen zu bilden, wobei die medizinisch relevanten alle in die Gattungen Bacillus (aerobe Sporenbildner) und Clostridum (anaerobe Sporenbildner) gehren. Sporen sind runde oder elliptische Gebilde (Abb. 3.13), die sich durch groe Widerstandsfhigkeit gegen Umwelteinflsse auszeichnen. Es sind keine Vermehrungsformen wie die Exosporen der Pilze, sondern Dauerformen, die der Erhaltung der Art bei ungnstigen ueren Verhltnissen dienen. Pro Zelle wird eine Spore ausgebildet, und zwar in der Zelle, weshalb sie genauer als Endosporen bezeichnet werden. Die Ausbildung einer Endospore ist ein sehr komplexer Differenzierungsproze. Er wird durch Nhrstoffmangel induziert und beginnt damit, da ein Teil des Zytoplasmas durch Invagination der Zytoplasmamembran von der brigen Zelle abgeschirmt wird. In diese sogenannten Sporenprotoplasten werden ein komplettes Genom sowie alle zur Wiederauskeimung notwendigen Makromolekle eingelagert. Auerdem wird Dipicolinsure gebildet, die als Kalziumsalz eingelagert wird und bis zu 15% der Sporentrockenmasse ausmacht. Dipicolinsure kommt nur in

krobiologie. Die Bedeutung liegt nicht nur in der Tatsache, da einige pathogene Bakterien Sporen bilden; vielmehr ist es ihre enorme Widerstandsfhigkeit, auch nichtpathogener Arten, die die aufwendigen Sterilisationstechniken fr Nhrmedien und medizinische Gerte notwendig macht (s. Kap. 2.2.4) Whrend vegetative Zellen bei Austrocknung, durch Behandlung mit Desinfektionsmitteln in blicher Konzentration oder durch Erhitzen auf 100 C absterben, bleiben Sporen unbeschadet. Andererseits sind Sporen die zuverlssigsten Indikatoren zur regelmigen Prfung der Funklionstchtigkeit von Heiluftsterilisatoren und Autoklaven (s. Kap. 2.2.4). Man verwendet dazu standardisierte Teststreifen, die mit Sporen des thermophilen Bacillus stearothermophilus beladen sind. Diese Sporen mssen innerhalb der vorgeschriebenen Sterilisationszeit (z.B. 10 Minuten bei 121 C heiem Wasserdampf oder 120 Minuten bei 160 C Heiluft) abgettet werden. Literatur
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3.2 Physiologie der Bakterien

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allen oder nur in bestimmten physiologischen Situationen bentigt werden.


Stoffwechseltypen Im Gegensatz zu den Pflanzen und den Tieren, die jeweils auf einen Ernhrungstyp festgelegt sind, zeigen die Bakterien eine erstaunliche Vielfalt.

Sie sind oft in der Lage, je nach Nahrungsangebot auf verschiedene Ernhrungsweisen umzuschalten. Zur Charakterisierung des Stoffwechscltyps werden
die genutzte Kohlenstoffquelle, die Energiequelle und der Wasserstoffdonator unterschieden. Kann der Zellkohlenstoff hauptschlich aus CO2 assimiliert werden, bezeichnet man diese Bakterien als autoiroph, whrend heterotroph solche Bakterien sind, die organische Kohlenstoffquellen bentigen. Wenn das Sonnenlicht als Energiequelle genutzt werden kann, spricht man von pholutrophen Bakterien und von chemotrophen, wenn chemisch gebundene Energie bentigt wird. Stammt schlielich der Wasserstoff bzw. die Elektronen, aus einer organischen Verbindung, so wird diese Ernhrungsweise als organolroph bezeichnet, im Gegensatz zu lithotroph, wenn anorganische Quellen wie H?S oder NH4* erschlossen werden knnen.

3.2 Physiologie der Bakterien


HANS-GEORG SAHL 3.2.1 Wachstum von Bakterien Zum Wachstum bentigen Bakterien, wie alle Lebewesen, Wasser und darin gelste Nhrstoffe. Die Nhrstoffe mssen alle chemischen Elemente enthalten, die fr den gesamten Stoffwechsel, d.h. fr die Energiegewinnung, fr den Aufbau von Zellmaterial und fr die Aktivitt von Enzymen bentigt werden.
Grundelemente und Spurenelemente

Alle fr die Medizin wichtigen Bakterien bentigen energiereiche organische Verbindungen zum Wachstum und sind somit chemo-organoheterotroph. Es wird deutlich, da sie damit nur einen kleinen Ausschnitt aus dem groen Bakterienspektrum darstellen.
Nhrstoffansprche medizinisch wichtiger Bakterien

Zu den Grundelemcnten, die in hheren Konzentrationen (> 10 4M) bentigt werden, gehren 12 der chemischen Elemente. Kohlenstoff, Sauerstoff, Wasserstoff und Stickstoff sind die Hauptkomponenten aller organischen Verbindungen. Schwefel ist in den Aminosuren Cystein und Methionin enthalten, und Phosphor ist in Form von Phosphat u.a. Bestandteil der Nukleinsuren und vieler Koenzyme des Energiestoffwechsels (z.B. ATP). Kalium als K+ ist das wichtigste anorganische Kation in der Bakterienzellc. Magnesium, Calcium, Eisen, Natrium und Chlor sind in Form ihrer Ionen (Mg2+, Ca2+, Fe2+, Fe-V, Na+ und Cl~) u.a. wichtige Kofaktoren von Enzymreaktionen oder in Enzymen selbst gebunden. Die Spurenelemente sind in Konzentrationen < 10~7M vorhanden und meist Bestandteile von Enzymen. Hierzu zhlen Zn2+, Mn2+, Ca2+, Cu2', Co2', Ni2', MoO42-, SeO32" und WO42~. Zn2+ und Mn2+ sind essentiell fr alle Bakterien, whrend die anderen Ionen nicht von

Die Ansprche der fr die Medizin wichtigen Bakterien an das Nhrstoffangebot sind sehr unterschiedlich. Es gibt solche, die mit wenigen Grundnhrstoffen wachsen, und andere, die sehr komplexe Nhrmedien bentigen. Anspruchslose heterotrophe Bakterien vermehren sich schon, wenn die N-Quelle anorganisch ist und nur
eine organische C-Quelle vorliegt. Escherichia coli z.B. wchst in einem synthetischen Nhrmedium, das auer D-Glukose nur anorganische Verbindungen enthlt: (NH4)H2PO4 1,5 g; K2HPO4 1,0 g; MgSO4 0,2 g; Glukose 2.0 g; Aqua dcst.1000 ml; pH 7,2; die bentigten Spurenelemente sind meist als Verunreinigung in den Chemikalien enthalten. Aus diesen wenigen Stoffen baut E. coli die gesamten Zellbestandteilc wie Proteine, Nukleinsuren, Polysaccharide, Lipide und niedermolekulare Metabolite auf.

Eine Reihe von Bakterien stellt aber weit hhere Ernhrungsansprche. Infolge einer Anpassung an eine parasitre Lebensweise oder

172

Allgemeine Bakteriologie

bestimmte Umweltverhltnisse haben sie die Fhigkeit der Synthese fr einen oder fr mehrere lebensnotwendige Stoffe verloren. Fr sie mssen diese Substanzen deshalb im umgebenden Milieu zur Verfgung stehen. Die fr das Wachstum unbedingt erforderlichen Bausteine, die auerhalb der Zelle verfgbar sein mssen, werden Wachstumsfaktoren genannt. Wichtige Wachstumsfaktoren fr Bakterien sind Nicotinamid, Thiamin, Riboflavin, Pantothensure, Biotin und Folsure. Aber auch p-Aminobenzoesure, Aminosuren, Purine und Pyrimidine knnen Wachstumsfaktoren darstellen. Einen sehr hohen Bedarf an Wachstumsfaktoren haben z.B. die Milchsurebakterien, die alle diese Stoffe in der Milch oder auf Schleimhuten vorfinden.
Eine extreme Form der Abhngigkeit von der Nhrstoffzufuhr zeigen obligat zellparasitre Bakterien wie die Rickettsien und die Chlamydien. Die Chlamydicn knnen z.B. keinen eigenen Energiestoffwechsel betreiben und sind auf die Zufuhr von ATP sowie einer Reihe weiterer Wachstumsfaktoren angewiesen. Sie lassen sieh auerhalb von eukaryontischen Zellen praktisch nicht anzchten.

Wachstum und Vermehrung

Unter Wachstum versteht man die irreversible Zunahme an Biomasse. Sie lt sich messen, indem man z.B. das Trockengewicht oder den organisch gebundenen Stickstoff bestimmt. Die Zunahme der Biomasse wird bewirkt durch eine Vergrerung der Bakterienzelle, bis eine Querteilung in zwei Tochterzellen erfolgt (Abb. 3.14). Die Querteilung wird wahrscheinlich eingeleitet, wenn das Verhltnis von Zellvolumen und Zelloberflche einen bestimmten, fr die einzelnen Bakterienarten unterschiedlichen Wert erreicht. Die Zeit, in der sich die Zahl der Bakterienzellen verdoppelt, wird als Generationszeit bezeichnet.
Die Generationszeit einzelner Bakterienarten ist sehr unterschiedlich und von ueren Einflssen abhngig.

In den blicherweise bei der diagnostischen Bakteriologie benutzten Komplexnhrbden, deren Grundlage Pepton, Blut oder andere organische Bestandteile darstellen, sind die erforderlichen Wachstumsfaktoren im allgemeinen bereits enthalten.

Sie kann sinnvollerweise nur whrend der exponentiellen Wachstumsphase (s.u.) bestimmt werden. Unter optimalen Bedingungen betrgt sie bei E. coli durchschnittlich 20 Minuten, bei zchtbaren Treponemen aber 4 bis 18 Stunden und bei Mycobacterium tuberculosis 18 Stunden. Die kurze Generationsdauer bei E. coli bedingt, da auf festen Nhrbden bei 37 C aus einer Zelle in weniger als 24 Stunden eine sichtbare Anhufung von Bakterien, eine Kolonie, gebil-

Abb. 3.14 Schematische Darstellung der exponentiellen Vermehrung von Bakterien. Bei Querteilung entstehen aus einer Zelle zwei Tochterzellen (aus einer Originalarbeit von W. ARBER, Zrich, Mannheimer Forum 81/82, hrsg. von Boehringer Mannheim GmbH).

3.2 Physiologie der Bakterien det wird, die viele Millionen (108 oder mehr) Zellen enthlt. Bei M. tuberculosis dagegen dauert es etwa 14 Tage oder noch lnger, bis auf geeigneten Nhrbden ein Koloniewachstum erkennbar wird. Aus dieser Tatsache geht hervor, da die kulturelle Diagnose der Tuberkulose wesentlich lnger dauert als z.B. die von
E. coli.
Wachstum in statischer Kultur

173

schlielich ein Gleichgewichtszustand erreicht, bei dem nur noch wenige lebende Zellen vorhanden sind. In diesem Zustand kann die Kultur ber Wochen oder Monate verharren.

In einem flssigen Nhrmedium erfolgt nach Einimpfen einer definierten Bakterienzahl das Wachstum in bestimmten Phasen, da sich die Bedingungen stndig ndern. Die Kinetik der Vermehrung kann grafisch dargestellt werden, wenn regelmig die Zellzahl bestimmt und als Logarithmus gegenber der Zeit in einem Koordinatensystem eingetragen wird (Abb. 3.15).
1. Anlauf- oder Latenzphase (lag-Phasc). Zunchst passen sich die Bakterien an das neue Medium an. Dann erfolgt eine Grenzunahme und schlielich beginnen Zellteilungen, die an Geschwindigkeit mit der Zeit zunehmen. 2. Die Phase des exponentiellen Wachstums (logPhase). Der Logarithmus der Zellzahl nimmt linear mit der Zeit zu. 3. Stationre Phase. Kommt es zum Mangel an einzelnen Komponenten des Mediums oder treten hemmende Stoffwechselprodukte auf, nimmt die Geschwindigkeit der Zellteilungen wieder ab. Es sterben ebenso viele Bakterienzcllen ab, wie durch Teilung hinzukommen. 4. Phase der Abnahme der Zellzahl. Hier berwiegt die Zahl der absterbenden Bakterien, wobei jedoch durch die sich auflsenden Zellen neue Nhrstoffe fr die noch lebenden Zellen entstehen. Es wird

Auch das Wachstum auf einem festen Nhrboden, bei dem eine Zelle zu einer Kolonie auswchst, ist eine statische Kultur, die nach einer bestimmten Zeit zum Stillstand kommt. Jedoch lassen sich hier die einzelnen Wachstumsphasen aus methodischen Grnden nicht verfolgen. Bakterien kommen an ihren natrlichen Standorten praktisch nie als Reinkulturen vor, es sei denn, die ueren Bedingungen sind so selektiv (z.B. der pH-Wert), da nur noch eine extrem angepate Art hier wachsen kann. Vielmehr leben sie in komplexen Mischkulturen (siehe Kapitel 3.6: Normalflora), in denen sie sich nicht so ungehindert vermehren knnen, wie es unter definierten Bedingungen in Reinkultur der Fall ist. Ein limitiertes Nhrstoffangebot, toxische Stoffwechselendprodukte und die Produktion von antagonistischen Substanzen (Bacteriocine, Antibiotika) fhren zu einer natrlichen Begrenzung des Wachstums und zu einem labilen Gleichgewichtszustand, zu dem auch der Wirtsorganismus durch seine zahlreichen spezifischen und unspezifischen Schutzeinrichtungen einen wichtigen Beitrag leistet.
Physikalische Einflsse auf das Wachstum

Es wurde bereits erwhnt, da uere Bedingungen einen entscheidenden Einflu auf das Wachstum von Bakterien haben. Es sind vor allem physikalische Parameter, wie Temperatur,

Abb. 3.15 Schematische Darstellung der Wachstumskurve einer Bakterienkultur in einer Nhrflssigkeit.

174

Allgemeine Bakteriologie

pH-Wert, Gaskonzentrationen und verfgbares Wasser, die jeweils nur in einem bestimmten Bereich ein Wachstum von Bakterien ermglichen.
Temperatur

Entsprechend ihrer Temperaturoptima kann man die bisher bekannten Bakterienarten in psychrophile (Optimum < 15 C), mesophile (20-45 C) und thermophile (> 55 C) einteilen. Naturgem liegt das Wachslumsoptimum der medizinisch bedeutsamen Bakterien im Bereich der Krperwrme (ca. 35-37 C). Andere Bakterien vermgen jedoch durch strukturelle Besonderheiten ihrer Zellkomponenten noch in Extrembereichen wie 0 C oder ber 100 C zu wachsen. Auch knnen Bakterien unterhalb 0 C ber lange Zeit am Leben bleiben, wobei jedoch kein Wachstum stattfindet. Einige medizinisch relevante Bakterien (z.B. Listerien) knnen sich allerdings noch bei Khlschranktemperaturen vermehren (Verderben von Nahrungsmitteln). Andere, wie die Meningokokken, sind auf 37 C adaptiert und wachsen schon bei Zimmertemperatur nicht mehr. Die meisten (z.B. Enterobacteriaceae) knnen aber einen breiteren Temperaturbereich nutzen. ber 60 "C werden vegetative Zellen (mit Ausnahme der thermophilen Bakterien) geschdigt; Bakterien-Sporen werden erst durch Temperaturen ber 100 C abgettet.
Wassergehalt

tion verderben. Bei der Lyophilisierung (Gefriertrocknung) wird den Mikroorganismen im tiefgefrorenen Zustand das freie Wasser nahezu vollstndig entzogen. Auf diese Weise knnen Bakterien jahrelang aufbewahrt werden, ohne ihre Vermehrungsfhigkeit zu verlieren. pH-Wert Die meisten Bakterien wachsen optimal im Neutralbereich um pH 7. Laktobazillen, die unter physiologischen Bedingungen in der Vagina dominieren, und viele Pilze bevorzugen einen leicht sauren pH-Wert (ca. pH 5) und halten ihn durch Produktion von organischen Suren aufrecht. An Extremstandorte adaptierte Bakterien (bis pH 1 und pH 14) spielen in der Medizin keine Rolle. Sauerstoff
Im Verhalten gegen Luftsauerstoff (Tab. 3.3) lassen sich die obligat aeroben Bakterien, die auf das Vorhandensein von Luftsauerstoff angewiesen sind, die fakultativ anaeroben Bakterien, die sowohl bei Gegenwart von Luftsauerstoff als auch bei dessen Fehlen wachsen knnen, und die obligat anaeroben Bakterien unterscheiden.

Wichtig fr das Wachstum von Mikroorganismen ist die Verfgbarkeit von freiem Wasser. Auch hierin sind ihre Ansprche recht unterschiedlich. Whrend sich medizinisch wichtige Bakterien nur in wrigem Milieu vermehren knnen - auch bei Wachstum auf festen Nhrboden oder in vivo auf Epithelien steht Wasser praktisch unbegrenzt zur Verfgung - knnen viele Pilze Nahrungsmittel, die durch Wasserentzug haltbar gemacht werden (z.B. Kse, Marmeladen), besiedeln und durch Aflatoxinproduk-

Medizinisch relevante Bakterien findet man in allen drei Gruppen; die meisten gehren jedoch zu den fakultativ anacroben (z.B. Enterobacteriaceae) und den obligat anaeroben Bakterien (z.B. Clostridicn). Fr alle obligat aeroben Bakterien ist der Sauerstoff zum Wachstum notwendig. Er dient im Zuge der Atmung als terminaler Elektronenakzeptor in der Atmungskette (s.u.) und kann in dieser Funktion nicht ersetzt werden. Im Gegensatz dazu knnen fakultativ anaerobe Bakterien auch andere Elektronenakzeptoren benutzen (Abb. 3.16). Fakultativ Anaerobe vermgen aber auch durch Grung Energie fr ihren Stoffwechsel zu gewinnen (s.u.). Sie knnen somit uerst flexibel unter den jeweiliTab. 3.3 Bedeutung von Luftsauerstoff fr Bakterien

Bakteriengruppe obligat Aerobe fakultativ Anaerobe

Stoffwechsel aerobe Atmung (O2 ist notwendig zur Oxidation organischer Substrate zu CO2 und H2O) aerobe Atmung (in Gegenwart von O2) Grung oder anaerobe Atmung (in Abwesenheit von O2) Grung oder anaerobe Atmung (O2 ist toxisch)

obligat Anaerobe

3.2 Physiologie der Bakterien

175

Abb. 3.16 Vereinfachtes, nicht stchiometrisches Schema des bakteriellen Stoffwechsels *)Hexosen knnen
durch Bakterien auf drei verschiedenen Wegen in Pyruvat berfhrt werden, die je nach Bakterienart in unterschiedlichem Ausma am Zuckerabbau beteiligt sind oder auch anabolische Aufgaben haben knnen: 1. Glykolyse (Emden-Meyerhof-Parnas-Weg); 2. Pentosephosphat-Weg; 3. 2-Keto-3-desoxy-6-phoshoglukonat-Weg (Entner-Doudoroff-Weg).

gen Gegebenheiten den effektivsten Stoffwechselweg benutzen und an vielen Standorten wachsen.
Fr anaerobe Bakterien ist der Sauerstoff toxisch.

Das hat folgende Grnde: Bei der Reduktion des Sauerstoffs entstehen neben H2O (Reduktion von Os durch die Zytochrom-Oxidase) auch O22" und O2 , wenn nur zwei bzw. ein Elektron auf ein OvMolekl bertragen werden, bzw. wird, wie z.B. bei Aminosure-Oxidasen oder der Xanthinoxidase. O22-, das durch Protonen-

anlagerung zu H2O2 wird, und das Superoxidradikal O2 sind jedoch toxisch. Fr ihre Entgiftung sorgen vor allem die Katalane (2 H2O? 2 H2O + O2) und die Superoxid-Dismutase H2O2 + O2); bei vielen Anae(2 O2" + 2 H+ robiern fehlen entweder beide oder nur die Superoxid-Dismutase.
Neben diesen Gruppen gibt es noch aerotolerante und mikroaerophile Bakterien. Aerotolerante Bakterien sind anaerobe Bakterien, die einen geringen Oi-Partialdruck tolerieren knnen. Mikroaerophile hingegen sind aerobe Bakterien (z.B. die Gattung Campylobacter), die jedoch nur in Gegenwart eines reduzierten

176

Allgemeine Bakteriologie

Oi-Partialdrucks (ca. 5-10 Volumenprozent) wachsen knnen.

Da der Luftsauerstoff bei den obligat anaeroben Bakterien zum Absterben fhrt, mu Untersuchungsmaterial, das auf Anwesenheit anaerober Bakterien geprft werden soll, sofort nach der Entnahme durch geeignete Manahmen vor dem Zutritt von Luftsauerstoff geschtzt werden, wenn ein optimales Ergebnis der Untersuchung erzielt werden soll. Kohlendioxid Nur die autotrophen Bakterien knnen CO2 als alleinige C-Quelle nutzen. Trotzdem vermgen viele heterotrophe Bakterien, die reduzierte CQuellen bentigen, auch CO2 in den Stoffwechsel einzuschleusen. Dies geschieht hauptschlich durch Karboxylierung des Phosphoenolpyruvats (PEP-Carboxylase und PEP-Carboxykinase) und des Pyruvats (Pyruvat-Carboxylase). Viele der medizinisch wichtigen Bakterien sind an das Wachstum im Wirtsorganismus adaptiert, wo hhere CO2-Konzentrationen als in der Luft (0,04 Volumenprozent) herrschen. So wachsen z.B. Neisserien und viele Streptokokken zumindest bei der Erstisolierung erst bei 5-10% CO2.

nen, bezeichnet man als Katabolismus. Dieser mndet in zentralen Stoffwcchsel-lntcrmedirprodukten (Phosphatestern und organischen Suren), die als Vorstufen fr Biosynthesen und fr die weitere Energiegewinnung verwendet werden. Dieser Abschnitt wird als Intermedirstoffwechsel bezeichnet. Die Reaktionen, die der Synthese von Bausteinen und dem Aufbau von zelleigencn Makromoleklen dienen, werden als Anabolismus zusammengefat. Es ist an dieser Stelle nicht mglich, die Vielzahl der bekannten Stoffwechselreaktionen zu beschreiben. Diese sind in den Lehrbchern der Biochemie und allgemeinen Mikrobiologie detailliert behandelt. Es ist lediglich beabsichtigt, die grundlegenden Prinzipien herauszuarbeiten und die Besonderheiten des bakteriellen Stoffwechsels im Vergleich zu anderen heterotrophen Lebewesen darzustellen.

Enzyme, Koenzyme und Stoffwechselregulation Die Stoffwechselschritte der Zelle werden von Enzymen durchgefhrt.
Enzyme fungieren als Katalysatoren, d.h. sie setzen die Aktivierungsenergie einer chemischen Reaktion herab und beschleunigen den Reaktionsablauf bis zum Erreichen der Gleichgewichtskonzentrationen.

3.2.2 Mechanismen des Stoffwechsels


Alle Lebewesen bentigen zur Aufrechterhaltung ihrer Lebensfunktionen die stndige Zufuhr von Energie. Die primre Energiequelle fr heterotrophe Lebewesen wie Tiere, Pilze und viele Bakterien, darunter alle potentiell pathogenen. sind Zucker und Polysaccharide, aber auch Fette und Aromaten, die von photoautotrophen Lebewesen produziert werden. Heterotrophe Organismen oxidieren die organischen C-Verbindungen zu CO2 oder organischen Suren und nutzen die dabei freigesetzte Energie zum Aufbau eigenen Zellmaterials. Die Energiespeicherung und die Energiegewinnung, der Aufbau und Abbau von Zellmalerial erfordern eine Vielzahl von chemischen Reaktionen, die hochspezifisch durch Enzyme (s.u.) katalysiert werden und in ihrer Gesamtheit als Stoffwechsel (Metabolismus) bezeichnet werden. Der Stoffwechsel lt sich vereinfacht in drei Abschnitte einteilen, die naturgem flieend ineinander bergehen (Abb. 3.16). Alle Reaktionen, die dem Abbau von organischem Material zum Ziel der Gewinnung von Energie die-

Durch sie knnen Reaktionen, die bei normalen" Temperatur- und Druckverhltnissen kaum mebar sind, mit hoher Geschwindigkeit ablaufen. Enzyme - ganz berwiegend sind sie Proteine, in seltenen Fllen auch Ribonukleinsuren - haben gegenber chemischen Katalysatoren den Vorteil der uerst hohen Spczifitt und der Regulierbarkeit ihrer Aktivitt. Es gibt einfache Enzyme, die ein Substrat binden, die Umsetzung katalysieren und die Produkte entlassen. Andere brauchen fr ihre Aktivitt Kofaktoren. die fest gebunden sein knnen (prosthetische Gruppen) oder nur bei der Katalyse mit dem Enzym in Verbindung treten (Koenzyme, Kosubstrate). Die wichtigsten Koenzyme und prosthetischen Gruppen im Stoffwechsel sind NAD, FAD, Zytochrome, Ubichinone und Chinone, sowie ATP. ADP und AMR Die genannten Koenzyme fungieren als bertrger von Elektronen bzw. Wasserstoff oder als Gruppenbertrger (z.B. Methylgruppen, Phosphatgruppen). Die Regulation des Stoffwechsels findet auf zwei Ebenen statt: Feinregulation direkt am Enzym durch Aktivierung und Hemmung der Enzymaktivitt;

dies erfolgt ber die Konzentrationen der Substrate und Produkte, sowie durch kompetitive und nicht-kompetitive Hemmung.

3.2 Physiologie der Bakterien

177

Grobregulation auf der Ebene der Transkription durch Induktion oder Repression der Enzymsynthese: Ein gut untersuchtes Beispiel dafr ist die Induktion der -Galaktosidase, einem Enzym, das Laktose zu Glukose und Galaktose hydrolysiert. Die Synthese dieses Enzyms findet bei Abwesenheit von Laktose nicht statt. Erst Laktose oder Strukturanaloge im Medium wirken als Induktoren, die letztlich die Transkription des Laktose-Operons ermglichen. Allerdings werden zahlreiche Enzyme auch in jeder physiologischen Situation gebildet (konstitutive Enzyme), und daher nicht auf der Ebene der Transkription reguliert. Stoffaufnahme Jede Zelle ist gegenber ihrer Umgebung durch eine Membran abgegrenzt, die als Permeabilittsbarriere fungiert. Fast alle Bakterien besitzen auerhalb der Membran eine Zellwand, welche die mechanische Stabilitt der Zelle gewhrleistet.
Nhrstoffe, die im Zytoplasma bentigt werden, mssen deshalb zunchst ber die Zellwand und die Zytoplasmamembran aufgenommen werden.

mende Molekl (z.B. Glukose und Fruktose bei E. coli) modifiziert. Die Energie stammt aus dem Phosphatester des Phosphoenolpyruvats (PEP), wobei die Phosphatgruppe auf den Zucker bertragen wird und dieser nach dem Transport als Zuckerphosphat in der Zelle vorliegt. Energieum Wandlung Viele der in die Zelle transportierten Nhrstoffe (z.B. Aminosuren, Zucker, Purin- und Pyrimidinbasen) werden von Bakterien nach entsprechender Aktivierung direkt in anabole Prozesse eingeschleust. Sie knnen aber auch hufig zur Energiegewinnung verwendet werden, wenn geeignetere Substrate fehlen. In der Regel gilt, da zunchst immer das am effektivsten und mit dem geringsten Aufwand zu metabolisierende Substrat verwertet wird. E. coli baut z.B. zuerst Glukose ab, bevor es andere Zucker oder gar Aminosuren nutzt. Die bevorzugten Substrate fr den Energiestoffwechsel sind die Kohlenhydrate, zuallererst die Glukose, anhand derer die Energiegewinnung heterotropher Bakterien im folgenden gezeigt werden soll. Die berfhrung der Glukose in COi und Wasser bei gleichzeitiger ATP-Synthese erfolgt im gnstigsten Fall durch Atmung in drei Abschnitten (s. Abb. 3.16): Abbau bis zum Pyruvat (Brenztraubensure); hierfr stehen Bakterien neben der universellen Glykolyse noch weitere Wege zur VerfgungAbbau des Pyruvats ber verschiedene Reaktionen mit unterschiedlichen Endprodukten (Reaktionen charakteristisch fr unterschiedliche Bakteriengruppen). Endabbau im Trikarbonsurezyklus, wenn das Pyruvat vorher zu Acetyl-Koenzym A (Acetyl-CoA) und CO2 oxidiert wird. Der Trikarbonsurezyklus ist bei vielen Bakterien, vor allem bei den grenden (s.u.), nur unvollstndig oder gar nicht vorhanden. Es kann an dieser Stelle nicht auf die einzelnen Reaktionen der Glukoseoxidation zu CO2 eingegangen werden. Wichtig fr die Betrachtung der Energieumwandlung ist, da in ihrem Verlauf die Mglichkeit besteht, ATP zu generieren. Diese ATP-Bildung im ersten Abschnitt erfolgt enzymatisch im Zytoplasma direkt am Substrat und wird deshalb als Substratphosphorylierung bezeichnet im Gegensatz zur Elektronentransportketten-Phosphorylierung an Membranen (s.u.). Bisher wurde nur der Verbleib des Kohlenstoffs betrachtet, nicht aber auf die bei der Oxidation

Polymere Substanzen (Polysaccharide, Proteine) knnen in der Regel von Bakterien nicht direkt in die Zelle geschleust werden. Sie mssen durch Enzyme, die in die Umgebung ausgeschieden werden (Exoenzyme) zuerst in Monomere oder kurze Oligomere zerlegt werden. Diese knnen per Diffusion zunchst durch die Zellwand in den periplasmatischen Raum (s. Kap. 3.1.2) gelangen. Fr die Aufnahme ber die Zytoplasmamembran stehen der aktive Transport und die Gruppentranslokation als hochspezifische und energieverbrauchende Prozesse zur Verfgung. Die Spezifitt wird durch Transportsysteme gewhrleistet, die aus mehreren Proteinen bestehen knnen.
Durch die Energieaufwendung ist es mglich, Substanzen gegen ein Konzentrationsgeflle in der Zelle anzuhufen.

Beim aktiven Transport (u.a. von Zuckern, Aminosuren, anorganischen Ionen) wird das betreffende Molekl unmodifiziert in die Zelle geschleust. Die Energie stammt aus dem ATP oder direkt aus dem Protonengradienten (s.u.). Bei der Gruppentranslokation wird das aufzuneh-

178

Allgemeine Bakteriologie

freiwerdenden Elektronen eingegangen. Diese werden auf NAD oder FAD bertragen, die danach in reduzierter Form als NADH2, bzw. FADH2 vorliegen, da jeweils zwei Elektronen transportiert werden. Die reduzierten Koenzyme mssen aber wieder oxidiert werden, um fr weiteren Glukoseabbau zur Verfgung zu stehen. In der Art, wie die Bakterien sich der Elektronen, bzw. des Wasserstoffs entledigen oder sogar die darin fixierte Energie weiter nutzen, unterscheiden sich die einzelnen Bakteriengruppen betrchtlich; die jeweils realisierten Wege lassen sich in zwei prinzipiell unterschiedliche Gruppen zusammenfassen: die Atmungen und
die Grungen.

Atmung
Organismen, die eine Atmung betreiben, nutzen das hohe Energieniveau, auf dem sich der an NAD gebundene Wasserstoff befindet, zur weiteren Energiegewinnung in Form von ATP aus.

Sie oxidieren den Wasserstoff mit O2 zu H2O, jedoch nicht in einer unkontrollierten Knallgasreaktion, wobei die Energie in Form von Wrme

frei wird, sondern stufenweise in einer enzymatisch kontrollierten Reaktion. Die an dieser Reaktion beteiligten Enzyme sind zu einem in der Zytoplasmamembran angeordneten funktioneilen Komplex, der Atmungskette, zusammengefat (Abb. 3.17). Diese besteht aus einer Reihe von Proteinen, die Elektronen- bzw. Wasserstoff-bertragende prostethische Gruppen und Koenzyme gebunden haben, bzw. binden (NAD, FAD, Chinone, Zytochrome). Eine Vorstellung ber die molekularen Mechanismen, die die Oxidation des Wasserstoffs mit der Gewinnung von ATP koppeln, liefert die chemiosmotische Theorie von MITCHELL. Danach pumpt die Atmungskette stndig Protonen aus der Zelle. Durch diesen vcktoriellen Protonentransport nach auen entsteht ber die H+ impermeable Membran ein Ladungsungleichgewicht, der sog. Protonengradient (s. Abb. 3.17). Die Energie des Wasserstoffs wird also zunchst in diesem Gradienten gespeichert, der, physikalisch gesehen, in der Lage ist, Arbeit zu leisten. Das geschieht an bestimmten Stellen in der Membran, an denen die Protonen gezielt in das Zytoplasma zurckstrmen und den Gradienten wieder ausgleichen.

Abb. 3.17 Schema der Energieumwandlung in einer aerob atmenden Bakterienzelle (nicht stchiometrisch).

3.2 Physiologie der Bakterien

179

Diese Stellen sind vornehmlich das membrangebundene Enzym ATPase und Enzymsysteme des aktiven Transports. Hier wird der Rckflu der Protonen mit der Synthese von ATP, bzw. der Aufnahme von Metaboliten gekoppelt (Abb. 3.17). Auch andere energieabhngige Prozesse, wie die Geielbewegung, werden durch den Protonengradienten getrieben. Diese Art der ATP-Bildung durch die membrangebundenen Enzyme der Atmungskette und die ATPase wird im Gegensatz zu der im Zytoplasma ablaufenden Substratphosphorylierung als Elektronentransportketten-Phosphorylienmg bezeichnet. Sie erst ermglicht die vollstndige Ausnutzung der in reduzierten organischen Verbindungen enthaltenen Energie. Anaerobe Atmung, Der Sauerstoff als terminaler Akzeptor der Elektronen kann bei Bakterien durch andere Verbindungen obligat oder fakultativ ersetzt werden. Bei der Nitratatmung werden die Elektronen auf NO.c bertragen und dieses zum N2 oder bis zum NH3 reduziert. Andere Akzeptoren sind z.B. NO2. SO42~ und andere oxidierte Schwefelverbindungen. HCO_v und Fumarat. Wenn Bakterien ber die entsprechenden bertrgerenzyme verfgen, knnen sie also auch in Abwesenheit von Sauerstoff die energetischen Vorteile der Atmung nutzen. Da hier ein membrangebundener Elektronentransport stattfindet, spricht man von einer anaeroben Atmung (s. Abb. 3.16). Grung
Wie die anaerobe Atmung verluft die Grung ebenfalls unter Ausschlu von O2.

Suregrung durch, bei der Laktat. Succinat. Azetat, Formiat, H2 und auch Ethanol und 2,3Butandiol entstehen. Bakterien der Gattung Clostridium produzieren vornehmlich Buttersure und Butanol. In Abb. 3.18 sind die wichtigsten Grungswege und Produkte zusammengefat.
Alle Reaktionen erbringen aber keinen weiteren Energiegewinn in Form von ATP, sondern dienen nur der Entfernung des Wasserstoffs.

Die Grungen sind von groer Bedeutung in der Lebensmittelindustrie. Milchprodukte wie Kse und Joghurt, Sauerkraut, Bier und Wein sind nur einige der durch mikrobielle Grungen produzierten Nahrungsmittel. Energiebilanz bei Grung und Atmung Fr grende Bakterien stellt die Substratphosphorylierung die wichtigste Form der ATP-Regenerierung dar. Wird die Glukose ber die Glykolyse abgebaut, entstehen dabei netto 2 Mol ATP pro Mol Glukose. Da aber auch andere Abbauwege mglich sind und in einigen Fllen auch Acetyl-CoA ber Acetylphosphat in Acetat und ATP berfhrt werden kann, knnen bei Grungen allgemein 1-4 Mol ATP pro Mol Glukose gewonnen werden. Atmende Organismen dagegen knnen den Wasserstoff ber die Atmungskette oxidieren. Fr den theoretischen Fall, da alle im Zuge der Oxidation der Glukose zu CO2 gebildeten Reduktionsquivalente

Jedoch findet zumindest bei der klassischen Grung keine Elektronentransportketten-Phosphorylierung statt, entweder weil den jeweiligen Bakterien die notwendigen Enzyme fehlen (obligate Grer) oder ein verwertbarer Elektronenakzeptor nicht zur Verfgung steht (fakultative Grer). Unter diesen Bedingungen stehen die Bakterien vor dem Problem, sich des Wasserstoffs zu entledigen, um NADH2 fr weiteren Glukoseabbau zu oxidieren. Der einfachste Fall, den Wasserstoff als gasfrmigen H2 freizusetzen, findet man bei einigen medizinisch unbedeutenden Arten verwirklicht. Weiter verbreitet ist die Mglichkeit, den Wasserstoff auf organische Intermedirprodukte zu bertragen und diese auszuscheiden. Bei der Milchsuregrung wird z.B. Pyruvat zur Milchsure (Laktat) reduziert. Diesen Weg gehen die Laktobazillen und einige Streptokokken. Die Enterobacteriaceae fhren eine gemischte

Abb. 3.18 Schema der Entstehung wichtiger


Grungsprodukte.

180

Allgemeine Bakteriologie

(NADH2, FADH,,) vollstndig zur ATP-Synthese genutzt werden, knnen maximal 38 Mol ATP pro Mol Glukose gewonnen werden, wenn man die durch Substratphosphorylierung gebildeten ATP addiert. Dieses dokumentiert die enorme Effizienz der Atmung im Vergleich zur Grung sehr eindrucksvoll. Allerdings knnen klassische Grer wie die Clostridien auch in gewissem Umfang einen Elektronentransport durchfhren, z.B. mit Hilfe der membrangebundenen Fumaratreduktase, die bei der Reduktion von Fumarat zu Succinat Protonen im Sinne der chemiosmotischen Theorie aus dem Zytoplasma schleust und somit einen Protonengradienten erzeugt, der zur ATPSynthese beitrgt. Dadurch wird zwar die ungnstige Bilanz der Grung im Vergleich zur Atmung verbessert, deren Effizienz jedoch nicht erreicht. Sekundrstoffwechsel Die bisher beschriebenen Stoffwechselwege zur Energiegewinnung und auch die nicht nher betrachteten Biosynthesewege der Zellbausteine und Biopolymere sind fr die Zelle essentiell. Daneben produzieren Bakterien und Pilze eine Reihe weiterer Substanzen, deren Nutzen primr nicht ersichtlich ist. Sie werden deshalb als sekundre Metabolite und die Stoffwechselwege, die zu ihrer Synthese fhren, als Sekundrstoffwechsel bezeichnet.
Die bekanntesten Produkte des Sekundrstoffwechsels sind Antibiotika, Mykotoxine und andere Wirkstoffe mit z.T. groer industrieller Bedeutung.

nen Bakterienarten angegeben (s. auch Kap. 2.3: Mikrobiologische Untersuchungsverfahren).


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3.3 Genetik der Bakterien


JRG HACKER

Bedeutung der Stoffwechselleistungen fr die Diagnostik von Bakterien Das Vermgen einer Bakterienart, einen bestimmten Stoffwcchsclweg zu beschreiten, eine bestimmte Substanz zu verwerten oder ein bestimmtes Produkt zu bilden, sind wichtige Kriterien fr eine systematische Klassifizierung und die Diagnostik der Bakterien. Soll z.B. ein Krankheitserreger identifiziert werden, so untersucht man auch seine Stoffwechselleistungen und Enzymausstattung. Man berprft z.B. das Vorhandensein von Katalase, Oxidase, das Wachstum in Gegenwart von O?, das Wachstum bei verschiedenen Temperaturen, oder das Vorhandensein von zahlreichen Enzymen. Einzelheiten sind bei der Besprechung der verschiede-

Die Genetik beschftigt sich mit den Mechanismen der Vererbung bestimmter Merkmale von einer Organismengeneration auf die nchste. Unter Gen wird ein Teilbereich der Nukleinsure verstanden, der eine bestimmte Information trgt, die meist in eine Aminosuresequenz bersetzt wird. In der Genetik wird zwischen Genotyp und Phnotyp von Organismen unterschieden. Unter Genotyp wird die Gesamtheit der genetischen Anlagen verstanden, whrend als Phnotyp die Gesamtheit der exprimierten Merkmale bezeichnet wird. Die Gesetze der Vererbung werden seit langem intensiv studiert. Mit dem Aufkommen der molekularen Genetik, vor allem aber mit der Entwicklung der Gentechnologie, haben sich viele genetische Methoden zu Standardlabortechniken entwickelt, mit deren Hilfe Probleme aus den verschiedensten Bereichen der Biologie und Medizin untersucht werden knnen. Auch unser Wissen um die Mechanismen der mikrobiellen Pathogenitt und um die Ausbreitung pathogener Erreger ist durch die Anwendung genetischer Methoden revolutioniert worden. Die Entwicklung der molekularen Genetik als relativ eigenstndige Wissenschaftsdisziplin hat die Entstehung einer Reihe von z.T. neuen Fachtermini nach sich gezogen, von denen einige in Tabelle 3.4 aufgefhrt sind.

3.3 Genetik der Bakterien

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Tab. 3.4 Erklrung einiger Begriffe aus der molekularen Genetik Aktivator BakterienChromosom Bakteriophage DNA-Polymerasen downstream Gen Genomics Genotyp, Genom Gensonde Induktor Insertionssequenz (IS) Konjugation Modifikation Mutation Operator Operon Phnotyp Plasmid Polymerase chain reaction" (PCR) Promotor Proteom Replikation RNA-Polymerase Repressor Restriktion Restriction length fragment polymorphism" (RLFP) Transfektion Transformation Transkription Transkriptom Translation Transposon upstream Regulatorprotein, bindet an DNA-Bereiche in der Nhe der Promotoren, frdert eine effektive Transkription und fhrt zur positiven" Genregulation ringfrmiges, groes, selbstreplizierendes DNA-Molekl, Trger aller wichtigen Gene eines Bakteriums Bakterien-Virus", kann nur kurze Zeit autonom existieren, Nukleinsure kann in Bakterien-Genom integrieren Enzyme, die die Neusynthese von DNA-Strngen katalysieren in Richtung auf das 3'-Ende einer DNA Teilbereich einer Nukleinsure, der eine genetische Information trgt, kann meist in eine Aminosuresequenz bersetzt werden beschreibt die Analyse der Genome von Organismen Gesamtheit aller genetischen Anlagen eines Organismus bekanntes kloniertes Gen und Teilsequenz eines Gens; wird nach Markierung als Werkzeug zur Charakterisierung von unbekannter Nukleinsure eingesetzt biologisch wirksame Substanz, die an Regulatorproteine bindet und so die Aktivitt von Regulatoren beeinflusst, kann als Co-Repressor oder Co-Aktivator wirken genetisches Element, hat die Fhigkeit zu springen (transponieren) und in das Genom zu inserieren bertragung von DNA mit Hilfe von Plasmiden von einem Spender- auf ein Empfnger-Bakterium Methylierung von DNA-Moleklen, Schutzmechanismus gegen das Wirken der Restriktion sprunghafte, ungerichtete nderung einer Nukleinsuresequenz DNA-Sequenz, zwischen Promotor und Startcodon eines Gens gelegen, dient als Bindungsstelle fr Repressoren aus mehreren benachbarten Genen bestehende Determinante, die Gene werden gemeinsam reguliert, hufig wird eine gemeinsame (polycistronische) mRNA gebildet Gesamtheit aller Merkmale eines Organismus auerhalb des Chromosoms liegendes, kleines, selbstreplizierendes DNA-Molekl, kodiert meist fr nicht-essentielle Eigenschaften Amplifizierung eines Nukleinsure-Fragments aus einem Nukleinsuregemisch durch Einsatz spezifischer Primer und einer hitzeresistenten DNA-Polymerase vor einem Gen lokalisierte DNA-Sequenz, dient als Bindungsbereich fr die RNAPolymerase Proteinkomposition eines Organismus Weitergabe der Nukleotidabfolge von Nukleinsuren von einer Organismengeneration auf die nchste DNA-abhngiges Enzym, das die Neusynthese von mRNA auf der Grundlage der DNA-Basensequenz katalysiert Regulatorprotein, das an eine Operatorstruktur bindet, behindert eine effektive Transkription und fhrt zur negativen" Genregulation Abbau von DNA mittels Restriktionsendonukleasen Unterschied im Muster von verschiedenen DNA-Moleklen nach Spaltung mit Restriktionsenzymen und Auftrennung der Fragmente im elektrischen Feld bertragung von (nackter) Bakteriophogen-DNA in Bakterienzellen bertragung von (nackten) DNA-Moleklen in Bakterienzellen mit nachfolgender Rekombination bertragung der DNA-Nukleotidabfolge auf die mRNA Gesamtheit der Transkripte (insbesondere mRNAs) eines Organismus bersetzung der RNA-Basensequenz in eine Aminosuresequenz von Proteinen springendes (transponierbares) genetisches Element, trgt zustzliche Gene in Richtung auf das 5'-Ende einer DNA

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Allgemeine Bakteriologie

Es sind vor allem drei Makromolekle, die in der Genetik von Interesse sind. Die Desoxyribonukleinsure (DNS, engl. deoxyribonucleic acid", DNA) fungiert bei den meisten Organismen, darunter auch bei Bakterien, als Trger der genetischen Information. Diese Information wird im Verlauf eines als Transkription bezeichneten Prozesses in Boten-Ribonukleinsure (engl. messenger ribonucleic acid", mRNA) bersetzt. Whrend der Translation werden auf der Grundlage der in der mRNA verankerten Botschaft Proteine gebildet, die eine spezifische, schon in der DNA vorgezeichnete Aminosuresequenz besitzen. Diese von FRANCIS CRICK als Dogma der Molekularbiologie" bezeichneten Gesetzmigkeiten gelten sowohl fr Eukaryonten als auch fr Prokaryonten, also auch fr Bakterien. Dennoch unterscheiden sich die genetischen Prozesse bei Bakterien von denen der Eukaryonten in einer Reihe von Details. Eine gewisse Modifikation hat das Dogma" DNA zu mRNA, mRNA zu Protein" durch die Entdeckung der Reversen Transkriptase erfahren. Mit Hilfe dieses Enzyms ist es mglich, RNA, die bei bestimmten Tumorviren als genetisches Material vorkommt, in DNA umzuschreiben.

3.3.1 Struktur der DNA


Das bakterielle Genom besteht aus DNA. Die DNA selbst ist aus Nukleotiden aufgebaut, die durch Phosphodiesterbrcken miteinander verbunden sind. Ein Nukleotid wiederum besteht aus einer Purinbase (Adenin oder Guanin) oder einer Pyrimidinbase (Cytosin oder Thymin), einem Phosphatanteil und einem Zucker (Desoxyribose). Das Zucker-Phosphatgerst der DNA wird ber die 3'- bzw. die 5'-OH-Gruppen der Pentosen miteinander verknpft, wodurch das Molekl eine Polaritt erhlt. DNA-Molekle sind in der Regel doppelstrngig aufgebaut (Abb. 3.19). Die Basen eines Stranges der DNA paaren komplementr ber A-T- bzw. G-CBrcken mit den entsprechenden Basen des zweiten Stranges, die Paarung erfolgt ber Wasserstoffbrckenbindungen. So entsteht das DNA-Molekl mit zwei rechtsgngig umeinander gewundenen Strngen, wie es von WATSON und CRICK 1953 vorgeschlagen wurde. Bedingt durch die Struktur einer Doppelhelix bildet ein DNA-Molekl nun zwei Furchen, die sog. major groove" und die minor groove". Diese Furchen spielen eine wichtige Rolle bei der Interaktion von DNA-Moleklen mit anderen Makromoleklen, beispielsweise mit DNA-Bindeproteinen, deren Wirken fr die Regulation von Genen eine groe Bedeutung hat.

3.3.2 Das bakterielle Genom


Zum Genom von Bakterien zhlen das Bakterienchromosom und extrachromosomale Elemente, beispielsweise Plasmide oder Prophagen. Im Jahre 1995 wurde erstmals die gesamte DNA-Sequenz eines Bakteriums, des Meningitis-Erregers Haemophilus influenzae publiziert. Seitdem sind die Totalsequcnzen weiterer medizinisch bedeutsamer Bakterien, aber auch die Sequenzen von Escherichia coli K-12 und von Saccharomyces cerevisiae bestimmt worden; auch die Bestimmung der vollstndigen DNASequenz des menschlichen Genoms schreitet voran (Tab. 3.5). Diese Flut neuer Informationen hat eine neue Disziplin, Genomics", entstehen lassen, die sich mit der Struktur und Organisation von Genomen beschftigt. Ausgehend von der DNA-Sequenz einzelner Organismen wird die Gesamtheit der mRNA-Molekle im Transkriptom" und die Protein-Komposition eines Organismus im Proteom" erfat (Abb. 3.20).

Abb. 3.19 Modell einer DNA-Doppelhelix und


Darstellung der Replikation. Im unteren Bereich dienen die beiden voneinander gelsten Strnge als Matrize fr die Neusynthese. Abkrzungen: A, Adenin; C, Cytosin; C, Guanin; T, Tyrosin.

3.3 Genetik der Bakterien

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Tab. 3.5 Genome verschiedener Organismen Organismus Bakteriophage X 1 74 Lnge 1,7 um 61 (im 61 (im 400 (im 500 pm 1360 um 2700 um 5 mm 50 mm 1000 mm 1000 mm Kilobasenpaare 5,3 180 580 1660 1830 4600 9500 13 000 130000 3 000000 3 000000 DNA-Sequenz liegt vor liegt vor liegt vor liegt vor liegt vor liegt vor teilsequenziert liegt vor liegt vor teilsequenziert liegt vor

Bakteriophage T4 Mycoplasma genitalium Helicobacter pylori Haemophilus influenzae Escherichia coli Myxococcus xanthus Saccharomyces cerevisiae Drosophila Maus Mensch

Die Gre von DNA-Moleklen wird meistens


in Basenpaaren (bp) oder in Kilobasenpaaren

(kbp) angegeben. Die Analyse bakterieller Genom-Sequenzen zeigt, da bakterielle Genome eine Gre von ca. 600 kbp (Mycoplasma genitalium, siehe Tab. 3.5) bis zu 9.500 kbp {Myxococcus xanthus) haben knnen. Das Escherichia co//'-Genom hat eine Gre von 4.600 kbp. Ein Groteil des bakteriellen Genoms besteht aus kodierenden Sequenzen, die auch als open reading frames" (ORFs) bezeichnet werden und die oftmals identisch mit Strukturgenen sind. Das .-co//-Genom weist 4405 ORFs auf. In den nchsten Jahren werden die Totalscqucnzen der Genome von 100-150 Organismen erwartet. Die zutage tretenden Informationen werden zur Aufdeckung neuer Gene und Genfamilien, zur Beantwortung von Fragen der Evolutionsbiologie, aber auch zur Identifizierung neuer Targets fr die antimikrobielle Chemotherapie fhren.

Neben den Strukturgenen trgt das bakterielle Genom auch die Informationen fr sich wiederholende (repetitive) Sequenzen, die eine Rolle bei der Genregulation spielen knnen. Weiterhin sind springende Gene" (IS-Elemente, Transposons) auf dem Bakterienchromosom lokalisiert.
Das Bakterienchromosom bertrifft in seiner Lnge eine prokaryontischc Zelle um das 500 bis lOOOfachc. Um trotz dieser Grenverhltnisse eine Verpackung" des Chromosoms in der Zelle zu gewhrleisten, liegt das Molekl in gedrillter Form vor. Die DNA befindet sich aber nicht wie bei Eukaryontcn in einem Zellkern, sondern sie liegt als enggepacktes Knuel frei im Zytoplasma. Die Topologie von DNAMoleklen wird durch das Wirken von zwei Enzymen, der Topoisomera.se I und der Topoisomerase II (Gyrase) bestimmt. Whrend die Gyrase superhelikale Windungen in die DNA einbaut, ist die Topoisomerase I in der Lage, gespannte DNA zu entspannen. Diese Enzyme spielen eine Rolle bei der Transkription, der Rekombination und der Replikation der DNA. Interes-

Abb. 3.20 Schematische Darstellung zur umfassenden genetischen Analyse von Mikroorganismen.

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Allgemeine Bakteriologie

santerweise reagieren bestimmte Antibiotika, die Gyrasehemmer genannt werden, beispielsweise Nalidixinsure und Chinolone, mit einer Untereinheit der Topoisomcrase II, was zu einer Blockierung der DNAReplikation und damit zu einem bakteriziden Effekt fhrt. Punktmutationen innerhalb von Gyrasegenen fhren wiederum zur Ausbildung von Resistenzen gegenber solchen Antibiotika.Weiterhin spielen fr die Packung von bakterieller DNA basische Proteine eine Rolle. Einer dieser Faktoren, das H-NS-Protein, trgt ber eine Vernderung der DN A-Topologie zur Regulation bestimmter Gene bei. Das H-NS-Protein wird von einem Genlocus kodiert, der als osml. (osmotic regulation") bezeichnet wird, da er ursprnglich bei der Suche nach Mutanten, die die Osmoscrcgulation von Bakterien beeinflussen, identifiziert wurde. Einige dieser o.vmZ-regulierten Loci kodieren fr Faktoren, die einen Beitrag zur Virulenz von palhogenen Enterobakterien leisten.

3.3.3 Semikonservative Replikation der DNA


Die genetische Information, die durch die Nukleotidabfolge in der DNA reprsentiert wird, mu von einer Organismengeneration auf die nchste weitergegeben werden. Dieser Proze, der als identische Replikation der DNA-Sequenz bezeichnet wird, ist eine wesentliche Grundlage fr die Konstanz der biologischen Arten. Wichtige Experimente zur Replikation der DNA sind um 1960 von MESFXSON und STAHL und von CAIRNS und Mitarbeitern durchgefhrt worden. Bei der Replikation kommt es an einer bestimmten chromosomalen DNA-Sequenz, dem sog. origin of replication", zu einer Trennung der beiden DNA-Strnge (s. Abb. 3.19). Die alten Strnge stellen jeweils die Matrizen (templates") fr die Synthese der beiden neuen DNA-Strnge dar. Da das DNA-Molekl nach erfolgter Replikation aus einem alten (konservierten") und einem neuen Strang besteht, spricht man auch von semikonservativer Replikation. Ausgehend von der sog. Replikationsgabel" erfolgt die Replikation des Chromosoms in beide Richtungen (bidirektional). Die Replikation der DNA ist ein sehr komplizierter
Proze, an dem ber 20 unterschiedliche Enzyme beteiligt sind. Zunchst wird durch eine DNA-abhngige RNA-Polymerase (Primase) ein kurzer RNA-Einzelstrang synthetisiert. Dieses Oligonukleotid paart mit einem entwundenen DNA-Einzelstrang und bildet einen Startpunkt (primer") fr die Neusynthese der DNA. Der DNA-Primcr wird spter entfernt. Bei der Synthese neuer DNA wird vor allem ein Enzym wirksam: die DNA-Polymerase III. Da das Wachsen der DNA-Strnge immer in 5'-3'-Richtung erfolgt, kann

ein Strang kontinuierlich synthetisiert werden, die Synthese am anderen Strang dagegen mu diskontinuierlich erfolgen. Die neu synthetisierten DNA-Fragmente (OKAZAKi-Fragmcnte) an diesem Strang werden dann durch eine Ligasc miteinander verbunden. Interessanterweise besitzt die DNA-Polymerase III auch eine 3'-5'-Exonukleasc-Aktivitt, so da eine fehlerhafte Replikation in vielen Fllen repariert werden kann (proofreading"). Neben dieser Form der bidirektionellen, semikonservativen Replikation des Chromosoms ist bei Plasmiden und Bakteriophagen auch das sog. rolling circle model" der Replikation bekannt. Hier beginnt die Replikation des zirkulren DNA-Molekls mit einem nukleolytischen Schnitt an einem Strang. Von diesem Wachstumspunkt aus erfolgt die Neusynthese der DNA. Im Verlauf der Replikation kommt es zu einer vollstndigen Verdrngung eines Einzelstranges aus dem zirkulren Molekl. Durch die Synthese eines zum verdrngten Strang komplementren Stranges entsteht dann wiederum ein doppclslrngiges DNAMolekl. Um eine kontinuierliche DNA-Replikation bei einem fest fixierten Ort der Synthese zu gewhrleisten, mu sich der innere Ring der DNA drehen, damit dem Replikationsapparat stets neue Nuklcotidsequenzen zur Verfgung stehen.

3.3.4 Transkription
Ein Schlsselvorgang bei der Realisierung der genetischen Information ist die bertragung der Nukleotidabfolge von DNA auf messenger"RNA (mRNA). Dieser Vorgang wird Transkription genannt. Die RNA ist hnlich aufgebaut wie die DNA, allerdings kommt als Pentose nicht Desoxyribose sondern Ribose vor. Weiterhin wird Uracil statt Thymin als Pyrimidinbase in die Nukleinsure eingebaut. Neben der mRNA, die als einstrngiges Molekl vorliegt, sind zwei weitere RNA-Spezies bekannt: die Transfer-RNA (tRNA) und die ribosomale RNA (rRNA).
Die tRNAs sind fr die Synthese der Proteine von Bedeutung. Die rRNAs sind Bestandteile der Ribosomen. Die 16S RNA spezifischen Gene, die fr die 16S rRNAs kodieren, sind bei Prokaryonten stark konserviert. Allerdings treten auch geringe Unterschiede zwischen den 16S RNA spezifischen Genen unterschiedlicher Arten auf, so da die Sequenzen dieser Gene zur Artbestimmung mit herangezogen werden. Weiterhin stellen rRNA-Molekle Zielstrukturen fr die Spezies-spezifische Identifizierung von Bakterien mit Hilfe von DNA-Sonden dar.

Essentiell fr die Synthese der mRNA und damit fr die Realisierung der genetischen Information ist die DNA-abhngige RNA-Polymerase. Dieses Enzym besteht aus mehreren Untereinheiten und ist in der Lage, unter Beteiligung des sog. Sigma-Faktors an eine spezifische DNA-Se-

3.3 Genetik der Bakterien

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quenz, den sog. Promotorbereich zu binden (Abb. 3.21). Promotoren sind vor den kodierenden Bereichen der Gene lokalisiert. Sie zeigen sog. Konsensus-Sequenzen, die bei E. coli 10 Nukleotide (-10 Region oder PRIBNOW-BOX) bzw. 35 Nukleotide (-35 Region) stromaufwrts von den mRNA Startpunkten liegen. Die Basenabfolge der idealen" E. coli -10-Box lautet TATAAT, die Sequenz der -35-Box ist TTGACA. Oftmals sind weitere DNA-Sequenzen und zustzliche Proteine bei der Bindung der RNAPolymerase an die Promotoren beteiligt. Mit Hilfe verschiedener Methoden ist es heute mglich, den genauen mRNA-Startpunkt fr bestimmte Gene zu identifizieren und so auch die Konsensus-Sequenzen fr die Promotoren festzulegen. Wenige Nukleotide vor dem Startcodon fr prokaryontische Gene (ATG) ist die sog. Shine-Dalgarno" (SD)-Sequenz lokalisiert, die bei der Translation eine Bedeutung hat und als Bindungsstelle fr das Ribosom verwendet wird.
Die mRNA-Synthese erfolgt nach Aulwindung des DNA-Molekls stets am sog. codogenen Strang" in 3'-Richtung. Am Ende der kodierenden Bereiche bilden sich hufig Terminationsstrukturen aus, die ein Ablsen der RNA-Polymerase von der DNA zur Folge haben. Die Terminatoren bestehen aus palindromischen (spiegelbildlichen) Nukleotidsequenzen, die eine Haarnadelstruktur ausbilden knnen. Einige Antibiotika (beispielsweise Rifampicin) sind in der Lage, die RNA-Polymerase zu inaktivieren und so eine antimikrobielle Wirkung zu erzielen. Im Gegensatz zu eukaryontischen Organismen knnen bei Bakterien sowohl Gene einzeln als auch en bloc transkribiert werden. Mehrere hintereinanderliegende Gene werden als Operon bezeichnet. Man spricht auch von monocistronischen bzw. polycistronischen mRNAs. Bei eukaryontischen Organismen kennt man noch den Vorgang des splicings", bei dem die kodierenden Bereiche (Exons) aus einem GesamtmRNA-Molekl herausgeschnitten und neu zusam-

mengesetzt werden. Die nicht-kodierenden Bereiche werden dabei als Intron-Bereiche bezeichnet. Das Transkriptom

Einhergehend mit der Analyse der vollstndigen DNA-Sequenzen einzelner Organismen (Genotnics") verspricht die mglichst vollstndige Erfassung der mRNA-Molekle eines Organismus in Form von Transkriptomen neue Erkenntnisse ber die Expression von Genen. Dabei spielt der Einsatz von Mikroarrays oder Bio-Chips" eine groe Rolle (s. Abb. 3.20). Auf die Chip-Matrices knnen viele (bis zu mehreren tausend) DNA-Sequenzen, reprsentiert durch Oligonukleotide auf engsten Raum (z.B. 1 mm2) aufgebracht werden. Diese verschiedenen Oligonukleotide knnen etwa ein Genom oder Teile davon reprsentieren. Nach Hybridisierung von isolierter mRNA oder umgesetzter cDNA eines Mikroorganismus mit einer solchen Chip-Matrix lt sich ein Expressionprofil ganzer Genome erstellen. In Zukunft wird diese Technologie auch dazu dienen, in einer erweiteren Analyse fr Infektionserreger die Expression von Virulenzgenen (z.B. Toxin-Genen) oder von Resistenzgenen zu bestimmen.

3.3.5 Translation
Im Verlauf der Translation wird die Basensequenz der mRNA in die Aminosuresequenz der Proteine bersetzt. Whrend bei Eukaryontcn Transkription und Translation zu unterschiedlichen Zeiten an unterschiedlichen Orten (Zellkern und Zytoplasma) stattfinden, gehen beide Prozesse bei Prokaryonten ineinander ber. Orte der Eiweisynthese sind Multienzymkomplexe aus RNA und Proteinen, die sog. Ribosomen. An bestimmte Stellen der Ribosomen kn-

Abb. 3.21 Schematische Darstellung eines Promotor-Bereiches von Escherichia coli. Es sind die KonsensusSequenzen (-35-Region, -10-Region), das Startnukleotid fr die mRNA, die Ribosomen-Bindungsstelle (Shine-Dalgarno-Sequenz, SD) und das Startcodon fr den kodierenden Bereich dargestellt.

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Allgemeine Bakteriologie

nen nun mRNA-Molekle und mit Aminosuren beladcne Transfer-RNA-Molekle binden, um die Translation zu initiieren. Innerhalb einer mRNA-Basensequenz sind jeweils Dreiergruppen von Nukleotiden (sog. Codons oder Tripletts) spezifisch fr eine Aminosure. Spiegelbildlich zu diesen Codons besitzen die tRNA-Molekle sog. Anticodons, die mit den korrespondierenden Dreiersequenzen der mRNA paaren knnen. Die Tatsache, da bestimmte Codons fr nur eine Aminosure kodieren, wird als genetischer Code bezeichnet. Mit wenigen Ausnahmen gilt der genetische Code universell, d.h. er ist fr alle Lebewesen gltig. Bei Bakterien ist noch die Tatsache von Interesse, da das Codon AUG (selten auch GUG), das fr die Aminosure Methionin kodiert, als Startcodon gilt (s. Abb. 3.21) und da die Codons UAA, UAG, sowie UGA als Stoppsignale verwendet werden. Aufgrund der Tatsache, da es zwar 21 Aminosuren, aber (abzglich der Stoppsignale) 61 mgliche Tripletts gibt, werden fr bestimmte Aminosuren mehrere Codons verwendet. Dieses Phnomen wird auch als Degeneriertheit des genetischen Codes" bezeichnet. Der Gebrauch einzelner Codons (codon usage"') kann typisch fr bestimmte Organismen sein. Der Translationsproze selbst lt sich in die Phasen Initiation, Elongation und Tcrmination unterteilen. Nach erfolgter Eiweisynthese kommt es zu einem Ablsen der neu synthetisierten Polypeptidkette sowie der tRNA- und der mRNA-Molekle von den Ribosomen.
Das Proteom

3.3.6 Mutationen
Mutationen werden definiert als sprunghafte, angerichtete Vernderungen der Nukleinsuresequenz. Mutationen fhren zu Vernderungen des Genotyps eines Organismus. Mutationen knnen, mssen aber nicht notwendig zu einer nderung des Phnotyps, also zu einem neuen Merkmal fhren. Generell gilt, da die Mutationsbildung eine treibende Kraft der Evolution darstellt, da durch mutative Ereignisse immer wieder neue Varianten eines Merkmals herausgebildet werden knnen, die dann der Selektion unterliegen. Dies gilt letztlich auch fr Virulenz-assoziierte Gene, die durch Punktmutationen eine Vernderung erfahren knnen und die so fr funktioneil unterschiedliche Produkte kodieren knnen. Unterschiedliche mutative Formen eines Gens werden auch als Allele bezeichnet, wobei zwischen dem Ausgangsgen, dem Wildtyp-Allel und dem Mutanten-Allel unterschieden werden mu. Verschiedene Allele eines Gens fhren zu einem genetischen Polymorphismus. Mutationen knnen spontan auftreten, wobei die Mutationsrate (mutatives Ereignis in einem Gen, in einer Generation) bei Bakterien zwischen 10 6 bis 10""' liegen kann. Daneben knnen Mutationen auch durch verschiedene mutagene Substanzen induziert werden. Zu diesen Mutagenen gehren desaminierende Substanzen wie salpetrige Sure sowie alkylierende Verbindungen wie lhylmethansulfonat (EMS) oder N-Mcthyl-N-Nitro-Nitroso-Guanidin (MNNG). Auch Farbstoffe wie Akridinorange und ionisierende Strahlen (Rntgenstrahlen, Gamma-Strahlen) knnen Mutationen auslsen. Die mutative Wirkung einzelner chemischer Verbindungen oder Strahlen kann mit Hilfe des bakteriologischen Arnes-Tests analysiert werden. Aufgrund der Vernderungen der Basensequenz eines Gens knnen unterschiedliche Typen von Mutationen unterschieden werden (Abb. 3.22). Erfolgt bei einer Mutation der Austausch einer Purinbase durch eine andere (oder einer Pyrimidinbase durch eine andere), so spricht man von
Transitionen. Im Gegensatz dazu sind Transver-

In Analogie zu den Begriffen Genom und Transkriptom wurde 1995 der Terminus Proteom" eingefhrt, der die Gesamtproteinkomposition eines Organismus beschreibt. Mit Hilfe neuer oder verbesserter Analyse- und Auswertungstechniken wie der zweidimensionalen Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-Gele) und der Massenspektrometrie lassen sich Protein-Karten fr einzelne Organismen erstellen (s. Abb. 3.20). So konnten fr die 4405 E. coli K-12-ORFs mittlerweile 1600 Proteine durch ihre Position auf dem 2D-Gel erfat werden. Mittels Proteom-Analyse lassen sich Regulationskaskaden bestimmen, die Quantitt einzelner Proteine kann studiert werden, Effekte von Mutationen knnen analysiert und posttranslationelle Modifizierungen knnen vorhergesagt werden.

sionen Austausche von Purinbasen gegen Pyrimidinbasen oder umgekehrt. Bedingt durch die Degeneriertheit des genetischen Codes mssen Austausche von einzelnen Basen, die als Punktmutationen bezeichnet werden, nicht in jedem Falle eine nderung der Aminosuresequenz nach sich ziehen. Der Austausch von Basen, die in dritter Position eines Codons stehen, fhrt

3.3 Genetik der Bakterien

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zwar zur nderung der Nukleotidsequenz, diese nderung mu aber nicht notwendigerweise zur Aminosuresequenznderung fhren. Bleibt die Aminosuresequenz konstant, so wird diese Mutation als neutral" bezeichnet. Bei echten Punktmutationen kommt es dagegen zu Vernderungen der kodierenden Nukleotidsequenzen und zur Entstehung neuer Proteinvarianten. Dabei kann es sich um missense"-Mutationen handeln, die durch einen Nukleotidaustausch zu einem vernderten Protein fhren. Bei nonsense"-Mutationen wird dagegen ein neues Stopcodon generiert, das zu einem Abbruch der Proteinbiosynthese fhrt. Darber hinaus sind nderungen des Leserahmens (sog. Raster- oder irame shift"-Mutationen) bekannt, bei denen es zur Insertion oder Deletion von Basen kommt. Durch diese Mutationen knnen vllig neue Proteine oder verkrzte Polypeptide entstehen.
Punktmutationen knnen auch zu einer nderung der Basensequenz von virulenzassoziierten Genen bei Mikroorganismen und damit zu funktionell vernderten Proteinen fhren. Eine groe Rolle spielen solche Mutationen bei Viren, etwa beim Auftreten von Resistenzen gegenber antiviralcn Substanzen (z.B. ProtcaseInhibitor-Resistenzen bei HIV). Auch die Expression bestimmter bakterieller Virulenzgene, etwa von Membranproteinen bei N. gonorrhoeae kann auf "frame shiff'-Mutationen und dadurch bedingter Expression bzw. Nicht-Expression des entsprechenden Gens zurckzufhren sein. Mit Hilfe neuer molekularbiologischer Verfahren ist es mglich, die Sequenzen einzelner Gene gezielt zu verndern (site directed mutagenesis"), um so den Einflu bestimmter Aminosuremotive oder Domnen auf die Funktion von Proteinen zu untersuchen. Mutationen mssen nicht in jedem Fall zu nderungen von Mcrkmalskomplexen fhren. Neben den neutralen"' Mutationen werden gelegentlich echte Reversionen beobachtet, bei denen es zu Rckmutationen zum Wildtyp-Allel gekommen ist. Daneben sind Suppressionen bekannt, in deren Verlauf eine zweite Mutation die erste mutative Vernderung ausgleicht. Als Gegenspieler" der Mutationsfhigkeit haben sich im Laufe der Evolution Reparaturmechanismen herausgebildet, die in der Lage sind, DNASchden zu erkennen und zu beheben. Einmal ist hier die Photoreaktivierung bekannt, in deren Verlauf unter Einwirkung von Licht Pyrimidin-Dimere, die durch UV-Einwirkung entstanden sein knnen, gespalten werden. Im Zuge der Dunkelreaktivierung werden schadhafte DNA-Bereiche enzymatisch eliminiert und durch neu synthetisierte Abschnitte ersetzt. Abb. 3.22 Darstellung verschiedener Typen von Punktmutationen (verndert nach KNIPPERS, 1997).

Transpositionen Transpositionen stellen eine besondere Form von Mutationen dar, bei denen ein springendes

Gen" (Insertionssequenz, Transposon) in eine definierte Ziel (target")-Sequenz des Genoms inseriert. Durch diese Transpositionsereignisse knnen Gene inaktiviert, aktiviert, deletiert oder amplifiziert werden. Das einfachste springende Gen stellt die Insertionssequenz (IS; auch IS-Element) dar. Wie in Abb. 3.23 dargestellt, wird von einem IS-Elemcnt das Enzym Transposase kodiert, das den Transpositionsvorgang selbst katalysiert. Die inverted repeats" an den Enden des IS-Elementes interagieren whrend des Transpositionsvorganges mit der TargetDNA-Sequenz im Genom. Neben den IS-Elementen sind auch etwas komplizierter aufgebaute genetische Elemente, die Transposons in der Lage, zu transponieren. Transposons tragen neben der genetischen Information, die fr die Transposition verantwortlich ist, zustzliche Gene, meistens solche, die Resistenzen gegen Antibiotika determinieren. Insofern spielen Transposons eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Ausbreitung von Antibiotika-resistenten Krankheitserregern. Man unterscheidet zusammengesetzte" Transposons (Klasse-I-Transposons), die an den Rndern jeweils identische oder sehr hnliche IS-Elemente tragen, von einfachen" Transposons, an deren Enden inverted repeats" lokalisert sind (s. Abb. 3.23). Darberhinaus sind konjugative Transposons bekannt, die neben der Transposition auch die Fhigkeit zur konjugativen bertragung zeigen. Integrons als eine besondere Form von transponierbaren Elementen stellen kom-

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Allgemeine Bakteriologie

Abb. 3.23 Struktur von ISElementen und Transposons. Abkrzungen: tnpA, Transponase-Cen; res, Resolvase site; tnpR, Resolvase-Cen; kan, Kanamycin-Resistenzgen; str, Streptomycin-Resistenzgen; bleo, Bleomycin-Resistenzgen; bla, -Laktamase; die oberen Pfeile geben die Transkriptionsrichtung von Genen an, die unteren Pfeile stellen IR (inverted repeats) dar.

plexe genetische Gebilde dar, die eine eigene TargetScqucnz und ein Gen, das fr eine spezifische Integrase kodiert, tragen, [ntegrons knnen so bestimmte Gene, insbesondere Resistenzgene, sammeln" und bertragen. Transposons werden in der Molekulargenetik u.a. verwendet, um mittels Transposonmutagenese Gene von Bakterien zu inaktivieren und dann funktional zu studieren.

3.3.7 Rekombination und Gentransfer Neben dem Auftreten von Mutationen sind Rekombinationsereignisse eine weitere Mglichkeit der Vernderung von genetischem Material von Bakterien. Dabei kommt es zu einem physikalischen Austausch von Nukleinsure (meist DNA) an einem bestimmten Ort des Genoms. Bei der homologen Rekombination treten Austauschprozesse an Orten gleicher oder hnlicher (homologer) DNA-Sequenzen auf. Rekombinationsprozesse spielen eine Schlsselrolle bei der Variation wichtiger Virulenzeigenschaften pathogener Mikroorganismen. Im Verlaufe dieser Prozesse knnen sich Oberflchenmolekle der Mikroorganismen (Kapseln, Fimbrien, Membranproteine) schnell hinsichtlich Expression bzw. Nicht-Expression (Phasenvariation) oder hinsichtlich der Struktur der exprimierten Varianten (antigene Variation) ndern. Diese Variationsprozesse knnen eine enorme pathogenetische Bedeutung haben. Oftmals beruhen Rekombinationen auf der bertragung von Nukleinsuren, wobei DNA

von einem Spenderorganismus (Donor) auf einen Empfnger (Rezipient oder Akzeptor) transferiert wird. Bei Genbertragungen zwischen unterschiedlichen Stmmen oder zwischen Vertretern verschiedener Arten spricht man auch von horizontalem Gentransfer". Im Gegensatz zu dem Proze der Meiose bei Eukaryonten, der mit einer Neukombination von genetischem Material verbunden ist und hufig mit sexueller Paarung einhergeht, spricht man bei Bakterien von parasexuellen Prozessen". Zu diesen genetischen Austauschprozessen bei Bakterien zhlen die Transformation, die Transduktion und die Konjugation. Die Entwicklung der Bakteriengenetik als eigenstndige wissenschaftliche Disziplin war eng verbunden mit der Aufklrung dieser parasexuellen Prozesse von Prokaryonten und mit der Ausnutzung dieser Vorgnge fr das experimentelle Arbeiten im Labor. Transformation Unter Transformation wird die bertragung von nackter" DNA in Bakterien verstanden (Abb. 3.24). Zum erfolgreichen Ablauf einer Transformation ist es notwendig, da die Empfngerzelle in einem kompetenten Zustand vorliegt, d.h. die Zellwand des Rezipienten mu permeabel fr fremde DNA sein. Nach der Aufnahme der fremden DNA kommt es zu Rekombinationsprozessen, in deren Verlauf die aufgenommene Nukleinsure in das Empfngergenom integrieren kann.

3.3 Genetik der Bakterien

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Abb. 3.24 Mglichkeiten des Gentransfers bei Bakterien, a) Transformation, b) Transduktion, c) Konjugation.

Bei gram-negativen Bakterien wird ein derartiger kompetenter Zustand u.a. durch Behandlung der Zellen mit CaCl2 erreicht. Neuerdings knnen Bakterien auch durch das Ausnutzen elektischer Felder (Elektroporation) in einen kompetenten Zustand versetzt werden. Eine Reihe von Bakterien, u.a. Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae oder Streptococcus pneumoniae liegen jedoch in einem Zustand der natrlichen Kompetenz vor. Die biologische Bedeutung dieser natrlichen Kompetenzstadien mag darin liegen, da so eine grtmgliche Variabilitt bestimmter genetischer Merkmale, etwa die Ausbildung unterschiedlicher Formen von Zeliwandanhngseln (Pili) bei N. gonorrhoeae oder die Expression der Penicillinresistenz bei Pneumokokken erreicht wird. Als Sonderform der Transformation gilt die Transfektion, in deren Folge Bakteriophagen-DNA in Bakterien transferiert wird. Die Transformation hat sich in den vergangenen Jahren zu einer Standardmethode entwickelt, um neurekombinierte DNA in Zellen zu bertragen; sie ist damit eine grundlegende Methode der modernen Molekularbiologie und der Gentechnologie. Transduktion

Bei der Transduktion als zweiter Mglichkeit des Gentransfers bei Bakterien kommt es

zur bertragung von bakterieller DNA durch Bakteriophagen (s. Abb. 3.24). Bakteriophagen sind Viren, die Bakterien als Wirtszellen verwenden. Die meisten Bakteriophagen, beispielsweise die E.coli-Phagen T4 besitzen DNA als genetisches Material, einige Phagen wie MS2 oder Q enthalten jedoch RNA-Molekle. Bakteriophagen sind in der Lage, sich durch einen lytischen oder einen lysogenen Zyklus zu vermehren. Whrend des lytischen Zyklus adsorbieren Bakteriophagen an spezifische Rezeptoren der Bakterienoberflche. Danach entlassen die Bakteriophagen ihre Nukleinsure, meist DNA, in das Zytoplasma der Bakterien. Innerhalb kurzer Zeit kommt es zu einem Umschalten" des bakteriellen Stoffwechsels auf die Bedrfnisse der Phagen. Es werden Strukturproteine der Phagen gebildet und nach Lyse der Bakterienzellwand werden einige hundert Phagenpartikel abgegeben, die jetzt ihrerseits neue Wirtsbakterien befallen knnen. Allerdings kann die DNA der Bakteriophagen auch in das Bakterienchromosom integrieren. Man spricht dann von temperenten Phagen oder Prophagen; die Weitergabe der phagenspezifischen Nukleinsure von einer Bakteriengeneration auf die nchste erfolgt dann durch Replikation des Chromosoms (lysogener Zyklus). Die Phagen-DNA kann aber auch aus dem Chromosom herausgeschnitten werden, wobei dann der lytische Zyklus neu eingeleitet wird.

190

Allgemeine Bakteriologie

Mikroorganismus Vibrio cholerae E. coli (EHEC) Corynebacterium diphtheriae Clostridium botulinum Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus

Gensymbol ctx stx dtx botC, botD speA, speC

Toxin Cholera Toxin Shiga Toxin Diphtherie Toxin otulinum-Neurotoxine C,D Erythrogene Toxine Enterotoxin A

Tab. 3.6 Bakteriophagen-kodierte Toxine

entk

Dieses Ereignis kann durch spezifische Umweltsignale induziert werden.

Bei der Exzision von Prophagen aus dem bakteriellen Chromosom knnen auch der PhagenDNA benachbarte chromosomale Sequenzen mitgenommen und auf andere Bakterienstmme bertragen werden. Dieser Vorgang wird als Transduktion bezeichnet. Bei bestimmten Phagen wie dem E. co/z'-Phagen X. werden immer die gleichen chromosomalen Gene transduzierl, da der Phage immer an einer bestimmten Stelle des Chromosoms integriert (spezielle Transduktion). Andere Bakteriophagen, wie der E. coliPhage Pl , sind in der Lage, zufllig an unterschiedliche Stellen des Chromosoms zu integrieren. Somit kann dieser Phage potentiell alle Bereiche des Chromosoms auf andere Stmme

bertragen (allgemeine Transduktion). Interessanterweisc sind viele Toxin-Genc. darunter solche, die fr sehr potente Bakteriengifte kodieren (s. Tab. 3.6), Teile von BaktcriophagenDNA. Diese Toxin-Gene knnen auch Iransduktiv bertragen und in das bakterielle Genom integriert werden.
Plasmide

Die dritte Form des Gentransfers bei Bakterien, die Konjugation, ist an die Prsenz von Plasnden gekoppelt. Plasmide sind extrachromosomal sich autonom replizierende DNA-Molekle, die sich stabil in Bakterien etablieren knnen. Sie haben eine Gre von 1,5 kb bis zu 500 kb und liegen meist in der CCC (circular covalcnt clo-

Abb. 3.25 Schema eines


transferablen Resistenz-Plasmides mit Transposon und Integron. Abkrzungen: Tra-Region, Transfer-Region; rep, Replikationsregion; ine, Inkompatibilittsregion; sull, Sulfonamid-Resistenz-Cen; IR, inverted repeats" (nach LENCELER et al., 1999).

3.3 Genetik der Bakterien

191

sed") Form vor. Plasmide knnen in einigen Spezies (u.a. Borrelia) aber auch durch lineare DNA-Molekle reprsentiert werden. Plasmide sind in 1 bis 100 Kopien in der Zelle vorhanden. Grere Plasmide sind oftmals durch Konjugation transferierbar. Das Modell eines TransferPlasmides ist in Abb. 3.25 dargestellt. Neben den Genen fr Transfer und Replikation tragen viele dieser Plasmide ein ine- (incompatibility") Gen, dessen Produkt die gemeinsame Replikation von zwei Plasmiden derselben /c-Gruppe in einer Zelle verhindert.
Plasmide knnen eine Reihe von zustzlichen" Genen tragen, die bei Krankheitserregern eine groe Bedeutung fr das Infekonsgeschchen haben. Zum einen sind Resistenz (R)-Plasmide bekannt, die oft mehrere Antibiotika-Resistenzen vermitteln. Die Resistenzgene knnen wiederum auf Transposons oder Integrons lokalisiert sein, wie dies in Abb. 3.25 dargestellt ist. Die oftmals ber Artgrenzen hinweg beobachtete bertragung von Multiresistenz-Plasmiden ist ein groes Problem in der klinischen Mikrobiologie. Darberhinaus knnen auch virulenzassoziicrtc Gene auf Plasmiden vorkommen. Wie in Tabelle 3.7 dargestellt, knnen dies Gene sein, die fr Adhsinc, Toxine, lnvasine oder Eisenaufnahmesystemc kodieren und deren Produkte direkt zur Pathogenitt der Erreger beitragen. Bei den jetzt hufig beschriebenen chromosomal kodierten Pathogenittsinseln" kann es

sich auch um integrierte und mutativ vernderte Plasmide handeln. Darber hinaus knnen Plasmidc fr eine Reihe von weiteren Funktionen kodieren (s.Tab. 3.7) von denen die Bakteriocine ebenfalls eine Bedeutung fr die Medizinische Mikrobiologie haben knnen. Mit Hilfe der Bakleriocine knnen Bakterien sensitive Vertreter der eigenen Art abtten und so einen Wachstumsvorteil in einer Bakterienpopulation erlangen.

Konjugation Zur Konjugation sind nur Bakterien befhigt, de tragen. Die tra+ Gene dieser Plasmide kodieren u.a. fr Sex-Pili". Diese Pili stellen Zellwandanhngsel von ca. 5 nm Dicke und 2 um Lnge dar. Sie sind in der Lage, Rezeptoren auf anderen, nicht plasmidtragenden Zellen zu erkennen. Nach Kontaktaufnahme von Pili und Rezeptor kann der Konjugationsvorgang beginnen. Whrend der Konjugation kommt es wahrscheinlich zu einem kurzzeitigen Verschmelzen der Zellwnde beider Konjugationspartner und zur bertragung eines Stranges der PlasmidDNA. Nach Replikation dieser Kopie in der Empfngerzellc etabliert sich das bertragene Plasmid im Rezipienten (s. Abb. 3.24).
Mikroorganismus

die transferierbare oder mobilisierbare Plasmi-

Plasmid-kodierte Funktion Konjugation Antibiotika-Resistenz Antibiotika-Produktion Bacteriocin-Produktion Physiologische Funktionen Virulenzfaktoren Toxine Adhsine lnvasine Eisenaufnahme

Beispiel F-Plasmid, verschiedene Plasmide R-Plasmide verschiedene Plasmide Col-Plasmide Nif-Plasmid Deg-Plasmide Lac-Plasmide Enterotoxin-Plasmid Cytolysin-Plasmid Tetanustoxin-Plasmid K88-, K99-, CFA-Plasmid Yop-Plasmid Ipa-Plasmid Spv-Plasmid Aerobactin-Plasmid

Tab. 3.7 Plasmid-Typen


E. coli, verschiedene Bakterien verschiedene Bakterien Streptomyceten E. colii Rhizobien
Pseudomonas

Enterobakterien E. coli Enterococcus faecalis Clostridium tetani E. coli Yersinia spp. Shigella spp. Salmonella spp. E. coli

DNA-Transfer

Ti-Plasmid

Agrobacterium tumefaciens

192

Allgemeine Bakteriologie

Besonders gut sind die Konjugationsprozesse bei F-Plasmid-tragenden (F fr Fertilitf'J E.coli-Stmmen untersucht; hnliche Phnomene werden jedoch auch durch andere Plasmide induziert und sind bei einer Reihe von pathogenen Bakterien bekannt. Neben der direkten bertragung von Plasmiden sind durch Konjugation auch Bereiche des Bakterienchromosoms von Zelle zu Zelle transferierbar. In diesen Fllen mssen die Plasmide in das Chromosom integriert sein. Bei derartigen Hfr-Stmmen (high frequency of recombination") werden dann mit Teilen des Plasmides auch angrenzende Bereiche des Donorchromosoms in den Rezipienten bertragen. Die bertragenen Sequenzen knnen durch Rekombinationsereignisse in das Empfngerchromosom integrieren. Nach HfrTransfer von F-Plasmiden und angrenzenden chromosomalen Donorsequenzen kann es auch zur Bildung von sog. F' (prime)-Plasmiden kommen. F'-Plasmide bestehen aus F-Plasmiden und Genen des Spenderchromosoms. Sie entstehen, wenn es nach Hfr-Transfer nicht zu einer Integration von Donor-DNA in das Rezipientenchromosom kommt, sondern wenn F-Plasmid und bertragene benachbarte Donorsequenzen im Rezipienten zyklisieren und so ein neues extrachromosomales Element - das F'-Plasmid bilden, das nun seinerseits transferabel ist. Experimente mit Hfr-Stmmen und F'-Plasmiden werden in der Bakteriengenetik u.a. durchgefhrt, um Genkarten von Chromosomen unterschiedlicher Bakterien zu erstellen (chromosomal mapping").

Endonukleasen. Fremde, beispielsweise durch Gentransfer eingefhrte DNA, die nicht methyliert ist oder die an anderen Stellen Methylgruppen trgt als die eigene DNA, kann dem Restriktionsproze unterworfen sein und somit abgebaut werden.

3.3.9 Genetische Regulationsmechanismen


Die meisten Gene von Bakterien werden nicht stndig exprimiert, sondern ber fein abgestimmte Mechanismen in ihrer Aktivitt reguliert. Signale fr die Genregulation sind hufig Umweltfaktoren wie Temperatur, lonenstrkc, Osmolaritt oder die Zusammensetzung des Nhrmediums. Einige Gene tragen zwischen ihren Promotoren und dem Startcodon der entsprechenden Gene (ATG) eine DNA Sequenz, die als Operator bezeichnet wird (Abb. 3.26). An diese Sequenz knnen Proteine binden, die als Repressoren bezeichnet werden. Besetzt ein Repressor-Protein die Operator-Sequenz, so wird die RNA-Polymerase bei ihrer Bindung an die DNA massiv behindert, so da eine effektive Transkription nicht mglich ist. Durch die Wirkung eines Repressors wird das entsprechende Gen negativ" reguliert. Hufig sind die Repressor-Molekle jedoch nur aktiv, wenn sie ihrerseits an einen Co-Repressor binden. Andererseits knnen sog. Induktoren Repressoren daran hindern, an die jeweilige Operatorsequenz zu binden.
Im Falle des Tryptophan (frp)-Operons beispielsweise kann der Repressor die Aminosure Tryptophan als Co-Repressor binden; erst nach dieser Bindung kommt es zu einer Interaktion zwischen Repressor und Operator und damit zu einer Repression des IrpOperons. Durch diesen Mechanismus ist sichergestellt, da das Gen nur bei entsprechendem Bedarf (Tryptophan-Mangel) aktiv ist. Gene, die fr Enzyme des Synthesestoffwechsels kodieren, werden hufig durch die entsprechenden Endprodukte in ihrer Aktivitt reguliert. Aber auch Gene, die eine Bedeutung fr die Pathogenitt von Bakterien haben, knnen durch CoRepressoren negativ reguliert werden. Ein Beispiel dafr ist das Fr (ferric uptake regulator")-Protein. das Bedeutung fr die Regulation von Eisenaufnahmesystemen, aber auch von anderen Virulenzfaktoren wie Toxinen hat. Als Co-Repressoren binden Fc2~-Ionen an das Fur-Protein, das dann die entsprechenden Gene blockiert. Bei Eisenmangel wiederum werden die Fur-regulierten Gene aktiv, da unbeladene FurProteine nicht an die Promotorbereiche binden knnen. Im Gegensatz zu diesen Beispielen werden Gene, deren Produkte am Zellkatabolismus teilhaben, oft von

3.3.8 Restriktion und Modifikation


Im Zusammenhang mit Gentransfer und Rekombinationsereignissen bei Bakterien spielen Restriktions- und Modifikationsprozesse eine Rolle. Bakterien synthetisieren artspezifisch, in Ausnahmefllen stammspezifisch Enzyme, die als Restriktionsendonukleasen bezeichnet werden. Diese Enzyme, die als grundlegende Werkzeuge der Gentechnik groe Bedeutung erlangt haben, schneiden DNA-Molekle an bestimmten Nukleotidabfolgen. Hufig zeigt jedoch die homologe DNA eines Bakteriums oder eines Phagen an diesen Target-Sequenzen Methylierungen, die von Modifikationsenzymen determiniert werden. Ein bestimmtes Methylierungsmusler der DNA kann charakteristisch fr eine bestimmte Spezies sein, es schtzt die homologe Nukleinsure vor dem Abbau durch die eigenen

3.3 Genetik der Bakterien

193

Abb. 3.26 Darstellung genetischer Regulationsmechanismen.

Verbindungen, die durch die Genprodukte umgesetzt werden, induziert. Dies geschieht im Falle des Laktose (Znc)-Operons. Das Hauptgenprodukt des lac-Operons, das Enzym -Galaktosidase, spaltet das Disacharid Laktose in Galaktose und Glukose. Das lacOperon wird jedoch nur transkribiert, wenn der LacRepressor durch ein Laktose-Derivat, das als Induktor wirkt, gebunden wird. In diesem Fall ist der Repressor nicht mehr in der Lage, an die Operatorsequenz zu binden, um die Transkription des /oc-Operons zu inhibieren. Das Enzym -Galaktosidase wird dann produziert.

Modell" beschrieben werden knnen. Gene, die durch ein Zwei-Komponenten-Modell" reguliert werden, unterliegen einer strikten Umweltkontrolle, die in der Regel ber zwei Kontrollproteine, dem Sensor" und dem Receiver" ausgebt wird. Das Schema eines Zwei-Komponenten-Modells" ist in Abb. 3.27 dargestellt.
Bei dem sog. Sensor-Protein" handelt es sich um ein Membranprotein, dessen N-Terminus ins Periplasma reicht und das hier bestimmte Umwcltsignale wie Osmolaritt oder Temperatur aufnimmt. Die Sensor-Proteine sind Histidinkinasen. Sie sind in der Lage, unter bestimmten ueren Bedingungen (Signal) Autophosphorylierungen durchzufhren. Die Phosphatgruppen werden dann an sog. Receiver-Proteine" weitergegeben, hier kommt es zu einer Phosphorylierung von Aspartatresten. Die Receiver-Proteine stellen ihrerseits DNA-Bindungsproteinc dar, die direkt mit der DNA interagieren und so die Aktivitt bestimmter Operons dirigieren. Die Fhigkeit der Regulator-Proteine, an DNA zu binden, ist wiederum direkt abhngig von ihrer Phosphorylierung, so da ein Signaltransfer von Umweltparametern auf die Aktivitt bestimmter Gene mglich wird. Als klassisches Beispiel fr die Zwei-Komponenten"-Regulation gelten die ueren Membranproteine OmpC und OmpF, die bei pathogenen Enterobakterien zur Virulenz beitragen knnen. Sie werden durch den Sensor EnvZ und den Receiver OmpE reguliert. Diese Regulatoren reagieren auf nderungen der Osmolaritt. Auch andere Virulcnz-assoziierte Gene bei Salmonellen, Bordetella pertussis, Vibrio cholerae und anderen pathogenen Organismen unterliegen einer Kontrolle durch Zwei-Komponenten-Systeme". Ein ebenfalls hufig bei pathogenen Bakterien realisiertes Regulationsprinzip ist das des Quorum sensing". Dabei werden von Bakterien kleine Molekle (bei gram-negativen Bakterien hufig Homoscrin-Lakton-Derivate) produziert, die wiederum als Indukto-

Neben diesen negativen", durch Repressoren beeinfluten Regulationsmechanismen sind auch Beispiele fr eine positive" Regulation bakterieller Gene bekannt. In diesen Fllen bindet ein sog. Aktivator meist stromaufwrts" (upstream") von der Promotorregion an die DNA, um die Bindung der RNA-Polymerase an die Konsensus-Sequenzen zu untersttzen.
In der Nhe der Promotorregion des /ac-Operons bindet beispielsweise der Crp (catabolite repression protein")-Faktor, der so die Transkription untersttzt. Interessanterweise ist das Crp-Molekl nur aktiv, wenn als Co-Faktor ein Molekl zyklisches AMP (cAMP) gebunden wird. Der cAMP-Spiegel wiederum sinkt drastisch, wenn Glukose im Medium vorhanden ist, so da hier eine weitere, durch Umweltfaktoren determinierte Regulationsebene realisiert ist. Auch andere genetische Determinanten wie das Arabinoscopcron werden durch Aktivatoren reguliert. Derartige Aktivierungen sind auch fr Gene bekannt, deren Produkte eine Rolle in der Pathogenitt von Bakterien spielen.

Repression und Aktivierung von Genen spielen auch eine bedeutende Rolle bei Regulationsereignissen, die durch das Zwei-Komponenten-

194

Allgemeine Bakteriologie

Abb. 3.27 Schema eines ZweiKomponenten-Regulationssystems. a) Darstellung von Sensor- und Regulator-Moleklen b) Signalbertragung (nach HACKER und HEESEMANN, 1999).

ren von Operons fungieren knnen. Allerdings kommt es erst dann zu einer Induktion, wenn gengend groe Mengen des Induktor produziert werden, d.h. wenn die Bakterienpopulation eine bestimmte Diehtc erreicht hat. Besonders gut untersucht ist das ..Quorum sensing"-System bei Pseudomonas aeruginosa. dem auch die Regulation von Toxingcnen unterliegt.

Molekulare Pathogenittsforschung
Eine Reihe von Fragen aus der Medizinischen Mikrobiologie konnte in den letzten Jahren durch die Anwendung von gentechnischen Methoden neu gestellt und teilweise beantwortet werden. Einige der dabei verwendeten Methoden sind in Tabelle 3.8 zusammengefat. Erstmals ist es mit Hilfe dieses neu etablierten molekularbiologischen Methodenbestecks mglich, Pathogenittsfaktoren von Bakterien kausal zu analysieren. Zum einen knnen Pathogenitts-assoziierte Gene kloniert und charakterisiert werden. Rekombinante Plasmide, die solche Gene tragen, knnen in nicht-virulente Bakterienstmme eingefhrt werden, um den spezifischen Beitrag der entsprechenden Determinanten zur Virulenz der Stmme einschtzen zu knnen. Weiterhin ist es mglich, Pathogenitts-assoziierte Gene, die auf dem Chromosom oder auf Plasmiden von Wildstmmen lokalisiert sind, durch Transposons oder durch die Einfhrung von spezifischen Mutationen zu inaktivieren und so isogenc, d.h. genetisch identische Stmme zu konstruieren, die nur in dem vernderten Locus differieren. Mit Hilfe dieser und hnlicher Anstze ist es gelungen, Pathogenittsfaktoren verschiedener gram-negativer und gram-positiver Bakterien zu identifizieren und deren Gene zu charakterisieren. Durch die Methodik der DNA-Sequenzierung und eine anschlieende ortsspezifische Mutagenese ergeben sich neue Mglichkeiten bei der Analyse von Struktur-Wirkungsbeziehungen verschiedener Pathogenittsfaktoren. Mit Hilfe von neuen Differenzmethoden" (RDA, mRNA-dd) ist es mglich, Gene bzw. Transkripte zu identifizieren, die spezifisch von pathogenen Vertretern einer Art oder einer Gattung gebildet werden. Die Analyse der korrespondierenden Loci

3.3.10 Grundlagen der Gentechnik


Bei der Gentechnik handelt es sich um ein Methodenspektrum, mit dessen Hilfe Gene isoliert und neu rekombiniert (kloniert) werden knnen. Die klassische"' Mikrobengenetik, die Mikrobiologie und die Biochemie haben mit der Identifizierung von Plasmiden, der Entdeckung entsprechender Enzyme (Restriktionsendonukleasen, Ligasen) und der Etablierung von Transfermethoden diese Technologie erst mglich gemacht. Wie in Abb. 3.28 dargestellt, werden mittels gentechnischer Methoden Gene aus ihrem Genomverband heraus isoliert und in Vektor-Plasmide kloniert, die dann wiederum in verschiedene Organismen oder Zellen bertragen werden knnen. Somit knnen Gene und ihre Produkte isoliert analysiert werden. Gene knnen auch gezielt in Expressionsvektoren kloniert werden, um das Produkt in grerer Menge zu erhalten, eine Methode, die in der Biotechnologie vielfach zur Anwendung kommt. Mit Hilfe von shuttleVektoren" knnen Gene dann auch in unterschiedliche Spezies bertragen werden. Reportergene wurden u.a. entwickelt, um die Aktivitt von Promotoren zu bestimmen und die Lokalisation von Genprodukten in der Zelle zu studieren.

3.3 Genetik der Bakterien

195

Abb. 3.28 Das Prinzip der Cenklonierung; res, Resistenzgen; rep, Replikationsregion. erffnet die Mglichkeit, neue virulenzassoziierte Gene nachzuweisen und die Wirkung der Produkte zu studieren. Neue /-vj'vo-Expressionsysteme (DFI, IVET) bzw. Mutagenesestratcgien (STM) machen zunehmend die Identifizierung von mikrobiellen Faktoren mglich, die spezifisch nur whrend einer Infektion, also in vivo aktiv sind.

Gentechnik und Medizinische Mikrobiologie Auch fr praktische Belange der Medizinischen Mikrobiologie spielen gentechnische Methoden heute eine wichtige Rolle. Einige der in Frage kommenden Verfahren sind in Tabelle 3.9 zu-

Tab. 3.8 Molekulargenetische Verfahren zur Analyse von pathogenen Mikroorganismen Verfahren Transposonmutagenese, Mutantenanalyse reprsentative Differenz-Analyse (RDA) mRNA differential display" (dd) differential fluorescence induetion (DFI) technology in vivo expression technology (IVET) signature tagging mutagenesis (STM) Anwendung Identifizierung, Charakterisierung von Virulenzgenen Identifizierung von Virulenzgenen Identifizierung von Transkripten Identifizierung von in vivo aktiven Promotoren Identifizierung von in vivo exprimierten Genen Identifizierung von in vivo essentiellen Cenprodukten

196

Allgemeine Bakteriologie

Tab. 3.9 Molekulargenetische Verfahren in der Medizinischen Mikrobiologie Verfahren Anwendung Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) arbitrary primed (AP) polymerase chain reaction (PCR) DNA-DNA-Hybridisierung (Sondentechnik), PCR, DNA-Sequenzierung Herstellung rekombinanter Proteine fluorescence based in situ hybridization (FISH) Herstellung rekombinanter Antigene Herstellung attenuierter Bakterien oder Viren Analyse von Infektionsketten Analyse von Infektionsketten Nachweis von Erregern, Nachweis von Virulenzgenen, Nachweis von Resistenzgenen Einsatz bei serologischen Nachweisverfahren (ELISA) in situ Erregernachweis Subunit-Impfstoffentwicklung (z.B. HBV) Lebendimpfstoffentwicklung (z.B. V. cholerae)

sammengefat. So knnen Prparationen genomischer DNA unterschiedlicher BakterienStmme mit Hilfe von Restriktionsenzymen verdaut werden; die entstehenden DNA-Fragmente unterschiedlicher Gre werden dann im Agarosegel aufgetrennt. Der auftretende Rest riktions-Fragment lnge n-Polymorphismus
(restriction fragment length polymorphism",

nicht-radioaktiven Nachweissystem markierte DNASonde eingesetzt, um auf der Folie durch Bindung der Sonde an homologe DNA-Bereiche bekannte Nukleotidsequenzen nachzuweisen. Mit Hilfe dieser Technik ist es mglich, die DNA unbekannter Stmme zu analysieren und bestimmte Gene zu identifizieren.

RFLP) stellt dabei ein Kriterium fr die Identifikation und die Zuordnung von Stmmen, beispielsweise innerhalb einer Infektionskette dar. In letzter Zeit wurde die Puls-Feld-Gelelektrophorese (PFGE) als eine wichtige Methode etabliert. Mit Hilfe selten schneidender Restriktionsendonukleasen werden relativ groe DNAFragmente erzeugt, die in einem elektrischen Wechselfeld aufgetrennt werden knnen und so ein berschaubares, individuelles Bandenmuster fr einzelne Stmme ergeben. Auch Variationen der Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction" = PCR) lassen sich zur Analyse von Infektketten heranziehen. Fr epidemiologische und krankenhaushygienische Fragestellungen, etwa bei der Einschtzung des pathogenen Potentials von Stmmen, aber auch fr die medizinische Diagnostik hat sich die DNA-Sonden-Technik zu einem wichtigen molekularbiologischen Werkzeug entwickelt.
Whrend einer DNA-DNA-Hybridisierung wird die DNA einzelner Bakterienstmme im Agarosegel aufgetrennt, die DNA-Fragmente werden dann auf eine Trgerfolie (Nitrozellulose, Nylon) transferiert und dort gebunden (SouTHKRN-Transfer). Es ist auch mglich, Bakterien direkt auf einer Folie anzuziehen und die DNA durch Lyse freizusetzen (DNA-DNA-Dot Technik). Nachdem die zu untersuchende DNA auf der Folie gebunden und behandelt wurde, wird eine bekannte, spezifische, mit einem radioaktiven oder

In der mikrobiologischen Diagnostik haben sich noch weitere Methoden fest etabliert. Mit Hilfe von neu synthetisierten Starter-Oligononukleotiden (primern) ist es mglich, unter Zuhilfenahme der Polymerase-Ketten-Reaktion DNA von pathogenen Bakterien anzureichern und zu analysieren. Die PCR-Technik wird vor allem zur Identifizierung von schwer kultivierbaren Bakterien (Mykobakterien, Chlamydien) aus Untersuchungsmaterial verwendet. Darber hinaus werden, bedingt durch die bessere Verfgbarkeit von DNA-Sequenzen, zunehmend DNASequenzierungen, z.B. von 16S rRNA-Genen, zur Identifizieung von Krankheitserregern herangezogen. Die 16S rRNA-Molekle werden auch als Target-Strukturen bei der FISH-Technologie verwendet, um Infektionserreger im Gewebe in situ nachzuweisen. Weiterhin werden klonierte Gene, die bestimmte Antigene kodieren, verwendet, um reine und hochspezifische Diagnostika herzustellen. Dies kann einmal in der Etablierung von spezifischen Nachweissystemen fr Serumantikrper etwa im ELISA oder im Immuno-Blot bestehen, indem rekombinante Antigene als Detektionssystem verwendet werden. Weiterhin knnen rekombinante Proteine als Ausgangsmaterial fr die Herstellung hochspezifischer polyklonaler oder monoklonaler Antikrper dienen, die in der mikrobiologischen Diagnostik eingesetzt werden knnen. Auch zur Herstellung von Impfstoffen wer-

3.4 Taxonomie der Bakterien

197

den zunehmend gentechnologische Verfahren eingesetzt. Dabei knen Antigene kloniert und Subunit-Vakzine in groer Menge rein hergestellt werden, wie das bei dem Impfstoff gegen Hepatitis-B-Viren der Fall ist. Auch die Konstruktion von Lebendimpfstoffen mittels gentechnischer Verfahren ist nunmehr mglich. Weitere Einsatzmglichkeiten gentechnischer Verfahren werden sich vielleicht bald durch die Entwicklung von DNA-Impfstoffen ergeben. Literatur
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Die Klassifizierung richtete sich ursprnglich nach morphologischen Eigenschaften (Kokken, Stbchen, Spirillen usw.) und wurde durch physiologische Charakteristika (Vergrung von Kohlenhydraten und anderen Substanzen, Nhrstoffanforderungen, Temperaturoptimum und vieles andere mehr), Gram-Reaktion, Beweglichkeit, Sporenbildung sowie chemotaxonomische Merkmale (Zcllwandzusammensetzung usw.) erweitert. Wie die Systematik der Tiere und Pflanzen folgt auch die Taxonomie der Bakterien einem hierarchischen Prinzip. Taxonomie und Systematik sind Synonyme, obwohl manche Autoren Unterschiede machen und die (mehr knstlich-nomenklatorische) Taxonomie als Teilgebiet der (natrlichen) Systematik betrachten. Die Lebewesen werden in drei Domnen ( Domain; Ur-Reiche" nach WOESE; Domain" ist derzeit der bergeordnete Begriff ber kingdom". Die Ordnungsbegriffe wurden entsprechend zunehmender Erkenntnisse in den letzten 10 Jahren sehr unterschiedlich angewandt) unterteilt:
Bacteria Archaea Eucarya

(Eds.): Escherichia coli and Salmonella. Cellular and molecular biology. 2nd cd. ASM Press, Washington D. C. 1996. SALYERS, A. A.: Bacterial pathogenesis. A molecular approach. ASM Press, Washington D. C. 1994.
BARGER

3.4. Taxonomie der Bakterien


WERNER KHLER

Zu den wichtigsten Aufgaben des Klinischen Mikrobiologen gehren die Isolierung und Identifizierung von Krankheitserregern. Die Ergebnisse sind dem behandelnden Arzt in einer allgemein verbindlichen Form mitzuteilen, es bedarf also einer einheitlichen Nomenklatur, deren Regeln fr die Bakteriologie im International Code of Nomenclature of Bacteria" geregelt ist.

wobei Bacteria und Archaea Prokaryonten (kernlose Zellen), Tiere und Pflanzen (einschlielich Protophyten) Eukaryonten (Zellen mit Nukleus. Kernmembran und mehreren Chromosomen) sind. Die hierarchischen Rnge (Taxa, Singular: 7axon) sind fr die Bakterien in Tab. 3.10 zusammengestellt. Die taxonomische Grundeinheit ist die Art (Species). Die Organismen einer Art sind einander in ihren morphologischen, physiologischen, biochemischen, serologischen und anderen untersuchten Eigenschaften in hohem Mae hnlich. Absolut identisch sind nur Stmme, die aus einem Klon, d.h. aus einer einzelnen Zelle, hervorgegangen sind. Die Bestimmung eines Klons kann fr epidemiologische Zwecke bedeutsam sein. So fhren z.B. Stmme der Species Streptococcus pyogenes zum Streptokokken-bedingten toxischen Schock Syndrom. Bevorzugt werden dabei Stmme der Serotypen Ml und M3 gefunden, und es zeigte sich, da ein Klon des Serotyps Ml besonders hufig war und sich ber die ganze Welt verbreitet hat. hnliches gilt fr andere Species. Species, die in wesentlichen Merkmalen bereinstimmen, werden zu einer Gattung (Genus, pl. Genera) zusammengefat, Gruppen hnli-

198

Allgemeine Bakteriologie

Tab. 3.10 Taxa der Bakterien


Taxon Klasse Unterklasse Ordnung Unterordnung Familie Unterfamilie Stamm Unterstamm Gattung Art Unterart lateinisch classis subclassis ordo subordo familia subfamilia tribus subtribus genus species subspecies englisch class subclass order suborder family subfamily tribe subtribe genus species subspecies - ales - ineae - aceae oideae - eae - ineae Pseudomonadales Pseudomonadineae Pseudomonadaceae Pseudomonadoideae Pseudomonadeae Pseudomonadineae Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa Wortendung Beispiel

eher Genera zu einer Familie usw. bis in die hheren Ordnungen (s. Tab. 3.10). Der Code regelt die Nomenklatur nur bis zur Subspecies. Synonym von Subspecies" ist - entgegen hufigem Gebrauch - Variett" (variety), ein Begriff, der nach geltenden Nomenklaturregeln nicht mehr gebraucht werden darf. Zur Bezeichnung infrasubspezifischer Rnge empfiehlt der Code trotzdem die Endsilbe var", je nachdem, auf welcher Basis die jeweilige Gruppe definiert wurde. Hufig wird aber auch noch die Endung ,,-typ" verwandt, wie z.B.
Serovar/Serotyp: Antigene Eigenschaften Biovar/Biotyp: Biochemische oder physiologische Eigenschaften Chemovar/ Chemische ZusammensetChemotyp: zung (meist der Zellwand) Phagovar/Lyso- Reaktionen gegenber Baktyp oder teriophagen Phagentyp: Pathovar/Patho- Besondere pathogene Eityp: genschaften, z.B. bei verschiedenen Tierarten Beachte: es mu heien die Scrovar, die Phagovar, da von Variett abgeleitet; meist wird flschlich das Maskulinum gebraucht, das im Deutschen fr Typ zutrifft und deshalb auch besser unser Sprachgefhl trifft.

Kette. Selbst in einer Kolonie (mit ~1091012 Zellen) finden sich meist einige Zellen mit biologischen Eigenschaften, die von der Mehrzahl der Zellen in der Population abweichen. Nach den Regeln des o.a. International Code of Nomenclature of Bacteria" soll ein Typ-Stamm (type strain) in Reinkultur vorliegen, der in seinen Eigenschaften mit denen der Originalbeschrcibung weitgehend bereinstimmt. Numerische Taxonomie (ADANSONsche Taxo-

Ein Bakterien-Stamm (engl. strain) ist eine Population weitgehend hnlicher Zellen, die im Idealfall aus einer Zelle hervorgegangen ist (= Klon). Das gleiche gilt fr einen Pilz-, Virusoder Protozoenstamm.
In der Praxis geht ein Stamm bei der Isolierung aus klinischem Material oder bei der Weiterimpfung (Subkultivierung) aus mehreren Individuen hervor, z.B. bei Streptokokken aus den Zellen einer Streptokokken-

nomic): Numerisch taxonomische Untersuchungen, die zahlreiche physiologische, biochemische und ggf. serologische und morphologische Merkmale der zu untersuchenden Bakterienstmme gleichgewichtet miteinander vergleichen, sind heute nur noch fr die Bearbeitung der mittels 16S rRNA-Vergleich als hochverwandt bekannten Organismen von praktischer Bedeutung. Genotypische (Molekulare) Taxonomie: Die Fortschritte molekularbiologischer Forschung haben auch die taxonomischen Untersuchungen beeinflut. 765 rRNA-Basenvergleich: Die heutige Methode der Wahl fr phylogenetische Untersuchungen ist der von WOESE eingefhrte Vergleich der Basensequenzen der 16S ribosomalen RNA (16S rRNA). DNA-DNA-Hybridisierung: Dieses Verfahren bercksichtigt gleichfalls die Basensequenz. DNA-Einzelstrnge von zwei zu untersuchenden Stmmen werden hybridisiert. Bei einer nachgewiesen Homologie weit ber 70% wird angenommen, da beide Stmme einer Species angehren. GC-Gehalt: Die Bestimmung des Verhltnisses von A - T zu G - C Basenpaaren der chromosomalen Bakterien-DNA, ausgedrckt in mol% GC ist heute nur noch von untergeordneter Bedeutung zum Nachweis von Verwandtschaften.

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

199

Nomenklatur

Die Benennung der Bakterien folgt dem LINNEschen binren (oder binominalem) System, d.h. zur Kennzeichnung einer Bakterienart werden Gattungsname und Speziesbezeichnung angegeben (z.B. Escherichia coli, Streptococcus pyogenes). Der Gattungsname wird in der Regel abgekrzt und zwar mit seinem ersten Buchstaben (E. coli, S. pyogenes). Dem Einsender von Untersuchungsmaterial sollte zur Vermeidung von Irrtmern stets die volle Bezeichnung mitgeteilt werden, da es natrlich gleichartige Abkrzungen unterschiedlicher Bedeutung gibt (Staphylocoecus aureus, Streptococcus pyogenes = S. aureus, S. pyogenes). Bei Publikationen wird bei der erstmaligen Erwhnung der volle Name ausgeschrieben und dann abgekrzt. Neben den offiziellen" Bakteriennamen existieren Vulgrnamen", wie Tuberkelbaktericn, Typhusbazillen, Keuchhustenbakterium etc., die bei Bcfundbermittlungen nicht anzuwenden sind.
Nach den Nomenklaturregeln wird bei wissenschaftlichen Verffentlichungen nicht nur der Name von Gattung und Species angegeben, sondern auch der Name dessen, der die jetzt gltige Bezeichnung erstmals prgte. Dieser mu mit dem Entdecker des Keimes nicht identisch sein: der 1883 von Robert KOCH entdeckte Choleraerreger wird korrekt als Vibrio cholerae PACINI 1854 bezeichnet; der 1879 von Albert NEISSER entdeckte und 1885 von Ernst BUMM erstmals reingezchtete Gonococcus: Neisseria gonorrhoeae (ZOPF 1885) TREVISAN 1885 und der 1884 von Friedrich LOEFFLF.R entdeckte Diphtherieerreger: Corynebacterium diphtheriae (KRUSE 1886) LEHMANN und NEUMANN 1896. Durch die fortschreitende Entwicklung molckularbiologischer Techniken ndern sich zwangslufig Zuordnungen von Bakterien zu Genera oder hheren Taxa. Das hat zur Folge, da sich auch die Namen ndern, fr den behandelnden Arzt eine unerfreuliche, aber nicht zu vermeidende Entwicklung. So hat man z.B. vorgeschlagen (Oux 1992), alle Salmonellen. die man bisher als Species betrachtete (Salmonetla typhi, S. paralyphi B, S. typhimurium) in einer Art als Salmonella enterica zusammenzufassen und die mehr als 1000 bisherigen Arten als Serovare zu betrachten. Der Befund mte dann lauten: Salmonella enterica spp. enterica Serovar typhi. Um dies zu vermeiden, wurde entgegen allen Nomcnklaturregeln vorgeschlagen, die Serovarbezeichnung mit einem Grobuchstaben zu beginnen: Salmonella Typhi. Unter Bercksichtigung der geltenden Nomenklaturregeln wurde dieser Vorschlag von der Judicial Commission eindeutig zurckgewiesen: Salmonella enterica has no Standing in nomenclature". Dennoch wird in der Literatur von dieser Schreibweise zunehmend Gebrauch gemacht und man mu mit diesen Formulierungen vertraut sein.

Bei einer nderung der Nomenklatur sollten dem einsendenden Arzt ber eine lngere Zeit beide Benennungen, die alte und die neue, mitgeteilt werden, damit er nicht durch neue Bezeichnungen, die er z.B. in der Literatur findet, verwirrt wird. Smtliche bekannten Species der Prokaryonten sind gem dem jeweiligen Stand des Wissens in Bergey's Manual of Systematic acteriology zusammengefat, Neubeschreibungen sollten im Journal of Systematic Bacteriology verffentlicht werden. Bergey's Manual bercksichtigt in zunehmenden Mae auch genotypische Merkmale. Trotz meist dichotomer Schlssel kann sich die Artidentifizierung in bestimmten Gattungen als schwierig erweisen.
Literatur BALOWS, A.. H. G. TRPER, M. DWORKIN and W. HRDER: The Prokaryotes. Springer, New York, 2. Aufl. 1992. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Ed. J. G. Holt). Williams & Wilkins, Baltimore, Vol. I 1984. Vol. II 1986, Vols. III und IV 1989. GOODFELLOW, M.. and A. G. O'DONNELL (Eds.): Handbook of New Bacterial Systematics. Academic Press, Orlando, FL 1993. International Code of Nomenclature of Bacteria (Bacteriological Code) (Ed. P. H. A. SNEATH), 1990 Revision. Amer. Soc. Microbiol., Washington, DC 1992. Old, D. C: Nomenclature of Salmonella. J. Med. Mikrobiol. 37. 361-363 (1992).

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie


ADOLF BAUERNFEIND, GEORG PETERS

3.5.1 Definition und Abgrenzung


Antimikrobielle Chemotherapie umfat die Behandlung mikrobiell verursachter Erkrankungen mit Arzneimitteln, die schon in geringen Konzentrationen das Wachstum von Mikroorganismen hemmen oder sie abtten.

Dabei soll der Wirkstoff nicht mit Stoffwechselvorgngen oder Funktionen des Makroorganismus (Patienten) interferieren. Nach der Natur der Krankheitserreger werden antibakterielle, antivirale, antimykotische und antiparasitre Chemotherapie unterschieden. Darunter ist die

200

Allgemeine Bakteriologie

antibakterielle Chemotherapie das umfangreichste und differenzierteste Teilgebiet.


Das folgende Kapitel beschftigt sich mit der Charakterisierung der antibaktericllen Chemotherapeutika. deren Grundlagen und ihrer klinisch-praktischen Anwendung. Die Darstellung der antituberkulotischen Chemotherapeutika erfolgt im Kapitel Mycobacteriaceue bzw. Tuberkulose.

3.5.2 Anfnge der antimikrobiellen Chemotherapie


Die gezielte Suche nach antimikrobiellen Stoffen Anliseptika und Therapeutika - wurde erst nach der Entdeckung der Mikroorganismen als Ursache von Infektionen gegen Ende des vorigen Jahrhunderts mglich. So leitete Lord JOSEPH LISTER (1827-1912) von den Erkenntnissen Louis PASTEURS (1822-1895) ber die Rolle von Bakterien und Spropilzen bei Fulnis und Grung sowie der Verbreitung von Mikroorganismen durch die Luft die Ntzlichkeit des Phenols als Antiseptikum zur Vermeidung der postoperativen Septikmic her (1866). Trotz enormer Bakterizidie ist Phenol jedoch mit dem Nachteil fehlender Selektivitt behaftet: seine Toxizitt ist fr eukaryontische Zellen mindestens ebenso gro wie fr prokaryontische. Erst PAUL EHRLICH (1854-1915) hat die selektive Toxizitt als Prinzip antimikrobieller Therapie in den chemotherapeutischen Index gefat: dem Verhltnis zwischen maximal tolerierter Dosis eines Chemotherapeutikums zu dessen minimaler kurativer Dosis. Zugleich gelang es ihm, dieses Prinzip am Beispiel der Chemotherapie der Syphilis in die Praxis umzusetzen: die bis dahin etablierte Therapie der Lues mit anorganischen Quecksilberprparaten war mit schwersten Nebenwirkungen belastet. Demgegenber zeigte das Prparat EH 606 in der Reihe der von PAUL EHRLICH erprobten organischen Arsenverbindungen, das Salvarsan. entscheidend verbesserte therapeutische Wirkung bei sehr viel geringerer Toxizitt. Ein hheres Niveau der selektiven Toxizitt als das mit anorganischen oder metallorganischen Verbindungen crziclbare lie sich aber erst erreichen, als es gelang, Substanzen zu finden, welche spezifisch mikrobielle Stoffwechselvorgnge oder Strukturen treffen. Diese neue ra der antimikrobiellen Chemotherapie begann mit der Beobachtung, da Textilfarbstoffe. speziell die Sulfanilamid-Derivate der Di- und Triphenylmethan-Farbstoffe ber eine antimikrobielle Wirkung verfgen. GERHARD DOMAGK (1895-1964) entdeckte eher zufllig, da Prontosil (Sulfonamido-chrysoidin, ein Farbstoff fr Seide und Wolle) Muse vor der Schlafkrankheit schtzte, obwohl es in vitro keine erkennbare Wirkung auf die Trypanosomen hatte (1935). Damals wurde bereits das Pro-drug-Prinzip demonstriert: die Wirksubstanz wird erst im Organismus aus einer inaktiven Vorstufe freigesetzt. Von GERHARD DOMAGK wurde noch ein weiteres Grundphnomen der antimikrobiellen Chemotherapie aufgezeigt: die Fhigkeit von mikrobiellen Erregern, sich der Wirkung einer Chemotherapie durch Entwickeln von Re-

sistenzmechanismen (s.u., Sulfonamide) zu entziehen. Dieser Weg, antimikrobielle Stoffe durch Derivatisierung synthetischer organischer, metallfreier Molekle zu entwickeln, setzte die traditionelle Linie der Chemotherapie - Therapie mit Chemikalien - fort. Parallel dazu lief eine zweite Entwicklungsrichtung der antiinfektisen Therapie, die biologische. Das Phnomen, da lebende Mikroorganismen oder Produkte derselben imstande sind, andere Mikroorganismen zu hemmen (La vie empeche la vie" - Louis PASTEUR), war bekannt und in Therapie umgesetzt worden (z.B. die Pyocyanase aus Pseudomonas aeruginosa). PAUL VUILLEMIN hatte 1889 den Begriff der Antibiose charakterisiert als einen Zustand, in dem ein Lebewesen in absolutem Gegensatz zu einem anderen steht. Am fruchtbarsten erwies sich die Beobachtung Sir ALEXANDER FLEMINGS (1881-1955), da ein Stamm von Penicillium notutum ein Stoffwechselprodukt abgibt, welches bakterizid und bakteriolytisch insbesondere auf Kokken wirkt (1928). FLEMING befrchtete zunchst, da die antibakterielle Wirkung therapeutisch nutzlos bleiben wrde, falls zugleich der natrliche Abwehrmechanismus des Patienten beeintrchtigt wrde. Erst sein Nachweis, da Rohpenicillin ohne Wirkung auf Leukozyten blieb und seine antibakterielle Wirkung auch in Gegenwart von Blut und Gewebsflssigkeit behielt, lie ALEXANDER FLEMING an die Zukunft des Penicillins als Therapeulikum glauben. Penicillin wurde nach berwinden der Probleme der Anreicherung, Reinigung und Groproduktion seit 1944 in die Therapie eingefhrt.

3.5.3 Mikrobiologische Grundlagen


Wirkungsmechanismen von Antibiotika
Ziel der antibakteriellen Therapie ist die Beseitigung der Infektionsursache durch Hemmung der Vermehrung oder Abtten des Erregers.

Dazu greifen Antibiotika mglichst selektiv in den bakteriellen Stoffwechsel ein. Angriffspunkte beim Erreger liegen in der Synthese von Peptidoglykan, Proteinen, Nukleinsuren, Folsurc bzw. der Struktur und Funktion der Zytopiasmamembran (vgl. Kap. 3.1).
Hemmung der Peptidoglykansynthese (vgl. -Laktame)

Peptidoglykan ist die formstabilisierende Schicht der bakteriellen Zellwand. Es legt sich netzfrmig um die Zytoplasmamembran. Die Synthese des Peptidoglykans (s. Kap. 3.1.2) vollzieht sich in einer Serie von Einzelschritten, und zwar zunchst im Zytoplasma, im weiteren Verlauf an der definitiven Lokalisation des Peptidoglykans auerhalb des Zytoplasmas. Der Ablauf der Peptidoglykansynthese bietet verschiedene

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

201

Angriffspunkte fr Antibiotika. Sie alle hemmen letztlich die Fertigstellung des starren Peptidoglykannetzes. Die Hemmung der Peptidoglykansynthese allein, z. B. mit -Laktam-Antibiotika, ttet die Zelle zumeist nicht ab, sie lst jedoch autolytische Vorgnge aus, die zum Zelltod fhren. Dadurch wirken Antibiotika, welche in die Peptidoglykansynthese eingreifen, bakterizid. Dazu gehren alle Substanzen mit -Laktam-Ring und zustzlich einige Verbindungen mit anderen chemischen Strukturen wie Cycloserin, Bacitracin, Vancomycin, Fosfomycin. Sie setzen in der Biosynthese des Peptidoglykans an unterschiedlichen Stufen ein. |i-l.uktiiiii-Antibiotika interferieren mit der letzten Phase der Peptidoglykansynthese. Zu diesem Zeitpunkt sind N-Acetylglukosamin und N-Acetylmuraminsure bereits zum linearen Polymer verkettet. Die Ketten liegen schon auerhalb der Zytoplasmamembran am definitiven Ort, sie sind aber noch hydrophil und flexibel. Erst die Quervernetzung macht sie zum formgebenden mehrschichtigen Mureinsacculus. Dazu werden die Polysaccharidketten z. B. bei Escherichia coli ber die Peptide aus alternierenden D- und L-Aminosuren ihrer Muraminsurereste verknpft. Die Quervernetzung erfolgt ber die Aminogruppe des Lysins oder der meso-Diaminopimelinsure des einen und die Carboxylgruppe des D-Alanins des benachbarten Polysaccharidstranges. Bei Staphylococcus aureus werden die Strnge anders als bei E. coli durch Einbau einer fnfgliedrigen Peptidbrcke vernetzt (indirekter Quervernetzungstyp).
Penicillin-bindende Proteine (PBPs)

Zelltod durch Selbstauflsung (Autolyse). Diese Autolyse ist ein aktiver Proze, der durch die Hemmung der PBPs ausgelst wird und an dem mehrere zelleigene Enzyme beteiligt sind. Wird er nicht angeschaltet, kann die Zelle in Gegenwart von -Laktamen berleben (Toleranz).
Hemmung der Proteinbiosynthese

Unterschiede in der Proteinbiosynthese (vgl. Kap. 3.2) zwischen Eukaryonten und Prokaryonten ermglichen die Hemmung der Synthese von Protein in Prokaryonten, ohne zugleich die Eukaryontenzelle zu schdigen. Der Grad der selektiven Toxizitt ist jedoch im Vergleich zur Hemmung der Peptidoglykansynthese deutlich geringer. Dies kommt in Hufigkeit, Art und Schwere unerwnschter Nebenwirkungen bei antimikrobieller Therapie mit Proteinbiosynthese-Hemmern zum Ausdruck. Antibiotika setzen an unterschiedlichen Stellen der Proteinbiosynthese an. Aminoglykoside und Tetrazykline inhibieren Funktionen im Bereich der 3()S-Untereinheit, Chloramphenicol. Makrolide, Lincosamine in dem der SOS-Untereinheit des bakteriellen Ribosoms. Der Wirktyp ist zumeist bakteriostatisch, bei Aminoglykosiden bakterizid, bei Makroliden werden beide Wirktypen beobachtet.
Hemmung der Nukleinsuresynthese

Die Mechanismen der DNA-Replikation und -Transkription unterscheiden sich - obwohl grundstzlich bei Eukaryonten und Prokaryonten dieselben - so weit, da eine selektive Toxizitt zugunsten der Prokaryonten mglich wird (vgl. Kap. 3.5.6: Chinolone, Rifampicin).
Hemmung von Funktionen der Zytoplasmamembran

Penicillin-bindende Proteine katalysieren die Quervernetzung benachbarter Glykanstrnge und sind damit fr die Synthese des Peptidoglykans essentielle Enzyme. Die Quervernetzung kann von einem anderen PBP (einer Endopeptidase) wieder geffnet werden, wenn dies z.B. fr das Wachstum des Peptidoglykans durch Einbau weiterer Ketten notwendig wird.
Alle -Laktam-Antibiotika, nicht nur Penicilline, binden an PBPs.

Die Strukturen der Zytoplasmamembranen von Bakterien und Pilzen unterscheiden sich nicht nur von denjenigen tierischer Zellen, sondern auch untereinander hinreichend, um eine selektive Zerstrung ihrer Funktion durch bestimmte Substanzen zu ermglichen. So tten Polymyxine nur Bakterien, Polycnc oder Imidazole lediglich Pilze (nur deren Zytoplasmamembran enthlt Sterole).
Antibiotika-Resistenz
Natrliche, erworbene, phnotypische Resistenz

Ursache dafr ist die sterische hnlichkeit zwischen der Amidbindung im -Laktam-Ring und der Azyl-D-Alanyl-D-Alanyl-Struktur in der Pentapeptidkette, der natrlichen Bindungsstelle der PBPs. Direkte Folge ist der Stop der Synthese des Peptidoglykannetzes, indirekte der

Alle verfgbaren Antibiotika weisen Lcken im Spektrum der humanpathogenen Erreger auf.

202

Allgemeine Bakteriologie

Sind alle Stmme einer natrlichen Population einer Art oder Gattung gegen ein Antibiotikum resistent, so gilt dies als natrliche, primre oder intrinsische Resistenz. Beispiele fr derartige Taxon-spezifische Resistenz sind die Resistenz von gramnegativen Stbchen gegenber Vancomycin oder Bacitracin, von Burkholderia-Arten gegenber Polymyxin, von S. maltophilia gegenber Carbapenemen. Ist dagegen die Resistenz begrenzt auf nur einen Teil der Stmme einer natrlichen Population, handelt es sich um erworbene, sekundre Resistenz. Klinische Resistenz setzt die Empfindlichkeit in Relation zur Wahrscheinlichkeit eines Therapieerfolgs: die minimale Hemmkonzentration (MHK, Resistenzbestimmung s.u.) eines Erregers liegt oberhalb der Grenzkonzentration, bei der hinsichtlich der zugelassenen Hchstdosierung noch ein Therapieerfolg erwartet werden kann. Klinische Sensibilitt liegt vor, wenn die MHK eines Erregers gleich oder kleiner ist als die festgelegte Grenzkonzentration, so da im allgemeinen ein Therapieerfolg bei blicher Dosierung und geeigneter Indikation zu erwarten ist. Natrliche Sensibilitt aller Stmme einer Spezies gegenber bestimmten Antibiotika ist seit Beginn der antimikrobiellen Therapie immer seltener geworden. Beispiele fr heute noch sichere Empfindlichkeit sind die von Streptococcus pyogenes und Treponema pallidum gegenber Penicillin G.
Sind die Ursachen der Unempfindlichkeit eines Stammes nicht vererbbar, liegt eine phnotypische Resistenz vor.

So bleiben -Laktame bei den peptidoglykanarmen Formen der gram-negativen (Spbroplasten) oder den peptidoglykanfreien Formen der gram-positiven (Protoplasten) wirkungslos. Trotzdem berleben sie eine -Laktam-Therapie nur in seltenen Fllen (Persisters) als zellwandfreie Formen, um anschlieend zu kompletten Erregern zu revertieren, da sie zumeist durch die Aktivitt der krpereigenen Abwehr abgettet werden.
Resistenzbestimmung

Sie charakterisiert einen Stamm nach der Wirkung eines Antitiotikums auf dessen Vermehrungs- oder berlebensfhigkeit. Parameter dafr sind die niedrigste vermehrungshemmende (bakteriostatische) Konzentration (minimale Hemmkonzentration, MHK, vgl. Abb. 3.29)

bzw. die niedrigste Abttekonzentration (minimale bakterizide Konzentration, MBK). Diese liegt bei Antibiotika mit bakterizidem Wirktyp ( -Laktame, Aminoglykoside, 4-Chinolone) im allgemeinen nur um das Zweifache ber der MHK. Das ermglicht die therapeutische Wirksamkeit derartiger Substanzen auch bei Infektionen abwehrgeschwchter Patienten (z.B. bei Granulozytopenie). In seltenen Fllen kann die MBK um das 32fache und darber hher sein als die MHK (vgl. Toleranz). Dann mu fr die Therapie auf eine Substanz mit unverminderter Bakterizidie ausgewichen werden. Der Therapieerfolg resultiert aus dem Zusammenwirken zwischen Antibiotikum und den Infektabwehrmechanismen des Patienten. Resistenzbestimmungen sollen ermitteln, ob die Mindestvoraussetzungen fr einen Therapieerfolg von Seiten des Antibiotikums erfllt sind, nmlich das Erreichen der bakteriostatischen Antibiotikum-Konzentration am Infektionsort. Der Wert des in vitro Ergebnisses fr die Voraussage des Therapieergebnisses wird vom Grad der Vergleichbarkeit der antimikrobiellen Faktoren in vitro und in vivo determiniert. Diese wird bei den verschiedenen Methoden zur Resistenzbestimmung in unterschiedlichem Ausma, aber nie vollstndig erreicht (Tab. 3.11). So knnen die Pharmakokinetik des Antibiotikums am Infektionsort sowie die krpereigenen humoralen und zellulren Abwehrfunktionen nicht oder nur unvollstndig in ein praktikables Routine-Testsystem einbezogen werden. Der prdiktive Wert der in vitro Aktivitt eines Antibiotikums als Therapieempfehlung ist wesentlich vom pharmakokinetischen Verhalten des Antibiotikums im Patienten abhngig. Informationen darber liegen nicht einmal als Durchschnittswerte fr alle Antibiotika, Dosierungen, Infektionsorte und Funktionen der Eliminationsorgane vor. In bewuter Generalisierung im Sinne einer praktikablen Orientierung wurde deshalb bisher als Grenzkonzentration zwischen Empfindlichkeit und Resistenz eines Erregers z.B. die nach der Hlfte des Dosierungsintervalls im Serum Gesunder nachweisbare Konzentration des Antibiotikums herangezogen. Diese nhert sich bei einer Reihe von Antibiotika der Konzentration in verschiedenen Geweben an. Erreicht oder bersteigt sie die MHK eines Stammes, gilt er als sensibel, bleibt sie unterhalb der MHK, als resistent. Ergnzend werden Therapieergebnisse klinischer Studien zur Grenzwertfindung herangezogen. Derartige Grenz-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

203

Abb. 3.29 SchachbrettTitration (Checkerboard) zur Ermittlung der Wirkung von AntibiotikaKombinationen (aus: BAUERNFEIND und SHAH, 1995).

konzentrationen (cut-off points, break-poinls) werden fr die verschiedenen Antibiotika vorgeschlagen, z.B. von DIN (DIN 58940) oder vom National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS, der USA. Beispiele fr DIN-MHK-Grenzwerte gibt Tab. 3.12.
Weiterfhrende Interpretation der Resistenzbestimmung.
Das Resistenzverbalten eines Bakterienstammes gegenber einem Satz von Antibiotika aus verschiedenen Gruppen beschreibt dessen Resistotyp.

nes Stammes herauszulesen (interpretive reading"). Beispiele sind in Tab. 3.13 zusammengefat. Daneben kann ein Resistenzmuster Hinweise fr die Identifizierung eines Erregers oder einer Erregergruppe geben (Tab. 3.14).
Antibiotika-Kombinationen.
Grundstzlich sind Kombinationen aus bakteriostatisch und bakterizid wirkenden Substanzen wegen des Risikos eines Antagonismus zu vermeiden.

Dieser reflektiert den zugrundeliegenden Genotyp, soweit die Resistenzgene des Stammes phnotypisch exprimiert werden. Darauf beruht die Mglichkeit, aus den MHK-Werten fr verschiedene Antibiotika die Resistenzmechanismen ei-

Dies ist der Fall, wenn z.B. ein Antibiotikum nur auf proliferierende Zellen bakterizid wirkt, deren Vermehrung jedoch in Gegenwart eines bakteriostatischen Kombinationspartners verhindert wird. Ein Antagonismus kann jedoch auch bei Kombination von Antibiotika gleichen Wirktyps auftreten, so z.B., wenn ein -Laktam-Anti-

204

Allgemeine Bakteriologie

Tab. 3.11 In vitro Bestimmung der antibakteriellen Wirkung von Antibiotika


Methode Prinzip, Megre Besonderheiten

Verfahren mit Endpunktbestimmung Die Beurteilung erfolgt anhand eines Mewertes, der erst am Ende der Bebrtungszeit erfat wird. Reihenverdnnungstest, RVT geometrische Verdnnungsreihe des Wirkstoffes Minimale Hemmkonzentration, MHK, 1 engl. MIC : niedrigste Wirkstoffkonzentration mit vermehrungshemmender (bakteriostatischer) Wirkung. Minimale bakterizide Konzentration, 2 MBK, engl. MBC : niedrigste Konzentration, welche die eingeste Bakterienzahl (z.B. 5 5 x 10 KBE/ml) um mindestens 99,9% abttet. Agardiffusionstest, ADT, Blttchentest Radiale Diffusion vom Wirkstofftrger in den beimpften Agarnhrboden. Der Durchmesser des Hemmhofs im Bakterienrasen ist Ma fr die Empfindlichkeit des Stammes. quantitatives Ergebnis; aufwendig: fr jeden Wirkstoff ist eine eigene Verdnnungsreihe notwendig. Resultat fr schnell wachsende Erreger nach 16stndiger Bebrtung, fr langsam wachsende (Anaerobier) nach 48 Stunden bzw. 3-4 Wochen (Mycobacterium tuberculosis).

Bestimmen der Zahl der berlebenden Bakterien in Kulturen mit AntibiotikaKonzentrationen in Hhe der MHK und darber; Dauer bis zum Ergebnis doppelt so lang wie bei der MHK-Bestimmung. Resultate mssen mit denen des Reihenverdnnungstests korrelieren. Strikte Standardisierung der Testbedingungen notwendig (u.a. Dichte des Bakterienrasens, Zusammensetzung und Schichthhe des Nhrbodens, Bebrtungsdauer und -temperatur, aktive Konzentration des Wirkstoffes auf dem Blttchen).

Verfahren mit Verlaufsbeobachtung Fr die Beurteilung werden Mewerte zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf der Exposition erfat. Bakterizidiekinetik - bei konstanter Wirkstoffkonzentration nach Zugabe eines Antibiotikums zur beimpften Nhrlsung wird die Zahl der vermehrungsfhigen Bakterien in verschiedenen Zeitabstnden (meist 2, 4, 6, 8, 24 Stunden) bestimmt. Flssigkeitskulturen werden variablen Wirkstoffkonzentrationen ausgesetzt und - wie oben - nach der berlebenskinetik der Bakterienpopulation analysiert. erfat Abttegeschwindigkeit und Verlauf bei gleichbleibender Konzentration des Antibiotikums. Fr jede Konzentration (zumeist MHK und Vielfache davon) ist ein eigener Testansatz erforderlich. bezieht die Pharmakokinetik in die in-vitro-Analyse ein. Wirkstoffkonzentrationsverlufe (z.B. im Serum) werden in der Kultur des Teststammes reproduziert. Bakterizidiekinetik verschiedener Dosierungen und Dosierungsintervalle in Relation zur MHK eines Stammes erfabar. Wichtiger pharmakodynamischer Parameter fr die prklinische Charakterisierung neuer Antibiotika.

- bei variabler Wirkstoffkonzentration

1 2

minimum inhibitory concentration minimum bactericidal concentration

biotikum im Erreger die Synthese einer -Laktamase induziert, welche den -Laktam-Ring des zweiten Antibiotikums spaltet (Abb. 3.30). In Antibiotika-Kombinationen kann die Wirkung der beteiligten Einzelsubstanzen gemessen

an ihrer Wirkung allein erhht, vermindert oder unverndert sein. Die Wirkung einer Antibiotika-Kombination lt sich nicht vorhersagen, sie mu jeweils fr den einzelnen Erreger bestimmt werden. Quantifizierbar werden Kombinations-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

205

Tab. 3.12 Beispiele fr Grenzwerte von antibakteriellen Wirkstoffen (nach DIN 58940, 1998, verndert) antibakterieller Wirkstoff Benennung Kurzzeichen gilt auch fr folgende Wirkstoffe Penicillin Oxacillin PEN OXA Testergebnis sensibel" Bewertungsstufe sensibel 1 (S) < 0,13 1 intermedir 2 (I) 0,25-1 resistent 3 (R) > 2 2

Penicillin G Oxacillin Dicloxacillin Flucloxacillin Ampicillin Amoxicillin Cefaclor Cefuroxim-Axetil Cefpodoxim-Proxetil Cefetamet-Pivoxil Cefotiam-Hexetil Ceftibuten Cefixim Loracarbef

Ampicillin orale Cephalosporine

AMP

2 1 1 4

4-8 2-A 2 4-8

16 8 4 16

Ceftazidim

CAZ

Ceftazidim Cefoperazon Ceftriaxon Cefepim Cefotetan Cefotaxim Cefodizim

4 2 4

8-16 4-8 8

32 16 16

' MHK so gering (kleiner oder gleich der gewhlten Grenzkonzentration), da bei blicher Dosierung und geeigneter Indikation ein Therapieerfolg zu erwarten ist. 2 Der zu erwartende Therapieerfolg ist abhngig davon, ob der Erreger Gene fr einen Resistenzmechanismus exprimiert und ob der Infekt in einem leicht zugnglichen (Harnwege) oder einem nur schwer erreichbaren Bereich (Lunge, Atemwege) lokalisiert ist. Im ersten Fall kann der Erreger mit einer Regeldosierung eliminiert werden, im zweiten auch nicht mit der maximal zugelassenen Dosierung. 3 MHK so hoch (ber einer Grenzkonzentration), da auch bei Verwendung der zugelassenen Hchstdosierung ein therapeutischer Erfolg nicht zu erwarten ist.

Wirkungen durch spezielle Verfahren (Schachbrett-Titrationen), mit denen sich die Wirkung der beiden Partner in verschiedenen Konzentrationsverhltnissen erfassen lt. Als Synergismus gilt dabei die Verminderung der MHK-Werte fr jede der beiden Substanzen auf wenigsten 1/4 der MHK der Einzelsubstanzen (vgl. Abb. 3.29).
Resis tenzentstehung Natrliche Funktion der Antibiotika fr Mikro-

Mikroorganismen leben zumeist in Verbnden, entweder als Reinkulturen (in Form von Mikrokolonien oder Biofilmen) oder als Lebensgemeinschaften aus verschiedenen Arten oder deren Untergruppen (wie z. B. Bacteriocintypen).

organismen. Die Mehrzahl der antimikrobiellen Substanzen wird von Mikroorganismen (Bakterien, Pilzen) selbst produziert. Welcher Nutzen fr den Produzenten steht Aufwand und Risiken bei deren Produktion gegenber?

Diese sind das Ergebnis der Selektion koexistenzfhiger Stmme derselben oder verschiedener Spezies. Sowohl beim Zustandekommen als auch bei der Erhaltung derartiger Bioznosen sind Mechanismen der Symbiose (z.B. crossfeeding) und der Antibiosc beteiligt. Fr die Antibiose kommt neben Bakteriocinen den selbst produzierten Antibiotika eine natrliche Funktion in der Kompetition mit anderen Mikroorga-

206
Spezies S. pneumoniae H. influenzae

Allgemeine Bakteriologie

Resistenz-Phnotyp Penicillin-R Amoxicillin-R, Augmentan'-R Ampicillin-R, Augmentan-S

Resistenzmechanismus PBP PBP

Tab. 3.13 Interpretation eines Antibiogramms

TEM-1 TEM-1,TEM-2, SHV-1 Inhibitor-resistente TEM-1 Laktamasen ESBL

E. coli

Ampicillin-R, Ceftazidim-S Ampicillin-R, Augmentan-R, Ceftazidim-S Ampicillin-R, Ceftazidim-R, Cefoxitin-S Ampicillin-R, Ceftazidim-R, Cefoxitin-R

Plasmid-codierte AmpC -Laktamasen

Kombination aus Amoxicillin und Clavufansure Spezies oder Genus Enterococais spp., Listeria spp. Klebsiella spp. Proteus mirabilis Stenotrophomonas maltophilia Burkholderia spp., S. maltophilia Burkholderia spp., Proteus spp. Providencia spp., Serratia spp. Resistenz Cephalosporine Aminopenicilline Tetrazykline Carbapeneme Aminoglykoside Colistin Tab. 3.14 Beispiele fr taxon-spezifisches Resistenzverhalten

nismen um den Standort zu. Dabei sollen die Abwehrfunktionen nicht dem Produzenten selbst schaden. Fr diesen Selbstschutz wurden Resistenzmechanismen entwickelt. Die Resistenzgene sind im Verlauf der Evolution durch horizontalen Transfer auf andere Spezies bergegangen und dort zu stabilen Bestandteilen des Genoms geworden. Sie schtzen diese Organismen vor Antibiotika, wobei der Aufwand (costs of fitness) fr die Expression des Resistenzmechanismus hufig am Bedarf orientiert wird, und zwar ber Mechanismen, mit denen Signale aus dem Milieu rezipiert und in die Zelle transduziert werden, ehe Synthese und Sekretion von Abwehrstoffen (z.B. inaktivierende Enzyme von Antibiotika) in Gang gesetzt werden.

Resistenzentwicklung. Eine anlibiotische Therapie kann trotz in vitro Empfindlichkeit des initial isolierten Erregers erfolglos bleiben. Hufigste mikrobiclle Ursache ist die Resistenzentwicklung unter Therapie mit Persistenz des Erregers. Dies wird oft nicht abgeklrt, da hei Nichtansprechen auf eine initiale Therapie (klinisch meist nach 2-3 Tagen erkennbar) mit zustzlichen oder alternativen Antibiotika ohne erneute bakteriologische Analyse weiter therapiert wird. Die Therapie kann aber auch trotz Elimination des ursprnglichen Erregers erfolglos bleiben, wenn ein neuer, die Infektion fortsetzender Erreger mit Resistenz gegenber dem Ausgangsantibiotikum hinzugekommen ist. Dies kann noch whrend der Therapie eintreten (Erregerwechsel) oder erst nach deren Ah-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

207

Schlu (Reinfektion). Wird eine erneute Infektion von einem in allen Merkmalen mit dem initialen Erreger identischen Stamm verursacht (z.B. durch DNA-Fingerprint nachgewiesen), so liegt ein Rezidiv (relaps) vor, u.U. als Folge einer Suppression der Erregervermehrung infolge zu niedriger Antibiotika-Dosierung oder zu kurzer Therapiedauer.
Resistenzentwicklung unter Therapie hat die Frage nach der Rolle der Antibiotika bei der Entstehung der Resistenz aufkommen lassen (Gewhnung"). Tatschlich ist der Nachweis fr das vom Antibiotikum unabhngige Entstehen der Resistenz dadurch erschwert, da die resistenten Zellen nur in Gegenwart des Antibiotikums identifiziert werden knnen, also so nicht entschieden werden kann, ob sie bereits vor Anwesenheit des Antibiotikums vorhanden waren oder erst in Gegenwart des Antibiotikums aufgetreten sind. DCLBRCK und LURIA (1943) lsten dieses Problem mit dem Fluktuationstest. Er widerlegt die LAMARCKJstische Erklrung (Gewhnung" als Ursache der Resistenz) fr die Resislenzentstehung bei Bakterien. Das Prinzip des Experimentes (Abb. 3.31) liegt darin, da bei Annahme eines Adaptationsmechanismus bei initial Antibiotikum-empfindlichen Bakterien aus mehreren unabhngigen Kulturen nach Transfer auf einen Antibiotikum-haltigen Nhrboden aus jeder dieser Kulturen auch jeweils etwa die gleiche Zahl resistenter Zellen nachweisbar sein mte (gleiche Adaptationsbedingungen fr alle Bakterien in allen Kulturen). Tatschlich jedoch schwankt (fluktuiert) die Zahl resistenter Zellen zwischen den verschiedenen Kulturen betrchtlich, und zwar signifikant strker als zwischen mehreren Proben, die aus nur einer der Kulturen entnommen werden. Vergegenwrtigt man sich

Abb. 3.30 Antagonismus Imipenem - Piperacillin bei Pseudomonas aeruginosa.

den exponentiellen Vermehrungsgang innerhalb der Bakterienpopulation, so wird deutlich, da bei Annahme von Spontanmutationen als Ursache der Resistenzentstehung das Eintreten der Mutation (das Entstehen der resistenten Zellen) in verschiedenen Kulturen zu unterschiedlichen Zeitpunkten (in unterschiedlichen Generationen) zu erwarten ist. Damit mu auch die Anzahl der resistenten Zellen am Ende des Experimentes ungleich sein, hatten doch zufllig in einer frheren Generation auftretende Mutanten ber eine grere Anzahl noch bevorstehender Generationen

Abb. 3.31 Fluktuationstest nach DELBRCK und LURIA. S. Text.

208

Allgemeine Bakteriologie

Zeit, sich zu vermehren, als das bei Mutationen gegen Ende der Vermehrungsphase der Population einer Bakterienkultur mglich ist. Damit war Spontanmutation als Ursache vererbbarer Resistenz bewiesen und dem Antibiotikum lediglich die Rolle der Selektion bereits resistenter Mutanten aus der Mischpopulation zugewiesen. Therapieprobleme als Folge von Mutationen zur Resistenz entstehen bevorzugt dann, wenn am natrlichen Standort (Intestinum, Oropharynx) oder am Infektionsort groe Erregerpopulationsdichten vorliegen, die sich auch unter Therapie nur langsam reduzieren lassen.

Resistenzbertragung

Beispiel: bei chronischen oder chronisch rezidivierenden Infekten der tiefen Atemwege (z.B. Tuberkulose, Mukoviszidose) oder der Harnwege (z.B. bei Querschnittgelhmten). Dort ist der antibiotische Selektiondruck zugunsten resistenter Stmme hinreichend, um sie anzureichern, selbst dann, wenn z.B. als Folge einer Deletion die Generationsdauer der resistenten Zellen im Vergleich mit den sensiblen verlngert sein sollte. Die Mutationshufigkeit scheint sich unter Strebedingungen, wie hoher Bakterienkonzentration in der stationren Wachstumsphase, zu erhhen und damit auch die Wahrscheinlichkeit der Selektion von Mutanten mit grerer Fitne in der gegebenen Stresituation. Miverstndlich wurden diese Vorgnge als directed" (gerichtete) oder adaptive Mutationen bezeichnet, obwohl sie nicht im Widerspruch zum Prinzip der Spontaneitt von Mutationen stehen.
Mutationen im bakteriellen Chromosom fhren im allgemeinen zur Resistenz gegenber nur einem Antibiotikum.

Chromosomale Resistenz bleibt zumeist beschrnkt auf dasjenige bakterielle Individuum, in dem das Mutationsereignis eingetreten ist und dessen folgende Generationen (vertikale Resistenzweitergabe). Mikroorganismen knnen aber auch Gene von bereits resistenten Zellen bernehmen (horizontale Resistenzweitergabe). Dies kann erfolgen durch Aufnahme freier DNA (Transformation) oder als Teil eines Bakteriophagengenoms (Transduktion), bzw. im Anschlu an Zellkontakt (Konjugation). Dadurch wird berwiegend nur ein einziges chromosomales Resistenzgen transferiert und kann nach Rekombination in das Genom an die folgenden Generationen vererbt werden. Die Mobilitt von Resistenzgenen kann betrchtlich gesteigert sein durch deren Integration in Transposons. Mit ihnen knnen Gene springen (jumping genes") von Chromosom zu Chromosom, von Plasmid zu Plasmid oder zwischen Chromosom und Plasmid.
Der gleichzeitige Transfer mehrerer Resistenzgene wird mglich bei deren extrachromosomaler Lokalisation auf Plasmiden.

Gleichzeitige Mutationen zur Resistenz gegenber zwei Antibiotika mit verschiedenen Resistenzmechanismen bei demselben bakteriellen Individuum (Doppelresistenz) sind extrem selten (bei einer Mutationsfrequenz von z.B. jeweils 10~7 fr eines der beiden Gene also 10~14 fr ein Bakterium, das zugleich gegen beide Antibiotika resistent ist). Das Risiko fr den Aufbau chromosomaler Multi-Resistenzen ist deshalb selbst bei langdauernden chronischen Prozessen bei Kombinationstherapie gering (z.B. Tuberkulose), bei konsekutiver Monotherapie jedoch betrchtlich (z.B. Chinolon-, Makrolid-, und Tetrazyklin- Resistenz bei zunchst nur Methicillinresistenten Staphylokokken).

Diese knnen neben Genen fr vom Chromosom unabhngige (autonome) Replikation und fr den bertragungsmechanismus (tra-Gene) Gene fr Resistenz gegenber Antibiotika verschiedener Gruppen tragen (vgl. Kap. 3.3). Vereinzelt wurden in derselben Kopplungsgruppe zustzlich Gene fr Virulcnzfaktoren wie Toxine oder Adhsine gefunden. Antibiotika-empfindliche Wildtypstmme (Rezipienten) werden nach Aufnahme derartiger Resistenz- (R-) Faktoren resistent und gleichzeitig zu bertrgern (Donatoren). So kann es zu rascher (infektiser") Ausbreitung von Resistenz innerhalb einer Bakterienpopulation, aber auch auf Stmme anderer Spezies oder Genera kommen. Dadurch kann ein Erreger zugleich resistent werden gegenber Penicillinen, Cephalosporinen, Monobaktamen, Carbapenem, Aminoglykosiden. Chloramphenicol, Tetrazyklinen, Sulfonamiden. Trimethoprim. Da alle Resistenzdeterminanten auf einem DNA-Stck hintereinander liegen (Kopplungsgruppe), selektiert jedes einzelne der Antibiotika die Multiresistenz. So findet man auch heute noch Chloramphenicol-resistente E. co//-Stmme, obwohl mit diesem Antibiotikum kaum mehr therapiert wird, da es hufig mit Determinanten fr andere, noch verwende-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

209

te Antibiotika (z.B. Ampicillin) auf einer Kopplungsgruppe angeordnet ist.


Resistenzmechanismen

Antimikrobielle Wirkung einer Substanz setzt deren Vordringen in aktiver Form bis zu ihrem nativen Angriffspunkt voraus. Wirkungsmindernd sind demnach alle Mechanismen, welche das Eindringen der Substanz in die Zelle erschweren, ihre Bindefhigkeit an den Angriffspunkt verringern oder sie inaktivieren. Mikroorganismen schtzen sich vor Chemotherapeutika durch verschiedenartige Mechanismen. Diese, sowie die Lokalisation der Resistenz-Gene sind in Tab. 3.15 zusammengestellt. Fr dieselbe Substanzgruppe knnen bis zu 4 verschiedene Resistenzmechanismen existieren. Der Resistenz-Phnotyp einer Bakterienzelle kann das Ergebnis des Zusammenwirkens mehrerer Resistenzmechanismen sein, z.B. von enzymatischer Inaktivierung plus verminderter Permeabilitt oder von vermindertem Eindringen (Influx) plus aktivem Efflux. Die spezifi-

schen Resistenzmechanismen und deren jeweilige Bedeutung fr einzelne Substanz- und Erregergruppen werden bei den einzelnen Antibiotika behandelt. Ihnen gegenber stehen unspezifische Mechanismen der Antibiotika-Resistenz, welche gleichzeitig die MHK-Werte fr Substanzen unterschiedlicher Substanzklassen erhhen. Das gilt insbesondere fr solche Mechanismen, durch die bereits in die Zelle eingedrungene Antibiotika wieder aktiv entfernt werden, noch bevor sie ihren Wirkort im Zytoplasma erreichen konnten. Charakteristisch fr viele dieser Efflux-Pumpen ist das breite Spektrum der von ihnen aus der Zelle entfernten Substanzen (Multidrug-Efflux-Systems). Sie weisen eine hnliche Architektur auf wie Mechanismen zur Proteinsekretion (z.B. von Hmolysinen). Derartige Efflux-Mechanismen sind im Zusammenwirken mit verminderter Permeation durch die uere Membran Ursache der primren Resistenz gramnegativer Bakterien gegenber den meisten Schmalspektrum-Antibiotika (Makroli-

Tab. 3.15 Mechanismen der Antibiotika-Resistenz Antibiotika-Gruppe Resistenzmechanimus -Laktarne AminoChloramglykoside phenicol Makro SulfonTetraChinolide amide/ zykline lone Trimethoprim P C C C/P C/P C Vancomyein Polymyxin

enzymatische Inaktivierung MembranImpermeabilitt aktives Herauspumpen des Antibiotikums (Efflux) Vernderung des Ribosoms Vernderung der Zellwandbausteine Vernderung der Zielenzyme berproduktion der Zielenzyme Mutanten zur Auxotrophie

C/P C

C/P C

P P

C/P

C/P

C/P

C/P C C/P

P = Plasmid-codiert, C = chromosomal codiert

210

Allgemeine Bakteriologie

Abb. 3.32 Pharmakokinetik antibakterieller Substanzen (SRCEL, 1993). - Cm = Maximale Plasmakonzentration am Ende der Infusion nach parenteraler Applikation oder der Zeitpunkt der maximal erreichbaren Konzentration nach oraler Applikation. AUC = Area under curve - Flche unter der Plasmaspiegelkurve. Die Flche, die zwischen der Zeitachse (Abszisse) und Konzentrationsachse (Ordinate) und der Plasmakonzentrationskurve gebildet wird. -\}/2 = terminale Halbwertszeit. Sie wird bestimmt, wenn alle Resorptions- (orale Gabe) und Verteilungsvorgnge (i.v. oder oral) abgeschlossen sind. - MHK = minimale Hemmkonzentration. Als Zielparameter fr die Wirksamkeit, zu dem die maximale Konzentration als Cmax/MHK-Quotienten bzw. die Zeit oberhalb der MHK (in der Abbildung durch einen Pfeil nach unten gekennzeichnet) dargestellt ist.

Abb. 3.33 Simulation einer Plasmaspiegelkurve nach intravenser und nach oraler Applikation (SRCEL, 1993). Aus den jeweils berechneten AUCWerten wird ein Quotient F = AUC p.o. 4- AUC i.v. gebildet, der die absolute Bioverfgbarkeit, also die Resorbierbarkeit der Substanz aus dem Magen-DarmTrakt, angibt.

de, Fusidinsure, Rifampicin). Die Expression stummer oder die verstrkte Expression konstitutiver Multidrug-Efflux-Gene (z.B. durch Mutation im Repressor-Gen des Operons) kann zur Resistenzentwicklung fhren (z.B. bei P. aeruginosa zur Doppelrcsistenz gegen Fluorochinolone und Imipenem). Efflux-mechanismus-korrelierte Resistenz gegen Chloramphenicol, Tetrazykline, Fluorochinolone, Imipenem und -Laktame tritt unter einem Teil der Isolate von Enterobakterien, P. aeruginosa und Neisseria gonorrhoeae auf. Neuerdings werden Substanzen entwickelt, welche Efflux-Mechanismen inhibieren.

3.5.4 Pharmakologische Grundlagen


Pharmakokinetik

Chemotherapeutika unterscheiden sich in ihrem pharmakokinetischen Verhalten im Organis-

mus. Aber auch fr dieselbe Substanz knnen z.T. erhebliche Unterschiede je nach Alter des Patienten, Grundkrankheit und Funktionszustand von Niere und Leber bestehen. Eine fr die praktische Anwendung entscheidende Gre ist die Bioverfgbarkeit einer antibiotischen Substanz. Darunter versteht man das Ausma und die Geschwindigkeit, mit der das Antibiotikum in der systemischen Zirkulation des Organismus verfgbar ist. Zur Messung der Bioverfgbarkeit wird die Serumkonzentrationszeitkurve nach einmaliger Applikation des Antibiotikums bestimmt (Abb. 3.32). Aus dieser Kurve lassen sich die maximale Serumkonzentration (Cmax) und der Zeitpunkt der maximalen Serumkonzentration (tmax) bestimmen. Aus der Flche unter der Plasmaspiegelkurve (area under the curve, AUC) und der verabreichten Dosis lt sich die Gesamtkrper-Clearence, d.h. also die Gesamtfhigkeit des Organismus, diese Substanz auszuscheiden, berechnen. Multipliziert man diese mit der renal ausgeschiedenen Menge (in Prozent), so erhlt man die renale Clearence. Die Differenz zwischen totaler und renaler Clearence ist die nichtrenale Clearence. Bei der oralen Gabe eines Antibiotikums ist seine Resorbierbarkeit eine wichtige Gre (Abb. 3.33). Voraussetzung dafr ist zunchst die Surestabilitt, d.h. die Substanz mu den Magen

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

211

unbeeinflut passieren und so an die Resorptionsorte im Dnndarm gelangen knnen. Weiterhin mu die Substanz in gelster Form vorliegen und ausreichend fettlslich sein. Die Resorbierbarkeit eines Antibiotikums wird einmal durch seine galenischen Eigenschaften (z.B. Partikelgre, Lslichkeit) sowie physiologische oder pathologische Zustnde des Patienten (Alter, Magen- und Darmmotilitt, gleichzeitige Nahrungsaufnahme) bestimmt. Von Einflu ist auch die prsystemische Elimination; darunter versteht man die potentielle Metabolisierung eines Arzneimittels in der Darmschleimhaut und/oder der Leber, die vor dem Eintreten in den systemischen Kreislauf stattfindet (,,first-pass"-Effekt). Eine weitere wichtige Gre ist die Art der Verteilung des Antibiotikums im Organismus. Sie wird im wesentlichen durch 3 Faktoren bestimmt. Zum einen durch die Fhigkeit, in Gewebe zu gelangen bzw. besondere Organschranken wie z.B. die Blut-Hirn-Schranke oder die Plazentarschranke zu passieren und sich passiv oder durch aktiven Transport intrazellulr anzureichern. Diese Eigenschaften hngen wesentlich von der chemischen Struktur der jeweiligen Substanz ab. So erreicht z.B. Nalidixinsure keine wesentlichen Plasmaspiegel, aber hohe Urinspiegel. Chinolone erreichen hohe Gewebskonzentrationen, etwa in Hhe der Plasmaspiegel, und Chloramphenicol, Makrolide. Tetrazyklinc und Chinolone knnen intrazellulr angereichert werden. Nur wenige Substanzen sind in der Lage, auch bei intakter Blut-Liquor-Schranke in hohen Konzentrationen in den Liquor zu gelangen wie z.B. Chloramphenicol. Penicilline knnen dies nur aber auch nur eingeschrnkt - wenn die Blut-LiquorSchranke, z.B. bei Meningitis, zusammengebrochen ist, whrend Aminoglykoside auch dann nicht in den Liquorraum gelangen. Dieses hat direkt klinisch-praktische Konsequenzen fr die Auswahl von Chemotherapeutika bezogen auf die Infektionslokalisation (z.B. Meningitis), aber auch auf den Erreger (Chlamydien intrazellulre Erreger - Tetrazykline). Ein weiterer, die Verteilung bestimmender Faktor sind Hhe und Strke der Plasmaproteinbindung. Fr Antibiotika gilt, da nur der nicht gebundene Anteil wirkfhig ist. Der dritte, die Verteilung eines Antibiotikums charakterisierende Faktor ist das Verteilungsvolumen. Dies ist eine hypothetische Gre, welche die Antibiotikakonzentration im Plasma zu der im Gesamtkrper in Beziehung setzt. Das Verteilungsvolumen setzt sich aus drei Kompartimenten zusammen: dem vasalen Raum, dem extravasalen Raum und dem intrazellulren Raum. Vor allem

bedingt durch Penetrationsfhigkeit und Plasmaproteinbindung ergeben sich fr die einzelnen antibiotischen Substanzen zum Teil erhebliche Unterschiede im Verteilungsvolumen von berwiegend intravasal (z.B. Aminoglykoside) bis hin zu berwiegend intrazellulr (z.B. Chinolone). Schlielich sind Art und Schnelligkeit der Elimination wichtige pharmakokinetische Parameter. Die Elimination eines Antibiotikums kann entweder in unvernderter Form erfolgen oder nach vorhergehender Metabolisierung in der Leber. Wichtigstes Eliminationsorgan ist die Niere, ber die durch glomerulre Filtration und/oder tubulre Sekretion die meisten Antibiotika bzw. ihre Metaboliten ausgeschieden werden. Weiteres Ausscheidungsorgan ist die Leber, aus der viele der gebildeten Metaboliten via Galle in den Darm gelangen und dann mit den Fzes ausgeschieden werden. Das Ma fr die Elimination durch den Organismus ist die Clearance (s.o.), fr die Geschwindigkeit der Elimination die Halbwertszeit (Un)- die wiederum durch das Verteilungsvolumen und die Clearance festgelegt wird. Bezglich des Eliminationsweges lassen sich drei Typen von Antibiotika festlegen (Tab. 3.16). Antibiotika des Typs 1 (Pcnicillin-Typ) werden nicht oder nur gering metabolisiert und damit berwiegend unverndert ber die Nieren ausgeschieden. Damit kumulie-

Tab. 3.16 Ausscheidungstyp von Chemotherapeutika 1. Penicillintyp Penicilline Cephalosporine (Ausnahmen: Typ 2) Aminoglykoside Ofloxacin Enoxacin 2. Chlorampnenicoltyp Chloramphenicol Doxycyclin Clindamycin *Ciprofloxacin

*MetronidazoI
*Cefoperazon

*Ceftriaxon
3. Nitrofurantointyp Nitrofurantoin Pipern idsure
* Bei funktionell Nierenlosen Dosisreduktion erforderlich wegen der nicht metabolisierten Anteile

212

Allgemeine Bakteriologie

ren diese Substanzen in direkter Abhngigkeit von der Nierenfunktion. Zum Typ 2 (Chloramphenicol-Typ) gehren die Antibiotika, die nahezu vllig metabolisiert und nur ganz gering in unvernderter Form ausgeschieden werden. Diese Substanzen knnen unabhngig von der Nierenfunktion dosiert werden, sind aber problematisch bei starken Leberfunktionseinschrnkungen. Substanzen vom Typ 3 (Nitrofurantoin-Typ) erreichen keine bedeutenden Plasmaspiegel, werden aber in hoher Konzentration im Urin ausgeschieden. Auch diese Substanzen kumulieren natrlich bei Nierenfunktionsslrung. Art und Geschwindigkeit der Elimination eines Antibiotikums sind praktisch einmal mitentscheidend fr die Festlegung von Dosis und Applikationsintervall und entscheiden andererseits darber, wann bei welcher Organfunktionseinschrnkung - Niere und/oder Leber - eine Anpassung zu erfolgen hat (s. Kap. 3.5.7).
Pharmakodynamische Prinzipien

de dagegen als Einmalgabe gegeben werden knnen. Ein weiteres wichtiges pharmakodynamisches Prinzip betrifft den postantibiotischen Effekt (PAE) einer Substanz. Hierunter versteht man die fortdauernde Wachstumshemmung eines Bakteriums ber den Zeitpunkt hinaus, wo noch mebare Konzentrationen der Substanz nachweisbar sind. Der PAE ist fr die jeweiligen Antibiotika bezogen auf eine bestimmte Erregerart vorhanden oder nicht bzw. unterschiedlich lang. So haben Penicilline und Cephalosporine keinen PAE auf gramnegative Bakterien, dafr aber Carbapencmc, Aminoglykoside und vor allem Fluorochinolone. Fr praktische Belange hat daher die Dauer des PAE auch einen Einflu auf das Dosierungsintervall (z.B. Einmaldosierung von Aminoglykosiden).
Nebenwirkungen
Jede Gabe von Antibiotika ist auch mit dem potentiellen Risiko von Nebenwirkungen verbunden.

Erst in jngerer Zeit rcken vermehrt pharmakodynamische Gesichtspunkte bei der antibakteriellen Chemotherapie in den Blickpunkt. Pharmakodynamik beschreibt die Beziehung zwischen pharmakokinetischen Parametern eines Antibiotikums zu seiner antibakteriellen Wirkung und damit letztlich zum erzielten klinischen Effekt (clinical outcome). Einmal knnen pharmakokinetische Megren, die den Konzentrations-Zeit-Verlauf einer Substanz bestimmen, zu einer wichtigen Megre der antibakteriellen Wirkung, der minimalen Hemmkonzentration (MHK) in Beziehung gesetzt werden: Dauer der Konzentration oberhalb der MHK (time over MIC, toMIC), Verhltnis von Serumspitzenspiegel zur MHK (peak/MIC-ratio) und Verhltnis von Flche unter der Kurve zur MHK (AUC/MIC-ratio). Unter Verwendung dieser Megren aus in vitro Untersuchungen, tierexperimentellcn Modellen und klinischen Studien lassen sich die einzelnen Substanzen unterschiedlich charakterisieren und Ableitungen fr Dosierung, Applikationsintervall etc. treffen. So ist z.B. der antibakterielle Effekt der meisten -Laktame konzentrationsunabhngig, hier ist also die toMIC" wichtig. Dies gilt nicht fr Aminoglykoside und Fluorochinolone, hier sind AUC/M1C" und peak/MIC" entscheidend. Praktisch bedeutet dies, da -Laktame hufiger oder als Dauerinfusion appliziert werden mssen, Aminoglykosi-

Man unterscheidet dabei Nebenwirkungen, die auf ihrer Hauptwirkung beruhen von solchen, die eine echte" Nebenwirkung darstellen. Unerwnschte Nebenwirkungen als Folge der Hauptwirkung, d.h. der antibakteriellen Wirkung, lassen sich als biologische Nebenwirkungen zusammenfassen (s.u.). Die echten" Nebenwirkungen sind Folge der unerwnschten, aber nicht vermeidbaren Interaktion mit eukaryonten Zellen. Fr praktische Belange hat sich hierbei die Unterscheidung in toxische, allergische sowie teratogenc und karzinogene Nebenwirkungen bewhrt. Ihnen liegen auch entsprechend unterschiedliche Pathomechanismen zugrunde.
Toxische Nebenwirkungen

Alle toxischen Effekte sind dosisabhngig und setzen keine vorherige Sensibilisierung voraus. Sie sind daher hufig Folge einer absoluten oder relativen berdosierung oder einer unsachgemen Applikation. Man unterscheidet bei den toxischen Nebenwirkungen akut-toxische Schdigungen von chronisch-kumulativen Schdigungen, die als Folge einer zu hohen Gesamtdosis ber eine bestimmte Zeiteinheit auftreten.
Akut-toxische Schdigungen sind z.B. die unmittelbar im Zusammenhang mit der oralen Gabe auftretende Magen-Darmunvertrglichkeit oder Venenwandsch-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

213

digungen mit starken Schmerzen bei zu schneller i.v.Applikation eines Antibiotikums. In diese Kategorie gehrt auch das Auftreten von Gevvebsnekrosen durch falsche, paravasale Injektionen. Klassisches Beispiel fr chronisch-kumulativ-toxische Schdigungen sind die Beeintrchtigung von Gleichgewichtsorgan und Innenohr nach zu langer Aminoglykosidgabe. Toxische Schdigungen knnen also sowohl lokal als auch systemisch auftreten. Eine weitere Unterscheidung der toxischen Nebenwirkungen ergibt sich daraus, ob die Schdigung reversibel oder irreversibel ist. So ist eine Knochenmarksdepression mit vorbergehender Leukopenie und/oder Thrombopcnie fast immer nach Absetzen des Antibiotikums reversibel, whrend eine Innenohrschdigung durch Aminoglykoside mit einem dauerhaften Hrverlust verbunden sein kann. In der Tab. 3.17 sind hufige Nebenwirkungsmglichkeiten und Beispiele fr verursachende Substanzen aufgefhrt. Zu beachten ist, da bestimmte Patientengruppen von vornherein strker in Richtung toxischer Nebenwirkungen gefhrdet sind. Hierzu gehren einmal Patienten, die schon physiologischerweise Einschrnkungen der Elimination und/ oder Metabolisierung aufweisen, wie Frh- und Neugeborene (noch keine vollstndige Ausreifung von Leber und Knochenmark) oder ltere Menschen (deutlich verminderte renale Clcarance, herabgesetzt von normal 120 ml/min auf 60-70 ml/min). Dann Patienten mit pathologischer Einschrnkung bestimmter Organfunktionen wie z.B. bei Hcpatopathie oder Niereninsuffizienz.
Allergische Nebenwirkungen

dosisabhngig, setzt aber die vorherige Sensibilisierung voraus. Allergische Nebenwirkungen sind unabhngig von der Hauptwirkung und kommen durch eine spezifische Immunantwort bei entsprechend sensibilisierten Patienten zustande, frhestens nach einer Latenzzeit von 1-2 Wochen nach der Erstexposition. Aufgrund der beteiligten Immunmechanismen werden 4 Typen allergischer Reaktionen unterschieden (Tab. 3.18). Da allergische Wirkungen nicht wirkstoffspezifisch sind, knnen sie durch strukturell verwandte Verbindungen ausgelst werden (partielle oder absolute Kreuzallergie). Da viele antibiotische Substanzen zumindest a Grundsubstanz Naturstoffe sind, kann die notwendige Sensibilisierung auch durch Kontakt mit dem Naturstoff erfolgen, mu also nicht Folge einer frheren Antibiotikagabe sein (z B. Penicillinallergie).
Diagnostisch abzutrennen von den echten allergischen Nebenwirkungen sind die pseudoallergischen Reaktionen, die nicht immunologisch bedingt sind, sondern nur ein hnliches Reaktionsmuster bieten. Sie sind immer Folge einer Freisetzung von Mediatoren allergischer Reaktionen z.B. aus Mastzellen durch die direkte Wirkung des Antibiotikums. Hieraus kann das gleiche klinische Bild wie bei einer echten anaphylaktischen Reaktion entstehen. Typisches Beispiel ist das sogenannte Red-Neck"- oder Red-Man"-Syndrom bei zu schneller Gabe von (nicht chromalographisch gereinigtem) Vancomycin, bei dem es zu einer rasch aufschieenden Hautrtung im Schulter-Nackenbe-

Das Auslsen einer allergischen Reaktion ist nicht immer wirkstoffspezifisch und auch nicht
toxische Nebenwirkung gastrointestinale Strungen Thrombophlebitis Transaminasenerhhung Nierenschdigung Leberschdigung Innenohrschdigung Knochenmarksaplasie Leukopenie Thrombozytopenie Gerinnungsstrungen Alkoholintoleranz periphere Neuropathien ZNS-Strungen Chemotherapeutikum

Tab. 3.17

Ampicillin, Amoxicillin/Clavulansure, Cefuroxim-Axetil, Chinolone, Makrolide, Nitrofurantoin, Tetrazykline Ciprofloxacin, Dicloxacillin, Imipenem, Metronidazol Apalcillin, Cefuroxim, Cefoxitin, Ciprofloxacin Aminoglykoside, Vancomycin Clindamycin, Erythromycin, Rifarnpicin Aminoglykoside, Glykopeptide Chloramphenicol -Laktame, Glykopeptide, Ofloxacin Cotrimoxazol, Glykopeptide, Ofloxacin Methylthiotetrazol-Cephalosporine (z.B. Latamoxef), Penicilline Methylthiotetrazol-Cephalosporine Metronidazol, Tetrazykline Imipenem, Metronidazol, Minocyclin, Ofloxacin

Beispiele fr mgliche toxische Nebenwirkungen von Chemotherapeutika

214

Allgemeine Bakteriologie

TAB. 3.18 Allergische Nebenwirkungen Chemotherapeutika Allergietyp Manifestation Typl (Reagintyp) Rtung, Schwellung, Urtikaria, deme incl. Clottisdern, abdominelle Angina, Bronchospasmus, Hemikranie, anaphylaktischer Schock Leukopenie, hmolytische Anmie, thrombozytopenische Purpura Serumkrankheit, vaskulre Purpura

von

Biologische Nebenwirkungen

Typ II (zytotoxischer Typ) Typ III (Serumkrankheitstyp) Typ IV (Spttyp)

Kontaktekzem, Photoallergie

Typ I-Ill: humoral-vermittelte Frhreaktionen; Typ IV: zellulr-vermittelt

Biologische Nebenwirkungen beruhen auf unerwnschten Effekten der Hauptwirkung, also der antibakteriellen Wirkung von Antibiotika. Jede Antibiotikagabe ist mit einer mehr oder weniger starken Beeinflussung der Normalflora verbunden. Folge ist die zumindest partielle und zeitweise Reduktion der Normalflora und das isolierte berwuchern resistenter Keimarten der jeweiligen Standortflora. Da die Normalflora z.B. durch die Produktion inhibitorischer Substanzen eine Rolle in der antiinfeklisen Barrierefunktion von Haut- und Schleimhuten spielt, kann es zur Kolonisierung mit fakultativ-pathogenen Bakterien, Pilzen und Viren kommen. Klinisch manifestieren sich diese Nebenwirkungen z.B. als Soorkrankheit von Mund und Vagina, orale Aphthosis ulcerosa oder schwere Sekundrinfektionen wie eine Candidapneumonie. Eine solche Nebenwirkung ist auch die Antibiotika-assozierte Pseudomembranse Kolitis (AAPC).
Unter oder nach Antibiotikatherapie kommt es zu einem berwuchern mit Clostridium difficile, das zwei Toxine bildet, die einen enterotoxischen bzw. zytopathischen Effekt auf die Mukosa des Darmes haben. Klinisch imponieren blutige Durchflle mit kolikartigen abdomincllen Schmerzen, bis hin zum akuten Abdomen. Gleichzeitig besteht hohes Fieber mit Schttelfrost. Klinisch-chemisch findet man Leukozytosc. BSG-Erhhung. Thrombopenie und Hypalbuminmie. Koloskopisch zeigen sich ein dem der Mukosa. weie Plaques und Pseudomembranen aus Fibrin, Granulozyten und Zelldetritus. Komplikationen sind das toxische Megakolon. spontane Dickdarmperforationen. Peritonitis und Sepsis (siehe auch spezielles Kapitel). Dem Vollbild der pseudomembransen Kolitis kann eine Antibiotika-assoziiertc Diarrhe ohne koloskopisch sichtbare Zeichen vorausgehen. Mit Ausnahme der Glykopeptide Vancomycin und Teicoplanin und von Metronidazol kann eine Therapie mit smtlichen Antibiotika dieses Krankheitsbild zur Folge haben. Eine besondere Hufung findet sich nach oraler Gabe von Aminopcniciinen mit geringer enteraler Resorption wie Ampicillin sowie nach systemischer Therapie mit Clindamycin.

reich, verbunden mit Angstgefhlen und Kreislaufdysregulationen kommt.


Teratogene Wirkungen

Teratogene Wirkungen von Antibiotika knnen durch mutagene Wirkungen, aber auch durch toxische Schdigungen whrend der Organogenese bedingt sein. So fhrt die Gabe von Aminoglykosiden bei einer Schwangeren je nach Abhngigkeit von Dosierung und Dauer mit hoher Wahrscheinlichkeit zu einer Innenohrschdigung des Ften. Prklinische Untersuchungen von Antibiotika zur potentiell teratogenen Wirkung sind sehr schwierig und nicht immer aus Tiermodellen auf den Menschen bertragbar. Entsprechend ist eine hchstmgliche Zurckhaltung bei der Applikation von Antibiotika whrend einer Schwangerschaft geboten. Hier wird die Indikationsstellung mageblich durch die vitale Bedrohung der Mutter beeinflut. Lediglich die meisten Penicilline und Cephalosporine, und mit Einschrnkung Makrolide, knnen whrend der Schwangerschaft angewendet werden.
Noch schwieriger ist die Feststellung einer potentiell karzinogenen Wirkung von Antibiotika, weil sich diese erst nach einer sehr langen Latenzzeit feststellen lt. Hier sind Langzeitbeobachtungen nach Registrierung einer antibiotischen Substanz von entscheidender Bedeutung.

Eine weitere wichtige biologische Nebenwirkung einer Antibiotikatherapie sind die HERXHEIMER-Reaktion oder HERXHEiMER-hnliche Reaktionen.
Darunter versteht man das Auftreten von Fieber. Schttelfrost, Schweiausbruch, Tachykardie und eventuell akuter Niereninsuffizienz kurz nach Beginn einer Antibiotikatherapie. In schweren Fllen kann es zum Vollbild des Schocks kommen. Pathogenetisch zugr