CAPITOLUL I OBIECTUL DE STUDIU AL GENETICII UMANE

Biologia este stiinta care se ocupa cu studiul legilor ce stau la baza originii, organizarii si evolutiei organismelor vii. Desi cunoscuta din antichitate, Biologia s-a dezvoltat si se dezvolta permanent, reprezentand fundamentul teoretic pentru discipline ca : genetica, anatomia, fiziologia, embriologia, antropologia, patologia genetica, imunobiologia, biologia celulara, etc. Dezvoltarea biologiei a fost si este conditionata de dezvoltarea tehnicii si perfectionarii metodelor de studiu si cercetare, cautandu-se o permanenta preocupare de a elucida relatia omului cu universul, cu mediul inconjurator care este in permanenta schimbare. Este stiinta cu caracter nerestrictiv. Dar lumea vie se compune dintr-un mare numar de individualitati, care, prin similitudini de forma, structura, functii, se grupeaza in populatii, in specii. Similitudinile se mentin in succesiunea generatiilor in populatie datorita capacitatii de a transmite, in forma codificata, ansamblul de caractere specifice populatiei sau speciei, dar si cu particularizari fenotipice ale fiecarui individ in populatie. Diversitatea fenotipica a indivizilor in populatie este consecinta recombinarii aparatului genetic in meioza si fecundatie, a proceselor cronogenetice si cronobiologice in activitatea genomului. Este influenta unor secvente tranzitionale din genom, sau efectul distructiv indus de factori fizicochimici si biologiei agresivi, capabili sa modifice aparatul genetic al celulelor din organism. Complexitatea acestor procese particulare organismelor vii a impus aparitia unei stiinte biologice bine delimitata : GENETICA. GENETICA este stiinta ereditatii, variabilitatii si reproducerii organismelor vii. Este stiinta fundamentala. Relativ tanara, genetica a avut o evolutie rapida, diversificandu-se in mai multe directii de cercetare si anume: - genetica umana fundamentala - genetica moleculara - genetica medicala - genetica populatiei sau antropologica - cronogenetica 9

- si cronobiologia dezvoltarii organismelor. Genetica, sinteza dinamica a datelor si descoperirilor din biofizica, biochimie, biomatematica, cibernetica, semantica, citologie, etc., ne ofera cheia" dezlegarii necunoscutelor fiintelor vii. Genetica permite sa cunoastem structura materialului ereditar, mecanismelor de conservare sau de diferentiere a caracterelor pe fond genetic, sa cunoastem factorii cu potential de modificare a structurii si functiei aparatului genetic (mutatiile). Tot genetica descifreaza macanismele si procesele de diferentiere, de dezvoltare ontogenetica (normala si/sau patologica). Ea permite elaborarea de metode pentru clonarea terapeutica, de fertilizare in vitro, etc. Prin extrapolarea principiilor Biologiei si Geneticii in patologia umana, s-a conturat o disciplina medicala fundamental : Genetica Medicala". Genetica umana, Genetica medicala studiaza principiile, procesele, mecanismele si legile care guvemeaza diferentierea, cresterea, reproducerea si dezvoltarea indivizilor din populatiile umane. Analizeaza relatiile dintre individ si populatiile conspecifice, ca produs al evolutiei normale sau patologice a omului, in raport cu mediul sau de viata. Genetica medicala contribuie la elaborarea mijloacelor terapeutice eficiente in combaterea, corectarea si preintampinarea aparitiei bolilor genetice in familie, in populatie. Deasemenea asigura starea de sanatate fizica si psihica a omului. Recentele achizitii stiintifice in genetica confirma valoarea extrapolarii principiilor acestei stiinte in medicina, cu posibilitatea cunoasterii complexe a omului normal sau bolnav. Datorita progreselor in biologie si biogenetica, J. Bernard afirma ca Genetica este strans legata de interesele omului, de societate. De aceea spunea Bernard: ....genetica cere cu necesitate clarificarea stiintifica a proceselor biologice, abordarea stiintifica a evolutiei genomului uman, cunoasterea, la toate nivelele de organizare, a organismului si viitorul genetic al omului..." Linus Carl Pauling (1949) afirma urmatoarele: ...dintre toate sistemele naturale, materia vie este aceea care, prin imensele sale transformari, pastreaza cea mai mare parte a propriei sale treceri istorice inscrise in organizarea sa. Ca nu exista alt sistem ca eel biologic, care sa fie constant suprimat si simultan mentinut, si ca este suficient a ne interoga pe noi insine pentru a sti in care dintre sistemele vii actuale s-a realizat cea mai mare parte a trecerii istorice...".

10

Genetica cauta sa descifreze interrelatiile dintre componenta genetica a organismului si factorii de mediu, de a descifra interferentele de influenta si/sau efectele distinctive, intre genotip si mediul ambiant. Genetica, stiinta cu caracter nerestrictiv, studiaza complexitatea structural-functional-comportamentala a omului, in care rolul primordial il are genomul, constituit in momentul formarii zigotului prin procesul de fecundatie. Pentru o corecta apreciere a aparatului genetic care controleaza caracterele exprimate fenotipic, este necesara cunoasterea unor marimi pe care Dubinin (1969) le mentiona pentru om : - celula gametica la om contine aproximativ un sfert de microni cubi 3 (miu ) de acizi nucleici, in greutate de 4x10 12 g (grame) ; - populatia terei este estimata la sase miliarde de locuitori : 6x109; - nasterea acestui numar de oameni necesita 12xl09 gameti haploizi (6x109 ovule si 6x109 spermatozoizi); - volumul total al acizilor nucleici existent in cele 12 miliarde de gameti haploizi se estimeaza la 4,8 mm3 si o greutate de 48 mg ADN; - intr-un vol urn egal cu o picatura de ploaie este inmagazinata componenta moleculara, ADN-ul, pentru cele 6 miliarde de indivizi umani; - dar corpul uman are aproximativ 6xl013 celule, din care se distrug in 24 de ore cca 5x10" celule. Dar tot atatea se produc, asigurand regenerarea fiziologica si mentinerea integritatii morfo-functionale a organismului. Datele prezentate de Dubinin evidentiaza complexitatea constitutionala a speciei Homo sapiens.

11

CAPITOLUL II EREDITATEA LA OM
Ereditatea este functia biologica a organismelor vii de a conserva si transmite caracterele morfo-structurale, moleculare, fiziologice si comportamentale de la o generatie la cele care-i succed. Este latura sincronica, de conservare si transmitere a informatiei genetice, prin care este mentinut axul structural-functional al speciei in spatiu si timp. Ereditatea conserva caracterele, le stabilizeaza. Pentru studiul ereditatii, in fata geneticienilor au fost formulate o serie de intrebari ca: - Ce se transmite? Care este natura fizico-chimica a materialului genetic mostenit de la parinti? - Cum este transmis materialul genetic? Care sunt mecanismele ce asigura continuitatea intre generatii? - Cum actioneaza materialul genetic? - Daca raspunde destructiv la interferentele cu factorii agresivi din mediu si care sunt efectele fenotipice asupra indivizilor? Sunt intrebari fundamentale la care genetica raspunde, explica, demonstreaza, convinge. Viata precede intricatiei fenomenelor dinamice, legate de structurile specifice ale celulei, ale organismului. Dinamismul", propriu vietii, este exprimat sub diversele activitati metabolice care asigura cresterea si functiile organismului. Suportul acestui dinamism este asigurat de moleculele proteice, cu rol structural sau enzimatic, ce se caracterizeaza prin specificitate de structura si functie. Identitatea si specificitatea proteinelor de la o generatie la alta in cadrul speciei sunt garantate si realizate prin mecanisme informational codificate, de biomoleculele genomului uman. Biomoleculele care detin, in forma codificata, informatiile genetice se caracterizeaza prin aranjari particulare ale componentelor structurale, realizand ceea ce numim masinaria genetica", "banca genetica" de informatii din genomul organismului. Dar spre deosebire de variabilitate, ereditatea, ca functie sincronica, stabilizeaza caracterele datorita macromoleculelor codante. 12

Macromoleculele codante implicate in functiile de ereditate si variabilitate trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii : - sa detina informatia necesara structurii, functiei si stabilitatii" de reproducere in celulele organismului. Aceasta informatie o gasim codificata in ordonarea aperiodica a monomerilor, ca unitati de structura ce alcatuiesc aparatul genetic molecular al celulei, in ADN; - sa fie capabile de autoreplicare (autocatalitica), mecanism care asigura trecerea nemodificata" a informatiei genetice din celula mama spre celulele fiice ce rezulta prin diviziune; - sa exercite functia heterocatalitica, cand, prin decodificarea informatiilor genetice inscrise in structura lor, sa asigure sinteza de ARN mesager care, in citoplasma, realizeaza sinteza proteinelor cu structura specifica, in conformitate cu mesajul genetic copiat. - sa prezinte o oarecare labilitate" ca raspuns la interferanta cu factorii de mediu potentiali agresivi si cu efecteie distructive asupra moleculelor codante. Aceste conditii sunt indeplinite de acidul dezoxiribonucleic (ADN-ul), care, virtual, isi exercita functiile la toate organismele: procariote si eucariote. Datorita procesului convergent intre informatia codanta si proteine, apar similitudini de forma structura si functii intre indivizii conspecifici, dar si o divergenta fenotipica interindivizi, definind individualitatile in populatie. De exemplu, fenotipul unui individ este o sinteza" complexa de elemente mostenite de la generatiile ascendente, realizata prin procesul informativ, codificata , transmisa si mostenita. Trasaturile fenotipice le grupam in categorii de caractere dupa cum urmeaza: - caractere specifice care particularizeaza specia; - caractere intraspecifice sau individuale particulare si de diferentiere a indivizilor conspecifici; - caractere dobandite de novo"posibile a fi inscrise in zestrea genetica a individului. Ele au efecte severe distructive - morbide sau letale - si care pot deveni transmisibile.

13

1. Suportul molecular al ereditatii

Dupa ce Avery si col. (1944) au demonstrat ca ADN-ul este suportul molecular care, in forma codificata, detine informatia genetica, iar Watson si Crick (1953) au elucidat structura in dublu helix a ADN-ului, a urmat o perioada de cercetari intensive si extensive asupra acizilor nucleici. In datele publicate de geneticieni se faceau referiri la doi constituenti principali din genomul eucariotelor : acidul dezoxiribonucleic (ADN-ul) si o clasa de proteine bazice cu masa moleculara mica si sarcina pozitiva (+), denumite histone. Daca Avery si col. au evidentiat rolul ADN-ului la procariote, capacitat cu functia de transformare a bacteriilor din forme nevirulente in forme virulente, cercetatorii Herschey si Chase (1952), demonstreaza ca in procesul infectiei" bacteriilor de catre bacteriofagi (numai ADN-ul fagic patrunde in celula gazda), unde, prin autosinteza, se asigura multiphcarea bacteriofagilor. Daca predecesorii au evidentiat rolul ADN ca suport malecular al ereditatii, cercetatorii Conrat si Willams (1955-1956) au demonstrat ca si ARN-ul detine informatie genetica. Ei au observat ca unele ribovirusuri (exemplu virusul mozaicului de tutun - VMT), detin ARN, asigura multiphcarea prin sinteza de ARN. In 1955, Chargaff si col., folosind metode fizico-chimice de analiza a ADN-ului, au stabilit cvasi proportionalitate valorica intre cantitatea de adenina si timina, si a guaninei in raport cu citozina. Raportul de egalitate intre A = TsiG = Ca primit numele regula sail raportul Chargaff. Continuindu-si cercetarile asupra ADN-ului, Chargaff a constatat diferente valorice privind numarul si ordinea nucleotidelor din moleculele ADN ce apartineau diverselor specii de plante si animale. In aceeasi perioada au fost descoperite fortele Van der Waals de atractie slaba, precum si puntile de hidrogen prin care se cupleaza cele doua lanturi nucleotidice din structura ADN-ului. Prin aceste descoperiri s-a lansat ipoteza ca fenomenul de complementaritate intre A-T si G-C, cuplate prin punti de hidrogen si fortele Van der Waals, au rol in procesul de polimerizare controlata si transmiterea informatiei genetice. S-a demonstrat ca molecula tipar" genereaza noi molecule complementare cu molecula initiala. S-a mai stabilit ca legaturile fosfodiesterice 5 nucleotidele in molecula, determinant o structura liniara si ordonata care este ADN-ul. 14

1. Suportul molecular al ereditatii

Dupa ce Avery si col. (1944) au demonstrat ca ADN-ul este suportul molecular care, in forma codificata, detine informatia genetica, iar Watson si Crick (1953) au elucidat structure in dublu helix a ADN-ului, a urmat o perioada de cercetari intensive si extensive asupra acizilor nucleici. In datele publicate de geneticieni se faceau referiri la doi constituent! principali din genomul eucariotelor : acidul dezoxiribonucleic (ADN-ul) si o clasa de proteine bazice cu masa moleculara mica si sarcina pozitiva (+), denumite histone. Daca Avery si col. au evidentiat rolul ADN-ului la procariote, capacitat cu functia de transformare a bacteriilor din forme nevirulente in fonne virulente, cercetatorii Herschey si Chase (1952), demonstreaza ca in procesul infectiei" bacteriilor de catre bacteriofagi (numai ADN-ul fagic patrunde in celula gazda), unde, prin autosinteza, se asigura multiplicarea bacteriofagilor. Daca predecesorii au evidentiat rolul ADN ca suport malecular al ereditatii, cercetatorii Conrat si Willams (1955-1956) au demonstrat ca si ARN-ul detine informatie genetica. Ei au observat ca unele ribovirusuri (exemplu virusul mozaicului de tutun - VMT), detin ARN, asigura multiplicarea prin sinteza de ARN. In 1955, Chargaff si col., folosind metode fizico-chimice de analiza a ADN-ului, au stabilit cvasi proportionalitate valorica intre cantitatea de adenina si timina, si a guaninei in raport cu citozina. Raportul de egalitate intre A = TsiG = Ca primit numele regula sail raportul Chargaff. Continuindu-si cercetarile asupra ADN-ului, Chargaff a constatat diferente valorice privind numarul si ordinea nucleotideior din moleculeie ADN ce apartineau diverselor specii de plante si animale. In aceeasi perioada au fost descoperite fortele Van der Waals de atractie slaba, precum si puntile de hidrogen prin care se cupleaza cele doua lanturi nucleotidice din structure ADN-ului. Prin aceste descoperiri s-a lansat ipoteza ca fenomenul de complementaritate intre A-T si G-C, cuplate prin punti de hidrogen si fortele Van der Waals, au rol in procesul de polimerizare controlata si transmiterea informatiei genetice. S-a demonstrat ca molecula tipar" genereaza noi molecule complementare cu molecula initiala. S-a mai stabilit ca legaturile fosfodiesterice 5'-3' cupleaza nucleotidele in molecula, determinand o structure liniara si ordonata care este ADN-ul. 14

Totusi momentul revolutionar" in studiul structurii si dispozitiei spatiale a ADN-ului este anul 1953, cand Watson si Crick (laureati ai premiului Nobel) folosind ca metoda de studiu spectreie de difractie a razelor X, au demonstrat ca molecula ADN are o structura spatiala (o arhitectura) ordonata sub forma de dublu helix. Argumentele de ordin general rezultate din cercetarile biochimistilor si geneticienilor, prin care este atestat rolul ADN-ului ca suport molecular al ereditatii si variabilitatii sunt urmatoarele: - ADN-ul este o molecula cu structura speciala determinata de ordonarea aperiodica a nucleotidelor in catenele cuplate complementar; - ADN-ul este molecula capacitata cu functia de autoreproducere, functia autocatalitica, care se realizeaza prin replicare semiconservativa. Este functia care asigura conservarea informatiei genetice in generatiile ce succed; - ADN-ul serveste ca tipar pentru a i se decodifica mesajul genetic inscris in structura sa. Prin decodificare si respectarea principiului complementaritatii bazelor, rezulta molecula de ARN mesager, care, in citoplasma celulei, asigura sinteza de proteine cu structuri si functii specifice; - avand structura neramificata, informatia genetica din ADN este stocata si dispusa liniar. Este principiul care asigura decodificarea corecta"; - cantitatea de ADN este aceeasi in toate celulele somatice (cu aproximatie), fiind celule diploide; - in celulele gametice, care sunt haploide (cu numarul injumatatit de cromozomi fata de celulele somatice - la organismele cu reproducere sexuata) cantitatea de ADN este redusa la jumatate in raport cu celula somatica diploida; - cantitatea de ADN variaza in raport cu fazele ciclului celular si numarul cromozomilor : - in ciclul mitotic (fig. 1) : -in stadiul interfazic Gi gasim: - 2n cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 1 cromatida pentru fiecare cromozom; - in stadiul interfazic S are loc sinteza ADN-ului prin replicare semiconservativa. La sfarsitul acestui stadiu cantitatea de ADN va fi de 4n; - in stadiul G2 interfazic gasim: - 2n cromozomi; - 4n cantitate ADN; 15

- 2 cromatide (surori) pentru fiecare cromozom; - la sfarsitul ciclului mitotic gasim: - 2n cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 1 cromatida pentru fiecare cromozom.

cantitate ADN

4o ADN

2n ADN

INfTERFAZA

10 12 14

16

18

imi20 Z.

Fazeieji durata

(h)

|P:'M! ATI
MTTOZA

Fig.l Variatia cantitatii de ADN in raport cu fazele ciclului celulelor somatice - in meioza, cu formarea gametilor haploizi, gasim : (fig.2) - In diviziunea primara a meiozei: - in stadiul d gasim : - 2n cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 1 cromatida pentru fiecare cromozom; - in stadiul G2 gasim : - 2n cromozomi; - 4n cantitate ADN; - 2 cromatide pentru fiecare cromozom; - la sfarsitul diviziunii primare celulele au : - in numar cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 2 cromatide pentru fiecare cromozom; - In diviziunea secundara a meiozei : - in interfaza, profaza si metafaza gasim : - in numar cromozomi; 16

- 2 cromatide (surori) pentru fiecare cromozom; - la sfarsitul ciclului mitotic gasim: - 2n cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 1 cromatida pentru fiecare cromozom.

ADN

4n ADN

2n ADN 0,5 C2 C,

0
,

10

12

14

16

18

iiili 20 22
fc.11111

Riwfeji
durata

irsTTERFAZA

^T^-s |P!M ATI

*

W
fc

MITOZA

Fig.l Variatia cantitatii de ADN in raport cu fazele ciclului celulelor somatice - in meioza. cu formarea gametilor haploizi, gasim : (fig.2) - In diviziunea primara a meiozei: - in stadiul d gasim : - 2n cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 1 cromatida pentru fiecare cromozom; - in stadiul G2 gasim : - 2n cromozomi; - 4n cantitate ADN; - 2 cromatide pentru fiecare cromozom; - la sfarsitul diviziunii primare celulele au : - in numar cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 2 cromatide pentru fiecare cromozom; - In diviziunea secundara a meiozei : - in interfaza, profaza si metafaza gasim : - in numar cromozomi; 16

- 2n cantitate ADN; - 2 cromatide pentru fiecare cromozom;

-la sfarsitul diviziunii secundare celulele vor avea : - in numar cromozomi; - in cantitate ADN; - 1 cromatida pentru fiecare cromozom. Observam ca in celula gametica numarul cromozomilor si cantitatea de ADN sunt reduse la jumatate in raport cu celula somatica; - cand structura ADN este modificata, efect al actiunii agresive a factorilor potentiali mutageni, sau printr-un mecanism de crossing-over inegal, apar caractere noi (normale - adaptative sau patologice).

Fig. 2 Variatia cantitatii de ADN in raport cu fazele ciclului celular in gametogeneza.

2. Structura moleculei de acid dezoxiribonucleic (ADN)

Molecula de ADN din genomul procariotelor si eucariotelor are o structura polidezoxiribonucleotidica dublu catenara, catenele fimd cuplate intre ele pe principiul complementaritatii bazelor azotate componente. Cele doua catene cuplate realizeaza o dispozitie spatiala, o arhitectura in dublu helix. 17

legaturi fosfodiester 5 -3 formand scheletul glucido-fosforic. ADN-ul este molecula inalt polimerizata. 2.1. Unitatea de structura a molecuiei de ADN Unitatea de structura a ADN-ului este nucleotidul. Este un monomer in componenta caruia exista trei tipuri de molecule, inseparabile intre ele : o baza azotata, o pentoza si un radical fosfat. Bazele azotate pot fi purinice si pirimidinice. Bazele purinice prezinta doua heterocicluri : un hexaheterociclu (pirimidinic) si un pentaheterociclu (imidazolic). Bazele purinice in structura ADN-ului sunt : adenina (A) si guanina (G) (fig. 3).
NM, 0

CM

W I
NM, N it C O
X

O HN i C O
X

CH XH MM

C * .CM NM

"

m
Fig.3 Structura bazelor purinice (A; G) si pirimidinice (T; C).

18

Bazele pirimidinice se prezinta sub forma unui hexaheterociclu pirimidinic. In structura ADN-ului bazele pirimidinice sunt reprezentate de timina (T) si citozina (C) (fig.3). A doua componenta din structura nucleotidului este pentoza, un glucid care se prezinta ca heterociclu de tip beta ((3)- furanozic. Cele doua componente, baza azotata si pentoza, esterifica cu formarea nucleozidului. Esterificarea se face printr-o legatura N-glucidica, legatura covalenta. Esterificarea se face intre hidroxidul din pozitia Ci al pentozei si azotul din pozitia N3 la pirimidine si pozitia N9 pentru purine. A treia componenta a nucleotidului este radicalul fosfat, care se cupleaza, prin esterificare, de nucleozid, cuplarea stabilindu-se cu hidroxidul de la C3 sau C5 al pentozei. Cuplarea celor trei componente fmalizeaza structura nucleotidului (fig.4sifig.5). Fig. 4 Structura nucleotidului cu baza pirimidinica ( Timina ) ; esterificare C5-

Structura nucleotidului cu baza purinica (Adenina) ; esterificare C5.

19

H-'

H HO' P">-CM>/
li 0

H\H

1 OK

H/M

OK

(Acidul fosforic poate esterifica si la OH de la carbonul 3, ramane liber de la carbonul 5). Fig. 5 Structura nucleotitului cu citozina

0
1

O-P-

0-

0<^
J

CH,

o.
OH

20

Structura nucleotidului cu guanina

OH OH

o:

ADN-ul este molecula rezultata din esterificarea si ordonarea liniara acelorpatru tipuri de nucleotide.

2.2. Structura primara a ADN

Structura primara analizeaza modul de formare a monocatenei din structura moleculei de ADN. Se urmareste ordonarea nucleotidelor si gradul de polimerizare a monocatenei ADN-ului. Polimerizarea nucleotidelor se face prin legaturi fosfodiesterice, intre radicalul fosfat al nucleotidului,cu hidroxidul din pozitia 3' sau 5', a pentozei nucleotidului urmator. Prin polimerizare se formeaza scheletul glucido-fosforic al monocatenei liniare din molecula ADN-ului. Desi prezente, bazele azotate nu participa la realizarea structurii scheletului glucido-fosforic. Bazele sunt cuplate cu hidroxidul Ci al pentozei fiecarui nucleotid. Prezenta si ordinea bazelor din monocatena polinucleotidica determina specificitate structural-functionala moleculei de ADN. Ordonarea 21

specifica realizeaza informatia genetica inscrisa in ADN-ul genomic (fig. 6).

ADN-ul

Fig. 6 Structura primara a ADN (scheletui glucido-fosforic) - esterificare 3'-5\

22

Nucleotidele sunt molecule orientate, cuplate intre ele prin legaturi fosfo-diester in ordinea:

. . .-y-s'-y-S'-y-S'-y-S'-y-S'-ys'-y'S'-ys'-y-s'-y-s'-....
Ordonarea nucleotidelor confera polaritate moleculei de ADN. Polaritatea confera proprietati fizico-chimice deosebite si functii biologice particulare moleculei de ADN. Monocatena are la un capat pentoza terminala cu hidroxidul liber in pozitia OH-3', iar la capatul opus pentoza cu hidroxidul liber OH-5\ Acesti hidroxili terminali asigura cuplarea si dispunerea in tandem a moleculelor de ADN, cu realizarea structurii tridimensionale in cromozomul celular. Este distributia in spatiu sau arhitectura cromozomilor. Dupa descoperirea rolului ADN-ului in ereditatea organismelor, analizele fizico-chimice care s-au efectuat ulterior, au identificat prezenta a patru tipuri de nucleotide in structura sa. Initial s-a crezut ca in molecula ADN-ului, cele patru tipuri de nucleotide ar respecta ordonarea periodica, care ar structura cele doua catene polinucleotidice. Periodicitatea considera ordonarea regulata a celor patru nucleotide, conform schemei :
.....A G T C A G T C A G T C A G T C A G T C A G T C ....
.....L_____J L_____J L____J L_____J L_____J 1_____J I______I L_____J_.

......

2'

3'

4'

....

Conform principiului ordonarii periodice a nucleotidelor, structura moleculelor de ADN ar fi trebuit sa fie identica atat la procariote cat si la eucariote, atat la protozoare (organisme unicelulare) cat si la om, atat la regnul vegetal cat si la eel animal. Ca urmare, datorita identitatii structurii moleculelor de ADN, si cum ADN-ul are functia de determinism genetic, ar fi trebuit ca toate speciile de pe Tera: plante-animale, bacterie-om, sa prezinte aceleasi caractere, cu aceleasi structuri si functii. Dar studiile fizico-chimice cantitative au consemnat ca nucleotidele nu au ordonare periodica. Rationamentele pentru care nu s-a acceptat periodicitatea nucleotidelor sunt urmatoarele: - s-ar fi realizat o informatie genetica limitata; - prin periodicitatea nucleotidelor s-ar fi obtinut numai patru tipuri de triplete (codoni) care sa specifice aminoacizii din structurile proteice; - cum exista o stricta corespondenta intre codon si aminoacid (un codon specifica strict un tip de aminoacid) ar fi trebuit ca toate moleculele proteice sa contina numai patru aminoacizi a caror ordonare respecta ordonarea periodica a codonilor (tripletelor), iar proteinele sa prezinte 23

Nucleotidele sunt molecule orientate, cuplate intre ele prin legaturi fosfo-diester in ordinea:

...-y-s'-ys'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s''.....
Ordonarea nucleotidelor confera polaritate moleculei de ADN. Polaritatea confera proprietati fizico-chimice deosebite si functii biologice particulare moleculei de ADN. Monocatena are la un capat pentoza terminala cu hidroxidul liber in pozitia OH-3', iar la capatul opus pentoza cu hidroxidul liber OH-5'. Acesti hidroxili terminali asigura cuplarea si dispunerea in tandem a moleculelor de ADN, cu realizarea structurii tridimensionale in cromozomul celular. Este distributia in spatiu sau arhitectura cromozomilor. Dupa descoperirea rolului ADN-ului in ereditatea organismelor, analizele fizico-chimice care s-au efectuat ulterior, au identificat prezenta a patru tipuri de nucleotide in structura sa. Initial s-a crezut ca in molecula ADN-ului, cele patru tipuri de nucleotide ar respecta ordonarea periodica, care ar structura cele doua catene polinucleotidice. Periodicitatea considera ordonarea regulata a celor patru nucleotide, conform schemei :
......A G T C A G T C A G T C A G T C A G T C A G T C .... L____J L____J L___J L_____J L____J L____J I____J L____J.. ....... 1 2 3 4 1' V 3' 4' ....

Conform principiului ordonarii periodice a nucleotidelor, structura moleculelor de ADN ar fi trebuit sa fie identica atat la procariote cat si la eucariote, atat la protozoare (organisme unicelulare) cat si la om, atat la regnul vegetal cat si la eel animal. Ca urmare, datorita identitatii structurii moleculelor de ADN, si cum ADN-ul are functia de determinism genetic, ar fi trebuit ca toate speciile de pe Tera: plante-animale, bacterie-om, sa prezinte aceleasi caractere, cu aceleasi structuri si functii. Dar studiile fizico-chimice cantitative au consemnat ca nucleotidele nu au ordonare periodica. Rationamentele pentru care nu s-a acceptat periodicitatea nucleotidelor sunt urmatoarele: - s-ar fi realizat o informatie genetica limitata; - prin periodicitatea nucleotidelor s-ar fi obtinut numai patru tipuri de triplete (codoni) care sa specifice aminoacizii din structurile proteice; - cum exista o stricta corespondenta intre codon si aminoacid (un codon specifica strict un tip de aminoacid) ar fi trebuit ca toate moleculele proteice sa contina numai patru aminoacizi a caror ordonare respecta ordonarea periodica a codonilor (tripletelor), iar proteinele sa prezinte

aceeasi structura, acelasi numar de aminoacizi, aceiasi aminoacizi ca structura la toate organismele vegetale si animale. Ca urmare din structurile proteice ar fi trebuit sa lipseasca 16 aminoacizi (cunoscuti in structurile proteice sunt 20 aminoacizi) si prezenti numai patru tipuri . Cel care a demonstrat ca cele patru tipuri de nucleotide au o ordonare aperiodica, aleatorie, a fost Chargaff (1950). Folosind metode fizicochimice cantitative, prin degradare enzimatica a moleculelor de ADN, a demonstrat ordonarea aperiodica si ca cele patru tipuri de nucleotide, ce structureaza monocatena polinucleotidica a moleculei de ADN, au o ordonare aleatorie, non-periodica. Dupa Chargaff, ordonarea aperiodica, aleatorie in monocatena ADNului s-a realizat in cursul evolutiei bio-genetice a moleculelor de ADN. Sa consideram ipotetic o secventa aperiodica din catena moleculei deADN:
.......A T T C C G A G C T T A C G A G T T G C T T A C C C C A A T A . . . .
L_J I____I I___J IJ L___I I___I L_J L_J l__J L_J L_.............

......

123

45

10

Analizand aceasta secventa observam ca numarul tripletelor (codonilor), ca tipuri diferite, asigura o crestere numerica a tipurilor de triplete (43 = 64 - vezi codul genetic), dar si pozitia tripletelor este aleatorie. Datorita ordonarii aperiodice a nucleotidelor si tripletelor se realizeaza o cantitate inepuizabila de informatie genetica depozitata in structura moleculelor de ADN. Informatia genetica realizata prin aperiodicitatea nucleotidelor, confera fiecarei molecule de ADN specificitate structural-functionala, obtinindu-se marea diversitate a tipurilor de mesaje genetice depozitate in structurile ADN-ului. Mesajele genetice inscrise in structurile ADN pot fi decodificate si matedalizate in molecule de ARN mesager. Cum ARNm este implicat direct in sinteza de proteine, imprima acestor proteine o structura specifica (conform mesajului genetic decodificat din ADN), proteine care vor exercita si functii specifice in celula, in organism. Pentru o mai corecta intelegere a semnificatiei biologice a aperiodicitatii nucleotidelor ce structureaza, biochimic, monocatena polinucleotidica din molecula ADN, vom analiza o secventa arbitrara" in componenta careia sunt 1000 nucleotide. Cum fiecare nucleotid este reprezentat de una din cele patru tipuri de baze azotate, conform principiului aperiodicitatii (ordonarea aleatorie), se pot realiza combinatii polinucleotidice de ordinul 41000, respectiv 10600. Dar genomul uman
24

contine aproximativ 3.500.000.000 perechi de nucleotide. In consecinta [ ordonarea aperiodica ar determina combinatii de ordinul 43.500.000.000 perechi de nucleotide. Si daca folosim preceptul lui Einstein ca numarul atomilor din Univers ar fi 0.88 x 1079 se poate considera ca informatia genetica ar fi I inepuizabila in spatiu si timp, datorita aperiodicitatii structurii primare. Importanta structurii primare: - asigura specificitate structural-functionala moleculelor ADN; - realizeaza informatia genetica , care este depozitata sub forma de mesaje ereditare pentru caracterele moleculare, celulare, tisulare, de organ si pentru activitatea metabolica a organismului uman; - sub forma de mesaje genetice, informatia genetica este decodificata prin sinteza de ARNm, care, in citoplasma, determina sinteza deproteine cu structuri si functii specifice in celula.

2.3. Structura secundara a ADN

Cu exceptia unor bacteriofagi, la care ADN-ul este monocatenar, toate procariotele si eucariotele au molecula ADN structurata din doua I monocatene cuplate. <> ADN-ul este dublu catenar. catenele fiind copolimerice. Catenele copolimerice sunt cuplate intre ele prin punti de hidrogen, punti ce se stabilesc intre bazele azotate prezente in structura monocatenelor. Chargaff (1950), este cercetatorul care a demonstrat ca ADN-ul are o structura secundara dublu catenara. Folosind metode fizico-chimice de analiza cantitativa, Chargaff stabileste raportul de complementaritate intre bazele purinice si cele pirimidinice, complementaritate care asigura cuplarea catenelor copolimerice. Rezultatele lui Chargaff pot fi sintetizate astfel : -intre bazele azotate intercatenare se stabilesc punti de hidrogen. I Complementaritatea, in conditii fiziologice normale a structurii ADN-ului, se realizeaza intre: Adenina cu Timina (A - T) si Guanina cu Citozina (G-C); - raportul de complementaritate se bazeaza pe urmatorul rationament valoric: indiferent de specie si regn, s-a constatat ca adenina este valoric egala cu timina, iar cantitatea de guanina este egala cu a I citozinei. Aceste raporturi valorice: A = T si G = C explica complemen25

taritatea. Acest raport complementar in baze A = T si G = C este numit regula Chargaff sau ratio baza" ; - complementaritatea este demonstrata prin cinetica reactiilor fizicochimice, conform urmatoarelor principii de analiza : hidrogenul din componenta bazelor azotate are un nucleu" cu volum mic si intens pozitiv. In jurul acestui nucleu graviteaza un electron negativ (e~). Acest electron negativ este incapabil" sa satisfaca sarcina pozitiva a nucleului atomic. In consecinta, hidrogenul poate primi un electron negativ de la alt atom, cu care isi completeaza orbita. In aceste conditii se poate stabili o legatura electrovalenta. Hidrogenul reahzeaza aceste legaturi si cu atomul de azot sau cu oxigenul din structura altei baze azotate, care poate fi purina sau pirimidina ; - in molecula ADN-ului cu structura normala, adenina (ca baza purinica) poate stabili doua punti de hidrogen cu timina (baza pirimidinica), iar guanina (ca baza purinica) reahzeaza trei punti de hidrogen cu citozina (baza pirimidinica), (fig.7). Sunt cupluri complementare in ADN: A = T; T = AsiG = C;C = G. Cuplarea complementara prin punti de hidrogen este principiul structurii secundare a moleculei de ADN;

&*\ / ?\

Ir

r
OH,

,
K**\

'

r|

UM.............o

o-... i m /'
5

> \

*\

A
{***)

T
l*irtft)

G
foMBMI

C
jcftorirt}

Fig. 7 Cuplarea bazelor azotate prin legaturi de hidrogen. T se leaga cu A prin doua legaturi de hidrogen ; C se leaga cu G prin trei legaturi de hidrogen. - analiza cantitativa a moleculelor de ADN extrase de la diverse specii animale sau vegetale au evidentiat urmatorul aspect : cantitatea de A + T nu este egala cu cantitatea G + C : 26

A+T ---------^ 1 G+C Datorita raportului valoric neunitar este confirmata aperiodicitatea ordonarii nucleotidelor in catenele copolimerice (deci intre purinele si pirimidinele din componenta celor doua catene este respectata complementaritatea de cuplare). Valoarea neunitara a raportului Chargaff confirma aperiodicitatea celor doua catene (aperiodice) copolimerice , desi intre bazele purinice si cele pirimidinice este respectata complementaritatea. A+T - raportul ---------, valoric , variaza in limite foarte largi. G + C De exemplu: - la Saccharomyces cerevisie cuplul A + T este in proportie de 64% fatadeG + C-36%; " - la Bos taurus A + T este in proportie de 58% iar G + C in proportie de 42%; - la Homo sapiens (om) proportia este de 62% A + T iar G + C de 38% etc. Observam ca intre specii apar diferente valorice intre A + T si G + C; - desi valoarea raportului Chargaff variaza valoric intre specii, la indivizii conspecifici se mentine aproape constant si apropiat valoric. In 1978 Lints confirma aperiodicitatea cuplurilor complementare. Ca importanta, complementaritatea structurii secundare confera moleculei de ADN functii bio-genetice esentiale: - respectand principiul complementaritatii se asigura replicarea semiconservativa a ADN-ului (autocatalitica) si continuitatea informatiei genetice (functia sincronica si conservarea ei); - pe principiul complementaritatii bazelor azotate, se realizeaza decodificarea mesajelor genetice inscrise in structura ADN-ului de catre moleculele de ARNm. Moleculele de ARNm sunt complementare fata de secventele decodificate din ADN; - metode de analiza a structurii ADN-ului prin denaturare si renaturarea moleculei se bazeaza tot pe principiul complementaritatii bazelor purine si pirimidine;

27

- pe principiul complementaritatii bazelor azotate se construiesc" si se folosesc sondele si amprentele genetice pentru identificarea si localizarea genelor, pentru secventierea moleculelor de ADN.

2.4. Structura tertiara a ADN

Prin tehnica difractiei razelor X s-a stabilit ca ADN-ul are o arhitectura spatiala ordonata. Wilkins (1950) este primul cercetator care a folosit tehnica difractiei razelor X in studiul moleculei ADN , urmat de Franklin in 1951. Rezultatele obtinute de Wilkins si Franklin au confirmat ca: - cele doua catene copolimerice, cuplate complementar, au dispozitia spatiala in dublu helix. Aceasta observatie confirma ca molecula ADN are structura tridimensionala sau dispozitie spatiala; - structura tridimensionala a ADN-ului este asemanatoare pentru procariote si eucariote, indiferent de gradul de evolutie a speciilor. In 1953, Crick si Watson care, fara sa cunoasca lucrarile si observatiile lui Wilkins si Franklin, folosind tehnica difractiei razelor X, elaboreaza ipoteza asupra structurii tridimensionale a moleculei ADN din genomul celular. Modelul elaborat de Watson si Crick a fost publicat in 1953 in revista Nature", rezultate pentru care li s-a acordat Premiul Nobel pentru Medicina. La elaborarea modelului tridimensional, Watson si Crick au folosit raportul de complementaritate intre cele doua catene copolimerice din molecula ADN. Pe baza datelor obtinute prin difractia razelor X cei doi cercetatori au elaborat postulatul: ADN-ul este molecula dublu catenara. Cele doua catene sunt cuplate prin punti de hidrogen, conform principiului complementaritatii intre purine si pirimidine (A = T si G = C). Catenele cuplate se spiraleaza formand un a helix iar catenele copolimerice fiind antiparalele. Planele pentozelor cuplate cu acidul fosforic sunt dispuse la exteriorul duplexului, formand scheletul glucidofosforic paralel pe axa virtuala a dublului helix. Bazele azotate, cuplate complementar si dispuse in interiorul moleculei au planele perpendiculare pe axa virtuala a moleculei de ADN". Planele cuplurilor complementare sunt la distanta de 3,4 A (0,34nm) intre ele. Fiecare cuplu complementar de baze are un unghi de rotatie de 36 in raport cu cuplul urmator. Cuplurile complementare sunt Valori folosite in studiul moleculei ADN: lm = 102cm = 103mm = 106um = 109nm = 1010A metru centimetri milimetri micrometri nanometri Angstromi 28

etajate". Intre ele se stabilesc interrelatii hidrofobe, ceea ce confera un plus de stabilitate moleculei de ADN. Rotatia, spiralizarea dublului helix in jurul unui ax central virtual", se realizeaza spatial, nu plan. Inaltimea unei rotatii de 360 are un pas de 34A (3,4 nm). Pe o spira completa se gasesc etajate zece perechi de cupluri complementare de baze azotate. Energia de suprapunere (stocking energy) se evalueaza prin interrelatii termodinamice: forma haotica-forma helicoidala. Dupa Polland si col. (1966), contributia puntilor de hidrogen este mica, iar valoarea AH2 reprezinta energiile de suprapunere a nucleotidelor cuplate prin punti de hidrogen. La eucariote, stabilitatea moleculei de ADN este asigurata si de histone, proteine cu care se cupleaza ADN-ul. Histonele sunt proteine bazice care neutralizeaza sarcinile negative. Unii fizico-chimisti considera ca fortele Van der Waals au rolul mai important in stabilitatea dublului helix, fata de puntile de hidrogen. In ordonarea bazelor, desi aperiodica , molecula de ADN are o structura tertiara ordonata. Cuplurile A = T si G = C au simetrie, ceea ce asigura inserarea lor in lant, indiferent care este ordinea : A = T , T = A, G = C sau C = G. De retinut ca intre cele patru cupluri complementare exista toate permutarile posibile de inserare secventiala. Metodele folosite in studiul ADN-ului, ca : difractia luminii polarizate, spectrele de difractie a razelor X, ultracentrifugarea cu sedimentarea moleculelor, difuziunea, autoradiografierea, denaturarea-renaturarea, clonarea moleculei, etc, au stabilit proprietatile fizico-chimice, precum si functiile exercitate de ADN in genom. Ca proprietati fizico-chimice mentionam: - prin dispozitia in dublu helix, spatiul si volumul unei molecule ADN sunt considerabil reduse. Prin micsorarea volumului si spatiului corespunzator se asigura un depozit impresionant de informatii si mesaje genetice in ADN-ul genomului uman; - ADN-ul este molecula neramificata, putin rigida. Este o molecula polimerica flexibila si fragila" ; - masa moleculara a moleculei de ADN poate fi estimata la 12-16 x 6 10 daltoni. Genomul uman are in celula somatica diploida (46 cromozomi) aproximativ 3,5 x109 perechi de nucleotide, respectiv 7><10 mg ADN. Daca cele doua catene inalt copolimerice ar avea bazele

"AH = 5-6 Kcal / mol; este modalitatea de calcul si evaluare a castigului de energie (Crothers si Zimm, 1964).

29

etajate". Intre ele se stabilesc interrelatii hidrofobe, ceea ce confera un plus de stabilitate moleculei de ADN. Rotatia, spiralizarea dublului helix in jurul unui ax central virtual", se realizeaza spatial, nu plan. Inaltimea unei rotatii de 360 are un pas de 34A (3,4 nm). Pe o spira completa se gasesc etajate zece perechi de cupluri complementare de baze azotate. Energia de suprapunere (stocking energy) se evalueaza prin interrelatii termodinamice: forma haotica-forma helicoidala. Dupa Polland si col. (1966), contributia puntilor de hidrogen este mica, iar valoarea AH2 reprezinta energiile de suprapunere a nucleotidelor cuplate prin punti de hidrogen. La eucariote, stabilitatea moleculei de ADN este asigurata si de histone, proteine cu care se cupleaza ADN-ul. Histonele sunt proteine bazice care neutralizeaza sarcinile negative. Unii fizico-chimisti considera ca fortele Van der Waals au rolul mai important in stabilitatea dublului helix, fata de puntile de hidrogen. In ordonarea bazelor, desi aperiodica , molecula de ADN are 0 structura tertiara ordonata. Cuplurile A = T si G = C au simetrie, ceea ce asigura inserarea lor in lant, indiferent care este ordinea : A = T , T = A, G = C sau C = G. De retinut ca intre cele patru cupluri complementare exista toate permutarile posibile de inserare secventiala. Metodele folosite in studiul ADN-ului, ca : difractia luminii polarizate, spectrele de difractie a razelor X, ultracentrifugarea cu sedimentarea moleculelor, difuziunea, autoradiografierea, denaturarea-renaturarea, clonarea moleculei, etc, au stabilit proprietatile fizico-chimice, precum si functiile exercitate de ADN in genom. Ca proprietati fizico-chimice mentionam: - prin dispozitia in dublu helix, spatiul si volumul unei molecule ADN sunt considerabil reduse. Prin micsorarea volumului si spatiului corespunzator se asigura un depozit impresionant de informatii si mesaje genetice in ADN-ul genomului uman; - ADN-ul este molecula neramiflcata, putin rigida. Este o molecula polimerica flexibila si fragila" ; - masa moleculara a moleculei de ADN poate fl estimata la 12-16 x 10 daltoni. Genomul uman are in celula somatica diploida (46 cromozomi) aproximativ 3,5 x109 perechi de nucleotide, respectiv 7><10-9 mg ADN. Daca cele doua catene inalt copolimerice ar avea bazele

"AH = 5-6 Kcal / mol; este modalitatea de calcul si evaluare a castigului de energie (Crothers si Zimm, 1964).

29

complementare cuplate in dispozitie rectiliniara s-ar obtine un filament ADN a carui lungime poate ajunge la 200 cm; - in lumina ultravioleta (UV), absorbtia ADN se face la lungimea de unda de 260nm; - structura tridimensionala asigura functiile: autocatalitica, heterocatalitica si variabilitatea (prin mutatie, repararea eronata sau prin recombinarea genetica a moleculelor ADN). Stabilitatea termodinamica a ADN-ului se asigura prin: - legaturile slabe de hidrogen, numite si legaturi metastabile. Cuplul G-C cu trei punti de hidrogen este mai puternic", mai stabil, decat cuplul A-T, care are numai doua punti de hidrogen. - fortele Van der Waals, desi slabe, sunt suficiente" pentru a organiza si mentine molecula in helixuri de homopolimeri nucleotidici; - interactiunile hidrofobe intre planurile cuplurilor de baze complementare si hidratarea gruparilor P04"; - de proteinele histonice, care, combinandu-se cu dublul helix al ADN-ului, neutralizeaza sarcinile negative.

30

3. Formele izomorfe de ADN (Forme geometrice" de ADN)

Din analiza moleculelor de ADN prin metoda spectrelor de difractie a razelor X, metoda de rotatie a luminii polarizate si imaginile electronomicroscopice s-a evidentiat existenta formelor izomorfe de ADN. S-a observat ca prin cresterea numarului de rotatii complete pe unitatea de lungime, se produce o tensiune" helicoidala crescuta. Aceasta tensiune poate fi dispusa prin formarea unei bucle cu rotatie levogira sau superinfasurarea pozitiva (positive super coil"). Daca ADN-ul are rotatia opusa fata de normal, apar bucle dextrogire sau superinfasurare negativa (negative super coil"). Moleculele de ADN lipsite de bucle dextrogire sau levogire laterale sunt considerate molecule relaxate". Cand numarul de spiralizari pozitive creste, in duplexul moleculei se produce si o condensare a spirelor. Tensiunea superficiala induce suprasolicitarea" structurii tertiare a ADN-ului cu alternative potentiale, cum ar fi: catenele neperechi, ADN-ul de tip Z si/sau forma in agrafa, ac de par". Ca alternative potentiale sunt si regiunile zonale ale duplexului ADN-ului de tip B , formate dintr-o monocatena autocomplementara, numita palindrom. Tensiunea superhelicoidala poate exista in interiorul celulelor sau nucleului celular daca exista un mecanism biologic care ar determina comprimarea capetelor moleculelor de ADN. 0 structura simpla, in care capetele moleculei de ADN sunt comprimate (constranse), este ADN-ul in cere inchis covalent, prezent in genomul multor virusuri, in ADN-ul mitocondrial si cloroplaste, sau in genomul unor procariote mici. La eucariote ADN-ul se asociaza cu proteinele histonice prin legaturi saline formand nucleoproteine. Proteinele histonice au dispozitie discontinua, cu formarea nucleozomilor si solenoizilor. Prin aceasta dispozitie histonica se mareste diametrul moleculei de ADN. Histonele, impreuna cu ionii de Ca2+, au rol in mentinerea arhitecturii spatiale a ADN-ului. In general, spiralizarea dublului helix al moleculei de ADN este dextrogira. Dar imaginile electrono-microscopice si analizarea in lumina polarizata au consemnat ca rotatia helixurilor poate fi atat dextrogira cat si levogira.
31

De exemplu, Alexander Crick (1979), folosind metoda observatiei cristalografice cu variatia gradului de hidratare a mediului, a descoperit ca pe secventa de 4-12 perechi de nucleotide obtinute artificial, apare o spiralizare diferita de cea dextrogira. In prezent putem vorbi de existenta a trei forme izomorfe de ADN (fig.8): ADN-ul de tip A , ADN-ul de tip B si ADN-ul de tip Z.

Forma A

Forma Z

Forma B

Fig.8 Forme izomorfe de ADN

Saenger (1984), folosind spectrele de difractie a razelor X, constata ca distanta dintre cele doua catene cuplate complementar dispuse in spirala, nu este uniforma , chiar daca ele sunt dextrogire in lumina polarizata. Dupa aspectul depresiunilor intercatenare, Saenger considera ca, la eucariote, molecula de ADN se poate gasi sub doua forme izomorfe: forma tip A si tip B.
32

ADN-ul de tip A este forma deshidratata si cristalizata a moleculei. Este forma care roteste lumina polarizata de la dreapta spre stanga. Este forma dextrogira. Bazele azotate sunt exact perpendiculare pe axa virtuala dextrogira a helixului. Tipul A este putin alungit, distanta dintre cuplurile complementare redusa, iar diametrul moleculei este mai mare. Acest tip nu are existenta histologica de lunga durata in ciclul celular. ADN-ul de tip B este forma hidratata a moleculei. Este forma dextrogira. Are existenta biologica. Saenger, analizand comparativ molecula deshidratata si cristalizata de tip A si molecula hidratata de tip B, constata diferente de dimensiune si aspect in traseul de spiralizare a celor doua catene cuplate, si anume: prezenta depresiunilor primare si secundare (major si minor) (fig. 9). De exemplu ADN-ul de tip A prezinta un helix larg, iar pasul helixului dupa o revolutie completa, este mai mic. Ca urmare, depresiunea primara (major) are o deschidere mica, dar foarte adanca (profunda), si o depresiune secundara putin vizibila. La ADN-ul de tip B sunt vizibile ambele depresiuni: depresiunea primara cu deschidere foarte larga dar putin adanca si depresiunea secundara, vizibila. Saenger a mai stabilit ca cele doua forme A si B sunt forme reversibile. Si anume, conversia helixuluide tip B intr-un helix de tip A si invers, este conditionata de hidratarea mediului in care sunt introduse cristalele. Este consecinta directa a interferentei stereochimice intre depresiunea larga si cea ingusta, precum si prezenta moleculelor de apa, al caror numar variaza in raport cu gradul de depresiune. Rich (1979), Saenger (1984) si altii au descoperit ADN-ul de tip Z ADN-ul de tip Z este forma levogira ca spiralizare a moleculei. Este un ADN format aproape in exclusivitate din G-C. Helixurile se rotesc de la stanga spre dreapta, iar scheletul glucido-fosforic al celor doua catene cuplate are aspect de zig-zag (linie franta), de unde si numele de ADN de tipZ. ADN-ul de tip Z are helixurile mai alungite si cu diametru mai mic fata de ADN-ul de tip B. Depresiunea majora este cu deschidere larga dar aplatizata. Guanina din ADN tip Z se gaseste la periferia moleculei. Aceasta din cauza excesului de guanina in componenta lanturilor polinucleotidice. ADN de tip Z poate fi obtinut artificial. Retine atentia deoarece, prezentand guanina eversata spre exteriorul moleculei, are tendinta de a se cupla spontan cu substantele necunoscute cu potential cancerigen. In conditii fiziologice nu s-a constatat tranzitia" ADN -ului de tip A sau B intr-un ADN de tip Z. Experimental s-a obtinut aceasta tranzitie din tipul A sau B, dar procesul nu este reversibil. 33

Imbach si Gosselin (1982), analizand procesul tranzitional, spuneau: ADN-ul de tip Z levogir este bogat in repetitia cuplurilor G-C, secvente I care in ADN-ul de tip A sau B la eucariote sunt rare". In stare nativa tipul i de ADN Z, cu inalta repetitivitate a cuplului G-C, este prezent in secventele genomice ale unor virusuri potential oncogene. Se pare totusi ca acest tip de ADN Z este uneori prezent si la eucariote. El ar avea rol in reglarea functiei aparatului genomic. Argumentele care presupun existenta in vivo" a ADN-uluide tip Z la eucariote, sunt urmatoarele: - enzimele nucleare, topoizomerazele, pot forma sau pot distruge reversibil, structura tipului Z in vivo"; - anticorpii produsi prin imunizare cu ADN sintetic, se fixeaza pe I ADN-ul nuclear in puncte precise (situsuri) ale cromozomilor. Sunt ipoteze de lucru care sustin existenta ADN-ului cu structura levogira Z in vivo", molecule cu distributie specifica si care ocupa situsuri precise in cromozomii nucleari. De asemenea, s-a observat ca trecera formei dextrogire A sau B in forma levogira Z, in vivo", antreneaza dereglari in mecanismele reglatoare ' in expresia mesajului genetic. In prezent nu sunt cunoscute exact situsurile cromozomale unde sunt localizate moleculele ADN-ului Z si nici rolul exercitat in genomul celular.

4. ADN-ul nuclear
Dupa ce Avery (1944) a stabilit rolul fundamental al ADN-ului in ereditatea caracterelor, cercetarea ADN-ului, la eucariote, s-a intensificat si diversificat. Primii care si-au concentrat cercetarile asupra ADN-ului au fost Boivin si Vendrely (1948) care analizand ADN-ul, la Bos taurus, extras din diverse tesuturi (timus, ficat, pancreas, rinichi) au constatat ca: - indiferent de tesutul analizat, in nucleul celulelor cantitatea de ADN este aceeasi. Au mai stabilit ca nucleul diploid al celulelor somatice are o cantitate de ADN de aproximativ 6,5x10-l2gv - fata de celulele somatice diploide, in gametii cu nucleul haploid, cantitatea de ADN este redusa cu aproximativ 50% (3,4x 10-12 grame); In 1949, Mirsky si Ris constata ca in componenta moleculelor de ADN exista aceleasi baze azotate, indiferent de regn sau specie.
34

In 1950 Mirsky, analizand cantitatea de ADN la diverse specii de eucariote, observa existenta unor diferente valorice. Datorita acestor observatii, Mirsky a demonstrat urmatorul aspect: cantitatea de ADN nu este direct proportionala cu numarul cromozomilor existenti in nucleul celulelor si nici cu gradul evolutiei biologice a speciilor. Determinarile efectuate au evidentiat urmatoarele: specii putin" (evoluate au o cantitate mai mare de ADN nuclear, iar specii mult" evoluate au o cantitate mai mica. De exemplu: - Procariotele au o cantitate ADN de 10 ori mai mare in raport cu numarul proteinelor codificate. - Euglena viridis contine o cantitate de ADN aproximativ egala cu cea existenta in nucleul celulelor somatice la Homo sapiens (om). - Salamandra (Amphiuma), precum si unele specii de pesti inferiori, au o cantitate de ADN de 50 de ori mai mare in raport cu cantitatea de ADN la om. - Unele plante si specii de batracieni au in genomul lor de 100 de ori mai mult ADN fata de ADN-ul genomului uman. - Ariciul de mare (nevertebrat superior) contine de 50 de ori mai mult ADN decat cantitatea ADN la Rattus norvegicus (soarece). Daca am lua in consideratie ^cantitatea de ADN" criteriu de apreciere a gradului de evolutie biologica si complexitate structural (fiinctionala , si daca tot ADN-ul existent ar fi codant, ar trebui sa admitem pa ariciul de mare ar fi de 50 de ori mai evoluat ca soarecele, ca unele specii de batracieni si pesti inferiori si chiar unele plante, sa prezinte un grad de polutie de 50 de ori si chiar de 100 de ori mai mare decat al omului; sau Euglena sa o pozitionam pe aceeasi treapta de evolutie cu omul actual. S-a consemnat o neconcordanta intre cantitatea de ADN si gradul de polutie a speciilor, o neconcordanta intre cantitatea de ADN si numarul de gene codante. De exemplu, Mirsky (1950) a lansat ipoteza ca in genomul prganismelor vii exista o cantitate mare de ADN necodant, non-functional indeterminismul genetic al sintezei de proteine. Rezultatele obtinute i-au determinat pe geneticieni sa-si concentreze bercetarile asupra studiului ADN-ului eucariotelor. Primele incercari apartin lui Marmur si col. (1963), care elaborand si folosind tehnica denaturarii si renaturarii ADN-ului, purificat dupa bxtragerea de la diverse specii de eucariote, au constatat diferente in lapiditatea de reasociere si refacere a moleculelor. In procesul de reasociere a catenelor complementare apar diferente de timp. Unele catene reasociaza intr-un timp foarte scurt, altele reasociaza lent sau foarte lent. 35

Britten si Kohne (1968), folosind aceeasi metoda au facut un studiu comparativ al procesului de denaturare-renaturare a ADN-ului de la procariote si eucariote. Ei au extras ADN-ul de la Escherichia coli (procariot) si de la Bos taurus (eucariot) si cu fragmentele de ADN, a caror lungime era variabila, au urmarit cinetica procesului de denaturare-renaturare. Fragmentele folosite de ei aveau o lungime in jur de 500 perechi de nucleotide. Rezultatele au fost urmatoarele: viteza si tipul de renaturare a ADN-ului la Escherichia coli difera semnificativ fata de renaturarea ADN la Bos taurus. O alta observatie a fost ca in interiorul unei molecule ADN de la Bos taurus sunt secvente polinucleotidice ce difera intre ele prin viteza de renaturare, concentratie molara si timp de refacere a moleculei (fig9).

hibridizarea % (Fractia neasociata)

i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i

10-3

10-2

10-1

10

102

103

Cot (moli x secunde)

104

Fig.9 Cinetica renaturarii ADN la Escherichia coli si Bos taurus (dupa Britten si Kohne - 1968). Din studiul comparativ al moleculelor de ADN procariotic si eucariotic, au obtinut o curba cu mai multe sigmoide la Bos taurus in comparatie cu cele de la E. coli
36

Aceste observatii au fost premiza elaborarii ipotezei referitoare la heterogenitatea tipurilor de ADN in genomul nuclear al eucariotelor, ipoteza confirmata ulterior. Dupa ei, la eucariote este o cantitate de ADN care are runctie de a codifica sinteza de proteine (are informatie genetica), darsi o mare cantitate de ADN non-codant, denumit ADN egoist". Rezultatele obtinute au permis acceptatrea a trei tipuri de ADN. In raport cu cinetica renaturarii si a heterogenitatii secventelor polinucleotidice constitutionale, in genomul eucariotelor gasim : ADN inalt repetitiv, ADN moderat repetitiv si ADN nerepetitiv (fig. 10). Fig.10 ADN-ul NUCLEAR DIN GENOMUL UMAN TIPURI DE ADN
N ER E P ET IT IV ADN NUCLEAR

S EC V E N T E (C O P II)U N IC E CODAN TE

FA M IL II E G EN E D CO DAN TE

COPII MULTIPLE HETEROCROMATIMA CONSTITUTIVA : CENTROMER. TELOMER, CONSTRICTII SECUNDARE

/
D IS P E R SA T E TANDEM

DET EI VlINlbM GEN IETIC

ARNr ARNt

37

4.1. Denaturarea si valoarea Cot de renaturare a ADN-ului celular

Principiul metodei: moleculele de ADN, extrase si purificate, se I supun la temperatura de 100C timp de 10 minute. La aceasta temperatura si intr-un mediu alcalin, legaturile de hidrogen stabilite intre bazele I complementare se rup separandu-se catenele copolimerice. Acest proces este numit denaturare. Dupa 10 minute are loc o racire lenta a mediului de reactie cand se restabilesc legaturile de hidrogen, recuplandu-se complementar cele doua catene, cu refacerea integrala a dublului helix al moleculei de ADN, proces numit renaturare. Britten si Kohne (1968) au observat ca la temperatura ridicata si un pH alcalin, legaturile de hidrogen dintre catenele complementare se rup cu suprimarea interactiunilor Van der Waals. O alta observatie pe care au facut-o este ca in timpul denaturarii creste absorbtia in UV (k = 260nm) a bazelor azotate dupa decuplarea complementara, in timp ce I cantitatea de lumina UV absorbita de molecula de ADN in dublu helix este I mai mica. Autorii explica diferenta de absorbtie a UV astfel: prin rupereal puntilor de hidrogen si separarea catenelor complementare, bazele azotate; sunt mai expuse la actiunea UV, efect denumit hipercromic. Cand molecula de ADN este in dublu helix, datorita spiralizarii, o parte din bazele azotate dispuse etajat, sunt partial mascate" de scheletul glucido-fosforic al ADN- | ului. In consecinta, absorbtia in UV a moleculei este mai scazuta. Acest efect 1-au numit efect hipocromic. Autorii considera ca prin denaturare se manifesta efectul de hipercromaticitate, iar prin renaturare efectul de hipocromaticitate. Denaturarea si renaturarea sunt procese reversibile. Cand temperatura si pH-ul sunt aduse la valorile fiziologice, fortele necovalente se refac, catenele se recupleaza complementar, iar molecula de ADN isi I reface dublul helix. In prezent, principiul de lucru in procesele de denaturare-renaturare este urmatorul: ADN-ul extras din celula procariota sau eucariota se fragmenteaza in I secvente de aproximativ 1000 perechi de nucleotide. Fragmentele se supun procesului de disociere, cand catenele complementare se separa. Daca 38

repunem catenele singulare in conditii fiziologice (temperatura si concentratie ionica favorabila) ele se vor recupla. Cand fragmentele de ADN nu contin secvente repetitive, refacerea moleculei se face cu aceeasi viteza (ex. ADN-ul la procariote). Daca fragmentele contin secvente repetitive si nerepetitive, recuplarea monocatenelor se realizeaza la valori diferite de timp (ex. ADN-ul la eucariote). Parametrii care influenteaza gradul si viteza de recuplare a monocatenelor dupa denaturarea ADN-ului sunt: -concentratia initiala a ADN-ului - Co; -timpul necesar pentru renaturare - t; Valoarea Cot este produsul dintre concentratia molara a ADN-ului si timpul necesar pentru reasocierea monocatenelor complementare exprimat in secunde. Cot - Cot' = valoarea de comparatie a vitezei de recuplare a diferitelor secvente de ADN. , Cu cat diferenta valorii Cot este mai mica, cu atat viteza de recuplare a catenelor este mai rapida iar timpul necesar refaceii moleculei ADN este mai mic. Pentru valoarea Cot se foloseste ca referinta valoarea Cot a unui ADN "standard" (un homopolimer) sau a unui ADN procariotic cu lungime cunoscuta. Complexitatea genomului compus din secvente repetitive se stabileste prin curba Cot: Cot = Co x t - de unde - Co - este concentratia initiala a ADN-ului in moli de nucleotide /litru; -1 - este timpul de renaturare in secunde. Valorile Cot se exprima pe un grafic, curba exprimand repetarea secventelor din genomul studiat (fig. 11).

39

Perechi de nucleotide t 1{)7

T

10

102

1p

10

105

1Q6

10* 1G50

10^

i_____I J....,J 100 1000 10000 ......1 ......-i ____-L T 10

icr3

10

1CT*

0.1 1 Col (molxs/1)

v-4

Fig.ll Curba Cot. Valoarea Cot 10" - 10" exprima un ADN inalt repetitiv. Valoarea Cot 10 - 10" exprima un ADN moderat repetitiv. Valoarea Cot peste 102 este un ADN nerepetitiv (dupa J. M. robert, 1983). In 1975, L. Stryer, studiind cinetica reasocierii catenelor complementare si curbele Cot, a stabilit : - ADN-ul cu un timp de renaturare foarte mic - 10"4 < Cot < 0.01 (renaturare foarte rapida) si refacerea integrala a moleculei, este un ADN inalt repetitiv. Este tipul de ADN usor de identificat si analizat, cu oligoelemente repetitive scurte (de 5-300 perechi de nucleotide) dispuse in tandemuri lungi. - ADN-ul cu o valoare Cot cuprinsa intre 0,01 < Cot < 10 corespunde ADN-ului moderat repetitiv, la care secventele au lungimi variabile cuprinse intre 100-1000 perechi de nucleotide.
40

- ADN-ul la care valoarea Cot de reasociere variaza intre 10 < Cot < | l000. deci are o valoare mare, este un ADN nerepetitiv sau cu secvente junice. Datorita secventelor nerepetitive, timpul necesar pentru recunoastere si recuplare a catenclor complementarc este mai mare. Cinetica renaturarii ADN este in raport de logaritmul Cot, adica produsul concentratiei initiale si al timpului, exprimat in moli litruxsecunde. Cand Cot are valoare de 50% mai mica fata de valoarea Cot a ADN inalt repetitiv, se noteaza Cot '/2 si este ADN moderat repetitiv.

5. Heterogenitatea ADN-ului din genomul uman si pnctiile lui

Plecand de la demons'tratiile lui Chargaff (1974) si in raport cu frecventa secventelor de ADN care apar in genomul nuclear, in genomul uman exista dona grupe mari de ADN: - ADN-ul repetitiv, care poate fi inalt repetitiv si moderat repetitiv; - ADN-ul nerepetitiv sau cu secvente unice ; |ln analiza lungimii secventelor polinucleotidice din genomul uman si a tuturor speciilor din regnul animal si vegetal, sunt folosite urmatoarele notatii valorice: |-pb =perechi debaze; |-Kb = kilobaza = 1000 pb = 10? pb; bib = megabaza = 1000 kb = 1.000.000 pb = 106 pb; lGb = gigabaza - 1000 Mb = 1.000.000 kb =1.000.000.000 pb = 10 pb.

5.1 Familii de ADN repetitiv

In genomul eucariotelor si/sau unor organisme eucariote superioare rvoluate din regnul animal gasim ADN repetitiv. In raport cu dimensiunea numarul secventelor repetitive, cu functia codanta sau nu, in genomul ^rnian gasim ADN moderat repetitiv si inalt repetitiv. a) ADN-ul moderat repetitiv. La organismele eucariote 25-30% in totalul ADN-ului nuclear se reasociaza cu o viteza a carei valoare Cot variaza in limite largi: intre 0.1 si 10.

41

Toate moleculele din ADN-ul genomic nuclear care au valoare Cot intre aceste limite de reasociere sunt denumite ADN nulear moderat repetitive. Coeficientul de repetabilitate a secventelor identice variaza intre 10 104. Secventele repetitive sunt scurte. Contin intre 300-1000 pb. Numarul perechilor de baze este mai mare in ADN-ul moderat repetitiv, respectivele secvente fiind foarte scurte, cu un numar foarte mic de cupluri complementare. In raport cu sensibilitatea la enzimele care degradeaza ADN-ul si temperatura de topire" (TM), de disociere-reasociere, s-au stabilit urmatoarele: - secventele ADN-ului moderat repetitiv nu se caracterizeaza prin repetabilitate secventiala ordonata si reasociere exacta. Ordonarea este discontinua; ' - renaturarea, reasocierea, se poate face in secvente inrudite" dar nu identice, rezultand un hibrid . Distributia ADN-ului moderat repetitiv in cromozomi este discontinua. Secvente moderat repetitive se pot intercala si printre moleculele de ADN nerepetitiv. Aceasta discontinuitate in distributia intracromozomiala a ADN-ului moderat repetitiv a fost demonstrata experimental. De exemplu, prin fragmentarea moleculelor de ADN cromozomial in secvente a caror dimensiune este de aproximativ 5 Kb, urmata de procesul de denaturare la o valoare Cot corespunzatoare ADN-ului moderat repetitiv, se constata ca mai mult de 50% din totalul secventelor disociate vor forma hibrizi ADN-ADN, iar restul secventelor, reasociind foarte lent, este nerepetitiv. Un alt indicator care confirma distributia discontinua a secventelor moderat repetitive este frecventa cu care clonele de ADN recombinat contin secvente de ADN moderat repetitive. De exemplu, prin folosirea de ADN din genomul celular uman pentru prepararea unui situs de clonare" genomica, a carui lungime medie este de 20 Kb, s-a observat ca aproximativ 90% din moleculele donate contin secvente moderat repetitive. Young (1979) a demonstrat ca secventele repetitive intermediare variaza ca numar si pozitie in ADN-ul diverselor specii. De asemenea, el a mai demonstrat ca apar diferentieri de repartitie chiar intre indivizii conspecifici, diferentieri de repartitie intracromozomiala. Diferentierile de numar si pozitie a secventelor repetitive intre indivizii conspecifici sunt si rezultatul recombinarilor intracromozomiale prin crossing-over inegal".
42

Secventele cu pozitie si ordine neomogena intre indivizii conspecifici, pot fi folosite ca marked genetici pentru studiul populatiilor, camarkeri pentru identificarea indivizilor (criminalistica, medicina legala), sau folosite ca markeri corelat cu diverse boli determinate genetic. 0 serie de cercetatori, precum Pardue (1973), Sanger (1981), Li (2001), Venter (2001), IHGSC (2001), Whitfield (1995), s.a. au stabilit ca printre secventele de ADN moderat repetitiv se gasesc numeroase secvente codante. Conform datelor obtinute, secventele codante sunt gene care, genetic, determina sinteza histonelor (histogenele) sau gene care codifica jtipurideARNrsiARNt. De exemplu, se presupune existenta in genomul uman haploid a circa 200 gene pentru ARNr 5S, iar pentru ARNf aproximativ 1300 gene (Pardue si col.,1973). Pe baza indicatorilor mentionati se estimeaza existenta in genomul uman a circa 3x10' fragmente repetitive din ADN. Printre secventele ADN repetitive se mai gasesc si alte tipuri de secvente genetic active. Acestea ar codifica, informational genetic, diverse sinteze proteice necesare activitatii celulare. Din acest grup de secvente informational active din ADN moderat repetitiv, mentionam : - genele ribozomale care codifica molecule de ARNr (acid ribonucleic ribozomal). Transcrierea este catalizata de enzimele ARN polimeraze III, cu locusuri pe bratul scurt p"al cromozomilor acrocentrici |(vezi cromozomii). In segmentele cromatidice denumite organizatori nucleolari" se gasesc intre 150-200 copii genice (familia de gene ale ARN,). Pe bratul lung q", in apropierea centromerului cromozomului numarul 1. ar fi locusul genei pentru ARNr 5S. - genele pentru sinteza ARNt (acid ribonucleic de transport) cu locusurile pe cromozomii nr. 1 si 6 sunt catalizate tot de ARN polimeraza III; - secventele SINEs (short interspred repeated sequences) a caror lungime este estimata intre 100 si 400 pb si reprezinta 3-5 % din totalul ADX-ului genomului uman. In genomul uman se estimeaza un numar de aproximativ 500.000 de secvente SINES (nature, 2001, 411). Unii cercetetori includ secventele SINEs si Alu in grupa elementelor transpozabile, cu rol in activitatea replicarilor (vezi initierea sintezei ADN). - secventele LINEs (long interspred repeated sequences) sunt secvente de 6-7 kb . In genomul uman se estimeaza existenta a 100.000 de secvente LINEs. Amplificarea lor s-ar face prin reverstranscriere (retrotranspozitie). Se presupune a avea rol in cuplarea cromozomilor
43

omologi in zigomerul profazei primare a meiozei si implicare in crossing-over. Se crede ca secventele SINEs si LINEs ar proveni din gene codante printr-un mecanism de retroinsertie. Aceste secvente nu sunt transcrise in molecule de ARMm . Tabel I. Tipul si numarul copiilor din genomul uman al familiei ADN repetitiv (dupa IHGSC, 2001; Li si col., 2001)
Familia secventelor repetitive SINEs: Alu MIR MIR3 LINEs: LINEs-1 LINEs-2 LINEs-3 Elemente LTR Transpozoni ADN Numar relativ de copii in genomul uman 155800 109000 39300 75000 868000 516000 315000 37000 443000 294000

5.2. Tipuri de ADN inalt repetitiv Din totalul genomului uman, aproximativ 10% este ADN inalt| repetitiv. Este reprezentat de secvente cu dimensiuni de 1 pana la 200 pb (si mai multe), dispuse in tandem. Moleculele de ADN inalt repetitiv au lungimi variabile in raport cu dimensiunea secventelor si gradul de repetabilitate a secventelor. Se considera ca acest tip de ADN poate aveaun coeficient de repetabilitate a microsecventelor ce pot depasi si un milionde ori. De exemplu, Walker si col. (1969) apreciau ca secventele scurte de
CCCTAA

GGGA TT se Pt repeta, prin dispunerea in tandem de peste 1.000.000 de ori. ADN-ul inalt repetitiv este necodant, fiind in exclusivitate un ADN egoist" deoarece isi exercita numai functia de autoreplicare. Intr-un studiu efectuat de Tartoff in 1975, s-a constatat ca raportul bazelor A+C complementare G+C IN ADN-ul inalt repetitiv, valoric, este diferit fata de ADN-ul repetitiv. 44

Tartof a mai observat ca, in majoritate, ADN-ul inalt repetitiv este localizat in zonele cu heterocromatina constitutiva (respectiv in benzile C) ale cromozomilor si anume: regiunea pericentromerica (majoritar), la nivelul telomerelor si constrictiilor secundare (Tabel II) . Tabel II. Secvente de ADN inalt repetitiv satelitic in regiunea pericentromerica (dupa Tartof, 1975)

Specia Drosophila melanogaster

Componenta secventelor repetitive AGAAG ATAAT ATATAAT AATAACATAG AGAGAAGAAG ACAAACT ATAAACT ACAAATT AT CGT ATCC CCCTAA ACACAGCGGG

Drosophila viridis

Cancer boscalis Pagurus pollicaris Cavia porcellus Dipodomys ordii

Un studiu facut pe cromozomul Y uman a evidentiat ca secventele repetitive din celulele gametice sunt hipometilate, iar in cromozomii celulelor somatice secventele sunt hipermetilate (Dib si col. 1996; Bird, 1999). Se presupune ca ADN-ul inalt repetitiv ar avea rol in imperecherea liniara a cromozomilor in stadiul de zigonem din profaza primara a meiozei. Dupa dimensiune, numar si limgimea dispunerii in tandem, secventele inalt repetitive din ADN pot fi de tipul: - ADN satelit; - ADN mini satelit; - ADN microsatelit; - ADN interspres (transpozonic), (fig. 12 si fig. 13); Clasificarea familiilor secventelor inalt repetitive din ADN genomic uman a fost facuta de Casanova si col. (1985), Nogo si col. (1986),

45

Malaspina si col. (1990), Lavett (1997), Venter si col. (2001), IHGSC3 (2001), s.a. ADN-ul satelit. Este ADN-ul cu numar foarte mare de secvente repetitive a caror lungime variaza in limite cuprinse intre 5 si 25 pb. Prin dispunerea lor in tandem, lungimea satelitului ajunge la cca 100 kb. Se apreciaza ca unitatile repetitive ale ADN-ului satelit sunt simple sau moderat complexe. Densitatea ADN-ului satelit este determinata de componenta in baze azotate a unitatilor de repetitie , care-i total diferita de restul ADN-ului nuclear. Folosindu-se metoda ultracentrifugarii in gradient de densitate Ag-CsSCU, s-a stabilit ca in raport de numarul unitatilor repetitive dispuse in tandem, se pot identifica trei familii majore de ADN satelit: - familia de ADN satelit compusa din unitati repetitive foarte scurte, prin numarul bazelor/secventa; - familiile II si III (familia II = 1,693 g/cm3; familia III = 1,697 g/cnr) ce contin, dispuse in tandem, secvente de tipul ATTCC......... Prin centrifugare in gradient de densitate nu s-a putut stabili heterogenitatea complexa a secventelor ADN-ului repetitiv satelitic. Totusi heterogenitatea a fost demonstrata prin folosirea digestiei ADN-ului cu enzime de restrictie, care recunosc un singur situs din unitatea repetitiva.

"' IHGSC = International Human Genome Sequencing Consortium .

46

< " ^
1I
/J

G* o H Pi

o b

z
<

s
A. i * "

z
ADN TELOMERIC

ft.

5
J

5
o z
w 0

z
J3

z
w
J

Q <

h U

5 u,
w

w a:
>*

47

ry'v/vvyv/'-'
s

Transpozon

Insertia transpozonului in gena Clranspozooy Gena cu functie mutanta modificata

JWWW C Transpozon^ VSAAAA

Secventa transpozomului folosit, rezultat prin insertie. Indepartarea transpozomului si refacerea initiala a genei

Gena

Fig. 13 Dinamica transpozonului insertionat in gena dupa Clark si Wall (1992). ADN-ul satelit nu este transcris in ARNm. Este non-informational. D gasim localizat, in special, in regiunile heterocromatice la cromozomii Iq, 9q, 16q si Yq. Un tip particular de ADN satelit este ADN-ul alfoid (alfa = a), prezent in toti cromozomii din genomul celulei, localizat in regiunea centromerica. Se caracterizeaza prin repetitivitatea in tandem a unei unitati ce contine 117 pb. Satelitul alfoid centromeric are un situs cu ajutorul caruia se leaga cu o proteina centromerica specifica. Familia ADN alfoida ar contine 8 x 103 copii de unitati dispuse in tandem si reprezinta 4% din totalul genomului nuclear. Csink si Henicoff (1988) presupun, pe baza cercetarilor efectuate, ca ADN satelit s-ar gasi localizat si in regiunile constrictiilor secundare. Sunt si cromozomi genomici unde ADN-ul satelit este combinat", prin altemanta repetitiva si in raporturi valorice variabile, cu alte tipuri de ADN repetitiv. In aceasta combinatie sunt identificate, ca dispersie, intracromozomic (in diverse segmente cromatidice). Aceasta dispersare 48

cromozomica combinativa ii este caracteristica ADN-ului satelit, in comparatie cu ADN-ul alfoid care e omniprezent in regiunea centromerica a cromozomilor. ADN-ul minisatelit. Este ADN-ul alcatuit din grupe repetitive, care, dispuse in tandem pot avea lungimi ce ajung la 20 kb. Unitatea repetitiva are dimensiunea ce variaza intre 14 si 65 pb. In zona telomerica a cromozomilor sunt minisateliti la care unitatea repetitiva este reprezentata de un hexanucleoid de tipul ... 5'- TTAGGG 3'....Aceasta imitate, repetata de sute de ori, se cupleaza cu telomeraza. Sccventa comuna a ADN-ului minisatelit este - GGGCAGGAXG - de iinde X" poate fi orice tip de nucleotid. Aceasta secventializare o gasim la ADN-ul minisatelit localizat in regiunile distal-telomerice ale cromozomilor. Deoarece X" poate fi orice tip de nucleotid, confera minisatelitilor trasaturi hipervariabile. Pe cromozomii sexuali x si y nu s-a identiflcat ADN minisatelit. Ca rol, ADN-ul minisatelit telomeric ar proteja cromozomii sa nu se degradeze" in timpul replicarii ADN. AD\-ul minisatelit este denumit si VNTR (,,variable number of tandem repeats"). Datorita hipervariabilitatii secventelor, s-au consemnat diferente de mvel molecular intre indivizii conspecifici. Diferentele interindividuale variaza in limite intre 0,1 si 20 kb. Datorita variatiilor individuale (prin repartitie sau prin prezenta tipului de minisatelit) minisatelitii pot fi folositi ca markeri genetici, ca amprcnte genetice, cu ajutorul carora se poate stabili tipul constitutional al fiecarui individ din populatie, din familie. Asemenea markeri se pot folosi in studiile antropologice, in studiul etniilor, in stabilirea gradului de rudenie intre indivizi. Se folosesc la studiul cuplurilor gemelare pentru a stabili starea de gemeni univitelini (monozigoti) sau bivitelini (dizigoti) . Deasemenea au aplicabilitate,ca test genetic, in criminalistica, in medicina legala, in diagnosticul bolilor moleculare pe fond genetic. ADN-ul microsatelit. Este ADN-ul genomic care, la eucariote, prezinta secvente simple repetate, constituite din 1 pana la 13 pb. Este distribuit in tot genomul nuclear uman. Aceste secvente simple" se pot repetade 10-20 de ori, realizand microsateliti de lungimi variabile. Un exemplu de microsatelit cu secvente simple, care prezinta ca unitate repetabila o singura pereche de nucleotide, este microsatelitul care are repetabilitate de n" ori a cuplului complementar A-T:

49

.......5' - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA................3' .......3' - TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT..............................................5' In genomul uman exista 15% din ADN-ul microsatelit format din repetitivitatea unui singur cuplu complementar A-T, iar 28% este ADN microsatelit compus din repetarea a doua perechi de nucleotide: .. ..5' - C AC AC AC AC AC AC AC ACAC AC AC A 3' .... 3' - GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT. .5' si care reprezinta 28% din ADN-ul genomic. Microsatelitii au o mare variabilitate determinata de numarul mononucleotidelor si binucleotidelor care intra in componenta lor, dar si in raport cu lungimea secventelor repetete. Diversitatea microsatelitilor se amplifica prin: repetari extensive a secventei initiale, prin recombinarea ADN-ului cu formarea de repetitii interdispersabile, prin pierderea unei unitati repetitive (un nucleotid) in timpul replicarii sau repararii moleculei de ADN. De asemenea diversitatea microsatelitilor se realizeaza si prini activitati de transpozitie realizate de mecanismele de conversie ale ARN-ului in ADN, prin implicarea retrovirusilor, in special cei endogeni (RVE). Repetitiile trinucleotidice in ADN-ul microsatelit sunt foarte rare in genomul uman. Datorita unei ample diversitati pot fi folositi ca marked genetici (vezi rolul minisatelitilor). ADN-ul inalt repetitiv interspres. In genomul uman sunt identificate doua familii de ADN inalt repetitiv interspres : familia Kpn si familia Alu. - Familia Kpn . Din aceasta familie fac parte secventele lungi, repetate, in genomul uman (Strachan si Read, 1991). Repetitiile secventelor lungi sunt identificate la fiecare 50 Kb din genomul uman. Datorita diferentelor de lungime a secventelor, aceasta familie este considerata heterogena, determinand un accentuat poiimorfism molecular in genomul uman. Fiecare secventa Kpn" are un capat 3' si se termina cu o caseta" poli-A de lungime variabila. Secventele interspres Kpn" le gasim localizate in benzile eucromatice G-pozitive (in metafaza, benzile G-pozitive sunt intunecate si intens cromatice). Ca distributie, aceasta familie se gaseste si in zone cu eucromatina cromozomiala dar nu in zonele codante. Unele secvente Kpn" prezinta similitudine structurala cu gena care codifica enzima transpozaza.
50

Sunt presupuneri ca secvente din familia interspres Kpn" sunt implicate in procesele transpozitionale din genom, dar fara a fi cunoscut pana in prezent rolul lor in aceste procese. Repetitiile Kpn" lipsesc din exoni dar sunt prezente in introni. - Familia interspres Alu. Descoperita in genomul uman de catre Calabretta si col. (1982). Secventele Alu in numar de aproximativ 300 -500.000, sunt dispuse grupat sau dispersat pe grupuri de secvente, in zonele eucromatice ale cromozomilor. Denumirea de secvente Alu este data de enzima de restrictie prin care sunt izolate din genomul celular. Secventele Alu apar la fiecare 4 kb. Desi lipsesc din exonii genelor, sunt identificati in introni si chiar in unele pseudogene sau in interiorul ADN satelit. Ca lungime o secventa Alu poate ajunge pana la 300 pb. Dupa Whitfield si col. (1995), familia Alu este reprezentata si de transpozoni, iar elementele Alu pot fi transcrise de ARN polimeraza III. Datorita diferentelor de lungime a secventelor , familia Alu amplifica heterogenitatea genomului uman la nivel molecular. Calabretta a stabilit diferente de numar in populatiile celulare la acelasi individ si diferente intre indivizii conspecifici. Tot Calabretta a consemnat diferente valorice ale secventelor Ahi" intre indivizii normali si intre cei care manifesta o anume boala pe fond genetic. Exemplul urmator convinge diferentele numerice intre omul normal si eel bolnav. Astfel, in genomul leucocitelor omului normal se pot identifica 50 secvente Alu, cuplate cu secventele unice" Hi5A , in timp ce in genomul leucocitelor la bolnavii cu leucemie acuta , s-au identificat numai 5 cupluri Alu-Hi5A. O alta diferenta intre individul normal si eel bolnav de leucemie acuta este ca in citoplasma leucocitelor la leucemici se gasesc un numar crescut de secvente Alu in forma de inel, ceea ce la individul normal lipsesc. Datorita studiilor si rezultatelor obtinute, s-a lansat ipoteza ca familia Alu este reprezentata si de transpozoni, dintre care unii ar fi retrovirasi, sau secvente interspres labile (Whitfield si col. 1995). Autorii acestei ipoteze considera ca retrovirusii din genomul uman nuclear, respectiv transpozonii, ar trece in citoplasma leucocitelor, unde ar determina o accentuata instabilitate genomica la om (leucemie acuta). Calabretta si col. considera ca secventele Alu" sunt si de origine crossing-over intragenic inegal, responsabil de patru deletii si o duplicate. Familia Alu poate prezenta un situs de restrictie pentru enzima Alu I. 51

Merita aprecierea pe care cercetatorii o dau secventelor repetitive din genomul uman. Ei considera ca secventele repetitive sunt resturi ancestrale (din ADN-ul primar sau arhaic). Datorita polimorfismului accentuat, identificarea lor poate fi folosita ca marked antropologici si paleontologici. Au aplicabilitate bio-genetica si valoare diagnostica. Daca se accepta ca sunt produsul si al crossing-overului inegal in meioza si autoduplicatie, prin studiul comparativ al primatelor actuale si al formelor fosile, aceste secvente repetitive reprezinta repere de interpretare si evolutie antropologica a lui Homo sapiens.

5.3. Elemente genetic transpozabile Transpozonii

Majoritatea secventelor inserate (SI) din familia Alu sunt transpozonii, amplificati prin procesele de transpozitie. Primele identificari legate de prezenta transpozonilor si miscarilor transpozitionale ale acestor secvente apartin lui Barbara McClintock in | 1950. Descoperirea B. McClintock a deschis un teren de cercetare genetica in genomul organismelor eucariote si in mod deosebit in genomul uman. Situindu-se printre cei care s-au ocupat in mod deosebit de procesele transpozitionale, B. McClintock (Premiul Nobel in 1983), sugera ca dispunerea spatiala a moleculei de ADN cromozomial nu este constanta. Ca moleculele ADN-ului genomic nuclear ar contine secvente nucleotidice repetitive. Ipotetic, autorul considera ca materialul genetic cromozomial suporta frecvente modificari datorita transpozitiei unor secvente nucleotidice. Aceste secvente, care-si schimba locusul de la un cromozom la altul, au fost denumite transpozoni (fig. 12, 13, 14). Prezenta si transpozitia transpozonilor are loc la toate organismele procariote si eucariote. Transpozonii, secvente polinucleotidice de insertie, tree dintr-un locus in altul pe cromozomi, in interiorul genomului celular. Secventele inserate de ADN altereaza genomul, cauzand modificari fenotipice ale unor caractere,si ale caror efecte sunt asemanatoare mutatiilor.

52

Fig. 14 ELEMENTE GENETIC TRANSPOZABII 1

ELEMENTE GENETIC TRANSPOZABILE

L/,

EUCARIOTE

EXCIZIE IMPRECISA

OPERONUL LA LOCULDEINSERTIE ATRANSPOZONULUI

SECVENTE INSERTIONATE

i au TRANSPOZONI V. REARANJARI CROMOZOMIALE RETROTRANSPOZONI

transpozitie

"}

CROMOZOMALA

determina

MUTATII POLARE

RUPTURI (DELETII) CCROMOZOMIALE

INFECTII RETROVIRALE

SIDA

Natura secventelor de insertie transpozabile a fost studiata prin fenomenele de recombinare. Modelele biologice folosite pentru studiu au fost bacteriile Sacharomyces cerevisiae si Ddosophila melanogaster. De exemplu sunt observatii care confirma ca molecula de ADN a bacteriofagului lambda (X), dupa ce traverseaza membrana celulei bacteriene, se insera aproape constant, in anumite puncte (situsuri) specifice ale cromozomului inelar. S-a constatat ca inserarea este facilitata de o integraza. Dupa cum observam, inserarea beneficiaza de existenta unor zone sau puncte din ADN-ul cromozomial care au proprietati de fixare. Aceste situsuri sunt simbolizate prin notatiile ISi. IS2, IS3 etc., plasate in zone diferite din genomul bacterian. S-a mai observat ca segmentul de ADN insertionat, enzimatic se poate detasa, inserandu-se in alt punct de fixare al cromozomului. De aici si denumirea de gene saritoare". Enzima implicata in detasarea si insertionarea secventei de ADN ar fi transpozaza. (D.E. Snyder, 1992). Fenomenul de migrare" a unor secvente polinucleotidice din componenta unei molecule ADN in alta molecula sau in alt cromozom, a fost numit de cercetatori transpozitie genica, iar segmentul transpozat cu numele de transpozon sau gena saritoare (Shapira,1979). Fenomenul nu este identic formei de recombinare intre moleculele de ADN omoloage. Transpozitiile se produc in celulele rec"", respectiv celule al caror ADN nu se recombina prin mecanismul clasic. La primele cercetari si observatii s-a presupus ca transpozitia genica este proprie numai unor fagi temperati, sau unor virusuri oncogene. Dar prin continuarea si extinderea cercetari lor s-a constatat ca transpozitia genica se manifesta si la alte vietuitoare, inclusiv la om. Din studiile efectuate, G. Childs considera ca in genomul celular ar exista 0 noua clasa de gene, pe care a denumit-o clasa de gene orfonf. Dupa Childs, orfonii sunt secvente nucleotidice izolate, insertionate printre grupele de gene din componenta normala non-repetitiva a cromozomului. Dupa el, procesul si locul de insertionare este aleatoriu. Tot Childs emite ipoteza ca orfonii ar fi gene implicate in dezvoltarea organismului. Ulterior, cercetatorii G.J. Brewer si Ch.F. Sing, lanseaza urmatonil concept : cand transpozonul este insertionat in interiorul sau in apropierea unei gene din cromozom, acesta blocheaza activitatea respectivei gene. In cazul cand transpozonul se detaseaza din acel punct insertionat, gena isi recapata functia initiala, iar transpozonul putandu-se insertiona ulterior pe alt cromozom. 54

Brewer si Sing sustin ca unii transpozoni reprezinta o gena sau agment de gena in genom. ranspozonii pot fi identificati in genomul organismelor procariote si carote. De exemplu la Escherichia coli miscarile de insertie a inspozonilor se realizeaza cu o frecventa de aproximativ 1/10 replican. I genomul uman, unde este o cantitate mare de ADN repetitiv, un numar litre secventele genice insertionate sunt de origine transpozonica. La om, transpozonii sunt transpozati prin actiunea enzimei iverstranscriptaza. I Cercetatorii Strachan si Read (1999) au demonstrat ca prin folosirea ft matrite" ARN, enzima reverstranscriptaza va determina sinteza implementara a unei secvente polinucleotidice de ADN capabila sa se sertioneze in genomul celular. Se considera ca majoritatea transpozonilor au origine ancestrala. I Transpozonii pot fi folositi ca markeri pentru stabilirea tipului nstitutional genetic al indivizilor umani, la identificarea gemenilor litelini si bivitelini, pentru studii paleoontologice si antropologice, in ibilirea etapelor si evolutia speciei Homo sapiens. De asemenea se losesc ca elemente implicate in transmiterea si diferentierea particulara a caractere, ca markeri in diversele boli pe fond genetic. L Pe langa rolul lor ca markeri genetici, elementele transpozabile pot implicate in activitatea genomului uman, avand rolul: - capacitatea de directionare" a actiunii genelor in timpul diferentierii si dezvoltarii organismului; - stabilirea interactiunii cu alte gene, in special in studiul genelor reglatoare si structurale din componenta operonilor; - prin procesul de transpozitie insertionala, induc conditii noi de reorganizare a cromozomilor, cu implicatii in etapele ontogenice, si aparitia diverselor structuri la individul unde s-au produs procesele transpozitionale ale segmentelor polinucleotidice; - transpozonii determina un grad ridicat de variabilitate genetica la nivel molecular (polimorfism molecular); - prin numar si frecventa insertiei secventelor in genomul uman, in stabili labilitatea" genomului uman, receptivitatea genomului la actiunea factorilor de mediu, capacitatea de adaptare, sau nu, la conditii deosebite de stres sau noxe fizico-chimice. Desi cu un potential ridicat de roluri, sau influente in care sunt implicati transpozonii, ei pot fi contrabalansati de prezenta mutatiilor sau producerea mutatiilor de novo" in genomul uman. 55

Un aspect important a fost relevat de Brewer si Sing. Ei considera ca elementele transpozabile ar fi implicate in producerea anomaliilor cromozomale de tipul: ruperi (deletii) cromozomale la nivelul situsurilor fragile. Aceste fisuri cromozomale pot determina afectiuni, boli pe fond genetic. Datorita transpozonilor care indue labilitate genomica, se poate transforma functia unei celule sau unui tesut normal, pot induce dereglari in activitatea celulelor sau tesuturilor. Un exemplu care confirma posibilele modificari in activitatea organismului sunt transpozonii, care determina rezistenta la diverse antibiotice (penicilina, kanamicina, cloramfenicol etc.). Modificarile genomice induse de transpozoni ca rezistenta la antibiotice, sunt urmatoarele: segmentul ADN care determina rezistenta la cloramfenicol are in partea terminala secventa de insertie ISi, iar gena care confera rezistenta la tetraciclina are in zona terminala secventa de insertie IS3. Orfonii ar fi gene rezultate din translocatia cromozomilor cu implicatie in dezvoltarea organismului.

5.4. Palindromul
O categorie de ADN repetitiv necodant este ADN-ul in palindroame. Palindromul se formeaza datorita posibilitatii de realizare a autocomplementaritatii, consecinta ordonarii particulare a bazelor azotate pe o secventa monocatenara din structura ADN-ului cromozomal. Sa presupunem o secventa pe o monocatena din structura moleculei deADN: Daca se analizeaza cu atentie putem observa aparitia posibilitatii de cuplare complementara a bazelor, formand o bucla numita palindrom: .....CCGATTAGGCAAT .....GGCT AATCCGTTA Ca lungime, palindroamele variaza in limite foarte largi, continand intre 6 pb pana la cateva sute si chiar mii de pb. La unele eucariote numarul pb din componenta palindroamelor ar reprezenta pana la 50% din totalul nucleotidelor din genom.

. CCGATTAGGCAAT ATTGCCTAATCGG....

Homo sapiens (omul actual) ar avea aproximativ un numar de 120.000 palindroame. In 1975, Schmid si col. au identificat secvente unice de ADN flancate la cele doua extremitati de secvente terminale de tipul: ATTCGG---------------------------------------CCGAAT
ADN cu secventa unica

6. Genomul mitocondrial sau ereditatea citoplasmatica

In evolutia biologica a organismelor vii a avut loc o specializare intracelulara. La unele bacterii si alge, materialul genetic, respectiv moleculele de ADN, este prezent in citoplasma celulelor. La eucariote consemnam concentrarea materialului ereditar in nucleu, mai exact in cromozomii nucleari. Concentrarea materialului ereditar in nucleul celulelor la eucariote, asigura: - o mai buna protectie" a materialului ereditar; - o distributie precisa" a materialului ereditar in timpul diviziunii mitotice sau meiotice. Dar la eucariote materialul ereditar nu este in totalitate localizat in nucleu. Sunt identificate molecule de ADN in cloroplaste (la plante) si mitocondrii (la animale). De retinut ca la procariote in afara de moleculele ADN care formeaza unicul cromozom, exista si epizomii, forme libere de ADN in citoplasma. In citoplasma celulelor somatice, la eucariote, gasim molecule de ARNm. ARN-ulm sintetizat in nucleu poate persista in citoplasma, avand o oarecare autonomie in raport cu ADN-ul nuclear (vezi mecanismele diferentierii). Autonomia relativa a ARNm fata de nucleu s-a demonstrat experimental prin supravietuirea limitata a celulelor enucleate, care pot sintetiza proteine cu viata lunga pe baza ARNm existent in citoplasma. Cantitatea ADN-ului citoplasmatic este foarte mica in raport cu cea din nucleu (0,5 din totalul ADN-ului celular). Acest ADN da nastere fenomenelor de ereditate citoplasmatica sau extracromozomiala. Terminologia folosita in studiul ereditatii citoplasmatice este urmatoarea: - plasmonul sau plasmotipul este echivalentul genotipului nuclear, reprezentand totalitatea masei ereditare localizata in citoplasma; - plasmida, echivalentul genei, este unitatea ereditara a plasmonului, denumita si plasmogena;
57

- plasmonul sau plasmotipul reprezinta totalitatea determinantilor genetici din componenta plasmidelor; - citoplasmonul, totalitatea plasmidelor ce se gasesc dispersate in citoplasma. Structura genomului mitocondrial Molecula ADN-ului mitocondrial este in dublu helix cu aspect circular (fig. 15). Sanger a stabilit ca ADN-ul mitocondrial din celuleie somatice umane are in componenta sa 16590 perechi de baze (de nucleotide) pentru fiecare mitocondrie. In 1981, Anderson si col. au finalizat secventierea (cartografierea) structurii moleculei de ADN mitocondrial (fig. 15).

58

Fig. 15 ADN-ul mitocondrial

CYS \ HIS .w . f iP
1 LYS LEU

\i

.AUG "/ ASf/-ARG ' /ALA IL.E

6.1.Caracteristicile si functiile ereditatii citoplasmatice

Din cercetarile facute pana in prezent se pot stabili urmatoarele teristici si functii ale ereditatii citoplasmatice (Fig. 16): - nu prezinta
V

. AS*

^, - CITOCROM OXIDAZA III

segregare de tip mendelian. Nu respecta legile

jdelienc;

L-IMET PRO

59

- ereditatea este uniparentala, de regula materna. In Fi unele caractere sunt apropiate de cele ale genitorului matern; - absenta fenomenului de linkage; - posibilitatea ca unele plasmagene sa suporte mutatii, iar caracterele care apar (normale sau patologice) nu respecta regulile mendeliene de segregare si transmitere; - in componenta moleculei ADNm nu sunt proteine de tip histone si nonhistone; - cercetarile lui Stracham si Read (2000) au stabilit ca cele do catene ale moleculei ADNm au componente nucleotidice diferite : d complementare, pe o catena predomina guanina, fiind denumita si cate grea (notata H), cealalta catena este bogata in citozina, denumita catena usoara (notata L); - molecula de ADNm, lipsita de introni, are foarte putine secvente repetitive. Asa se explica de ce aproape intreaga molecula ADNm isi exercita functia de determinism genetic, pe secvente genice; - molecula de ADNm detine aproximativ 37 gene cu func1" determinante. Preponderent detine genele pentru moleculele de ARNt si ale ARNr (Diane K. Lavett, 1997); - prin lipsa mecanismelor de reparare a moleculei ADNm in genomul mitocondrial, creste riscul ratei mutatiilor; - factorii ereditari citoplasmatici sunt detectati prin absenta segregarii in meioza (ovogeneza) sau printr-o segregare care, valoric, nu respecta legile mendeliene; - replicarea moleculei ADNm este unidirectionata; - analizata la microscopul electronic, molecula de ADNm are arhitectura similara cu genomul procariotic (circulara); - se sintetizeaza semiconservativ, dar independent de replicarea ADN-ului cromozomial.

6.2. Ereditatea citoplasmatica sau matroclina

La produsul de conceptie, ADN-ul mitocondrial, respectiv ereditate' citoplasmatica, este de origine materna. Explicatia este urmatoarea: la organismele eucariote sexuate fecundatia se realizeaza intre ovul si spermie. Ovula retine aproape in totalitate masa citoplasmatica, citoplasma in care se gasesc mitocondrii cu ADN. Spermia (capul spermatozoidului cu nucleul haploid) este lipsita de masa citoplasmatica, sau are o cantitate extrem de mica. In consecinta nu contine mitocondrii. Deci rezulta lipsa ADN-ului mitocondrial.
60

Prin fecundatie si constituirea zigotului, zigotul care contine preponderant ADN-ul cromozomial nuclear de dubla origine (23 | cromozomi din ovul si 23 cromozomi din spermie- zigotul devenind celula diploida), contine si o cantitate suplimentara de ADN. Deoarece ADN-ul suplimentar mitocondrial este de origine materna, la copil apar unele nsaturi de caracter apropiatc de ale mamei. Sunt caractere transmise uniparental, sunt nemendeliene. Acest tip de transmitere a caracterelor uniparental, materne este Hnnoscut si sub denumirea de ereditate matroclina sau materna. Genitorul patern nu transmite acest tip de ADN citoplasmatic. Citoplasmonul nu se formeaza de novo. El se formeaza prin replicarea iinui organit preexistent" ancestral ca rezultat al unor simbioze realizate in cursul evolutiei biologice, care au avut loc intre eucariotele si [ procariotcle ancestrale (arhaice). 6.3. Mutatii in genomul mitocondrial si efecte induse Datorita incapacitatii de reparare, sau o reparare limitata si incompleta (in raport cu genomul nuclear), ADN-ul mitocondrial poate fi [supus niecanismelor mutationale, mutatii induse de actiunea factorilor potential mutageni, de origine exogena sau endogena. Dupa Farland (2001), Pascale de Lonloy (2001), Saado (2001), Ehonbridge (2001). s.a., mutatiile mitocondriale reprezinta o cauza portanta a bolilor umane pe fond genetic. In conditii normale, ADN-ul mitocondrial codifica polipeptide implicate in sistemele de fosforilare oxidativa (lantul respirator) ale celulei. Sunt procese care asigura energia necesara activitatii tuturor tesuturilor si ^nelor din organism (exemple: sistemul nervos, muscular, etc.) ADN-ul pitocondrial codifica si sinteza moleculelor de ARNt si ARNr (fig. 16). I ADN-ul mitocondrial este implicat, prin functia de determinism genetic la: [sinteza hem-ului, in procesele de detoxifiere a amoniacului din ciclul Bireogenetic, in procesele de oxidare a grasimilor, dar si in fazele initiale ale j apoptozei celulare. In conditii de mutageneza, mutatia genelor mitocondriale induce Iboli din grupul bolilor degenerative, ca: miopatiile, encefalopatiile, [ epilepsia mioclonica, neuropatii, etc. De exemplu, Mc Farland si col. (2001) au studiat sindromul Leigh, Berminat genetic de mutatii in secventele moleculei ADN-ului I mitocondrial. Autorii au identificat cinci modificari in structura ADN-ului
61

mitocondri al, considerate modificari polimorfice de secventa. Aceste modificari polimorfice indue encefalopat ie necrotica subacuta, miocardiop atie hipertrofica cu efuziune pleurala bilaterala, precum si scaderea activitatii citocrom C oxidazei (Cox) in muschii scheletici si cardiac. In trecut, unele anomalii erau considerate boli cu specificitate de organ. Cercetarile recente accepta ipoteza mutatiilor in ADN-ul mitocondria l, pe care Mc Farland le considera mutatii homeoplas mice. Sun t cerectari

care au identificat proteine modificate in lantul respirator mitocondria l, consecinta mutatiilor in ADN-ul mitocondria l. Asemenea proteine modificate indue disfunction alitati, cum ar fi: deficienta complexulu i III (Cm ubiquinolcitocrom Creductaza) din lantul mitocondria l, care in mod normal, catalizeaza transferul de electroni de pe succinat si nicotinamid adenindinuc leotid, legat de dehidrogen aza. Bolnavii cu disfunction alitati ale complexulu i Cm, manifesta mioencefal opatie si miocardiop atie

(Pascale de Lonay si col, 2001). Un studiu interesant apartine lui Rovio si col. (2001) care au stabilit o corelatie intre mutatiile ADNpolimerazei mitocondri ale umane si infertilitate a masculina.

62

NU ARE LOC SEGREGARE CITOPLASMA TIC A

MATERNA (MATROCLINA)

Fig. 76 ADN-ul MITOCONDRIAL sau CITOPLASMATIC

7.Replica rea ADN-ul ui

Diviziunea celulara si reproducerea organismelor asexuate si sexuate implica transmiterea integrala a informatiei genetice de la o generatie la generatiile care succed.

GENELE PENTRU ARNr

63

Cercetatorii au intuit si au demonstrat ca rolul primordial in I mentinerea si transmiterea informatiei genetice il are ADN-ul din genomul organismelor procariote sau eucariote. De exemplu, Pauling (1962) mentiona: ...dintre toate sistemele naturale, omul, ca toate fiintele vii, este acela care prin intensele sale transformari, pastreaza cea mai mare parte a propriei sale treceri istorice in organizarea sa. Se considera ca nu exista alt sistem, cum este eel biologic, care sa fie mai constant suprimat si simultan mentinut, si ca este suficienta ne interoga genetic pe noi insine pentru a sti in care din sistemele vii structurale s-a realizat trecerea istorica." In 1953, Watson si Crick, pe baza complementaritatii bazelor azotate din dublul helix al ADN-ului, demonstrata de Chargaff, au facut urmatoarea remarca: ...se poate remarca urmatorul aspect: existenta postulata a perechilor specifice (complementare) sugereaza imediat un mecanism posibil de copiere a materialului genetic." Cei doi cercetatori, Watson si Crick ( laureati ai premiului Nobel in 1953), rezuma astfel replicarea ADN-ului celular: modelul nostru de ADM este de fapt constituit din perechi tipar de nucleotide, fiecare complementare intre ele. Noi credem ca inainte de replicare legaturile de hidrogen se rup si ca cele doua lanturi se desperecheaza si se separa. Fiecare lant joaca rol de tipar pentru formarea unui nou lant complementar, pe care, secventa de nucleotide a lantului vechi va fi riguros respectata pe catena nou formata." Conform ipotezei lansata de Watson si Crick, replicarea moleculei ADN este de tip semiconservativ. Catenele se separa asemanator desfacerii unui fermoar (de aici si denumirea ipoteza fermoarului" lansata de cei do: cercetatori). Fiecare catena ce se separa din molecula in replicare va servi ca matrita (template) pentru sinteza catenei noi, care complementar se vor cupla rezultand doua molecule. Fiecare molecula va avea o catena veche si una nou sintetizata. Moleculele rezultate sunt identice intre ele dar identice si cu molecula ADN initiala de la care a inceput replicarea. Ceea ce Watson si Crick au intuit ipotetic, cercetarile ulterioare au confirmat corectitudinea: replicarea este de tip conservativ. Replicarea semiconservativa a ADN-ului a deschis cai noi in cercetarea genetica, in general si in patologia umana, in special.

64

7.1. Principiul si mecanismul replicarii

Proprietatea autocatalitica, respectiv replicarea moleculelor de ADN. este caracteristica pentru toate organismele eucariote. Sinteza ADN-ului respecta trei reguli: a) Sinteza ADN-ului este copierea semiconservativa a ADN-ului in curs de replicare, cu respectarea principiului complementaritatii bazelor, stabilit de Chargaff si demonstrat ca structure secundara a ADN de catre Watson si Crick. b) Sinteza ADN-ului pe catenele matrita"se realizeaza numai in directia 5'-3' deoarece legaturile fosfodiesterice au directie defmita chimic : 5'(fosfat) terminal si 3'(hidroxil) terminal. Desfacerea lanturilor cu ruperea puntilorde hidrogen este dezavantajata energetic dar este condusa energetic spre ATP. c) Enzimele polimeraze catalizeaza elongarea catenelor care se cupleaza complementar pe catenele matrita completand moleculele ADN in replicare. Replicarea este semiconservativa. Fiecare molecula rezultata va contine o catena veche (matrita) si o catena nou sintetizata (complementara pe matrita). Fiecare diviziune celulara este precedata de replicarea corecta" a ADNului genomic. Modelul Watson-Crick prezice existenta furcii de replicare" in cursul sintezei ADN-ului (fig. 17). Furca de replicare s-a studiat la procariote cu ajutorul atomilor marcati cu timidina tritiata. Autoradiografiile obtinute asupra dinamicii replicarii ADN au fost examinate la microscopul electronic (J. Coirns,1963).

65

Catena replica Uf contlnuu (eaten* conductoare) ADN ligaza Replicare discontinue prin fragmente Okazaki) Fig. 17 Replicarea ADN Furca"de replicare. Replicarea ADN se poate produce numai in directia 5'-3'. Un lant ADN se poate sintetiza continuu pe directia 5'-3'.Celalalt lant este sintetizat fragmentat (fragmente Okazoki), care apoi sunt sudate in prezenta ADN-ligaza, pentru a alcatui un lant complet. 7.2. Metode de studiu Pentru a demonstra ca ADN-ul se replica semiconservativ sunt folosite variate metode dintre care mentionam: a) autoradiografia cu examinarea imaginilor la microscopul electronic ; b) ultracentrifugarea in gradient de densitate. a) Microscopia electranica. Primele incercari de vizualizare a| replicarii semiconservative apartin lui Coirns (1962). El a demonstrat Escherichia coli, ca replicarea are un punct de initiere, de la care procesul progreseaza pana cand apar doi cromozomi inelari in celula bacteriana.

Direcjia de deplasare a furcii de replicare

66

Prin folosirea BrdU (brom-deoxi-uridina), precursor de sinteza analog timidinei, sau prin folosirea timidinei tritiate (3H), s-a analizat incorporarea acestora in moleculele ADN nou sintetizate. Cu ajutorul microscopului electronic s-a observat ca, incepand cu punctul de initiere incepe ruperea puntilor de hidrogen. Acest proces progreseaza unidirectional punctului de initiere sau bidirectional (fig. 18). Moleculele care vor rezulta prezinta catenele de novo" diferit colorate fata de catenele matrita si ami me: -catena matrita se prezinta de culoare inchisa (intunecata); - catena nou sintetizata va fi de culoare deschisa datorita incorporarii nucleotidelor marcate. Aceasta metoda are aplicabilitate in studiul genomului uman in testarea mutagenitatii chimice. Replicare (Orpine de replicare) I 100 kb

____f%___
Czr~
Fig.18 Direc|ia de replicar

b) Experimentul Meselson si Stahl. Mecanismele si procesele implicate in replicarea moleculelor ADN la procariote si eucariote au fost elucidate folosindu-se mutanti, conditionale", care influenteaza efectele secundare (fenotipica) in conditii speciale. Contributie speciala la studiul replicarii semiconservative a ADNului genomic au avut Meselson si Stahl (1958) prin experientele la procariote. Cei doi cercetatori au elaborat o metoda de masurare a densitatii moleculelor de ADN hibride. Ei au folosit pe cale fizica separarea densitatilor de diferentiere. Metoda elaborata confirma in vivo" ca molecula ADN se replica semiconservativ, conform srtucturii dublului

67

Principiul metodei: cand diverse molecule se supun I ultracentrifugarii prin folosirea unei solutii concentrate de CsCl, conform I gradientului de densitate, separarea si repartitia moleculelor se va realiza I conform principiului: in fiecare punct concentratia si repartitia in CsCl a I moleculelor este in functie de fortele de gravitatie ale moleculelor supuse I centrifugarii. Moleculele cu concentratie si masa moleculara mare se dispun la I fundul eprubetei de ultracentrifugare, iar cele cu concentratie mica spre supra fa la lichidului. ADN-ul, molecule cu masa moleculara diferita, prinl ultracentrifugare se stratifica in benzi in CsCl. Aparitia benzilor ADN in gradient de densitate in CsCl este j rezultatul a doua forte antagoniste: - forta de gravitatie, care are tendinta de a sedimenta moleculele de ADN; - fortele de sens contrar, prin care moleculele ADN se dispun in benzi, in raport cu masa moleculara. Dispunerea stratificata in benzi este in relatie cu difuziunea termica a moleculelor ADN. Concentratiile moleculelor ADN (in raport cu numarul generatiilor ce au succedat hibridizarii moleculare) se vor dispune bandat in gradientul de densitate. In functie de valoarea medie si in raport cu generatia cercetata, distributia este gaussiana. Cand tubul de ultracentrifugare contine un amestec de molecule ADN cu masa moleculara diferita, aceste molecule vor stratifica la nivele diferite in concentratia de CsCl, formand benzi distincte (fig. 19). Fiecare banda poate fi analizata la spectrofotometru sau autoradiografic, rezultatele putand fi exprimate si grafic. Meselson si Stahl, folosind culturi de Escherichia coli si izotopi de atomi de azot diferit marcati, au demonstrat experimental replicarea semiconservativa a ADN : a) Au cultivat celule de Escherichia coli pe un mediu de cultura marcat cu "N, care este un azot greu. In timpul sintezei ADN-ului, precursorii marcati cu N sunt incorporati in catenele nou sintetizate, cuplandu-se complementar cu catena tipar (provenita din molecula initiala in curs de replicare). In acest mediu marcat cu 15N, bacteriile sunt mentinute mai multe generatii pentru a avea certitudinea ca ambele catene, ce vor rezulta cuplate complementar intre ele, vor fi marcate cu l5N.

68

A unnat extragerea ADN-ului din coloniile de E. coli dezvoltate pe mediul de cultura si supus ultracentrifugarii in gradient de densitate intr-o soluticde CsCl. Deoarece aceste molecule au incorporat in timpul sintezei numai precursori marcati cu azot greu ~N, ADN-ul cu masa moleculara mai mare (un ADN grcu), fata de ADN-ul nemarcat (natural), prin uliracenlrifugare, se va strati Ilea in partea inferioara a tubului de centrifugare. ADN-ul se dispune sub forma unei benzi in regiunea de concentratie a CsCl din tub, care este egala cu densitatea sa de plutire (fig. 19). b)Un experiment asemanator au efectuat cu Escherichia coli, numai ca mediul de cultura a fost marcat cu azot usor l4N. Dupa o suita de generatii celulare si replicari ale ADN-ului din genomul procariotic, supune ADN-ul, care prin sinteza a incorporat l 4 N (azotul usor) ultracentrifugarii in gradient de densitate in CsCl. Deoarece aceste molecule au incorporat azot usor N , masa moleculara fiind mai mica (este un ADN usor), se vor stratifica in partea superioara a tubului, form and o banda distincta si jdistantata fata de banda 15 N. Este banda ADN l4N (fig. 19). c) dupa stabilirea gradientului de densitate 15N si 14N, au elaborat urmatorul experiment: un mediu de cultura (mediul III) marcat cu azot usor ftpe acest mediu a insamantat E.coli din mediul 1 care a fost marcat cu Dt greu 15N. Pe mediul III, E. coli s-a dezvoltat un interval de timp corespunzator unui singur ciclu celular (o generatie procariota). In consecinta si ADN-ul genomic procariotic s-a replicat o singura data. Au extras acest ADN, 1-au supus ultracentrifugarii in gradient de densitate cu CsCl. Rezultatul a fost urmatorul: aparitia unei benzi de ADN localizat I'intermediar ca distanta fata de banda 15N si banda 14N. Este un ADN hibrid care este structural din dona catene : o catena '^N si una ,4N (,5N/14N) j ( f i g .l 9 ) .

M arcare N 15

G enerative "0" M a rca reN l4

G e n era tiaT V A D N extras

A D N extras \ /

N14

N14 N14
ADN hibrid N15 N 14 5 0%

Uitfacentfifuaare in CsCl Fig. 19 Etapele experimentului MeselsonStahl la Escherichia coli. d) Au continuat experimentul folosind mediul IV, marcat tot cu azoi usor 14N, pe care a insamantat E.coli recoltata din mediul III. Pe aces: mediu bacteriile au fost mentinute tot o singura generatie. ADN-ul extras si supus gradientului de densitate prin ultracentrifugare in CsCl s-a stratificai astfel : 50% in zona mediana a tubului (ADN hibrid 15N/14N) si si 50% in zona gradient 14N. Nicio molecula ADN nu a fost identificata la gradientul ,5N. Acest ADN ar corespunde genomului din generatia a II-a a bacterid E.coli.

70

Explicatia data de Meselson si Stahl este urmatoarea (fig.20):

Generatia F2

16N

15N

Generatia ADN marcat 15N "0"

Fig.20 Mecanismele etapelor replicarii ADN dupa Meselson-Stahl La sfarsitul generatiilor F0, dupa o suta de replicari aleADN-ului genomic, pe parcursul mai multor generatii celulare, intreg ADN-ul continea catenele marcate: pe mediul I cu l5N (15N/15N) iar pe mediul II cu l4 N(l4N/l4N).
I 4,

Trecandu-se E. coli de pe mediul I pe mediul III marcat cu N, unde s-a mentinut o singura generatie celulara, deci o singura replicare, ADN-ul rezultat este un ADN hibrid cu o catena marcata cu l5N, a doua marcata cu , 4 N (ADN hibrid 15N/14N). In consecinta masa moleculara este
14

15,

diferita de a ADN-ului N si '*N. Va avea o masa moleculara intermediara celor doua gradiente 1:,N si l4N. Deci ADN-ul marcat continea o catena 71

,3

veche marcata cu 15N si o catena noua complementara in raport cu cea veche, dar marcata cu 14N. Masa moleculara este media masei molecularea ADN-ului 15N si 14N. ADN-ul hibrid, dublu catenar, rezultat prin replicare in primul ciclu celular (Fi) prezinta un raport de 1:1 intre catenele 15N si 14N pentru fiecare molecula de ADN. Acest raport se obtine numai in conditiile cand sinteza ADN este semiconservativa. Pentru esantioanele de ADN extras din generatiile F2, F3,...etc, raportul intre moleculele hibride ADN 15N/14N si ADN-ul cu ambele catene marcate 14N (conform experimentului fig. 19) va creste in progresie geometrica in favoarea ADN-ului 14N. O remarca : raportand numarul catenelor marcate cu N si N din ADN-ul generatiilor Fi,F2,F3,...etc.,se observa un raport mendelian" (fig.20). Experimentul Meselson si Stahl permite urmatoarele evaluari: - ADN-ul celular se replica semiconservativ; - Continutul relativ egal intre G si C, si respectiv intre A si T; - Separarea ADN-ului nativ dublu helicoidal, de ADN-ul denaturat non helicoidal; - Studierea denaturarii si renaturarii ADN-ului; - Separarea ADN-ului nuclear (cromozomial) de ADN-ul mitocondrial (citoplasmatic). ADN-ul mitocondrial are o componenta diferita in bazele azotate, fata de ADN-ul nuclear.

7.3. Enzime si proteine implicate in replicarea ADN

La organismele procariote si eucariote sunt identificate urmatoarele complexe enzimatice implicate in mecanismele replicarii si sintezei moleculelor ADN: - ADN polimeraza I este denumita si enzima Romberg. Estd enzima monomerica, cu o masa moleculara de 103 Rd. Lantul polipeptidic al enzimei poate fi clivat in doua segmente : produsul mare de clivare de 68 Rd, denumit si fragmentul Klenov si fragmentul mic de clivare de 35 Kd. 1 Fragmentul mare are actiune polimerazica si exonucleazica 3'-5', iar fragmentul mic are functia exonucleazica 5'-3', si care excizeaza grupuri mici de nucleotide (segmente polinucleotidice mici). Ca rol ADN polimeraza I intervine in mecanismele de replicare si corectare a erorilor ce apar in timpul formarii catenei de novo". Este enzima care introduce primul dezoxiribonucleotid la capatul 3'-0H al primerului ARN, cand incepe sinteza de novo". Dupa cuplarea
72

nucleotidului la pozitia 3'OH al ARN primer, ADN polimeraza I se decupleaza si intra in functie catalitica enzima ADN-polimeraza III, care asigura elongarea lantului polinucleotidic al catenei de novo care se smtctizeaza. ADN polimeraza I este implicata in alungirea fragmentelor Okazoki. ADN polimeraza I, ca enzima moderat progresiva, are si rol exonucleazic de tip 3'-5' si 5'-3', determinand si o hidroliza a unui lant ADN. polimerizand segmente pana la 10 nucleotide. Actiunea exonucleazica 3'-5' corecteaza erorile posibil aparute in timpul sintezei catenei de novo", iar actiunea exonucleazica 5'-3'se materializeaza prin sinteza catenei de novo" prin indepartarea ARN primer. - ADN polimeraza II - Rolul este putin cunoscut dar este si ea implicata in replicare. - ADN polimeraza III - Catalizeaza (replicarea) sinteza ADN-ului directionata de matrita ADN. Este enzima inalt procesiva polimerizand aproximativ 1000 de nucleotide. Pentru a asigura aditia precursorilor dezoxiribonucleozizi-trifosfat, enzima necesita prezenta unui primer ARN cugruparea 3'-OH libera. ADN polimeraza III asigura sinteza catenei de novo" in directia 5'-3\ rol important in sinteza. Aceasta enzima este multimerica. Holoenzima este un caomplex de 900 Kd. Daca la procariote sunt implicate ADN polimerazele I, II si III, la eucariote s-a identificat un important complex enzimatic implicat in replicare. La eucariote sunt implicati mai multi factori in replicarea ADN-ului, iarcomplexul enzimatic cu rol catalitic este reprezentat de enzimele: - ADN polimeraza de tip a (alfa). Are o structura complexa formata din mai multe subunitati, toate implicate in replicarea ADN-ului. Masa moleculara variaza intre 110-220 Kd. Argumentele care intaresc ipoteza ca ADN polimeraza a are rol major in replicare sunt urmatoarele: - blocarea activitatii polimerazei a cu aphidicolina (drog), sinteza ADN-ului este stopata ; - mutantii conditionali ai genei ce actioneaza la temperatura de 42C (temperatura nepermisiva), enzima nu se mai implica in replicarea ADNului; - enzima nu are activitate 3'-5' exonucleazica. Enzima a polimerazica, pe langa activitatea de tip ADN polimerazica are si o activitate primazica.
73

- ADN polimeraza p (beta). Este localizata in nucleul celulei eucariote. Are o masa moleculara de 45 Kd. Activitatea catalitica se cupleaza cu repararea ADN-ului cand apar erori in replicare. Activitatea de reparare a erorilor asigurata de ADN polimeraza (3 se cupleaza cu polimeraza 8 (epsilon). - ADN polimeraza 8 (delta). Are proprietati apropiate de polimeraza a si impreuna pot fi identificate la nivelul complexului de initiere a replicarii ADN. Deoarece inhibitorii sunt comuni si cu efecte asemanatoare cu cele ale tipului a, se presupune ca cele doua enzime ar avea un precursor comun. Activitatea importanta a polimerazei 8 este 3'-5' exonucleazica. Pentru ca enzima polimerazica sa fie activa (conditional) este necesara prezenta cofactorului ciclina sau PCNA (prolifferating cell nuclear antigen). Concentratia polimerazei 8 este crescuta in stadiul interfazic S". - ADN polimeraza y (gama). Este identificata in mitocondrie. Are o masa moleculara de aproximativ 60 Kd. Este implicata in replicarea ADNului mitocondrial. Se crede ca activitatea sa este corelata cu o gena cromozomala din nucleu. - ADN polimeraza (epsilon). Ca si polimeraza p, aceasta enzinr are rol important in repararea erorilor sau a mutatiilor punctiforme ce ap-in timpul replicarii ADN-ului. Alte complexe enzimatice implicate in replicarea moleculelor AD sunt: - ADN helicazele - care separa catenele complementare al moleculei in curs de replicare. Activitatea acestui complex enzimati necesita o sursa energetica asigurata de prezenta ATP-ului. Aceste belie* asigura inaintarea ruperii puntilor de hidrogen si despiralizarea catenelor* zona furcilor de replicare. - ADN topoizomerazele I si II . Despiralizeaza helixul ADN-ul sectioneaza catenele la nivelul axului fosfodiesteric, deruleaza molecu dupa care resudeaza fisura produsa in respectivele catene. Topoizomeraza sectioneaza o singura catena din ADN-ul in replicare. Topoizomeraza sectioneaza ambele catene ale ADN. - ARN primaza sau ARN polimeraza. Este enzima c* sintetizeaza secvente scurte de ARN - amorsa implicate in sinteza no" catene de ADN. - ADN ligaza - este enzima care catalizeaza legatura fosfodiest intre 3'-OH de la un capat al unei catene ADN si gruparea 5'-fosfat de capatul catenei complementare a ADN-ului dublu helix. Reactia absoarbe energia data de NAD (nicotinamid adenindinucleotid) si de ATP. 74

In replicarea ADN-ului sunt implicate proteine de tipul: - Proteina dnaA - declanseaza despiralizarea dublui helix al moleculei ADN si initiaza sinteza ARN-primer sau ARN-ul amorsa; - Proteina dnaB - coparticipa la declansarea despiralizarii dublului helix; - Proteina rep (helicaza) -deasemeni coparticipa la despiralizarea dublului helix; - Proteina SSP (Single Strand binding-protein) - dupa ce puntile dehidrogen au lost rupte si s-au scparat catenele polinucleotidice ale ADN-|ului, aceasta proteina stabilizeaza monocatena.

7.4.Mecanismul molecular de replicare a ADN-ului Ul.Etapele sintezei moleculei ADN.

a)Despiralizarea ADN-ului in curs de sinteza. Procesul incepe de kstusul de origine al replicarii. Zona este denumita situs oriC", avand o lungime de aproximativ 245 pb. Pentru inceperea si controlul replicarii moleculei ADN, metilarea adeninei din secventa GATC este esentiala. Situsul C" se va cupla cu proteina dnaA, formand complexul care declanseaza reactiile de despiralizare a ADN-ului, initiind si sinteza ARN-primer. Sinteza ARN-primer se face prin activarea enzimei ARN-primaza. [Reactiile initicrii si activarii situsului de origine C" sunt amplificate de Iproteinele dnaB si de helicaza. b)Stabilizarea monocatenelor. Prin ruperea puntilor de hidrogen si separarea monocatenelor, pe segmentele unde s-a produs despiralizarea, monocatenele sunt mansonate de proteinele SSP. Prin mansonare monocatenele devin stabile fara a se mai recupla. c) Sinteza ARN-primer (amorsa). Primaza este enzima care asigura sinteza ARN-primer. Dupa sinteza ARN-ul primer se localizeaza la situsul de initiere, unde incepe sinteza catenei de novo", care, impreuna cu catena complementara - matrita, va construi viitoarea molecula ADN. r Laprocariote este un singur situs de initiere pentru replicarea ADN-j u l u i . La eucariote, datorita complexitatii genomului (prin numar cromozomi si cantitate ADN) sunt mai multe situsuri de initiere la nivelul aceleiasi molecule ADN.

75

Initiata replicarea si ruperea puntilor de hidrogen, prin separarea monocatenelor complementare, progresiv, se formeaza furca de replicare" (fig. 21). La eucariote furca de replicare este bidirectionata, in sensul ca ruperea puntilor de hidrogen, despiralizarea si separarea progresiva a catenelor complementare din ADN sunt directionate in ambele sensuri (sensuri opuse) ale moleculei in replicare.

Fig. 21 Mecanismul si enzimele implicate in sinteza ADN la E.coli (furca de replicare) 76

d) Sinteza lantului pleading si logging4". ') Dupa initierea separarii catenelor matrita" a ADN-ului in replicare, sinteza catenelor de novo" complementare in raport cu catenele matrita este neuniforma (Kornberg, 1968). Kornberg a observat ca pe catena matrita cu esterificarea 5' - 3', sinteza catenei de novo" urmeaza un flux continuu (leading)- este lantul conducator. Pe catena matrita" din ADN cu esterificarea in sensul 3'-5', [sinteza este discontinua. Este lantul Jogging" - intarziat sau discontinuu . - Sinteza pe catena leading - in prezenta ARN-primer cuplat la furca de replicare, ADN-polimcraza III incepe esterificarea si cuplarea in flux continuu a nucleotidelor pe matrita a carei esterificare este directionata in ordinea 5'-3'. Pentru formarea catenei de nuovo, coparticipa helicaze, ATP, proteina SSP si giraza ncgativa (enzima care asigura supraspiralizarea unor nolecule). Pe masura ce se esterifica nucleotidele pe catena de nuovo, ele se vor cupla complementar cu nucleotidele prezcnte pe catena matrita, finalizand progresiv molecula de ADN. - Sinteza pe catena logging - Pe catena la care esterificarea este [directionata in ordinea 3'-5' sinteza este diferita fata de catena leading. Pe aceasta catena esterificarea si sinteza catenei de novo" este discontinua : complexa si intarziata. Deoarece sinteza catenei de novo" se face sub actiunea enzimei ADNpolimeraza III numai in directia 5'-3', pe catena matrita esterificata 5' sinteza este complexa cu participarea unor factori si mecanisme particulare. Cel care a descifrat mecanismul sintezei pe catena logging a catenei de novo" a fosl Okazaki. El a demonstrat ca pe catena logging sinteza are loc pe fragmente polinucleotidice. Sinteza este fragmentara. cesul se demleaza astfel: ADN polimeraza III realizeaza esterificarea B' a unui fragment polinucleotidic, al carui numar de nucleotide poate variaintre 1000 si 2000. Sunt fragmented Okazaki. Pentru esterificare si ca fragmentelor Okazaki este necesara prezenta ARN-amorsa (primer). Pe acest ARN-amorsa se asambleaza nucleotidele in directia 5'-3' 1 , 2 1 ) .

Leading= lantul conducator", cu sinteza continua a ADN; Lo ging = lantul intarziat", cu sinteza g discontinua a ADN.
77

7.4.2.Replicarea ADN si modelul aditiei primerilor Structura antiparalela a catenelor din molecula ADN in curs de replicare complica" mecanismul sintezei catenelor de novo". Este demonstrat ca prin avansarea separarii catenelor matrita" cu formarea furcii de replicare, catenele de novo" se sintetizeaza pe ambele catene matrita". Dar furca de replicare prezinta pe un ram esterificarea in directia 5'-3' iar pe al doilea esterificarare in directia 3'-5'. Cum sinteza catenelor de novo" necesita prezenta ARN-primer (amorsa), acest ARNprimer urmeaza urmatoarele etape de formare si cuplare pe catena matrita" a ADN-ului in replicare: - pe matrita ADN se sintetizeaza o secventa de ARN-primer. Capatul 3'-OH al ARN-primer este elongat de o ADN-polimeraza; - ARN-ul preformat se cupleaza cu matrita ADN, ceea ce permite propriului capat; 3'-OH sa fie folosit in sinteza ADN; - un capat al ARN-primer generat in duplexul ADN este implica! intr-un mecanism elementar de producere a unei incizii; - in reactia directa de identificare a unui nucleotid cu participarea ADN-polimerazei III, primeaza proteina. Pe catena matrita leaging" sinteza catenei de novo" avanseaza in directia 5'-3', iar pe catena logging" sinteza se extinde pe directia 3'-5',CB| formarea de fragmente scurte care sunt sintetizate (in prealabil) pe directia 5'-3'. Aceste fragmente monocatenare pot fi ulterior extinse in directie inversa fata de deschiderea furcii de replicare. Aceste fragmente (fragmentele Okazoki) pot fi marcate, analizate si urmarite in dinamica procesului de replicare si sinteza a ADN-ului. Datorita diferentelor de sinteza intre catenele leading" si Jogging" sunt consemnate urmatoarele particularitati: - lantul polinucleotidic pleading" necesita prezenta unui singiu ARN-primer; - lantul polinucleotidic clogging" solicita prezenta unui numar mare de molecule ARN-primer.Numarul mare de molecule ARN-primer pentn. catena logging este determinat de numarul fragmentelor Okazoki ce se formeaza pentru sinteza ADN cu matrita esterificata in directia 3'-5'. Este demonstrat ca fiecare fragment Okazoki incepe sinteza in prezenta unui ARN-primer. De retinut ca aceste molecule ARN-primer au dimensiuni foarte mici, continand circa 10 baze lungime. 78

Sinteza moleculei ARN-primer este catalizata de enzima ARNIpolimeraza, enzima determinata genetic de gena dnaG.

7.5.Etape in sinteza catenelor de novo" in replicarea ADN

In 1970 Temin si Baltimore au demonstrat transcrierea inversa" ARN'->ADN in timplul replicarii si sintezei moleculei de ADN. Ei au Herimentat pe ribovirusul Rauscher pentru leucemia murina si pe )ribovfrusul sarcomului Raus. Incuband acesti virusi in prezenta HP(d-nucleozid trifosfat) a ionilor de Mg2+ sau de Mn2' au obtinut un iimer ADN sensibil la hidroliza cu dezoxiribonucleaza. Autorii au Hat ca prin tratarea amestecului obtinut din respectiva hidroliza cu nbonucleaza, sinteza ADN-ului nu avea loc. Bazandu-se pe aceste rezultate pnin si Baltimore au emis ipoteza ca ARN-ul viral este esential pentru Dlimerizarea si sinteza ADN-ului. I Acest experiment elaborat de Temin si Baltimore a evidentiat ca ..ADX-polimeraza dirijata de ARN" sau transcriptaza inversa" este enzima H foloseste ARN-ul, hibrizii ARN-ADN si ADN-ul ca matrita pentru carea ADN-ului din genomul celulelor. [ Enzima transcriptaza inversa" a fost izolata din oncovirusuri din Alele umane si murine (precum soareci, sobolani). La om si murine area transcriptazei inverse s-a realizat atat din celule normale cat si din | cclulc canceroase. [ Mecanismul de actiune a transcriptiei inverse este prezentat ftnatic in fig. 22. 23. schema elaborata de Watson. loose si Kurtz in 83 (..Recombinant DNA").

79

ADN giraza de reducere a spiralizarii ADN(despiralizarea) Helicaza de despiralizare a ADN Proteina SSB de conversie a singurei catene ADN Primozomul forma primara Holopolimeraza III

Topoizomeraza de relaxare a tensiunil SSB Proteina deplasata de catena in crestere

Catena intarziata ndepartarea primerulw si completarea spatiulii Polimeraza Catena Leading rapida (conducatoare)

Ligaza Fig. 22 Factorii implicati in replicarea ADN-ului (proteinele implicate) dupa Adams si col. 1992, si reprodusa dupa Clark si Wall, 1992.

80

ARN 5' 3"

Termina te poliA (poliade ninicS) AAAA AAAA TTTT

flevers transcriptase Primer oligotimidinic virala"

ADNc

c
NaOH

AAAAAA AA TTTT

B u c I S "ac de par*

e
ADNc '

TTTT

i
ADN poiimeraza I

Nucleaza* SI

/;;'. JJMecanismul transcriptiei inverse. Analizand etapele transcriptiei inverse in sinteza ADNc dublu catenar, cu implicarea ARN- primer, se poate stabili urmatorul mecanism: terminatia poliadenilica din catena ARNm este hibridizata cu o catena scurta oligotimidinica. Secventa oligotimidinica serveste ca primer pentru actiunea revers-transcriptazei ce foloseste catena ARN ca matrita" pentru sinteza catenei ADNc (ADNc= ADN complementar); ADNc rezultat prezinta terminal o bucla in ac de par";

81

c) prin degradarea ADNm cu NaOH, bucla terminala a ADNc devine primer" pentru enzima ADN-polimeraza I; d) in prezenta nucleazei Si, bucla este clivata rezultand molecula de ADNc dublu catenara. Proprietatea revers transcriptazei (transcriptaza inversa) de a sintetiza ADN-ul cu ajutorul matritei de ARNm, este folosita la sintezele artificiale ale genelor, pornind de la un ARN-mesager corespunzator (complementar" structurii unei gene). Se mai foloseste la sinteza ADN-c ca sonda moleculara. Steele (1979) sugereaza ca ARNm din mutatiile somatice poate fi grins'' (acrosat) de un virus si transferat in gonade, iar cu ajutorul reverstranscriptazei sa produca ADN-c, care poate fi integrat in genomul celulelor gametice. Ipoteza lui Steele ar sustine rationamentul cu privire la mecanismul genetic de mostenire a caracterelor dobandite in cursul vietii individului. Desi ordinea etapelor nu este bine cunoscuta in totalitatea proceselor implicate, pot fi considerate urmatoarele etapizari: - sinteza ARN-primer; - extensia sa cu ADN-ul; - indepartarea ARN-primer si inlocuirea lui cu un fragment ADNcomplementarizat(ADNc) de ARN-ul primer; - legarea (covalenta) fragmentelor Okazaki adiacente. ARN-ul primer este sintetizat de un primozom, care este un complex proteic format din: - ARN potimeraza - ADN dependenta, enzima denumita primaza care este codificata de gena DNA-G - doua proteine codificate de genele DNA-B si DNA-C. Sunt proteine care se asociaza cu primaza; - proteinele i, n, n', n" si care recunosc loculde sinteza ARN-primer. Primozomul exercita rolul in sinteza ARN-primer implicat in procesele urmatoare: - pe masura ce helicazele actioneaza pentru ruperea puntilor de hidrogen si separearea monocatenelor complementare din structura ADNului in replicare, proteinele SSB, care mansoneaza catenele pentru a nu se recupla, nu mansoneaza ultimul segment al catenelor complementare, care va prezenta forma unui ac de par". Acest ultim segment va fi recunoscut de primozom. Este segmentul unde se initiaza sinteza ADN-ului. 82

Initierea sintezei ADN-ului in prezenta primozomului si a ARNprimer, catalizata de ADN-polimeraza III, incepe la extremitatea 3'-OH libera a moleculei de ARN-primer. Sensul esterificarii si de cuplare a nucleotidelor ce vor structura catena de novo'Va fi 5'-3\ Pe masura ce se sintetizeaza catena de novo" si cuplarea complementara cu catena matrita, proteinele SSB sunt indepartate. Acest proces se deruleaza pe catena leading. Pe catena logging, unde procesul este discontinuu, in esterificarea 5'3' si formarea catenei de novo", sunt implicate variante ale enzimei ADNpolimeraza III, deoarece aceasta enzima este compusa din subunitati functionale, care sunt codificate de gene diferite. Pe catena logging discontinua pe care, ca prima etapa, se sintetizeaza fragmentele Okazaki, sinteza ADN-ului este intarziata. Fragmentul Okazaki a carei dimensiune ajunge la 1000-2000 b, dupa sinteza sa realizeaza o rotatie de 180 in axul longitudinal al catenei matrita cu care se va cupla complementara. La rotatia de 180 a fragmentului Okazaki este implicata o enzima-invertaza. Rolul invertazei este urmatorul: catena logging are directia de esterificare 5'-3'. Initial fragmentul Okazaki sintetizat are directia de esterificare tot 5'-3'. Pentru a se cupla cu catena matrita logging se produce rotatia in ax longitudinal al fragmentului Okazaki. Dupa rotatie directia de esterificare a fragmentului Okazaki devine 3'-5'. In aceasta stare fragmentul Okazaki se va cupla complementar pe catena logging. In urma acestei cuplari catenele devin antiparalele cu formarea in final a moleculei ADN. Dupa sinteza si cuplarea fragmentului Okazaki cu catena matrita logging, ARN-primer este indepartat, iar golul" lasat este completat de ADN-polimeraza I care prin activitatea exonucleazica, va introduce un nou fragment Okazakic de ADN. Capatul 3'-OH al fragmentului ce se va asocia incontinuare este adiacent capatului fosfat 5'-OH al fragmentului anterior. Legarea fragmentelor Okazaki este realizata de o enzima ADN-ligaza. Zona cuprinsa intre punctul de initiere si fragmentele de ADN replicat este denumita replicon. La om, lungimea repliconului variaza in limite foarte largi, intre 100 si 300 kb, dimensiunea repliconului flind determinata de Huberman si Riggs, inca din 1968. In genomul mamiferelor (si la om) numarul unitatilor de replicare (a repliconilor) variaza intre 2000 si 3000. La mamifere situsurile de initiere a replicarii apar pe zone aleatorii, nu in puncte specifice. Aceste zone contin un niimar de secvente prezente in genom. Fiecare zona are importanta deoarece actioneaza ca initiator al replicarii (fig.24). 83

originea replicarii

_______i_______
Furca Xj j j j j j \ Furca 5'------------------ 3' 5'------------------>3'
3' 4--------------------5' 3'-

Crestere

Crestere

Fig. 24 Replicarea bidirectionala in sinteza ADN.

Spre deosebire de procariote, complexitatea zonelor de initiere a replicarii este consecinta naturala a genomului, care este complex si necesita mecanisme ample de activare si reglare a replicarii. Se presupune ca activarea unei zone de origine si initiere a replicarii ADNului ar depinde de pozitia in structura tridimensionala si cuaternara a cromozomilor si mai putin de compozitia specifica in nucleotide a repliconului. Huberman si Riggs (1968) au observat ca rata replicarii este diferita la eucariote fata de procariote. Folosind tehnica autoradiografica de analiza a replicarii ADN-ului a observat ca furca de replicare la mamifere ar inainta cu 3kb/min. Dupa initierea replicarii ADN-ului rata de alungire a catenelor de novo" pare a fi constanta, ca derulare, pentru fiecare tip de celula din organism. De exemplu la procariote, intregul ADN din unicul cromozom inelar se replica in 20 minute. La Escherichia coli cromozomul prezinta o singura zona de initiere a replicarii. Are un singur replicon cu doua furci de replicare care inainteaza in sensuri contrare pana cand se vor intalni. Fiecare furca de replicare are o rata de 1600 pb (perechi baze) pe secunda. La om rata replicarii in celulele somatice este mult redusa valoric. Se estimeaza ca ar fi de aproximativ 100-150 pb/sec pentru fiecare furca de replicare.

cS4

Daca luam in consideratie numanil cromozomilor, tipul si cantitatea de ADN (repetitiv si nonrepetitiv), arhitectura moleculelor ADN, prezenta histonelor si arhitectura cuaternara a cromozomilor (nucleozomi, solenoizi, bucle, etc.) la eucariote, sunt consemnate deosebiri esentiale intre procariote si eucariote. Procariotele au un singur replicon, un singur situs de initiere in replicarea ADN-ului, genomul este lipsit de histone si tipuri diferite de ADN (Cairn, 1962). Spre deosebire de procariote, eucariotele au in genomul celular o cantitate foarte mare de molecule ADN, care insumeaza in total un numar de aproximativ 3.5 x 109 pb. Ca urmare prin structure si componenta repetitiva si nerepetitiva este putin probabil existenta unui singur situs de initiere in replicarea ADN (Cairn). La eucariote, replicarea intregului ADN genomic se face intr-un timp limitat, in stadiul interfazic S'. La eucariote apar doua probleme fundamentale in replicarea ADN-ului genomic: - probleme de ordin topografic determinate de structura cromatinei cromozomiale: nucleozomii, solenoizii, buclele. Sunt elemente legate de arhitectura cromozomilor care pot introduce" superspire negative" in morfologia cromozomilor; - o alta problema este ca moleculele ADN-ului in dublu helix, cuplate cu histonele si prezentand si secvente repetitive, trebuie sa se replice integral, intr-un interval foarte scurt de timp. Daca am raporta procesul la eucariote fata de procariote, prin cantitatea si heterogenitatea ADN-ului, ar trebui ca la eucariote timpul necesar pentru replicarea integrala a ADN-ului sa fie de peste 100 ori mai mare la om fata de procariote.(Eschericia coli). Asa cum s-a mentionat, Huberman si Riggs au identificat formarea mai multor puncte de initiere in replicarea ADN-ului cromozomial, puncte ce se gasesc la distante intre ele de 100-300 kb. In raport cu numarul punctelor de initiere putem aprecia numarul repliconilor / cromozom. In genomul uman punctele de initiere s-ar gasi la 150-200 kb distanta intre ele. Luand in consideratie numarul perechilor de nucleotide si distanta intre punctele de initiere, se aproximeaza un numar de aproxiativ 3000 situsuri de initiere. La om repliconii nu se replica sincron. Se observa o replicare asincrona. Asincroniile sunt legate de momentul activarii situsului de initiere si de elongatia repliconului. Asincronia replicarii ADN-ului se observa in stadiul interfazic S". 85

Asincronia in activitatea repliconilor este determinata si de forma de condensare a fibrilei de ADN, de abundenta cuplurilor complementare G = C in structura repliconilor, de cantitatea de ADN repetitiv per molecula si cromozom.

7.6.Erori de replicare a ADN si repararea erorilor in genomul uman

ADN-ul din componenta genomului celular, prezent la procariote si/sau eucariote, datorita interrelatiei cu factorii ambientali ai organismelor vii, poate fi influentat, distructiv , de interferenta agresiva" a unor factori exogeni sau endogeni (vezi cap. mutatii). Aceste distructii mutationale in structura ADN-ului genomic au ca efecte directe modificarea mesajelor genetice inscrise, iar ca efecte secundare aparitia unor caractere noi, care la om se manifesta ca sindroame severe pe fond genetic. Daca s-ar mentine erorile induse in structura si functiile ADN-ului, frecventa, incidenta bolilor pe fond genetic, ar fi alarmant de ridicata. Mai mult, cu fiecare generatie care succede frecventa ar fi in permanenta crestere valorica. Se apreciaza ca frecventa erorilor punctiforme in structura ADN-ului, manifestate ca boli genetice, ar fi de 10~6 la nivelul intregii populatii umane. Dar ADN-ul genomic dispune de mecanisme si procese prin care sa-si corecteze erorile din structura proprie. In cazul cand ADN-ul n-ar avea capacitatea de autoreparare structurala, atunci valoarea mutatiilor punctiforme ar creste de la 10"6, cat se considera mutatiile spontane in populatiile umane, la peste 1000 de ori. Dar ADN-ul genomic uman isi corecteaza propriile erori mutationale, ceea ce explica incidenta scazuta a mutatiilor genice la nivel populational. Factorii populationali ce indue erori in structura ADN-ului genomic pot fi endogeni si/sau exogeni. a) Factorii endogeni - intracelulari. La nivel intracelular pot avea loc o serie de procese care favorizeaza producerea leziunilor in structura ADN-ului genomic. Acestea sunt: pierderea unei baze purinice sau pirimidinice, urmarea hidrolizei legaturilor glicozidice; 86

trans form area adeninei in hipoxantina, care modiflca raportul de complementaritate. In urma dezaminarii adeninei, hipozantina ce rezulta va complementariza cu guanina; radicalii de oxigen rezultati in concentratii crescute pot interfera distructiv (mutagen) ADN-ul; prin procese de metilare a bazelor azotate cu modificarea complementaritatii. b) Factorii exogeni ce produc leziuni in ADN. Factorii exogeni, potentiali mutageni, cu actiune distructiva a structurii si functiei ADN-ului sunt: factori fizici (radiatii ionizante, ultraviolete); factori chimici; factori medicamentosa factori biologici. Catalogul acestor factori mutageni este impresionant valoric si mult diversificat (vezi cap. mutatii).

7.6.1.Mecanisme de reparare a erorilor in structura ADN

In prezent s-a demonstrat ca in genomul celular au loc procese reparatorii, care asigura integritatea structurala si functia ADN-ului. In procesele de reparare si realizarea integritatii ADN-ului celular sunt implicate complexe enzimatice in mecanismele desfasurate in genomul eucariotelor. a) Complexe enzimatice ce intervin in repararea erorilor ADN.

Endonucleazele Actioneaza asupra situsurilor apurinice/apirimidinice dupa excizia bazelor, excizie indusa de ADNglicozidaze , sau prin incorporarea eronata a bazelor in structura ADN-ului genomic. Unele endonucleaze isi intensifica activitatea de reparare dupa iradierea genomului cu UV (ultraviolete). Prin iradierea cu UV unele endonucleaze excizeaza dimerii pirimidinici care se formeaza pe cateneie ADN-ului. Acest grup de endonucleaze este denumit UV-endonucleaze. ADN-polimerazele - Sunt implicate catalitic in repararea exciziilor din cateneie ADN-ului care prezinta terminatii 3'-OH.

87

ADN-ligazele - Sunt enzime care cupleaza doua catene din structura moleculei ADN prin formarea de legaturi difosforice intre hidroxilii3'-OHsi5'-OH. Topoizomerazele I si II - care pot sectiona una sau ambele catene ale ADN-ului unde s-au produs erori in molecula. b) Mecanismele de reparare a erorilor din ADN la eucariote

Spre deosebire de procariote, la care mecanismele de corectare a erorilor din ADN-ul genomic sunt bine studiate, la eucariote, datorita complexitatii genomului (numar mare de cromozomi, numar mare molecule ADN, etc.) mecanismele nu sunt complet elucidate si cunoscute. Erorile pot rezulta prin cuplarea incorecta intre purine/pirimidine. In timpul replicarii semiconservative cuplarea complementara intre nucleotide nu este respectata" datorita interferentei distructive a unor factori ambientali agresivi". Erorile se produc in urmatoarele situatii: cand incepe despiralizarea si separarea catenelor, este posibila fisura pe una sau ambele monocatene; nerespectarea principiului complementaritatii intre purine si I pirimidine (normal A-T si G-C) a nucleotidelor care se esterifica pe catena I de novo" in raport cu catena matrita". Se pot forma dimerii", cupluri I nucleotidice false (necomplementare); cand asupra nucleului, ADN in replicare, actioneaza factori potential mutageni, inducand suprimare de nucleotide, substitutie sau insertie de baze in catena matrita sau in cea de novo"; formele tautomere ale bazelor azotate, sau ionizarea lor, modifica I raportul de complementaritate cu formarea de dimeri si erori in structura I ADN. Sunt cercetatori care mentioneaza ca sunt posibile erori, dar in I procente foarte mici, datorita cuplarii gresite (eronate) intre purine si I pirimidine. Dupa Covic si Stefanescu (2004), conform reactiilor | stoichiometrice , greselile de necomplementaritate intre nucleotidele de pe catena matrita" si cele esterificate pe catena de novo" se pot produce in raport de 1/10000.
5

Stoichiometria (gr. Stoikheion = element + metron = masura). Chimia fizica ce studiaza raporturile cantitative intre elemente in combinatii sau in reactii chimice.
88

In genomul celulelor eucariote (sau procariote) sunt sisteme care I identifica eroarea lezionala sau insertionala din ADN, iar pe cale enzimatica pot fi corectate (fig.25 si fig.26). Repararea poate fi realizata prin mecanisme enzimatice implicate in I urmatoarele procese: fotoreactivarea enzimatica, repararea prin excizie, I repararea postreplicare, sau repararea prin alchilare sub actiunea metil transferazei (Anca-Michaela Israil, 2000). Ca mecanisme la eucariote mai consemnam: Mecanismul BER (Base Excision Repair) - Cand ADN -polimerazele nu catalizeaza incorporarea gresita intre bazele azotate pe | catena nou sintetizata, producand distorsiuni in dublul helix al ADN. Capacitatea de autocorectie a ADN-polimerazelor care asigura I complementaritatea corecta intre cuplurile nucleotidice in timpul sintezei fc)N-

ului.
4

Rata de corectare a erorilor in timpul replicarii ADN-ului este de 110' -lO"6 prin mecanismul BER si de peste 1000 de ori prin capacitatea ADN-polimerazelor de autocorectare a erorilor din ADN (Covic si Stefanescu, 2004). La om sunt identifiacate complexe genice care codifica sinteza proteinelor MSH2, MSH3 si GTBP. Aceste proteine pot recunoaste erorile de imperechere, iar cuplul MSH2 / MSH3 are capacitatea de a identifica insertiile si deletiile punctiforme ce survin in structura ADN. Restitutia moleculei ADN lezata poate fi: completa, fiind identica cu structura initiala a moleculei ADN; restitutie partiala a moleculei; reparatie nerezolvata, molecula ADN necorectata va fi prezenta in genom ca molecula mutanta. Prin lipsa capacitatii de reparare a leziunilor" apar disfunctii" severe in organism. De exemplu, indivizii care prin mutatie isi pierd capacitatea de reparare a ADN-ului la actiunea UV, prezinta maladia cunoscuta sub denumirea Xerodermie pigmentara".

89

u.v. i i i i i i i i i i i i
i i i i i i

i i i ] i i i
i i i i i i i

ii
II

i i i i i i i i
i i i i

**>
i i i i i i i i i i i i i i
i i i i i i i

/s y
i i i i i i i i i i i i i i
i i i i i i i

i i i i i ii i i i i i ii
i i i i i ii

Fig.25 Schema generala de reparare a ADN: 1 leziunea produsa de UV; 2formarea dimer-timinei; 3ruperea catenei de catre ADN - endonucleaze si ADN-glicozidaze; 4incepe corectarea leziunii catenei de novo", de ADN-polimeraze si I ADN-ligaze; 5excizia completa a regiunii lezate de UV de catre topoizomerazele I I sill; 6cuplarea si completarea sectiunii lezate si refacerea ADN-ului.

90

-**"!"'

I T G ' A C

1T C 1| T G 1C 1 1A 11 |
1

|
G C

| |
C G
A

11

11
"f A G C T A

C G

1iradiere UV 1 1
A T A T dimer timinic G C C G A C G G C

C G

fotoliaza' (pozitionare)

absorb tie onerqie UV

' I
Id)

T # T

I
*

C A G T

J___I_ _I___I_ _L _ _
eliberarea enzimei

G C

T A

C A T G T A

1 G A C

C G

C G

C G

A T

26 Etape in repararea erorilor moleculei de ADN

91

CAPITOLUL III

ANATOMIA GENOMULUI UMAN CROMOZOMII

La organismele eucariote si om, cea mai mare cantitate de ADN este localizata in nucleu in formatiuni pe care Weldever (1883) le-a denumit cromozomi. Prin definitie, cromozomii sunt elemente cu aspect filamentos de natura nucleo-proteica, prezenti permanent in nucleul celulei. Individualizarea si analiza cromozomilor este posibila in fazele ciclului mitotic sau meiotic, in special in metafaza mitotitca, precum si studiul lor la microscopul electronic. In interfaza ciclului celular la eucariote, cromozomii sunt condensati formand asa numita cromatina nucleara, ca in mitoza sa prezinte aspectul filamentos hipercondensati. Cromozomii sunt elemente dinamice si constante, a caror functie si activitate genetica sunt esentiale pentru viata celulei, pentru viata organismului. Cromozomii se gasesc la toate organismele eucariote, si unele procariote, la care numarul, forma, talia sunt trasaturi caracteristice fiecarei specii.

92

1. Etape in analiza genomului uman

Geneticianul francez Dutrillaux (1976) considera parcurgerea a trei etape principale in analiza si studiul genomului uman si anume: - etapa socului hipotonic - etapa trizomiilor - etapa bandarii cromozomilor Totusi o etapa istorica in studiul aparatului genetic la om este Proiectul Genomului Uman" care, primele rezultate obtinute de geneticieni, au fost publicate in anul 2000. Pana in 1956, genetica era abordata conceptual, fiind consemnate si unele cercetari experimentale de certa valoare stiintifica cum sunt experientele lui Gr. Mendel (1865) facute pe Pissum sativum (mazare), iar Th. Morgan (1903-1911) pe Drosophila melanogaster (musculita de otet). Rezultatele lor sunt deosebit de valoroase pentru fundamentarea stiintifica a geneticii. De exemplu Mendel a formulat legile segregarii si transmiterii caracterlor ereditare, legi care au caracter universal in lumea vie a organismelor cu reproducere sexuata, iar Morgan a elaborat teoria cromozomiala a ereditatii. Dar, datorita dezvoltarii tehnicilor si metodelor cu aplicabilitate de studiu in genetica umana (in mod deosebit) a inceput cercetarea diversificata si aprofundata asupra genomului uman. De exemplu, cercetatorul Hsu (1956), introducand socul hipotonic asupra celulelor mitotice, a reusit pentru prima data, sa stabileasca numarul corect de cromozomi in celulele somatice la om. Aceasta descoperite a fost considerata atat de importanta incat atomistul Hanschka (1961) a declarat Homo sapiens a cunoscut nucleul atomic inainte de a cunoaste numarul cromozomilor din celulele propriului corp". Cu ajutorul acestei metode s-a efectuat studiul analitic al cromozomilor umani la subiectii normali sau cu diverse sindroame genetice. De exemplu intre 1956 - 1970 s-a studiat morfologia cromozomilor, originea cromozomilor - materni si paterni (Ford si Hamerton 1956), iar in 1959 Legeune, Gauthie si Turpin au stabilit ca etiologie a sindromului Down, prezenta unui cromozom acrocentric 21, in plus (cariotipul: 47,XX + 21 sau 47,XY + 21).

93

A urmat apoi identificarea modificarii numarului de cromozomi, ca etiologie genetica in sindroamele: Turner, Patau, Eduards, Klinefelter, superfemele, etc. Etapa trizomiilor. O data memorabila este anul 1970 cand incepe o noua etapa in analiza si studiul genomului uman. Este etapa bandarii cromozomilor,, Prin bandarea cromozomilor se identifica omologia corecta a cromozomilor, precum si eventualele modificari, in structura cromatidelor cromozomale, care, cu microscopul optic si metoda Hsu nu puteau fi identificate. Incepand din anul 1980 pana in prezent analiza cromozomilor umani se extinde asupra infrastructurii si secventializarii nucelotidelor din genomul uman. Aceste studii deschid noi orizonturi de analiza teoretice dar mai ales cu aplicabilitate in patologia umana. Este etapa Proiectul Genomului Uman".

2. Numarul cromozomilor la om
Primele enuntari legate de genomul uman apartin lui Fleming (1882) care introduce notiunea de ,,crornatina'', considerand cromozomii segmente colorabile ale nucleului. Dupa ce Waldeyer introduce notiunea cromozom" a urmat incercari nereusite de a stabili numarul cromozomilor la om. De exemplu, Hansemann (1897), considera ca celula somatica la om ar avea intre 16 si 36 cromozomi, iar Winiwater (1912) lanseaza ipoteza ca barbatii ar avea 47 cromozomi (47, X) in celula somatica iar femeia 48 cromozomi (48, XX). In 1920, H.Winkler introduce notiunea de genom". Dupa el, genomul este setul haploid de cromozomi din celula gametica. In prezent, prin genom se considera setul complet de gene particulare fiecarei specii. Anul 1956 este important deoarece s-a stabilit numarul corect al cromozomilor in celula somatica: 2n = 46 cromozomi. Studiile citogenetice comparate la diverse specii eucariote au evidentiat variatii numerice in limite foarte largi (Tabel III).

94

Tabel III. Numarul cromozomilor la unele specii de eucariote Specia Homo sapiens (om) Macaca mulata (maimuta Rhesus) Pan troglodytes (cimpanzeu) Bos taurus (bovine) Canis familiaris (cainele) Felis domestica (pisica) Eqvus cabalus (cal) Mus musculus (soarece) Raltus norvegiens (sobolan) Cyprinus carpio (crap) Drosophila melanogaster Musca domestica Ascaris megalocaphala univaleus Numar diploid de 46 V , 42 ^ 48 60 78 V 38 ^ 64 V 40 V 42 V 104 \/
8 v

12 2 V

Din exemplele din tabel observam ca numarul cromozomilor in celulele somatice nu respecta gradul evolutiei bio-genetice si complexitatea structurala si functionala a speciilor. In consecinta numarul cromozomilor nu este criteriu taxonomic sa stabilim evolutia si pozitia filogenetica a speciilor. De exemplu la vertebtrate sunt specii inferioare filogenetic" cum este Cyprinus carpio cu 104 cromozomi, in timp ce omul are 46. Speciile cu reproducere sexuata poseda doua tipuri de celule, diferite prin numarul de cromozomi: celulele sexuale (gametii) au un set simplu de cromozomi - denumit set haploid sau garnitura gametica, notat cu n"; celulele somatice cu numar dublu de cromozomi, garnitura diploida, notata cu 2n". In nucleul celulei somatice diploide, fiecare cromozom este dublu reprezentat, unul de origine materna, adus de ovul, al doilea patern, adus de spermatozoid. Ei alcatuiesc perechea de cromozomi omologi, deoarece au aceeasi dimensiune, aceeasi morfologie si aceeasi valoare genetica. Cum numarul diploid se realizeaza in procesul de fecundatie, rezultand zigotul, el poate fi numit si garnitura zigotica. Omul este specie somatica diploida, cu gameti haploizi6. Numarul cromozomilor din setul haploid gametic este de 23 (n - 23). Celula Scurtarea fazei haploide in favoarea celei diploide este caracteristica organismelor eucariote superioare
95

somatica diploida contine 46 cromozomi (2n = 46), respectiv 23 perechi de cromozomi, respectiv suma a doua seturi haploide. Dupa functia genetica in celule exista doua grupe de cromozomi: autozomi (somatici) si heterocromozomi sau gonozomi. Heterocromozomii sunt numiti si cromozomi sexuali deoarece determina sexul genetic al individului. De exemplu, in celula somatica diploida sunt 44 autozomi, dispusi in 22 perechi de cromozomi omologi, doi cate doi. Dar in celula somatica exista si doi cromozomi sexuali, care, raportati la cele doua sexe nu prezinta omologie morfo-structurala si functionala, si anume: la femeie avem doi cromozomi X (XX), la barbat un X si un Y (XY). La om, specie cu reproducere sexuata, dupa pubertatea ontogenetica, gasim un tip de celule care difera de celulele somatice, prin numarul cromozomilor. Sunt celulele sexuale (gametii) la care numarul cromozomilor este redus la jumatate, fata de celulele somatice. La om celulele sexuale au 23 de cromozomi: 22 autozomi si un cromozom sexual, care, in functie de sex poate fi X sau Y. Cum la femeie intre ovulele ce pot fi elaborate prin ovogeneza nu exista diferente genetice, prezentand aceeasi formula cromozomiala - 23 X, inseamna ca ea va elabora acelasi tip de ovula. Deci femeia este homogametica. La barbat, dataorita neomologiei cromozomilor sexuali (XY), in spermatogeneza se vor repartiza cromozomul X intr-un garnet, iar Y in altul. Ca urmare, barbatul elaboreaza doua tipuri de gameti care se deosebesc prin tipul de cromozom sexual prezent, X sau Y. Deaceea barbatul este considerat heterogametic. Prin fuzionarea a doua celule haploide gametice se obtine zigotul, celula diploida din care se va dezvolta viitorul organism uman. La om, ca la toate speciile cu reproducere sexuala, ontogenetic este parcursa alternanta intre celulele somatice diploide ca numar de cromozomi (diplofaza) si celulele gametice haploide (haplofaza) (fig. 27).

96

"

6,XY^-^ 46.XX Ovul fecundat (zigot) (2N) Spermatozoid (N) Ovul (N) -

Diplofaz a

^ Ovogonie Spermatogonie "" ^ f(2N) (2N Haplofaza

Fig. 27 Alternanta genomului la om: diplofaza - haplofaza

Sunt cazuri cand starea fiziologica a organismului sau influenta unor factori agresivi externi, pot influenta ciclul celular (meioza sau mitoza), modificand numarul cromozomilor. Prin aceste modificari apar celule aneuploide (vezi mutatiile). Sunt deviatii de la numarul cromozomilor in celula somatica sau gametica. In cazul cand in organism exista o populatie celulara aneuploida, numeric crescuta, se indue dereglari in morfologia, anatomia si functia orgnanismului, a caror etiologie clinica se incadreaza in grupul sindroamelor genetice". Aneuploidia apare foarte rar la subiectii normali fiziologic. De exemplu C. Brown (1966) a constatat la unele persoane normale, dar inaintate in varsta, existenta unor celule la care lipseste un cromozom. El a gasit un procent de aproximativ 7% limfocite, cu 45 cromozomi (monozomie) la unele femei care au depasit varsta de 60 ani. Cromozomul 97

absent probabil, fund cromozomul X. La barbatii peste 60 de ani, unii aveau in sangele periferic 1-2% limfocite cu 45 cromozomi, absent fiind probabil cromozomul Y. Deci aneuploidie prin pierderea unui cromozom.

3. Dimensiunea genomului uman

Desi structura fizica a nuceleelor celulelor la eucariote este similara pentru toate speciile, sunt consemnate diferente de lungime, de dimensiune a genomului. De exemplu, la eucariotele inferioare genomul poate avea o lungime de aproximativ 10 Mb, in timp ce la eucariotele superioare lungimea genomului depaseste 100 000 Mb . Deasemenea apar diferente de dimensiune si lungime a genomului intre procariote si eucariote. Unii geneticieni considera ca lungimea genomului este concordanta cu complexitatea structurala a speciilor analizate (tabel IV) . Tabel IV Exemple de dimensiune a genomului la diverse specii de organisme (publicate si analizate in cadrul proiectului de secventializare)
Specia Lungimea genomului in Mb 3200 3300 180 97 12,1 4,64 4,41 2,16 16000 120000 Autorii

Homo sapiens Mus musculus (soarece) Drosophila melanogaster Nematode Saccharomyces cerevisiae Escherichia coli K12 Mycobacterium tuberculosis Streptococcus pneumoniae Triticum aestivum Fritillaria assyriaca

Venter si col. (2001); HGSC (2001) -//Adams si col. (2000) CESC(1998) Goffean si col. (1996) Blattnersicol. (1997) Cole si col. (1998) Tettelin si col. (2001) -//-//-

Lungimea genomului este in concordanta cu complexitatea structurala o organismelor (vezi tabelul). Astfel la ciuperci dimensiunea
98

genomului este foarte redusa (12,1 Mb) in timp ce la vertebratele superioare poate ajunge pana la 3200 Mb (la om) si 3300 Mb (la soarece). Iar la unele I specii de plante dimensiunea genomului este impresionanta de 16 000 si chiar 120 000 (la exemplele din tabel). Dimensiunile foarte crescute la vertebratele superioare sunt legate de numarul genelor din genom, care la om este de aproximativ 30 000 - 40 000 gene informational active. Marea variatie a dimensiunii genomului la eucariotele superioare, este legata si de numarul secventelor repetitive care variaza de la 106 pentru ADN inalt repetitiv pana la 103-10 pentru ADN-ul moderat repetitiv, fata de cateva zeci de mii de copii pentru ADN cu secvente unice". Legat de paradoxul valorii C, s-a crezut mult timp ca exista o corelatie intre complexitatea structural-morfologica si functionala a organismelor si dimensiunea genomului nuclear la eucariote. Daca la eucariotele inferioare este o cantitate foarte mica de ADN in I genomul nuclear, in raport cu existentul in genomul eucariotelor superioare I (vertebrate) explicatia ar fi urmatoarea : la eucariotele inferioare genele I functionale sunt mai grupate si au mai putin ADN repetitiv in timp ce la vertebratele superioare este o accentuata dispersare a genelor functionale in genom, distantate de secventele repetitive din genom. Dar moleculele ADN sunt in strctura si functia cromozomilor. In Iconsecinta lungimea totala a genomului nuclear, o gasim repartizata pe segmente" moleculare in cromozomi. Ca urmare in functie de cantitatea ADN prezenta in fiecare cromozom din totalul genomului nuclear, cromozomii pot avea dimensiuni variabile. Deasemenea dimensiunea cromozomilor este conditionata si de prezenta (variabila cantitativ) moleculelor de ADN, repetitiv si nerepetitiv, precum si in raport de functia exercitata de celula in organism. In aceste conditii putem admite ca la eucariote putem face o clasificare a cromozomilor dupa dimensiune (talie, grosime) in raport cu genomul diferitelor specii eucariote. De exemplu la eucariote putem observa urmatoarele dimensiune ale cromozomilor: - cromozomi mici, intalniti la unele nevertebrati inferioare, la reptile, la pasari; - cromozomi mari, intalniti la vertebratele superioare si om; - cromozomi uriasi sau politeni, prezenti in glandele salivare la diptere (insecte). In raport cu factorii implicati, lungimea si grosimea cromozomilor variaza in limite foarte largi. 99

De exemplu, la om lungimea (talia) cromozomilor variaza intre 1,5 10 /I, iar diametrul (grosimea) intre 0,2 - 2 /x . Dar lungimea si grosimea cromozomilor variaza si in raport cu fazele ciclului celular. Daca in interfaza ciclului celular, cromozomii dispusi in tandem (sinapsis) sunt sub forma de filamente foarte fine si lungi (grosimea putand varia intre 35-100 A) formand cromatina nucleara, in ciclul mitotic ei se individualizeaza si sunt usor de analizat. In ciclul mitotic incepe spiralizarea si hipercontractia (hipercondensarea) fibrilei de ADN din cromozomi (hiper - hiper -spiralizarea - polisolenoidica, a polibuclei, forma si condensarea fibrilei de nuceloproteina). Prin procesele de hiper-spiralizare si condensare (contractia cromatidelor) cromozomii se vor scurta considerabil ca talie. De exemplu, Onuki (1968) si Ruzicka (1973) analizand cromozomii la microscopul electronic au observat ca intr-o faza amitotica, progresiv, filamentul de ADN se hiperspiralizeaza si condenseaza (contractia fibrilei). Aceste procese observate sunt maxime in metafaza mitotica. Prin aceste procese, grosimea creste, urmata de reducerea taliei cromozomilor. Talia sau lungimea cromozomilor poate fi apreciata cu ajutorul urmatoarei relatii: L=
P + q

Y.22A + X
L = lungimea relativa a cromozomului. p+q = lungimea totala a cromozomului ( p este bratul scurt, q este bratul lung al cromozomului); E = este suma lungimii a 22 autozomi + cromozomi sexual X (lungimea cromozomilor dintr-un set haploid). Se apreciaza ca prin hiperspiralizare si condensarea fibrilei de ADN, talia cromozomilor s-ar reduce (aproximativ) de 20 ori, in raport cu extensia posibila a fibrilei. Dar lungimea si grosimea cromozomilor, pot fi modificate ireversibil atunci cand asupra celulei actioneaza unele medicamente (ex. citostatice ), unele noxe chimice sau agenti fizici. De exemplu, daca ciclul mitotic se deruleaza la temperatura ridicata sau in prezenta colchicinei, cromozomii se scurteaza si se ingroasa 100

considerabil. In schimb prezenta unor compusi alchilanti indue o ireversibila despiralizare si decontractare a cromozomilor.

4. Morfologia cromozomilor
Prin analiza cromozomilor in metafaza ciclului mitotic la microscopul optic, se pot observa unele particularitati legate de morfologia cromozomilor, datorita procesului de hiperspiralizare si condensare in aceasta faza. Elementele legate de morfologia cromozomilor sunt urmatoarele (fig.28) 101

c.s. cm

c.s.

Fig.28 Morfologia generala a cromozomilor a)- Cromatidele (fig.28)

Intr-un ciclu celular cromozomii parcurg doua etape distincte morfologic: etapa de cromozom monocromatidic si cea de cromozom dicromatidic. Etapa de cromozom monocromatidic o parcurge anafaza si telofaza ciclului mitotic precum si in stadiul Gi interfazic.

102

Etapa de cromozomi dicromatidici - Stadiul de cromozom dicromatidic il gasim in stadiul G2, interfazic, precum si in profaza si metafaza mitotica. O referire speciala este pentru stadiul S-interfazic. In stadiul S are loc replicarea semiconservativa a fibrilei de ADN din cromozomul monocromatidic. Prin replicare se dubleaza cantitatea de ADN. Progresiv, pe masura ce fibrila de ADN se replica semiconservativ, fibrilele rezultate se vor separa, rezultand doua cromatide identice sau surori. Cele doua cromatide se mentin cuplate pana la sfarsitul metafazei, in punctul numit centromer. La sfarsitul metafazei are loc clivajul ecuational la nivelul centromerului avand ca rezultat separarea celor doua cromatide. Din momentul separarii fiecare cromatida devine cromozom monocromatidic (fig.29) pentru urmatorul ciclu celular.

,Gj_______SjJ_______, PROFAZA METAFAZA ANAFAZA_______TELOFAZ.A INTERFAZA MITOZA INTERFAZA

Fig.29 Alternanta mono - si dicromatidica a cromozomilor intr-un ciclu celular. In anafaza, fiecare cromatida separata prin clivajul centromerului (cromatidele dupa separare devin cromozomi monocromatidici) se va deplasa spre unul din polii celulei in mitoza, sau in anafaza meiozei secundare. Prin aceasta repartitie a cromatidelor surori la cei doi poli ai celulei in diviziune (a cromozomilor monocromatidici) se asigura repartitia identica" a materialului genetic in celulele fiice rezultate.

103

b)- Centromerul - ultrastrucutra Centromerul, numit si constrictie primara este zona unde cele doua cromatide surori, rezultate prin replicare semiconservativa, raman unite pana la sfarsitul metafazei mitotice si in metafaza secundara meiotica. Centromerul este o particularitate morfologica constant prezenta la nivelul fiecarui cromozom, mentinandu-si pozitia la nivelul cromatidelor. La cromozomii umani, centromerul apare ca o conexiune punctiforma, deoarece cromatidele in acea zona de cuplare au o grosime foarte mica. Datorita acestui aspect, i s-a atribuit si denumirea de constrictie primara. Imaginea electronomicroscopica arata ca centromerul, la cromozomii umani ca la toate eucariotele superioare, este alcatuit din trei domenii: domeniul central, domeniul de imperechere si kinetocorul, domenii care au fost descrise de Politi si colaboratorii (2002). Bogat in heterocromatina, centromerul este un complex de proteine si ADN repetitiv, neinformational si netranscriptibil. Miezul centromerului format din ADN alfa satelit, datorita variatiei numarului de cupluri nucleotidice in secventele repetitive (variaza intre 5 pana la 171 pb), prezinta un accentuat polimorfism. Polimorfismul centromerului poate fi observat prin variatiile cantitative ale heterocromatinei centromerice constitutive. ADN-ul alfa satelit, asociinduse cu proteinele centromerice (ex: CENP-A, CENP-C, CENP-I) este implicat in organizarea centromerului (proteinele centromerice identificate sunt: CENP-A, B, C, D, E, F, G, H si I). ADN centromeric, asociat cu proteina CENP-A(proteina omoloaga histonei H3) se replica la mijlocul stadiului S interfazic. Aceasta asociere este prima etapa in determinarea morfologica a centromerului. Ross (1977) si Clophan (1978) au stabilit ca centromerul cromozomilor are o structura complexa. Initial ei au confirmat ca la nivelul centromerului apar doua formatiuni cu aspect granular pe care le-au denumit cu kinetocor, formatiuni care se dispun simetric axului longitudinal al cromozomilor, cu ajutorul carora se cupleaza de fusul mitotic. Kinetocorii sunt domenii distincte si tranzitorii din structura centromerului. Formandu-se la sfarsitul profazei sunt activi in metafaza si anafaza, ca in telofaza sa aiba parte o dezansamblare. In 1999 Van Hooser si col., examinand kinetocorii la microscopul electronic, observa ca au structura trilaminata si anume: stratul extern dens a carei coroana este vizibila numai cand kinetocorul nu este atasat de microtubuli; 104

stratul intermedial" luminos ingust si clar, care separa stratul extern de stratul intern; stratul intern dens, care se continua cu heterocromatina comisurala, prin care cromatidele sunt cuplate pana la clivajul ecuational al cromozomilor. In stratul extern sunt incluse proteinele motorii CENP-E precum si proteinele punctului de control al fusului mitotic de tipul Madl, 2, Bubl, 3 etc. Kinetocorii indeplinesc trei functii: se ataseaza de captetele microtubulilor fusului de diviziune; genereaza forte pentru deplarasarea cromozomilor deveniti prin clivaj monocromatidici; de a nu incepe anafaza pana cand toti cromozomii sunt toti atasati fusului de diviziune. Prin pozitia centromerului in cromozom, cromatidele sunt subdivizate in doua brate, care pot fi egale sau inegale ca lungime. Conventional, bratui scurt, numit si brat proximal se noteaza cu p" si bratui lung sau distal notat cu q". Pentru a stabili corect pozitia centromerului si diferenta de lungime intre bratele p" si q", se folosesc urmatorii indici de calcul si exprimare: indicele centromeric (i.e.) =----------= lugimea bratului scurt x 100 / p+q lungimea totala a cromozomului; diferenta de lungime intre brate (d) = q-p raportul intre brate (r) = . P Vezi tabelele V si VI. Prin pozitia centromerelor si diferentelor de lungime intre brate, in genomul uman se identifica trei tipuri morfologice de cromozomi: (fig.30). cromozomi metacentrici, care au centromerul in pozitie centrala, iar bratele p" si q" aproape egale (p ~ q ); cromozomi submetacentrici. Au centromerul pozitionat spre extremitatea cromatidelor, iar bratele sunt inegale ca lungime. De exemplu bratui p" reprezinta ca lungime aproximativ 1/3 din lungimea totala a cromozomului, iar bratui q" 2/3; cromozomi acrocentrici. Sunt cromozomii care au bratui p" foarte scurt (de aproximativ 2-3/10 din lungimea cromozomului), iar bratui q" lung (aproximativ 7-8/10 din lungimea cromozomului). La cromozomii

105

acrocentric! putem terminala.

considera ca centromerul este in pozitie aproape

METACENTRIC

SUBMETACENTRIC

ACROCENTRIC SATEUT PUNTE CROMATICA

CENTROMER

18 17

21

22

Fig. 30 Tipuri morfologice de cromozomi umani Tabel V. Clasificarea tipurilor de cromozomi dupa lungime si pozitia centromerelor. Lungimea cromozomil or Mari Mijlocii Mici Pozitia centromerului Metacentrici Submetacentri Acrocentric! A1;3 E B 2,4-5 -II16 F C6-12.X D 13-15 19-20 E 17-18 G21 -22,Y

Tabel VI. Valoarea indicelui centromeric ( i.e.) la tipul morfologic de cromozomi. Tipul de Metacentric Submetacentric Acrocentric Valoarea I.e. 46-49 26-45 17-30

b) - Constrictiile secundare Sunt cromozomi care au constrictii si in alte zone ale bratelor cromatidice. Deoarece este o pozitie aleatorie, nu toti cromozomii le prezinta si nu intotdeauna sunt observabile, au fost numite constrictii secundare. La unii cromozomi (1, 9 si 16) pozitia constrictiei secundare este constatnta in generatiile celulare care succed. Prin pozitia constanta

106

constrictia secundara este o particularitate morfologica de a indentifica un cromozom, precum si omologul sau. Ca zone de decondensare a fibrilei de nucleoproteina, constrictiile secundare pot fi identificate si cu ajutorul microscopului optic la cromozomii 1, 9 si 16, la care pozitia este pe bratele "q", in apropierea centromerului. Uneori apare constrictie secundara in zona mediana a bratului "q" a cromozomului sexual y, precum si pe bratele "p" la cromozomii acrocentrici. Daca pozitia constrictiei secundare poate fi constanta pentru unii cromozomi, in schimb zona de extindere pe cromatida este variabila: spatial redusa sau extinsa. 0 observatie interesanta a fost facuta de Sasaki si Makino (1963) care, cultivand celulele timp de sase ore pe un mediu de cultura lipsit de calciu, a constatat accentuarea constrictiei secundare la bratele "q" a cromozomilor 1, 9 si 16. Conform observatiei facute de ei, se pare ca ionul calciu, ar fi implicat in gradul de nespiralizare a fibrilei de nucleoproteina in zona constrictiilor (nespiralizare prin lipsa calciului). Mai tarziu Dutrillaux (1971) a consemnat ca gradul de extindere spatiala a constrictiei secundare pe bratul "q" al cromozomului 9 variaza in limite foarte largi: de la 1 la 5 unitati. El a stabilit ca aceste variatii dimensionale sunt caracteristici individuale. In 1972, Gagne si Laberge au emis ipoteza ca variatiile de extindere spatiala a constrictiei secundare ar fi determinate de prezenta unui situs fragil, unde este ADN repetitiv. Lubb si Ruddle (1971) au identificat o constrictie secundara pe bratul "p" la cromozomul 9 uman, constrictie, ca localizare, frecvent prezenta la populatia negroida din SUA. Datorita polimorfismului de dimensiune, constrictia secundara poate servi ca marker morfologic pentru identificarea indivizilor, cu valoare antropologica, dar si ca marker pentru cartografierea cromozomilor. De exemplu, constrictia secundara de pe bratul "q" al cromozomului 1 a servit ca marker pentru a stabili locusul genei pentru sistemul eritrocitar genetic Duffy, iar colectivul de geneticieni de la facultatea de Medicina din Craiova, condus de profesorul Chita a constatat la pacientii cu handicap psihoneurologic (deficienta mentala), o extensie spatiala a constrictiei secundare pe bratul "q" la la cromozomul 9. Deci locusul genei pentru dezvoltarea psiho-neurologica ar fi in zona limitrofa constrictiei secundare pe bratul "q" cromozom 9. Prin extensie respectiva sau respectivele gene au fost "represate". 107

Dutrillaux (1972) considera ca fragilitatea constrictiilor secundare ar fi responsabila de unele translocatii intercromozomiale cum ar fi translocatia reciproca intre cromoxomul X si banda 1 q 31. d) Satelitii cromozomiali sunt mase mici de cromatina localizate la extremitatea terminala a bratelor "p" (scurte), la cromozomii acrocentrici, separati de centromer prin prezenta unei constrictii secundare accentuate. Cu aspect corpuscular, sunt intens si uniform colorati cu colorantii specifici. La om, satelitii sunt observati la nivelul cromozomilor acrocentrici din grupa D (cromozomii 13 - 15) si grupa G (cromozomii 21 si 22). Toate cele cinci perechi de acrocentrici pot avea sateliti, dar numarul cromozomilor satelizati dintr-o anumita celula este variabil si nu depaseste, de regula cifra 9 (Fergusson Smith si Handmarker 1963). Mai rar, apare formatiune satelitica si pe cromozomul 17. Pe cromozomul y (acrocentric) nu apar sateliti. Dimensiunea variabila si aditia diferentiata a colorantilor bazici specifici asigura un polimorfism accentuat al cromozomilor, iar filamentele de cuplare la cromozom, prin grosime si lungime, prezinta o mare diversitate. Aceste elemente servesc drept criterii de comparatie intre indivizi, de a identifica un individ (in raport de tipul constitutional genetic) de a stabili (in anumite limite) filiatia genetica. Uneori se observa sateliti divizati in doua portiuni de cromatida datorita prezentei a doua constrictii secundare la distante mici, pe bratul "p" al acrocentricilor. Filamentele de cuplare ale satelitilor de cromozom sunt de natura hetero cromatina constitutiva. Frecvent in timpul mitozei sau meiozei, extremitatile satelitare se asociaza, fenomen denumit asociatie satelitara rezultand translocatiile echilibrate (t. robertsoniene). Luciani si col. (1968) au stabilit ca la nivelul filamentelor satelitice sunt localizate genele, complexul de gene, care codifica sinteza moleculelor de ARNr (ARNR: ARNr 5S si ARNr - 5,8 S) de aceea, acest nivel se asociaza cu denumirea de organizator nucleolar (fig.31). Formatiunile satelitice, desi sunt implicate direct in patologia genetica, pot servi ca marked morfologici pentru elucidarea unor mecanisme ce se produc in ciclul mitotic sau meiotic. Satelitii, datorita polimorfismului accentuat, pot fi folositi ca marked in urmatoarele cazuri: - care cromozom acrocentric supranumerar este corect identificat din grupele D sau G (in sindrom Patau, Down etc.); - care genitor este "responsabil" de non-disjunctie meiotica in trizomiile acrocentricilor; 108

- sa stabilim daca non-disjunctia s-a produs in meioza primara sau secundara. De exemplu daca celula, genetic, este diplosomica (adica avem uncromozom acrocentric in plus, numarul cromozomilor fiind de 24 in loc de 23) iar doi cromozomi acrocentrici au satelitii cu aceleasi particularitati [morfologice si intensitatea de aditie a colorantilor bazici speciflci, nondisjunctia a avut loc in meioza secundara. Daca intre cromozomii acrocentrici nu consemnam identitate, non-disjunctia s-a produs in meioza primara.

Satelit a r<~ Satelit p Sateliti 2 i 3 Satelit 1 21

Satelit (J ADNr Satelit p Sateliti 2 Satelit a

tig. 31 Dispozitia ADN-ului satelit la nivel centromeric si telomeric dupa itrachan (1996), Read. Human Molecular Genetics (1996)

109

i 3

5. Organizatorii nucleolar!

Exista dovezi care confirma ca formarea nucleolilor este dependent! de constrictiile secundare, dintre sateliti si bratul scurt al cromozomilo acrocentrici; in zona de sinteza a ARNr, considerate regiuni organizator nucleolari. Organizatorii nucleolari sunt regiunile cromatidice unde, in mo< exceptional AND-ul este transcris cu constituirea unei structuri nuciean postmitotice - nucleolul. S-a demonstrat ca la nivelul organizatorilor nucleolari sunt situsuril< informationale codante ale ADN pentru sinteza ARNr Marcandu-se preparatele nucleare cu nitrat de argint si examinare la microscopul electronic, s-a putut stabili dimensiunea situsului ADN prii "masurarea" lungimii moleculei de ARNr. In genomul uman organizatorii nucleolari sunt asociati cu satelitii 1 perechile de cromozomi acrocentrici 13, 14, 15, 21 si 22. (fig. 32)

110

Fig. 32 Metafaza cu cromozomi bandati (mitoza in celula umana). Evidentierea organizatorilor nucleolari NORs. Aparent, secventele ADN din regiunea organizatorilor nucleolari sunt constante si stabile in ciclul mitotic, in timp ce in meioza se pot forma noi constelatii genice pentru ARNr, datorita (probabil) crossing-over inegal ce sar produce in profaza primara a meiozei. Daca acceptam aceasta ipoteza, putem explica existenta regiunilor variabile si regiunile invariabile la nivelul ribozomilor. Acest aspect este important daca luam in consideratie ca in aceste regiuni organizatori nucleolari" exista complexe repetitive care ar grupa 200-300 gene si aproximativ 2000 pseudogene, implicate in sinteza ARNr. Clark si Wall (1996) studiind organizatorul nucleolar la cromozomul 21 uman au stabilit ca orientarea genelor componente incepe de la telomer la centromer.

Ill

Deasemenea ei an mai constatat urmatoarele : "filamentul' dintre I satelit si centromer se caracterizeaza printr-un polimorfism accentuat ca I dimensiune. Desi lung filamentul nu s-a putut identifica un crossing-over I inegal la organizatorii nucleolari pe cromozomul 21 (prin analize I citogenetice). Totusi, marcarea organizatorului nucleolar cu nitrat de argint, sau I prin tratarea cu acizi tari se obtin benzile N (de la organizator nucleolar), I punandu-se in evidenta situsurile active si non-active ale organizatorului nucleolar, confirmanduse polimorfismul accentuat al acestei zone cromatidice care se transmite mendelian. Sunt probe care demonstreaza ca prezenta organizatorului nucleolar este esentiala pentru viata si dezvoltarea celulelor. De exemplu L'Heritier (1971) a observat ca deletia completa a organizatorului nucleolar are efect letal asupra celulelor. Filogenetic s-a stabilit ca secventele invariabile ale organizatorilor I nucleolari sunt "conservate" constant, fara a se modifica structura ADN- i ului in respectivele zone, in timp ce secventele variabile sunt particulare fiecarei specii. Datorita specificitatii situsurilor de ADN ale secventelor variabile, se presupune ca in celula n-ar exista doi ribozomi identici prin tipul de ARNr Secventele variabile se modifica cu fiecare generatie celulara datorita crossingover-uk" inegal ce are loc. Deci este o pronuntata labilitate a secventelor variabile. Studiile filogenetice au evidentiat ca primatele inferioare au o singura pereche de cromozomi omologi cu organizatori nucleolari, in timp ce soarecele si urangutanul au in genom opt perechi de cromozomi cu organizatori nucleolar. 112

6. Telomerele
La nivel molecular, telomerele sunt succesiuni receptive terminale ale cromozomilor si extremitatilor liniare ale ADN (Brawn, 2002 , Dubrana sicol.,2002). Telomerele sunt complexe dezoxiribonucleo-proteice. Daca reluam defmitia emisa de Muller, pe baza observatiilor efectuate, telomerele sunt segmente cromatidice terminale a fiecarui cromozom din genom. Telomerele, desi au in componenta lor protenie si secvente repetitive de ADN, nu contin infomatie genetica (Uchiumi, 1998). Secventele repetitive din structura telomerelor pot fi: -telomere cu secvente uniform repetitive; -telomere cu secvente si lungimi variabile; - telomere cu secvente diferit repetitive, distribute neuniform. Ele au capacitatea sa programeze transcriptia, blocand diferitii factori implicati in transcriptie. Dupa Chang si col. (1995) si Griffith si col. (1998) telomerele nu sunt degradate, nu fuzioneaza cu alte capete ADN. Protejeaza cromozomii de distrugere, asigura individualitatea lor pe tot parcursul ciclului celular si protejeaza cromozomii de rearanjamente. Griffith mentioneaza ca telomerele au rol in organizarea tridimensionala a nucleului. Telomerele, ca structuri nucleoproteice la capetele cromozomilor din celula eucariotelor, sunt formate din ADN frecvent repetitiv. Secventele care se gasesc in sute de copii, dispuse in tandem, sunt alcatuite din succesiuni hexanucleotidice TTAGGG. Hexanucleotidul 5' - TTAGGG -3' studiat inca din 1985 de catre Cooke si col. Ei au studiat telomerele la comozomii sexuali X si Y la om, prezinta o mica extensie la capatul 3' terminal al moleculei de ADN in dublu helix din telomer (Tham si Zakian, 2000). Aceasta extensie la capatul 3', bogata in guanina, in anumite conditii se poate asocia in structuri cuaternare 4G. Aceasta extensie 3' masoara la mamifere 150-350 nucleotide si sunt prezente la ambele capete ale cromozomului (Williamson si col. , 1989; Wright si col; 1997; Zhong si col. 1992). Extensia 3' permite enzimei telomerazei sa mentina lungimea telomerelor.

telomer = (gr.) telos= capat; meros= parte 113

Extensia terrninala 3', bogata in guanina (G) urmata de o secventa bogata in citozina (C) poate autocomplementariza, realizand o structura in forma "ac de par" respectiv un palindrom terminal (fig. 33). AATTTTCCG / ________________ TTAAAGGC *. Fig. 33 Structura telomerica ac de par". Strucura palindromului "ac de par" la capatul terminal 3' al ADNului telomeric asigura: - integritatea structural - moleculara a telomerului - individualitatea morfologica a cromozomului. Lungimea repetitiilor hexoanucleotidice din structura teleomerelor din cromozomii umani este de aproximativ 10-15 kpb, apreciata de Kipling si Cooke (1990), folosind tehnica Sounthern Blot TRF (terminal restriction fragments) Tot cu tehnica TRF8 s-a apreciat ca telomerele mai lungi sunt prezente pe cromozomii 1 si 2 (aproximativ 5 681 Mpb) iar cele mai scurte pe cromozomii 21 si 22 (Suda si col. 2002). Dar la nivelul cromozomi lor au fost identificate secvente repetitiv telomerice si in alte zone cromatidice decat cele terminale (Strachan si Read, 1996). De exemplu au fost puse in evidenta astfel de secvente telomerice in jurul centromeruiui, prezenta care confirma mecanisme dinamice in evolutia "filogenetica" a cromozomilor la vertebrate si om. S-a emis ipoteza ca secventele repetitive telomerice din zona centromeruiui reprezinta ADN ancestral, restant dupa fuziunea telomerica a doi cromozomi acrocentrici, fmalizandu-se o singura entitate cromozomala (exemplu fuziunea robertsoniana). Se presupune ca pozitia centromerica a secventelor repetitive telomerice ar fi consecinta reductiei telomerice prin translocatie robertsoniana , cum este cazul celulelor tumorale, sau consecinta erorilor in replicarea si repararea ADNului (ex. Cazul sindromului Bloom). '. . /

ADN

secventa unica"

TRF = telomeric repeat binding factor 114

Sindromul Bloom se caracterizeaza prin dilatarea vaselor mici din dermul fetei (teleangiectazie), o fotosensibilitate cu grave leziuni cutanate, nanism intrauterin, uneori cu evolutie catre hemopatie maligna. Dar secventele repetitive telomerice se cupleaza cu proteine specifice ce asigura stabilitate extremitatilor cromozomale, protejand I ADNul de degradare si fuziune (Wei si Price, 2003). Proteinele associate ADNului telomeric, sunt implicate in mentinerea lungimii telomerelor prin formarea buclei "t" telomerice (vezi palindromul "ac de par"), consemnat de Griffth si col. 1999). Bucla "t" nu permite accesul telomerazei la ADNul telomeric. La nivelul telomerelor cromozomilor umani, Buyon si Cach (1999) au identificat doua clase de proteine specifice care se cupleaza cu secventele repetitive ale ADNului telomeric si anume: -proteine de tip TRF1 si TRF2 care se cupleaza cu ADNul telomeric dublu catenar; - proteine cuplate cu repetitiile secventelor hexonucleotidice 5' -TTAGGG-3' din monocatena 3'. Functiile acestor proteine sunt : TRF1: controleaza lungimea telomerelor, cu rol de reglator negativ de a mentine dimensiunea telomerelor, prin inhibitia telomerazei care ar actiona la capetele cromozomilor; TRF2: mentine structura corecta a telomerelor protejand fuziunea capla-cap a cromozomilor si cu rol de a tranzita celula in diversele stadii ale ciclului celular, dar si cu rol de a mentine configuratia corecta a ADNului din extensia telomerica 3'. In caz ca proteina TFR2 se pierde, dispar cozile G cu posibilitatea fuziunii cromozomilor (Kanoh si col. 2003). La nivelul ADN-ului telomeric gasim si proteine de tipul: Pin 2 cu rol in reglarea mitotica (Kishi si Lu, 2002); PinXi un inhibitor al activitatii telomerazei; TIN 2 (TFR1- interacting nuclear protein 2) cu rol in reglarea lungimii proteinelor; Trankiraza cu rol de a elibera TRF1 endogen de pe telomere. Sunt identificate si alte tipuri de proteine telomerice cum sunt: - proteinele: Ku; - proteinele h Rapl (human represor activator protein 1); - proteinele Patl (protection of telomeres); - proteinele PTOP (Pot interacting protein);

115

6.1. Replicarea si repararea telomerelor

Prin identificarea telomerazei, complex ribonucleoproteic, s-a stabilit ca ADN-ul telomeric se replica printr-un mecanism particular care antreneaza o degradare progresiva a repetitiilor telomerice. Koering si Gilson (1998) considerau ca eroziunea telomerelor controleaza numarul de diviziuni celulare, prin pierderea controlului asupra diviziunii. Prin pierderea de ADN telomeric consecintele ar fi: - o semnificativa instabilitate a cromozomilor; - o modificare a expresiei genelor ce pot preveni modificarile arhitecturii nucleului. Pierderea de ADN telomeric cu fiecare ciclu celular ar putea fi explicata prin incapacitatea ADN-polimerazelor de a replica in intregime capatul 3 al catenei intarziate si indepartarea segmentului ARN amorsa de la capatul 5' al catenei conducatoare (vezi sinteza ADN). Aceasta ipoteza a fost lansata de Dahse si col. (1997) de Cong si Bacchetti (2000). Telomeraza sintetizeaza ADN-ul telomeric pe matrita de ARN primer, amorsa". Implicarea ARN-ului primer si a telomerazei in sinteza telomerelor a fost demonstrata prin metoda clonarii telomerelor la cromozomii eucariotelor. Prin clonare s-a observat ca in telomer are loc o sinteza de novo pe matrita de ADN sintetizat de novo". S-a stabilit ca ARN-ul primer, amorsa, este eel care introduce matrita pentru sinteza secventei repetitive 5'-TTAGGG-3', iar telomeraza activeaza aceasta sinteza. Sunt probe care confirma ca activitatea telomerazei are specificitate de tesut sau de linie celulara. De exemplu, la cromozomii umani din celulele gametice lungimea telomerelor este mai mare decat a telomerelor din cromozomii celulelor somatice. Explicatia ar fi ca in celula gametica numarul secventelor telomerice repetitive este mai mare (ex. in cromozomul y). Reducerea lungimii telomerelor in celulele somatice impune o reducere a activitatii telomerazei, avand ca efect pierderea progresiva de cromatina cromozomala cu fiecare ciclu celular. Ipotetic, acest proces de pierdere de cromatina cromozomala poate fi considerat un mecanism" de programare" si evolutie progresiva a secventei" si moartea celulara. De aceea se presupune ca reducerea si/sau absenta activitatii telomerazei ar fi consecinta pierderii progresive a secventelor de ADN repetitive din telomere, justificand incetarea ciclului mitotic i moartea celulelor. Pe baza acestui rationament, ipotetic, se considera ca imunosenescenta precoce in sindromul Down ar fi cauzata de pierderea 116

progresiva si recesiva a telomerelor. Counter si Herby presupun acelasi mecanism si la subiectii cu senescenta ontogenica. O observatie importanta si de mare perspectiva pentru terapia genetica" este studiul facut pe tumorile ovariene la femei privind prezenta si activitatea telomerazei, mai exact intensitatea activitatii enzimei. Un asemenea studiu facut de Clark si Wali (1996), dar mai ales prin valoarea datelor obtinute, va pune problema prevenirii senescentei si mortii celulare" prin deletii telomerice. Ar fi o masura profilactico-preventiva deoarece in senescenta celulara, dar mai ales in celulele canceroase, activitatea telomerazei este redusa sau chiar absenta. De aceea mentinerea integritatii celulare (integritatea genetica), pentru supravietuirea si prelungirea vietii unei linii celulare normale ar presupune o refacere/reparare a telomerelor in urma fisurilor care au avut loc la acest segment cromozomial. In acest context, telomeraza este foarte eficienta in mentinerea repetitiilor telomerice existente (Biessmann si Mason, 2003), iar Dahlen si col. 2003 considera ca datorita existentei unei relatii stranse intre replicare si complexul telomerazic se mentine lungimea telomerelor si stabilitatea telomerazei, iar o mutatie la nivelul unui component din acest complex afecteaza mentinerea lungimii telomerelor. Ipoteza repararii telomerelor se bazeaza pe unele cercetari facute la nevertebrate. S-a demonstrat ca un cromozom, dupa ce a suportat o fisura telomerica (deletia telomerica), nu se mai scurteaza in urmatoarele cicluri celulare. Acest aspect evidentiaza ca secventa repetitiva care a ramas in telomer, realizeaza prin intermediul ARN-ului matrita (primer) si activitatii telomerazei o crestere a numarului de secvente telomerice repetitive, mentinand cromozomul in stare functionala din punct de vedere genetic si supravietuirea celulelor.

6.2. Efectele secundare determinate de nerepararea telomerelor

In prezent nu s-au semnalat mecanisme active de reparare a telomerelor, dar sunt bine cunoscute efectele secundare induse de microdeletiile telomerice care nu sunt reparate. De exemplu, microdeletiile telomerice prin care se pierde ADN indue o insuficienta" haploida a genomului cu efecte severe asupra produsului de conceptie. Asemenea microdeletii telomerice sunt identificate, ca etiologie genetica, in sindromul Wolf- Hirschom (4p") si sindromul Miller - Dieker (17p"). 117

S-a lansat ipoteza ca in celulele canceroase se produc deletn telomerice ale cromozomilor urmate de translocatii criptice ascunse" ce s-ar stabiliza prin aditionari repetate de telomere provenite, prin deletia, de la alti cromozomi. Un asemenea mecanism se presupune pentru cromozomul 6 uman in melanom. Deasemenea, un alt criteriu etiologic de diagnostic in diversele tipuri de tumori canceroase, este analiza lungimii telomerelor. S-a observat ca in diversele celule tumorale lungimea telomerelor variaza anormal" fata de telomerele cromozomilor din celulele normale. O confirmare a valorii acestui criteriu sunt studiile efectuate pe celulele canceroase din tumorile intracraniene. De exemplu, prin investigarea a 60 de pacienti cu tumori cerebrale s-a constatat ca in 41 din cazuri cromozomii prezentau telomere foarte lungi, fata de normal, in 21,7 cazuri telomerele erau foarte scurte si numai in 36,7 din cazuri telomerele aveau lungimea in limitele normale. Acest studiu a fost facut, luandu-se ca celule de referinta.

6.3. Rolul telomerelor

Telomerele nu contin informatie genetica, dar sunt de importanta deosebita pentru fiecare ciclu celular parcurs de o celula somatica. Ca urmare telomerele au urmatoarele atributii in viata celulei: a - datorita structurii secventelor repetitive de ADN si a palindromului" in ac de par", telomerele asigura integritatea celulelor si stabilizarea - individualitatea fiecarui cromozom; b - se presupune rolul telomerelor initierea cuplarii cromozomilor omologi in zigonemul profazei primare a meiozei reductionale, rezultand bivalentii; c - telomerele ar functiona ca niste terminatii cromatidice inerte" cu rol in prevenirea scurtarii cromozomului la fiecare ciclu mitotic. d - telomerele ar avea capacitatea" de a recunoaste ADN-ul defect, nereparat. Recunoasterea cromozomilor intacti sau cu ADN defect ar explica: - repararea cromozomilor in zona telomerica; - regenerarea" unei linii celulare, supravietuirea celulelor, cuplata functia cu activitatea telomerica - stoparea senescentei si moartea celulei. e - scurtarea telomerelor prin microdeletii, proces posibil a avea loc cu fiecare ciclu celular (respectiv ciclu mitotic), influenteaza numarul de diviziuni al respectivei linii celulare, ducand la senescenta si apoptoza celulara. Rata scurtarii telomerelor variaza intre 50-150 pb/diviziune 118

celulara. Un aspect de retinut legat de scurtarea telomerelor este cromozomul 17p uman, care, datorita prezentei telomerelor scurte nu se pierde printre primii cromozomi. Blasca (1999) a observat ca scurtarea telomerelor la cromozomii umani 22p, lp si 5p, acelereaza senescenta celulelor; f - Counter (1992), cercetand ciclurile mitotice si meiotice la om a observat urmatoarele: - cromozomii cu telomere scurte nu sunt recombinogenici; - telomerele sever scurtate, due la pierderea integritatii cromozomiale, indue instabilitate genetica si pierderea capacitatii celulei de a se divide; g - Stabilizarea lungimii telomerelor cu ajutorul telomerazei asigura prelungirea vietii celulei si o senescenta celulara tardiva; h - lungimea telomerelor la mamifere si om este influentata de structura cromatinei telomerice. Confirmarea ese cromozomul X inactiv interfazic. Cromozomul sexual X inactiv fund heterocromatic, hipermetilat si cu histone subacetilate, ar sugera o corelatie intre structura cromatinei si mecanismul de mentinere a lungimii telomerelor.

7. Structura moleculara a cromozomilor la eucariote

In celulele eucariote cromozomii au in structura lor urmatoarele molecule: ADN, proteine histonice, proteine nonhistonice, ARN, Mg, Ca, glucide, lipide. a)- ADN-ul cromozomial ADN-ul este o prezenta constanta in structura cromozomului. In celula somatica la eucariote, in nucleu exista 97-99% din totalul ADN-ului celular, iar 1-3% gasim in mitocondriile citoplasmatice. In cromozomi cantitatea de ADN este de 30-40%>. Genomul uman contine 3 x 10 pb pentru fiecare cromozom. In fiecare cromozom se gaseste o molecula liniara de ADN care cuprinde ADN cu secvente unice, ADN moderat repetitiv si ADN inalt repetitiv (cu secvente foarte scurte necodificatoare care se repeta de un numar foarte mare de ori). (a se vedea tipurile de ADN celular, capitolul II). Cantitatea ADN-ului cromozomial nu exprima un raport direct proportional cu complexitatea structural functionala, cu evolutia j filogenetica a speciilor. De exemplu, amfibienii au cea ma mare cantitate de I ADN in genomul celular in raport cu existentul ADN in genomul celulei 119

umane. Un exemplu interesant il reprezinta lalelele (plante) care au in genom o cantitate de 10 ori mai mult ADN fata de genomul uman. Prin analizele fizico-chimice si stabilirea masei moleculare a ADN, in componentele nucleotidice (3,2 Gb - giga baze) s-ar gasi 3,2 x 10 pb. Dupa Kaplan (1989), fiecare cromozom contine o molecula de ADN. La unele eucanote lungimea moleculelor din componenta
Q

cromozomilor variaza intre 6,7 x 10 pana la 1x10 pb. Casperson, folosind metoda microspectrofotometrica in UV a stabilit ca, in general, continutul ADN-ului intracromozomial este proportional cu lungimea fiecarui cromozom. De exemplu, cromozomul 1 cu lungimea cea mai mare din genomul uman, contine 279 Mb, iar cromozomul 22, eel mai mic, acrocentric, are 48 Mb. Continutul pb in cromozomi umani, de la 1 la 22 (autozomii), valoric descreste progresiv de la 279 Mb pana la 45 Mb pentru cromozomul 21, si 48 Mb pentru cromozomul 22. b) - ARN-ul cromozomial In extractele nucleare s-au identificat molecule hibride ADN -ARN. Asemenea complexe hibride variaza cantitativ cu fazele ciclului celular. De exemplu, in stadiul interfazic Gl, cantitatea de ARN in cromozomi este crescuta. Aceasta crestere a moleculelor de ARN in nucleu este motivata deoarece in acest stadiu are loc in celula o activitate intensa de sinteza a proteinelor, iar moleculele de ARN sunt necesare si implicate in aceste procese de sinteza. Cantitatea complexului hibrid ADN - ARN este crescuta in zonele eucromatice ale cromozomului. In stadiul interfazic S" cand are loc replicarea ADN-ului cromozomial, cantitatea de ARN este foarte redusa. In general in cromozomi cantitatea de ARN variaza intre 12 si 13 %.

7.1. Proteinele cromozomale

La eucariote, ADN-ul din cromozomii nucleari este asociat cu proteinele, formand complexe de nucleoproteine sau fibra de cromatina. Proteinele din fibra de cromatina pot fi de doua tipuri: proteine de tip histone si proteine non histone. In ansamblu cantitatea de proteine histonice si nonhistonice din cromozomi este de 68-72 %.

120

7.1.1 Proteinele histonice

Histonele reprezinta o clasa de proteine bazice, cu masa moleculara mica si incarcatura pozitiva. Ele interactioneaza cu gruparile fosfat din ADN prin fortele electrostatice si ionice pentru a neutraliza incarcatura negativa a acestor grupari. Asocierea histonelor cu molecula ADN, cu fibrila ADN-ului cromozomial, se face in stadiul S interfazic al ciclului celular, in imediata vecinatate a bifurcatiei de replicare a ADN-ului. Cuplarea histonelor cu ADN-ul si prezenta lor in structura cromozomilor este numai la organismele eucariote. Genomul procariotelor este lipsit de histone. Structural, histonele lipsite de activitate enzimatica controleaza: structura tertiara in dublu helix a moleculei de ADN, sunt implicate in structura polinucleozomica a flbrilei de cromatina a cromozomilor nucleari. Deasemenea histonele asigura spiralizarea si condensarea cromatinei, maresc stabilitatea ADN-ului cromozomial. Functional, histonele actioneaza ca represori ai activitatii genice prin condensarea cromatinei si superspiralizarea ADN-ului, ADN care nu mai poate functiona ca matrita in replicare, si transcriere in stare superspiralizata. Prin metilare, acetilare si fosforilare, histonele indue modificari in procesele de transcriptie ADN * ARN. Histonele au in structura lor o proportie crescuta de aminoacizi cu sarcini pozitive (diamino-dicarboxilici), ceea ce permite cuplarea cu gruparea fosfat din structura moleculei de ADN. Histonele sunt alcatuite dintr-o catena polipeptidica cu un continut bogat in aminoacizi bazici (lizina si arginina). In raport cu continutul in aminoacizi bazici, histonele se grupeaza in: -histone bogate in lizina si sarace in arginina; -histone sarace in lizina dar bogate in arginina; -histone sarace in lizina si putini amioacizi arginina. Weintraub (1976), folosind metoda electroforetica si cromatografia cu schimbatori de ioni, a identificat existenta a cinci tipuri de histone in structura genomului la eucariote. Aceste histone au fost simbolizate cu notatiile Hi, H2A, H2B, H3 si H4 (tabel): -Hi este foarte bogata in lizina; -H2/\ contine raporturi cantitativ egale de lizina si arginina; -H213 contine un numar mai mare de lizina fata de arginina; -H3 si H4 contin un numar foarte mare de arginina. 121

Folosind electroforeza in gel, Weintraub a observat modificari posttranslationale, identificand si subtipuri de histone. Modificarile produse la nivelul histonelor altereaza" incarcatura electrica a moleculei, afectand interrelatia ADN - histona. De exemplu, Matsumoto si col. (1980) au observat ca fosforilarea histonei Hi se asociaza cu condensarea cromozomilor: fosfokinaza - histona Hi initiaza mitoza si regleaza condensarea cromozomilor. Au demnostrat ca acetilarea aminoacizilor din histona H4 determina deschiderea nucleului histonic, proces asociat cu transcrierea regiunilor cromatinelor nucleare si activarea ADN-ului ca matrita in transcrierea mesajului genetic. Histonele H2A, H2B, H3 si H4 au secventa de aminoacizi conservata filogenetic, ele fiind in raport echimolecular cu ADN-ul. Raportul ADNhistona are valoarea ~ 1 pentru cele patru tipuri mentionate. Prin tratarea fibrilei polinucleozomice cu tripsina si eliminarea histonei Hi, fibrila polinucleozomica nu-si modifica structura, confirmanduse ca histona Hi nu participa la structura nucleozomului. Tabel VII Numarul de aminoacizi si masa molecuKi... a histonelor din timusul de vitel (dupa Elgin si Wintraub, 1976 ) Tipul de histona
Hi
H2A

H2B

H3 H4

Caracteristic a generala Foarte bogata in lizina Bogata in lizina si arginina in raporturi egale Contine mai multa lizina, mai putina arginina Bogata in arginina Bogata in arginina

Numar aminoaci zi 216 129 125 135 102

Masa molecular a 21.500 d 14.000 d 13.775 d 15.320 d 11.280 d

Histonele sunt prezente in genomul tuturor eucariotelor. Totusi, interesanta este identificarea unei proteine cu o structura apropiata de histonele eucariotelor la Escherichia coli. Aceasta proteina a fost notata H, desi procariotele nu au cromozomul cu structura nucleozomica. Histonele Hi, cu o masa moleculara de 21500 d, reprezinta un grup de proteine relativ heterogen. H] are 0 structura variabila la diferite specii. 122

Variabilitatea subtipurilor de histona Hi, apre ca modificari posttranslationale suferite. Pentru Hi se apreciaza o evolutie mai accelerata, confirmata de identificarea a 15 - 30 subtipuri Hi la diverse specii, si aproximativ 15 subfractii H] in diferitele tesuturi ale aceluiasi organism. Histonele H2A, H2B, H3 si H4 se caracterizeaza printr-un conservatorism structural, fara a prezenta subtipuri histonice. Datorita conservatorismului celor patru tipuri de histone, consemnam 0 asemanare (nu identitate) a raportului de aminoacizi la histonele din genomul regnului vegetal si animal. De exemplu histona H4 de la Pissum sativum (mazare) are secventa in aminoacizi aproape identica cu cea de la Bos taurus (vitel). Histonele H2A, H2B, H3 si H4 sunt proteine cu o masa moleculara cuprinsa intre 22000 d si 14000 d. Datorita numarului mare de aminoacizi bazici (diaminoacizi) valoarea pH ajunge la ~ 10. Ca urmare, prin gruparea NH2 din structura, aminoacizii interactioneaza cu electronii negativi din gruparea fosfat a ADN-ului cromozomial. Structura invariabila filogenetic a histonelor H2A, H213, H3 si H4 explica rolul universal si important in structura cromozomilor. Daca Hi are o variabilitate accentuata filogenetic, determinata de modificarile post-translationale, eventualele diferente ale histonelor H2A, H2B, H3 si H4 ar fi determinate de unele divergente evolutive. Cele mai conservatoare histone, prin structura, sunt histonele H2A, H3 si H4 . De exemplu, histona H4 are 0 rata a evolutiei de 0,06 mutatii pe 100 reziduuri de aminoacizi in 100 milioane de ani, in timp ce rata evolutiei fibrinei este de 80 mutatii, iar a hemoglobinei de 20 mutatii in 100 milioane de ani. Histonele H2A, H2B, H3 si H4 sunt hidrofobe - acide la capatul Cterminal si hidrofobe -bazice la capatul N-terminal. Regiunea C-terminala ire aspect globular si e bogata in aminoacizi hidrofobi - leucina si izoleucina sau in aminoacizi destabilizatori ai duplexului ADN- glicina si 3rolina. Presiunea selectiva a conservat regiunea globulara din necesitatea nteractiunii histona-histona, sau histona-nonhistona. S-a constatat ca prin fosforilare, acetilare sau metilare a histonelor ipar modificari post - translationale. De exemplu, prin fosforilare se >roduce o crestere a sarcinilor pozitive (+), prin acetilare sau metilare are oc o scadere a sarcinilor pozitive (+) dar cresc sarcinile negative (-). Prin iceste modificari de sarcini (+) si/sau (-) se modifica fortele de interactie ntre familia histonelor H2A, H2B, H3 si H4 si ADN, interactional^ in irocesele de translatie si replicarea genelor, avand rol de modulare.

123

Histona Hi se asociza, ca monomer", cu ADN-ul, in timp ce H2A, H2B, H3 si H4 formeaza dimeri care se vor asocia intre ei, rezultand un octamer, in jurul caruia se infasoara duplexul ADN, formand nucleozomul. Legarea histonelor de ADN se face prin legaturi ionice intre gruparea fosfat a ADN-ului si gruparile amino ale histonelor. De exemplu Hi, H2A si H2B se leaga prin resturile lizina la perechile AT, iar H3 si H4 se leaga prin resturi de arginina la cuplul complementar G -C. Histonele se cupleaza cu ADN in depresiunea (adancitura) mare a moleculei ADN, atat in zonele eucromatice, cat si heterocromatice. Genele care codifica familia proteinelor histonice sunt localizate si dispuse in tandem pe aceeasi molecula ADN, ele fiind prezente in multe copii in genom. Genele care codifica histonele sunt reprezentate de secvente scurte. Unele gene de sinteza a histonelor sunt inserate printre secventele ADN-ului moderat repetitiv. Aceste gene sunt denumite si histogene". Se presupune ca histogenele sunt rezultate prin duplicatia secventelor nucleotidice din genom, sau prin crossing-over inegal intragenic. Histonele bogate in arginina inhiba sinteza ARN-ului, iar cele bogate in lizina au un proces de inhibitie a ARN mai moderat, mai redus. La eucariote, histonele sunt sintetizate sub controlul secventelor oligonucleotidice, incluse discontinuu si in ADN-ul moderat repetitiv. Genele care codifica sinteza histonelor sunt transmise numai in stadiul S interfazic al ciclului celular. Moleculele de ARNm pentru histone, cu numar mic de nucleotide, nu sunt poliadenilate, sunt lipsite de introni. Omul contine pe cromozomii 1, 6 si 12 aproximativ 20 de gene care codifica histonele. Genele care codifica histonele sunt grupate pe o secventa a moleculei ADN de 6-9 kb, iar transcrierea lor se face separat. Numarul mare al secventelor genice repetate pentru histone ar fi urmarea recombinarilor intragenice inegale selectionate in evolutia biogenetica.

7.1.2. Proteinele non-histonice

Pe langa proteinele histone, in structura cromatinei cromozomiale intra si proteinele non-histonice sau hertonele. Este o clasa foarte heterogena de proteine acide. 124

Sunt mult diversificate, aproximativ 115 proteine cu proprietati fizico chimice si biologice diferite. Non-histonele nu se caracterizeaza prin histospecificitate marcata. Sunt bogate in aminoacizi cu pH acid, cum sunt: ac. glutamic, ac. aspartic, triptofanul. pH-ul acestor proteine non-histonice variaza pe o scara larga, intre pH 3 10. Proteinele non - histonice sunt reprezentate de un complex de enzime ca: ADN-polimeraza, ARN-polimeraza, NAD-sintetaza (nicotinamid-adenindinucleotid-sintetaza), metilaze, acetilaze, nucleaze, fosfokinaze. Este complexul enzimatic necesar replicarii, transcriptiei si maturarii ARNm, replicarii moleculei de ADN, etc. Din grupa proteinelor non-histonice fac parte activatorii si represorii genelor din structure si activitatea operonilor, proteinele contractile de tipul tubulinei, actinei si miozinei, proteine care intervin in mecanica fusului de diviziune in metafaza si anafaza ciclului mitotic sau meiotic. Unele non-histone sunt sensibile la prezenta hormonilor steroizi, tiroxina etc. Un grup majoritar de proteine non-histonice este reprezentat de proteinele HMG (Hight Mobility Group) prezente la toate eucariotele. Sunt identificate patru tipuri principale de HMG: HMGi, HMG2, HMG14 si HMG17. Structura acestor proteine este bipolara: la o extremitate a moleculei sunt localizati aminoacizii bazici, la extremitatea opusa, aminoacizii acizi. Aceasta dubla polaritate structurala este presupusa ca fiind interactiunea lor cu histonele si ADN-ul din cromatina nucleara. In perioada interfazica le gasim, ca localizare in citoplasma, ca apoi, in stadiul S sa migreze spre nucleu, unde pot fi implicate in replicarea ADN si in transcriptie. S-a mai constatat ca numai HMGi si HMG2 tree din citoplasma spre nucleu, in timp ce HMG14 si HMGi7 se gasesc permanent in nucleu, unde interactioneaza cu nucleozomii. Pentru complexul de proteine non-histonice in special pentru clasa HMG in genomul nuclear exista un mare numar de gene repetate. Se presupune ca in genom ar exista intre 20-30 gene copii (repetate) pentru fiecare tip de HMG. Aceste gene HMG sunt lipsite de introni ca si genele care codifica histonele (si ele sunt lipsite de introni). In genomul uman, singurele gene donate pana in prezent care codifica proteinele non-histonice sunt genele pentru HMG14 si HMGi 7. Tot din grupa non-histonelor fac parte doua peptide, notate: Scl de 170 kd9 si Sc2 de 135 kd (Sc provine de la scafoid = schela). Acest grup de

kd (kilodalton) = 1000 daltoni. 1 dalton (d) este o unitate atomica a masei moleculare. 125

nonhistone au fost identificate, in celulele HeLa1 dupa eliminarea histonelor. Se presupune ca grupul de peptide Scl si Sc2 ar avea rol in conservarea cromozomului metafazic, asigurand integritatea cromozomului. In prezent sunt identificate peste 120 tipuri diferite de nonhistone care se deosebesc intre ele si prin masa moleculara care variaza in limite foarte largi: intre 10-150 kd. Proteinele non-histonice sunt sintetizate in citoplasma celulei, dupa care vor traversa porii anvelopei nucleare, trecand in nucleu. Proteinele nonhistonice au o rata de sinteza foarte crescuta, dar si de degradare. Cantitati crescute de non-histone sunt gasite in nucleii celulelor cu activitate foarte intensa. Eucromatina contine mari cantitati de non-histone, iar heterocromatina o cantitate foarte mica. Non-histonele pot interactiona cu histonele, cu ADN-ul si ARN-ul. Cantitativ, non-histonele variaza in raport cu fazele ciclului celular, sau cu tipul de celula din organism. Deoarece non-histonele sunt implicate in activarea specifica a genelor, fosforilarea lor este esentiala. Non-histonele, interactionand cu ADN-ul, modifica transcriptia (o influenteaza) si stimuleaza sinteza ARNm. Sinteza lor, independenta de sinteza ADN, se desfasoara pe intreg ciclul celular. Cu rol esential in expresia genelor in timpul ciclului celular, pot recunoaste specific, secvente nucleotidice din ADN. Pana in 1973, configuratia spatiala, ADN-proteine a fost interpretata si analizata cu erori". In prezent prin analiza imaginilor electronomicroscopice si a datelor rezultate din tratarea enzimatica a fibrilei ADNproteine, sau interpretarea spectrelor de difractie a razelor X, asocierea ADNproteine si configuratia in interiorul cromozomilor este corect si complet elucidata. Unitatea de referinta pentru a analiza configuratia fibrilei de ADNproteine a fost cromozomul acrocentric numarul 13 din genomul uman. Cromozomul 13 prezinta urmatoarele componente valorice: - molecula de ADN in dublu helix, din cromozom, dispusa liniar, are o lungime de 32000 JU;

HeLa - linie de celule epiteloide umane provenite dintr-un carcinom de col uterin, prelevate de la bolnava si mentinute in cultura celulara continua. 126

- ca dimensiuni, cromozomul 13 are o lungime de 5,8/x si grosimea de 0,8/z. Cercetatorii au cautat sa clarifice care este conformatia anatomica" a fibrilei ADN-proteine in cromozomi, cu respectarea dimensiunii cromozomului si exercitarea functiilor de baza ale ADN. Au clarificat implicarea proteinelor de tip histone in aceasta configuratie, rolul lor. Primele observatii apartin lui Golumb si Bahr (1974) care au confirmat ca fibrila ADN-proteine cu diametrul de 2,5 - 6 nm, este integrata intr-o structura fibrilara mai complexa a carei rata de pliere, stabilita de ei este de 20/1, observatii confirmate de Kornberg (1974), Weintraub (1976), Finch (1977) s.a. Cercetarile care au urmat (Burkholder, 1988 si Strachan-Read, 1999) au evindentiat ca fibrila de ADN din cromozom, formeaza mici bucle in jurul unor molecule proteice de tip histone.

8. Configuratia anatomica" a cromozomiior

La eucariote, genomul celular este reprezentat de seturi de molecule liniare" de ADN, fiecare set fiind inclus in structura si arhitectura unui cromozom. Comparandu-se talia cromozomiior cu numarul si lungimea moleculelor de ADN se constata diferente valorice impresionante, cromozomii avand dimensiuni de ordinul micronilor. De exemplu intr-un cromozom de talie medie din grupa III ( a carui lungime sa fie de 4,5/x) se gaseste un filament ADN a carui lungime liniara ajunge la aproximativ 5 cm. In aceste conditii putem considera ca fibrila de ADN cuplata cu histone are o configuratie anatomica", o anume dispozitie ca arhitectura,, supramoleculara, pentru a depozita respectiva fibrila de ADN - histona de 5 cm intr-un cromozom micrometric. Configuratia fibrilei de ADN asigura un depozit impresionant de informatie genetica in fiecare cromozom. La organismele eucariote sistemul conformational este bine organizat asigurand, intergral functiile ADN-ului cromozomial: functia autocatalitica; functia heterocatalitica; functia de variabilitate a aparatului genetic. Sistemul conformational al ADN-ului in cromozomi este conditionat, prin asociere, de proteinele de tip histone. 127

Asocierea ADN-histone era cunoscuta inainte de anul 1970. S-a stabilit ca ADN-ul se cupleaza cu histonele, formand fibrila de nucleoproteica, dar mecanismul de asociere si stabilitate nu era corect definit. Asocierea a fost denumita fibrila fina de tip A" formata din ADN si histone. Kornberg (1974), Burkholder (1988) si Romarkrishnam (1997) au constata ca fibrila fina de tip A, spatial, are o dispozitie complexa, determinand o crestere in dimensiune, pe care au denumit-o fibrila elementara de tip B" cu grosimea de 20-30 nm. In 1999, Shachan si Read, folosind metoda difractiei razelor X, au constatat ca dimensiunea fibrilei fine de tip A este de 10-11 nm, iar prin supersuper-spiralizare si trecuta in fibrila elementara de tip B, dimensiunea depaseste 20-30 nm. Prin aceste observatii se confirma datele lui Golumb si Bahr (1974) ca fibrila de tip B, este o stare conformational- spatiala a fibrilei de tip A. Fibrila B avand o arhitectura mai complexa. In prezent se accepta ca fibrilele de tip A si B sunt doua stari fizicochimice a ADN- histone datorita fortelor de atractie intre moleculele de histone pentru fibrila fina de tip A si interactiei intre nucleele proteice invecinate, pentru fibrila elementara de tip B. Fibrilele A si B sunt etape de aranjare complexa a asocierii ADN-ului cu histonele. Datele actuale confirma ca in fiecare cromozom exista o fibrila de ADN cu lungime si numar perechi de baze caracteristice. Fibrila de ADN-histona realizeaza o arhitectura si conformatie anatomica", particulara fiecarui cromozom din genomul uman. S-a mai demonstrat ca in metafaza ciclului mitotic sau meiotic fibrila de nucleo-proteina realizeaza niveluri de pliere, supersuperspiralizare, condensare si rasucire care reduc considerabil lungimea fibrilei, pana la 1/10000. Prin aceasta conformatie supramoleculara este acceptat imensul depozit de material genetic intr-un cromozom micrometric. 8.1. Arhitectura supramoleculara sau anatomia" cromozomilor umani

Folosindu-se metode biochimice (enzimatice) difractia razelor X si imaginile electronomicroscopice s-a observat ca in cromozom, fibrila de nucleo-proteina realizeaza o arhitectura" dispusa pe patru nivele de organizare si dispozitie spatiala (fig. 34): 128

nivelul sau structura primara a cromozomilor - nivelul nucleozomic; nivelul sau structura secundara - nivelul solenoidic; nivelul sau structura tertiara nivelul bucleiform; structura cuatemara - hiperspiralizarea si condensarea buclelor cromozomale.

Fig. 34 Arhitectura supramoleculara a fibrilei de ADN in cromozomii eucariotici (dupa Strachan si Read, 1999).

8.1.1 -Nucleozomui- structura primara a cromozomului

Unitatea de baza a structurii cromatinei nucleare este nucleozomui. Ca nivel al structurii primare, nucleozomui este unitatea fundamentala a fibrilei fine de tipA, cu aspect perlat sau corpuscular, cu diametrul de 1 lnm. Formatiunile corpusculare sunt separate intre ele de secvente nucleotidice din structura ADN-ului, secvente ce au un diametru de aproximativ 2nm (fig. 35).

129

Nucleu proteic (8 molec. de histone)

Fig. 35 Nucleosomi a) structura nucleosomului b) imaginea electronomicroscopica (300.000 X)

a polinucleozomica la pasare

fibrei

de

cromatina

Supusa actiimii enzimelor s-a stabilit ca formatiunea corpusculara care cuprinde si segmentul intercorpuscular, are un numar de aproximativ 200 pb. Prin metoda socului osmotic si analiza electronomicroscopica s-a evidentiat ca structura primara a cromozomului are aspect perlat". Fiecare 130

perla" sau corpuscul este compus dintr-un nucleu proteic, format din 8 molecule de histone, cate doua molecule de H2A, H2B, H3 si H4, deci un octomer. Nucleozomii au fost denumiti si corpusculi m" sau particule Structura completa a nucleozomului este urmatoare octomerului de histone, care se asociaza cu o secventa de 140pb din molecula ADN, care se inruleaza cu o rotatie completa de 360 si trei sferturi. In componenta nucleozomului intra si unele proteine non-histonice de tipul nucleoplasminelor Ni si N2. Un nucleozom este separat de nucleozomul urmator de o secventa de 60 pb. Stabilitatea nucleozomului este asigurata de fortele de atractie stabilite intre histonele din nucleul proteic, iar stabilitatea fibrilei polinucleozomice este determinata de fortele de interactie existenta intre nucleozomi. S-a constatat ca in vivo" asamblarea histonelor in nucleozom se face in prezenta nucleopasminelor Ni si N2, care sunt proteine non-histonice acide, cu rolul de a neutraliza respingerea electrostatica dintre histone, cupleaza histonahistona, determinand stabilitate nucleozomului. S-a stabilit ca histonele au un centru hidrofob cu radicali bazici datorita aminoacizilor arginina si lizina. In cazul acetilarii, metilarii sau fosforilarii histonelor, considerate modificari epigenetice, nucleozomul nu mai prezinta stabilitate, se disociaza. Aceste modificari au loc in timpul transcrierii mesajului genetic inscris in secventa de nucleotide spiralizata in jurul nucleului din zonele eucromatice ale cromozomului. Cu ajutorul topoizomerazei, a nucleoplasminelor Ni si N2 nucleul proteic poate fi disociat intr-un tetramer compus din H3 si H4. Tetramerul H3 si H4 se cupleaza cu tetramerul format din histonele H2A si H2B intregind structura nucleului proteic. Histonele H3 si H4 formeaza zona centrala a nucleului proteic pe care se inruleaza superhelixul de ADN. Histonele H2A si H2B se ataseaza, cate doua molecule pe fiecare fata a tetramerului H3 si H4. Daca H3 si H4 asigura proprietati asemanatoare nucleozomului si in absenta lui H2A si H2B , histonele H2A si H2B nu asigura proprietati nucleozomice in lipsa celorlalte tipuri (H3 si H4). Spatial, forma geometrica a nucleozomului este ca 0 sfera turtita sau cilindru turtit cu diametral de l l n m si 5,5 nm inaltime. Datorita turtirii discoidal biconvexe, nucleozomul a fost denumit si platisom.

131

Histona Hi nu participa la structura nucleozomului. Hi este localizata pe secventele a cate 23 pb la intrarea si iesirea fibrilei de ADN, inainte si dupa ce a realizat inrularea in jurul nucleului proteic. Aceasta Hi induce o rigiditate secventei polinucleotidice asigurand separarea nucleozomilor, in fibrila polinucleozomica din cromozomi. Aceasta secventa polinucleotidica dintre doi nucleozomi vecini se numeste fragment de legatura sau ADNlinker". Fosforilarea histonei Hi este semnalul care determina condensarea cromatinei cromozomale si declansarea ciclului mitotic sau meiotic. Prin realizarea fibrilei polinucleozomice din cromozom, fibrila elementara de ADN isi reduce lungimea de 6-7 ori. In timpul replicarii ADN-ului sau de transcriere a mesajului genetic intr-o molecula de ARNm, stabilitatea nucleozomului este redusa datorita modificarilor ,,epigenetice". Prin metilare acetilare sau fosforilarea aminoacizilor lizina si/sau arginina sunt modificate fortele de atractie histonahistona, nucleozomul se disociaza iar ADNul poate sa transcrie mesajul sau sa se sintetizeze prin autoreplicare.

8.1.2 -Solenoidul- structura secundara a cromozomului

Structura secundara a cromozomului a fost si este studiata prin metode cristalografice, spectre de difractie a razelor X, difractia neutronilor si analiza imaginilor electronomicroscopice. Datele obtinute de Vogel si Matulsky (1982,1988) si Vogel si Grumwald (1994) au permis enuntarea urmatoarei ipoteze : ADNul din cromozomii eucariotelor se cupleaza cu histonele formand nucleozomii, rezultand fibrila poli-perlata, polinucleozomica sau super - helixul cromatinian". Fibrila polinucleozomica realizeaza la randul ei o superinrulare de tip levogir rezultand structuri" inalt ordonate ale cromozomilor. Aceste structuri echivaleaza cu super-super-helixuri". In aceste super-super-helixuri nucleozomii adiacenti sunt grupati intr-un helix comun ADN-proteina. Formatiunea care rezulta este numita solenoid, avand dimensiune variabila (intre 30-60 nm) (fig. 36).

132

"

Fig. 36 Cromatina superspiralizata (solenoidul) Prin suprainfasurare si gruparea a 6-7 nucleozomi la o rotatie de 360 se formeaza si solenoidul. Aceasta conformatie arhitecturala" este stabilizata de fortele de interactie ale nucleozomilor adiacenti de interactiuni intre regiunile hipervariabile N-terminale si COOH terminale ale histonelor Hi prezente pe secventa polinucleozomica ce se inruleaza. Rolul histonei Hi in formarea solenoidului este important deoarece prin prezenta a doua lanturi polipeptidice asigura urmatoarele interactiuni: un lant polipeptidic interactioneaza cu ADNul dintr-un nucleozom, iar cu eel de-al doilea lant va interactiona cu ADN-ul din nucleozomul urmator.
133

Histona Hi ar actiona ca o grefa" care grupeaza nucleozomii, asigurand stabilitate superstructurii in solenoid. La aceasta conformatie anatomica" supramoleculara sunt implicate si proteinele non-histonice din clasa HMG prin subtipurile HMG14 si HMG17. Prin dispozitia polisolenoidica fibrila de ADN din cromozom, in stadiul G2 interfazic, isi reduce lungimea de 50 de ori, fata de stadiul Gi cand fibrila polinucleozomica are 0 reducere de 7 ori. Gradul eel mai inalt de compactare solenoidica a cromatinei s-a observat in nucleul spemiatozoidului cand histonele sunt inlocuite cu protamine. Dupa fecundatie histonele sunt reintroduse in structura fibrilei de ADN. O observatie interesanta apartine lui Lima de Faria (1975) care a anticipat notiunea de solenoid prin folosire de imitate cromomer . Dupa Faria cromomerele sunt configuratii sferice in permanenta schimbare. Nu erau considerate replicari sau unitati de transcriere. Cromomerele erau considerate structuri cromozomale de tranzit, ca un fenotip cromozomal".

8.1.3 Bucla cromozomala ca structura tertiara

Tratarea cromozomilor in metafaza mitotica sau meiotica folosind 0 solutie de NaCl 2M, acestia prezinta 0 retea fibroasa orientata axial, inconjurata de un halou de fibre ADN cu structura solenoidica. Aceste fibre au aspect bucleiform, dimensiuni variabile find orientate in toate directiile (fig. 37). Aceste bucle au ca baza axul longitudinal al cromozomului. Ca structura moleculara, buclele contin intre 5 pana la 200 kb ADN, cu o valoare medie de 65kb.

134

Retea interna

Fig. 3 7 Organizarea bucleiforma a flbrilei de ADN in cromozom. Structure tertiara. ADN-ul genomic este organizat in bucle de 5 si 200 Kb. Buclele sunt ancorate cu proteine scheletice foarte specifice ADN-ului din regiunile SARs (Scaffold Associated Regions). Dupa Clark si Wall 1992, reprodusa dupa Gosser si Laemli, 1987). Formarea buclelor din fibrila polisolenoidica si conservarea" lor in timpul metafazei cromozomilor este determinata de proteinele non-histonice de tipul Scl si Sc2 (Scazzold"). Proteinele Scl si Sc2 asigura interactiuni ADN-proteina si proteina-proteina. Prin interactiuni se formeaza o ampla retea de fibre polisolenoidice dispuse bucleiform, orientate pe axul longitudinal al cromozomului. Se presupune ca buclele ar reprezenta subunitati functionale genetic si de replicare a cromozomilor, prin prezenta asa numitelor replicari.

135

Structura tertiara bucleiforma, realizeaza o reducere a lungimii fibrei elementare de ADN in cromozom de aproximativ 1000 de ori. 8.1.4 Structura cuaternara a cromozomilor In metafaza mitotica sau meiotica la eucariote, cromozomii sunt supusi unei hipercondensari a buclelor cu orientare in spirala (rasucire) a fibrilei de ADN bucleiform, urmand axul longitudinal al cromozomului (fig.38).

Fig. 38 Structura cuaternara a cromozomului - Model propus de Filipski si col.(1990) si reprodusa de Clark si Wall (1992).

136

Fibrila bucleiforma se dispune spatial in razele hexametrice cu un continut ADN de aproximativ 300 kb. In final, se obtine o fibra de 200-300 nm grosime pe axul longitudinal cromozomial. Fibrila de ADN dispusa in razele bucleiforme hexametrice, prin rasucire are imaginea unei bobinari. Din imaginile electromicroscopice se apreciaza ca o rotatie de 360 a fibrilei bucleiforme ar cuprinde aproximativ 30 rozete hexametrice. Prin rasucirea rozetelor hexametrice si hipercondensare se stabilesc particularitatile morfo-strcuturale ale cromozomului in metafaza mitotica si meiotica. Filipski (1990), analizand cromozomii metafazici la mamifere, apreciaza ca intr-un cromozom s-ar realiza intre 29-33 rotatii a rozetelor hexametrice. Numarul de rotatii a rozetelor hexametrice si hipercondensate est in raport cu cantitatea de ADN din cromozom. Prin studiul arhitecturii cromozomilor metafazici de catre HelsopHarrison si col. (1988) s-a constatat ca la bobinarea" rozetelor hexometrice si condensare ar participa circa 30 proteine non-histonice de tipul HMG. Colectivul condus de Heslop-Harrison a indentificat ca antigenul nuclear AF2 este implicat direct in bobinarea" si condensarea fibrilei bucleiforme. S-au mai identificat o clasa majora de non-histone desemnate Scl si Sc2. Sc2, cu masa moleculara de 135Kda, nu i se cunoaste inca rolul pe care il are in structura cuaternara a cromozomilor. Scl, cu masa moleculara de 170 Kda si in cantitate mai mare, a fost identificata ca topoizomeraza II a ADNului / taza II. Se gasesc cate trei molecule de taza II pentru fiecare bucla de ADN, cu localizare la baza buclelor. Se presupune ca ar avea rol in condensarea cromatinei. Proteinele non-histonice de tip MARs (matrix- associated regions), interactionand cu topoizomerasa II asigura hipercondensarea cromozomilor metafazici. Bobinarea a cca 30 de rozete hexometrice la o rotatie de 360, ar realiza o grosime de 200-300 nm. Fiecare bobina" ar echivala cu o banda G" la cromozomii umani. Cromozomul 1 din genomul uman are prezenta in jur de 30 de rozete hexametrice condensate. In prezent sunt identificate majoritatea proteinelor non-histonice esentiale, asociate cu structura retelei fibroase axiale cu rol in condensarea cromozomilor in mitoza sau meioza. 137

Prin bobinarea in spirala a fibrei de ADN bucleiform, insotita de hipercondensare, firbila elelemtara de ADN isi reduce lungimea in metafaza de aproximativ 10000 de ori. Identificandu-se, etapizat, structura si arhitectura complexa a fiecarui cromozom, intelegem si acceptam posibilitatea depozitarilor unor cantitati mari de ADN, de ce in cromozomi exista in forma codificata o cantitate impresionanta de infonnatie genetica pentru codificarea caratcterelor exprimate fenotipic, in cromozomi cu dimensiune de ordinul micronilor.

9. Starile fizice ale cromozomilor Heterocromatina si eucromatina

Emil Henilz (1935) a observat la plante si insectele cercetate, cromozomi, sau secvente din cromozomi, uniform si intens colorati (colorate), denumiti(denumite) heterocromatina. Cercetarile au stabilit ca este o asociere intre ADNul nuclear si proteinele histone, iar in raport de pliere, dispozitia fibrilei de nucleo-proteina si starile functionale in interfaza celulara, colorantii bazici specifici sunt puternic sau slab fixati in cromatina nucleara. In dinamica functionala a ciclului celular, cromatina nucleara se prezinta, discontinuu, neuniform colorata: heterocromatina si eucromatina.

9.1. Heterocromatina (He)

Heterocromatinele sunt segmentele cromatidice sau cromozomii cu structura condensata, uniform si intens colorati in telofaza si interfaza timpurie a celulei eucariotelor. Semnalata initial la cromozomii sexuali, s-a observat ca si cromozomii somatici (autozomi) au secvente heterocromatice. Heterocromatina este determinata de secvente de ADN (moderat si inalt) repetitiv, cuplate cu histone, cu un coeficient ridicat de pliere si condensare pe lungimi si dimensiuni variabile. Extinderea si numarul

138

zonelor heterocromatice sunt particularitati caracteristice fiecarui cromozom din genomul celular. Regiunile heterocromatice sunt situsurile secventelor repetitive si inactive informational, care au o replicare tardiva in stadiul S interfazic. ADNul din zonele heterocromatice (repetitiv) isi exercita numai rolul egoist" de autoreplicare. Sunt cateva exceptii de la regula de non-functionalitate a heterocromatinei. De exemplu, segmentele distale ale telomenelor, desi iieterocromatice, indeplinesc functii vitale pentru celula, asigurand nentinerea in anumite limite, dimensiunea si integritatea structural-morfo-iinctionala a cromozomilor pe parcursul ciclurilor celulare. Aceste structuri elomerice opresc scurtarea progresiva a cromozomilor. Daca ar lipsi ,mecanismul telometric de protectie" a dimensiunii, structurii si functiei romozomilor din genomul celular, celula ar fi distrusa (vezi structura elomenelor). Rolul protector" este asigurat de secventele hexanucleotidice TTAGGG- repetitive care, filogenetic, sunt foarte bine conservate. Exceptie de la regula nonfunctionalitatii heterocromatinei romozomiale sunt si regiunile centromerilor si organizatorii nucleolari. De exemplu, incadrat in definitia de heterocromatina, centromerul ste implicat in dinamica fiecarui cromozom, datorita kinetocorului din ltrastructura centromerica . Si anume kinetocorul se cupleaza cu fusul de iviziune, implicat in procesul de citodiereza a cromozomilor in anafaza litotica sau meiotica. Aceeasi exceptie de la regula nonfunctionalitatii snetice prezinta regiunile organizatori nucleolari ai acrocentricilor (RON, ride, pe langa secventele inalt repetitive noninformationale, se gasesc mltiple locusuri pentru genele care transcriu sinteza ARN-ribozomal). Dupa Yunis si Yasmineh (1971) heterocromatina joaca un rol, in ;enta structural", protejand regiunile vitale ale genomului de actiunea structiva a factorilor mutageni din mediul extern. Protejeaza genele de la velul organizatorilor nucleolari de efectul mutatiilor si recombinarilor. Tot heterocromatina poate stabili bariere de fertilitate", cu lplicatii in diversitatea animalelor in cursul evolutiei si speciatiei )arlington 1937), facilitand translocatiile viabile de tip robertsonian jziuni centromerice) (Petrov, 2001). Cantitatea de heterocromatina reprezinta in medie 1/5 - 1/3 din talul ADNului genomului nuclear. Aspectul caracteristic al heterocromatinei este de cromocentri, adica lomerari de cromatina condensata care depasesc (ca diametru) elementele ucturale ale eucromatinei. 139

He se caracterizeaza prin alociclie, adica diferente de spiralizare intre diversele segmente cromatidice ale cromozomului, sau prin heteropicnoza. Heteropicnoza se caracterizeaza prin afmitati tinctoriale de colorare si gradul de condesare a unui cromozom. In raport cu regiunile eucromatice care sunt izopicnotice, heteropicnoza poate fi pozitiva sau negativa, respectiv colorare mai puternica sau mai slaba decat eucromatina. In raport de stabilitate, constanta si prezenta raportata la cuplurile de cromozomi omologi, heterocromatina nucleara este de doua tipuri: He constitutiva si He facultativa.

9.1.1 Heterocromatina constitutiva

Heterocromatina constitutiva este formata din ADN inalt repetitiv (ADNul satelit), cu localizare precisa in cromozomi, prezenta constanta pe parcursul ciclurilor celulare care succed. Raportata la cuplul de cromozomi omologi, He constitutiva are aceeasi localizare, extindere dimensionala, aditia de coloranti (ca intensitate) si comportament, identic in evolutia si dinamica omologilor in fazele ciclului celular. La om, He constitutiva, evidentiata prin tehnica pentru benzile C" , constant, este localizata in zona centromerilor. He constitutiva are si localizari extracentromerice, intercalata printre segmente scurte de eucromatina a bratului lung al cromozomului Y, la nivelul telomerelor, constrictiilor secundare si pe bratele scurte p" ale acrocentricilor. Reparatia extra centromerica intercalara a He constitutive este evidenta la perechile de cromozomi autozomi 1,9, 16 si Y si in regiunile organizatori nucleolari. He constituiva nu prezinta specificitate tisulara sau celulara, dar prin extindere, ca dimensiune intracromozomala, este particulara fiecarui individ. Folosindu-se metoda de hibridatre a ADNului in situ din cromozomul y s-a evidentiat dispunerea in tandem a secventelor inalt repetitive. Supuse actiunii unor endonucleaze de restrictie si analizata componenta nucleotidica s-a constatat ca secventele din ADN inalt repetitive sunt bogate in cuplul A-T, iar Miller (1974) a observat ca secventele inalt repetitive din cromozomii antozomi sunt bogate in 5-metil-citozina. Acest ADN este denumit si ADN- satelit privit ca un ADN banal" si inactiv. 140

Ohno (1974) considera ca ADNul banal" s-ar fi acumulat in cursul evolutiei biologice la eucariote prin autoduplicari succesive. Ohno sustine ca secventele dispuse in tandem in zonele heterocromatice ar separa" genetic actiunea agentilor potentiali mutageni. Opus ipotezei lui Ohno cercetatorul Gagne, care folosind metoda analizelor autoradiografice a constatat o oarecare activitate in aceste zone heterocromatice. El se bazeaza pe observatia ca in spermatocite si ovocite, la om, apar nucleoli in vecinatatea constitutiva care contine ARNr transcris de genele limitrofe zonelor heterocromatidice. Daca prin defect mutational sau aditional, He se extinde pe spatii mai mari in cromozomi, respectivele zone limitrofe zonelor heterocromatice isi inceteaza functia, efectele fiind severe pentru om. Se presupune, ca efecte genetice ca He aditionala ar induce scaderea capacitatii de reproducere a omului, accelerarea proceselor tumorigenetice, tendinte comportamentale deviante (criminali). In raport de cantitatea de He constitutiva (sau chiar facultativa) se incearca a se stabili o corespondenta cu diversele sindroame pe fond genetic. Deoarece studiile fllogenetice au evidentiat ca He are rol important in evolutia biogenetica a vertebratelor, identificarea si compararea cantitatii de He la Homo sapiens, este recomandata in studiile antropologice ca diferentiere intracromozomale intre diferitele populatii umane.

9.1.2 Heterocromatina facultativa

He facultativa este segmentul cromatidic unde condensarea fibrilei de ADN si fixarea uniforma si intensa a colorantior specifici, nu au corespondent pe cromozomul omolog. Datorita condensarii particulare a fibrilei de ADN si inactivitatea genetica din zonele cromatidice ale cromozomului, apar similitudini asemanatoare cu He constitutiva. Aspectul heterocromatic nu prezinta segmente heterocromatice omoloage constante la nivelul cromozomilor omologi. He facultativa poate fi limitata pe segmente cromatidice dintr-un cromozom, sau extinsa la nivelul unui cromozom (total). Brown (1966) arata ca un cromozom total, heterocromatic este numai cromozomul X la femeie, cromozom care are aspect heteropicnotic in interfaza ciclului celular. He constitutive care contin ARNr transcris de genele cu locusuri in aceste zone cromatidice.
141

Deoarece He constitutiva este prezenta in cromozomul tuturor eucariotelor la toate speciile de mamifere, se presupune ca ar proteja" centromerii si organizatorii nucleolari si ca ar interveni in proceseie de atractie" si sinapsis a cromozomilor omologi in zigonemul profazei primare din meioza. Atractia ar fi determinata de He constitutiva din segmentele telometrice. Este He cariotipica. 9.1.2.1 Inactivarea cromozomului X Inactivarea totala a unui cromozom X din cuplul XX, este caracteristica numai mamiferelor si omului (fig. 39).

Fig. 39 Aspect morfologic al cromatinei sexuale. Apendicii perinucleari din polimorfonucleare, la om. 142

Forma heteropicontica a cromozomului X inactivat a fost descoperita de Barr si Bertrand (1949) in nucleele hipoglosului de pisica. In 1961, Lyon si Rusell au aratat ca la inceputul embriogenezei, in ziua a 16a dela fecundatie, la embrionii de mamifere XX incepe inactivarea unui cromozom X, care in raport de originea cromozomului X - patern sau matern, inactivarea este aleatorie. Folosind metoda de marcare a cromozomilor Lyon a observat urmatoarele: inactivarea cromozomului X, de origine materna sau paterna este aleatorie; inactivarea cromozomului X poate fi totala sau partiala; dupa inactivare, procesul este ireversibil pentru clonele celulare descendente. Prin inactivarea unui cromozom X la femeie se asigura un echilibro genie functional, la cele doua sexe (barbat si femeie) pentru caracterele somatice codificate de genele cu locusuri pe cromozomul X. Cromozomul X inactivat in interfaza ciclului celui ce reprezinta ca o formatiune intens si uniform heterocromatica. Este starea heteropicnotica de corpuscul Barr. De retinut ca la Homo sapiens cromozomul X nu este inactivat total. In partea distala a bratului scurt (p) ramane segmentul Xpter-Xxp 22.3 neinactivat. Regiunea Xpter-Xp 22.3 neinactivata contine genele care codifica unele caractere, cum ar fi: steroid sulfataza, sistemul genetic eritrocitar Xg, sindromul Kellman, retardul mental, etc. Neinactivate sunt si regiunile Xp 21.1 - Xp 22.2, Xp 11.1 - Xp 11.3 si zona limitrofa a bratului q, zone unde isi au locusurile alte gene codante. Inactivarea incompleta a fost consemnata atat la femei, dar si la barbati cu sindrom Klinefelter (XXY). De ce inactivarea se realizeaza pe segmente cromatidice ale cromozomului X si nu total, a fost preocuparea multor cercetatori. De exemplu Lyon (1998), Riggs, Brown (1991), Migeon (1994) Heard si col. (1997) s.a. folosind observatiile la diverse specii de mamifere (in special marsupialele) si datele obtinute din experientele pe culturi celulare provenite de la diverse mamifere si om, au lansat unele ipoteze explicative. Ei au descoperit existenta unui centru de inactivare pe cromozomul X, notat XIC, care intervine in inactivarea - cis a cromozomului X. Dupa Riggs, Brown si Migeon, inactivarea cromozomului X se realizeaza in mai multe etape (stadii): 143

a) Initierea si activarea centmlui de inactivare XIC. Folosindu-se marcarea cromozomilor X si metilarea, constata ca procesul de inactivare incepe de la centrul XIC. Tot prin aceleasi procedee de analiza si identificare, au observat ca in interfaza celulei somatice 46,XX procesul de inactivare are loc numai la unul din cromozomii homomorfi X. Acesta poate fi de origine materna sau paterna. b) Disperesia intracromozomiala a procesului de inactivare. Riggs si Migeon si recent Ballabio si Willard (1991) considerau ca procesul de inactivare - cis are loc pe axul longitudinal al X-ului. Coreleaza evolutia procesului de inactivare cu diminuarea, progresiva, a activitatii de transcriptie a genelor codante limitrofe centrului XIC. Ei au mai observat ca in regiunea Xqll, langa centrul XIC se gaseste Xist care influenteaza inactivarea, sau reactivarea, cromozomului X. Prin structure sa, gena Xist poate transcrie un ARN de 15kb. Gena este activa numai in cromozomul inactivat, iar rolul ei a fost pus in evidenta folosindu-se metoda de hibridizare in situ" si marcare cu fluorocrom. Activitatea genei este dependenta de gradul de metilare - 5 terminal al genei. O alta observatie facuta de Riggs si Migeon este ca in regiunea Xqll exista si o suita de insule GpC, considerate insule de metilare. In cazul cand in regiunea GpC metliarea se extinde asupra promotorului si a primului exon, acoperind o secventa de 1,5 kb din structure gena Xist, inceteaza transcrierea ARN-ului, iar procesul de inactivare a X-ului progreseaza. In aceste conditii se poate afirma ca activitatea genei Xist si gradul de metilare a ADN-ului influenteaza inactivarea. Dar procesele implicate in inactivarea cromozomului X sunt mult mai complexe, devenind o importanta tema de cercetare. Pe baza datelor experimentale obtinute pe culturile celulare, Clark si Wall presupun ca in vivo" procesul inactivarii cromozomului X ar fi asemanator cu eel observat in vitro". Se presupune ca centrul XIC ar modifica arhitectura fibrilei de ADN, iar centrul de initiere a inactivarii sa actioneze in directia > Xist >ARN. Deasemnea, considerandu-se ca un cromozom, are aproximativ 150 Mb ADN, inactivarea ar incepe in mai multe situsuri ce se gasesc la distante de 30-300 kb, dispuse in axul longitudinal al cromozomului X. Deci existenta mai multor centre initiator al inactivarii (XIC). De la centrele XIC incepe inactivarea cromozomului. 144

Inactivarea s-ar realiza prin alunecare progresiva gratie unor enzime ie restrictie EcoB si EcoK, enzime care ar cupla situsurile, formand o suita le bucle infasurate. Procesul s-ar desfasura in cascade. Cand s-a incheiat inactivarea ntr-un segment cromatidic, procesul trece la urmatorul centru XIC, :ontinandu-se inactivarea. Progresiv are loc si heterocromatizarea si condensarea excesiva a mclelor (formate din ADN). Cand procesul este terminat pe toata lungimca, cromozomului X, iuclele hipercondensate si infasurate sunt mentinute in aceeasi stare de roteinele de esafodaj, cu formarea corpusculului Barr. ) Mentinerea inactivarii. Starea heteropicnotica (heterocromatinizare) a romozomului sexual X inactivat incepe din ziua de a 16a a perioadei mbrionare. Odata inceput, procesele de inactivare si starea de corpuscul Barr in iterfaza ciclului celular au loc pe tot parcursul vietii unei femei. Aceste rocese sunt conditionate de gradul de metilare - 5' a genei Xist si de inctia de a transcrie sinteza ARN a acestei gene. I Reactivarea cromozomului X inactivat. Este cunoscut ca in zigot si in imele 16 zile de la fecundatie cuplul de cromozomi X homomorfi este activ inctional. Dar dupa acest interval de timp incep procesele de inactivare a XLlk" [nsa in stadiul S interfazic si in timpul ciclului mitotic sau meiotic, are loc izinactivarea cromozomului. Reactivarea cromozomului X este dependenta : mecanismul inactivarii. Se considera ca reactivarea insumeaza procesele verse ale inactivarii.

145

Izocromozomul X Normal X

Centromer Centromerul activ

(a) Pozitia centromerului inactiv

Figs 40 Cromozom X bandat. a) cromozo m X normal. b) Y cromozom.

9.1.2.1.1 Numarul cromozomilor X inactivati La sexul feminin unde in celula somatica diploida exista doi cromozomi X homomorfi, in interfaza celulara numai un cromozom X este inactivat. Prin urmare, la o femeie normal a gasim un singur corpuscul Barr. Prezenta si identificarea corpusculului Barr ca stare morfologica a cromozomului X inactivat, prezinta un dublu rol: a) Stabilirea sexului genetic primar. Este sexul cromozomial la femeie. b) Valoare diagnosctica. Sunt cazuri clinice de disgenezii gonozomale (heterocromozomiale) determinate de non-disjunctia cromozomilor X in gametogeneza la barbat sau la femeie. Consecinta non-disjunctiei, in meioza se pot obtine gameti diplogonozomici (24,XX sau 24,XY), care, in urma fecundarii cu gametii normal, se obtin zigorii cu XXX a sexul feminin sau XXY la sexul masculin. Avand in vedere ca in celulele somatice numai un singur cromozom X este activ genetic, iar ceilalti sunt inactivitati inseamna ca: 146

la produsul de conceptie cu formula gonozomala XXX, vom gasi in elulele somatice (in interfaza) doi corpusculi Barr; la produsul de conceptie XXY la barbat (sindrom Klinefelter) vom gasi in interaza celulelor somtice un corpuscul Barr. In concluzie, Clark si Wall considera ca inactivarea completa a cromozomului X este rezultatul de interferenta intre coeficientul de heterocromatizare, metilare si compartimentizarea cromozomului X. Cercetatorii Riggs (1990), Hayman (1990), Migeon (1994), Sincler (1990) s.a au elaborat o terie in care se mentioneaza ca modelul de inactivare in mozaic a cromozomului X prezinta un avantaj, bio-genetic, deoarece previne activitatea unor gene recesive ce pot determina aparitia unor boli in patologia umana. Bolile legate de X. f.1.2.2 Cromozomul Y in inter fata celulara Conform ipotezei lansata de Rice (1994), Migeon (1994), Clark si Wall (1996). Cromozomul Y a acumulat o cantitate crescuta de heterocromatma in cursul evolutiei sale, determinata de cresterea cantitatii de ADN repetitiv, care confera starea de heterocromatina pe bratul lung

if
Datorita starii fizice a ADN-ului repetitiv, respectiva zona jromatidica este intens heterocromatica. In aceste conditii, cromozomul Y )oate fi evidentiat in interfaza celulelor somatice la barbati. De exemplu, daca tratam celulele somatice de la barbat cu ;hinacrina, cromozomul Y apare la periferia nucleului interfazic ca un :orpuscul intens fluorescent. Datorita fluorescentei intense este denumit :orpusculul F". Numarul corpusculilor F" este direct proportional cu numarul romozomilor Y prezenti in celula somatica sau gametica.

9.2. Regiuni dublu minut" (DM) si regiuni marcate imogen

Caracteristica genomului mamiferelor si in mod deosebit in culturile slulare umane este prezenta regiunilor dublu minut" (DM) si regiunile larcate omogen (RMO). Bertino si col. (1982), Schimke (1982) sustin ca regiunile DM si MO din genomul celular sunt amplificari de material genetic specific. 147

Ei au remarcat prezenta acestor regiuni in culturile celulare umane. in special in celulele tumorale, asociindu-le cu rezistenta la unele medicamente.

9.2.1 Regiuni dublu minut" (DM)

Regiunile dublu minut" (DM) se prezinta, ca aspect, asemanator cu cromozomii normali din genomul celular, dar sunt lipsiti de centromer (A. Harvey 1996). Fiecare regiune DM are un continut de aproximativ 10002000 kb ADN. Desi se autoreplica aceste DM nu sunt implicate in mecanismele ciclului mitotic, ele segregand aleatoriu ca repartitie in celulele fiiice care rezulta. Urmare a acestei segregari aleatorii se pot obtine celule cu o cantitate inegala de ADN. Clark si Wall mentioneaza ca DM se pot pierde prin micronucleere". Studiile efectuate de Bertino si col (1982) si de colectivul condus de Bermer (1991) pe culturi celulare provenite din diversele tipuri de tumori canceroase au evidentiat existenta liniilor celulare tumorale rezistente la activarea unor medicamente antimetabolice care se administreaza in tratamentul bolii canceroase. De exemplu Bertino a stabilit ca linia celulara K-562, provenita de la persoane cu leucemii este rezistenta la chimioterapia cu metotrexat (MTX). Bertino si col. pun aceasta rezistenta la MTX pe seama amplificarii genei care codifica sinteza dihidrofolat reductaza (DHFR), enzima care este cantitativ crescuta la pacientii tratati cu MTX. Schimke (1982) si Bertino au identificat ca din 200 tumori primare umane 182 linii celulare tumorale (91%) prezentau in nucleu DM. In celulele tumorale rezistente la MRX s-au identificat si 20 cromozomii cu DM. S-a mai observat ca DM sunt labile. Aceasta observatie a fost posibila experimental, si anume introducand in cultura concentratii mici de hidroxine, DM dispar din celula.

9.2.2 Regiuni marcate omogen (RMO)

In 1982, Schimke a observat ca in cromozomii cu material genetic amplificat, apar segmente cromatidice, extinse spatial, care nu sunt bandate 148

indiferent de tehnica de bandare folosita, segmente colorate omogen. Schimke si Bertino considera ca RMO sunt urmarea amplificarii de material genetic in respectivii cromozomi. Observatiile lor au fost suplimentate de Benner si col (1991), care sustineau ca o astfel de amplificare de material genetic marcate omogen (RMO) s-ar realiza la locul genei care codifica sinteza enzimei dihidrofolat reductaza. Aceasta ipoteza lansata de ei se bazeaza pe observatiile facute pe linii celulare de soarece tratate cu metotrexat. Si anume, au identificat aparitia de RMO pe cromozomul 2 din genomul celular de soarece, in zona mediana a cromozomului unde se gaseste gena dhfr, gena care, amplificata, sintetizeaza o cantitate crescuta de enzima dihidrofolat reductaza, conferind rezistenta la MTX. Benner presupune ca RMO ar fi si rezultatul ruperii sau translocarea RMO deja existente in ciclurile celulare anterioare. Interesanta este ipoteza lui Schimke si Benner care considera ca DM ar fi precursori in formarea RMO. Ideea se bazeaza pe observatia ca liniile celulare resistente la MRX, sunt mentinute pe mai multe cicluri celulare anterioare. Interesanta este ipoteza lui Schimke si Benner care considera ca DM ar fi precursori in formarea RMO. Ideea se bazeaza pe observatia ca liniile celulare rezistente la MTX, mentinute mai multe cicluri celulare in cultura, apare o extindere a regiuni lor DM si RMO, sunt mai alungite in axul longitudinal al cromozomilor. RMO sunt apreciate ca suplimentari stabile de ADN in cromozomi obtinute prin amplificari succesive, deoarece nu sunt modificate ca dimensiune si prezenta in cromozomi la tratamentul cu concentratii mici de hidroxiuree. Regiuni marcate omogen apar in foarte putine celule din tumorile primare. Din totalul tipurilor de tumori primare, numai in 13 (6,5%) apar regiuni marcate omogen (RMO), iar in cinci tipuri (2,5%) apar atat DM cat si RMO.

9.3. Eucromatina cromozomala

Cromozomul, pe langa segmentele heteropicnotice si supercondensate cu aditia intensa a colorantilor bazici specifici, prezinta si ?one izopicnotice denumite zone de eucromatina. Zonele eucromatice au ^respondent pe cromzomii omologi din genomul celular. Eucromatina prezinta urmatoarele caracteristici: 149

- are o activitate intensa in interfaza celulara, prin prezenta ADN-ului reprezentativ si informational activ; - in zonele de eucromatina cu ADN nerepetitiv sunt locusurile tuturor genelor cu determinism genetic in exprimarea fenotipica a caracterelor, gene implicate in procesele de crestere, dezvoltare a organismului; - colorare slaba (normala) in interfaza celulara; - zonele de eucromatina cu ADN nerepetitiv prezinta o condensare si despiralizari normale; - eucromatina are o replicare ciclica normala fata de alociclia (tardiva) de replicare a ADN-ului repetitiv din zonele heterocromatice.

10. Cromozomii celulari B"

Sunt cromozomii supranumerari aditionali complementului normal de cromozomi al unei specii. Cromozomii B, care nu se deosebesc de cromozomii A" (normali), nu sunt esentiali pentru cresterea, diferentierea si reproducerea indivizilor in conditii normale. Indivizii cu cromozomi supranumerari B" nu se deosebesc fenotipic de indivizii conspecifici lipsiti de cromozomi B". Cromozomii ,,B" prezinta unele insusiri cu caracter general si anume: prezinta o morfologie diferita fata de cromozomi; au talia foarte mica in raport cu cromozomii normali de tip A"; au o cantitate foarte mare de heterocromatina constitutiva; cromzomii B" nu se cupleaza cu cromozomii A" in zigonemul profazei primare a meiozei; nu contin gene cu informatii majore pentru activitatea celulei, a organismului; activitatea unor gene de pe cromozomii B" se cumuleaza cu genele informational active de pe cromozomii A". se caracterizeaza prin transmitere nemendeliana de la o celula la alta de la o generatie la alta, acolo unde sunt cromozomi B". Este o mostenire nemendeliana. In ansamblu transmiterea nemendeliana a cromozomilor B" de la o generatie celulara (de indivizi) la alta generatie, poate fi 150

asemanatoare cu ereditatea nemendeliana a ADN-ului mitocondrial. Repartitia cromozomilor B" in nucleii viitoarelor celule fiice, este aleatorie, ceea ce explica diferente de numar intre celulele organismului cu astfel de cromozomi (Romera (1991). S-a emis ipoteza ca acesti cromozomi B" ar avea originea intr-o trizomie a cromozomilor A" si in mod deosebit trizomii ale cromozomilor sexuali, deoarece au o structura omoloaga cu acestia (Sandery si col. 1990). Jones si Rees (1982) au identificat la unii cromozomi B" secvente unice din ADN-ul component, iar la unele insecte s-au pus in evidenta secventa de ADN ribozomal. Genele cu locusuri pe cromozomii B" au efecte cantivative asupra unor caractere, cumulate cu efectui genelor ce codifica unele caractere, ce au locusuri pe cromozomii A". Cromozomii B" nu indue, genetic, efecte salitative in fenotipul indivizilor. Uneori cromozomii B" pot influenta cuplarea cromozomilor A" in ) rofaza primara a meiozei iar cromozomii A" pot influenta segregarea ;romozomilor B" in timpul diviziunii (in anafaza mitotica sau meiotica). frin aceasta segregare aleatorie explicam, de ce in populatiile celulare, ale iceluiasi organism, apar diferente de numar ale cromozomilor B". Jones si Rees (1982) considera ca prezenta cromozomilor B" in irofaza primara a meiozei influenteaza comportamentul cromozomilor A" are isi pot modifica mecanismele de formare a chiasmelor. Deasemenea Jones si Rees considera ca influenta exercitata de romozomii B", ar fi determinata de controlul secventelor de metilare si emetilare din cromozomii A". Se presupune ca prezenta cromozomilor B la foarte multe specii de lante si animale, ar avea consecinte evolutive, deoarece prin influentarea omportamentala a cromozomilor A in meioza, ar explica existenta unui lecanism genetic de adaptare la prezenta unor factori externi ce pot etermina procesele de recombinare genetica. Se considera ca prezenta cromozomilor B, ca numar suplimentar ita de complementul cromozomial normal ar avea un efect genetic aditiv ;upra organismelor, favorizand si inducand cresterea adaptativa a ganismelor la fluctuatiile factorilor din mediu.

151

11. Benzile cromozomale

In 1969, Casperson a observat ca fiecare cromozom din setul haploid prezinta in prometafaza si metafaza mitotica sau meioza o succesiune de benzi diferit colorate: clare si intunecate. El a mai observat ca numarul, dimensiunea si ordinea benzilor sunt asemanatoare daca se studiaza fiecare cuplu de cromozomi din celula diploida. Deasemenea, numarul, ordinea si dimensiunea benzilor sunt caracteristice pentru fiecare cuplu de cromozomi omologi, dar si caracteristice fiecarui individ din populatie. Ca definitie, banda cromozomala este segmentul cromatidic clar delimitat de segmente diferit colorate. Folosindu-se tehnici diferite de colorare, benzile evidentiate pot fi identificate ca benzi fluorescente si non-fluorescente, benzi intens colorate cu Giemsa si slab colorate, etc. Dupa tratare si colorare specifica, cromozomii prezinta si o alternanta discontinua de benzi intunecate si luminoase, dispuse pe axul longitudinal al fiecarui cromozom.

11.1. Factori implicati in formarea benzilor

In aditia discontinua a colorantilor si delimitarea intercalara a benzilor intunecatte si palide, intens fluorescente sau slab fluorescente sunt implicati factori, dintre care mentionam: ADN-ul repetitiv si nerepetitiv; prezenta particulara a unor baze complementare pe diverse segmente ADN; distributia perlata" a proteinelor histonice; plierea neuniforma a fibrilei elementare de ADN. a) ADN-ul repetitiv si nerepetitiv, factor implicat in formarea benzilor cromozomale. Cercetarile lui Guenot (1973) au scos in evidenta ca in cromozom, pe langa ADN-ul nerepetitiv, exista o cantitate apreciabila de ADN repetitiv. Guenot aduce urmatoarele argumente: Escherichia coli, cu un cromozom inelar, cantitatea de informatie asigura existenta a circa 4000 de gene informational active (E.coli are 4736.000 pb-40000 b) ce determina 152

sinteza de proteine celulare. Cum codul genetic este universal, iar masa moleculara a proteinelor sensibil egala, pe baza calculului asemanator cu eel facut la bacterii, in genotipul mamiferelor ar trebui sa existe 3x410 gene active. De exemplu, soarecele ar trebui sa contina in genom de 1000 de on mai multe gene fata de E.coli, iar omul ar trebui 3500.000 gene. Pentru a accepta acest rationament legat de stricta corespondenta a cantitatii de ADN si numarul genelor active din genomul eucariotelor ar fi trebuit indeplinita urmatoarea conditie: tot ADN-ul din celulele eucariotelor saprezinte numai scvente nerepetitive, dispuse liniar pe cromozom. Dar, in 1968, Britten si Kohne (s.a.) au descoperit ca in cromozomii mamiferelor (si la om) exista o mare cantitate de ADN repetitiv, care se pliaza (plicatureaza). Prin aceasta plicaturare in anumite secvente cromatidice cantitatea de ADN este abundenta si comasata, iar aditia colorantilor este mai intensa si uniform dispusa (benzile): aspect heterocromatic sau fluorescent. b) Diferente in componenta bazelor din ADN. Un factor care asigura configuratia neuniforma a ADN-ului si aditia colorantilor specifici cu formarea benzilor cromozomale este distribuita cuplurilor complementare a bazelor azotate. Pe fibrila elementara de ADN cromozomal, sunt zone unde predomina cuplul complementar A-T, iar in altele G-C. De exemplu in segmentele polinucleotidice repetitive bogate in A-T se fixeaza mai puternic substantele fluorescente, iar in zonele bogate in G-C fluorescenta este slaba. c) Distributia neunifonna a proteinelor histonice din fibrila polinucleozomica si polisolenoidica a ADN-ului cromozomal. Prin hidroliza enzimatica a cromozomilor metafazici, s-a constatat ca ADN-ul bogat in G-C se asociaza cu histonele bogate in arginina, iar secventele bogate in A-T se asociaza cu histonele bogate lizina. Deoarece secventele din ADN bogate in A-T sau G-C sunt distribuite pe segmente cromatidice evidentiate ca benzi intercalate si distributia histonelor bogate in lizina sau arginina din ADN-ul cromozomal are loc dupa acelasi tipar de benzi. In 1965, Littan considera ca histonele bogate in lizina produc condensarea cromatinei in cromozom, iar cele bogate in arginina ar preveni condensarea. Ca urmare Meisner (1973) afirma ca histonele au rol important in mentinerea structurii tridimensionale a cromozomilor.

153

11.2.Tipuri de benzi in cromozomii eucariotelor

In 1971, la Paris a avut loc a treia reuniune a geneticienilor pentru standardizarea nomemclaturii, codificarii de analiza si interpretare a benzilor cromozomale, reuniune la care s-a decis denumirea lor in benzi Q, G,R siC. (fig. 41)

-".

S *'

(9

I S

* A

3*3

^^

**

&

13

fto

H i:

is
21 22 .X X

Fig. 47 Micrografia cromozomilor a) Metafaza celulei in diviziune b) Cariotipul (46, xx) - Cromozomii - hidroliza enzimatica si colorare cu Giemsa.

154

Fig. 41 bis Cromozomii bandati prin digestie enzimatica. Cariotip normal de femeie. 1- Compararea benzilor R la stanga, benzi Q in centru si benzi G la dreapta (digestie enzimatica a cromozomului 1 uman). In 1972, Gagne, Laberge si apoi Babrow au descris o varianta a 3enzilor C si anume benzile T sau telomerice. Dutrillaux si col. (1973) au ^ompletat sistemele de marcaj si bandare evidentiind benzi particulare" 155

prin folosirea, unei coloratii cu acridin orange, dupa tratamentul cu 5bromdeoxiuridina (BUDR).

11.2.1. Benzile Q
In 1968, Casperson, folosind clorura de chinacrina (agent alchilant fluorescent), a observat un model de benzi fluorescente pe cromozomi, separate, de zone nonfluorescente. Casperson a denumit aceste benzi, benzi Q (initiala de la quinacrina). In 1972, cercetatorii Weisblum si Haseth au stabilit ca substanta fluorescenta chinacrina se fixeaza puternic in segmentele cromatidice unde este ADN foarte bogat in cupluri complementare A-T. Miller (1973) colorand cromozomii denaturati cu anticorpi fluorescenti anti-adenina" confirma ipoteza lui Weisblum si Heseth, obtinand benzi de tip Q. Benzile Q evidentiaza heterocromatina care contine putine gene informational active. Fiecare pereche de cromozomi omologi se caracterizeaza printr-o diversitate de benzi fluorescente ca: numar, ordonare, dimensiune, intensitatea substantei fluorescente fixata. Clorura de chinacrina se fixeaza preponderent in ADN-ul foarte bogat in A-T precum si secventele repetitive LINES. Sunt benzile cromatidice care se replica spre sfarsitul stadiului interfazic S. Termenii de apreciere a intensitatii gradului de fluorescenta a cromozomilor sunt: negativ, aproape fluorescent, palid fluorescent, mediu fluorescent, intens fluorescent, stralucitor. Metoda fluorescenta este folosita, in mod deosebit, pentru studiul cromozomului Y in scopul identificarii unor eventuale translocatii Y, intre cromozomul Y cu cromozomul X, sau cu autozomii. Deasemenea metoda fluorescenta poate fi folosita ca marker" pentru identificarea cromozomului numarul 3 din genomul celular. Benzile Q prezinta un polimorfism mendelian" polimorfism transmisibil si caracteristic fiecarui individ in populatie. Analiza benzilor Q este recomandata pentru studii antropogenetic (etnice), familiale, medicolegal, criminalistice. Bobrow (1971) si Casperson (1971) recomanda analiza benzilor Q in studiul derularii spermatogenezei la om si animale.

156

1.2.2. Benzile G
Ca si benzile Q, benzile G care se suprapun ca numar, ordonare, idimensiune, evidentiaza ADN-ul bogat in heterocromatina uniform condensata care cuprinde putine gene informational active. Benzile G sunt echivalente cu benzile Q fluorescente. Pentru evidentierea benzilor G, tehnica frecvent folosita este hidroliza enzimatica urmata de colorare cu Giemsa (Dutrillaux 1971). Prin metoda Dutrillaux, cromozomii apar cu aditia discontinua a colorantului Giemsa. O alternanta de benzi intens colorate si benzi palide sau foarte slab colorate (sau chiar decolorate). Colorarea neuniforma a cromozomilor ar fi determinata de reconsctructia" diferentiala a ;romozomilor dupa distorsionarea (cauzata enzimatic) prin mutarea ;ationilor, sau de alterarea" diferentiata a complexului ADN- histone. Benzile G apar in zonele unde exista o cantitate mare de ADN repetitiv jogat in A-T cu grad ridicat de pliere a fibrilei de ADN si bogata in lecvente repetitive LINES. In aceste regiuni cromatidice replicarea ADN-ului este tardiva in tadiul interfazic S. Constrictiile secundare de pe cromozomii 1, 9 si 16 sunt benzi G lozitive, dar Q negative. Sunt cercetatori care considera ca benzile G sunt urmarea stabilizarii au extractiei unor proteine acide. Daca adaugam actinomicina D cu cateva re inainte de obtinerea preparatelor cromozomale, apar benzi G, fara alt atament de fixare. Actinomicina nu reactioneaza cu histonele, dar se leaga e ADN in faza interfazica G2 a ciclului celular, cand cromozomii se regatesc pentru condensarea premeiotica sau premitotica. Exceptie de la yidentiere pentru benzi G este cromozomul Y.

1.2.3. Benzile C
Benzile C reprezinta sctructurile cromatidice unde este localizata ;terocromatina constitutiva. Primii care au evidentiat si analizat benzile C i fost Amighi-Hsu (1971) si Yunis si col. (1971). In functie de tehnica folosita cromozomii sunt supusi unui tratament nic (mediu puternic alcalin) sau unui tratament termic, urmat de o ilorare cu Giemsa.

157

In prima etapa dupa denaturarea termica sau ionica a ADN-ului urmeaza renaturarea ADN-ului satelit. ADN-ul moderat repetitiv si nerepetitiv nu se renatureaza imediat. Aparitia benzilor C presupune o separare hidrolitica a bazelor purinice urmata de-o eliberare de tip p a partilor depurinizate in timpul tratamentului termic. Studiul benzilor C scoate in evidenta: continutul de ADN satelit; evidentiaza crossing-overul inegal intre cromozomii omologi si meioza; evidentiaza segmentul extins de heterocromatina centromerica spre bratul q al cromozomului 1, 9 si 12. evidentiaza segmentul extins de heterocromatina in zona distala a bratului q si o banda subtire in zona centromerului pe cromozomul Y; metoda de analiza in hibridarea celulara om-soarece.

11.2.4. Benzile R (reverse)

Benzile R se obtin prin denaturarea termica moderata si colorarea cu acridin orange. Sunt reversul benzilor G si Q. Benzile R evidentiaza situsurile ADN bogate in G-C. Metoda de evidentiere a benzlior R a fost elaborata de Dutrillaux si Lejeune(1971). S-a observat ca olicomicina, cromomicina A, sau nitromicina, introduse in mediul de cultura indue aparitia benzilor R. Benzile R evidentiaza zonele eucromatice cu densitatea" cea mai mare de gene informational active in timp ce zonele de heterocromatina sunt foarte colorate. In zona benzilor R replicarea ADN-ului este timpurie. Se recomanda analiza benzilor R pentru identificarea remanierilor cromatidice in zonele terminale ale cromozomilor.

158

11.2.5. Benzile T (telomerice)

Folosind o tehnica modificata de identificare a benzilor R, Dutrillaux (1973) a observat ca sunt evidentiate numai telomerele bratelor cromozomului. Principiul metodei modificate este urmatorul: supusi cromozomii metafazici tratamentului termic puternic si colorare cu acridin orange in ultraviolete (UV) cromozomii au coloratia slab portocalie, iar telomerele apar colorate fluorescent - verzui, a caror intensitate este variabila de la un cromozom la altul, de la un individ la altul si care se transmit mendelian. Benzile T reprezinta fractia de ADN-R cea mai rezistenta la tratamentul termic puternic. Metoda de analiza a benzilor T serveste pentru identificarea rearanjarilor telomerice ca translocatii terminale intercromozomice, translocatii roberstoniene, prezenta cromozomilor inelari, inversiile paracentromerice, anensomia de recombinare.

11.2.6. Benzile NOR (organizatori nucleolari)

Cromozomii acrocentrici din genomul celulelor umane, prezinta pe bratul scurt p" regiuni corespunzatoare organizatorilor nucleolari, regiuni unde, prin prezenta genelor specifice se sintetizeaza ARNr. Organizatorii nucleolari pot fi evidentiati prin colorare cu nitrat de argint (Goodpasture si Bloom, 1975; Howell si col. 1975, Deuton si col. 1976). Cu aceasta colorare, benzile NOR se prezinta cu o tenta galbena usor bruna.

12. Cromozomii si fazele ciclului celuiar

Morfologia cromozomilor in raport cu fazele ciclului celuiar, este studiata prin analiza imaginiior electronomicroscopice, autoradiografia cromozomilor marcati cu izotopi radioactivi, prin tehnici diferentiate de bandare, etc. Ca definitie, prin ciclul celuiar se considera ansamblul de modificari ce au loc in celula, dupa formarea sa prin diviziunea celulei mama si momentul cand aceasta celula finalizeaza, prin diviziune proprie, formarea adoua celule fiice fig. 42. 159

Mitoza SintGza ARN \"l Sinteza Sinteza proteicS ARN

Replicarea ADN S Sinteza redus3 de ARN si proteine Sinteza de histone

Fig.42 Ciclul celular

12.1.Cromozomii in interfaza ciclului celular

Interfaza este intervalul cuprins intre sfarsitul unei diviziuni si inceputul diviziunii celulare a ciclului celular. In interfaza ciclului celular, cromozomii nucleari formeaza cromatina nucleara. Deoarece cu fiecare ciclu mitotic sau meiotic cromozomii se individualizeaza in acelasi numar, talie, forma ce caracterizeaza specia, se considera ca in interfaza se pastreaza

160

mdividualitatea. In interfaza cromozomii sunt decondensati, au talia mai nare fata de metafaza mitotica, cu aspect filamentos si alungit. In interfaza cromozomii pastreaza" zone cu heterocromatina ;ondensata pe care, unii cercetatori le mai denumesc cromocentre. Dimensiunea si numarul cromocentrelor interfazici difera de la o specie la klta. La om in interfaza, condensat" heteropicnotic, este cromozmul ;exual X, in celula somatica la femeie. Forma condensata" este cunoscuta iub denumirea de corpuscul Barr sau cromozom X inactivat interfazic. In interfaza, datorita spiralizarii si condensarii foarte reduse, rrosimea fibrilei elementare de ADN-histone este de aproximativ 100 A (10 lm), iar in unele regiuni fibrila avand si grosimea de 2-3 nm (Tanaka si col. 974). Evenimentul major al cromozomilor interfazici este replicarea iparatului genetic, respectiv ADN-ul. La inceputul interfazei fiecare romozom este monocromatidic, dar dupa replicarea semiconservativa a VDN, cromozomii devin dicromatici (vezi morfologia cromozomilor) Interfaza se subdivide in trei stadii : (fig.42) stadiul Gl; stadiul S; stadiul G2.

2.1.1. Stadiul Gl
Este stadiul care urmeaza dupa terminarea ciclului mitotic, rezultand elulele fiice. Durata stadiului Gl variaza in raport cu tipul de celule somatice :udiate (Tabel VIII). abel VIII. Perioada stadiilor interfazice la om in raport de tipul de celula nalizata.
Tipul de celule Cultura limfocitara (sange periferic) Cultura fibroblasti embrionari Cultura celule HLA G1 4,60 11,00 8,00

s
9,60 12,70 6,00

G2 3,50 8,00 5,00

Total ore 17,70 31,70 19,00

161

La mamifere si om, stadiul Gl variaza, in medie, intre 5-10 ore, exceptand celulele canceroase la care stadiul este foarte scurt sau absent. a) Sintezele in stadiul Gl. La inceputul stadiului Gl, cromozomii sunt moncromatidici continand o cantitate de ADN caracteristic speciei. Fiind celula somatica, cu numar diploid de cromozomi, cantitatea de ADN este 2n (fig.43). La om sunt 46 cromozomi prin dispunerea, in tandem (contiguitate), a cromozomilor. In acest stadiu se sintetizeaza ARNm care asigura producerea de proteine necesare cresterii celulare. In Gl nu are loc sinteza de ADN. El fiind denumit si stadiul de presinteza sau preduplicare a ADN-ului.

12.1.2. Stadiul S
Cu o durata de 5-10 ore; se caracterizeaza prin replicarea totala a ADN-ului cromozomial, rezultand o cantitate dubla de ADN (4n) in cursul acestui stadiu. In celulele eucariotelor replicarea este orientata, bidirectionala si semiconservativa (vezi sinteza ADN-ului). In stadiul S replicarea ADN-ului din cromozomii eucariotelor, se realizeaza in aproximativ 400 minute, ceea ce arata ca replicarea se face, simultan in mai multe situsuri. Daca sinteza nu s-ar declansa simultan in mai multe situsuri si avand in vedere cantitatea de ADN din celula somatica umana ar fi trebuit sa se replice, in totalitate, in aproximativ 14 zile.

162

cantitate ADN

G1

G2

G1

Fig.43 Cronologia ciclului celular

12.1.3. Stadiul G2
Se caracterizeaza prin incetinirea sintezei histonelor si incetarea sintezei ADN-ului din cromozomi. Are o durata de 4-5 ore. Stadiul G2 incepe dupa ce sinteza ADN-ului cromozomial este completa. In acest stadiu persita sinteza ARN, desi cantitatea de ADN este dublata. Stadiul G2 pregateste celula pentru mitoza.

12.2.Cromozomii mitotici
Mitoza distribuie egala cantitatea de ADN intre cele doua celule fiice care vor rezulta dupa incheierea telofazei (fig.44).

163

A.

B.

C.

D.

4f c

E.

F.

Fig. 44 Fazele ciclului mitotic reprezentare schematica Mitoza intereseaza toate elementele nucleare (cariodiereza) si toate elementele citoplasmatice (citodiereza).

164

12.2.1. Profaza
Durata profazei este de 10-15 minute, dupa aspectul si structura" cromozomilor, profaza se subimparte in: a) - Profaza timpurie : cromozomii sunt inca filamentosi si subtiri, cu distributie neuniforma in nucleu. In profaza timpurie se observa la microscopul electronic o usoara infasurare (spiralizare) intre cromatidele surori. b) - Profaza tarzie: cromozomii devin mai scurti, mai grosi si rigizi (drepti). Incep a se distinge elementele morfologice ale cromozomilor: centromerul, constrictiile secundare si satelitii pe acrocentrici.

12.2.2. Metafaza
Este faza care urmeaza profazei cu o durata de aproximativ 23-35 minute. Cromozomii sunt mult ingrosati si scurtati datorita formarii supersuper-helixurilor" buclelor si rasucirii fibrilei elementare a ADN+histone. In metafaza, cromatidele surori ale fiecarui cromozom sunt clar delimitate, iar cromozomii sunt bine individualizati. Dupa ruperea anvelopei nucleare si formarea fibrelor fusoriale, cromozomii dicromatidici migreaza catre planul ecuatorial al celulei, dispunandu-se perpendicular pe fibrele fusoidale, formand placa ecuatoriala sau metafazica.

12.2.3. Anafaza
Cu o durata de 5-8 minute, cromozomii se cliveaza in plan longitudinal, clivajul ecuational cand cele doua cromatide se separa. Fiecare cromatida, dupa clivajul ecuational, devine autonoma si se transfonna in cromozom monocromatidic independent. Dupa separare, cromozomii, monocromatidici incep sa migreze, in numar egal, spre cei doi poli ai :elulei.

165

12.2.3. Telofaza Incepe dupa ce cromozomii au migrat spre polii celulei. In cele 20 minute cat dureaza telofaza, cromozomii se regrupeaza in evantai intr-o masa, compacta heterocromatica. Incepe procesul invers fata de cum s-a derulat in profaza. Cromozomii incep a se decondensa, devin filamentosi, contur difuz. Tot in telofaza are loc citodiereza, respectiv separarea citoplasmei in doua jumatati, fiecare continand cate un nucleu cu numar 2n (diploid) de cromozomi monocromatidici. In finalul telofazei rezulta doua celule fiice identice intre ele si identice cu celula mama.

13. Cariotipul uman normal

Cromozomii individualizati in mitoza sau meioza, prezinta in metafaza mitotica o morfologie care permite o analiza de identificare (fig. 45). In raport de talie, morfologie si prin tehnici de bandare, cromozomii pot fi identificati in cupluri omoloage si ordonati in cariotip. Perfectand tehnica culturilor celulare, Tjio si Levan (1956), au stabilit ca in celula somatica diploida omul are 46 cromozomi (numar normal, caracteristic speciei Homo sapiens). In 1971, s-a trecut la analiza cromozomilor folosindu-se tehnici de bandare (Paris, 1971) Analiza cromozomilor metafazici se face pe celule recoltate din tesuturile cu potential mitotic ridicat, sau in culturile celulare. In metafaza ciclului mitotic cromozomii sunt dicromatidici, bine delimitati si individualizati, motive pentru care analiza cariotipului este recomandata in aceasta faza

166

Mi to/a premeiotica

Ultima faza S a replicarii ADN

,eptoten

Zygoten

Fazele mcio/ci Cromo/omi matcrni: alb Cromozomi paterni: ncgru

Fig. 45 Schema cu fazele meiozei Examenul citogenetic care grupeaza un ansamblu de metode si tehnici, permite studiul cromozomilor pentru citodiagnostic in cazul copiilor nascuti cu multiple malformatii congenitale, de a stabili cauza unor

167

esecuri de reproducere, de a identifica aberatiile cromozomiale embrio-fetale in cazul avorturilor spontane, etc. Examenul citogenetic contribuie la o mai buna cunoastere a hartilor cromozomale la om, la intelegerea cat mai corecta a mecanismelor genetice in oncogeneza si imunogeneza, la stabilirea filiatiei genetice, sau in antropologia genetica si antropogeneza. Criteriile de intocmire si analiza a cariotipului respecta principiile de identificare si codificare stabilite la Denwer (1960), Lonrda (1963), Chicago (1966) si cele de la Paris (1971).

13.1. Recomandarea analizei cariotipului la om

Deoarece metodele de analiza sunt neeconomice (costisitoare), necesita timp indelungat pentru a se obtine rezultatul si un personal specializat si aparatura corespunzatoare, se impune o selectie" a cazurilor clinice supuse unei astfel de investigatii. a) Examenul prenatal - Datorita posibilitatii de recoltare a lichidului amniotic, in care se gasesc celule provenite de la embrio-fat, se poate analiza citogenetic, genomul produsului de conceptie. Criteriile care impun examenul citogenetic prenatal sunt: - varsta inaintata a persoanei gestante (primi geste, primi - para. De exemplu Golbus si col. (1981) apreciaza ca sindromul Down este de 0,9% pentru copii nascuti din mame primigeste - primipare in jurul varstei de 35 ani si de 5,5% la cele peste 43 ani; - riscul de recurenta in familia unde s-a nascut copil cu aneuploidie; - cand un membru din cuplul parental prezinta o modificare in structura si morfologia unui cromozom. De exemplu Thompson (1986) apreciaza, ca riscul teoretic, este de 50% de a se naste cu copil cu cariotip dezechilibrat" daca unul din genitori prezinta modificari cromozomale; -stabilirea sexului genetic al fatului b) Examenul postnatal - ca prioritati sunt urmatoarele: - analiza citogenetica a nou - nascutului cu multiple morfo si histodisplazii; - ambiguitate gonadica - hermafroditisml - deficiente de crestere postnatala, retard psiho-neurologic; - adolesenti cu un aspect impuber cum ar fi atrofia testiculars ginecomastia la baieti, deficiente in dezvoltarea caracterelor sexuale secundare; - in tulburari grave de comportament; 168

- la cuplurile cu infertilitate sau sterilitate fara cauze clinice; - la cuplurile cu repetate esecuri de reproducere, pierderi zigotice (avorturile" menstruale), sau cu avorturi spontane repetate; - persoanele iradiate accidental sau terapeutic, sau supuse timp indelungat unui climat cu noxe chimice poluante (boli profesionale), dupa ingerare de medicamente cu efecte secundare severe (efecte cancerigene).

14. Replicarea cromozomilor umani

Functia de conservare (sincronica) si transmitere a informatiilor genetice in succesiunea generatiilor celulare, sau a indivizilor din populatie, este asigurata de capacitatea de autoreplicare a cromozomilor din genomul celular. Replicarea cromozomilor este determinata de structura moleculara ADN, care prin replicarea semiconservativa si dublare cantitativa, se repartizeaza egal in cele doua cromatide. Watson si Crick, dupa ce au stabilit structura in dublu helix si capacitatea de replicare a ADN-ului, au sugerat ca si cromozomii se replica semiconservativ. S-a demonstrat ca in stadiul S interfazic, cromozomii se replica semiconservativ. Citologic, replicarea cromozomilor a fost demonstrata prin urmatorele metode: - metoda elaborata de Taylor (1957) de analiza autoradiografica prin marcarea cromozomilor cu timidina tritiata (3H); prin folosirea 5-bromdezoxiuridina (BrdU) si analiza cromozomilor.

14.1. Experimentul Taylor

Taylor (1957) a lucrat pe planta Vicia faba (bobul) cultivata pe un mediu marcat cu timidina tritiata, precursor ce poate fi incorporat in structura ADN-ului in timplul replicarii semiconservative (fig 46). In mediul marcat cu 3H (mediu cald") se introduce radacina plantulelor de V.faba, unde vor fi tinute aproximativ 8 ore (timp pentru o singura replicare a ADN-ului, respectiv a cromozomilor). Replicarea semiconservativa se deruleaza in stadiul S interfazic al ciclului celular.

169

Dupa 8 ore in mediul marcat, plantele sunt scoase, se spala radacina pentru indepartarea aderentelor de suprafata a substantei radioactive. Din varful radacinilor se recolteaza un esantion celular, care, dupa tratare cu colchicina si socul hipotonic vor fi supuse analizei autoradiografice. Urmeaza trecerea plantelor, crescute in primul mediu cald" pe al doilea mediu, care este rece", respectiv lipsit de precursori marcati cu timidina tritiata. Dupa 8 ore se scot din mediul doi si tree pe mediul trei, tot rece". La fiecare generatie de 8 ore, pe mediul doi si trei se recolteaza cate un esantion celular, colchicinizat si supus socului hipotonic, se analizeaza autoradiografic. Taylor a folosit pentru analiza trei esantioane celulare, care reprezinta trei generatii de celule provenite de la plantulele de V. faba crescute pe respectivele medii de cultura. Din analiza autoradiografiei s-au obtinut urmatoarele date (fig. 46): Primul esantion celular (prima generatie) prezinta: - Toate placile metafazice marcate cu timidina tritiata; - Toti cromozomii din placa metafazica marcati; - Ambele cromatide ale fiecarui cromozom marcat; Deci un marcaj de 100%. Al doilea esantion celular ( a doua generatie de celule) prezinta: - Toate metafazele marcate cu timidina; - Toti cromozomii metafazici marcati; - Analizat fiecare cromozom, va prezenta o cromatida marcata cu timidina tritiata, a doua cromatida nemarcata. Al treilea esantion celular (generatia a treia) se prezinta autoradiografic: - Fiecare metafaza jumatate din numarul cromozomilor din genom cu ambele cromatide nemarcate, jumatate din numarul de cromozomi componenti marcati; - Fiecare din cromozomii marcati prezinta o cromatida marcata cu timidina tritiata si o cromatida nemarcata.

170

Prereplicare cu timidina

Marcate 100%

Marcate 50%

Marcate 50% si Nemarcate 50%

Fig .46 Experimental Taylor de a demonstra natura semiconservativa de replicare a ADN in cromozomi (dupa Clark si Wall, 1992). Dupa Taylor aceste rezultate sunt posibile numai prin replicarea semiconservativa a cromozomilor ca rezultat al replicarii semiconservative a ADN-urilor din structura lor si repartizarii egale a ADN-ului in cele doua cromatide. Rationamentul lui Taylor este urmatorul: (1) - Celulele din radacina plantulelor de Vicia faba, inainte de a fi crecute pe mediul cald" marcat cu timidina tritiata, au moleculele de ADN cu ambele catene nemarcate (vezi sinteza ADN). In mediul marcat, ADN-ul din fiecare cromozom, in stadiul S interfazic incepe sa se replice semiconservativ. Prin separarea celor doua monocatene, fiecare va servi ca tipar (matrita) pentru sinteza noilor catene (complementare), prin acest mecanism cu timidina tritiata, datorita incorporarii respectivului nucleotid in structura moleculei de ADN. Dublandu-se cantitatea de ADN, in stadiul S incepe si cromozomul, care initial este monocromatidic, sa se replice semiconservativ pentru a repartiza egal moleculele de ADN in cele doua cromatide. Dar moleculele de ADN fiind marcate, prin repartitia egala si cele doua cromatide vor fi marcate. Aceasta imagine autoradiografica demonstreaza ca cele doua cromatide sunt indentice prin continutul de ADN care a rezultat prin replicare semiconservativa. 171

In concluzie, in esantionul unu toate metafazele au cromozomii marcati si ambele cromatide marcate. Analiza celulelor din esantionul doi reprezinta generatia a doua de celule, cand toti cromozomii metafazici sunt marcati dar fiecare cromozom cu o cromatida marcata si a doua nemarcata ; rationamentul este urmatorul: Inainte de a fi introduse in primul esantion ADN cromozomal avea ambele catene nemarcate. Introduse plantulele in mediul cald" prin replicarea semiconservativa, fiecare molecula ADN va avea o catena marcata, a doua nemarcata. Are loc clivajul ecuational al cromatidelor, care devin cromozomi monocromatidici, fiecare cromozom continand ADN cu o catena, marcata, una nemarcata. In generatia a doua, celulele puse in mediu nemarcat, in stadiul S. ADN-ul se replica semiconservativ. Prin separarea catelenor una marcata, a doua nemarcata si servind ca matrita, noile catene vor integra in structura lor nucleotide nemarcate. Ca urmare vor rezulta doua molecule: una marcata (catena provenita cu marcare de la prima generatie celulara), a doua molecula total nemarcata. Cum cromozomii metafazici din celulele generatia a doua, prezinta o cromatida marcata, a doua total nemarcata, explica repartitia moleculelor de ADN in cele doua cromatide, rezultat al replicarii semiconservative: intr-o cromatida se repartizeaza molecula de ADN marcata, in a doua cromatida, ADN nemarcat. Acelasi rationament si pentru esantionul celular generatia a treia. In concluzie replicarea cromozomilor se desfasoara in baza replicarii semiconservative a ADN-ului component. Acest mecanism, consemnat si la nivel cromozomial demonstreaza rolul cromozomilor in dinamica celulara, de a asigura transmiterea informatiei genetice de la o generatie celulara la generatiile care succed. Se asigura functia de ereditate ( sincronica). Confirmarea si demonstrarea ca replicarea cromozomilor este semiconservativa are loc in stadiul S interfazic; s-a realizat prin metoda fuziunii celulare. De exemplu: fuzionand o celula in stadiul G2 interfazic, cu o celula in metafaza mitotica, cromozomii incep sa se individualizeze in G2, sa se hipercondeseze cu delimitarea celor doua cromatide ale fiecarui cromozom; daca se fuzioneaza o celula in stadiul Gl cu o celula in metafaza, cromozomii in G2 se condenseaza si se individualizeaza, dar vor prezenta o singura cromatida. Concluzia este ca replicarea cromozomilor eucariotici are loc intre stadiul Gl si G2, adica in stadiul interfazic S. Ori replicarea ADN-ului are 172

loc tot in stadiul S. Ca urmare, replicarea cromozomilor se desfasoara semiconservativ in stadiul S, pe masura ce se dubleaza cantitatea de ADN prin replicarea proprie. Prin acest mecanism, cromozomii asigura transmiterea integrala a informatiei genetice de la celula mama spre celulele fiice, deci continuitatea genetica a materialului ereditar, conservarea informatiei in succesiunea generatiilor celulare.

14.2. Cromozomii se replica asincron

Stadiul S, are durata de 6-8 ore, iar timpul necesar pentrti sinteza unei molecule de ADN este de cateva minute. Daca sinteza moleculelor de ADN si a cromozomilor s-ar desfasura uniform, o replicare sincrona, timpul necesar pentru sinteza totala a ADN-ului din genom ar fi de ordinul minutelor. Insa datele experimentale au stabilit ca sinteza ADN-ului si replicarea semiconservativa a cromozomilor sunt asincrone, necesitand un interval de timp de aproximativ 6-8 ore pentru totala replicare a cromozomilor din genom.

14.2.1. Asincronia inter- si intracromozomala

Autoradiografic s-a stabilit comportamentul cromozomilor in stadiul S interfazic, momentul cand se declanseaza replicarea, mecanismul si timpul necesar, stadiului S pentru replicarea semiconservativa a tuturor cromozomilor din genom. Rezultatele confirma asincronia de procesare si timp, in replicarea cromozomilor din genomul celular. De exemplu, in culturile limfocitare umane s-au observat urmatoarele diferentieri: cromozomul 1: telomerele si segmentele de eucromatina incep replicarea la inceputul stadiului S. In segmentele distale ale bratelor si zona pericentromerica replicarea este tarditva, iar constrictiile secundare replica spre sfarsitul stadiului S. Cromozomul 2 - incepe replicarea mai tarziu in stadiul S. Dar in timp ce zona pericentromerica incepe replicarea, telomerele o sfarsesc.

173

Cromzomul 3 - in general, replica tardiv. Replicarea incepe de la telomere si progresiv, inainteaza spre centromer. Cromozomii 4 si 5 - replica tardiv. In momentul initierii replicarii pe bratele q, procesul este mai rapid si de scurta durata, iar bratele p replica incet. Cromozomii 6-12 - au comportament asemanator intre ei prin desfasurarea replicarii, ca proces, evolutie si timp. Cromozomii 13-15 - Cromozomul 15 replica la inceputul stadiului S, iar cromozomul 13 spre finalul stadiului (foarte tardiv). Cromozomul 14 incepe replicarea cand o sfarseste cromozomul 15 si o termina cand se initiaza replicarea pe cromozomul 13. Cromozomii 16-18 - cromozomul 17 replica la inceputul stadiului S, cromozomul 18 la sfarsit, iar cromozomul 16 la mijlocul timpului stadiului S. Cromozomii 19-20 - replicare timpurie. Cromozomii 21-22 - replicare timpurie. S-a mai constatat ca desfasurarea in timp a replicarii ADN-ului nu este conditionata de talia cromozomilor. De exemplu perechile 1 si 2 cu talie mare replica mai rapid fata de cromozomii 13, 16 si 21, cromozomi cu talie medie si foarte mica. Diferente sunt consemnate intre cromozomii 1 si 2: cromozomul 2 incepe replicarea dupa ce la cromozomul 1 procesul este in plina desfasurare. Desi cromozomul 2 incepe mai repede decat cromozomul 1 replicarea, o termina mai repede. Diferente in ritmul si timpul de replicare apar in functie de tipul celulei. Pentru cromozomii sexuali X si Y, replicarea este tardiva. De exemplu, cromozomul X heteropicnotic (corpuscul Barr) initiaza replicarea la 2 ore si jumatate dupa initierea replicarii pe autozomi. Stabilirea si cunoasterea asincroniei replicarii semiconservative a cromozomilor are importanta deosebita in aprecierea interferentei proceselor cu actiunea dereglanta indusa de agentii potentiali mutageni (a se vedea mutageneza).

174

15. Polimorfismul cromozomilor umani

Se apreciaza ca aproximativ 5-7% dintre indivizii conspecifici se diferentiaza prin minim o particularitate morfologica sau arhitecturala a cromozomilor din genom. De exemplu daca luam ca elemente de reper, bandarea sau fluorescenta cromozomilor putem aprecia un accentuat polimorfism cromozomial de pana la 50% indivizi din populatie. Elementele care stabilesc criteriile de polimorfism cromozomial in genomul indivizilor din populatie sunt: constrictiile secundare: extindere, aditia colorantilor in respectivele zone (Krag - Obsern, 1980) variatii ale satelitilor: dimensiune, proeminenta, distanta de centromer, sateliti dubli sau in tandem, absenta lor; lungimea bratului p" la acrocentrici (Waditu si col. 1980); variatii de aditie a colorantilor pe segmente cromatidice sau a gradului de fluorescenta (Simi si Tursi, 1982) lungimea bratului q a cromozomului Y. Un polimorfism accentuat este consecinta replicarilor aditionale, a inversiilor, duplicatiilor, deletiilor, translocatiilor (Prokofieva -Belgovskaia, 1977). Dupa Verma (1983) se crede ca variantele morfologice ar fi implicate in procese ca : riscul non-disjunctiei cromozomilor (ex. acrocentrici lor), translocatiile robertsoniene etc. Polimorfismul fiziologic este distinct de polimorfismul mutational.

175

16. Mecanismele si factorii implicati in evolutia genomuiui uman

Informatiile aduse de genetica si datele oferite de genetica populatiilor au deschis cai noi pentru descifrarea si interpretarea mecanismelor antropogenetice si evolutia bio-genetica a speciilor. Daca ne limitam la clasa hominidelor (si om), afirmam ca dispunem de probe care evidentiaza schimbari esentiale in structura si numarul cromozomilor, considerate mecanisme genetice in antropogeneza. Studiile incepute in 1962 de Chlarelli, au fost reluate, extensiv si intensiv in 1972-1973 de cercetatori ca Grouchy, Turleau, Pearson, Babrow, s.a., gratie perfectionarii tehnicilor si metodelor de studiu citogenetic.

16.1. Comparatie intre genomul uman si al pongidelor

Turleau (1972), Grouchy (1972, 1975) intr-un studiu comparat, constata semnificative diferentieri de structura, morfologie si numar intre cromozomii umani si ai pongidelor (in special Pan troglodytes -cimpanzeu). Ca diferentieri cromozomice consemnam: datorita absentei segmentului cromatidic ql, pe cromozomul uman apare constricita secundara care lipseste la cimpanzeu. Deasemenea pe bratul cromozomului 1 uman lipsesc benzile q2i si q22- La cimpanzeu sunt prezente; prin analiza benzilor, s-a constatat ca benzile Q si G de la cromozomul 2 uman corespund, prin numar, dimensiune cu cele consemnate la perechea 2 de cromozomi omologi la cimpanzeu. Grouchy (1972), considera ca la om, cromozomul 2 s-a format prin dispunerea in tandem la nivelul telomerelor bratelor p, a celor doi cromozomi din cuplul omolog 2 (translocatie robertsoniana). Prin aceasta translocatie robertsoniana, s-a redus numarul de cromozomi la 46 (numar total) cat are omul actual, fata de 48 cromozomi la Pan troglodytes (cimpanzeu). Lejeune (1970, 1973) considera aceasta fuziune centromerica un mecanism important in speciatia" cromozomala.

176

De exemplu, prin translocatia 2p si 2q a cromozomilor de cimpanzeu, la cromozomul 2 uman apare o lacuna.

16.2. Factori etiologici implicati in evolutia genomului uman

Ca factori etiologici primordiali in evolutia cromozomilor umani sunt remanierile de tip mutational, cu efecte comportamentale si aparitia de noi caractere exprimate fenotipic. Dintre factorii etiologici in evolutia cromozomilor umani mentionam: a) Efectele induse de remanierile cromozomiale sunt in raport direct cu numarul indivizilor din populatie care au suportat remanierile cromozomale, cu distanta intre generatiile care au succedat. De exemplu, la Homo sapiens frecventa inversiilor pericentrice este de 0,16 x 10" . Stabilirea starii de homozigotie este urmarea directa a remanierilor cromozomale care se produc in raport cu starea de homogamie1 a populatiei. Frecventa remanierilor si realizarea starii de homogamie este invers
17

proportionala cu dimensiunea" unei populatii panmictice . In populatiile mici homogamia (consangvinitatea) este mai frecventa, deci si evolutia cromozomilor este rapida. Specia Homo sapiens, reprezentata de o populatie cu numar foarte mare de indivizi, prezinta, la fiecare generatie remanieri cromozomale frecvente (modificari de structure, morfologie si functie). Deoarece la om coeficientul de cosangvinitate fiind foarte redus valoric, posibilitatea ca remanierile sa ajunga la stadiul de homozigot" pentru cuplul de cromozomi omologi, este foarte mica. Exceptie il face incestul sau izolatele umane. b) Un factor care influenteaza evolutia cromozomilor la om este rata mutatiilor si patologia" genica. Exemplu care conflrma rata mutatiilor ^enice, ca factor in evolutia" cromozomilor, sunt in patologia umana: lanismul telangiectazic si ataxia telangiectazica (ataxia cerebrala
1

Populatie homogama - populaia realizata prin incrucisarea indivizilor de sexe opuse, dar u asemanari fizice, psihice, genetice si cu un stramos comun. " Populatia panmictica - populatia a carei membri componenti se incruciseaza aleatoriu: -ira selectie preferentiala, fara mutatii, fara un stramos apropiat, comun (nu onsangvinitate).
177

progresiva, cu deficiente imunologice - Ig A- si oculo-cutanate). Este cauza genetica determinata de instabilitatea cromozomala prin deficienta endonucleazei ce favorizeaza remanieri cromozomale de tipul: translocatia 14ql2 pe cromozomul 7 din genom, sau segmentul respectiv translocat pe cromozomul omolog 14. Remanieri cromozomale si o rata crescuta a mutatiilor cu efecte deviante" in fentotip apar si in infectiile virale. In familiile consangvine riscul de homozigotare, prin remanieri cromozomale, este foarte crescut. c) Gradul crescut de consangvinitate favorizeaza un coeficient ridicat de homozigotare prin remanieri genice si cromozomale. Efectele sunt: aparitia de noi caractere fenotipice, care se fixeaza usor in genom si devin transmisibile.

Consangvinitatea accelereaza mecanismele genetice in evolutia speciilor, prin: - trecerea in stare homozigota a genelor cu aparitia de situsuri care indue rupturi cromozomale; - formarea rapida a caracterelor noi, cauzate de genele recesive rare; - cumularea efectelor compartimentale a remanierilor cromozomale cu aparitia de noi caractere.

16.3. Mecanisme in evolutia cromozomilor

(1) Primii care au stabilit ca inversiile pericentrice sunt remanierile structurale cele mai frecvente in evolutia cromozomilor umani au fost Grouchy si col. (1972). Concluzia lor se bazeaza pe studiile de citogenetica comparata intre Homo sapiens si Pongidele actuale. Ei au consemnat atat inversii pericentrice cat si paracentrice, a caror valoare sunt: a) Inversii pericentrice: - intre Homo sapiens si Pan troglodytes - 6 inversii; - intre Homo sapiens si Gorilla - 8 inversii; - intre Homo sapiens si Pongo - 7 inversii. b) Inversii paracentrice (mai rare): - Homo sapiens fata de Pan paniscus - inversie la cromozomul 7; - Homo sapiens fata de Gorilla - doua inversii la cromozomii 7 si 16; 178

- Homo sapiens fata de Pongo - trei inversii la cromozomii 7, 10, 17. Aceste inversii s-au produs pe un segment cromatidic relativ scurt. (2) Translocatiile - Un alt mecanism observat de Grouchy in evolutia cromozomilor sunt translocatiile. Desi la Homo sapeins sunt frecvente, in general, raportata ca element citogenetic, comparatie cu Pongidele, s-a constatat o singura translocatie majora intercromozomala. La om este translocatia intercromozomala prin fuziunea telomerica 2p si 2q care la Pan paniscus reprezinta un cuplu de cromozomi 2 omologi (translocatie robertsoniana). (3) Translative reprezinta un mecanism in evolutia cromozomilor umani. De exemplu: - banda q 13 de la cromozomul 11 de la Pongo este prezenta si pe cromozomul 11 la Homo; - la Pongo pe bratul scurt al cromozomului este banda pi3, prin translatie, la Homo o intalnim pe bratul q al cromozomului 20, probabil intre qll si ql2.

16.4. Efectele remanierilor asupra structurii cromozomilor

a) Efecte cantitative. La Homo Sapiens duplicatia sau deletia unui segment cromatidic are efect morbid sau letal asupra indivului afectat. In consecinta, se apreciaza ca deletia si duplicatia au jucat un rol minor in evolutia cromozomilor de la Pongide la Homo. b) Efecte compartimentale - Modificarea structurii cromozomilor deregleaza meioza datorita neomologiei pe segmente cromatidice intre cromozomii omologi. De exemplu remanieri de tipul translocatiei echilibrate sau aneusomia'3 recombinarilor (recombinari complexe sau efecte intercromozomale) due la diminuarea fertilitatii. Aneusomii cu efecte compartimentale intracromozomice la Homo Sapiens sunt: inversiile pericentrice (mecanism de remaniere foarte activ), translocatiile.

13

Aneusomie - orice modificare de structura sau de numar a cromozomilor din genom. 179

c) Efecte asupra fenotipului - Remanierile echilibrate nu modifica fenotipul individului purtator. Ca remanieri echilibrate, translocatiile, pot fi reciproce, tralslocatie, prin fuziune centrica, insertii. Sunt si translocatii reciproce care indue modificari fenotipice. De exemplu, translocatia reciproca intre cromozomul X si un autozom, care determina monozomia partiala a autozomului. Insertia poate determina gruparea unor gene, care, normal, se gasesc la mare distanta pe cromozomi. Inversia pericentrica modifica secventa de citire a mesajului inscris in gene. Fuziunea telomerica a doi cromozomi, perturba reglarea respectivelor gene, daca citirea codificata se face de la centromer spre telomer.

16.5. Ipoteze asupra mecanismelor evolutiei cromozomilor la om

Evolutia cromozomilor implica un mare numar de mecanisme. Se pare ca remanierile cromozomale in evolutia genomului, sunt dependente de structura, ultrastructura si morfologia cromozomilor. a) Ipoteza sintezei de material nou sau pierdere de material. Studiile citogenetice comparate intre Homo si Pongidae, au evindentiat ca spre deosebire de Pongidae, la Homo apar benzi Q terminale pe bratui p", iar la bratui q" lipsa benzilor Q terminale. Deasemenea apar diferentieri de localizare a heterocromatinei, precum si aparitia benzilor Q juxtacentromerice la cromozomii umani. Grouchy mentioneaza ca bratui p al cromozomilor acrocentrici prezinta o regiune heterocromatica, care formeaza sateliti a caror dimensiune este variabila (la om pe cromozomi 13, 14, 21, 22). Dupa Grouchy, acesti sateliti ar fi rezultatul sintezei de novo" de material genetic, sau consecinta duplicarii unei benzi, deja existenta pe bratui scurt p". Heterocromatina si regiunea telomerelor sunt zone cromatidice unde pot avea loc remanieri structurale datorita localizarii lor in raport cu centromerul. Se cunoaste ca centromerul si telomerele au rol important si determinant in replicarea normala a cromozomilor. b) Ipoteza schimbului neechilibrat de segmente cromatidice intre cromozomi . In profaza primara a meiozei reductionale are loc un schimb echilibrat de material genetic prin crossing-over echilibrat (egal). Sunt insa 180

si cazuri cand se realizeaza schimb neechilibrat datorita unui crossing-over inegal realizat intre cromozomii omologi. c) Ipoteza modificarii formulei cromozomale, Modificarea formulei numarului de cromozomi se realizeaza prin reducerea sau crestera numarului de cromozomi in genomul celulei. Reducerea numarului de cromozomi din genomul organismului se poate realiza prin doua procese: malsegregarea, repartitia inegala a numarului de cromozomi intre celulele fiice rezultate din meioza si mitoza (exemplu este sindromul Turner la om); fuziunea centromerica si/sau telomerica. Malsegregarea, repartitia inegala a numarului de cromozomi, determina in finalul diviziunii obtinerea a doua celule fiice diferite prin numarul cromozomilor: celula monozomica, numar redus de cromozomi si celula trizomica cu un cromozom in plus. Monozomia unui cromozom autozom, sau prezenta in celula numai a cromozomului Y (lipsind cromozomul X), la om sunt cu efect letal. Cand monozomia este legata de pierderea unui cromozom X la femeie (ex. sindromul Turner , 45, X) are ca efecte pierderea unor activitati genetice care se exprima fenotipic prin: disfunctii, histodisplazii sau morfodisplazii. Fuziunea centromerica , descrisa pentru prima data in 1916 de Robertson, determina reducerea numarului de cromozomi in genom. Fuziunea telomerica. Exemplu cromozomul 2 uman provine din fuziunea telomerica a cromozomilor submetacentrici 2p si 2q de la Pan troglodytes, iar la locul fuziunii apare o lacuna. Cresterea numarului de cromozomi in genomul celular. Legat de cresterea numarului de cromozomi in genom s-au elaborat mai multe ipoteze. Formarea de noi cromozomi prin sinteza de material centromeric. Ipoteza neacceptata. Prezenta de structuri asemanatoare centromerului, rezultate din fuziuni intercromozomice precedente, in evolutia genomului. Prin separare, aceste structuri isi reiau functia centromerica. Achizitia de cromozomi prin malsegregare. Formarea microcromozomilor. Mecanism ce poate explica prezenta centromerilor si telomerele de rezerva". De exemplu, la om, prezenta unui microcromozom (in exces) poate fi transmis la descendenti. La copil microcromozomul mostenit se poate duplica, rezuitand doi microcromozomi, identificabili prin cuplarea lor in zigonemul profazei primare a meiozei. Microcromozomii nu indue modificari fenotipice 181

deoarece ADN-ul lor nu contine informatie genetica pentru a fi decodificata in ARNm. Prezenta lui in genom poate avea urmatoarele urmari: sa primeasca, prin translocatie echilibrata, un brat de la cromozomii cu centromer, devenind genetic functional.

16.6. Relatii intre structura si remanierea cromozomilor

- Localizarea constrictiilor secundare, rezultate prin remanieri cromozomale, pot produce modificari fenotipice majore. - Existenta situsurilor fragile pe cromozomii remaniati (exemplu pe cromozomii 10 si 14 la om). - Fisuri cromatidice la nivelul benzilor T si R, si inversii paracentrice (ex. cromozomul 7 uman). - Formarea unor structuri ce favorizeaza endoreduplicarea segmentului distal al cromozomului 2q, fuziunea sau translocatii intracromatidice.

17. Arhitectura si evolutia cromozomilor sexuali (gonozomii)

La Homo sapiens, specie cu reproducere sexuata, exista un cuplu de cromozomi, care, prin structura, morfologie si functii sunt diferiti de cromozomii autozomi. Sunt cromozomii sexuali sau gonozomii, care la barbat sunt reprezentati XY, la femeie XX. Acest cuplu, XX sau XY, se constituie in momentul fecundarii si constituirii zigotului reprezentand sexul cromozomial, genetic, al fiecarui subiect din populatia umana. Cromozomii X si Y, intervin in formula sexului genetic. Acesti cromozomi se caracterizeaza printr-un accentuat polimorfism, de talie, zone pseudoautozomale, grad de heterocromatinizare, etc. (fig. 47).

182

Fig. 47 Cromozomul X si Y (supersia prin crossing-over) - bandare enzimatica.

17.1. Arhitectura cromozomului Y.

Datorita rolului esential in conditionarea sexului genetic si somatic la barbati, este necesara o analiza deosebita a cromozomului Y. Ca talie, cromozomul Y este eel mai mic din genomul urnan, avand aproximativ 60 Mb, ceea ce reprezinta 2-3%, cantitate ADN din setul haploid. Prin folosirea tehnicilor de bandare, s-a observat ca acest cromozom Y, prezinta regiuni distincte in strcutura sa, cum sunt: regiunile pseudoautozomale PARI si PAR2, regiunile eucromatice si heterocromatice. Regiunile pseudoautozomale ale cromozomului Y le gasim in zona terminala (distala) a bratelor cromozomului. Acestea sunt: PARI in zona terminala a bratului scurt (p) si PAR2 in zona terminala a bratuiui lung (q). Cele doua regiuni pseudoautozomale insumeaza 2920 Kb, din care 2600 Kb PARI si320KbPAR2. S-a observat ca in profaza primara a meiozei reductionale, se poate realiza schimb de material genetic cu regiuni omoloage de pe cromozomul >exual X. Se apreciaza ca cele 2920 Kb din regiunile pseudoautozomale ar >rezenta 5% din totalul ADN-ului component al cromozomului Y. 183

S-a mai stabilit ca regiunea PARI a bratului scurt este importanta, asigurand fertilitatea masculina. Acesta observatie este urmarea efectului producerii de deletii in regiunea bratului terminal p". Si anume deletia acestui segment cromatidic stopeaza meioza, determinand azoospermia (Kostiner Dana, 1988). Cromozomul Y prezinta regiunile eucromatice si heterocromatice reprezentand 95% din ADN-ul cromozomului. (Foote si col. 1992). Sunt regiunile Y-specifice, denumite si NRY (Non Recombining Y). Regiunea eucromatica Y - specifica - este paracentromerica pe bratul q", in regiunea centromerica si in regiunea paracentromerica a bratului p". (Foote si col. 1992). Regiunea heterocromatica a cromozomului Y . Aceasta regiune este localizata in zona Yq distala si corespunde benzii cromozomale Yq^. Este considerata regiunea inerta" datorita inactivitatii de codare, este noncodanta, dar se caracterizeaza printr-un accentuat polimorfism, stabilit prin analiza markerilor genetici la indivizii conspecifici. Polimorfismul regiunii heterocromatidice este consemnat in banda Yqn si in regiunea centromerului, regiuni care contin secvente repetitive. Aceste secvente repetitive pot fi grupate in trei mari familii: DyZ^.Este familia la care unitatea repetitiva are 3,4 Kb. Aceasta familie ar insuma 4000-6000 secvente repetitive. DyZ2. Unitatea repetitiva are apfoximativ 2,1 Kb si ar contine aproximativ 2000 secvente repetitive. DyZ^ este ADN-ul satelit de tip alfoid, in regiunea pericentromerica a cromozomului Y. In structura moleculara a cromozomului Y se gasesc si doua clase de secvente repetitive si anume SINES( Short Interspersed Elements) si LINEs (Long Interspersed Elements), secvente care se gasesc si pe cromozomii autozomi. Clasa SINEs este reprezentata de secvente Alu. Secventele Alu de pe Y sunt inalt divergente in raport cu secventele Alu de pe autozomi. Clasa SINEs contine secvente de 300 pb, insumand intre 300.000 - 900.000 unititati repetitive. Clasa LINEs. Este reprezentata de o singura familie de secvente pe cromozomul Y uman - familia Kpn, a caror membri ocupa aproximativ 6,4 Kb. S-a stabilit ca in cromozomul Y aproximativ 50% este ADN cu secvente repetitive non-codante. Cartografierea cromozomului Y a evidentiat doua clase de gene care 184

insumeaza aproximativ 40 gene. Repartizarea in cele doua clase a avut drept criterii functiile respectivelor gene. Cele doua clase sunt: - genele derivate din perechea ancestrala de autozomi. Dintr-o pereche ancestrala de cromozomi autozomi au evoluat cromozomii sexuali X si Y. Respectivele gene, in copie unica, sunt intotdeauna exprimate ca functie si au alele omoloage pe cromozomul X. Aceasta clasa de gene este localizata in regiunea pseudo-autozomala a cromozomului Y; - gene achizitionate in cursul evolutiei. Achizitionarea noilor gene pe cromozomul Y s-a realizat prin mecanismul de translocatie de la autozomi. Sunt localizate in regiunea nerecombinativa genetic din cromozomul Y. Majoritatea genelor din aceasta clasa se gasesc in copii multiple. Numai gena SRY (Sex determining Region of the Y), care codifica proteine cu functie Jnductor morfogenetic" in diferentierea testiculului, se gaseste in doza unica: Gena SRY nu are gena omoloaga pe cromozomul X.

17.2.Evolutia cromozomilor sexuali la om

Cromozomii sexuali reprezinta un tip special de evolutie genomica la mamifere si om. Datorita variabilitatii accentuate, determinata de particularitati de structura, morfologie si functie genetica, intre cromozomii X si Y, motiveaza ipoteza ca heteromorfismul gonozomilor este rezultatul unui lung proces si modificari complexe in evolutia separata a cromozomilor X si Y(Ohno, 1969; Marshall si Watson, 1991). Din datele experimentale si studiul filogenetic al cromozomilor sexuali au fost emise diverse ipoteze ca heteromorfismul dintre X si Y ar fi rezultatul unor mecanisme genetice. Ohno (1969), lanseaza ipoteza unei evolutii particulare a cromozomilor X si Y in raport cu evolutia autozomilor. El considera ca la speciile ancestrale de vertebrate, cromozomii ancestrali cu rol in sexualitatea speciilor erau morfologie identici, iar determinarea sexului era controlata de gene, de un sistem de cupluri alelice. Acest complex de cupluri alelice implicate in sexualitate nu era o necesitate absoluta. In functie de raporturile de homo - si heterozigot era determinat sexul. De exemplu cromozomii sexuali" ancestrali cu morfologie identica, care aveau cuplul homozigot al genelor sexualizante ar fi determinat un sex, iar starea heterozigota sexul opus. 185

Conform ipotezei lui Ohmo, sustinuta de cercetarile lui Grouchy (1987), Riggs (1990), Rice(1994) s.a, la mamifere si om, cuplul de cromozomi sexuali X si Y provine dintr-o pereche homomorfa de cromozomi ancestrali. Mecanismele care au precedat heteromorfismului gonozomilor umani au inceput si s-au derulat pe parcursul a 200 milioane de ani in evolutia bio-genetica a vertebratelor pana la omul actual. Heteromorfismul gonozomilor, exprimat prin accentuata diferentiere de structura, dimensiune si functie genetica existenta intre X si Y, a determinat elaborarea ipotezei ca cei doi cromozomi sexuali (la mamifere si om) au evoluat separat, independent (Bull, 1983, Charles Worth (1978), Marshall - Watson (1991) si Jablouka (1990). Conform argumentelor aduse de cercetatori, heteromorfismul cromozomilor sexuali X si Y s-a realizat intr-un lung proces evolutiv prin modificari graduale, cum ar fr. supresia partiala sau totala a crossing - over-ului in doi cromozomi omologi la sexul heteromorfic ce difera prin gena sexualizata. degenerarea" functiei genetice a cromozomului Y, cromozom heteromorf.

17.2.1. Supresia prin crossing - over

Ipotezele lansate considera ca genele sex-linkate cu efecte opuse asupra unor caractere la cele doua sexe, ar avea un avantaj selectiv la unul din sexe, urmarea recombinarilor interlocusuri (fig. 47) Reducerea marcata a structurii realizata prin schimbul genetic extins prin deletie, ar determina variante genetice care ar asigura exprimari fenotipice ale unor caractere, cum ar fi: afectare psihica, morfologica, diferentieri comportamentale. Asemenea modificari fenotipice ar putea fi considerate avantajoase pentru sexul heterogametic si neavantajoase pentru sexul homogametic. Supresia crossing-over-ului s-ar fi realizat prin urmatoarele mecanisme: a) Supresia genelor - Un factor care diminueaza recombinarea intracromozomica a gonozomilor este selectia genelor, considerat factor initiator in evolutia cromozomilor sexuali, in special pentru cromozomul Y. Selectia genelor, diferentiat la X si Y, dar mai ampla selectia la nivelul cromozomului Y, a dus la izolarea si separarea cromozomilor sexuali X si Y. Supresia genica s-ar fi realizat prin deletia intracromatidica prin care 186

sunt eliminate unele gene, urmata de aditia altor gene, cu informatii genetice diferite fata de cele eliminate. b) Modificari conformationale - Modificarile conformationale includ heterocromatinizarea si alternarea" timpului de replicare prin care se deosebesc cromozomii X si Y intre ei, care la randul lor se deosebesc de cromozomii autozomi. Modificarea conformationala explica replicarea tardiva a cromozomilor sexuali. c) Modificari structurale. Ele se pot produce prin inversii pericentrice si paracentrice. Modificarile structurale modifica ordonarea omologiei segmentelor cromatidice si imposibilitatea de cuplare completa a cromozomilor sexuali in stadiul de zigonem al profazei primare din meioza. Datorita cuplarii incomplete in meioza, segmental necuplat se va inactiva prin modificari conformationale. Asemenea inactivari ar fi consecinta inversiilor. Rearanjamentul strcutrural al cromozomului Y, care este diferit de al cromozomului X, determina partial, supresia crossing - over-ului in meioza. Datorita neomologiei intre X si Y, in zigonem nu se formeaza sinapsele intercromozomale si are loc, frecvent , crossing - overul. Crossing-overul se poate realiza numai la nivelul segmentelor pseudoautozomale, sau prin deletia bratului p" al cromozomului Y. Datorita neomologiei cromatidelor intre X si Y cuplaroa in meioza este incompleta. Daca in meioza s-ar produce un uossing-over intre cromozomii XX in zona unde a avut loc inversia intracnwnatidica, ar rezulta gameti aneuploizi" (corect o monozomie partiala). Dar, datorita cuplarii incomplete pe segmental cromatidic necuplat in meioza, se pot produce modificari conformationale in cromozomii sexuali. Clark si Wall (1996) considera ca supresia crossing-over-ului poate fi influentata si de modificarea structurii si conformatiei cromozomilor sexuali X si Y. Modificarea conformatiei determina degenerarea unor structuri cromozomale a heterocromozomilor X si Y. Consecinta degenerarii structurii intre X si Y este diferentierea genetica si modificarea functiilor, precum si izolarea heterocromozomilor. Va rezulta un cromozom Y cu talia foarte mica, iar cromozomul X cu talia mijlocie. Degenerarea structurii este realizata si prin acumularea de mutatii cauzate de alterarea" strcuturii ADN-ului din cromozomi. d) ^Degenerarea" functionala. La sexul feminin homogametic XX exista un rise crescut de acumulare a mutatiilor. Dar, datorita omologiei celor doi cromozomi X, este posibila o reducere a coeficientului de mutatie, 187

deoarece in meioza poate avea loc recombinarea prin crossing-over intre omologii X, precum si o rata crescuta a proceselor de reparare a defectelor" genetice produse. Clark si Wall considera ca rata mutatiilor la nivelul heterocromozomilor X si Y este apropiata valoric. Insa rata de fixare a mutatiei este mai crescuta la cromozomul Y. Cauza acestor diferentieri este urmatoarea: cromozomul Y, desi foarte mic dimensional, datorita neomologiei cu X, este lipsit de crossing-over si reparare a mutatiilor, sau s-ar produce foarte putine, in schimb, cuplul de cromozomi X, fiind omologi, in meioza este o rata crescuta de crossing-over si reparare a mutatiilor. Aceste particularitati legate de dinamica heterocromozomilor, determina diferentierile heterocromozomilor, determina diferentierile degenerative a functiilor intre X si Y. Clark si Wall (1996), Rice (1994), Migeon (1994) s.a, considera ca degenerarea functionala a cromozomului Y ar fi consecinta acumularii unei cantitati crescute de heterocromatina, urmarea modificarilor conformational si structurale. Conform ipotezelor lansate de ei, se considera ca acumularea de heterocromatina ar fi consecinta unei acumulari crescute de ADN parazit" de catre cromozomul Y, ADN a carui unica functie este autoreplicarea . Acumularea de heterocromatina ar fi avut loc dupa stabilizarea supresiei crossing over-ului si degenerarea functionala stabila. Dar degenerarea functionala a cromozomilor Y nu este stabila la toate speciile de mamifere. De exemplu, la Homo sapiens (omul actual) instabilitatea degenerarii cromozomului Y este evidentiata de polimorfismul accentuat in populatiile umane. Datorita relativei instabilitati degenerative sunt posibile supresii genice, modificari conformationale si structurale, achizitii de noi mutatii. Prin aceste mecanisme si procese se accentueaza degenerarea functionala a cromozomului Y fata de X. In concluzie: acumularea efectelor genice, modificarilor conformational-structurale si acumularea de mutatii, sunt elemente care determina degenerarea functional - genetica a cromozomului Y. Un exemplu de degenerare functionala, intre cei doi heterocromozomi, este ca pe bratul scurt (p) al Y-ului este locusul genei SRY (Yp 11.3) care determina sexul masculin, cromozomii X fiind lipsiti de aceasta gena, sexul va fi feminin. In meioza, posibilitatile de cuplare intre cromozomii X si Y sunt la nivelul segmentelor pseudoautozomale, deoarece contin secvente omoloage. 188

Conservarea cromozomilor sexuali la mamifere si om este remarcabila, fiind considerata ca un mecanism de protejare si asigurare a dozajului genelor X linkate. Enzimele polimeraze participa la elongarea noilor catene care se vor cupla, complementar, cu catenele matrita, intergind moleculele de ADN dupa replicare. Replicarea fiind semiconservativa, fiecare molecula rezultata va fi compusa din catena veche (matrita) si catena nou sintetizata (complementara). Fiecare diviziune celulara este precedata de replicarea corecta a ADNului genomic. Modelul Watson-Crick prezice existenta furcii de replicare" la molecula ADN in curs de sinteza . Furca de replicare a fost evidentiata si studiata la bacterii. Prin marcarea ADN-ului din celula bacteriana cu timidina tritiata, autoradiografiile obtinute au fost examinate la microscopul electronic ( J. Cairns 1963).

189

CAPITOLUL IV CONCEPTUL DE GENA

Johanssen introduce notiunea de gena (1909), fiind considerata, in prezent, unitatea informational - activa si determinanta, care codifica sinteza unei proteine cu structura si functii specifice. Interesanta este definitia, elaborata de Th. Morgan (1915), exponent al geneticii clasice, data genei: gena este unitatea de functie, recombinare si mutageneza a aparatului genetic celular. In prezent, definitia genei a fost corectata si completata, gratie tehnicilor si metodelor de analiza a ADN-ului, elaborate dupa 1970 si in prezent. Pana in 1970 conceptul asupra notiunii de gena se limita la a aprecia ordonarea nucleotidelor care realizeaza mesajul genetic pentru ordonarea aminoacizilor (numar si tipuri) in lanturile polipeptidice, determinand structura si proprietati specifice proteinelor. Dar nu existau tehnici prin care sa poata fi izolata gena din genomul eucariotelor. Tehnicile elaborate de Nierenberg si Kharana (1960-1965) desi valoroase, n-au reusit sa stabileasca dimensiunea unei gene din genom. Dificultatea era urmatoarea: disproportia intre dimensiunea genei, apreciata la cateva mii de perechi si baze, in raport cu numarul pb din ADN-ul celular, estimat la aproximativ 3.500.000.000 pb. Aceasta a putut fi eliminata prin elaborarea unor tehnici care au revolutionat studiul genomului uman, care au permis studiul structurii complexe a unei gene din genom. Noile tehnici au permis: o Cu ajutorul revers - transcriptiei s-a putut transcrie in vitro" o molecula de ARNm complementara cu o secventa de nucleotide din structura ADN-ului (Baltimore, Termin 1976) o Prin folosirea endonucleazelor de restrictie s-a putut realiza decuparea ADN-ului cromozomial in fragmente cu un continut de aproximativ lOOOpb. Prin acest procedeu genomul uman, cu un continut de 190

3xl09 pb, a putut fi decupat in cca 106 situsuri. In prezent sunt folosite peste 200 tipuri de endonucleaze (enzime de restrictie) pentru tot atatea situsuri I din ADN-ul genomic (Roberts si col. 1988). I o Inserarea de fragmente scurte de ADN (plasmide de 5 kb sau 40 kb I in timpul replicarii repliconilor ADN-ului genomului uman, sunt incercari I de recombinare in vitro" a ADN-ului celular prin introducerea de segmente ADN straine in respectiva celula. Prin acest procedeu se realizeaza amplificarea, puriflcarea si dimensiunea genei. Este procesul ce premerge clonarii genei ca metoda ce a revolutionat genetica actuala. (Old siPrimnoze 1980) o Secventializarea genei - prin stabilirea secventei aminoacizilor din lantul polipeptidic, polipeptid codificat genetic de gena din genomul celulei. Pentru secventializarea genei s-au folosit enzime ca ADN-polimeraze (Sanger si Coulson, 1975; Maxam si Gilbert, 1978). Din studiile efectuate pana in prezent putem defini ca gena este unitatea functionala a ADN-ului cromozomal sau mitocondrial care detine mesajul genetic in forma codificata pentru determinarea si sinteza unei proteine specifice, intermediara fiind molecula de ARNm, care decodifica mesajul genetic din ADN. Gena, cu dispozitie liniara si adiacenta altor gene se inlantuie cu acestea formand grupuri linkate in axul longitudinal al cromozomului, care se transmit grupat de la o celula la generatiile celulare care succed. Grupate, dispuse liniar, fiecare gena ocupa o pozitie pe cromozom, pozitie intercalata de genele vecine. Gena nu este delimitata de granite morfologice sau de componente chimice particulare. Gena are o delimitare functionala, relevata de semnificatia mesajului genetic inscris in structura sa nucleotidica delimitata fiind de cordonul non-sens" cu rol de punctuatie informationala. Functionarea genei este conditionata de integrarea intr-un sistem autoreplicativ, desi ea functioneaza independent" in determinismul calitativ al proteinei sintetizate in celula. Cromozomul nu este un simplu depozit de gene. El reprezinta un sistem armonios de relatii intergenice. Ordonarea genelor intracromozomale, s-a dezvoltat gradat in cursul evolutiei bio-genetice. Tot in cursul evolutiei bio-genetice s-a realizat structura cromozomului, duplicatiile genice implicate in structura fiecarui tesut, a fiecarui organ. Este acceptat si demonstrat ca gena este o secventa polinucleotidica din molecula ADN-ului cromozomal inzestrat cu capacitatea de autoreplicare.

191

In cursul evolutiei biologice s-a realizat structura chimica, dimensiunea si stricta specificitate informationala delimitate de codonii nonsens terminatori". Desi ca unitate de functie in genomul celular si entitate stabila, gena poate suporta modificari in structura ei, in conditiile cand asupra ADN-ului actioneaza factori exogeni agresivi, potentiali mutageni, cu efecte secundare asupra caracterelor exprimate fenotipic (malformatii congenitale pe fond genetic).

LStrutura genelor la eucariote

Analizate moleculele de ADN din cromozomul procariotelor si din cromozomii eucariotelor s-a constatat urmatoarele diferentieri: La procariote: un singur cromozom care contine o molecula gigant de ADN; ADN-ul din cromozomul procariotelor nu este cuplat cu proteinele de tip histone; ADN-ul procariotelor nu contine secvente nucleotidice repetitive; tot ADN-ul este informational genetic, activ, reprezentand in forma codificata, mesajele genetice pentru determinarea sintezei propriilor proteine specifice; genele lipsite de introni. La eucariote: existenta unui numar variabil de cromozomi in genom (omul are 46 cromozomi); ADN-ul din componenta fiecarui cromozom este cuplat prin legaturi sterice, cu proteinele de tip histone (Hi, H2A, H2B, H3 si H4), formand complexe nucleo-proteice; ADN-ul eucariotelor este heterogen in raport cu structura primara, cromozomii continand ADN repetitiv (moderat si inalt repetitiv -noninformational) si nerepetitiv (informational). Structural, gena este complexa, continand introni-exoni; Existenta familiilor de gene implicate in edificarea aceluiasi caracter; In ADN-ul din genomul uman exista 3,2 -3,5 x 109 perechi de nucleotide. 192

Luandu-se in considerate aceste diferentieri structural, cantitative si functionale, s-au emis ipoteze confirmate, ca genele la eucariote sunt fundamental diferite fata de procariote. De exemplu genele individuale considerate de Morgan entitati functionale indivizibile, sunt reprezentate de segmente nucleotidice care pot fi fragmentate" in subunitati structurale -functionale sau nonfunctionale. 1.1.Structura genei din genomul eucariotelor Din totalul ADN-ului cromozomal al eucariotelor numai o cantitate foarte mica de ADN este exprimata informational in structurile proteice. Se estimeaza ca din totalul ADN-ului nuclear aproximativ 5-10% este codant. Genetica moleculara a consemnat neconcordanta intre dimensiunea moleculei de ARN premesager, care a decodificat structura integrala a genei si care este identificat in nucleu si masa moleculara a ARNm prezent in citoplasma celulei. Discordanta masei moleculare intre cele doua stari (etape) ale ARNm, a dus la elaborarea ipotezei ca gena are o structura discontinua sau in mozaic, la eucariote. Din punct de vedere molecular gena la eucariote este o colectie" liniara de secvente informational active si secvente non-informationale. Dupa 1977 se cunosc incercari si analize moleculare, care, prin rezultate, au dus la o redimensionare a notiunii de gena. De exemplu Sharp (1977), Gilbert si Tonegam (1978), Crick (1979), Gilbert (1985) s.a, pe baza propriilor observatii, formuleaza ipoteza ca structura unei gene, ca unitate de transcriptie a ADN-ului genom, prezenta pe un locus in cromozom, are masa moleculara mai mare in raport cu ARNm citoplasmatic care a decodificat-o.

1.1.1. Structura discontinua a genei sau gena in mozaic"

Din punct de vedere al geneticii formale, gena este considerata unitatea de functie, recombinare si mutageneza, mostenita si transmisibila. Dar din punct de vedere molecular, gena este o colectie" liniara de secvente nucleotidice din ADN-ul cromozomial, care determina sinteza unei molecule de ARN, care precede sinteza unui polipeptid in citoplasma celulei. Datorita neconcordantei masei moleculare a ARN hibrid premesager; precursor al ARNm matur care se sintetizeaza la nivelul genei 193

din ADN-ul cromozomial, s-a preconizat ca structura genei care detine mesaj genetic este complexa, este secvential heterogena. Studiile lui Sharp si Roberts (premiul Nobel pentru medicina, 1993) au evidentiat ca genele din genomul uman, ca la toate eucariotele, au structura informational discontinua. Ei au observat prezenta unor structuri secventiale suplimentare" de nucleotide non-informationale intercalate printre segmentele nucleotidice cu mesaj genetic. Sharp si Roberts au numit secventele cu mesaj genetic informational exoni, iar secventele liniare non-informationale introni.(fig.48)

1 P I INC EXONI EXON3NC] EXON2

INTRON1

INTRON2

Fig. 48 Schema generala a unei gene" la eucariote. - ADN non transcrisa: SA: secvente adiacente P: promotor (semnal ATA) I: initierea transcriptiei. Secventa noncodanta transcrisa si prezenta pe ARNmm (mesager matur)
EXON

Secventa codanta (transcrisa si tradusa) Secventa noncodanta (transcrisa dar absenta din ARNm matur)

Exonii din structura genei sunt transcrisi in molecula de ARN premesager (precursor) iar mesajul lor il gasim, in totalitate, in molecula de ARN mesager matur. Acest ARNm matur este eel care, dupa traversarea anvelopei nucleare in citoplasma, asigura sinteza unei proteine, cu structura si functii specifice, mai corect sinteza unui lant polipeptidic ce va structura o molecula proteica. Intronii sunt transcrisi in molecula hibrida de ARN pre-mesager (precursor) impreuna cu exonii, dar nu sunt inclusi in structura fnala a moleculei de ARNm matur. Ei vor fi eliminati prin restrictie enzimatica, din 194

ARN premesager, in timp ce exonii vor fi recuplati de enzimele ligaze, formand ARNm niatur (vezi sinteza ARNm si a proteinelor). Decodificarea si sinteza ARN pre - mesager (precursor) este catalizata de enzima ARN-polimeraza II. In 1990, Kaplan si Delpech, considerau ca intron este orice segment transcris din ADN, dar eliminat dupa transcrierea primara. Deci intronii nu vor fi prezenti in structure unui ARNm matur. S-a observat ca numarul exonilor si intronilor variaza in limite largi in genele eucariotelor. De la un intron pana la 50 introni si chiar mai mult. De exemplu, gena care codifica sinteza actinei are un singur intron. Gena care codifica sinteza (3 - globulinei confine doi introni, in timp de gena care la pasari codifica sinteza precolagenului are 50 de introni. Un alt exemplu care confirma numarul variabil de introni in componenta genelor este gena pentru hemofilia A la om. Aceasta gena confine 186.000 pb, insumand nucleotidele din exoni si introni, respectiv 0.1% din totalul ADN-ului din cromozomul sexual X. Dar in molecula ARNm matur se gasesc numai 9000 pb. Deci numai 9Kb corespund segmentelor exonice, diferenta semnificativ mai mare, sunt nucleotidele din intronii non-informationali. O alta observatie a lui Shaip si Roberts este ca primul si ultimul segment polinucleotidic din structura genei in mozaic", sunt exoni. Ca urmare, o gena structurata in mozaic, va confine ca numar de introni egal cu al exonilor mai putin unul (ex 2n-l; de unde 2n este numarul exonilor din componenta genei structurale). Deasemenea s-a constatat ca, in general, primul intron este relativ scurt prin prezenta nucleotidelor care-1 structureaza, iar al doilea intron este mai lung. Ceilalti introni componenti ai genei structurale au lungimi variabile cuprinse intre 45 pb pana la aproape 5000 pb. De exemplu, la mamifere este o gena care determina genetic sinteza dehidrofolat reductaza (DHFR, care contine sase exoni. Gena existenta in ADN-ul cromozomal (in mozaic structural) contine 31000 pb in timp ce ARNm matur numai 2000 pb. Sau gena pentru tireoglobulina in ADN, contine 300 Kb iar ARNm matur are 8 Kb, in timp ce gena pentru distrofina, a carei lungime este de 2500 Kb, transcrie un ARNm matur de 14Kb. Din toate aceste exemple se constata neconcordanta intre structura genei din ADN cu locusul pe cromozom si structura prin numar de nucleotide din ARNm matur. Putem retine ca prin lungime si numar de nucleotide intronii sunt mult dimensionati fata de componenta exonilor. Deci gena contine un numar mare de secvente lipsite de mesaj genetic (noninformationale). 195

Prin folosirea metodelor de cartografiere prin restrictie" si secventializarea oligonucleotidelor prin marcarea precursorilor s-au evidentiat unele caracteristici ale genelor cu structura discontinua si anume: ordinea exonilor din structura genei din ADN-ul cromozomial este respectata si in structura ARNm matur. Ca urmare se poate afirma ca gena in mozaic" este fragmentata" pe secvente nucleotidice liniare, exoni-introni si nu dispersate. Concluzia: ca structura genei este discontinua. Intronii din componenta genei contin codoni terminatori non-sens", in toate fazele de transcriptie a genei in ARN pre mesager (precursor). Componenta unei gene structurale din genomul organismului este aceeasi in toate celulele, indiferent care este tesutul sau organul din care fac parte celulele; In marea lor majoritate intronii incep in pozitia 5 cu dinucleotidele GT si sfarsesc cu dinucleotidele AT in pozitita 3', al capatului opus al intronului. Sunt putine exceptii de introni care incep la un capat 5' AT si sfarsesc la capatul 3' AC. Structura 3' AT are importanta ca asigura decuparea corecta a intronilor din structura genei mozaic. Gena in mozaic incepe cu primul exon in pozitia 5, iar ultimul exon va sfarsi in pozitia 3', ordinea fiind stabilita din analiza ARNm matur rezultat din transcriptie si dupa eliminarea intronilor. Cand o gena structurala din genomul unui eucariot este lipsita de introni, carta de restrictie a ADN-ului pentru respectiva gena corespunde exact cu a ARNm obtinut prin transcrierea inversa cu ajutorul revers transcriptiei a ADNc sau a ADNm (mitocondrial). Este cazul histogenelor sau a genelor din genomul procariotelor (la care ADN-ul nu este cuplat cu histonele si nu exista secvente repetitive de tipul intronilor). De exemplu 20 histogene cu locusuri pe cromozomii 1, 6 si 12, constituind grupe de pseudogene"; Cand din ARN-ul m matur lipseste o secventa ce corespunde unui exon in raport cu componenta exonilor din gena care a transcris ARN premesager, apare modificare in carta de restrictie a ADNc. 196

1.1.2. Mecanisme in evolutia genelor cu structura discontinua

Asupra originii si evolutiei genelor cu structura discontinua (in mozaic") s-au emis diverse ipoteze. De exemplu, Chambon (1981) si Siidhof (1985) considera ca intronii eucariotelor ar fi relieve ale evolutiei codului genetic. Ei considera ca intronii ar fi resturi din molecula ADN-ului repetitiv ancestral. Acesti introni ca relieve ancestrale, prezentand in structura lor microsecvente repetitive, se mentin non-informationali, lipsiti de mesaj genetic, iar exonii ar fi secvente minimale", limita capabila de determinism genetic a sintezei unui lant polipeptidic, a unei proteine. Datorita metodelor si tehnicilor tot mai perfectionate de studiu in genetica, cum este metoda in care se folosesc fragmentele de restrictie, s-au emis si alte ipoteze privitor la originea, mecanismele si evolutia genelor cu structura discontinua la eucariote. Avantajele metodei fragmentelor de restrictie sunt urmatoarele: se poate stabili daca un fragment specific identificat este inrudit cu alte secvente din genom. prin clonare, fragmentele de restrictie pot servi ca trasori in hibridizarea ADN-ului cu scopul identificarii secventelor repetitive. prin folosirea sondelor exonice putem identifica prezenta unui exon si structura diverselor gene structurale din genom. Folosirea metodei fragmentelor de restrictie dar si a clonarii acestor fragmente (ca sonde de identificare) au permis enuntarea unor ipoteze asupra mecanismelor posibile in evolutia genei cu structura discontinua. Aceste mecanisme posibile ar fi urmatoarele: a) Evolutia genei prin duplicatia exonilor. Este mecanismul care ar motiva existenta la eucariote a genelor cu secvente exonice repetitive. De exemplu, gena care codifica colagenul la pasari contine un exon format din 54pb, exon care se multiplica de multe ori in componenta genei. b) Conversia segmentelor nucleotidice este un mecanism posibil in evolutia genei care codifica globina si care contine trei exoni si doi introni. Un alt exemplu este gena pentru mioglobina umana care are o structura identica cu structura a trei exoni prezenti in structura genei pentru globina. c) Duplicatia genei si excizia intronilor. Este mecanismul care motiveaza existenta genelor omoloage dar cu un mesaj genetic diferit. Ca exemplu, genele pentru sinteza insulinei si anume: mamiferele si pasarile 197

detin in genom o singura gena care codifica insulina, iar rozatoarele au doua gene. Daca la pasare gena contine doi introni, la soarece o gena are doi introni (la fel ca la pasari), a doua gena numai un intron. Aceasta diferentiere in introni a geneleor pentru insulina, prezente la rozatoare, este explicata prin excizia intronilor. Si anume se considera ca gena ancestrala pentru insulina a avut doi introni, iar prin evolutie s-a pierdut unul la gena omoloaga. d) La rozatoare prezenta a doua gene pentru codificarea insulinei, care difera structural si informational ar fi cosecinta a doua mecanisme in evolutia genei: un mecanism legat de duplicatia genei ancestrale; al doilea mecanism, excizia unui intron la una din cele doua gene. Dupa cum se observa prin aceste mecanisme incepe diversificarea structural-functionala a genelor, incepe polimorfismul molecular (fig.49). Un exemplu este gena pentru ovotransferina la pasari care cotine 17 exoni, fata de gena ancestrala presupusa ca ar fi avut 8 exoni si 7 introni. e) Duplicatia genelor si insertia de introni. Este posibil ca prin duplicatia unei gene, in componenta ei sa fie insertionat, un segment polinucleotidic non-informational, corespunzator unui intron ca lungime si structura microrepetitiva. f) Crossing-over inegal. Este mecanismul prin care se pot forma gene duplicate separate de un intron non-repetitiv.

2. Caracteristicile genei in raport cu cromozomii din genom

Gena, ca unitate de structura, functie si recombinare, exprimand o secventa polinucleotidica cu mesaj genetic din molecula ADN-ului cromozomal, prezinta unele caracteristici in raport cu cromozomii. Datorita heterogenitatii structural - functionale, a tipurilor de acizi ribonucleici (ARN), se considera ca locusurile in cromozomi pot fi ocupate de trei clase de gene: - gene ribozomale, care transcriu sinteza ARN ribozomal sub actiunea ARN- polimeraza; - gene din componenta operonilor, sunt genele implicate in sinteza si reglarea genetica a proteinelor, transcriptia catalizata de ARN-polimeraza II; - gene care codifica sinteza ARN transport sub actiunea ARN polimerazei III. 198

2.1.Locusul si formele alternative ale genei prezente pe cromozomi

La eucariote, inclusiv la om, genele au o dimensiune si ocupa o anumita pozitie in crornozom pe care o denumim locus. Deci locusul este spatiul si pozitia unei gene in crornozom. In genomul celular, gena se poate prezenta sub forme alternative. Formele alternative ale genei salbatice" sau ancestrale le numim alele. Alela este varianta modificata a unei gene intr-un locus dat pe crornozom. Formele alele sunt rezultate evolutive realizate prin urmatoarele mecanisme: mutatii punctiforme, crossing-over inegal, prin dedublarea accidentala a unei gene sau prin dedublarea asociata cu mutatia unei gene. Prin dedublare si mutatia genei se presupune ca mecanism in evolutia lanturilor polipeptidice din componenta globinei din structura hemoglobinei (Hb). Alela, ca forma contrastanta a genei, salbatice determina exprimari fenotipice diferit nuantate ale aceluiasi caracter in raport cu eel determinat de gena ancestrala sau de origine. Sunt cupluri de cromozomi omologi care au pe un locus variante alelice. Cum genele alele, convergent, sunt implicate in definirea aceluiasi caracter sunt numite cupluri alelomorfe. Cuplul alelomorf ocupand acelasi locus pe cromozomii omologi, poate fi separat prin diviziimea reductionala in meioza organismelor cu reproducere sexuata.

2.1.1. Polialelismul
In evolutia bio-genetica, o gena salbatica a suportat o succesiune de evenimente care au determinat modificarea mesajului informational initial. De exemplu prin mutatii punctiforme, dedublari sau recombinari intergenice (crossing-over inegal), sumativ, ca efecte genice s-au realizat variante alele pentru acelasi caracter, fiecare tip de alela exprimand trasaturi graduale ale caracterului manifestat fenotipic. Cand in locusul ocupat intitial de gena ancestrala sau salbateca" (de origine) gasim variante alelice, se considera polialelism sau polimorfism alelic. Polimorfismul alelic poate fi stabilit prin metoda cartarii genetice sau prin metoda de restrictie genica. 199

Prin cartarea genica se identifica situsurile unde s-au produs mutatii genice, cu efecte secundare in modificarea caracterelor exprimate fenotipic. Metoda permite identificarea variantelor alelice nonnale sau mutante in constitutia genetica a individului, sau in genofondul populatiei. Cartarea de restrcitie este metoda de identificare a seriei liniare a situsurilor din fibrila de ADN cromozomal. Este metoda de cartare a situsurilor de restrictie secventiala, dar nu identifica mutatiile din fibrila ADN. Indivizii componenti ai populatiei prezinta caracterul determinat de gena salbatica, sau unul determinat de variantele alelice derivate din gena salbatica, care, uneori, pot fi cu efecte deviante" fenotipic, consecinta unui mecanism de mutageneza genica. Prin metoda de cartare a fragmentelor de restrictie s-a evidentiat existenta in genom a genelor cu locusuri diferite pe cromozom, cu dimensiuni inegale, dar care au si exoni comuni. Prezenta genelor nealelice prin locusul ocupat, dar cu exoni comuni asigura sinteza de proteine identice" sau inrudite. Se considera ca dispersia acestor gene in locusuri diferite pe cromozom este rezultatul duplicatiei genice ca mecanism in evolutia biogenetica. Se considera (ca principiu al duplicatiei genice) ca prin acest proces, o copie a genei ancestrale (de origine) a evoluat catre o mutatie cu schimbarea locusului, in timp ce alta, a ramas la functia si locusul initial (fig-49). In functie de numar, lungimea exonilor si intronilor din structura genelor duplicate, se considera ca duplicatia genelor ancestrale a fost mai putin divergenta pentru exoni si accentuat divergenta pentru introni. Aceasta ipoteza ar fi un argument explicativ de ce exonii comuni in genele nealelice au lungimi foarte scurte, in timp ce intronii, care le diferentiaza, au lungimi variabile. Genele cu exoni comuni, dar cu locusuri diferite in cromozom, rezlutate prin duplicatii seriate si mutatii seriate plecand de la gena salbatica (ancestrala), formeaza o gnipare numita familie multigenica sau baterie mutligenica. S-a mai constatat ca familia multigenica poate fi grupata pe acelasi cromozom, sau cu locusuri pe cromozomi diferiti in genomul celulei.

200

GENJL

IV

W LT,LETALA

MUTATIS

DUBLAf?E\ GENETICAK AC CI DEN-J \

Y~?
T

GENE DUPLICATE

OMUTAT/E GENICA NELETALA

CONTINUAREA MUTATlEi SI SELECTIA NATUff'ALA

GENE CU OOUA FUNCTtl OIF Eft IT E

Fig.49 Duplicatia genei in evolutia genomului. Este posibil ca familia multigenica distribuita pe cromozomi diferiti sa fie rezultatul unei divergente genice insotita de conversia genica . Regruparea genelor cu exoni comuni este conditia de a mentine sinonimia functionala a genelor cu convergenta transcriptionala in edificarea unui caracter. Familia de gene inrudite grupate pe un cromozom, nu sunt inrudite cu genele prezente pe acelasi cromozom dar care ocupa locusuri diferite si codifica alte caractere exprimate fenotipic.
14

Conversia genica - inlocuirea de material de pe un situs ADN din cromatida unui cromozom, cu material genetic de la un cromozom neomolog, dar care ocupa aceeasi pozitie in raport cu cromozomul care a raportat conversia. Conversia genica este sinonima cu transcriptia (Finchman - Day, 1971). 201

Familia de gene este regrupata deoarece, prin duplicari au rezultat gene identice" (implicate in definirea aceluiasi caracter, dar diferite fenotipic) aliniate in tandem. Cand genele inrudite se gasesc cu locusul pe cromozomi neomologi, este consecinta translocatiei genelor, a conversiei genice. Sunt mecanisme posibile in evolutia genomului, cand, dupa duplicatia genica si separarea genelor din familia multigenica, a avut loc o evolutie divergenta". Se considera ca dispunerea in tandem a unei gene cu formarea unei familii multigenice pe un cromozom, ar fi o consecinta evolutiva a necesarului de proteina codificata de respectiva familie, sau a unor componente transcrise, necesare in cantitate mai mare pentru activitatea celulei, a organismului. In genomul uman gasim multiple baterii mutligenice" sau familii de gene, ordonate in tandem pe fibrila ADN-ului cromozomal, implicate in determinarea unui grup de caractere cu functionalitati sinonime sau inrudite". Din genomul uman putem prezenta ca exemple urmatoarele familii multigenice: Familiile de gene pentru histone si ARNr; Familia de gene pentru sistemul HLA (human leucocyte antigen) localizata in cromozomul uman 6p2105-p23. formata din: HLA- A cu 30 variante alelice, HLA-B cu 40 variante alelice,HLA-C cu 8 vairante, HLA-D cu 12 variante si HLA-Dr cu 10 variante alelice; Familia de gene pentru antigenele imunoglobulinelor, localizata pe cromozomul 14 uman reprezentata de: IgAi, IgA2, IgDj, IgE, IgGi, IgGi, IgG3, Igl si IgM; Familia de gene pentru IgJ, IgK, IgKC, IgKV cu localizare pe bratul p" al cromozomilor 21; Familia geneleor care determina sinteza histonelor localizata pe cromozomul 7q32 - q36, reprezentata de histonele Hi, HIA, H3 si H4 constitutiva din 10-40 secvente repetitive, dispuse in tandem; Familia genelor pentru globulinele p, y, 5, e localizata pe cromozomul lip 1205 -pi208; Familia genelor pentru sistemul eritrocitar Rh respectiv gene C,D,E, localizate pe cromozomul lp32 .

202

2.1.2. Liniaritatea genelor in cromozom

Consemnata de Morgan si Muller la Drosophila melanogaster, a fost demonstrata de Yanovski prin mecanismul suprimare cu acoperire". Exemple care confirma liniaritatea genelor pe cromozomii umani sunt multiple. Cel mai demonstrativ este exemplul legat de genele p si 5 care au locusul pe cromozomul 11 uman. S-a observat ca prin crossing-over inegal a rezultat o gena hibrida" care contine un amestec de secvente nucleotidice, in numar inegal de la gena (3 si 5. Efectul acestui crossing-over inegal il gasim in patologia umana, cunoscut ca sindromul Hb - Lepore varianta Hollandia care are un lant polipeptidic combinat : 22 aminoacizi corespund mesajului din gena 5, iar 50 aminoacizi de la gena p. Este o recombinare inegala. Crossing-over inegal realizat pe bratul p" al cromozomului 11 uman unde, liniar, sunt ordonate locusurile genelor s, y , y , (3 si 5. Cum genele p si 8 sunt adiacente (vecine), in profaza meiozei reductionale s-a produs un schimb inegal de segmente cromatidice, realizat in zona genelor p si 8. Acest mecanism demonstreaza liniaritatea genelor in cromozomi. ( S-a demonstrat si experimental liniaritatea genelor de catre Yanovski care a lucrat pe molecula ADN-ului de la bacteriofagi ).

2.1.2. Linkage genie sau inlantuirea genelor in cromozomi

In genomul uman exista un numar foarte mare de gene ce detin mesaj genetic codificat, cu implicare in mecanismele si procesele de crestere, diferentiere si dezvoltarea organismului. Dar fibril a de ADN este organizata si dispusa pe toata lugimea cromozomului, formand o fibrila unica fara discontinuitati spatiale. Cum genele sunt secvente informationale din fibrila ADN cromozomal, care este fara discontinuitati spatiale, rezulta ca si genele sunt linkate, sunt inlantuite intre ele, fund transmise grupat. Conceptul de linkage genie" este extins si la cromozomii umani, referindu-se la genele cu locusuri foarte apropiate si la genele cu locusuri indepartate intre ele, dar prezente pe acelasi cromozom. Conceptul de linkage genie" a fost elaborat inca din 1951, pe baza studiilor familiale a sistemelor genetice eritrocitare si plasmatice, sau prin interrelatia familiala a sistemului genetic eritrocitar cu diverse sindroame genetice din patologia umana.
203

In perioada 1951-1955 erau acceptate trei grupe de ^linkage genie" pe cromozomii autozomi din genomul uman: linkage intre genele sistemului genetic Lutheran si sistemul secretor (Mohrl951) linkage intre sistemul Rh si eliptocitoza stabilit de Lawler (1954); linkage genie intre sistemul ABO si sindromul Nogel-Patella (Renwick si Lawler (1955)). Renwick (1966), referindu-se la genele cu locus pe acelasi cromozom, introduce notiunea de sintenie, adica prezenta a doua sau a mai multor gene pe un singur cromozom. Renwick considera ca doua gene pot fi in raport sintenie (pe acelasi cromozom) dar nu si cuplate prin vecinatatea pozitiei pe cromozom, desi genele sunt inlantuite. Un exemplu prin care sa demonstram linkage genie este complexul de gene care codifica sistemele genetice pentru Rh si Duffy. Sistemul Rh este determinat de trei cupluri alelice CDE, care pot fi dominante sau recesive. In populatie, indivizii pot fi Rh+ sau Rh", reactia antigenica pozitiva fiind determinata, genetic de alela dominanta D (in stare homozigota DD sau heterozigota Dd) iar reactia negativa la alela recesiva d" in stare homozigota. Sistemul Duffy fiind conditionat de un cuplu alelic Fya (dominanta) si b Fy (recesiva). Pentru analiza linkage-ului genie se poate folosi metoda double -backross", in care un genitor sa fie dublu heterozigot Dd / Fya Fy , iar celalalt genitor dublu homozigot receziv (dd / Fy Fy ), urmand a se observa exprimarea fenotipica a celor doua caractere in filiatia familiala. Analizandu-se caracterele determinate de doua cupluri de gene nealelice D si Fy la descendenti stabilim genele primite de un copil, de cuplul parental heterozigot, iar in cazul nostru caracterele sunt pentru Rh si Duffy (fig.50).
204

f u

50% Rh* si Duffy pozitiv

60% Rh- si Duffy negativ

Fig. 50 Raport de segregare 1:1. Linkage-ul genie al genelor CDE si Duffy (+ si -) pe cromozomul nl urnan . Genele celor doua sisteme genetice inlantuite au locusurile pe bratul q" al cromozomului 1 uman. Daca locusurile genelor pentru Rh si Duffy nu s-ar fi gasit pe acelasi cromozom, inlantuite teoretic, ar fi trebuit ca descendentii sa prezinte patru genotipuri diferite si tot atatea asocieri fenotipice a respectivelor caractere: VA Dd / Fya Fyb; % DD Fyb Fyb; % dd Fya Fyb; % dd Fyb Fyb, adica un raport de segregare de 1:1:1:1, ceea ce ar fi insemnat ca genele sa fie neinlantuite si sa se combine aleatoriu, conform configuratie cis" sau trans". Dar raportul de segregare fund de 1:1, se confirma ca cele doua cupluri de gene pentru doua caractere diferite, au locusuri diferite pe acelasi cromozom si se transmit grupat. J. Thomson si M.Thomson (1986) au elaborat un rationament si calcul pentru a stabili linkage-ul genie si anume:

205

Sunt cazuri cand raportul de segregare a genelor inlantuite nu exprima un linkage echilibrat".Apar raporturi de segregare ca abateri de la legile mendeliene cu un linkage genie neechilibrat. Aceste abateri, care determina un dezechilibru in frecventa genelor legate intre ele (inlantuite) sunt rezultatul unor mecanisme in evolutia genomului, de dinamica unei populatii, sau posibilitatea reproducerii indivizilor din populatii diferite. Ca mecanisme si factori implicati in nerespectarea segregarii intre genele inlantuite cu locusuri pe acelasi cromozom, mentionam: Aparitia de neomutatii in populatie la nivelul genelor analizate si exprimate fenotipic. Remanierile cromozomale ca: inversiile, duplicatia, deflcienta etc., care modifica raporturile si pozitia genelor pe cromozomii omologi; Prezenta combinatiilor alelice cu frecvente variabile (crescute sau reduse) in populatie, pot fi si rezultatul unor selectii naturale favorabile sau nefavorabile; Prin amestecul a doua populatii cu frecvente diferite a cuplurilor alelice inlantuite, cand numarul de generatii care au succedat din momentul amestecului a fost mic si insuficient pentru realizarea combinatiilor alelice in populatia devenita heterogena genetic. In concluzie se poate spune ca intr-o populatie panmictica, naturala, in absenta crossing-over-ului cromozomilor omologi, in absenta remanierilor cromozomale, sau absenta neomutatiilor, caracterele controlate de cupluri alelice diferite dar inlantuite, cu locusi diferiti pe cromozomi omologi, prin segregare si transmitere la descendenti, raportul de segregare, este asemanator monohibridarii (analiza unui singur cuplu alelic). In exemplul mentionat, fiind cazul a doua cupluri de gene nealelice pentru doua caractere diferite daca aceste cupluri n-ar fi inlantuite, atunci am fi avut un raport de segregare de 9/16; 3/16, 3/16; 1/16, care ar fi corespuns dihibridarii. Dar s-a demonstrat ca raportul de segregare a doua cupluri nealelice, inlantuite pe acelasi cromozom este XA: XA (50 : 50) in loc de V*\ lA; l A; lA. 206

2.1.3. Crossing-over-ul
O alta particularitate a genelor in raport cu cromozomul pe care an locusul, este crossing-over-ul (fig. 51). Crossing-over-ul este schimbul de segmente cromatidice intre cromozomii omologi in profaza primara a diviziunii reductionale, in meioza. Este mecanismul fiziologic de recombinare intre cromatidele cromozomilor omologi. Prin crossing-over se constituie noi constelatii genice de dubla origine - materna si paterna pe acelasi cromozom.(Procesul va fi dezvoltat la variabilitate, vol. II)

207

entromer

Doi cromozom't omologi treclnd prin sinopsa In meioza

pent i 2 cro Fiecare cromozom duplicat pentru a forma

ma tide

diviziune meiotica C e n t r o m e r e .duplicate a doua diviaiune meiotica urmata

Cro sing over Intre

pereche de cro ma tide

P a t r u gameti hapIoi21 format!,aici 2 cross.over si doi noneross.over gameti

Fig. 51 Interpretarea teoretica a crossing-overului.

208

2.1.4. Tipuri de gene in genomul eucariotelor

Luand in consideratie rezultatele obtinute din Proiectul Genomului Uman" (inceput in 1980 si reorganizat), se estimeaza ca in genomul uman sar gasi in jur de 35000 - 40000 gene functionale, in care sunt inscrise mesaje genetice. In raport de functie, activitate si dispunerea in genom, precum si in raport de enzima care catalizeaza transcrierea mesajului in molecula de ARN, distingem clase, familii si superfamilii de gene. a) Clasa genelor complexe. Sunt genele implicate in sinteza si reglarea sintezei de proteine in celulele eucariotelor. Genele din clasa complexa sunt prezente si active in genomul fiecarei celule din structura organismului, unde indeplinesc functii esentiale pentru viata celulelor sau sunt implicate in procesele de citodiferentiere a unor celule cu structura si functii strict specifice. Conform criteriului de prezenta si functie in genom, aceasta clasa se subdivide in: Gene comune sau domestice al caror numar reprezinta 1/5 din totalul genelor informational active din genom, adica aproximativ 7000 gene, daca raportam cifra la numarul genelor de 35000 si peste 90% sin genele care codifica in orice tip de celula (Covic Sefanescu Sandovici, 2004). De regula sunt catalizate pentru transcriere de ARN polimeraza II. Genele comune sau domestice alcatuiesc complexul de gene din componenta operonilor (gena reglatoare promotor, operator, gene structurale). Sunt numite si gene clasa a Il-a. Gene specifice, sunt considerate genele care sunt implicate in citodiferentierea unor celule specifice ca structura si functii, de exemplu neuronul, muscularul, etc. Pot fi considerate gene specifice , pot fi considerate si gene supresoare, implicate in cresterea tumorala". Aceste gene supresoare, pin produsul transcris si translat - proteina supresoare" au actiune blocanta asupra dezvoltarii celulelor canceroase. Genele din clasa complexa se gasesc in genomul celular in copie unica sau duplicate. Gene in copie unica. Genele in copie unica prezente in genomul celulei se prezinta in cuplu alelic in raport de cuplul cromozomilor omologi din celula somatica diploida. Se estimeaza ca gena unica are capacitatea sa-si decodifice mesajul inscris in structura sa aperiodica, intr-o molecula de ARNm. Gena unica poate sintetiza 104 molecule ARNm, care trecute in 209

citoplasma dupa sinteza sa asigure 10 lanturi polipeptidice identice (Israil, 2000, pg 92). Gene duplicate. In cursul evolutiei biogenetice a eucariotelor, unele gene in copie unica s-au duplicat. Prin duplicatie se obtin pseudoenele. Gena duplicata - pseudogena - este cvasifunctionala in transcrierea mesajului genetic inscris in structura sa. Genele duplicate se pot stabiliza si functiona prin selectia genica. Ca exemplu de gene duplicate si devenite functionale sunt genele unice duplicate care, in prezent, formeaza o familie ce codifica lanturile polipeptidice din structura globine din Hb. In aceasta familie, este gena duplicata 0 care codifica sinteza unui lant polipeptidic din clasa pglobinei. b) Familii si superfamilii de gene in genomul eucariotelor. Este clasa de gene care grupeaza genele prezente intr-un numar inalt de copii in genomul celulei. Copiile genice pot fi grupate cu dispunere in tandem in cromozom, formand o familie sau superfamilie de gene, sau copiile genei sunt dispersate pe diversi cromozomi neomologi din genomul celulei. Familia genelor ARNr . Este o familie numeroasa, reprezentata de aproximativ 150- 200 gene. Genele din aceasta familie se gasesc dispuse in tandem pe bratele scurte (p) ale cromozomilor acrocentrici, in zona organizatorilor nucleolari. Transcrierea mesajului in moleculele ARNr este catalizata de enzima ARN- polimeraza I. Sunt geneticieni care desemneaza a fi o familie de gene clasa I, dupa criteriul enzimei ARN-azei I. Familia genelor ARNt. Genele acestei familii au secvente nucleotidice mici, iar transcrierea in ARNt este catalizata de enzima ARN polimeraza III. Majoritatea genelor ARNt sunt dispuse dispersat sau in tandem, cu localizare pe cromozomii 1 si 6. Se apreciaza ca aceasta familie ar fi reprezentata de cca 1300 gene. Superfamilia genelor pentru histone. Datorita numarului foarte mare si cu o structura aproape identica, genele care controleaza, genetic, sinteza, histonele alcatuiesc o superfamilie. Genele din componenta acestei familii pot fi dispuse in tandem sau dispersate pe cromozomi neomologi. Superfamilia genelor HLA - Genele HLA care formeaza complexul major de histocomatibilitate (MHC) sunt localizate pe bratul scurt (p) al cromozomului 6 din genomul uman. Superfamilia HLA, ocupand mai multe locusuri unde se grupeaza gene diferite, se divide in patru familii de gene HLA-A, HLA-B, HLA-C si HLA-D. La randul lor, aceste familii se grupeaza in trei clase: 210

o Clasa I grupeaza genele HLA-A, HLA-B si HLA-C. De exemplu genele HLA-A sunt reprezentate de 15 alele diferite notate de la Al la A15; genele HLA-B de 20 alele diferite, iar genele HLA-C prezinta 5 alele diferite. o Clasa II este reprezentata de familiile de gene de tip HLA-D si HLA-Dr. Genele de tip HLA-D sunt reprezentate de 6 alele diferite. o Clasa III, contine genele pentru componentele complementului C2, C4 si proactivatorii C3. Superfamilia imunoglobulinelor este divizata in cinci familii de gene, distincte prin specificitatea unor determinanti antigenici, desi ca structura genele prezinta unele asemanari. Superfamilia imunoglobulinelor contine familiile : IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Fiecare familie de Ig este reprezentata de un multiplu de gene diferite. Organismul uman are un potential genetic de a sintetiza 108 - 1010 tipuri diferite de anticorpi. Aceasta capacitate de sinteza a fost evidentiata de existena a trei clase de gene care codiflca lanturile polipeptide din structura anticorpilor, notate cu H pentru catenele, /x, y, 5, a, e, cu K si y pentru catenele L. Fiecare familie este impartita in sub familii. De exemplu familia G, prezinta sub familiile IgGi, IgG2,IgG3 si IgC4, iar familia genelor pentru IgA are doua sub familii IgAi si IgA2, etc.. Genele superfamiliei imunoglobulinelor pot fi grupate cu dispunere in tandem, sau sunt disperate pe cromozomi diferiti. Transpozonii si retrotranspozonii Reprezinta o clasa foarte importanta prin efectul dezorganizant al activitatii genomului, dar mai ales prin numarul lor in genomul celular. Din datele publicate de I.HG.S.C (2001), se apreciaza ca aproximativ 45% din totalul secventelor repetitive sunt rezultate din transpozoni si retrotranspozoni. Transpozonii, sau genele mobile au fost descoperiti de Birnstiel si confirmati de catre MC. Clintock (1950 - Premiul Nobel in 1983). Prezenta lor in genomul uman este numeric redusa. In genomul uman s-au identificat urmatoarele familii de transpozomii: LINES, SINES, Alu si elemente asemanatoare retrovirusurilor (transpozoni fosili). c)

211

Retrotranspozonii - sunt secvente nucleotidice transpozate prin intermediul ARN-ului. Transpozitia transpozonilor in retrotranspozoni se face sub actiunea transcriptazei inverse. Exemple de retrotranspozoni sunt familia LINES 1 si familia Alu.

3.1 nsusi rile si functiile genelor

Genele, in doza unica, sau grupate in clase, familii si superfamilii, au insusiri particulare indeplinind functii precise" in mecanismele materializarii informatiei genetice pe care o detin, finalizand prezenta unor trasaturi de caracter in fenotipul individului.

3.1. Variatii in expresia genelor

O gena, normala sau mutanta, prezenta in genomul celulei nu-si exercita intotdeauna capacitatea de a-si exprima mesajul printr-un caracter fenotipic, sau cand il exprima, caracterul poate avea grade variabile de manifestare. Aceste particularitati sunt cunoscute sub denumirea de penetranta si expresivitatea genelor. a) Penetranta este capacitatea unei gene de a se exprima, de a induce un caracter exprimat fenotipic. Este frecventa unei gene dominanta sau recesiva, normala sau mutanta de a induce un caracter in fenotipul individului. Fenomenul de penetranta este bine observat la cuplurile gemelare univiteline (monozigoti), prin analiza caracterului pe filiatie directa sau in izolatele umane. Cand un caracter are un coeficient de exprimare sub valoarea de 100% se considera penetranta redusa sau variabila (incompleta). Varianta este conceptul totul sau nimic". Cand gena dominanta este prezenta in doza unica (heterozigot) sau doza dubla (homozigot) iar gena recesiva in doza dubla (cuplu alelic

212

homozigot), caracterul (determinat genetic) este exprimat, considerandu-se penetranta completa1 . In general penetranta completa este caracteristica genelor dominante. Exceptie de la aceasta regula este procesul de epistazie, cand gena dominata, desi prezenta in genomul celulei, este non-functionala, cauzata de o gena recesiva nealelica, dar cu implicatii convergente in definirea aceluiasi caracter. Penetranta cu expresivitate completa sau incompleta, ar fi expresia constitutiei genotipului individului, precum si a relatiilor intergenice, intre gene nealelice. Kelly (1980) considera ca penetranta incompleta ar fi rezultatul interactiunii mai multor alele mutante cu locusuri pe acelasi cromozom, sau pe cromozomi diferiti, fara o conditie speciala" a mediului ambiant. Penetranta incompleta poate fi comparata partial, cu fenomenul de epistazie, proces caracteristic pentru exprimari fenotipice controlate de alele recesive. b) Expresivitatea reprezinta gradul de expresie fenotipica a unui caracter, forma care poate fi moderata, usoara sau severa. Este manifestarea nuantata fenotipic, calitativ sau cantitativ a aceluiasi caracter la indivizii din grupul familial sau la indivizii conspecifici. Expresivitatea, ca termen altemativ, este rata de manifestare" a unui caracter. Notiunile de penetranta incompleta" si expresivitate variabila", ajuta sa intelegem mecanismele si factorii care influenteaza expresivitatea, sa intelegem manifestarea graduala a unui caracter la indivizii din populatia umana. Manifestarea graduala, cantitativ sau xalitativ, a unui caracter (expresivitatea variabila) este conditionata de mai multi factori: natura biochimica si raportul dintre genele alelomorfe, de polialelie, de raportul cuplurilor alelomorfe cu factorii de mediu (poligenia de exemplu). Exemple de expresivitate variabila sau incompleta la om pot fi: manifestarea particulara a hexodactiliei la nivelul membrelor, a etrodactiliei (cand de la o simpla" sindactilie, se poate ajunge pana la reducerea numarului degetelor palmo-plantare).
5

Heterozigotii care au gena dominanta in doza unica, aceasta isi exercita functia de determinism genetic. Homozigotii - cu un cuplu alelic dominant sau recesiv, ca urmare genele activeaza in doza dubla.
213

Expresivitatea caracterului depinde de genotipul individului de factorii endogeni si exogeni, sau de raportul combinatiei cuplurilor de gene nealelice, implicate in definirea caracterului. Deasemenea expresivitatea caracterului este conditionat de constitutia genetica corelata, interferential, cu factorii de mediu. Penetranta si expresivitatea variabila, particulara diverselor familii, ar fi consecinta diverselor mutatii.

3.2. Functia heterocatalitica a genelor

Este functia genelor implicate genetic in sinteza proteinelor, cunoscandu-se ca molecula proteica este etapa primara in definirea fenotipica a caracterului. In raport cu rolul exercitat in functia heterocatalitica, genele pot fi: a) Gena promoter - este necesara pentru initierea transcriptiei informatiei genetice. Situsul genei promotor precede locusul genei care initiaza transcriptia informatiei genetice in structuri" specifice de ARNm, catalizat procesul de ARN-polimeraza. La eucariote, promotorul care interconditioneaza cu ARN-polimeraza II ar prezenta secventele consens 5'TATA-3' si 5'-CCAAT-3\ care s-ar repeta (Barsh si Eptein (1989)). Dupa Jones (1987) si Lee (1987), secventa 5'-TATA-3' s-ar repeta aproximativ 750 de ori, ajungandu-se la un numar de cca 3000 pb, iar secventa de 5'-CCAAT3', prin repetabilitate, ar contine cca. 80-100 pb. Sunt secventele care preced locusul de start a genelor implicate in transcrierea ARNm b) Gena operator - este secventa de nucleotide care are locusul dupa pozitia genei promotor. Are rolul de a regla activitatea genelor structurale, putandu-se cupla sau decupla de proteina represor determinata genetic de gena reglator. Dimensiunea se apreciaza la aproximativ 30 pb. c) Genele structurale - urmeaza ca locusurile genei operator. Detin mesaje genetice a caror informatii sunt transcrise moleculelor de ARNn, ARM si ARNr. d) Gena reglator - este gena care actioneaza indirect asupra genei operator din componenta operonului. Ea actioneaza prin intermediul unei proteine pe care a determinat-o genetic, denumita represor. Are locusul pe acelasi cromozom cu operonul, sau pe cromozomi diferiti. ( A se vedea sinteza proteinelor) 214

e) Genele mutante . Modificarea structurii unei gene eveniment rar, este transmisa generatiilor celulare care succed prin mitoza (mutatii in celulele somatice), sau este transmisa pe generatii familiale sau in populatie daca modificarea genei s-a produs in celulele gametice. Gena mutanta poate fi: o gena structurala, operatoare, promotor, sau gena reglator. Consecintele pot fi urmatoarele: mutatia genei structurale deregleaza sinteza proteinelor (enzimelor), obtinandu-se molecule cu calitati structural-functionale anormale. In functie de rolul proteinelor (inductori morfogenetici-explicam etiologia genetica a malformatiilor), implicarea in infrastructura celulelor, tesuturilor, morfo si histodisplazii, in componenta enzimelor - dismetabolii, etc.) in organism apar dereglari in activitatea celulelor, a organismului, sau absenta unor activitati genice, a caror functie poate fi esentiala pentru integritatea structuralfunctionala, esentiale pentru individ; mutatia genelor reglator, promotor sau operator, induce: sistarea sintezei de proteine, dereglarea homeostaziei moleculare si functionale a organismului. Genele mutante, ca unitati genomice functionale", au rol etiologic in majoritatea bolilor cu determinism genetic in familie, in populatie. Mutatiile genice sunt responsabile", in anumite limite, de mecanismele implicate in evolutia bio-genetica a fiintelor vii.

3.3. Activitatea genelor in raport cu perioadele ontogenetice

Zigotul, rezultat din procesul de fecundatie intre spermie si ovula, contine intregul potential genetic, in care sunt inscrise, codificat, mesajele necesare pentru definirea integrala a viitorului individ, ca imitate biologica in populatie. Odata constituit zigotul, genele din genomul viitorului organism, nu-si incep activitatea de determinism genetic, in acelasi moment ontogenetic, cu implicare in cresterea, diferentierea, dezvoltarea, regenerarea fiziologica, in general, in toate functiile care, genetic, asigura integritatea structuralfunctionala a organismului pe parcursul vietii sale.

215

Studiile cronogenetice16 au consemnat ca dupa fecundare si consituirea genotipului zigotic, unele cupluri alelice devin active", exercitandu-si functia de determinism genetic, altele isi mentin starea de inactivitate", sunt aparent active, sau isi exercita functia strict in anumite perioade ontogenetice. Sunt indivizi heterozigoti la care o alela se comporta ca gena dominanta" in copilarie si recesiva" la maturitate in timp ce alela omoloaga este inactiva in copilarie, dar functionala la maturitate (probabil mecanismelor de pleiotropie genica, sau un mecanism special de epistazie). Ca exemplu este cazul unor indivizi care in copilarie au parul blond sau roscat, iar spre maturitae culoarea parului devine bruneta sau castanie. Un exemplu care convige despre activitatea genomului pe perioade ontogenetice, (cand acelasi caracter, etapizat, exprimat diferential fenotipic) este sistemul genetic eritrocitar al hemoglobinelor umane (Kleihaner, 1970; Brimhall, 1974, s.a.). In structura hemoglobinei (componenta proteicaglobina) normal, apar cinci tipuri de lanturi polipeptidice, diferite intre ele prin numarul si ordinea aminoacizilor, sintetizate pe perioade ontogenetice ale omului. Aceste lanturi polipeptidice sunt notate simbolic : epsilon (e), alfa(a) , gama(y), beta((3) si delta(8). Structura primara a fiecarui lant polipeptidic este determinata genetic de genele structurale s, a, y, p si 5. Ontogenetic, in mod normal, omul prezinta mai multe tipuri de hemoglobine (tabel IX) Perioada Embrionara Gower I - e4 Gower II - 0:2 2 Fetala Adult Fetala - 01272
A l - (xp2 2

A2 - a252

16

Cronogenetica - se ocupa cu dimensiunea temporala a genei. Fiecare gena are 0 incarcatura calitativa si cantitativa determinata in timp biologic ereditar al individului (activitate pe perioade ontogenetice). 216

Tipul de hemoglobina prezenta pe perioade ontogenetice este in raport cu activitatea cronogenetica a familiei genelor care determina acest caracter: gene active, gene latente, gene inactive. Analiza cronogenetica a aparatului genetic care determina hemoglobinele, este urmatoarea: in primele luni ale embriogenezei se sintetizeaza hemoglobina Gower I si apoi Gower II. Spre sfarsitul lunii a treia de sarcina, hemoglobinele embrionare incep a fi inlocuite de hemoglobina fetala (HbF), hemoglobina care va domina perioada fetala a dezvoltarii intrauterine a produsului de conceptie. La nastere HbF reprezinta 70-80% din totalul Hb al nou-nascutului, deoarece, inca din luna a cincea a perioadei fetale incepe a se sintetiza HbAi, care la nastere o gasim in concentratie de 20-30%. HbF scade rapid, incat dupa primul an de viata postnatala o gasim in concentratie de 1-2%, fiind inlocuita cu HbA]. Spre maturitatea biologica a individului, HbAi este inlocuita cu HbA2.

217

CAPITOLUL V SINTEZA SI REGLAREA GENETICA A SINTEZEI PROTEINELOR

Sinteza proteinelor cu structura si functii specifice este activitatea fundamentala a fiecarei celule din organism. Sinteza proteinelor, reglata de fluxul informatiei genetice, este programata genetic, este inscrisa in structura aperiodica a ADN-ului si decodoficata de moleculele de ARN (acizii ribonucleic!), (fig. 52, fig. 53).

NUCLEUACITOPLASMA
V

unitoieo 30S

unitcteoBOS

ribozo?r.i

mtroni

TRANSCRIPTIA

^Ank',

7RAN5CI ^ADN

ARNp'm

MATURAREA ARN m

TRANSFORMER* proielne

Fig. 52 Schema generala a sintezei proteice la eucariote (dupa Robert, 1983) 218

Fig 53 STRUCTURA SI SINTE-ZA ARN-ului

Compus din

ARN

sintetizat de

ADN

Pnr: initial este TRANSCRIPTIA MONOCATENAR nu este folosita o catena CATENA NONTIPAR are loc pe CATENA MATRITA

catalizator ARN-POLIMERAZA

se leagS sinteza cornplementantate SFARITUL 31 AL RIBOZEJ

!
A=U G=C

DIRECTIA 5'3'

principal! sintezei

COMPLEME NTARITATEA BAZELOR

1. Acizii ribonucleic/ (ARN)

Structure fundamentals a ARN este aceeasi cu cea descrisa la ADN, exceptand urmatoarele diferente: - componenta glucidica din nucleotidele ARN-ului este riboza, pentoza care asigura polaritate moleculei de ARN; - baza pirimidinica, timina, prezenta in structura ADN-ului, in structura ARN-ului este inlocuita cu uracilul; - ribonucleotidele din molecula ARN-ului contin ademina (A), guamina (G) - ca baze puternice si citozina (C), uracilul (U) - ca baze pirimidinice; - cu exceptia unor virusuri la care molecula de ARN este dublu catenara, la eucarite si procariote dupa decodificarea mesajului genetic si sinteza la nivelul ADN-ului cromozomial sau mitocondrial, molecula ARNului este monocatenara. Monocatena ARN-ului este complementary cu segmental polinucleotidic decodificat din ADN; - masa moleculara a ARN-ului mai mica si lungimea monocatenei mult redusa in raport cu molecula dublu catenara a ADN-ului. Lungimea moleculei de ARN corespunde cu numarului de nucleotide decodificate din ADN, respectiv de dimensiunea genei decodificate. Acizii ribonucleici se caracterizeaza printr-o accentuata heterogenitate structurala si functionala in activitatea celulei. Fiecare tip de ARN exercita functii precise" in sinteza proteinelor celulare. Acizii ribonucleici sunt moleculele care, dupa decodificarea ADNului si sinteza, tree in citoplasma celulei. In celula eucariotelor distingem trei tipuri de acizi ribonucleici: ARNm (mesager), ARN,- (ribozom) si ARNt (transport). Aceste tipuri de ARN difera intre ele prin gradul de polimerizare, masa moleculara si structura moleculei. Sinteza ARNm este conditional de situsul promotor care initiaza transcriptia. Dupa sinteza, ARN-ulm este implicat in mecanismele de translate. Moleculele de ARN,- si ARNt sunt transcrise de matrite genice ale ADN-ului, si nu prin mecanisme de translate a moleculei de ARNm.

220

1.1. ARN-ul mesager (ARNm) Molecula de ARNm este monocatenara, are o masa moleculara variabila (in functie de dimensiunea genei care a fost decodificata), are capacitatea de reinnoire rapida. Se caracterizeaza printr-o mare instabilitate metabolica. Durata de supravietuire a unei molecule variaza intre 3' - 5' la procariote si de cateva ore la eucariote. Folosindu-se uridina tritiata (marcare cu tritium) s-a costatat ca ARNm se sintetizeaza in zonele eucromatice ale cromozomului, respectiv in zonele unde nu este ADN repetitiv. Zonele eucromatice corespund ADN-ului nerepetitiv. Cantitatea de ARNm in celula este de aproximativ 5% din totalul ARN-ului celular. Prin decodificarea matritei din ADN, ARNm va inregistra si transcrie mesajul genetic care, prin translatie, va fi inscris in sinteza si structura unei proteine specifice. 1.2. ARN-ul ribozomal (ARNr) Prezent in celula in cantitate de 75 - 85% din totalul ARN-ului celular. II gasim in componenta ribozomilor si/sau mitocondriilor citoplasmatice. ARN, este heterogen. Hetrogenitatea s-a stabilit in raport de masa moleculara si constanta de sedimentare (unitati Svedberg). Ribozomii, ca organite citoplasmatice, descrTselle G. E. Palade, sunt formati din doua subunitati inegale, diferentiate prin constanta de sedimentare (S) de 60 S si 40 S. In absenta ARN-ului, cele doua subunitati sunt disociate si liber dispersate in citoplasma. In prezenta ARNm cele doua subunitati se cupleaza, formand ribozomul, declansand procesele de translatie si sinteza proteinelor. Fiecare subunitate constituie complexul ARN, si proteine, complex denumit de Tibaldi unitatea functionala a cromozomului. In subunitatea 40 S, gasim molecula ARN, cu constanta de sedimentare 18 S si 33 molecule de proteine ribozomale. In subunitatea 60 S sunt molecule ARNr cu constanta de sedimentare 5,86S, 28S si 5S. Moleculele ARN,- 28S, 5,86S si 5S au regiuni helicale scurte, prin cuplarea complementara a bazelor azotate din structura. 221

ARNr se sintetizeaza la nivelul bratelor scurte (p) a cromozomilor acrocentric! (13, 14, 15, 21, 22). Sylvester (1986), studiind structura si organizarea complexelor repetitive la nivelul cromozomilor acrocentrici, apreciaza la 200 - 300 gene reale si aproximativ 200 pseudogene sunt implicate in sinteza ARNr 5S. In prezent se estimeaza un numar de cateva sute si chiar mii de copii care asigura transcrierea ARNr. Brajele scurte ale acrocentricilor, locul de sinteza a ARNr, sunt cunoscute si sub denumirea de organizatori nucleari". Greutatea moleculara a subunitatilor ribozomale este de aproximativ 1,6 milioane daltoni pentru subunitatea 60 S si de 900.000 d pentru subunitatea 40 S. Moleculele de ARNr asigura cuplarea ribozomului cu ARNm si acceptarea ARNt. ARNr are un dublu rol: structural si catalitic (in formarea lantului polipeptidic prin legaturi peptidice). 1.3. ARN-ul de transport (ARNt) Este un ARNt adaptator, care descifreaza mesajul genetic decodificat de ARNm din ADN, pozitionand si ordonand aminoacizii. Are rolul de transport al aminoacizilor, activati in prealabil, spre locul de asamblare si formarea polipeptidelor care se sintetizeaza la nivelul ribozomilor. ARNt este un micropolimer continand intre 75 - 100 ribonucleotide. In 1971, Attardi si col. au estimat, experimental, existenta a 1310 gene in genomul uman care codifica moleculele de ARNt. Gavrila (2004) mentioneaza ca prin metoda draft, care analizeaza secventierea genomului uman, s-au identificat numai 497 gene care ar codifica ARNt. Sinteza sa are loc la nivelul ADN-ului cromozomial sau mitocondrial. Initial este monocatenar, dar, prin autocomplementaritate, va prezenta o structura secundara secvential dublu catenara si o structura tertiara in trefla. ARNt prezinta doua situsuri, sau polaritati functionale: la extremitatea 3'-OH este un brat liber lung, continand o secventa de trei nucleotide cu bazele CCA (in ordinea proximala -> distala). Adenina terminala de la bratul liber lung se va cupla cu aminoacidul pe care-1 va transporta. Prin cuplarea aminoacidului (forma activata a aminoacidului) de segmentul 3'-OH CCA, ARNt il va vehicula spre ribozom, locul de sinteza a proteinei;
222

a doua polaritate functionala (situs) este bucla prezenta in partea opusa a extremitatii 3'-OH. In bucla exista o secventa de trei nucleotide cu rol de anticodon. Anticodonul este complementar cu codonul din ARNm unde va pozitiona aminoacidul. La molecula ARNt, ca structure terfiara, gasim: un brat liber scurt care contine nucleotide cu guanina. Este bratul5' OH fosfosilat; bucla B care se ataseaza de suprafata ribozomului; bucla C care se cupleaza cu aminoacid-sintetaza. Molecula ARNt are masa moleculara ce variaza intre 23000 - 30000 daltoni. Daca luam in consideratie ca pentru cei 20 aminoacizi sunt 61 triplete (codoni) cu sens, in celula ar trebui sa identificam existenta a 61 tipui de molecule ARNt. O molecula de ARNt se deosebeste de celelalte molecule ARNt prin anticodonul din bucla centrala. Fiecare tip de ARNt are un anume anticodon pentru un anume aminoacid. In prezent s-au identidficat 40 tipuri de molecule ARNt. Cum sunt unii aminoacizi recunoscuti de mai multi anticodoni, se poate considera existenta unei redundante informationale pentru ARNt. Aceasta redundanta asigura sinteza rapida si corecta" a proteinelor in celule.

1.4. ARN-ul interference (i-ARN)

In 2004, Goldman a descoperit existenta unui tip de ARN: s i ARN (small interferig ARN). Este un ARN cu molecula foarte mica, cu un numar de cca. 22 nucleotide. Aceasta molecula este considerate un micro interferig ARN (m i ARN). Moleculele de pre-mi-ARN sunt procesate de diferiti membri din familia ribonucleazelor clasa III. Moleculele mi-ARN ar avea functia de interferenta cu ARNm, dar unele molecule ar fi implicate in blocarea transcriptiei si fonnarii heterocromatinei. Molecula de i-ARN inhiba transcriptia, dar este i components integranta in mecanismul de reglare fina in expresia genelor din celulele normale. De asemenea, si-ARN serveste ca molecula tinta pentru medicamentele si agentii terapeutici. Un alt aspect important este ca i-ARN poate fi folosit in sinteza insulinei de catre celulele P - pancreatice (M. Stoffel, 2004).
223

Sunt cercetari efectuate de Hung - Shih (2004) care au evidentiat rolul mi-ARN in reglarea unor gene implicate in procesul dezvoltarii organismului. De exemplu, tintele actiunii mi-ARN sunt implicate si in semnalizarea si cresterea celulara, fiind considerat un factor de transcriptie. Sunt cercetatori care considera ca i-ARN poate fi foiosit, secvential, pe un set de gene cu expresie alterata, pentru a identifica eventualele erori in cazul represiei acestora. De asemenea, i-ARN permite studiul schimbarilor in expresia uneia sau mai multor gene. De exemplu, W. Pardrige (2004) a obtinut rezultate remarcabile in studiul tumorilor cerebrale. Pardridge, impreuna cu colaboratorii, lanseaza ipoteza ca i-ARN ar putea fi foiosit in terapia genica asupra unor celule mutante. De exemplu gena EGFR normala sau care a suferit mutatii. Este gena care determina sinteza receptorului factorului de crestere epidermic (EGFR) in tumorile cerebrale maligne.

2. Participarea moleculelor ARN la sinteza proteinelor

Materializarea mesajelor genetice, inscrise in structura ADN (cromozomial sau mitocondrial), respecta fluxul unidirectional si universal al informatiei genetice, conform teoriei semantice cu respectarea dogmei centrale a geneticii (fig. 54).
R<.l>ltc,irc TnimcnpUc

H ADN h------------! ARN" > ADN - pulimet;j/a

fV.'S-, 1|..1!I>U

Fig.54 Dogma centrala a fluxului informatiei genetice. (Revizuita dupa Diane K. Lavett, 1997).

224

2.1. Fluxul informatiei genetice

Biologia moleculara a permis descifrarea mecanismelor genetice care stau la baza formarii caracterelor exprimate fenotipic. Fiecare caracter, morfologic sau molecular, manifestat la indivizi in populatie, reprezinta ultimul lant" din seria etapelor biochimice controlate ontogenetic si filogenetic. Marea majoritate a caracterelor sunt determinate de gene inscrise, codificat, in structura ADN-ului celular. Intre informatia genetica, ca program, si forma finala de exprimare a caracterului se interpun o serie de etape obligatorii (fig. 55). ADN
CONTROLUL TRANSCRIPTIEI ARN-PREMESAGER PROCESARE AKNpm CONTROLUL PROCESULUI

ARN-m-MATUR CONTROLUL TRANSPORTULUI CONTROLUL ARN-m DEGRADAT TRANSPORTUL IN CITOPLASMA CONTROLUL TRANSLATIEI

ARN-m INACTIV

PROTEINA CONTROLUL DEGRAD ARIIPROTEINEI PROTEINA DEGRADAT A]

Fig. 55 Fluxul informatiei genetice la eucariote (Schema Generala) Elementele si etapele care preced si definesc caracterele ereditare au urmatoarea ordonare: - Prima etapa. Este genomul de la care se initiaza fluxul informatiei genetice. Genomul este un stoc de informatii biologice, existente in structurile moleculelor ADN-ului cromozomial sau mitocondrial. Pentru a putea fi utilizate informatiile biologice, este necesara activitatea coordonata a unor enzime si proteine, implicate intr-o succesiune complexa de reactii biochimice denumite expresia genomului. In cadrul acestui complex de 225

reactii biochimice se realizeaza transferul mesajului genetic in structura ARN m. Sinteza ARN-ului mesager, conform principiului complementaritatii, respecta riguros structura primara a ADN-ului care este decodificata. - A doua etapa - Produsul initial al expresiei genomului este transcriptonul. Transcriptonul este reprezentat de ARN, ca rezultat al decodificarii genelor din genom. Transcriptonul este reprezentat de tipurile de acizi ribonucleici implicati in sinteza proteinelor (ARNm, ARNr i ARNt). Transcriptonul se realizeaza prin procese de transcriere, cand genele din genom sunt copiate prin sinteza moleculelor ARN. Albert si col. (1994) au constatat urmatoarele: cantitatea totala a ARN-ului celular se raporteaza la gradul de complexitate structural -functional^ a organismelor. De exemplu, bacteriile au o cantitate totala de 0,05 - 0,10 pg17 ARN, iar in celulele mamiferelor cantitatea ajunge la 20 -30 pg. Dar nu toata cantitatea exprimata reprezinta transcriptonul. Albert si col. au constatat ca in celule, pe langa tipurile ARNm, ARN,- i ARNt (care reprezinta transcriptonul), exista o cantitate apreciabila de ARN care nu este codificat, nu este integrat in transcripton ca functionalitate. Astfel, in nucleu exista un ARN nuclear mic, sm ARM (small nuclear), care datorita bogatiei in uracil (21), este denumit si ARNu. Acest ARNsm ar fi implicat in procesarea ARNm. In citoplasma se gaseste un ARN mic ARNsc (small citoplasmatic), a carui functie este inca neelucidata. Nuta i col. (1998) presupune ca acest ARNsc, numit si ARNtm (mesagerul ARN de transfer), s-ar ata$a de un ARNm adaugand peptide in proteinele sintetizate incorect. - A treia etapa - Dupa formarea transcriptonului, acesta trece in citoplasma, acolo unde are loc sinteza protenelor. In citoplasma, componente ale transcriptonului, - ARN,-, si ARNm -, vor forma nisa" poligon, locul de asamblare a aminoacizilor in lantul polipeptidic (proteina) pe care ii transports ARN,. - A patra etapa este sinteza de proteina. Proteina sintetizata este etapa primara de materializare a mesajului genetic inscris in genom. Este etapa esentiala de materializare a informatiei genetice. Proteinele celulare, in calitate de caractere mendeliene, pot fi cercetate cu metode imunologice sau de biochimie genetica. Rezultatele
7

Picogramul (pg) - este simbolul denumirii submultiplilor unitatilor de masura. Este unitatea care semnific5 o milionime de milionime (10'12) 226

obtinute cu metodele de biologie moleculara, aplicabilitatea interpretative a datelor, a facut posibila conturarea homotipologiei, stiinta care se ocupa cu studiul caracterelor moleculare in populatie. - A cincea etapa ia in analiza modalitatile de participare si constituire a caracterelor morfo-anatomice la care proteinele sunt implicate direct. Realizate ontogenetic, controlate genetic si influentate de factorii exogeni, caracterele exprimate fenotipic sunt si particularizeaza pe fiecare individ in populatie. Daca urmarim fluxul informatiei genetice, biopolimerii celulari pot fi clasificati si etapizati dupa gradul semnificatiei genetice si participare la edificarea caracterelor fenotipice, conform teoriei semantice (Pauling). Conform teoriei semantice, fluxul informatiei genetice se divizeaza in etape si subetape, in raport de implicarea fiecarui component in mecanismul sintezei de proteine. Fluxul informatiei genetice poate fi analog cu sistemele cibernetice unde, pornindu-se de la programul central", acesta trece. printr-o serie de relee, pana la raspunsul final (produsul final). Conform teoriei semantice, releele" genetice sunt divizate in urmatoarele etape: - Semantida primara - este reprezentata de molecula de ADN ca program central, program realizat prin dispunerea aperiodica a nucleotidelor in structura primara. Aceasta dispunere stabileste programul informational genetic pentru sinteza unei proteine. Ca semantida primara, ADN-ul are stabilitate metabolica, capacitate de autoreplicare si, cand este cazul, autorepararea programului (autocorectarea). - Semantida secundara - reprezentata de ARNm, transcrie mesajul codificat al genelor din semantida primara (ADN). Avand durata scurta de supravietuire, nu are capacitatea de autoreplicare si reparare. Acest releu este important deoarece, copiind mesajul genetic din ADN si trecut in citoplasma, asigura, prin translatie, ordonarea aminoacizilor in structura proteinei. Tot in grupul semantidei secundare" sunt si moleculele de ARNr si ARNt care, dupa ce au fost transcrise din ADN, indeplinesc functii precise in mecanismele sintezei de proteine. - Semantida tertiara - este molecula de proteina, care, rezultat si control specific, este determinata de semantida secundara (fig. 56). Conform programului copiat de semantida secundara din molecula de ADN (semantida primara), semantida tertiara, desi are structura i 227

functie specifica, nu are capacitatea de a define un program folosit in sinteza specifica a altor proteine. Structura si functia sa specifica asigura exprimarea fenotipica a trasaturilor de caracter prin care se particularizeaza fiecare individ.
Semantida ________^ A.DN primarS

Semantida secimdaia

.ARN

MICROMORFOLOGICE (Moleculaie) CONTROLUL .\RN111 DEGR.\DAT PROTEINE-

ca enzune

MACROMORFOLOGICE (coiifoinuitii aiiatomomoxfo-stiuctmale)

LIPIDE

GLUCIDE PRODUSI DE METABOLISM

________ ___________./
MOLECULE EPISEMANTICE

Fig. 56 Fluxul informatiei genetice in acord cu teoria semantica Caracterele realizate de semantida tertiara (proteinele) pot fi de nivel molecular sau ca structuri morfo-anatomice. In organism se gasesc un numar impresionant de molecule proteice sau molecule heteroproteice (Ig, sistemele genetice eritrocitare si plasmatice, HLA, etc.) care pot fi identificate si care asigura constitutia genetica moleculara a individului. Dar sunt proteine implicate in structura diverselor tesuturi si organe, in infrastructura celulei, finalizand caracterele anatomo-structurale. Caracterele episemantice. In celula, in organism se sintetizeaza polizaharide si polilipide. Sunt caractere episemantice deoarece, ca produs final, nu exprima total informatia primelor trei semantide. Sinteza lor este asigurata de proteina specifica din structura si functia unei enzime.

228

3. Codul genetic
Intelegerea fluxului informatiei genetice impune si cunoasterea modului cum sunt codificate mesajele in structura ADN-ului cromozomial sau mitocondrial. Informatia genetica este inscrisa in moleculele acizilor nucleici (ARN) sub forma codificata, cod realizat prin ordinea aperiodica a bazelor azotate in structura primara a acestor biomolecule. Ordinea aperiodica intracatenara a bazelor azotate definete mesajul genetic. Ca defmitie, informatia genetica este determinate de secventa nucleotidelor din structura moleculei de ADN, copiata de ARNm, ca rezultat al transcriptiei si care ordoneaza, sau codifica specific, secventa aminoacizilor din structura unei proteine. Informatia genetica este conservata si multiplicata prin functia autocatalitica a moleculei ADN-ului (prin replicare semiconservativa). Orice informatie genetica este reprezentata conventional, prin simboluri (semne). Totalul simbolurilor care pot servi la realizarea unui mesaj genetic sau informatie, reprezinta alfabetul genetic. Simbolurile se asociaza intre ele in cuvinte de cod" prin care este exprimat mesajul genetic. Succesiunea cuvintelor de cod ordoneaza, codificat, fraze logice", se obtine mesajul integral pentru definirea unei molecule proteice exprimata fenotipic. Prin asocierea frazelor logice, codificate" se obtin mesajele genetice implicate in definirea caracterelor exprimate fenotipic, deflnind individul ca unitate biologica. Deci informatia genetica lucreaza cifrat". Cifm prin care informatia este logic exprimata, reprezinta codul genetic. Cunoscandu-se elementele de baza care asigura informatia genetica se pune urmatoarea problema, cum un alfabet genetic, cuprins din patru simboluri : A (adenina), G (gnanina), C ( citozina), T (timina) sau U (pentru ARNm), traduce informatia genetica intr-un limbaj proteic in structura caruia gasim 20 amioacizi, respectiv 20 litere". Dupa elucidarea structurii, proprietatilor i functiei bio-genetice a ADN-ului s-a trecut la descifrarea codului genetic. S-a demonstrat ca unitatea de functie a codului genetic este codonul, notiune introdusa de Crick in 1961. Crick considera codonul o succesiune de baze azotate, necesare pentru codificarea unui aminoacid din structura unei proteine. Initial s-a presupus ca unitatea de functie cu care opereaza codul genetic este reprezentata de un singur nucleotid, adica codonul univoc. 229

Daca nucleoidul univoc specifica strict un aminoacid, numarul codonilor obtinut ar fi de 41 = 4, deci numai patru tipuri diferite de codoni. Este un numar insuficient de codoni fata de eel al aminoacizilor. Ca urmare, in structurile proteice indiferent de specie si grad de evolutie sa gasim numai patru aminoacizi, restui de 16 fiind nespecificati si si ar trebui sa lipseasca din structurile proteice. Deci codonul univoc nu este acceptat. Acelasi rationament si in cazul codonului biunivoc cand s-ar obtine 42 = 16 codoni. Numar insuficient de codoni, chiar daca se admite ca in formarea codonilor joaca rol si ordinea bazelor: A-T, T-A, G-C, C-G ar specifica fiecare un alt aminoacid. Codonul biunivoc ar specifica numa 16 aminoacizi, patru fiind nespecificati genetic. Nici codonul biunivoc nu se accepta. Gratie experientei lui Nierenberg si Matthali (1961), s-a demonstrat si acceptat ca, dimensional, codonul este de tip triunivoc. Ca fiecare aminoacid este codificat ca o tripleta, respectiv o succesiune de trei nucleotide adiacente. Prin aceasta asociere si ordonare, numarul combinatiilor posibile este de 43 = 64. Se obtine un numar mai mare de codoni in raport cu numarul necesar pentru cei 20 aminoacizi. Codonul triunivoc este acceptat.

3.1. Proprietatile codului genetic

Analizat codul genetic are urmatoarele proprietati: a) Unitatea de functie a codului genetic este codonul format din secventa liniara a trei nucleotide. Este o tripleta. De exemplu, daca in gena ADN-ului avem secventa ...ATTGCCATTATGGCATAA...", codonii formati vor fi urmatorii: ..."ATT-GCC-ATT-ATG-GCA-TAA"... b) Codul genetic este degenerat. Numarul codonilor realizati prin combinarea nucleotidelor - 43 - este de 64. Raportat la numarul de 20 aminoacizi, sau 44 codoni in plus. Plusul numeric de codoni asigura redundanta informationala. S-a demonstrat ca unii aminoacizi pot fi codificati de 2, 4 sau 6 codoni. Numai triptofanul si metionina sunt codificati de cate un singur codon. Pentru 18 aminoacizi, codificarea multipla este asigurata de codonii sinonimi, justificand denumirea de codon degenerat sau redundant. Existenta codonilor sinonimi pentru un aminoacid asigura corecta si rapida sinteza a proteinelor, reprezinta o eventuala protectie contra unor posibile mutafii si prevenirea efectelor lor in celula. Din totalul de 64 codoni, 61 codoni specifica cei 20 aminoacizi, sunt codonii cu sens, iar trei codoni sunt nonsens.
230

c) Codul genetic nu este ambiguu. Un anume codon cu sens recunoasje un singur tip de aminoacid. d) Codul genetic are codon initiator. Codonul AUG care specifica metionina, este eel de la care se initiaza procesul de translate a mesajului genetic din ARNm (codonul complementar din structura ADN-ului este TAC). e) Codul genetic are semne de punctuatie. Semnele de punctuatie sunt asigurate de codonii nonsens terminatori. Codonii terminatori cu rol de punctuatie genetica delimiteaza dimensiunea si continutul mesajului si sunt reprezentati de triplete bine definite. Codonii nonsens sunt urmatorii: UAA, UAG, UGA. Prezenta lor semnifica sfarsitul translatiei" mesajului genetic necesar pentru sinteza proteinei. f) Codul genetic inscris in molecula ADN este necunoscut in structura ARNm prin complementaritatea bazelor, de exemplu: C prin G, G prin C, T prin A, A prin U. g) Posibilitatile de amplificare a codului genetic sunt inepuizabile. De exemplu, secventa de 10 dezoxi ribonucleotide realizeaza un milion de combinatii sau mesaje genetice diferite pentru sinteza aceluiasi numar de lanturi polipetidice cu structura, functie si specificitate diferita. Daca am lua in analiza o secventa de 15 nucleotide combinatii posibile vor fi de 415. Deci cateva milioane. h) Codonii din structura ADN (respectiv ARNm) nu sunt separati intre ei prin prezenta unui nucleotid neintegrat in componenta codonului. Deci, intre codoni nu sunt semne" de separare, nu sunt virgule". i) Codul genetic nu este suprapus, nesuperpozabil. Deci doi codoni vecini nu au nucleotid comun. Fiecare codon are bazele proprii care nu participa la formarea si functia altui codon (Khorana, 1968). Daca ar fi codul genetic suprapus, ar trebui acceptata si ambiguitatea, adica nerespectarea corespondentei stricte un codon un anume tip de aminoacid. Ar fi nerespectarea citirii in flux continuu a mesajului genetic. De exemplu Korana, pentru a demonstra nesuprapunerea codului genetic, a facut urmatoarele observatii: secventa ... GAA GAA GAA - ... poate asigura sinteza unui homopolipeptid format din lizina, arginina sau doar din ac. Glutamic. Tipul de aminoacid incorporat in homopolipeptid depinde de punctul de unde este citit mesajul codificat. Daca citirea incepe de la primul nucleotid, iar tripletele formale vor fi ... GAA-GAA-GAA ... etc, polipeptidul va fi structurat numai din ac. glutamic. Daca citirea incepe cu al doilea nucleotid ...G-AAG-AAG-Aag... etc, polipeptidul va avea in componenta sa lizina. In cazul ca tranzatia incepe cu nucleotidul al treilea 231

vom avea codonii ... GA-AGA-AGA-AGA ... etc, polipeptidul va contine arginina, deci suprapunerea este exclusa. j) Codul genetic este universal. Este stabilit ca in structure acizilor nucleici gasim aceleasi tipuri de nucleotide indiferent regnul (animal sau vegetal) indiferent care este gradul de evolutie a speciilor (procariote sau eucariote, bacterii sau mamifere). Deasemenea s-a demonstrat ca un anume codon va codifica acelasi tip de aminoacid, indiferent specia. De exemplu codonul UUU specifica fenilalanina la toate speciile. Datorita universalitatii codului genetic s-a reusit biosinteza hemoglobinei prin folosirea ribozomilor si ARNm din reticulocitele de iepure, in prezenta ARNt de la Escherichia coli. Hemoglobina obtinuta avea caracteristicile Hb de iepure. De ce? Pentru ca tripletele (codonii) din ADN-ul cromozomilor de la iepure codifica aceeasi aminoacizi ca si codonii de la E coli. Ceea ce difera insa este ordonarea codonilor in structura acidului nucleic al fiecarei specii. Distributia pozitionala a aceluiasi codon in mesajul genetic din ADN confera specificitate structural-functionala a aparatului genetic pentru fiecare individ, specie. Aceasta caracteristica, universalitatea codului genetic", are importanta in ingineria genetica. k) Codul genetic se poate modifica prin mecanisme de mutageneza. Sunt factori exogeni, potential mutageni, prin doza sau efect, care actionand asupra moleculelor de ADN celular, pot induce modificari in structura ADNului, pot modifica mesajul genetic (fig. 57). Interesant este calculul probabilistic efectuat de Wright in 1966. El face urmatorul calcul: daca gena ar avea 1000 nucleotide, posibilitatea combinarii secventei nucleotide este de 41000 sau 10600. Daca s-ar inlocui o singura baza din cele 1000 existente, se pot obtine aproape 3000 tipuri de alele noi (vezi mutatia genetica).

232

Gena salbateca Gena cu substitutia iinei baze

ATG ATG

CAT

GCA

TCiA TGA

ATG | c_____ ATG c .........

CTT ! non-sen*

GCA

Gena cu insert 1a unei baze Gena cu supriinarea unei baze

ATG

: OCT

TGC1

ATG nonsens

: AAT

GC.

ATG

! CTG

CAT

GAA nonseiis

; TGC

Fig. 57 Efecte induse prin procesul de mutageneza (dupa Crick, 1961)

4. Codarea i decodarea ARN-ului (sinteza proteinelor)

a) Codarea - Transcriptonul este unitatea functionala de codificare a mesajului genetic in ARN, mesaj inscris in structura primara a moleculei de ADN. Codarea transcriptonului cuprinde ARNm, forma transmisa a mesajului genetic necesar sintezei unei proteine cu structura si functii specifice. b) Decodarea este procesul complex de traductie (translate) a mesajului genetic din ARNm in proteina. In decodare sunt implicare doua tipuri de ARN: ARNr si ARNt, care fmalizeaza proteomul. Procesele de codare si decodare sunt complexe, necesitand unnatoarele etape: Accesarea transcriptonului din genom. Este etapa care modifica structura cromatinei si pozitionarea genelor active din nucleozom, la nivelul carora se va sintetiza ARNm. Ansamblu complex de initiere compus din diverse proteine care conlucreaza pentru codificarea genelor in ARN. Acest complex este foarte important deoarece initierea este un proces cu inalta tinta, actionand strict in zona genelor active. Odata inceputa initierea codificarii se va continua cu sinteza ARN-ului m, care copieaza mesajul genelor din transcripton.
233

 O alta etapa este procesarea molecului ARN-ului. La eucariote, gena are structura discontinue sau in mozaic continand exoni i introni. Intronii sunt subunitati genice noninformationale care sunt codificati impreuna cu exonii. Din aceasta codificare mixta a genei (exoni-introni) se formeaza ARN premesager sau primar. Acest ARN precursor pentru a deveni ARN m matur (functional) este supus unor mecanisme de procesare, la care sunt implicati spliceosomii (cu rol in cuplarea corecta a exonilor dupa decuplarea de introni). Ansamblul complex al translatiei (traductiei) mesajului genetic din ARNmm intr-o structura proteica, in structuri proteomice specifice. Formarea lantului polipeptidic si formarea structurii proteinei si configuratia corecta a structurii tridimensionale si cuaternare a proteinelor.

5. Transcriptonul i transcrierea informatiei genetice m structura ARNm

Transcriptonul, components semnificativa, confine codul pentru sinteza ARNm, iar acesta va specifica structura proteomului. Transcriptorul nu este sintetizat de novo" in celula, in organism. El este motenit de la ascendenti, mentinut in succesiunea generatiilor prin replicare semiconservativa sj transmis la descendenti (a se vedea sinteza ADN-ului sj aplicarea cromozomilor). Transcriptia nu rezulta din sinteza transcriptonului. Este rezultatul decodificarii mesajului din ADN, cod care este trecut in sinteza si structura ARNm, conform principiului complementaritatii bazelor azotate: ADN: AGCT ARN UCGA. Transcriptonul uman. Transcriptonul uman este substantial mai complex fata de eel al procariotelor i al unor levuri (Saccharomyces cerevisiae). Dei putin cunoscute, genele transcriptonului uman au inceput sa fie identificate, de exemplu, Caron si col. (2001) studiind transcriptonii din 8 linii celulare, normale si canceroase, au descoperit diferente cantitative la moleculele de ARNm care au fost transcrise de transcripton. Interesanta este descoperirea facuta de ei ca in moleculele codificate de transcriptoni, cantitatea de ARNm variaza (cantitativ) intre diversele tipuri de celule canceroase. Exemplu sunt diferentele transcriptonului intre

234

i celulele cancerului de colon si cele ale cancerului pancreatic (Zhang si col, J 1997). Prin analiza transcriptonului si stabilirea diferentelor calitative si | cantitative a moleculelor de ARNm, se deschid noi perspective cu implicare J inpatologie: - diagnosticul diferential in diversele tipuri de cancer la om; - descoperirea unor noi modalitati de tratare a bolii canceroase, sau a j altor boli pe fond genetic. Cei care au initiat analiza transcriptonului in diagnosticul diferential j in diversele tipuri de cancer au fost Golub i col (1999), care, analizand | transcriptonul in doua forme de leucemie (leucemia limfoblastica acuta si | leucemia mieloida acuta) au constatat diferente cantitative a ARNm celular.

j 6. Transcnerea transcriptonului
Pentru transcrierea (traductia) mesajului genetic Tnscris si j transcripton este necesara prezenta urmatoarelor elemente: | - transcriptorul, in structura ADN-ului celular, ce serveste ca matrifa de \ sinteza a ARNm precursor (ARN premesager) i - complexul enzimatic al ARN polimerazelorl, II sj III; - ribonucleotidelor activate; - elementelor cis-reglatoare in amonte de latura centrala a transcriptorului din regiunea laturei 5. Aceste elemente sunt prezentate de casetele 5. TATA sau GC si CAAT, considerate ca elemente de start al transcriptiei; - activatorilor: - sunt proteine trans-activatoare pentru fiecare ARNpolimeraza (la eucariote importanta pentru transcrierea mesajului genetic i este ARN-polimeraza II).

235

OPERON
asigura

TRANSCRIPTIA

Permite

In citoplasma

opreste

CONFORMATIA

f adopta

TRANSLATIA rezulta CONFORMATIA

PROTEINE ENZIME ARN-m

adopta

AMINOACID Concentratia crescuta in aminoacizi___________carid

ARN-m concentratia in aminoacizi scazuta

Fig. 58 Interrelatia cuplarii transcriptiei i translatiei Spre deosebire de procariote, la eucariote gena are o structure discontinua (in mozaic), formata din exoni si introni. Fiind copiate ambele secvente, intronii si exonii, traductia sau transcrierea mesajului genetic si maturarea ARNm, pentru a deveni functional, se desfasoara in doua etape: prima etapa este codificarea integrala a genei la eucariote (exonii si intronii) cu formarea molecului de ARN premesager (precursor). 236

 a dotia etapa este procesarea ARN pre-mesager, rezultand ARNmm (mesager matur), forma sub care trece in citosolul celulei traversand porii anvelopei nucleare. 6.1. Etapele formarii ARNm. Pentru sinteza ARNm se parcurg urmatoarele etape: - initierea transcriptiei; - elongatia transcriptiei; - stoparea (terminarea) transcriptiei.

6.1.1. Initierea transcriptiei, elongatia si stoparea.

a) - La procariote. Deoarece gena la procariote nu contine introni initierea transcriptiei se deruleaza in modul urmator: ARN-polimeraza actioneaza asupra transcriptonului. In zona tintita" pentru initierea transcriptiei, cele doua catene ale moleculei ADN se separa, iar cateva 5'->3' va lua aspectul de bucla monocatenara, cu capetele complementare libere. Despiralizarea situsului de initiere se face sub actiunea helicazei si enzimei dna. Sinteza ARNm are loc numai pe catena cu directia 5'3', considerate catena transcripton sau codanta. Catena complementary 5'>3' este necodanta sau non-transcripton. Secventa promotor -TATAAT- se gaseste in amonte de situsul start pentru sinteza ARNm. Dupa despiralizarea transcriptonului, pe situsul start care corespunde promotorului si in prezenta proteinei sigma (o), se fixeaza ARN-polimeraza. Odata cuplata enzima incepe transcrierea codului inscris in structura genei, rezultand molecula de ARN-m. Sinteza ARN-m pe catena ADN respecta, principiul complementaritatii bazelor: ADN: - 5' ATGC......3'ARN........UACG............ Dupa o secventa de 10 nucleotide de la inceperea transcrierii mesajului, proteina sigma (a) se decupleaza de gena promotor. Pentru procariote, mesajul codificat pentru formarea ARN-m incepe cu nucleotidul care are adenina A. Cand transcrierea ajunge spre terminarea genei, actioneaza o proteina stop, o proteina speciala rho" care are proprietatea sa recunoasca

237

tripleta stop" din gena transcrisa. Codonul stop, bogat in GC si recunoscut de proteina rho", va incheia sinteza ARNm. Dupa terminarea transcriptiei, ADN-ul isi reface integritatea moleculara dublu catenara. La procariote ARN-polimeraza recunoaste gena care va transmite ARN-m. La procariote, din transcrierea codului, rezulta direct molecula de ARNm functional, deoarece ADN-ul genei nu contine introni. b) La eucariote. Spre deosebire de procariote, la eucariote transcriptia mesajului genetic este mai complexa. Deosebirile intre sinteza ARNm la procariote si eucariote sunt urmatoarele: la procariote gena (lipsita de introni) va fi total transcrisa rezultand ARNm. La eucariote, la care gena contine introni si exoni, gena va fi transcrisa in totalitate (si exonii si intronii), rezultand in prima etapa un ARN premesager (precursor). Ca ARN premesager, acesta este supus unor etape de procesare pentru a se obtine ARN mesager matur; la procariote se transcrie orice gena indiferent de pozitia sa in molecula ADN. La eucariote, datorita existentei ADN-ului repetitiv noninformational, codificarea mesajului in ARN p.m. are loc numai in zonele eucromatice ale cromozomului, unde este ADN nerepetitiv genetic informational; la procariote in sinteza ARNm este implicata numai enzima ARN polimeraza, in timp ce la eucariote activitatea de transcriere este catalizata de trei tipuri de enzime: ARN polimeraza I este prezenta in zona organizatori nucleolari la cromozomi acrocentrici. Catalizeaza sinteza ARNr; ARN polimeraza II, este dispersata in nucleoplasms. Catalizeaza sinteza ARN pre-mesager; ARN polimeraza HI, prezenta in nucleoplasm^, catalizeaza sinteza precursorilor ARNt. Initierea transcriptiei la eucariote are loc la nivelul situsului de initiere, numai dupa ce s-a fixat enzima ARN-polimeraza II. Fixarea enzimei are loc numai dupa recunoasterea situsului TATA-box al promotorului de la capatul 5' > al transcriptorului. In amonte de situsul de initiere este o secventa 5'->3' (5' ... CCAGCCATG) implicata in declansarea si prereglarea sintezei ARN premesager. Deoarece situsul de initiere contine codonul initiativ TAC pentru metionina, copierea mesajului
238

genetic in ARNpm va incepe cu AUG - corespondentul complementar in ARNm.

16.1.2. - Accesarea genomului si procesarea ARN premesager

Procesarea genomului implica procese ce vor influenta structura cromatinei sj pozitionarea nucleozonului, acolo unde sunt gene active. Accesarea va asigura respectivelor gene accesibilitatea de a fi decodificate in ARN (fig. 59). AON SE MANIFEST A

Fig. 59 Transcriptia informatiei genetice in structura ARNm (dupa Robert, 1983)

239

Ansamblul complex implicat in initierea transcrierii mesajului genetic din gene cuprinde setul de proteine sigma (a) si rho care vor conlucra cu ARN polimerazele I, II i III pentru copierea codului in structurile ARN. Caracteristica ansamblului complex de initiere este tinta exacta" de actionare din genom, tintele" adiacente genelor active. 6.1.2.1. Procesarea pre-ARNm La eucariote gena este structurata sin exoni si introni. La sfarsitul transcrierii genei, rezulta ARNm nefunctional, numit pre ARNm sau precursor. Pentru a-si exercita functia proteomica, acest precursor ARNm este supus unui complex de procesare. Dupa ce proteina rho" a recunoscut codonul stop i s-a incheiat transcrierea mesajului din gena, ARN precursor este supus proceselor de procesare. Trecerea de la ARN precursor la Arnmm se face in doua etape: - prima etapa este legata de modificarea capetelor 5' si 3' a ARNm precursor. - a doua etapa este procesarea propriu-zisa a ARN precursor.. Pentru prima etapa, modificarile sunt urmatoarele: la capatul 5' al ARNm precursor se va cupla o molecula 7-metil guanozina, iar la capatul 3' o secventa poliadenilat, denumita si coada adenilica. Modificarea celor doua extremitati ale ARNm precursor asigura urmatoarele semnificatii: - stabilitate i protectie fata de actiunea endonucleazelor; - dupa maturizare, asigura transportul ARNm din nucleu in citoplasma (faciliteaza traversarea anvelopei nucleare), precum i cuplarea cu sub-unitatea ribozomica 60 S. A doua etapa este procesarea ARNm precursor. Este etapa de separare a exonilor de introni, separare exacta. Orice eroare modifica mesajul genetic. Excizia are loc in punctele de contact dintre exoni-introni, unde, in ARN precursor, exista cuplul 5'-GU, denumita situs donor si cuplul 3'-AG situs acceptor. O remarca! La eucariote nu exista ARNmm lipit de coada poliadenilica. Lipsa acestuia ar face nefunctional ARNm. Singurul ARNm lipsit de coada poliadenilica este eel care codifica sinteza histonelor. Secventa poliadenilat este denumita i situs de incheiere a transcriptiei".
240

De consemnat: fiecare gena transcrisa este incadrata dc doua situsuri: - situsul initiator de care se leaga ARN polimeraza II, - situsul terminator, care urmeaza codonului stop si care, sub actiunea endonucleazei, ataseaza coada" poliadenilica de molecula ARNm precursor. Dupa separarea exonilor de introni, exonii se vor cupla, se vor matisa. Un rol esential in procesele de matisare il au spliceosomiP. Spliceosomii sunt segmente de snARN (small nuclear ARN) cu capacitate catalitica (enzimatica). In asociere cu ARNm precursor, sunt implicati in procesul de splicin (matisare). In genomul uman se apreciaza exitenta a circa 22 gene a caror locasuri ar fi pe cromozoml 17 p 11.2 si 17 q. ' Spliceosomii au un dublu rol: recunosc punctul delimitant dintre exoni si introni care vor fi recuplati, matisandu-i in ordinea exacta, cum se gaseau in structura genei transcrise. In urma recuplarii exonilor si eliminarea intronilor, se obtine molecula de ARNmm (functionala). Dupa aceasta procesare care are loc in nucleu, ARNmm trece in citoplasma celulei unde prin procesele de translate va asigura sinteza unei molecule de proteina cu structura si functie specifica. Observand mecanismele de procesare, de matisare a intronilor si sudarea exonilor, P.Chambon (1981) a incercat sa explice originea, semnificatia si rolul intronilor in genomul eucariotelor. Chambon lanseaza urmatoarea ipoteza: spliceosomii (autorul a folosit termenul de enzima ancestrala) cu rol catalitic operand asupra preARNm pentru a rezulta ARNm matur, ar fi evoluat plecand de la o singura ribonucleoproteina ancestrala si care in evolutia biologica, s-ar fi diversificat in secvente mici de ARN (small nuclear) cu rol in procesele de cataliza si formare a ARNm matur. Dupa Chambon, intronii relicva" ar avea aceeasi origine cu ADN-ul repetitiv, aparent fara functie", dar care s-au perpetuat in succesiunea generatiilor, chiar daca este neutilizabil. Mai optimista este ipoteza lansata de Gilbert si Tonegawa (1981). Ei considera ca asa numitele relicve" intronice ar fi avut si vor avea importanta deosebita in evolutia biologica. Conform ipotezei lor, intronii relicva" ar fi existat la toate organismele vii, dar organismele cu ciclu de dezvoltare foarte rapid (eubacteriile, drojdia) s-ar fi pierdut in cursul evolutiei, prin actiunea selectiei. 241

Dupa Gilbert si Tonegawa, intronii relicva" n-ar fi inactivi, iar mecanismul excizie-lipitura" in timpul procesarii ARNm precursor ar avea un avantaj evolutiv, pentru ca prin combinatie cu mecanismele de crossing-over inegal si duplicatie-deficienta ar fi putut crea, si creeaza, noi secvente genice active, determinand noi proteine, noi caractere (nromale sau patologice).

7. Translatia sau transcrierea mesajului genetic din ARNmm 7.1. Sinteza de proteine
Proteomul este produsul final al genomului, i cuprinde toate proteinele dintr-o celula intr-un anume moment. De exemplu, o celula tipica mamiferelor, celula hepatica se presupune ca are 10000-20000 tipuri diferite de proteine. Ca hepatocitul ar contine aproximativ 0,5 mg sau 18-20% din greutatea totals a celulei (Alberts si col., 1994; Lodish si col., 2000) (fig. 60).

242

Fig. 60 Mecanismul asamblarii aminoacizilor si elongatia lantului polipeptidic (dupa Gallien, 1979). Dupa cum observam, proteomul, cantitativ, este complet si mult diversificat calitativ. Materializarea proteomului este rezultatul unui complex de procese de translatie (traductie) a mesajului genetic, inscris prin transcriere si matisare in ARNm matur. Translafia este procesul de decodificare a informafiei genetice din ARNmm, care asigura ordonarea secvenfiala specified a aminoacizilor, polimerizarea lor prin formarea de legaturi polipeptidice intr-o secventS polipeptidica. 243

Pentru transcrierea mesajului genetic si formarea lantului polipeptidic sunt necesare: - codul genetic mscris prin traductia genei si prezent in citoplasma ca ARNm matur; - nisa de asamblare a aminoacizilor, care este ribozomul cu ARNr; - moleculele care asigura traducerea informatiei genetice din ARNmm, reprezentate de ARNt ce contin anticodonii; - polipeptidaze, enzime de formare a legaturilor peptidice intre aminoacizi; - aminoacizi; - factorul de initiere; - factorul de elongatie si ATP. Sinteza moleculelor proteice se desfasoara in trei etape: - initierea; - elongatia; - terminalizarea.

7.1.1. La procariote
Pentru translate sunt necesare urmatoarele componente: - ARNm cu codonl initiator sau start: AUG; - ribozomii: subunitatile 50S si 30S; - ARNt initiator: formil - metionil - ARNt; - factori de initiere EF1, IF2 i IF3 - o molecula de guanozin trifosfat ca sursa de energie (GTP). In citoplasma, transcriptorul asigura translatia (citirea) mesajului genetic, materializat intr-o structure polipeptidica. Ajuns in citoplasma, ARNm se va cupla cu ribozomii care, compusj din doua subunitati, au un diametru de 15-20 nm. Cele doua subunitati inegale vor fi cuplate prin legaturi stabilizate de ionii de Mg + (a se vedea ARNr). Fiecare molecula de ARNm va fi explorata" de un ribozom. S-a observat insa, ca aceeasi molecula de ARNm poate fi explorata" seriat de mai multi ribozomi, formand polizomul sau poliriobozomul (G.E.Palade, 1953, Premiul Nobel 1974). Posibilitatea ca o molecula de ARNm sa fie explorata de mai multi riozomi, cu formarea mai multor lanturi polipeptidice identice, este conditionata de faptul ca in celula avem o cantitate mica de ARNm (ccj 4%), caracterizat de un turnover" foarte rapid, o mare instabilitate si degradare rapida. Gratie formarii polizomului se poate sintetiza, prin amplificare complexul proteomic din celula.
244

Pe subunitatea 30S a ribozomului se fixeaza factori de initiere IF1, IF2 si IF3, impreuna cu GTP (sursa energetica) (IF = factori de initiere, sunt proteine ce intervin in initierea i sinteza proteica). Pe acest complex se fixeaza ARNm si o molecula de ARNt cu anticodonul complementar codonului de initiere. Este ARNt, care transporta metionina activata si cuplata sub forma de formil - metionil - ARNti. acest complex vine in contact cu codonul AUG din ARNm. Dupa cuplare, sub ictiunea factorului de initiere IF2, subunitatea ribozomica mica se va cupla :u subunitatea mare constituind ribozomul. Prin cuplarea cu subunitatea nare, ARNt, care a transportat metionina, va fi integrat in situsul P al ubunitatii mari, dar subunitatea care, prin cuplare cu subunitatea mica, va icoperi si codonul ce urmeaza codonului initiator AUG. Spatiul codonului coperit in aval de codonul initiator reprezinta situsul A al ribozomului, are, initial, este liber. Soseste al doilea ARNt2 ce transporta alt aminoacid, ce va fi itrodus in situsul A liber. Dupa ocuparea celor doua situsuri (P i A), sub ctiunea enzimei peptidil - tranferazei si donorului de energie GTP, se Dimeaza legatura peptidica intre cei doi aminoacizi, rezultand un dipeptid. >upa formarea dipeptidului, ARNt] din situsul P este eliberat. Prin liberarea situsului P, ribozomul va inainta pe ARNm ocupand in aval de xlonul de initiere o secventa de trei nucleotide (al 2-lea codon pe ARNm). rin aceasta alunecare in directia 5'-3'a ARNm, RNt2 se va gasi acum in tusul P, iar situsul A liber. In urma acestei eliberari ajunge ARNt3 ce va transporta al 3-lea ninoacid pe care-1 va introduce in situsul A. Sub actiunea enzimei, intre jptidul transferazei si GTP, se stabileste legatura peptidica, intre ninoacidul 2 cu aminoacidul 3, rezultand un tripeptid. Procesul de avansare a ribozomului pe ARNm si formarea gaturilor peptidice intre amioacizi este denumit elongatie. In timpul Dngatiei mesajul genetic transcris in ARNm de la ADN, este materializat tr-o molecula proteica sintetizata. In timpul elongatiei cu sinteza polipeptidului sunt posibile erori, ce t fi corectate sau nu. Cand ribozomul ajunge la codonul non-sens sau stop (UAG, UAA j UGA) alunecarea se oprete. Dupa stopare complexul ribozom-ARNmlipeptid se separa, separare facilitate de un factor proteic (PF). Dupa terminalizarea translatiei i eliberarea lantului polipeptidic, ozomul se disociaza in cele doua subunitati, dispersandu-se in Dplasma. Cand in citoplasma ajunge un alt ARNm, subunitatile 245

ribozomale sunt supuse acelorasi procese si etape in translatia mesajului genetic.

7.1.2. La eucariote
La eucariote translatia este similara cu cea descrisa la procariote dar mai complex! Initierea translatiei la eucariote necesita: (fig. 61,62,63,64) - ARNmm semnal care contine obligatoriu in pozitia unu, codonul de initiere AUG in apropierea capatului 5' al ARNmm; - Aminoacidul initiator - metionina; - Factorul de initiere, in special IF2; - ATP, sursa energetica pentru activarea aminoacizilor; - ARNt; -GTP. Ribozomul cu situsurile P si A pe subunitatea mare, are pe subunitatea mica doua locuri de legatura cu ARNm si ARNt. Aminoacidul, forma activata a aminoacidului, se cupleaza la bratul liber lung de adenina distala, dupa prealabila identificare de catre anticodonul din bucla. Acest anticodon din ARNt va avea un codon complementar in componenta ARNm. La aceste procese participa ATP ca sursa de energie si amino-acil-ARNt-sintetaza care va recunoaste aminoacidul activat pentru a fi transportat. Recunoasterea o asigura anticodonul din ARNt. ARNt-1-initiator acceptor si ARNt-2-acceptor pentru al doilea aminoacid, vor ocupa in ordine ti si t2, situsurile P si A din subunitatea 60 S ribozomala. Dupa ocuparea situsurilor, intre cei doi aminoacizi se stabileste o legatura peptidica. Din acest moment incepe elongatia sintezei polipeptidului, datorita ,,alunecarii" ribozomului pe molecula ARNmm. La factorii de elongatie se implica EF-Tu pe care se fixeaza GTP. Prin decuplarea EF-Tu de aminoacid - ARNt, se stabileste legatura peptidica intre aminoacizi, catalizata de peptidul-transferaza din subunitatea mare a ribozomului. Elongatia are loc in directia 5'*3' a moleculei de ARNmm. Prin alunecare, situsul A se va elibera. Dupa fiecare eliberare a situsului A va fi introdus cate un aminoacid translocat de ARNt. Cand se ajunge la codonul stop (UAG, UAA sau UGA), de care se leaga un factor de eliberare, lantul polipeptidic se va separa de ribozom, si de ARNmm, urmate de dislocarea subunitatilor ribozomale, si dispersia lor in citoplasma. 246

Fig. 61 Nivele de control in sinteza protemelor la eucoriote SINTEZA PROTEINEI

t REGLARE

realizata prin

MULTIPLE NIVELE DE CONTROL ?I INFLUENTE conditionate de

Fig. 62 REGLAREA ACTTaTATH GENELOR IN SINTEZA DE PROTEINE LA PROCARIOTE (REPRESEE .SI RETROINTHBITIE)
PROTEIN A ACTIVATOARE ONDUCTIE) CONTROL

influetyeazS

pozmv

''
PROMOTOR OPERATOR

Fig. 63 REGLARE PRIN REPRESIE ENZIMATICA A SINTEZEI DE PROTEINE

Fonna lnutaiita-

GENA TRANS

to

Produce

\
OPERON INACTTV mi se leaaa de are caracteristica

FORMA *) ALOSTERICA

sail nil produce

PROTEINA REPRESOR

TRANSCRIPTIA

Wocheazri

ARN-POLIMERAZA

-se blocheazfl

Fig.64 Iiuluctia euzunatica a suite zei de proteme la Procariote

GEN TRANS
procuce

PROTEINA ACTIVATOR

nelegate de promotor

legate de

Permite

INACTIVA

GENA PROMOTOR

ARN-POLIMERAZEI

mitiaza

cuplarea la

TRANSCRIPTIA

S.Rolul proteinelor nou sintetizate in viata celulei.

Proprietatile fizico-chimice, functia i specificitatea unei proteine sunt determinate de numarul, tipul i succesiunea aminoacizilor, reziduuri componente in structura lor. DacS luam in analiza diversitatea mesajelor genetice inscrise in structura aperiodica a ADN-ului, mesaje codante, ce pot fi transcrise in ARNm i traductionate in structuri proteice putem sa acceptam marea diversitate a proteinelor in celule, in organism. Datorita imensei diversitati de structura, proteinele au o gama larga de functii. Ca functii a proteinelor nou-sintetizate mentionam: - functia catalitica in reactiile metabolice de sinteza sau hidroliza care au loc in celula. Functia catalitica a proteinei este sub forma de enzime, forma care asigura energia celulei. Ca functie catalitica, enzimele sunt implicate in biosinteza acizilor nucleici, a proteinelor, carbohidratilor, lipidelor, etc; - functia in infrastructura celulei. Proteinele sunt integrate in toate compartimentele ce formeaza citoscheletul celular, la toate nivelele de organizare morfo-anatomica a organismului; - functia contractila a proteinelor, de exemplu actina i miozina din fibrele citoscheletice ale fibrelor musculare; - functia de transportator. De exemplu, hemoproteina (hemoglobina) transporta gazele din si in celula (oxigenul, CO2). Sunt unele proteine care transporta acizii grai, albumina, etc.; - functia de protectie a celulelor din tesuturi si a corpului. De exemplu, anticorpii (imunoglobulina) sau unele proteine sunt implicate in coagularea sangelui. - functia de depozitare a proteinelor. De exemplu, feritina inmagazineaza Fe in ficat, gliadinele inmagazineaza aminoacizii in seminte de graii inactive. - reglarea proceselor celulare mediate de proteine. De exemplu: activatorii care leaga genomul de influenta genelor (individuale sau grupuri de gene), hormonii extracelulari, citokinele (proteine), insulina (regleaza glicemia), interleukinele regleaza mitoza i diferentierea celulara etc.

251

Capitolul VI RELATIILE INTERGENICE SI MEDIUL DE VIATA ALOMULUI

Pentru intelegerea relatiilor inter-genice si raportul gena-caractermediu, este necesara dezvoltarea notiunilor de genom, genotip si fenotip. Genomul reprezinta totalitatea genelor existente intr-un set haploid de cromozomi la organismele cu reproducere sexuata. La eucariotele cu reproducere sexuata, set haploid exista numai in celulele reproducatoare, in gameti. Ca urmare, genomul este totalitatea genelor existente in celula gametica. Genotipul este constitutia genetica a organismului. Aceasta este reprezentata de totalitatea genelor existente in cele doua seturi haploide primite de la genitori (din celula diploida), dar si genele din ADN-ul mitocondrial. Dotatia cromozomica din celula diploida (genotipul) este constituita din doua serii de cromozomi omologi: materni (23 de cromozomi) si patemi (23 de cromozomi). In fiecare pereche de omologi sunt inscrise genele care contin mesajele pentru sinteza unei proteine cu structura specifica pentru definirea caracterelor unui organism. Fiecare gena ocupa un locus "precis" in cromozomi. Forma sub care exista o gena pe un locus dat in cromozom, aparuta prin mutatie, crossingover inegal, sau prin duplicitate, etc si care indeplineste functie genetica, este numita alela. Pe cuplul de cromozomi omologi fiecare gena este dublu reprezentata, constituind un cuplu alelic sau gene alelomorfe. Alelele avand "comportament" dominant sau recesiv. Fenotipul - Genotipului i se "opune" fenotipul. In sens larg, fenotipul este ansamblul de caractere anatomo-structurale, moleculare si metabolicofunctionale ale fiecarui organism. Caracterele observabile sunt produse prin interactiunea informatiei genetice existenta in genotipul individului dar si in mediul sau de viata, de factorii ecologici. "Identitatile" fenotipice intre indivizi pentru un anumit caracter sunt rezultatul unei constitute genice sinonime. Sunt insa diferente fenotipice, cantitative sau calitative in exprimarea aceluiasi caracter la indivizii conspecifici, sau componenti ai aceleiasi familii. Caracterele cu exprimari fenotipice diferentiate intre indivizi, sunt conditionate sau influentate de factorii de mediu. Sunt 252

caractere, in special caracterele poligenice, cu predispozitie genetica, la care factorii din mediul extern pot influenta exprimarea nuantata, graduala, a aceluiasi caracter. Diversitatea fenotipica reprezinta gama de reactii fenotipice a unui genotip particular (constitutional genetic) ca norma de reactie a individului la influentele induse sau conditionate de factorii ecologici. Interferentele conditionale intre genotip si mediul ambiental, in modelarea si gradul de manifestare a unor trasaturi fenotipice, sunt strans legate. Modelarile fenotipice se pot analiza la diverse niveluri de organizare a biosistemelor: caractere de nivel molecular, tisular, de organ sau sisteme de organe, care in ansamblul lor definesc individul ca unitate biologica (morfotipica) in cadrul populatiei, a speciei.

1.Relatiile intergenice
Exprimarea fenotipica a unui caracter ereditar este conditionata de relatiile existente in cadrul unui cuplu alelic, sau de interrelatiile intre cuplurile de gene nealelice.

1.1. Relatii intre cupluri alelice.

In cadrul cuplurilor alelice apar relatii de dominanta, codominanta, raporturi cu efecte semiletale sau letale, etc. Pentru a intelege corect aceste relatii sunt necesare urmatoarele notiuni: - locus - este pozitia si spatiul" ocupat de o gena in cromozom. In celula somatica diploida, unde exista o pereche de cromozomi omologi, cuplurile de gene alelice ocupa aceleasi locusuri in cromozomii respectivi. - alela - este o varianta a unei gene realizata prin mutatie sau crossingover inegal, ocupand acelasi locus ca si gena normala. Doua alele nu pot coexista pe acelasi locus; - homozigot - starea in care locusurile omoloage sunt ocupate de alele identice; - heterozigot - cand locusurile omoloage sunt ocupate de alele neidentice; - dominanta - este gena care exprima fenotipic caracterul atat in starea homozigota (doza dubla), cat si in starea heterozigota (doza unica);

253

- recesiva - este gena care asigura exprimarea fenotipica a caracterului uman in stare homozigota, iar in prezenta genei dominante este nonfunctionala, sau anemic functionala, fara a se exprima caracterul.

1.1.1. Relatiile de dominanta - recesivitate

Notiunea de dominanta - recesivitate devine evidenta la eucariotele superioare sexuate, cand se incruciseaza doi indivizi de sexe diferite si care au gene diferite pentru acelasi caracter. De exemplu sa presupunem cuplul de alele A" si a". Subiectul heterozigot A/a, la prima vedere, prezinta un fenotip identic cu eel homozigot A/A. In aceste conditii, alela A este dominanta prevalenta", pe cand alela a" este recesiva latenta". Conditiile ca o alela sa fie dominanta sau recesiva sunt urmatoarele: alela este dominanta cand, in doza unica, este capabila sa sintetizeze o cantitate suficienta de proteina activa", care sa asigure functiile celulei sau organismului; alela este recesiva atunci cand induce sinteza unei biomolecule nula functional", care nu intra in concurenta" cu proteina activa" in nici o reactie in care aceasta ar fi implicata. La eucariotele superioare normale, alela dominanta este frecvent prezenta la indivizii speciei care traiesc in conditii naturale, fiind denumita si alela salbatica (+). Alela recesiva, ca produs al mutatiei, este de regula eliminata prin selectie naturala, mentinandu-se in concentratie crescuta numai in populatiile consanguine, sau cele conservate artificial (notate cu -). In general, genele mutante corespund recesivilor letale", semiletale" sau fara efecte fenotipice. Si anume in stare homozigota genele mutante nu permit dezvoltarea , sunt letale, iar in stare heterozigota se mentin in genotipul hibrizilor, asigurandu-se dispersia lor in genofondul populatiei. Nu intotdeauna alela dominanta isi mentine absolut, aceasta trasatura. Acest lucru se poate observa daca sunt folosite tehnici de finete, prin care pot fi identificate mici diferentieri a caracterului determinat de gena dominanta la indivizii heterozigoti in comparatie cu cei homozigoti. Aceasta diferentiere fenotipica poate fi explicata astel si anume, ca o gena dominanta in starea heterozigota (doza unica) nu intotdeauna este suficienta prin activitatea sa codanta pentru a asigura in totalitate" functia de exprimare fenotipica a caracterului.
254

Acest aspect il putem consemna la om cand, o gena mutanta dominanta in stare heterozigota, al carei grad de exprimare fenotipica a displaziei somatice este diferit in raport cu homozigotul dominant mutant (la acesta, morfodisplazia este mult mai severa). De exemplu, Mohr si Wriedt au studiat un cuplu cosangvin, la care cei doi genitori (el si ea) erau purtatori de brachidactilie moderata. Acest cuplu a dat nastere la un copil la care lipseau degetele din regiunea palmara si plantara insotite de multiple malformatii scheletice, determinand moartea la un an dupa nastere. Cei doi cercetatori au considerat ca genitorii erau heterozigoti, continand fiecare gena dominanta mutanta (cu efecte semiletale) iar copilul nascut era homozigot dominant mutant, iar efectul a fost letal la copil, deoarece in aceasta formula dominanta exprimarea fenotipica determinata de genele mutante a fost cu expresivitate completa (100%). Uneori intre cuplurile alelice, sunt raporturi de codominanta (a se vedea lucrarile practice) 1.1.1.1 .Dificultatile si exceptiile de la leg He dominantei si recesivitatii Analiza caracterelor monogenice, dominante sau recesive, au evidentiat unele dificultati de interpretare si abatere de la legile ereditatii dominante si recesive. Sunt mai multi factori de "eroare" ce intervin in interpretarea caracterelor dominante sau recesive. a)- Dificultati statistice Studiile genetice de respectare a legilor mendeliene de segregare a caracterelor mogenice (monofactoriale) stabilesc ca raportul de segregare a unui caracter dominant este de XA - V% daca unul din genitori este heterozigot (Aa) (fig.65) sau de 3A - lA cand ambii genitori sunt heterozigozi (A-a) (fig.65).

255

aa
''

f M .
A a a

HH
A a

Aa

T
A a

t
1

T
A a

t
f f

*Y
Aa Aa 50% (1/2)

i6

aa

rr ?f

aa

ff 0f

AA_______Aa______Aa . v aa .

50% (1/2)

75%(3/4)

25%(1/4)

Ereditate dominanta

F.reditare recesiva

A - gena dominanta a - gena ret*siva

Fig. 65 Ereditatea autozomal dominanta si recesiva Aceste raporturi de segregare sunt respectate in cazul cand este analizata o populatie (cazul izolatelor umane) sau sunt studiate un numar mare de familii cu descendenta numeroasa. Dar asemenea raporturi de segregare nu sunt respectate in totdeauna in genetica medicala deoarece numarul familiilor studiate (pentru acelasi caracter) este mic, sau numarul indivizilor studiati dintr-o populatie
1R

panmictica este mic. Dificultate in stabilirea caracterului - dominant sau recesiv (transmis genetic) este si situatia cand ancheta medico -genetica se adreseaza exclusiv la copiii aparent sanatosi din familie. Dar corecta analiza genetica impune folosirea sondelor genice pentru a stabili starea de heterozigot a purtatorilor (in special) de gena recesiva. b) Exceptii de la legile ereditatii dominante. Studiile efectuate pana in prezent au identificat exceptii de nerespectare si interpretare incorecta a legilor ereditatii dominante si recesive.

18

Populatia panmictica - p^pulatia la care incrucisarea intre indivizi este aleatorie (nu selectiva), fara neomutatii, fara casatorii consanguine. 256

De la legile ereditatii dominante sunt considerate urmatoarele exceptii: i) Penetranta. In mod normal, caracterul autozomal dominant trebuie sa fie exprimat fenotipic la fiecare generatie ce succede (deoarece caracterul dominant este exprimat in stare homozigota AA si heterozigota Aa). Sunt unele caractere dominante care, la nivel familial, se manifesta saltatoriu. Acest proces poate fi explicat astfel: Sunt gene dominante cu penetranta variabila. Penetranta poate fi completa (totala) sau incompleta (la care manifestarea fenotipica a caracterului dominant este si saltatorie). Penetranta completa sau incompleta se apreciaza in raport de prezenta caracterului exprimat fenotipic. Sa urmarim urmatorul exemplu, teoretic: - daca o familie formata din 10 membri prezinta aceiasi caracter, penetranta este de 100%(p completa); - daca respectivul caracter este prezent la 8 din cei 10 membrii, penetranta este de 80%(p incompleta), s.a.m.d. Ca urmare, penetranta este un concept statistic deflnit prin frecventa exprimarii fenotipice a unui caracter determinat de gena dominanta in starea heterozigota. Pentru gena dominanta penetranta poate fi determinata de constitutia genotipica a indivizilor, de mediul "intern" - epistazia sau influentata de mediul "extern" peristazia19, fie de interferenta ambilor factori - epistazia + peristazia. ii) Expresivitatea. Si expresivitatea este un factor ca exceptie de la legile dominaiitei. Expresivitatea poate fi conditionata de modul de viata al individului (alimentatia), dar si de alti factori. De exemplu: - un factor peristatic poate actiona la distanta asupra expresivitatii unei gene (vezi epistazia); - varsta si sexul imprima expresivitati marcate a caracterelor ereditare (de exemplu: guta, calvitia, hemocromatoza, etc). c) Exceptii de la legile ereditatii recesive. Exceptiile de la legile ereditatii recesive sunt: expresivitatea variabila a unui caracter recesiv care este conditionata de aceiasi factori ca cei care intervin in ereditatea dominanta: epistazia, peristazia. Deasemenea,

19

Peristazia - totalitatea factorilor din mediul exterior care pot influenta expresia fenotipica a genelor. 257

pleiotropia unei gene poate determina trasaturi fenotipice variabile, precum si la cuplurile de genitori consanguini. S-a mai constatat ca raportul de segregare a unui caracter autozomal recesiv, uneori, depaseste valoarea de lA (conform legilor mendeliene). Aceasta remarca este rezultatul studiului statistic realizat in fratiile care au numai copii, fenotipic, normali.

1.1.2.Gene (alele) cu efect letal

Lints (1981) considera ca printre cauzele responsabile de modificarea raporturilor mendeliene este letalitatea indusa de gena mutanta, sau reducerea viabilitatii anumitor genotipuri. Se considera gene letale cand in stare homozigota, indue dereglari morfostructural-functionale, severe, neviabile eliminand respectivii indivizi din populatie. Efectele letale si eliminarea indivizilor din familie, din populatie, pot avea loc: - prenatal: - ducand la avortul spontan; - postnatal: - inainte de varsta pubertatii si reproducerii; - sau prin inducerea infertilitatii si incapacitatatea de reproducere a indivizilor tarati. Exemplu de efect letal al genei mutante este morfo-displazia labiopalatoschizis (buza de iepure, gura de lup). Investigatiile genetice asupra acestei morfodisplazii au evidentiat ca unele forme pe fond genetic viabile sunt din punct de vedere constitutional la indivizii heterozigoti. In stare homozigota efectele acestei gene mutante sunt letale.

1.1.3.Gene (alele) semiletale.Gena Rhesus la om20

Efectul semiletal indus de o gena poate fi exemplificat prin analiza sistemului genetic eritrocitar Rh. La om, barbatii sau femeile pot avea Rh+ sau Rh-. Persoanele Rh+ (caracter determinat de gena dominanta D) pot fi homozigote D/D sau lieterozigote D/d, iar persoanele Rh- (care au gena recesiva d) pot fi d/d, homozigote recesive.

Rh este gena responsabila de producerea unui antigen numit Rhesus, care se gaseste si in sange la Macaca mulata (Maimuta Rhesus). 258

Persoanele cu gena dominanta D, elaboreaza un antigen, fiind Rh+. Cele care sunt homozigote recesive sunt lipsite de antigen si sunt Rh-. Antigenul este substanta (molecula, celula, tesut) care, introdusa in organismul omului (sau la orice alt mamifer), induce formarea de anticorpi specifici antigenului. Indivizii Rh+ (genotip D/d sau D/D) la care gena D este dominanta au in organism antigenul Rh+. Indivizii homozigoti recesivi d/d Rh -, desi nu au antigen in organism au capacitatea de a elabora anticorpi anti Rh-. Sa presupunem ca doi genitori: sotul D/D homozigot Rh+, sotia d/d homozigot pentru Rh- realizeaza un act de conceptie.Produsul de conceptie va fi obligatoriu heterozigot D/d, deci Rli+. Produsul de conceptie, spre sfarsitul perioadei fetale, incepe sa elaboreze antigenul Rh+, conform constitutiei sale genetice. Antigenul Rh+ de la fat poate traversa placenta, sau prin circulatie fetala, trecand in organismul matern gestant. Cum mama fiind Rh- si lipsita de antigen, in prezenta antigenului Rh+ va incepe elaborarea de anticorpi anti Rh. Elaborarea anticorpilor Rh poate duce la urmatoarele accidente: - pe perioada fetala a sarcinii, mama trimite spre fat anticorpi antiRh+ in sangele viitorului copil. Fatul, avand antigenul Rh+, va declansa o reactie anigen-anticorp, inducand o anemie hemolitica, care uneori, poate duce la moartea nou-nascutului; - antigenului Rh+ al fatului, trecand in organismul matern , care elaborand anticorpi anti - Rh+, poate declansa reactia antigen-anticorp la mama, determinand un proces de izoaglutinare; - cand o femeie sau un barbat sunt Rh- si au anticorpi anti Rh+, in cazul unei transfuzii de la o persoana Rh+ apar reactii de incompatibilitati de Rh. Sunt accidentele de transfuzie. In exemplul nostra, gena d (recesiva), in stare homozigota are efect semiletal. 1.2. Relatii (raporturi) intre genele nealelice Un caracter, analizat la nivelul organismului ca imitate biologica, poate fi conditionat fenotipic de influenta altor gene nealelice, dar prezente in genomul celular, ca gene diferite. Un aspect al relatiilor intre cupluri de gene nealelice (gene diferite informational), dar implicate in definirea unui caracter, este epistazia.

259

1.2.1. Epistazia
Termen introdus de Bateson (1905 si 1909), epistazia este "interactiunea genica in care o gena dominanta sau recesiva, influenteaza functia de determinism genetic, in exprimarea fenotipica a unui caracter dat de gene nealelice" dominante sau recesive. In relatiile de epistazie, cand ambele tipuri de gene nealelice sunt prezente in genotip, fenotipul unui caracter depinde, efectiv de una din gene. Genele "modificatoare" sunt numite epistatice, iar genele a caror exprimare fenotipica este influentata (fiind non-functionale genetic) de gena nealelica, sunt numite hipostatice. Epistazia poate exista sub doua forme: epistazia genelor dominante (gena dominanta fiind epistatica) si epistazia genelor recesive (gena recesiva, ca gena epistatica, influenteaza activitatea genetica a genei dominante). Un exemplu clasic de epistazie este fenotipul Bombay, ca sistem genetic eritrocitar pentru grupa sanguina ABH(O). Acest sistem este determinat genetic de doua cupluri de gene nealelice, care ocupa locusuri diferite pe bratul scurt al cromozomului 9.

260

Fig. 66 EPISTAZIA GENE AUTOZOMALE

SEGREGARE INDEPENDENTA

EPISTAZIE

FORME DE

ERORI SI/SAU RAPORTSEGREG ARE MODIFICAT

261

Locusul H poate fi ocupat de alela dominanta H, care in stare homozigota (H/H) sau heterozigota (H/h), determina genetic sinteza antigenului "de baza" H. Acest antigerTde baza" H este un precursor care cupleaza o molecula de fucoza formand substanta H. Cuplarea este catalizata de enzima fucoziltransferaza, enzima codificata de gena dominanta H. Locusul H poate fi ocupat si de alela recesiva h, care in stare homozigota (h/h) nu are capacitatea de a sintetiza enzima fucoziltransferaza. Locusul I ocupat de alela A, alela B sau de alela recesiva "i". Alela A si B sunt codominante. Alelele IA si IB codifica sinteza unor transferaze specifice care intervin in cuplarea unor molecule pe substante H ce constituie antigenele de grup sanguin A sau B. De exemplu, transferaza specifica, codificata de la IA, va fixa o molecula de acetilgalactozamina, formand pe substanta H antigenul de grupa A, iar alela IB, care codifica transferaza specifica, fixeaza pe substanta H o molecula de galactoza (antigenul de grupa B). Daca locusul I este ocupat de alela recesiva"i", in stare homozigota i/i nu se sintetizeaza nici o enzima (transferaza), nu se modifica substanta H, iar pe eritrocitele respectivului individ nu vom gasi antigenul A sau B, va fi de grup 0(H). Dar in situatia cand in locusul H gasim un cuplu alelic homozigot recesiv h/h in organism nu se mai sintetizeaza substanta H. Lipsind substanta H, chiar daca in locusul I avem genele dominante IA si IB, nu se formeaza antigenul de grup A sau B. Ca urmare alela recesiva h in stare homozigota h/h are rol epistatic blocheaza "formarea antigenelor, iar alelele I si I care sunt dominante, sunt gene hipostatice. Relatia intre genele epistatice si hipostatice este cunoscuta sub denumirea de fenotip Bombay , deoarece in acest oras indian s-a identificat o familie in care femeia avea constitutia genetica h/h, IB/i, aparent grupa "O". Casatorita, sotul avea constitutia genetica H/h, IA/i. Copilul rezultat din acest cuplu a fost grupa AB.

262

2. Relatii gena - caracter - mediu

Plecand de la relatiile inter-genetice, s-a luat in consideratie ca unui cuplu de alele cu locus unic pe cromozomi omologi, ii corespunde un efect "precis", observabil la nivelul fenotipului prin intermediul unei proteine cu structura si functii specifice. Dar relatiile gene-caractere pentru eucariotele superioare ca evolutie (respectiv omul) sunt mult mai complexe. De exemplu, in patologia genetica transmisibila ereditar, in majoritatea sindroamelor este consemnat un foarte "bogat" tablou simptomatologic, mult diversificat si sumativ. In consecinta este greu sa acceptam ca diversificarea morfotipurilor (normale sau patologice) sunt consecinta unei singure gene normale sau mutante. Ca urmare studiile genetice au luat in analiza si au considerat existenta mai multor raporturi si mecanisme genetice intre genotip - fenotip mediu, cum sunt pleiotropia, monogenia, polialelismul, poligenia (cu interferente de raporturi de influenta cu factorii de mediu).

2.1. Pleiotropia
Cand o mutatie duce la aparitia unei gene cu efecte patologice asupra organismului, este numita pleiotropa. Ca definitie, prin pleiotropism intelegem cazul cand o gena recesiva, si factorul proteic determinat genetic de respectiva gena, induce expresivitatea fenotipica a doua sau mai multor caractere care sunt indisolubil "legate" prin fenomenul de "cascada" si influenta genetica. O gena dominanta sau recesiva respecta legile mendeliene de segregare genotipica si expimare fenotipica a caracterului. Permite sa apreciem, probabilistic, coeficientul de aparitie a unui caracter la descendenti. Studiile clinice au evidentiat ca o gena mutanta (recesiva) poate induce un complex clinic simptomatologie drept criteriu de diagnostic si etiologic al unei boli. Complexul clinic indus de o gena recesiva mutanta, poate fi o polidisplazie (un complex multiplu modificat morfo-structuralanatomic), sau o disfunctie metabolica majora deregland activitatea tesuturilor, organelor, activitatea celulara. (Figura 67)

263

GENA MUTANTA RECESIVA CU INFLUENTA PLEIOTROPA GENA PLEIOTROPA (RECESIVA) MUTANTA

SINTEZA INDUCTOR MORFOGENETIC MODIFICAT

SINTEZA UNEI ENZIME ANORMALA

DIFERENTIAZA IN CASCADA LA DISTANTA

CALE METABOLIC A SECUNDARA

INFLUENTA ALTOR GENE

DISFUNCTIONALITATI TISULARE/ORGANE

PRODUSI SECUNDARI TOXICI

Fig. 67 Pleiotropia Grouchy, explica astfel efectul de pleiotropie a unei gene: "o gena este pleiotropa daca enzima determinata de ea este activa pe un substrat proteic situat in diverse locuri ale lantului energetic, sau daca enzima intervine in reactii chimice unde comporta substraturi diferite. A lua in considerare pleiotropia genelor, trebuie sa cercetam cum respectiva enzima este activa (diferit) in diversele tipuri de celule si tesuturi (Grouchy). Acest 264

pleiotropism se explica mai bine prin multipotentialitatea unei enzime, determinata de o gena, sa participe la sinteza directa a mai multor proteine diferite, ca semantida tertiara, dar mentinandu-si specificitatea de substrat. Dar, spune Grouchy, este putin probabil ca aceeasi gena, ca segment dintr-un lant ADN, sa poata sintetiza doua produse proteice diferite " (citat de Tridon, 1966). Termenul de "relatii pleiotropice" desemneaza situatiile cand o gena inlocuita cu alela mutanta are repercursiuni fenotipice complexe, modificand mai multe caractere, distincte, la nivelul organismului. Acest proces este cauza multor manifestari ereditare normale sau patologice, cum ar fi: longevitatea, aptitudinile intelectuale sau simptome si semne clinice variate ce insotesc un sindrom genetic. La organismele superioare, pleiotropia nu se limiteaza la nivelul actiunii primare a genelor care, in toate cazurile, este sinteza unei molecule proteice cu structura si functii strict specifice. Pleiotropia rezulta din inlantuirea cauzala care leaga activitatea primara a unei gene mutante "pleiotropa" de procesul de dezvoltare si morfogeneza embrio-fetala in care este implicata, direct sau indirect, respectiva gena. De exemplu, Tuchmann-Duplessis (1972) descria celula embrionara ca un sistem citologic complex, care detine intregul program genetic pentru diferentiere. Cand o celula s-a diferentiat, alte informatii din genotip sunt traduse in proteine, in enzime, care pot forma lanturi metabolice pentru noi functii celulare sau tisulare. Unele molecule proteice determinate de o gena, pot deveni proteine inductor morfogenetic, particapand la diferentierea altor tipuri de celule sau tesuturi. Consideram ca diferentierea este determinata de substante inductoare de natura proteica. Celula diferentiata devine inductoare prin proteina elaborata, devine inductoare pentru diferentierea altor tipuri de celule, asupra carora proteina inductor primar, poate influenta gene din respectivele celule (este posibil ca proteina inductor primar sa fie proteina reglator sau represor asupra functiei genelor). Este o inductie "in cascada" a carei secventa este riguros programata genetic cu aparitia unui larg evantai de celule si/sau tesuturi-organe diferite. Inducerea etapizata a procesului de diferentiere poate fi comparata cu teoria gradientilor de crestere si diferentiere elaborata de Child. Conform teoriei lui Child, consideram existenta unor relatii interferentiale de functii intre gene diferite, interferente de influenta in timpul proceselor de diferentiere. Fiecare etapa din "cascada" diferentierilor 265

tisulare (etapele reprezentand si organizatori morfogenetici cu potential genetic primar, secundar, tertiar, etc.) este implicata in a finaliza dezvoltarea completa a unui tesut, organ sau organism. Dar, este suficient ca un singur inductor morfogenetic, dintr-o "cascada" inductiva, sa fie modificat prin mutatia unei gene (ex. recesiva), ca intregul lant ce urmeaza punctului unde s-a produs mutatia, sa urmeze o diferentiere patologica. Acelasi mecanism de interferente protein-enzime este si in dereglarea proceselor metabolice. Numai intr-o asemenea inlantuire se insereaza pleiotropia, cand, schimbarea structurii unei substante active are repercursiuni variate in timpul dezvoltarii ontogenetice. Ca urmare, pleiotropia este capacitatea unei gene mutante de a produce efecte multiple si "aparent" independente. Efectele sunt rezultatul starii "inalt integrate" a metabolismului celular si dezvoltarii organismului. In patologie gasim frecvent procesul de pleiotropism indus de gene recesive mutante, retinand pentru exemplificare urmatoarele: - sindromul Laurence-Moon-Biedl la care gena are efect pleiotropic, boala caracterizandu-se prin: obezitate, retinita pigmentara, polidactilie, cretinism; - sindromul Holt-Oram prezinta aplazia policelui si comunicare interventriculara; - sindromul Hcdlerman-Streiff-Francois- cu dizarmonie craniofaciala (fata mica, nas subtire, efilat), anomalii dentare, nanism proportionat si armonios, hipertricoza si atrofie cutanata, microoftalmie, cataracta,etc. - sindromul Rubinstein-Taybi in care sunt asociate malformatii de tipul: falanga terminala la police si haluce cu aspect de paleta, microcefalie, nas acvilin, cataracta, epicanthus, anoftalmie, atrofie optica, deficienta mentala; - sindromul Meckel. Gena mutanta in stare homozigota induce o asociere de malformatii si anume: polidactilie, rinichi polichistic, meningocel occipital etc.

2.2. Raporturi de monohibridare si de dihibridare

Mendel (1866) a fost primul genetician care a folosit metoda incrucisarii si hibridarea la organisme "simple" care se deosebesc intre ele printr-un caracter unic sau un numar mic de caractere bine delimitate si usor de reperat. Pentru aceasta a selectat parentali - linie pura" din populatie homozigoti pentru caracterele cercetate. 266

Mendel a incrucisat organisme care se deosebeau printr-un singur caracter (monohidrare), prin doua caractere (dihibridare), sau prin mai multe caractere (polihidrare). Rezultatele obtinute i-au permis sa stabileasca legile fundamentale ale geneticii - legile segregarii caracterelor la descendenti. Aceste legi, au caracter de generalitate la organismele cu reproducerea sexuata, atat pentru caracterele normale, cat si pentru cele patologice.

2.2.1. Legile lui Mendel

Mendel enunta urmatoarele legi sau reguli de transmitere si segregare a caracterelor: a) uniformitatea hibrizilor primei .generatii (Fi) Enuntul legii este urmatorul: "daca este o incrucisare intre doi indivizi care difera printr-un singur caracter (monohibridare), hibrizii primei generatii (filiatia Fi) sunt asemanatori intre ei". Fenotipul va fi asemanator cu al genitorului care este homozigot dominant, dar genetic heterozigoti la nivelul cuplului alelic (Aa) (fig. 68). b)Segregarea hibrizilor in generatia F? Mendel a observat ca in F2 apar indivizi care au fenotipul asemanator cu al genitorilor din Fi, dar si indivizi care, in procente "fixe", prezinta fenotipul parentalilor incrucisati initial. Pe baza acestei observatii a presupus ca fiecare trasatura de caracter este determinate de o pereche de "factori" ereditari sau gene alele (termen folosit in prezent). Genele alele se vor separa in meioza genitorilor, segrega, iar prin fecundatie cele doua alele se vor reintalni refacand cuplul alelomorf. Deoarece in F2 apare fenomenul de segregare a caracterelor, in raport de 3:1 cand sunt alele-dominante recesive sau 1:2:1 cand sunt codominante, se confirma urmatoarele: indivizii parentali (P) sunt homozigoti A/A si a/a. Din punct de vedere genetic sunt puri pentru cuplul alelornorf. Gametii haploizi elaborati de fiecare parental homozigot, vor contine numai cate un singur factor ereditar, o singura alela. Prin fecundare, hibrizii F] primind cate o alela de la fiecare parental vor fi 100% heterozigoti Aa. Cand din cuplurile alelice AA si aa ale parentalilor, rezulta hibrizi Aa, iar fenotipic este exprimat caracterul (A), inseamna ca alela "A" este dominanta iar alela "a" recesiva.

267

INTERACTIUNI GENIC'E DfflBRIDAREA

Segregate nomiala

O
GO

LINKAGE GENIC cand

FAC'TORI EPIGENETK'I PENETRANTA REDUSA ENDOGENI/EXOGENI Poate zi

CODOMINANTA

MODIFICA RAPORTUL DE SEGREGARE

0 GENA BLOCHEAZA ACTIVITATEA ALTEI GENE

INFLUENTEAZA EXPRESI\TTATEA GENEI

INFLUENTATA DE EPLSTAZIE SAU DE FACTORI DE MEDIU

AMBELE ALELE EXPRIMA TRASATURILE DE CARACTER

Fig. 68 Dihibndarea

In cazul cand avem doi parentali, fiecare cu un cuplu alelic dominant pentru acelasi caracter A1A1 si A2A2, vor rezulta hibrizi A1A2 (heterozigoti) ce vor prezenta fenotipic si trasatura de caracter determinate de alela Ai, cat si cea determinate de alela A2. In astfel de situatii consideram ca alelele A] si A2 sunt codominante. Incrucisandu-se genitori hibrizi din Fi - A/a x A/a, heterozigoti, descendentii lor, care, in raport cu parentalii reprezinta generatia F2, vor prezenta trasaturi fenotipice distincte: 75% vor prezenta caracterul dominant A (asemanator parentalului homozigot dominant A/A) dar si al genitorului hibrid Fi heterozigot A/a, iar 25% descendenti cu fenotipul recesiv "a" (asemanator cu al parentalului homozigot recesiv a/a). Va rezulta un raport de segregare valoric de 75/25%, respectiv un raport de segregare 3:1. Dar descendentii F2 cu trasatura de caracter dominanta A, nu sunt uniformi din punct de vedere genotipic. Verificarea a fost demonstrate prin analiza descendentului F3 rezultati prin reincrucisarea parentalilor a/a cu hibrizii F2. Rezultatele sunt urmatoarele: hibrizii F2 au constitutia genetica in urmatoarele raporturi: 25% sunt homozigoti dominanti A/A, 25% homozigoti recesivi a/a si 50% heterozigoti A/a. Cum alela A este dominanta, caracterul fenotipic determinat de aceasta alela se va exprima atat in stare homozigota A/A, cat si in starea heterozigota A/a, iar caracterul recesiv "a" se va exprima numai in stare homozigota a/a. In cazul alelelor codominante, incrucisandu-se doi hibrizi heterozigoti, fiecare A1/A2 (A1A2 x A1A2) in Fi se vor obtine raporturile: 25% homozigoti A1A1, 25% homozigoti A2A2 i 50% homozigoti A1A2, iar raportul de segregare va fi 1:2:1 . O remarca: in cuplul alelic dominant/recesiv A si a, in starea lor heterozigota A/a nu este corespondenta intre genotip, care este Aa si fenotip, manifestat caracterul dominat de alela dominanta. O analiza neavizata ar considera ca alela recesiva "a" ar fi eliminate din genotipul hibrizilor Fi. In realitate, ea exista in genotip, dar este "mascata" de alela dominanta. Caracterul recesiv apare numai cand se reintalnesc doi heterozigoti purtatori cu acelasi tip de alela recesiva rezultand ca probabilitate de 25%, homozigoti a/a. Exceptie de la aceasta regula este epistazia. Aceasta remarca ajuta sa intelegem corect transmiterea bolilor autozomal recesive. c) Segregarea independents a caracterelor sau legea asortarii independente. 269

Aceasta lege a fost stabilita prin analiza dihibridarii, respectiv segregarea a doua caractere diferite, determinate de cupluri nealelice (gene diferite) ce au locusuri pe cromozomi neomologi. Legea segregarii independente a caracterelor demonstreaza ca genele diferite cu locusuri pe cromozomi diferiti (neomologi), nu sunt inlantuite (linkage genie), vor segrega si asorta independent. Aceasta lege, sau legea numerelor mari, a fost analizata matematic de catre Hardy si Weinberg la studiul genetic al poputiilor panmictice. Raportul constant de segregare este respectat in urmatoarele circumstante: incrucisarea indivizilor sa fie aleatorie, in populatie, nu selectiva, in respectiva populatie sa nu apara mutatie la genele analizate, sa nu existe emigrari, imigrari, fara consanguinitate a cuplurilor de genitori, factori care modifica raportul valoric al segregarii caracterelor (fig. 69).

270
Fin 69 INTERACTRTNI GENICE

-J

OGENA
BLOCHEAZA EXPRESIACELEI DE-ADOUAGENE

AMBELE ALELE EXPRMAT E

INCOMPLETASAU C0D0M1NANTA DATORITA EPISTAZIEI SAUMEDIU LUI FARA REGREGARE INDEPENBENTA

MASCULII SE DIFERENTIAZA DE FEMELE

2.2.2. Tipuri de trasnmitere mendeliana a caracterelor monofactoriale la om

Legile mendeliene, datorita caracterului de universalitate biogenetica, sunt aplicate si verificate i la om. Aplicarea legilor mendeliene la om intampina unele dificultati de interpretare cauzate de: - daca la plante si animale interpretarea i stabilirea raportului de segregare incepe de la cuplu parental homozigoti (dominat si recesiv), la specia umana nu este conceput, experimental, a se efectua "incrucisari" consanguine pentru a se obtine linie "pura"; - la om, pentru edificarea unui caracter participa mai multe sisteme, motiv pentru care urmarirea legilor care guvemeaza transmiterea caracterelor ereditare este dificila; - numarul mic de descendenti si de generatii ce pot fi analizate, plecandu-se de la cuplul parental. Pentru a studia legile mendeliene la om, se impune a studia sisteme relativ simple, controlate monofactorial, de un cuplu alelic. Studiul transmiterii mendeliene impune cercetarea sistematica a unei boli la nivel familial pe generatiile ce succed, la descendentii rezultafi pe fiecare generatie, atat pe filiate directa, cat si la heredocolaterali. Conform raportului "gena-caracter" la om sunt caractere care segrega mendelian. Raportui de segregare si exprimarea fenotipica a caracterelor sunt condifionate de: raportui de functionalitate genetica existent intre genele alele, de numarul cuplurilor de alele examinate, de locusul alelelor pe cromozomi: autozomi sau pe cromozomii sexuali. La om sunt analizate urmatoarele tipuri de trasmitere a caracterelor: ereditatea monogenica (monofactoriala) si ereditatea poligenica (multifactoriala).

2.2.3. Transmiterea autozomal dominanta

Sistemul Rhesus (Rh) este determinat de trei cupluri de gene inlantuite pe bratul q al cromnozomilor perechi 1: CDE - dominante, cde -recesive.

272

Contrar acestui complex de gene nealelice, indivizii in populatii se grupeaza in doua clase: Rh+ in proportie de circa 86% si Rh- 16%. Antigenul "D" care da caracterul de Rh+ este determinat genetic de alela D (indivizii putand fi D/D - homozigoti dominant sau D/d heterozigoti). Caracterul de Rh- este determinat genetic de alela "d", dar numai in stare homozigota. Sistemul Rh limitat numai la cuplul alelic D/d poate fi considerat (aparent) un caracter "mendelian simplu" monofactorial. Pentru a demonstra transmiterea autozomala "pentru comoditatea exemplului", sa admitem ca locusul genei pentru Rh ar fi ocupat de un singur tip de gena: D alela dominanta, "d" alela recesiva. Sa consideram o incrucisare Tntre un barbat Generatia parentala Generatia FI (descendentii primei generatii) D/D(? d/d $ D A D Dd Dd D Dd Dd

Rh+, homozigot dominant D/D si o femeie Rh- homozigota recesiva d/d. din acest cuplu toti descendentii vor fi genetic heterozigoti D/d, dar fenotipic vor fi Rh+. Pentru aceasta prima generatie, consemnam noncorespondenta intre genotip si fenotip. Toti descendentii ce vor rezulta dintr-un cuplu parental homozigoti D/D si d/d, vor fi Rh+, oferind falsa imagine ca acesti descendenti ar fi mostenit numai gena D. cum gena "d" este recesiva, in prezenta genei dominante "D" nu-si exercita functia de determinism genetic. Daca indivizii FI heterozigoti (D/d) se incruciseaza intre ei, in gametogeneza lor, se vor obtine in meioza 50% gameti cu alela dominanta D si 50% cu alela recesiva d. Genitori din FI Generatia F2 (descendentii generatiei a doua) c?Dd $Dd D D D DD Dd d Dd dd

Descendentii rezultati din cuplul heterozigot D/d, prezinta urmatoarele posibilitati de combinare genetica si segregare fenotipica: Constitutia genetica a fiecami descendent prezinta urmatoarele probabilitati de combinare a gametilor si constituire a zigotului, din care
273

potential, se va dezvolta: 25% homozigot dominant D/D, 50% heterozigot D/d si 25%) homozigoti recesivi d/d. cum gena dominanta D determina caracterul in stare homozigota D/D si heterozigota D/d, inseamna ca probabilitatea ca un descendent sa prezinte exprimat fenotipic starea de Rh+ va fi de 75%o, iar cea de Rh- de 25%>, procent care reprezinta probabilitatea ca zigotul sa fie homozigot recesiv d/d. daca starea de Rh+ va fi de 75% in F2, iar cea de Rh- de 25%o. Prin simplificare se obtine un raport de segregare de 3:1, cand urmarim un caracter determinat de o gena dominanta normala sau patologica. Respectand acelasi rationament si cuplare aleatorie intre indivizii conspecifici in populatie se pot realiza ase variante de cupluri (casatorii) si anume: Cupluri de genitori l)D/DxD/D 2) D/D x D/d 3) D/D x d/d 4) D/d x D/d 5) D/d x d/d 6) d/d x d/d Descendenti posibili - Toti descendentii vor fi Rh+ homozigoti (D/D); - Toti descendentii vor fi Rh+, dar 50% vor fi homozigoti D/D, 50%> heterozigoti D/d. - Toti descendentii vor fi Rh+, dar heterozigoti D/d. - 75%) descendenti pot fi Rh+, iar 25% Rh-dintre care 25% D/D, 25%o d/d si 50% D/d -constitute genetica. - 50%o descendenti Rh+ si 50%o Rh-. Dar vor fi heterozigoti D/d pt.Rh+ si homozigoti d/d pt. Rh-. - Toti descendentii vor fi Rh- si homozigoti d/d.'

Caracterele monofactoriale (sistemele moleculare episemantice: sistemele genetice eritrocitare si plasmatice, molecule specifice active, protein-enzime etc.) respecta acest model de segregare si combinare independenta a caracterelor la indivizii din populatie, cu exceptia fenomenului de epistazie genica. Aceleasi raporturi de segregare si combinare independenta pot fi consemnate in transmiterea unor boli autozomal dominante. De exemplu, acondroplazia, absenta incisivilor laterali, acro-osteoliza, brachi, dactilie colaboni retinian, polidactilia, etc.

274

in tabelul urmator vom prezenta riscul de transmitere si aparitie a acondroplaziei la descendenti, notandu-se cu "A" gena dominanta pentru acondroplazie, si cu "a" gena recesiva "normala".
Genotipul parental l.A/AxA/A 2.A/A x A/a 3.A/A x a/a 4. A/a x A/a Descendentii genotipuri Fenotipuri (A) x (A) A/A Toti bolnavi. (A) x (A sau a) Vi A/A; Vi A/a Toti bolnavi. (A) x (a) A/a Toti bolnavi. VA bolnavi, VA (A sau a) x (A sau a) VA A/A; 2/4 A/a; '/4 a/a normali (sanatosi) (A sau a) x (a) !/2 Aa, '/2 a/a Vi bolnavi, V2 sanatosi (a) x (a) a/a Toti sanatosi.

Gameti

5.A/a x a/a 6.a/a x a/a

Criteriile de interpretare a unui pedigree (arbore genealogic) familial pentru caracterele normale sau patologice si stabilirea ca se transmit autozomal dominant: - caracterul se manifesta in egala masura la ambele sexe. Uneori sunt si factori "secundari" ce pot influenta frecventa si expresivitatea caracterului, modificand raportul "sex ratio"; - caracterul se manifesta si in starea de heterozigot a subiectului. Pentru o boala cu transmitere autozomal dominanta, starea de homozigot induce efecte severe, incat produsul de conceptie devine neviabil inca din perioada embrio-fetala aerstat spontan (neviabil); - nasterea unui copil cu caracterul dominant (normal sau patologic), necesita ca eel putin unul din parinti sa prezinte caracterul iar genotipic sa fie heterozigot sau homozigot; - cand un parental este heterozigot, riscul sau sansa de a naste copil cu respectivul caracter determinat de gena dominanta va fi de " (50%). Abated de la aceasta regula apar in cazurile de epistazie; - caracterul autozomal dominant se transmite pe filiatie directa (bunici^parinti ->copii mepoti ...), pe verticala.

275

2.2.4. - Transmiterea autozomal recesiva

Caracterul determinat genetic de o gena recesiva, se exprima fenotipic numai la subiectii homozigoti. In stare heterozigot, gena recesiva, in prezenta alelei dominante este "inactiva", este mascata. Pentru a demonstra transmiterea si raportul de segregare a unui caracter determinat genetic de gena recesiva, vom folosi sistemul genetic plasmatic de secretor (Se) si nesecretor (se). Din punct de vedere genetic, gena pentru secretor este dominanta (Se), iar pentru nesecretor este recesiva (se). In populatie indivizii pot prezenta, drept constitute genetica, unul din cuplurile alelice: Se/Se homozigoti dominanti, se/se homozigoti recesivi si Se/se heterozigoti. In tabelul urmator expunem ca probabilitate, urmatoarele cupluri de genitori: Genotipul parental 1. se/se x se/se 2. se/se x Se/se 3. Se/se x Se/se 4. se/se x Se/se 5. Se/se x Se/Se 6. Se/Se x Se/Se Gameti (se) x (se) (se) x (Se sau se) (Se sau se) x (Se sau se) (se) x (Se) (Se sau se) x (Se) ' (Se) x (Se) Descendentii Genotipuri Fenotipuri se/se Toti nesecretori Vz se/se si Vz Vi necesretori, XA Se/se secretori l VA se/se; XA A nesecretori; lA Se/se, 2/4 Se/se secretori, 2/4 secretori Se/se Toti secretori Vi Se/se, Vi Toti secretori Se/Se Se/Se Toti secretori

In populatiile umane sunt identificate multe caractere normale cu transmitere autozomal recesive, dar i foarte multe boli. Boli cu transmitere autozomal recesive pot fi urmatoarele (cateva exemple): oligofrenia fenil piruvica (fenilcetonuria), siclemia, tatasemia majora, acatalazemia, alcaptomenia, mucoviscidioza, albinismul, etc. Criteriile de analiza si interpretare a unui pedigree (arbore genealogic) pentru a stabili ca un caracter (normal sau patologic) es+e transmis si determinat genetic de gena autozomal recesiva, sunt urmatoarele: - caracterul se manifests in egala masura la ambele sexe; 276

- indivizii heterozigoti, purtatori in genotip de gena recesiva sunt lipsiti de caracterul recesiv, deoarece gena recesiva, in prezenta alelei dominante, este inactiva, mascata; - nasterea unui copil care sa prezinte caracterul autozomal recesiv (m stare homozigota) este posibila daca ambii parentali sunt heterozigoti, purtatori de gena recesiva, probabilitatea de a naste copil cu caracterul recesiv este E (25%); In casatoriile consanguine, caracterul autozomal recesiv are o frecventa mai mare.

2.2.5 - Transmiterea autozomal codominanta

Cand doua alele, cu acelasi locus pe cromozomi omologi, sunt dominante, cand se combina prin fecundare, rezultand cupiul alelelor codominante, fiecare isi exercita functia de determinism genetic, exprimanduse fenotipic, caracterul va fi nuantat identificand trasaturile de caracter corespunzator fiecarei alele din cupiul alelomorf. Pentru demonstratie ne vom folosi de sistemul genetic plasmatic al haptoglobulinelor (Hp). Genele codominante care determina acest sistem sunt: gena dominanta Hpl pentru tipul de Hpl si gena dominant! Hp2 pentru Hp2.

277

in populatie sunt posibile urmatoarele cupluri parentali: Genotipul parental l.Hpl/Hpl x Hpl/Hpl 2. Hpl/Hpl x Hpl/Hp2 3. Hpl/Hpl x Hp2/Hp2 4. Hpl/Hp2x Hpl/Hp2

Gametii
(Hpl)x(Hpl) (Hpl)x(Hpl sau Hp2) (Hpl) x (Hp2) (Hpl sau Hp2) x (Hpl sauHp2)

5.Hpl/Hp2x Hp2/Hp2 6. Hp2/Hp2 x Hp2/Hp2

(Hpl sau Hp2) x (Hp2) (Hp2) x (Hp2)

Descendentii genotipuri Fenotipuri Toti cu haptoglobin^ Hpl/Hl Hpl Hpl/Hpl sau i/icuHpl !/2cuHp Hpl/Hp2 l-Hp2 Toti cuHpl-Hp2 Hpl/Hp2 (heterozigoti) l X A Hpl/Hpl A vor avea Hpl!/4 Hp2/Hp2 Hpl lA vor avea 2/4 Hpl/Hp2 Hp2Hp2 2/4 vor avea HplHp2 1 Vi vor avea Hpl/2Hpl/Hp2 Yi Hp2 Vi vor avea Hp2/Hp2 Hp2~ Hp2 Hp2/Hp2 Toti cu Hp2-Hp2 .

2.2.6.- Ereditatea legata de cromozomii sexuali

La mamifere si omul actual, cele doua sexe se diferentiaza genetic prin cuplul de cromozomi sexuali x si y. Sexul feminin are doi cromozomi x(xx): un cromozom x este de origine paterna, al doilea de origine materna, cuplu care se stabileste prin procesul de fecundare a gametilor si formarea zigotului diploid. La sexul masculin intre cromozomii sexuali X si Y se remarca o accentuata neurologie morfologica, dimensional^, si functionala. Lyon (1962), plecand de la aceste diferente a cuplurilor de cromozomi sexuali la cele doua sexe, si consemnand diferente si in activitatea genetica intre cromozomul X si Y, a studiat comportamentul cromozomilor X la femeie unde avem un cuplu XX, in raport cu sexul masculin care are un singur cromozom X, al doilea fiind Y.

278

Observatiile lui Lyon sunt urmatoarele: pentru a se mentine, valoric, un echilibru constant genetic si fenotipic a caracterele determinate de genele cu locusuri pe cromozomii X intre cele doua sexe, la sexul feminin, in celulele somatice (m interfaza) un cromozom X este inactivat, identificat ca o formatiune corpusculara (1,5-2 p diametru) intens heterocromatic. Prin aceasta inactivare se asigura un echilibru intre genele X-linkage de pe cromozomul X la sexul masculin si cromozomul X neinactivat de la sexul feminin. Alte observatii facute de Lyon sunt urmatoarele: a) - Inactivarea cromozomului X matern sau X-ul patern in celula somatica la femeie este aleatorie. Unul va fi inactivat. Dar, dupa inactivare, acel cromozom X inactivat, matern sau patern, va fi inactivat in toate generatiile celulare ce succed din respectiva celula. b) - Inactivarea cromozomului X nu este realizata in totalitate. Exceptie de la acest proces face segmentul distal al bratului p a cromozomului X. Genele X-linkage din acest segment cromatidic nefiind inactivate isi vor exercita functia de determinism genetic in cupluri alelice, din corespondentul omolog al cromozomului X noninactivat. Ca acest segment din bratul p al cromozomului X inactivat isi exercita activitatea genetica in cuplul alelomorf cu a cromozomului noninactivat se confirma prin diferenta valorica a doua tipuri de molecule (determinate de gene cu locusuri pe bratul Xp) prin care se diferentiaza cele doua sexe: gena care determina genetic sinteza de steroid, sulfataza si gena pentru antigenul Xg eritrocitar. Aceste molecule sunt produse in cantitate dubla la femeie, fata de continutul la barbat. La barbat cromozomul X si cromozomul Y raman activi la nivelul intregii populatii celulare din organism. In cazul cand pe cromozomul X de origine materna se gasesc unele gene mutante, la barbat aceastea isi pot exercita functia genetica in doza mica, exprimand fenotipic, caracterul determinat de gena mutanta. La femeie, daca un cromozom x are o gena mutanta, boala nu se manifesta, gena fiind recesiva in raport cu gena omoloaga (dominanta) de pe cromozomul x normal. Ca urmare femeia se considera purtatoare si transmitatoare a genei mutante, fara a i se manifesta fenotipic boala. In meioza, prin disjunctia cromozomilor sexuali se pot obtine urmatoarele tipuri de gameti, diferiti prin cromozomii sexuali: La femeie, in ovogeneza, ovulul poate avea cromozomul x fara gena mutanta, sau cromozomul x cu gena mutanta prezenta. RaportuI valoric fiind 50% ovul cu x normal si 50% ovul cu x mutant. 279

La barbat, in spermatogeneza, obtinem doua tipuri de spermii: spermie care are cromozomul y si spermie cu cromozomul x, care, fiind de origine materna, poate contine gena mutanta sau nu. Prin fecundare se pot obtine zigoti diploizi care, limitat la cuplul de cromozomi sexuali pot prezenta: XX; XX*m; XY; X*mY. Datorita omologiei genelor alelomorfe intre cromozomii X la femeie si neomologiei genice intre cromozomii X si Y la barbat, segregarea caracterelor respects legile mendeliene, dar transmiterea genelor mutante si manifestarea fenotipica a respectivelor caractere este diferita in raport cu determinismul genetic al genelor autozomale. La om caracterele X-linkage si Y-linkage se transmit: ereditatea legata de Y; ereditatea recesiva legata de X si ereditatea dominanta legata deX. a) - Ereditatea Y-linkata sau holandrica pe cromozomul Y, pe bratul scurt se gaseste gena TDF (factorul determinant testicular) care nu se gaseste pe cromozomul x. Caracterul determinat genetic de TDF este un exemplu de ereditate holandrica sau a cromozomului Y. Prin intermediul cromozomului Y, barbatii vor transmite gena TDF numai la descendentii de sex masculin. Cum cromozomul X nu poseda gena TDF, fiicele nu vor primi aceasta gena. Un alt exemplu de ereditate holandrica este gena pentru hipertricoza urechilor. Este un caracter care, la unii barbati, se prezinta cu par lung la lobul urechilor. b) - Ereditatea X-linkage recesiva in cazul cand unul din cei doi cromozomi X la femeie are o gena mutanta, ea va fi recesiva in raport cu alela omoloaga normala dominanta. Ca urmare, o femeie heterozigota, purtatoare a genei mutante recesive, nu va manifesta boala, in schimb este potential transmitatoare a respectivei gene la descendentul de sex masculin la care se va manifesta boala. Probabilitatea ca un ovul dezvoltat in meioza sa prezinte cromozomul x cu gena mutanta este de 50%. Ca exemplu demonstrativ de transmitere a unui caracter determinat de gena X-linkage recesiva vom folosi distrofia musculara Duchene". Aceasta distrofie caracterizata prin slabirea progresiva a musculaturii proximale, este urmarea unei sinteze masive a enzimei creatin kinazei (C.K.). Cum boala se manifesta numai la sexul masculin cu debut inca din copilarie si decesul la 20 de ani, boala este determinate de gena recesiva X280

linkage. Cand o femeie purtatoare a respectivei gene mutante se casatoreste cu un barbat normal rezultatul, ca probabilitate de recombinare prin fecundatie, va fi: 25% fetite normale XX, 25% fetite purtatoare XXCK, 25% baieti normali Xy si 25% baieti cu distrofia musculara Duchene X*CKY. Observam ca fiicele care au primit X-ul matern cu gena mutanta devin purtatoare si potential transmitatoare, dar somatic sanatoase. Cand zigotul Xy primeste prin ovul cromozomul X matern cu gena mutanta, devenind X*CKy, copilul de sex masculin care se va dezvolta si naste va fi bolnav de distrofia musculara Duchene. Ceilalti posibili descendenti XX si Xy, vor fi normali si nepurtatori de gena mutanta. In prezent sunt identificate 310 gene recesive X-linkage la om. Ca boli date de gene recesive X-linkage care se manifesta la barbati mentionam: daltonismul, hemofilia, albinismul, diabetul insipid nefragen, deflcienta in G6 PD (glucoza - 6 - fosfat de hidrogenaza) s.a. . c) - Ereditatea X-linkage dominanta sunt cunoscute cazuri familiale cand pe cromozomul X se gasete gena mutanta, care are raport de dominanta fata de gena normala" recesiva. In populatie, genotipurile si fenotipurile pot fi: XX femeie normala; XX* femeie heterozigota bolnava; Xy barbat normal; X*y barbat bolnav. Daca mama este heterozigota XX* (bolnava si gena mutanta dominanta prezenta), va transmite boala atat la fetite cat si la baieti:

XX*

XY

XX
9normala heterozigota

XY

XX* X*Y
(^bolnav

(^normal $bolnava

281

Daca tatal poseda pe cromozomul X gena mutanta dominanta, va transmite boala numai la fetite, baietii vor fi sanatosi:

XX
/\

x X v*

X*Y ^

XX

Xy

XX* Xy

fetita bolnava heterozigota Cand dominanta este completa, toti purtatorii genei mutante va manifesta fenotipic boala. Femeile heterozigole manifesto semnele morbide atenuat. Pentru sexul masculin, unele gene mutante dominante cu locus pe cromozomul X, pot avea si efecte letale. Exemplu de boala data de gena dominanta X-linkage este rahitisml vitamina-D-rezistent care se manifesta atat la barbati catr si la femei. Deosebirea prin care se manifesta boala la barbati si femei este urmatoarea: la barbati este uniform severa, in timp ce la femeia heterozigota, datorita lyonizarii unui cromozom X, este variabil afectata (cu variatii de manifestare a bolii). Sistemul eritrocitar Xg, hipoplazia emailului, hipoplazia dermala, sunt deasemenea ereditare cu transmitere X-linkage dominanta, precum si hiperkeratoza foliculara (Keratosis follicularis spinulosa decalvans eum ophian"). Persoanele cu hiperkeratoza foliculara au o pierdere totala sau partiala a genelor, sprancenelor si a parului capilar. Efectele keratozei foliculare sunt mai severe la barbati X*ky decat la femei. Aceasta diferenta de exprimare fenotipica se explica prin starea de heterozigot a femeii, care, avand o alela normala, compenseaza, prin atenuare, activitatea genei mutante dominanta.

282

2.3. Ereditatea poligenica - multifactoriala. Ereditatea "cantitativa"

Inca din 1889, Galton a observat la speciile studiate, prezenta unor caractere care nu respectau continuitatea naturala sau "identitatea" manifestata la fenotipul descendentilor. El a constatat caractere a caror exprimare fenotipica variaza in limite foarte largi (+ la -), de la o extrema la alta, pe care le-a denumit "caractere cantitative" sau "biometrice". Studiile care au urmat observatiilor lui Galton au stabilit urmatoarele: daca trasaturile de caracter (calitative), care respecta legile mendeliene, particularizate prin "discontinuitate mendeliana", caracterele "cantitative" (inteligenta, talia, greutatea, susceptibilitatea la boli cu predispozitie genetica ca: diabetul, boala canceroasa, procesele degenerative pe fond genetic, melanodermia), prin manifestarea fenotipica graduala, au o distribute gaussiana la membrii familiei, la indivizii conspecifici. Acest tip de transmitere este determinat genetic de un multiplu de cupluri genice nonalelice care au locusuri diferite pe cromatidele cromozomului, sau pe cromozomi diferiti. Fiecare cuplu genie cu activitate convergenta in definirea caracterului determinat poligenic, are efecte sumative: efecte negative prin diminuarea progresiva in exprimarea caracterului somatic, sau cu efecte pozitive, caracterul accentuandu-se progresiv pe parcursul ontogeniei indivizilor. Poligenia determina fenotipuri "valoric" diferite ale unui caracter chiar in cadrul familial Ereditatea poligenica nu respecta legile mendeliene de transmitere si segregare a caracterelor. Genele cu actiune convergenta asupra unui caracter poligenic pot fi dominante sau recesive. Datorita dispersiei genelor pe cromozomi diferiti, in meioza are loc disjunctia cuplurilor de cromozomi omologi (materni - paterni) rezultand gameti haploizi. Prin fecundarea gametilor se realizeaza recombinarea genomica, definirea zigotului diploid. Datorita disjunctiei si recombinarii cromozomilor (recombinare aleatorie) se asigura si o recombinare a genelor cu locusuri pe respectivii cromozomi, rezultand constelatii genice care nu respecta, ca determinism si segregare, legile mendeliene, ci distributia caracterelor exprimate fenotipic fiind de tip gaussian. Sub aspect "cantitativ" caracteru exprimat fenotipic, variaza in limite foarte largi (+ spre -). 283

Caracterele poligenice nu pot fi catalogate pe grupe: cantitativ sau calitativ distincte. In mod normal, acest grup de caractere se incadreaza in limitele de toleranta ale speciei, ale populatiei. Un exemplu de caracter poligenic prezentat este melanodermia. Melanodermia, caracter poligenic cu distribute geografica este determinat si transmis poligenic. Se considera ca pigmentatia cutanata este transmisa poligenic. Pigmentatia cutanata o gasim accentuata la populatiile negroide si nepigmentata (sau slab pigmentata) la populatiile caucaziene (albinos). Arbitrar, sa presupune ca melanodermia ar fi determinata de trei cupluri de gene nealelice, cu locusuri difeilie pe cromozomi celulari. Genele pentru melanodermie sunt dominante la populatia negroida si recesive la caucazieni. Sa consideram existenta urmatoarelor genotipuri in respectivele populatii, triplu homozigote dominante si recesive: - AA, BB, CC - homozigoti in populatia negroida, cupluri dominante; - Aa, bb, ce - homozigoti recesivi pentru populatia caucaziana Formarea unui cuplu de genitori: femeie alba, triplu homozigota recesiva, cu un barbat negroid, triplu homozigot dominant; putem observa ca descendentii mulatri vor fi descendenti cu pigmentatia cutanata asemanatoare cu a genitorului negroid, dei descendentii vor avea genotipurile heterozigote: Aa, Bb, Ce, ceea ce confirma caracterul dominant al cuplurilor de gene pentru melanodermie. Daca se vor cupla doi descendenti mulatri heterozigoti (Aa, Bb, Ce fiecare), descendentii vor prezenta o melanodermie variabil nuantata fenotipic, pigmentatia variind, gradual, intre alb si negroid. Diversificarea fenotipic in F2 este rezultatul combinatiilor genotipului celor sase cupluri de gene nealelice heterozigote, ilustrand segregarea independenta a caracterelor poligenice, ilustrand continuitate fenotipica a melanodermiei.

2.3.1. Relatii genotip - mediu sau caractere poligenice multifactoriale

Caracterele poligenice, desi determinate genetic, sunt influentate de interference ale factorilor de mediu intern ale indivizilor, sau mediul extern (factori ambientali, de mediu) (fig. 70) Factorii externi indue influente cantitative sau calitative asupra caracterelor poligenice, sau cu predispozitie genetica. Factorii externi (ecologici) ce actioneaza asupra fenotipului pot induce influente ce pot depasi limitele de toleranta ale speciei, ale
284

individului, determinand modificari asupra caracterelor care, uneori, sunt neconforme cu legile geneticii formale. Raspunsul sistemelor poligenice variaza in raport cu doza, tipul factorilor de influenta a mediului, depinde de intensitatea masurabila a factorilor de "interventie". Sunt cazuri cand nu putem detecta intensitatea interventiei unor factori de mediu in "modelarea" unui caracter poligenic exprimat fenotipic. In aceste cazuri implicat este numai genotipul, complexul genelor nealelice care indue variatii (vezi poligenia). Ereditatea multifactorial a, unde este o "conlucrare" conditionata intre factorii genetici si cei din mediul ambiental in edificarea unui caracter, nu trebuie confundata cu ereditatea poligenica. Ereditatea multifactoriala particularizeaza variatiile caracterelor masurabile, metrice si mai putin descriptibile. Variatia are un aspect continuu, indivizii prezentand orice valoare posibila cuprinsa intre doua limite extreme. Dublul determinism a caracterelor cantitative poate fi ilustrat daca analizam talia corpului la om. Se stie ca talia, determinata de complexe de gene nealelice dominante sau recesive, cu locusuri pe cromozomi diferiti, este influentata de factorii alimentari, de mediu. De exemplu, o alimentatie bogata in proteine stimuleaza cresterea taliei individului. De asemenea, multe malformatii congenitale multiple sunt expresia ereditatii multifactoriale, urmarea interferentelor dintre sistemul poligenic si influenta nefavorabila a unor factori "agresivi" din mediu care deregleaza mecanismele de diferentiere embrio-fetala (Fraser, 1980; Friedman si col., 1992; Frets si Niermajer, 1990).

285

DEZVOLTAREA /CRESTEREA SI DIFERENTIEREA EMBRIOFETALA

imp ica DIFERENTIERII __ ca parte a DEZVOLTAREA DECIZIILOR

REGLAREA LA MAI MULTE NIVELE

-care implies

Care pot implica'

LEGATURI (CORELARI) ALTERNATIVE

PREZENTA SAU ABSENTA GENELOR SPECIFICE

REARAHJARI ALE ADN pnn

Perdru a produce ' COMUTATOARE SPECIFICE DE COMUATATOARE SPECIFICE DE ACTIVARE/ DEZACTIVARE RECOMBINAREA SITUSURILOR (REGIUKILOR) SPECIFICE CRESTEREA care permit LANTURI (NODURI) AUTOREGLATOARE

ACTIVARE/DEZ ACTI VA RE COMUATATOR DE ACTI VARE/DEZ ACTI VA RE PENTRU ALTE GENE Perdru fmalisarea Ce condace la

VARIABILITATII

Carasjvms la

DECIZIILOR ANTERIOARE

DEZVOLTAREA RELEELOR DIRECTIONATfl

MEDIU

Ca're DIFERITE CAI

Fig. 70 Diferentierea in cascada

286

3. Notiuni de cronogenetica si cronobiologie asupra caracterelor multifactohale

Analiza corecta si extinsa asupra caracterelor poligenice cu dependenta de factorii de mediu au consemnat ca exprimarea fenotipica variaza pe parcursul ontogenezei individului. In consecinta putem mentiona ca sistemele poligenice cu activitate convergenta in definirea unui caracter "respecta" principiile cronogenetice si cronobiologice in dezvoltarea organismului, in evolutia exprimarii fenotipice a respectivelor trasaturi morfo -structurale si functionale.

3.1 Cronogenetica si cronobiologia in activitatea genomului uman

Dupa fecundare si constituire, zigotul confine zestrea genetica mostenita de la genitori. Este zestrea genetica pentru definirea caracterelor moleculare, celulare, tisulare, organe si activitatea psiho-neurologica a individului care se va dezvolta. Zigotul este "toti-potent" genetic. Insa, dupa constituirea zigotului, nu intreg genomul, nu toate genele inscrise codificat in genom, isi incep activitatea de determinism genetic. Este o etapizare ontogenetica in activitatea genomului constitutional a gruparilor poligenice implicate, convergent, in definirea unui caracter multifactorial. De aceea putem vorbi de cronogenetica si cronobiologia activitatii genomului si dezvoltarii organismului. Pentru intelegerea corecta a notiunilor de cronogenetica si cronobiologie sunt necesare cateva precizari: Einstein (1905), elaborand teoria relativitatii formuleaza simplist notiunea de cronogenetica: "un paradox al ceasurilor". Ulterior, Langevin inlocuieste orologiile lui Einstein cu doi gemeni: "unui trimis in spatiul cosmic, celalalt ramas pe pamant". El considera ca la mtoarcere, geamanul trimis in spatiu ar trebui sa fie mai tanar fata de eel ramas pe pamant. Din comparatia elaborata de Langevin, se desprinde ideea ca studiul gemenilor univitelini ajuta sa analizam si sa stabilim caracterele poligenice normale sau patologice. Cronogenetica se ocupa cu dimensiunea temporala a genei, cu etapizarea activitatii genelor din constitutia genetica a individului, raportata activitatea la perioadele ontogenetice. Cronogenetica se ocupa cu "timpul biologic primitiv", cu "timpul ereditar" motenit si, potential, transmis de fiecare individ din familie, din populatie.

287

Timpul ereditar poate fi supus mecanismelor de variabilitate prin recombinare si/sau mutageneza. Fiecare gena are o incarcatura de informatie in forma codificata determinata in cursul evolutiei bio-genetice, ce poate fi exprimata cantitativ sau calitativ in cursul dezvoltarii ontogenetice a fiecarui individ. Este timpul biologic ereditar al fiecarei gene. Din definitia cronogeneticii se poate consemna: - gena define a patra dimensiune, care este timpul sau durata de functionare; - variabilitatea genotipului este si temporara, gena activand intr-o anume etapa ontogenetica in dezvoltarea individului. Gena nu este numai calitativa-cantitativa; - se presupune ca timpul genetic respecta partial legile mendeliene Sincronismul activitatii genelor confirma ca manifestarea unui caracter normal sau patologic poate fi repetat exprimat in aceleasi perioade ontogenetice la membrii familiei, sa prezinte aceeasi evolutie si durata in timp, dar fara identitate (sincronism) in aspectul cantitativ sau calitativ al caracterului, exprimat la membrii componenti ai familiei. Se poate observa ca un caracter poligenic prezinta variatii, o gradualitate fenotipica in raport cu etapa ontogenetica a individuali. Variatii graduate apar, repetate la aceleasi perioade ontogenetice atat la membrii componenti din familie, cat si la descendentii familiilor. Aceasta diferentiere in exprimarea aceluiasi caracter la membrii familiei, sau la indivizi conspecifici, este cunoscuta ca "izocronism familial". Sincronismul genelor si izocronismul familial sunt epifenomene de origine genetica. Epifenomenul confirma existenta timpului biologic primar (genetic). Intre timpul fizic exogen ritmic si timpul biologic primar se stabilesc interrelatii conditionale. Rezultatul acestor inter-relatii reprezinta timpul mixt. Mathe' (1979) lanseaza ipoteza ca timpul biologic primar (genetic), factor genetic determinant poate fi modificat prin "alterari" mutationale. Studiul parametrilor timpului biologic primar pot fi teste reale de referinta, de identificare, prevenire si prognoza in exprimarea fenotipica a caracterului poligenic, normal sau patologic. Alterarea timpului biologic primar (genetic) se produce prin mutatii, autoduplicatii, crossing-over inegal sau prin recombinare intra- si intercromozomica. Aceste modificari s-au produs in cursul evolutiei bio-genetice a organismelor, sau in diverse perioade ontogenetice ale individului. 288

Cronobiologia studiaza relatia dintre timpul fizic si timpul biologic. Aceasta relatie reprezinta ritmurile timpului fizic in raport cu ritmul de raspuns al organismului la actiunea si influenta factorilor de mediu. Ritmul de raspuns al organismului la actiunea mediului este timpul exogen. Este un timp ritmic de solicitare a proceselor vitale ale organismului, la care timpul biologic primar (genetic) aduce un aport substantial ca raspuns la timpul exogen (la actiunea factorilor de mediu). In notiunea de cronobiologie sunt integrate caracterele multifactoriale cu dependenta partiala de influenta factorilor externi. Sunt caracterele cu dualitate interferentiala: factorii genetici (mosteniti) si influenta factorilor de mediu, care prin efectul aditiv si sumativ sunt diversificat exprimate valoric, sau calitativ, in fenotipul indivizilor. In notiunea de timp mixt este inclusa notiunea de getiotip temporal, componenta esentiala a timpului biologic primitiv. Genotipul temporal reprezinta functia de stabilitate relativa a genei. Este timpul ce corespunde activitatii genei intr-o anume perioada ontogenetica. Dupa exercitarea functiei, gena isi poate inceta activitatea fund represata de alte gene, prin epistazie temporala, prin pleiotropie sau prin neomutatie. In conceptul timpului mixt putem consemna latura operationala si latura cauzala. Operationala deoarece aparatul genetic constitutional determina inductia informational determinanta a genelor ce definesc ontogenetic caracterele. Timpul mixt nu este antagonist timpului biologic primar (genetic), nu este in contradictie in conditiile dezvoltarii individului in limite de toleranta nomiala ale mediului. Daca limitele de toleranta normala sunt depasite (- sau +) apar efecte antagonice intre timpul mixt si timpul biologic primar. Apar caractere modificate fata de normal determinate de influenta distructiva, indusa de factori agresivi din mediu, apar diverse boli.

3.2 Stabilitatea genei sau ergon

In contextul temporal, gena demonstreaza o variabilitate normala sau deviant-mutanta, datorita capacitatii de raspuns la actiunea factorilor endogeni sau exogeni ai organismului. Ergonul sau stabilitatea genei este rezultatul existentei si mentinerii factorilor poligenici mosteniti. Ergonul este rezultatul a trei nivele de conditionare: - stabilitatea fizico-chimica sau sinonimia; - stabilitatea repetarii informatiei sau redundanta informationala; - stabilitate prin repararea structurii genei. 289

a) Stabilitatea fizico-chimica sau sinonimia Plecand de la proprietatile fizico-chimice ale ADN-ului s-a constatat ca aceasta biomolecula are o mare stabilitate metabolica fata de moleculele ARN sau proteine. Datorita acestei stabilitati metabolice si capacitatii de replicare semiconservativa, se asigura latura sincronica, de conservare si continuitate a informatiei genetice, se asigura sincronismul informational in spatiu si timp al genomului uman, iar informatiile genetice sunt inscrise codificat in stmctura aperiodica a ADN-ului genomic. Caracterele poligenice normale sau patologice beneficiaza de redundanta informationala. Desi cu redundanta informationala, caracterele poligenice prezinta variatii fenotipice si in raport cu perioadele ontogenetice ale individului. Variatiile cantitative sau calitative ale caracterelor determinate genetic de complexe poligenice ar fi explicate astfel: - dualismul interferential stabilit intre componentele genice (dominante si/sau recesive) si factorii externi. Acest dualism determina exprimari variabile asupra caracterelor poligenice. Variatiile, cantitative sau calitative, ale caracterelor poligenice isi gasesc explicatia urmatoare: componenta genetica este constant mostenita, prezenta si functionala in genomul individului, dar factorii de mediu pot prezenta variatii ca doza, intensitate, timp si tipul de factor, ceea ce ar induce un raspuns diferentiat al organismului; - este posibil ca genele din complexul poligenic de control al unui caracter sa fie represate dupa o perioada de activitate ontogenetica, de alte gene din componenta complexului. De exemplu, sistemul hemoglobinelor umane ilustreaza aceasta ipoteza. Astfel, la om, diferentiem diferite tipuri de hemoglobina, prezente pe perioade ontogenetice diferite si anume: Hb e4 (embrionara I), Hb a2s2 (embrionara II), Hb a2y2 (fetala), Hb a2p2 (adulta I), Hb a282 (adulta II). Modificarea fenotipica a caractemlui ar fi si consecinta genelor transpozabile ce pot influenta activitatea unor gene; - un alt argument care explica variatiile individuale in manifestarea fenotipica a caractemlui poligenic este urmatorul: cand factorii extemi depasesc limita de toleranta (- sau +), iar actiunea lor este exercitata timp indelungat asupra genomului, acestia pot deveni factori agresivi potential mutageni, dezechilibrand complexul poligenic cu modificarea, valorica, a caractemlui exprimat. Observam ca sinonimia genei poate fi "dezechilibrata" functional in genomul celular in raport de factorii extemi sau factorii proprii individului. 290

De exemplu, sunt caractere a caror exprimare fenotipica variaza in raport cu varsta individului, cum ar fi hemoglobinele umane. In aceste conditii apare notiunea de "cronon". Stabilitatea relativa a genei explica variabilitatea timpului biologic primar, intra- si interindividual. Insasi Watson considera variabilitatea timpului biologic intra- si interindividual ca fiind neintamplatoare, ca o consecinta a evolutiei biogenetice primare a genomului. La organismele cu reproducere sexuata, prezenta cromozomilor omologi asigura redundanta informational - genetica. Fiecare gena structurala este o "repetitie" in dublu exemplar. Ca semnificatie bio-genetica redundanta informationala asigura: - variabilitatea fenotipica a caracterului exprimat si determinat genetic; - asigura variabilitatea informatiei genetice pe perioade echivalente de timp; - redundanta non-mutanta garanteaza dezvoltarea nonnala a individului si manifestarea in limite de toleranta normala a caracterelor, garanteaza evolutia "corecta", etapizata ontogenetic a caracterului. Dar selectia adaptativa stabileste valoarea redundantei pentru fiecare gena. Pentru aprecierea valorii redundantei pot fi folositi urmatorii parametri: - raportarea proceselor desfasurate pe fiecare etapa ontogenetica; - in raport de "epuizarea" progresiva a redundantei genice; de actiunea factorilor agresivi externi ce tintesc, distructiv, genele redundante; - de variabilitatea coeficientului de reparare a genelor redundante "alterate"; - de sistemul polinucleozomic care protejeaza, conditioneaza si individualizeaza ergonul genie. Stabilitatea fizico-chimica a genelor sinonime poate diferi de la o gena la alta. Diferentierea este determinata de componenta in cuplurile complementare si anume: sunt gene sinonime care au acelasi mesaj genetic pentru determinarea sintezei unei proteine; dar ele se diferentiaza prin tripletele componente, prin numarul puntilor de hidrogen in raport de cuplul complementar A = T sau G = C. O gena din complexul genelor sinonime, poate avea un numar mai mare sau mai mic de cupluri complementare A = T si G = C, ca urmare diferente in numarul puntilor de hidrogen, ceea ce determina o diferenta a timpului necesar pentru decodificare. Aceste diferente indue variatii in stabilitatea si timpul de functionare a genelor sinonime. Aceasta diferenta in sinonimia genelor poate fi transmisa 291

descendentilor. Se apreciaza ca o gena sinonima difera de gena omoloaga prin 12,5 - 15% din totalul puntilor de hidrogen, diferenta rezultata din cuplurile complementare a bazelor azotate componente. Variabilitatea timpului biologic individual poate fi determinata si de alti factori cum sunt: raportul dintre valoarea puntilor de hidrogen si temperatura de denaturare, de mediul acid, de concentratia mediului. Tot factor de influenta este ordinea crescanda a complexitatii structurii genelor sinonime cum ar fi: ordinea poli-A, poli A + T, poli A + G + T etc. Deci stabilitatea poate fi "deteriorata" prin procese si mecanisme diverse. Sunt factori de variabilitate a sinonimiei si redundantei care influenteaza coeficientul de stabilitate a genelor implicate in definirea unui caracter multifactorial, precum si a timpului de functionare a informatiei codificata de structura acestora. Durata informatiei sau chronomul Chronomul sau dimensiunea temporala a genei este durata de timp cat functioneaza o gena pentru determinarea sintezei tipului de ARN-m si edificarea proteinei cu structura si functii specifice. Chronomul sau dimensiunea temporala a genei este conditionat de: Raportul dintre dimensiunea mesajului genetic inscris in structura genei, de cantitatea informatiei daca toate nucleotidele componente ce formeaza mesajul genetic ar fi echiprobabile. Mesajul complet pentru edificarea unui caracter ar reprezenta maximum de informatie genetica, masura a redundantei. Dupa Britten si Davidson (1968), redundanta informationala a ADNului este asigurata de sinonimia genelor in raport de complexitatea formarii caracterelor poligenice. Redundanta asigura entropia materiei vii, elimina dezordinile in organism; Factor conditional al chronomului este si raportul valoric intre cantitatea de informatie existenta in ADN si calitatea informatiei decodificata in ARNm, care trecuta in citoplasma, va fi transcrisa in structura unei proteine. Teoretic, intre mesajul decodificat din ADN si eel ajuns in citoplasma ar trebui sa existe valori identice. Dar datorita structurii in mozaic a genei la eucariote, ARNm, prin mecanisme de restrictie enzimatica, de eliminare a intronilor si actiunea ligazei, de recuplare a exonilor informationali, se pot produce defecte. In consecinta, nu intotdeauna ARNm cuprinde in totalitate Chronomul genei din ADN. 292

 In durata informatiei si functiei genei timpul temporal (chronomul) poate fi influentat de eventuale imbolnaviri ale organismului care modifica mecanismele activitatii unor gene. Este posibil ca unele boli pe care individul le prezinta in diverse perioade ontogenetice, sa induca modificari in structura unor gene, care acumulate, pot fi materializate in sinteze eronate de molecule proteice sau dereglari in reglajul genetic al sintezei de proteine. Ca informatia genetica sa fie citita in totalitate si materializata in structuri proteice trebuie respectate inter-relatiile redundantei si limitele de toleranta normala asigurate intre: cantitate, calitate, ergon, chronon. Gena neomutanta prezinta alta dimensiune temporala fata de gena salbatica. In concluzie, consideram ca redundanta genei este asigurata pe un timp limitat, stabilitatea fiind relativa, partiala. Sistemul ergon/chronon (E/C) Sistemul ergon/chronon reprezinta a patra dimensiune a genei. Aceasta dimensiune a fost demonstrata prin studiul cuplurilor gemelare univiteline ("homozigoti"). Studiul confirma ca fenotipic caracterele poligenice sunt exprimate cu o coincidenta valorica de aproximativ 0,90% pe perioade ontogenetice la gemenii proveniti din acelasi cadru familial, in aceleasi conditii sociobiologice, economice si acelasi nivel de cultura. Nu aceeasi valoare a fost stabilita la gemenii bivitelini (raportul fiind de aproximativ 0,50%). Evaluarea raportului E/C permite sa apreciem gradul de stabilitate a genei (ergonul), sa apreciem timpul potential de activitate a genei (chrononul). Raportul E/C permite sa apreciem stabilitatea genotipului constitutional al individului. Stabilitatea genei este evaluata in raport de durata de functionare si manifestare a caracterului determinat genetic (ergonul), iar chrononul genei este evaluat pentru fiecare individ din cuplul gemelar. Chrononul este o notiune "simpla". Ergonul este o notiune "complexa" care insumeaza mai multe componente: factorii de mediu pot induce mutatii ireversibile in structura genelor. Mutatiile se produc cu viteze invers proportionate cu chrononul, cu gradul de stabilitate a genei. Ergonul unei gene difera de ergonul altor gene din complexul poligenic ce determina un caracter. Datorita particularitatilor ergonice ale fiecarei gene din complexul sistemului poligenic explicam diferentele E/C. Dobzhausky facea urmatoarea rem area: "este raspandita opinia conform careia genotipul unui individ ramane neschimbat din momentul 293

fecundatiei si pana la moarte, in timp ce fenotipul se modifica continuu. Aceasta afirmatie nu este corecta, deoarece la adult functioneaza alte gene, care existau in genom in perioada embrionara sau copilarie". Dobzhausky (1965) confirma ca factorii de mediu au influente aditive in expresivitatea fenotipica a caracterelor poligenice, dar pot influenta distructiv structura si functia unei gene. Aceste distructii genice pot avea efecte secundare nefavorabile pentru organism, iar prin depasirea limitelor de toleranta normale se trece in patologia individului. Factorii externi pot modifica raportul E/C prin: - modificarea stabilitatii structurii genei; - alterarea inform atiei genetice inscrisa in structura genei; - introducerea interactiunii operative de tip represie si transcriere, intre informatia - genetica si factorii de mediu. Parametrii de calcul a raportului E/C, respectiv a patra dimensiune a genei, sunt: - stabilitatea moleculara a genei; - redundanta informationala a genelor implicate in definirea caracterului poligenic; - capacitatea de reparare a ADN unde este inscrisa, codificat, structura genei. In raportul E/C factorul timp modifica valoarea interactiunii alelice si intergenice din complexul poligenic. Uneori raportul E/C poate fi modificat chiar in cadrul aceluiasi operon datorita neconcordantei interactiunilor (influenta si raspuns) dintre gena reglator si genele structurale. Neconcordantele cronogenetice E/C pot fi determinate de repartitia pe cromozomi diferiti a operonilor implicati in edificarea aceluiasi caracter. Neconcordanta este determinata de momentul inceperii functiei de decodificare a mesajelor inscrise in structura genelor structurale dar si a timpului necesar decodificarii. Sunt operoni cu activitate rapida, altii cu ritm variabil. Timpul activitatii diferentiate a genelor din complexul poligenic si ritmul de functionare sunt datorate componentelor nucleotidelor complementare: numar crescut sau redus al cuplurilor A = T sau G = C. Aceste neconcordante in activitatea operonilor pot influenta variatii ontogenetice in manifestarea unui caracter.

294

3.3 Metode de analiza a caracterelor poligenice multifactoriale

Perfectionarea metodelor citogenetice, genetica antropologica, biologie moleculara, bio-sociologie a evidentiat ca variatiile fenotipice ale caracterelor poligenice sunt determinate de doi factori: - factorii genetici determinant din constitutia individului; - factorii de mediu, conditionali si influenta, in care se dezvolta individul pe tot parcursul vietii sale. Pentru a demonstra dualitatea conditional si interference intre constitutia genetica primara si influentele induse de factorii de mediu, pentru a stabili "cuantumul valoric" al componentei genetice a individului si influenta aditiva indusa de factorii externi sunt folosite metodele: - studii familiale si analiza pedigree-ului; - studiul cuplurilor de gemeni; - studiul copiilor adoptati; - studiul susceptibilitatii caracterelor biologice si markerilor genetici. a) Studii familiale si analiza pedigree-ului Analiza membrilor componenti din familie este o metoda clasica pentru studiul geneticii umane. Folosita initial de Galton, metoda se bazeaza pe principiul stabilirii "riscului" familial ca probabilitate de transmitere a unui caracter normal sau patologic la indivizi, pe filiatie directa si heredocolaterali. In esenta, metoda este un studiu comparativ al caracterelor prezente la parinti si manifestate la descendenti. Metoda impune un studiu familial dinamic, unnarindu-se manifestarea caracterului poligenic pe perioade ontogenetice. Metoda se bazeaza pe principiul ereditarist, deoarece fiecare descendent mosjeneste de la fiecare parental 50% din constitutia genetica realizata prin fecundare. Valorile inregistrate se compara intre membrii familiei si cu valorile indivizilor neinruditi din populatie. Prin aceste studii comparative stabilim o anume relativitate, gradul si componenta genetica familiala, precum si substratul genetic predispozant. Aceasta analiza permite sa stabilim riscul familial al unor boli poligenice. Datele obtinute, statistic, evidentiaza ca heritabilitatea conflrma conceptul ereditarist. Metoda are un caracter relativ limitat ca interpretare si aplicabilitate. Permite o evaluare subiectiva asupra trasaturilor poligenice. 295

Ca varianta a studiilor familiaie este intocmirea si analiza pedigree-ului. Daca metoda studiului familial stabileste similitudiunea si heritabilitatea intre membrii familiei, pedigree-ul stabileste mecanismele comportamentului dominant sau recesiv al genelor din complexul poligenic implicat in edificarea caracterelor cu manifestare multifactoriala (genotip-mediu). In analiza pedigree-ului se impune necesitatea elaborarii unor modele statistice pentru a stabili concordanta genetica in cadrul familial. Caracterele poligenice nu confirma legile mendeliene, concluzie rezultata din studiul pedigree-ului. Pentru caracterele poligenice sunt elaborate noi concepte de analiza a pedigree-ului. Noile concepte pun accentul pe studiul penetrantei incomplete sau cu determinism genetic variabil, de fenocopii sau cazuri familiaie sporadice. De exemplu, Miron Baron (1990) apreciaza ca penetranta redusa explica manifestarea variabila a caracterului intre indivizi. Dintre, modelele genetice folosite la studiul pedigree-ului mentionam: - modelul locusului unic major - SML ("single major locus"); - modelul poligenic multifactorial - MFP.Daca variatiile ar respecta modelul SML, transmiterea si segregarea caracterului pot evidentia participarea unui singur cuplu alelic, respectand legile mendeliene. In aceste conditii la membrii familiei ar trebui sa existe genotipurile: homozigoti dominanti, homozigoti recesivi si heterozigoti. Baron considera ca parametrii modelului SML sunt urmatorii: frecventa alelelor, exprimarea fenotipica a genotipurilor mentionate, pragul si masura variatiei mediului. Dar caracterele multifactoriale sunt determinate de multiple cupluri de gene nealelice. In consecinta, se alege modelul MFP. Acest model ia in analiza doi factori de concomitenta si influenta: complexul de gene si factorii de mediu ce influenteaza caracterul exprimat fenotipic. Fiecare din cei doi factori are efecte minime, dar sumative. Prin metoda MFP se obtine un prag care evidentiaza limitele de toleranta ale individului pentru fenotipul caracterului determinat poligsnic. Pragul valoric corespunde gradului de implicare al factorilor genetici si al factorilor de mediu in edificarea caracterului poligenic. La analiza valorica a pragului pot fi asociati si factorii non-genetici, cum ar fi influentele culturale, educative, socio-economice.

296

Geneticienii au conceput si alte modele de analiza in transmiterea caracterelor poligenice, normale sau patologice, cum sunt: - modelul mixt al carui principiu este: "combina transmiterea unei gene din fondul poligenic si efectele mediului"; - modelul analizei a doua locusuri care urmareste analiza a doua cupluri de gene nealelice care interactioneaza in grade diferite; - modelul SML cu mai mult de doua alele; - modelul poligenic prin care se apreciaza efectele sumative ale fiecarui locus genie din sistemul poligenic. Uneori, pedigree-ul poate prezenta erori de interpretare cauzate de epistazia genica , de pleiotropie etc. - modelul multifactorial cu prag Metodele prezentate, metoda studiului familial si metoda de analiza a pedigree-ului la studiul caracterelor poligenice, impun argumente si interpreted mai ample, in special a datelor obtinute din studiul familial. Caracterele multifac tori ale continue au distribute gaussiana in familie, in populatie. Caracterele multifactoriale pot fi grupate in trei clase: - trasaturi multifactoriale cu variatie continua, valorile scalei gaussiene fiind cuprinse intre cele doua extremitati ale scalei; - trasaturi multifactoriale cu prag "fenotipic"; caractere cu manifestari fenotipice diferentiate pe perioade ontogenetice ale indivizilor. La om, un caracter poligenic cu variatie continua are o distribute normala in familie, in populatie. In cazul cand se depaseste de doua ori variatia standard (x2 2G) normala se considera valori exceptional ce depasesc limitele de toleranta. Ca urmare, pentru studiul familial si analiza pedigree-ului este necesara calcularea heritabilitatii genetice, concept care separa influentele relative genotip-mediu. Cu cat heritabilitatea este mai accentuata, factorii genetice sunt mai importanti. Fenotipul caracterelor multifactoriale reprezinta "suma" a trei valori: - "g"- contributia factorilor genetici aditionali cu varianta "G"; - "b"- contributia mediului in functie de varianta "B"; - "e"- contributia factorilor intamplatori din mediu, varianta "E". Relatia pentru a exprima heritabilitatea va fi: H2 = G/ (G + B + E) Heritabilitatea este masura prin care stabilim rolul factorului genetic in definirea caracterului poligenic. 297

b) Studiul cuplurilor gemelare S-a facut observatia ca studiul familial si metoda pedigree-ului ofera date nerelevante asupra caracterelor poligenice. Ca urmare s-au cautat alte criterii de a studia poligenia caracterelor. Un criteriu de analiza cu un aport substantial de stabilire a cuantumului valoric al complexului poligenic, corelat cu aportul factorilor de mediu in definirea unui caracter multifactorial, ii reprezinta studiul cuplurilor gemelare. Metoda respecta o regula elaborata de Tourraine: "cand concordanta este regula iar discordanta exceptia, caracterul este determinat genetic, dar gradul de exprimare fenotipica este cu dependenta de factorii de mediu". Aceasta regula isi gaseste aplicabilitate interpretativa pentru caracterele poligenice. Importanta este aplicabilitatea metodei si in studiul bolilor multifactoriale din populatiile umane. Cuplurile gemelare pot fi: - cuplul gemelar monozigot (MZ), rezultat dintr-un singur ovul fertilizat. Au aceeasi zestre genetica, identitatea fiind de aproape 100%. Gemenii monozigoti (MZ) au acelasi sex, aceeasi marked genetici, cu un fenotip aproape identic. La MZ se pot consemna unele diferentieri in expresivitate (variabila) pentru caracterele cu dependenta de mediu. - cuplul gemelar dizigot (DZ) rezulta din fecundarea, concomitenta, a doua ovule de catre doua spermii, cu formarea a doi zigoti. Gemenii DZ pot fi de sexe diferite, au 50% identitate genetica, markerii genetici cu identitate de 50%, iar manifestarea caracterelor multifactoriale mult diferentiata. La cuplurile gemelare MZ si DZ se poate urmari si stabili gradul de influenta a factorilor de mediu in expresivitatea caracterelor poligenice. Astfel de studii incepute de Galton (1905) si continuate de diversj cercetatori (Larmat 1977, Jones 1993, Lean 1992, Monod 1970, Reinberg 1991, Athanasiu 1995 s.a.) au urmarit analiza diferentelor intre sistemul poligenic determinant al unui caracter si gradul de influenta a factorilor de mediu. Pentru a se obtine date concludente, un studiu corect respecta urmatoarele criterii de analiza a cuplurilor gemelare: - gemeni univitelini care se dezvolta in acelasi mediu familial; gemeni univitelini care prin separare se dezvolta in conditii diferite de mediu si viata socio-economica; - gemeni bivitelini care se dezvolta in acelasi mediu familial; studiul fratriei gemenilor cu aceleasj conditii de viata cu a cuplului gemelar; - studiul aceluiasi caracter la indivizii neinruditi.Rezultatele pe care Larmat (1977) le-a sintetizat sunt urmatoarele (tabel): 298

Lffturi studiate

Neumansi col.

Burt

Erlenmeyer Kimling Jarvik

Schields Zozzo

Gemeni MZ crescuti impreuna Gemeni >,1Z crescuti separat Gemeni DZ crescuti impreuna Fratria crescuta impreuna cu cuplurile gemelare Fratria crescuta separat de cuplurile gemelare Indivizi neinruditi dar crescuti impreuna cu fratria si cuplul gemelar

0,92 0,86 0,53 0,50

0,94 0,77 0,55 0,54

0,87 0,75 0,53 0,49

0,76 0,77 0,51

0,90 0,6

0,42

0,41

0,42

0,25

0,28

0,23

Exprimarea coeficientului de corelare multifactorial a la cuplurile gemelare in raport de fratrie si indivizii neinruditi (dupaLarmat, 1977). - Coeficientul de corelare intre gemenii univitelini crescuti in acelasi mediu familial variaza in limite statistic nesemnificative, fiind obtinute valori cuprinse intre 0,90 - 0,94 (in raport de autorui studiului). Diferentele mici, nesemnificative, in expresivitatea caracterelor poligenice sunt consecinta raspunsului diferit, neuniform, la aceiasi factori de mediu. - Coeficientul de corelare intre MZ, separati si dezvoltati in conditii diferite de mediu, prezinta o diferenta semnificativa valoric. Diferenta coeficientului de corelare poate ajunge pana la 25%. Explicatia acestei diferentieri este urmatoarea: gemenii MZ au aceeasi zestre genetica 299

(~ 100%), dar fiind separati si dezvoltati in alte conditii geografice, socioeconomice si culturale, acesti factori au indus modificari asupra caracterului poligenic. Geamanul separat de mediul familial a reactionat diferit la noile conditii de dezvoltare, uneori unii factori putand modifica gene din complexul poligenic. Prin separare si dezvoltarea in conditii de mediu diferite, expresivitatea fenotipica diferita a aceluiasi caracter evidentiaza influenta aditiva (pozitiv sau negativ) indusa de factorii de mediu asupra genotipului. - Valorile total diferite in expresivitatea caracterelor poligenice intre gemenii MZ si DZ, care, desi dezvoltati in acelai mediu familial, sunt cauzate de constitutia genetica diferita intre acesti gemeni. Diferenta ajunge pana la 50% la DZ fata de MZ. Ca urmare si raspunsul DZ la aceleasi conditii de mediu va fi total diferit fata de MZ. - Cat priveste coeficientul de corelare intre cuplurile gemelare si fratrie, valorile sunt apropiate cu valorile corespunzatoare gemenilor DZ. Aceasta corespondenta valorica in expresivitatea unui caracter in fratrie fata de DZ este datorata genotipului constitutional care prezinta acelasj raport - de 50%o fata de MZ. - Analiza coeficientului de corelare intre indivizii neinruditi dar dezvoltati in acelasi mediu familial cu DZ, MZ si fratria, prezinta diferente ce pot ajunge pana la valori de aproape 75% fata de MZ si de 25% daca raportarile se fac la DZ si fratria cuplului gemelar DZ. Rezultatele obtinute la cuplurile MZ, dar separati prin adoptie, camine familiale sau orfelinate, unde au alte conditii de dezvoltare, confirma diferentele de corelare, cu influenta factorilor de mediu, a caracterelor multifactoriale. Deci nu putem neglija influenta mediului asupra caracterelor poligenice. Aceti factori au efecte aditive si interferand cu constitutia genetica, determina diferente graduale in expresivitatea fenotipica a aceluiasj caracter la indivizii conspecifici, sau diferente de expresivitate a aceluiasj caracter pe perioade ontogenetice ale individului Concluziile ce se desprind din studiul cuplurilor gemelare (MZ si DZ) si fratriile acestora sunt: caracterele poligenice - multifactoriale, cu predispozitie genetica si cu dependenta partiala de factorii de mediu vor avea expresivitatea fenotipica in raport de numarul cuplurilor de gene nealelice (dominante sau recesive) cu actiune convergenta in determinarea caracterului, dar si de prezenta si influenta factorilor de mediu ce actioneaza asupra genotipului. rezulta din aceste studii ca nu se absolutizeaza conceptul ereditarist constitutia genetica nu are rolul singular determinant in expresivitatea 300

aracterului poligenic nu se neaga rolul ambientului in dezvoltarea rganismului si edificarea caracterelor poligenice - conceptul ambientalist 5 remarca o dualitate interferentiala intre genotip si influenta mediului are, prin efecte sumative, asigura variatii fenotipice in manifestarea aracterelor poligenice. e confirma conceptul dualist.

.4 Heritabilitatea caracterelor multifactoriale

Pentru stabilirea efectului sumativ de influenta a factorilor de mediu ;upra genotipului in expresivitatea unui caracter poligenic se foloseste letoda de calcul a heritabilitatii. Calculul heritabilitatii caracterelor poligenice, initiat de Holzinger si izvoltat de Larmat ("Genetica inteligentei", 1977 pg.76), se bazeaza pe itele obtinute din studiile cuplurilor gemelare MZ siDZ. Criteriile de calcul sunt: - "diferenta medie a expresivitatii caracterului stabilita la MZ )MZ) cu acelasi genotip, raportata la fiecare membru din cuplul gemelar Z, reprezinta variatia ambientala; decalajul valoric mai mare intre DZ, DZ, exprima suma variatiei de influenta a factorilor de mediu si egalitatii genotipului intre gemenii DZ diferenta intre valorile DMZ si DDZ a indivizilor din fiecare cuplu melar exprima efectele sumative ale cuplurilor de gene nealelice fectele determinismului genetic)." Respectand aceste criterii de calcul se tine urmatoarea relatie a expresivitatii heritabilitatii: H = (DDZ - DMZ) / DDZ (1) Diferenta rezultata din aceasta relatie poate fi exprimata ca rianta VMZ2' prin relatia: H = (VDZ - VMZ)/ VDZ (2)

5 Calcularea variatiei caracterelor poligenice

Varianta genotipica. Geno tipul, componenta principala in exprimarea lotipica a caracterului poligenic, rezulta din valoarea raportului dintre rianta genotipului (VG) si varianta fenotipului (VF): VG/VF. Aportul constitutiei genetice a complexului poligenic in expresivitatea lotipica a caracterului poate fi apreciat in raport de aportul componentei 'ML = varianta MZ este media patratelor decalajului dintre performantele obtinute de :are individ din cuplul MZ in raport cu valoarea medie a cuplului MZ. 301

mediului. Acest aport se stabileste prin mas ararea caracterului exprimat fenotipic la gemenii DZ sau MZ separati prin adoptie, astfel incat vor avea conditii de mediu diferite. Varianta genotipica este suma a trei valori: valoarea ameliorarii aditive a caracterului (VA), valoarea data" de dominanta genelor (VD) si valoarea data de interactiunile intergenice (VI). Ea se exprima prin relatia: VG = VA + VD + VI. Varianta indusa de mediu. Ca varianta negenetica, reprezinta valoarea sumativa indusa de influenta factorilor de mediu extern asupra gradului de exprimare fenotipica a caracterului multifactorial - poligenic. Aportul mediului plus componenta genetica influenteaza diferenjial valoarea si gradul expresivitatii fenotipice a caracterelor poligenice la om. Varianta data de mediu este inclusa in varianta totala a caracterelor. Covarianta. Sunt cazun cand apar diferente intre variatia indusa valoric de mediu si variatia genotipica. In aceste cazuri un factor din mediul extern poate amplifica sau diminua valoric manifestarea caracterului multifactorial, fata de valoarea variantei dezvoltarii normale a individului. Cand individul se dezvolta in alte conditii de mediu sau cand la conditiile normale actioneaza un factor suplimentar capabil a influenta expresivitatea caracterului poligenic, se introduce notiunea de covarianta (COVGE). COVGE este varianta valorilor geno tipice (VG) si variatia valorilor fenotipice (E), ca efect sumativ "suplimentar" (aditional) a factorilor de mediu modificati. Relatia va fi: VE = VG + VE + 2COVGE Covarianta se introduce in calculul VE (variantei fenotipice) numai in conditiile carid membrii cuplului MZ, prin separare, se dezvolta in conditii diferite de mediu. Varianta (variatiile individuale). Abaterea de la valoarea medie a familiei sau a populatiei este exprimata prin varianta. Varianta este media acestor diferente ridicata la patrat. Componentii variantei sunt: VG - varianta genotipica rezultata din recombinarile aparatului genetic; VE - varianta devierilor induse de mediu; EF - varianta totala a fenotipului caracterului poligenic. VF = VA + VD + VI + VE

~~ Covarianta - capacitatea mai multor factori de a varia similar sau suplimentar, influentand un caracter 302

apitoiul VII &RTOGRAFIEREA, INGINERIA GENETICA 1 LONAREA GENOMULUI UMAN RINCIPII

Suportul molecular din genomul organismelor, care determine si *ura functiile de ereditate si variabilitate, a inceput sa fie studiat intensiv, extensiv, din anul 1944 cand Avery si Mc Leod au demonstrat, lerimental, rolul ADN-ului in transformarea virulentei la bacterii. Studiile ce au urniat au stabilit structura tridimensionals a moleculei ADN, din genomul celulelor umane, ultrastructura sau arhitectura tiala (cuaternara) a cromozomului celular, au stabilit functiile si vitatea semantics in definirea unor caractere exprimate fenotipic. Progresele tehnice, perfectionarea metodelor au permis abordarea r studii care au revolutionat genetica: incercari de cartografiere a omului uman, principii si aplicabilitatea ingineriei genetice si clonarea omului uman. Intelegerea importantei acestor studii impune prezentarea etapelor, norabile, in analiza genomului, a ADN-ului, care, prin structura si ;tiile sale, stabileste tipul constitutional genetic caracteristic fiecarui vid conspecific.

303

1. Tipul constitutional genetic

Daca in conceptia filozofilor antici prin constitute se intelegea structura fizica a individului, starea sa anatomica stabila, ulterior au fost elaborate definitii si ipoteze referitor la tipul constitutional al individului. Aceste ipoteze i definitii au fost elaborate de psihologi, psihiatri, neurologi, endocrinologi i geneticieni, etc. De exemplu, Kretschmer (1921), in lucrarea ,,Structura corporala si caracterul", definea tipul constitutional in urmatorii termeni: este ansamblul caracterelor unui individ grefate pe ereditatea sa". In 1922, Pende, exponent al scolii constitutional italiene considera tipul constitutional ca un ansamblu de particularitati morfologice, fiziologice i psihologice, prin care se caracterizeaza individul. Sunt particularitati determinate genetic, spune Pende, adapate la influentele modificatoare ale mediului inconjurator. Mai tarziu, I.C.Parhon (1930) definea tipul constitutional ca o ... conformatie morfologica a unui individ dat, compozitia sa chimica, modul de functionare a diverselor organe si felul in care el se comporta din punct de vedere psihic". In 1934, Kretschmer redefinete notiunea de tip constitutional considerand-o un ansamblu al intregului organism, in masura in care acesta formeaza, o entitate somato-psihica cu o interpretare activa si o interdependent^ constants a morfologiei, fiziologiei i caracterologiei". Pentru intelegerea corecta a conceptului tip constitutional genetic" al individului uman, pentru a valorifica efortul de cartografiere a genomului, a evidentia progresele realizate in ingineria genetica cu implicatii in patologia umana, se impune elaborarea unei formulari cuprinzatoare care sa exprime esenta constitutiei bio-genetice. Dupa o suita de formulari, incomplete sau eronate, s-a ajuns la o definitie cuprinzatoare elaborate de Delaunay (1969). El considera terenul sau tipul constitutional al individului uman o stare a materiei vii care rezulta din prezenta in celula a unui mare numar de constituenti chimici. 0 stare relativ stabila deoarece depind in ultima instanta de factorii genetici. Dar in acela^i timp este sj o stare care poate deveni instabila pentru ca pot interveni factori externi organismului, sau inerenti lui". Nascuta din neccsitatea de a explica functiile de ereditate i variabilitate (sincronica si diacronica), normale sau patologice ale omului, definitia contureaza clar ca trasaturile morfo-fiziologice i comportamentele
304

reprezinta raportul de interdependenta stabilit intre factorii genetici si factorii externi. Caracterele morfologice exprimate fenotipic au un determinism genetic, sunt inscrise, in forma codificata, in genomul fiecarui individ. Au continuitate genetica. Totusi, stabilitatea este relativa deoarece in perioada dezvoltarii embriofetale, mecanismele genetice implicate in diferentierea viitorului organism pot fi dereglate". Consecintele acestor dereglari" in aparatul genetic pot fi: - aparitia unor dezechilibre in tiparele informational-codificate genetic, care controleaza diferentierea celulara, tisulara, organogeneza; - instabilitatea" caracterelor ereditare, consecinta actiunii factorilor mezologici agresivi". Sunt procese si factori ce pot duce la modificarea tipului constitutional al individului. Latura morfologica si componentele tipului constitutional au valoare practica si teoretica deosebita deoarece stabileste particularul si individualul fenotipului: forma corpului, talia, greutatea, pigmentatia, trasaturile de caracter, comportamentul, temperamentul, trasaturile normale, deviante sau patologice. Toate trasaturile de caracter, macro- si micromorfologice, moleculare, comportamentale au un determinism genetic mostenit de individ de la ascendenti. Desi mostenite caracterele de la ascendenti, prin zestrea genetica, consemnam diversitate in exprimarea fenotipica, consemnam diferentieri, lipsa unei totale identitati somatice. Neidentitatea fenotipica intre genitori si descendent este rezultatul diversitatii genotipurilor realizate prin recombinarea genetica a genomului in meioza genitorilor si unirea aleatorie a gametilor haploizi (ovulspermie, cu formarea zigotului din care se dezvolta un nou organism). La organismele cu reproducere sexuata si om, posibilitatile de recombinare a aparatului genetic, valoric sunt amplificate. Ele se realizeaza prin recombinari inter- si intracromozomale, in meioza fiecarui genitor. Aceste posibilitati de recombinare a genomului indue marea diversitate a constelatiilor genice. De aceea se considera ca fiecare individ este o fiinta unica, originala si irepetabila genetic, prezentand o constitute bio-moleculara, structurala, morfologica si functionala in raport cu indivizii conspecifici. Deci principiul biologic de realizare a termenul constitutional genetic isi gaseste fundamentul in ADN-ul genomic. Se cunoaste ca ADN-ul cromozomal din nucleu, este relativ constant pentru specie, dar calitativ este particular fiecarui individ. 305

Daca diversitatea constelatiilor genice este consecinta recombinarilor inter- si intracromozomice, in schimb specificitatea structurii fiecarei molecule de ADN (in care sunt inscrise codificat informatiile genetice pentru fiecare trasatura de caracter) este explicate prin posibilitatea de ordonare aperiodica a celor patru baze azotate (A, G, T, C). In prezent se cunoaste ca in genomul uman se gasesc aproximativ 3,5 miliarde perechi de nucleotide.

2. Metode de analiza a structurii ADN Principii

In studiul genomului uman sunt etape care au pernis elaborarea proiectului de decodificare, cartografiere si clonare, cu implicatii in practica bio-medicala si inginerie genetica. Ca prima etapa, este anul 1944 cand Avery si Mc Leod, experimented pe Diplococcus pneumoniae au stabilit rolul ADN-ului in ereditate, cand, prin transformarea moleculei, a modificat virulenta la microorganisme. Este etapa conturarii noului compartiment de cercetare: biologia si genetica moleculara". A urmat anul 1953 cand, Waxon i Crick (laureatii premiului Nobel) au stabilit structura tridimensionala a ADN-ului, iar Chargaff complementaritatea bazelor azotate. Aceste studii au permis descifrarea i implicarea ADN-ului in ereditatea si variabilitatea organismelor vii. O etapa deosebita in studiul biologiei i geneticii moleculare incepe in anul 1970. este anul marcat cu o descoperire de importanta bio-medicala esentiala: ingineria genetica sau tehnologia ADN-ului recomnbinant". In prezent, datorita microaparaturii i metodelor de cercetare realizate pentru cartografierea genomului, ingineria genetica i clonarea genomica, impune cunoaterea structurii ADN-ului (vezi capitolul 2 - Structura ADN-ului celular). Descifrarea structurii ADN-ului a fost posibila folosind metode sj tehnici moderne de studiu si cercetare.

306

Ca principii, metodele folosite pentru analiza structurii ADN-ului sunt urmatoarele: a) - Absorbtia in ultraviolete (U.V.) metoda absorbtiei ADN-ului in UV a fost elaborate de Casperson in 1936. Principiul metodei se bazeaza pe proprietatea moleculei de ADN de a absorbi specific, lumina UV in lungimea de unda de 260 nm23. Aceasta metoda, calitativa, nu ajuta la stabilirea structurii totale a moleculei de ADN. Ca metoda calitativa, UV ajuta sa identificam prezenta acestor molecule in celuUL b) - Spectrul de difractie a razelor X Este o tehnica cristalografica, bazata pe capacitatea moleculei de ADN de a cristaliza in saruri de litiu si sodiu. Datele se aduna pe clisee spectrale de difractie a razelor X si analizate prin ecuatiile transformarii Fourier. Metoda descrie structura ADN-ului pana la nivelul a 10 milionimi de milimetru. c) - Ultracentrifugarea in gradient de densitate Metoda a fost elaborata de Meselson si Stahl in 1958 pentru a demonstra ca ADN-ul dublu catenar (respectand principiul complementaritatii bazelor azotate de cupiare a celor doua catene polinucleotidice) se replica semiconservativ. Metoda se bazeaza pe urmatorul principiu: ADN-ul extras din celula si purificat, se introduce intr-o solutie de CsCl (clorura de cesiu), apoi se supune centrifugarii la 140.000 g24, timp de 24 ore. Pentru identificarea catenelor si, respectiv, a moleculelor de ADN, nucleotidele se vor marca cu N14 sau N15, analiza facandu-se pe generatii celulare in functie de atomul marcat folosit. d) - Denaturarea - renaturarea prin variatii termice

23

24

" 'A = 10"' m = 0,1 nm (nanometri) G = acceleratia gravitationala = 9,81 m/'sec2

307

Principiul metodei este urmatorul: se incalzeste ADN-ul in solutie apoasa. In aceste conditii termice cele doua catene complementare ale moleculei se separa prin ruperea puntilor de hidrogen, iar vascozitatea scade. Cand solutia se raceste lent, catenele complementare se recupleaza, se realizeaza renaturarea moleculei. In aceste conditii denaturarea este reversibila. Daca solutia este racita brusc, catenele nu se mai recupleaza, catenele raman separate. Denaturarea se considera ireversibila. Metoda se foloseste in hibridarile moleculare ADN-ADN sau ADN-ARN. Denaturarea moleculei de ADN se face timp de 10 minute la temperatura de 100 C in solutie apoasa. Prin denaturare creste absorbtia in UV a bazelor azotate libere. Parametrii care asigura gradul si viteza de renaturare a ADN-ului denaturat sunt: concentratia initiala (Co) si timpul (t) de refacere a moleculei ADN. Cot este produsul dintre concentratia molara a ADN si timpul de reactie pentru reasociere care se exprima in secunde: Cot - cot = valoarea de comparare a vitezei de reasociere a secventelor monocatenare de ADN. In raport cu valoarea Cot rezultatul si interpretarea sunt urmatoarele: cu cat valoarea Cot este mai mica, cu atat valoarea de asociere a catenelor complementare este mare si invers. Viteza de repetabilitate este determinata de complementaritatea secventelor polinucleotidice: secvente complementar repetabile sau secvente nerepetabile.Secventele repetitive se reasociaza intr-un timp rapid, in timp ce secventele nerepetitive reasociaza lent, intr-un timp mai indelungat. e) - Studiul ADN-ului la microscopul electronic cu transmisie Incepand din 1960, gratie metodei puse la punct de Cairus, se examineaza molecula de ADN prin vizualizare la microscopul electronic. Primele observatii au fost facute pe ADN-ul bacteriofagilor dupa prealabiia distrugere si eliminare a capsidei proteice.

308

. Metode de analiza a genelor. Cartografierea enomului uman

Identificarea, locusul si analiza unei gene din cromozomul genomic, ; dau posibiliatea de a elucida comportamentul si amplificarea unei gene : poate fi clonata, clarifica mecanismele translatiei infonnatiei genetice, :scifreaza reglarea genetica a sintezei de proteine. Studiul genelor din genomul celular da posibilitatea de a urmari pe ape ontogenetice, activitatea lor. Respectand principiul cronogenetic si onobiologic, identificam prezenta genelor in genom, momentul inceperii stoparii activitatii lor, efectele deviante a unei gene mutante asupra nului. Prin metoda hibridizarii moleculei de ADN evidentiem daca gena utanta este mostenita de la ascendenti, daca este un produs mutagen de vo" (neomutatie), sau identificam formarea unei clone celulare capabila initieze un proces genetic tumorigen etc. De asemenea, sunt metode care, prin identificarea si structura genei, ;usul exact al genei pe cromozom, pot fi folosite in mecanismele de *inerie genetica, in terapia bolilor pe fond genetic (determinate de gene itante), in modificarea virulentei bacteriilor, in industria de medicamente

1. Hibridizarea ADN-ului genomic

Una din metodele recomandate pentru complexul de activitati si :ntificare a genelor este hibridizarea ADN-ului din genomul celular. Pentru aceasta analiza se folosesc sondele genetice care recunosc lele normale sau anormale, cu respectarea complementaritatii ileotidelor din structura genei investigate si nucleotidele ordonate in ida genetica, sau prin identificarea diversilor markeri genetici. Principiul metodei este urmatorul: separam termic catenele nplementare din molecula ADN. Dupa separare se identified pozitia, lensiunea si componenta nucleotidica a genei folosindu-se sonde 309

monocatenare de ADN, care au structura cunoscuta. Sondele sunt marcate cu izotopi radioactivi, sau sonde fluorescente. Conform principiului complementaritatii bazelor, sonda (sau sondele) se va / se vor cupla complementar pe secventa monocatenara omoloaga" a ADN-ului analizat, refacand structura bicatenara a ADN. Deci, hibridizarea, prin folosirea sondelor genetice, este realizata daca: ADN-ul separat termic monocatenar are structura omoloaga cu sonda folosita. De exemplu: sa presupunem secventa polinucleotidica pe monocatena ADN: ........A T T T C G G C ATTGATTGG.......................
|<------------------------------>|

daca sonda artificial sintetizata si marcata cu 32p are componenta i ordonarea in nucleotide de tipul: .... AAGCCGTAACTA.................... Conform principiului complementaritatii, sonda se va cupla pe secventa monocatenei din ADN genomic, separata termic, astfel: ADN............ATT TC G G C A T T G A T T G G ..................... IIII III III III III IIIIII III II Sonda................. A AG C C G T A AC A.................... Se folosesc diverse metode de hibridizare moleculara. a) Metoda Southern - Blot Principiul metodei: se foloseste o sonda specifica, marcata cu 32p, care, complementar, se va cupla cu o secventa omoloaga din genomul celular, respectiv cu o gena, care a fost separata sub actiunea enzimelor de restrictie. Este metoda de transfer Southern - Blot. Etapele metodei Southern - Blot sunt urmatoarele: - extragenea ADN-ului genomic din limfocite, fibroblasti, celule amnidice, vilozitati coriale, etc.; - eliberarea ADN-ului extras (fragmentare) cu ajutorul unei enzime de restrictie corespunzatoare. La nivelul siturilor de restrictie se pot obtine, prin fragmentare, secvente cu o dimensiune pana m 20 Kb; -denaturarea fragmentelor de restrictie pentru separarea monocatenelor; 310

- trecerea fragmentelor monocatenare pe geluri de agaroza, sau prin ipilarizare, unde vor fi imobilizate; - prepararea sondelor si marcarea lor radioactiva; - se hibridizeaza fragmentul monocatenar cu sonda preparata ntetic. Cuplarea respecta principiul complementaritatii bazelor azotate; - complexul format - molecula hibrida dublucatenara din fragmentul DN monocatenar restrictionat si sonda complementary se supun spalarii; - evidentierea complexului hibrid dublu catenar cu ajutorul unui mnal care este un indicativ pentru identificarea dimensiunii si pozitiei igmentului hibridizat. Avantajul metodei Southern - Blot este urmatorul: - identificarea unei gene normale in genomul celular, pentru ibilirea tipului constitutional al individului analizat; - identificarea genelor cu mutatii punctiforme din genom, prin icrodelatii sau prin insertii genice. Metoda permite identificarea organismului, daca este heterozigot ntru o gena mutanta, stabilim tipul de gena, si diagnosticul prenatal, jasemenea ajuta sa stabilim care dintre genitorii unui copil are in genomul Dpriu gena mutanta transmisa descendentului. Este o metoda cu aplicabilitate in consultul si sfatul genetic familial, criminalistica. In medicina legala, in antropologie, in stabilirea tipului netic si incompatibilitafile genetice intre indivizi. Metoda Northern - Blot Principiu: se foloseste molecula de ARNm extras din celula >anismului investigat. ARNm va complementariza cu o sonda mocatenara de ADN marcat cu ~ p (ADNc denaturat), care la randul sau complementariza cu oligonucleotidele ADN-ului antisens. Metoda FISH sau hibridizarea in situ a ADN Analiza se face direct pe genomul celular, cand cromozomii se sesc in prometafaza ciclului mitatic. Pentru identificarea si pozitia genei folosesc sonde marcate cu substante fluorescente (FISH), sau cu izotopi tioactivi de tipul 32p. Metoda permite identificarea si localizarea genei pe cromozom, sau ntificarea microdeletiilor. 311

Metodele de hibridizare a ADN-ului genomic au importanta si aplicabilitate in biologie si medicina. Cu ajutorul lor putem obtine urmatoarele date cu valoare interpretativa: - identificam numarul secventelor repetate in genom, numarul de copii polinucleotidice; - stabilim gradul de rudenie intre indivizi, identitatea genetica a indivizilor conspecifici, precum si filiatia genetica; - identificarea ADN-ului viral, evidentierea secventelor specifice de ADN si ARN din celule si tesuturi; - stabilirea diagnosticului genetic prenatal si postnatal pentru bolile pe fond genetic; - ajuta, ca principiu genetic, in practica grefelor si transplantelor, la stabilirea compatibilitatii sau incompatibilitatii genetice; - permite identificarea markerilor genetici specifici, celulari sau tisulari.

3.2. Cartografierea genelor prin secventierea ADN-ului genomic

Inca din 1909 atenfia geneticienilor s-a concentrat asupra identificarii si localizarii genelor in genomul organismelor, asupra cartografierii genomului uman. Cartografierea genomului uman este de importanta deosebita, deoarece permite: - stabilirea si cunoasterea tipului constitutional genetic al fiecarui individ din familie sau populatie; - diagnosticul bolilor genetice; - analiza incarcaturii genetice a populatiei prin imigrarea indivizilor si asimilarea unor gene ce le erau particulare in genafondul populatiei autohtone; - consultul genetic, sfatul genetic si aprecierea riscului de transmitere si aparitia unor boli pe fond genetic. Pe parcursul cercetarilor efectuate s-au folosit si se folosesc variate metode pentru localizarea genelor pe cromozomi, pentru cartografierea genomica. 312

3.2.1. Cartografierea genetica

Metodele clasice de a realiza cartografierea genelor sunt legate de analiza linkage-ul genetic si recombinarea intra- si intercromozomica in timpul diviziunii reductionale - meioza. a) Linkage-ul genie Daca raportam numarul cromozomilor din genomul celulei umane, a numarului perechilor de nucleotide din genom, si dimensiunea unei gene informational activa, la diversitatea si multitudinea trasaturilor fenotipice de nivel molecular, celular, tisular, de organ, organism in ansamblu, se desprinde urmatoarea observatie si concluzie: numarul genelor codante din structura ADN-ului cromozomial este considerabil de mare. Datorita raportului valoric stabilit intre numarul genelor si numarul cromozomilor din genom, se considera ca fiecare cromozom are in componenta sa un numar foarte mare de gene, care ocupa locusuri proprii. Cum in meioza, setul de gene din fiecare cromozom se repartizeaza in gametii haploizi impreuna cu cromozomul gazda", confirmand ca genele cu locusuri pe un cromozom nu sunt izolate, nu sunt independente. Ele se gasesc intanite si se transmit grupate. Este linkage-ul genie". Morgan este primul cercetator care a demonstrat linkage-ul genelor. Genele care se gasesc inlantuite si ocupa un segment cromatidic din cromozom formeaza un haplotip. In mod natural haplotipul genelor inlantuite se transmite grupat. Ca exemple de haplotipuri genomice mentionam: sistemul HLA pe bratul scurt al cromozomului 6, sistemul Rh si Duffy pe bratul lung al cromozomului 1, s.a. Pentru evidentierea si valoarea genetica vom analiza sistemele genetice eritrocitare Rh si Duffy (a se vedea sistemele genetice) (fig. 71). Analiza si interpretarea de transmitere si segregare a caracterelor determinate de genele din haplotip, incepe de la cuplul parental (P) care sunt dublu homozigoti si anume, un genitor dublu homozigot dominant Rh+ Df+/Rh+ Df+, al doilea dublu homozigot recesiv Rh- Df-/Rh- Df-.

313

Fl

Rh+y \7 Rh+ Dff OO Dfr

F2

Homozigo t dominant , 25%

Heterozigoti 50% 75%Rh+Df+

Homozigot recesiv 25%

V. ,_.,.,___*M_ _, _ ,____________'

25% Rh- DfB.aport de segregare 3:1

Fig. 71 Linkageul genie intre genele pentru Rh si Duffy pe bratul q al cromozomului 1. 314

Rh+ miRhDf-

Legenda:

y if

Modul de transmitere si regregarea genetica cu exprimarea fenotipica a celor doua caractere diferite confirma linkage-ul genie i anume: Cuplul parental elaboreaza gameti haploizi care: la genitorul dublu homozigot dominant, fiecare garnet va contine numai cromozom cu Rh+ Df+, iar celalalt genitor, homozigot recesiv, va elabora numai gameti Rh-Df- (vezi figura). Prin fecundatia celor doua tipri de gameti vor rezulta descendenti, care, genetic, 100% vor fi heterozigoti Rh+ Df+/Rh- Df-, iar fenotipic toti vor fi Rh+ Df+ (caractere codioficate de gene dominante). In cazul cand descebndentii heterozigoti Rh+ Df+/Rh- Df- se vor cupola pentru reproducere, fiecare va elabora doua tipuri de gameti ce se vor diferentia prin cromozomul care contine Rh+ Df+ si Rh- Df-. Prin fecundarea acestor gameti puri" din punct de vedere genie, vor rezulta descendenti, care, probalistic, vor poseda urmatoarele genotipuri si fenotipuri exprimate: 25% dublu homozigoti dominanti (Rh+ Df+/Rh+ Df+), 50%o dublu heterozigoti (Rh+ Df+/Rh- Df-) si 25% dublu homozigoti recesivi (Rh- Df-/ Rh- Df-); fenotipul posibil exprimat va fi de 75% Rh+ Df+ si 25% Rh- Df-. Acest raport probalistic este determinat de gena dominanta care este functional codanta atat in cuplu homozigot cat si in starea heterozigota, iar Rh- Df- este functional numai in cuplu alelic homozigot.. Daca raportam valorile ce se pot obtine, stabilim raportul de segregare fenotipica de 3:1. Deci in F2 este un raport de segregare 3:1 care aminteste de raportul de segregare monofactonal (monohibridare). Dar in modelul prezentat sunt doua caractere distincte. Cum raportul de segregare va fi de 3:1, inseamna ca respectivele gene Rh+) prezentate de o suita de trei gene, C D E dominante, sau c d e recesive, dar caracterul de Rh+ este dat de gena dominanta D) si gena Df (dominanta Df+ sau recesiva Df-) se confirma ca respectivele gene au locusuri pe acolo si cromozom (cromozom 1) sunt linkate si se transmit grupat.

315

b) - Analiza crossing-over-ului Observatiile facute pana in prezent plecand de la observatiile clasice, au evidentiat ca disjunctia independents a caracterelor nu este intotdeauna conforms cu legile mendeliene de segregare. Primele observatii apartin lui Morgan care a observat la Drosophila melanogaster necorcondanta intre genotipul genitorilor si fenotipul descendentilor, in sensul abaterii de la raportul de segregare mendeliana. Aceste abated, ca accidente" genetice, au fost denumite crossing-over". Crossing-over-ul, dupa Morgan, s-ar produce intr-un numar mic de celule genetice in timpul profazei primare a primei diviziuni meiotice reductionale. Crossing-over-ul s-a demonstrat a fi un mecanism de recombinare intre cromozomii omologi (intracromozomica) si care modifica valoric raportul probalistic de segregare fenotipica a caracterelor mendeliene. Ca definitie, crossing-over-ul este schimbul reciproc de segmente cromatidice intre cromozomii omologi in timpul meiozei. Se apreciaza ca frecventa de realizare a crossing-over-ului este direct proportionala a distantei locusului unei gene in raport cu centromerul cromozomului. Unitatea de masura a crossing-over-ului este centrimorfanul (1 cM = 1000 kb; 1 Kb = 1000 perechi de nucleotide). Frecventa de producere a crossing-over-ului este raportul dintre descendentii recombinati si numarul total de descendenti. Frecventa de recombinare serveste drept criteriu, la a aprecia distanta intre gene, cu locusuri pe acelasi cromozom, permite sa stabilim harta cromozomica pentru identificarea genelor cu locusuri pe cupluri de cromozomi omnologi. c) - Metoda sondelor si a amprentelor genetice Pentru identificarea genotipului si cartografierea cromozomi lor, diagnostic si explorarea produselor genice se folosesc sondele si amprentele genetice. Sonda are rolul de a recunoaste gena pentru care este complementary, recunoasterea fiind bazata pe hibridizarea moleculara. Gena sonda" are rolul de a recunoaste markerul genetic de interes. O sonda ADN sau ARN trebuie sa contina o secventa de eel putin 20 nucleotide. Sondele pot fi directe sau indirecte. Sondele directe au omologie cu gena din ADN-ul genomului celular supus studiului. Se folosesc frecvent urmatoarele sonde directe: 316

- ADNc - sunt sondele obtinute prin clonare, sau copii de ADNc sintetizate de ARNm; - Sonde de ADN genomic. Aceste sonde pot identifica secventa exonica sau intronul din structura genei studiate. Ambele tipuri de gene sunt incluse intr-un vector recombinant; - ribosondele, sunt secvente de ARN monocatenar, obtinute cu ARN-polimeraza. -oligosondele de sinteza. Sunt secvente scurte de nucleotide de ADN monocatenar. Sondele indirecte. Sunt fragmente de ADN din ADN-ul genomului celular. Ele sunt folosite pentru explorarea unei gene necunoscuta sau care nu este inca clonata. Sondele indirecte nu vor contine secvente dispersate de ADN inalt repetitiv, dar pot contine unele secvente ce corespund ADN-ului moderat repetitiv. Sondele indirecte evidentiaza RFLP-ul (polimorfismul lungimii fragmentului de restrictie) considerat marker genetic. Pentru analiza ADN-ului genomic se foloseste, frecvent, metoda Southern. Este metoda care permite vizualizarea unei secvente unice. Etapele de lucru ale metodei Southern sunt urmatoarele (vezi capitolul VII, punctul 3.1, a si b): - fragmentarea ADN-ului genomic prin electroforeza in gel de agaroza; - denaturarea secventelor polinucleotidice ale ADN-ului in situ"; - trecerea secventelor denaturate prin capilarizare pe un suport solid (filtru de nitroglicerina sau nylon); - denaturarea prin hibridizare in prezenta unei sonde monocatenare marcata cu izotopi radioactivi; - identiflcarea duplexuri lor formate prin complementaritate intre sondele marcate si secvente din ADN. Metoda sondelor ajuta sa identificam deletiile complete homozigote, sau hemizigote daca semnalul radioactiv lipseste. Deasemenea putem identifica deletiile partiale greu identificabile. Pentru siguranta si explorare corecta se pot folosi mai multe tipuri de enzime de restrictie pentru a stabili daca modiflcarea identificata de o anume enzima de restrictie este sau nu rezultatul unei mutatii punctiforme prin care s-ar putea creea un situs suplimentar. Inconvenientele metodei sunt: - necesita un timp foarte lung de executie si foarte complicata ca manevre de lucru (in special capilarizarea secventelor denaturate); - metoda nu poate fi automatizata. 317

c) - Dozajul genie la subiectii cu aberatii cromozomiale Metodele morganiene", respectiv analiza linkageului genie si crossing-over intracromozomal, sunt metode limitate, care se bazeaza pe observarea simultana a diverselor caractere, si urmarite, ca distribute, in succesiunea generatiilor intrafamiliale sau in populatie. Ca o imbunatatire a modalitatilor de cartografiere genica a fost ipoteza lansata de Harris (1965). El elaboreaza ipoteza efectului cantitativ" al genelor in genomul organismului. Ipoteza Harris raspunde la doua concepte: - ca genele controleaza metabolismele prin codificarea determinata in sinteza proteinelor, a enzimelor; - ca fiecare alela structural^ codifica, cantitativ, produsul proteic celular, produsul cantitativ al enzimei. Conform ipotezei lui Harris, se considers ca doua gene alelomorfe, care codifica aceasi enzima (proteina) asigura o activitate de 100%, in conditiile fiziologice. Dar s-a constatat ca in anomaliile cromozomiale de numar (trizomii sau monozomii), in anomaliile cromozomiale de structura (trizomiile partiale realizate prin translocatii cromatidice, sau monozomiile parti ale, consecinta a deletiilor cromatidice) apar modificari corespunzatoare in cantitatea de proteina specific sintetizata sau in activitatea enzimelor. Aceste efecte sunt explicate prin existenta unui supradosaj genie in genom, in cazul trizomiilor complete sau partiale sau sub dozaj genie in cazul monozomiilor complete sau partiale. De exemplu, verificand ipoteza lui Harris, cercetarile lui Sinet, Bethare, Junien (1978) au semnalat ca in trizomie activitatea unei enzime va fi de 150%, iar in monozomie se va reduce la 50%, confirmand ipoteza. In functie la care pereche de cromozomi s-a produs respectiva mutatie se poate stabili locusul respectivelor gene. Daca incercarile de cartografiere genica a cromozomi lor prin analiza linkge-ului genie si crossing-over-ul erau un ,joc de estetica stiintifica", de mica importanta pentru perioada 1911, ulterior s-au intensificat cercetarile pentru realizarea cartografierii genomului la organismele vii. De exemplu, cercetarile lui Lederberg si Tatum (1946), Cavalli-Sforza (1950), Lederberg (1952), Hayes (1953) s.a, folosind procesul de conjugare bacteriana au cartografiat genomul procariotului Escherichia coli. La om, primele incercari apartin lui Barski si col. (1960), apoi au urmat cercetarile lui Eplirussi si Weiss (1965), Harris si Watkins (1965), Weiss si Green (1967), Migeori (1968) s.a. 318

Cartografierea genomului uman, pentru timpul respectiv, a intampinat dificultati legate de: - numar relativ mare de cromozomi omologi (la om 23 perechi); - complexitatea aparatului genetic, exprimat prin numarul foarte mare de gene; - un ciclu reproductiv tardiv si limitat (la distanta de aproximativ 20 ani intre generatii); - existenta sistemelor poligenice cu activitate convergenta pentru acelasi caracter (caracterele poligenice), a caror gene au locusuri pe cromozomi neomologi; - obstacolul etic de a nu se experimenta la om in vivo"; - uneori, incertitudinea filiatiei genetice legale"; - lipsa tehnologiei performante, a metodelor de finete care ar fi permis patrunderea in infracosmosul structural si functional al genomului uman. La Inceputul anului 1980 a fost lansata ideea Proiectul Genomului Uman" de catre D. Botstein si R. Davis. Ideea, lansata ca metoda de studiu, a fost cartografierea genomului uman prin folosirea amprentelor electrofonetice de fragmente de restrictie a ADN-ului, cu lungimi polimorfice. Elaborarea Proiectului Genomului Uman" a fost posibila datorita urmatoarelor cercetari cheie" anticipate si anume: - secventierea genomului virusului Q174, a fagului H si a virususlui SV40 intre anii 1977-1982; - programele de cercetare care au dezvoltat hartile fizice a clonelor inserate cu informatia genetica specifics genoamelor la Saccharamyces cerevisiae, care au demonstrat fezabilitatea idei asamblarii fragmentelor cu secventa mica in genomuri complexe si complete. Hartile fizice au permis izolarea genelor bazata numai pe pozitia acestora pe cromozom; - dezvoltarea noilor tehnici performante si metoda de secventiere a fragmentelor de ADN complementar (ADNc), cum este random shatgun sequencing", au permis folosirea ESTs (Expressed sequenci taglin"), tehnica de secventiere automata. Proiectul Genomului Uman" a avut finalitate in 1999, cand s-au descifrat cu succes, secventele polinucleotidice din ADN-ul genomului uman, cu o acuratete de 99,99%. Secvente fara Gap-uri informationale. In aceeasi pcrioada s-a realizat construirea" de cromozomi bacterieni artificiali (Bacterian artificial chromosome - Bac), care au asigurat dezvoltarea unui sistem de clonare prin insertia in genom a fragmentelor de 319

ADN de lungime mare, care prezentau mai multa stabilitate decar cele inserate in cosmide.

3.2.2. Polimorfismul de restrictie

Polimorfisml de restrictie (RPLP = polimorfismul lungimii fragmentelor de restrictie), consemnat in cartografierea cromozomului si analiza tipului constitutional genetic la om, reprezinta marked genotipici codominanti. RFLP sunt variatii individuale ale secventelor de ADN ce pot fi identificate prin modificarea hartii de restrictie, folosindu-se metoda Southern. RFLP este determinat de cuplul sonda-enzima de restrictie ce corespunde unui locus din ADN-ul cromozomial. Fiecare fragment de restrictie, ca tip variabil in genom, se transmite mendelian, reprezentand (ca valoare genetica) un marker genetic. Pentru organismele cu reproducere sexuata, fiecare tip de fragment de restrictie se prezinta in cuplu alelic pe cromozomii omologi. Daca este homozigot, cuplul alelic de restrictie prezinta identitate dominanta, la individul heterozigot raportul cuplului alelic de restrictie este codominant. In consecinta, fiecare sistem alelic de restrictie este particular specific" unui locus polimorf. RFLP-urile pot fi intragenice sau extragenice. Genomul uman prezinia o paleta larga de variatii dimensionale individuale a situsurilor de restrictie, dar care, in majoritate, sunt neutre. Variabilitatea RFLP-urilor este determinate de diferenta de 1 la 200 nucleotide (1/200). Aceasta diferenta punctiforma determina o paleta foarte mare de locusuri polimorfe. Explorarea polimorfismului secvential a situsurilor de restrictie se realizeaza in urmatoarele etape: - hibridarea prin ribosonda care corespunde unei gene sau fragment din gena si care corespunde si evidentiaza RFLP exonic sau intronic. Ribosonda este asociata, pentru detectare, cu o enzima de restrictie. Cand sondele sunt lungi, enzimele de restrictie le fragmenteaza, ceea ce amplified numarul locusurilor explorate de sonde; - hibridarea cu o sonda ADN urmata de detectarea mis-watch-en" prin denaturarea in gel. - amplificarea secventierii unui segment cuprins intre doua amorse.
320

RFLP-urile bialelice corespund polimorfismului prin mutatii punctiforme dand un singur situs de restrictie. In aceste cazuri cuplul sonda/enzima induce doua variante ca alternative: Este sistemul +/- ce poate fi analizat pe autoradiograma prin metoda Southern. RFLP-urile bialelice pot fi exprimate valoric prin legea Hardy-Weinberg, cand o alela este notata cu p, omoloaga cu q. Conform legii HardyWeinberg, putem calcula PIC-ul (polymorphism information content) al unui RFLP autozomal, conform relatiei: PIC = 1 - (p2 + 2 p2 q2 + q2) respectiv PIC = 1 - (p2 + q2). Cu ajutorul relatiei PIC se poate aprecia polimorfismul de restrictie la nivelul unei populatii, polimorfismul frecventei alelice in populatie. Prin relatia PIC putem calcula frecventa teoretica a unui cuplu alelic, care poate fi homozigot sau heterozigot, iar valorile obtinute pot fi comparate cu valorile determinarilor practice a RFLP-urilor. In acest mod se stabileste daca genotipurile din genofondul unei populatii se gasesc in echilibru sau nu. In cazul cand se folosesc variate tipuri de enzime de restrictie, aceeasi sonda poate identifica mai multe RFLp-uri diferite. Acest aspect confirma ca un cuplu sonda-enzima defmeste un sistem alelic diferit. Cand pe acelasi cromozom se asociaza doua sau mai multe variante non-alelice avem un haplotip. RFLP-urile multialelice reprezinta un polimorfism de repetitie sau de rearanjare liniara a genelor componente ale unui cuplu de cromozomi omologi.

4. Notiuni de inginerie genetica i clonare

Incepand cu anul 1944 s-a conturat un nou departament de cercetari genetice: genetica moleculara (Avery). Genetica moleculara a revolutionat medicina moleculara prin folosirea unor metode de diagnostic, de sinteza, examinare, analiza si manipularea materialului genetic. Clonarea si ingineria genetica insumeaza procedee efectuate in vitro", cu gene, cromozomi, sau celule, in scopul obtinerii de noi structuri genetice, sau organisme nou reprogramate genetic. Ca istoric, ingineria genetica incepe inca din 1969 cand Beckwith si col, au izolat, pentru prima data, complexul genelor ce formeaza operonul 321

lac" la Escherichia coli. Folosind mecanismul transductiei bacteriene, bacteriofagul care se multiplied in bacterie ca celula gazda, produce liza genomului bacterian. Urmarea lizei, ADN-ul genomic se fragmenteaza. Gena lac" acrosandu-se de molecula ADN a bacteriofagului, iar acesta folosind alta bacterie ca gazda, insertioneaza gena in noul genom inducand un nou caracter (sinteza lactozei). Metodele ingineriei genetice elaborate se bazeaza pe molecula ADN vector" sau caraus", care transports si introduce gena sau cromozomul dorit, in genomul primitor, sau viitoarea gazda. Tehnicile pot fi: - inginerie genetica celulara, cand sunt fuzionati protoplastii celulei; -inginerie genetica moleculara, bazata pe tehnologiile ADN-ului recombinat. Prin tehnologia ADN-ului recombinat in vitro" se obtin molecule de ADN recombinate care pot fi folosite in clonarea genelor. Tehnologiile de inginerie genetica se bazeaza pe constuctia" de vectori de clonare, pe izolarea genelor folosire in clonare, gene denumite initial, ADN pasager sau ADN heterolog. - Tehnica ADN - recombinant foloseste un complex de enzime cum sunt: endonucleazele de restrictie, ADN-ligozele, polimeraze, exonucleaze, reverstranscriptaze, fosfotaze alcaline, etc. Frecvent, cu rol de vector se folosete genomul viral. Sunt insa si metode non-virale pentru transferul genelor din genomul celular sau al individului, ca donatori spre genomul primitor sau viitoarea gazda. Ca metode non-virale, folosite pentru insertionarea directa a genei in genomul celulelor tinta, mentionam: - socul electric, bombardarea cu particule ADN, lipozomii, transfexie cu laser, electroporatia, microinjectia cu ADN, .a. In raport cu posibilitatilor de studiu a exprimarii fragmentelor de ADN-pasager insertionate, vectorii se clasifica in (Covic si col., 2001): - vectori de clonare, care nu contin secvente de tip promotor. Sunt vectorii care insertioneaza un singur ADN-pasager la un situs unic de restrictie al vectorului ( nu ofera posibilitatea de a se analiza exprimarea mesajului genetic in genomul primitor pe care il aduce ADN-ul pasager); - vectori de clonare si exprimare. Au in structura lor secvente de tip promotor. Prezenta promotorului in genomul vectorului permit clonare si analiza exprimarii fragmentului de ADN pasager clonat; - vectori de clonare prin inlocuire - ADN-ul clonat inlocuieste (substituie) un fragment din molecula ADN-ului vectorial, dupa prealabila digestie enzimatica cu endonucleaza de restrictie. 322

In raport de structura si mod de actiune, vectorii pot fi: - vectori plasmidiali - prezenti in citoplasma bacteriilor. Sunt alcatuiti dintr-o molecula mica de ADN, cu replicare independents fata de cromozomul bacteriei; - vectori virali - au originea si structura de genom viral; - vectori hibrizi. Sunt bacteriofagi mici a caror structura hibrida este compusa din genomul filamentos de bacteriofag si de plasmid; - vectori cosmide cu structura hibrida: bacteriofag si plasmid. Vectorii pot fi clasificati si dupa modul de actiune asupra gazdei. Ei sunt: - vectori cronogenici. Au actiune de vectori numai la tulpinile din acelasi gen taxonomic. Nu actioneaza divergent, n-au actiune distributive. Sunt unitaxonomici. - vectori naveta (shuffle). Sunt vectorii care au replicare stabila. Sunt folosifi ca vectori de fragmente ADN-pasager pentru tulpini bacteriene de genuri (taxonomii) diferite. Ingineria genetica cu implicatii in clonarea genomurilor heterogene, are la baza tehnici ale ADN recombinant, cand se pot realiza amplicari selective a unei gene sau detectia specifica a unei gene.

323

Tabel X Vectori folositi pentru ADN-ul recombinant

Tipul de vector Retrovirusuri Avantaje - Integrarea in genomul celulei gazda. - Toate genele virale pot fi inlaturate. - Recombinant relativ singur. Adenovirusuri - Titru important. - Traductia eficienta in celulele in repaus in vitro" si in vivo" Virusuri adenoasociate (AAV) - Toate genele virale pot fi inlaturate. - Recombinant singur. - Expresia este stabiia - Transductia la nivelul celulei in repaus Lipozomi - Inofensivi, nu formeaza agenti infectiosi. - Imunogenitate neglkijabila - Fragmentele ADN pot avea dimensiuni mari Cosmide - Folosesc bacteria drept gazda. Permit insertia. - Transfer genie nuclear ineficient - Integrarea nepersistenta in nucleu - Lipsa specificitatii de tesut Dezavantaje - Integrare semialeatorie. - Necesita diviziuni celulare pentru amplificarea ADNrecombinant. - Titru relativ scazut. - Toxicitate - Imunogenitate semnificativa - Frecvente preexpuneri. - Numai pentru fragmente mici de ADN. - Obtinerea este dificila. - Genom incomplet elucidat.

- Cupleaza fragmente de ADN genomic. Cromozomi artificiali BACs i YACs Incorporeaza fragmente foarte lungi de ADN sunt plasmide cu centromere si talomere

impale
- ajuta la cartografierea cromozomilor si elaborarea hartii genetice la om. - putem cunoaste si elucida mecanismele de reglare in expresivitatea genei, prin procedeul de inductie sau represia operonului; - serveste la identificarea markerilor genetici cu aplicabilitate in medicina legala, criminalistica, antropologie, etc.; - ajuta la identificarea si izolarea unei clone genetice; - sa identificam mutatiile punctiforme; - este tehnica amplificarii genelor in vitro" (PCR), daca se foloseste ADN-ul ca matrita.

4.1. ADN-ul recombinant Principiu

Recombinarea naturala a ADN-ului genomic are loc in meioza (elaborarea gametilor) si fecundatie,. Acest mod de recombinare are un rol important in evolutia speciilor, in diversificarea genotipurilor intre indivizii conspecifici, cu expresivitati fenotipice variabile. Este recombinarea (naturala) care asigura incadrarea indivizilor conspecifici in limitele normale de toleranta ale speciei. Opus recombinarii naturale, este recombinarea artificiala sau tehnologia ADN-ului recombinant realizata in vitro (in conditii de laborator), cand se foloseste o tehnologie complexa, cunoscuta sub denumirea de inginerie genetica. Recombinarea artificiala a ADN-ului (Genetic Enginering), progres al biotehnologiei moderne, se bazeaza pe introducerea unei cantitati de informatie genetica suplimentara in genomul unui organism (bacterie, vegetal, animal).

325

Ca tehnologie, recombinarea ADN-ului in vitro" se realizeaza in urmatoarele etape: - sectionarea ADN-ului in fragmente specifice. Fragmentele obtinute sub actiunea enzimelor de restrictie prezinta capete adezive; - sectionarea ADN-ului din genomul vectorului, care va cupla vectorul specific de la donator". Fiecare fragment din ADN-ul vectorului prezinta capete adezive; - cuplarea fragmentului specific cu un fragment ADN al vectorului la nivelul capetelor adezive. Cuplarea este catalizata de enzime ADN-ligaze; - dupa cuplarea celor doua fragmente, segmentul rezultat (ADN vector + ADN fragment specific) se introduce in celula gazda (primitor); - odata introdus fragmentul in celula gazda, se urmareste in dinamica, comportarea fiecarui segment: segmentul specific provenit de la donator si segmentul ADN al vectorului; - daca fragmentul de ADN recombinant este acceptat de celula gazda (primitor), vor incepe procesele de transcriere si translate a mesajului inscris in segmentul specific provenit de la donator, finalizand sinteze proteice cu structura si functii specifice asa cum se prezentau in celula donator. Dupa insertionarea fragmentului ADN donor, celulele primitor incep a se multiplica, dupa prealabila replicare a ADN-ului genomic. In replicarea genomului celulei primitor este implicat i segmentul specific de ADN provenit de la celula donator, iar celulele rezultate din diviziunile realizate, vor confine si segmentul de ADN recombinant. Aceste procese sunt rezultatul ingineriei genetice, iar mecanismele sunt denumite clonarea ADN". Deci, prin cuplarea a doua fragmente ADN, ce provin de la specii sau organisme diferite, se obtine un ADN heterogen ca origine informationala. Este molecula de ADN recombinant. Cuplarea fragmentelor de ADNc heterogenetic se realizeaza prin intermediul capetelor complementare coezive. Prin cuplarea fragmentelor ADN, prin intermediul ligazelor, se obtine ADN-ul recombinant, sau ADN-ul hibrid. In ingineria genetica sunt doi factori genetici esentiali: genomul primitorului (este eel care accepta insertionarea genei vehiculate de vector spre celula tinta (viitoarea gazda) si gena de interes, obtinuta artificial sau izolata din genomul altei celule normale, care va fi introdusa in celula primitor. Ca celule tinta (primitor) folosite in ingineria genetica sau clonare pot fi: 326

- celulele somatice in scopul cercetarii limitate a unor disfunctii genetice ale individului, direct analizat; - celulele gametice (germinale) pentru a se preveni prin inginerie genetica transmiterea defectului la descendenti. Analiza genotipului, metodele folosite in cartografiere, inginerie genetica si clonare, servesc pentru explorarea gradului de exprimare fenotipica a produselor determinate de genele informational-active, servesc la corectarea unor defecte genice, servesc explorarilor genice cu valoare diagnostic^. Ca importanta bio-medicala a acestor explorari consemnam urmatoarele: - ajuta sa. stabilim etapele ontogenetice in activitatea genelor -respectiv aspecte cronogenetice in activitatea genomului uman; - permit o analiza a influentelor etapizate ontogenetic, induse de factorii de mediu asupra genotipului. Este o analiza cronobiologica a interferentelor dintre genotip-fenotip-factori de mediu; - serveste la identificarea cromozomului sexual X lyonizat interfazic la nivelul celulelor unui tesut sau organ; - ajuta la stabilirea manifestarilor fenotipice a caracterelor genetice caracterizate prin penetranta si expresivitate variabila (completa sau partiala); - permit sa determinam daca un sindrom pe fond genetic este cauzat de insertionarea in genomul uman al unui genom strain (de exemplu retrovirusii, virusul HIV).

4.2. Analiza functieie genei artificiale

Pentru a stabili functia unei gene artificiale (ADNc) in vitro", sunt folosite diverse sisteme de analiza. Dintre aceste sisteme mentionam: - cotransformarea; - cotransfectia; - microinjectia. a) Cotransformarea. Este procesul de analiza directa a unui ADNexogen in culturile celulare la eucariote. Acest procedeu are un randament slab, deoarece s-a observat ca intr-o populatie celulara in cultura de 103-106 celule, numai 1-2 pot manifesta competenta de incorporare a genei exogene, si sa devina stabila si functionala.
327

Acest procedeu, cu incercari reusite, este legat de gena timidinkinaza (TK).S-a lucrat cu fibroblasti de soarece TK- (celule L, lipsite de gena pentru timidinkinaza). Fibroblastele TK- au fost transformate in fibroblaste TK+ prin intermediul virusului Herpes simplex (HSV1), virus care detinea in genomul sau gena TK (de origine exogena si acrosata de la o alta celula TK+). La om incercari reusite s~au obtinut cu gena p (beta) a globulinei, prin introducerea in zona stabila a genei p globulinei umane in celulele teratocarcinoame de soarece. b) Cotransfectia. Principiul procedeului este cuplarea fizica a unei gene din genomul eucariotic, la genomul ADN al unui virus. Introducerea genei prin cotransfectie, de catre virusul care a acrosat gena, in genomul unei celule eucariote pe care a folosit-o ca gazda. Insertionarea este realizata in culturile celulare. Inconvenientul procedeului este ca insertionarea genei in celula eucariota se poate realiza numai in vitro". Prin acest procedeu s-a reusit insertionarea genelor pentru P globulina, provenite de la iepure si soarece in celulele renale de maimuta, dezvoltate in cultura. Genele au fost vehiculate de virusul SV40c) Microinjectia. Este metoda de studiu a promotorilor specifici pentru ARN-polimeraza II si III. Ca procedeu tehnic este introducerea unei gene (direct) in ovocitele de xenopus (ariciul de mare).

4.3. Metoda PCR (polymerase chain reaction)

Metoda PCR este procedeul de clonare acelulara a ADN-ului. Metoda asigura amplificarea directs, rapida si selectiva a unei secvente ADN sau ARN dintr-un amestec complex, atunci cand sunt cunoscute secventele capetelor fragmentului de ADN. Metoda foarte sensibila. Amplificarea PCR este o reactie in lant a unei secvente ADN, datorita existentei unor oligonucleotide amorsa care initieaza sinteza secventei ADN. Metoda PCR (polymerase chain reaction) a fot elaborate in 1985 de catre Kary Mullis (Premiul Nobel pentru chimie in 1993). Metoda a fost perfectata prin folosirea ADN-polimerazei termostabile, care a simplificat toata procedura de executie si elaborarea unei aparaturi care sa asigure cicluri simple de temperatura (ciclizator termal). Datorita acestor noi descoperiri si aparatura ciclizatorului termal, 328

toda PCR este intensiv folosita in cercetare, dar si in laboratoarele de letica clinica pentru geno-diagnostic. Ca aplicatii, metoda PCR permite: - diagnosticul clinic in: P-talasemie, fibroza chistica, a-1-itripsina, distrofia miotonica, Coreea Huntington, fenilcetonurie, emie, polipoza adenomatoasa familiala, s.a.; - determinarea sexului: primerii flancheaza regiunea tinta a /entelor specifice ale cromozomului sexual Y; - detectarea patogenilor; - determinarea unor noi secvente de ADN; - determinarea mutatiilor si neomutatiilor; - izolarea si constituirea unor noi clone de ADN etc. Principiul metodei este urmatorul: se foloseste ca matrita o secventa :ifica de ADN monocatenar, cu ajutorul careia se sintetizeaza in vitro" lant complementar ADNc in prezenta ADN polimerazei si a unui onucleotid primar (amorsa) in componenta caruia exista 15-20 eotide. Oligonucleotide primer are capatul 3'-OH liber de care se vor oligonucleotide^ ADN si vor forma noul lant. Alungirea amorsei se in sensul 5'-3'. Metoda de amplificare PCR este o reactie in lant a unei secvente de ^, prin denaturari termice si polimerizarea secventei de ADN in enta oligonucleotidelor amorsa. Procedeul este denumit clonare jlara. Prin acest procedeu secventa poate fi amplificata de aproximativ 1 ird de ori. Daca se foloseste enzima reverstranscriptaza, se poate amplifica Jm. Primerii oligonucleotidici sunt denumiti si amplimeri. Extensia primerilor urmeaza urmatoarele etape: i prima etapa este denaturarea ADN-ului ce va fi folosit ca matrita cu ml unei ADN-polimeraze si prezenta de dNTP; I a doua etapa urmeaza o suita de denaturari ale ADN-ului dublu lar matrita. Aceste denaturari sunt realizate astfel: - denaturarea termica a ADN-ului dublu catenar; - calirea" primerilor prin racirea secventelor ADN denaturate; - extensia primerilor cu ADN-polimeraza la temperatura optima de ie a enzimei.

329

Fiecare repetare a sintezei catenelor, reprezinta un ciclu de amplificare. Fiecare sinteza a lantului nou de ADN, devine, la randul ei, matrita pentru un alt ciclu de amplificare. Prin acest mecanism explicam de ce secventa de ADN tinta amplificata se poate amplifica selectiv, ciclu dupa ciclu, pana la 1 miliard de ori. Numarul final de cicluri de amplificari succesive ale regiunii tinta poate fi exprimat prin formula: (2n - 2n)x, in care: - n = numarul de cicluri; - 2n = primul produs obtinut dupa primul ciclu si produsii secundari, cu lungimea nedeterminata obtinut dupa ciclul2; - x = numarul de copii ale matritei initiale. Calculele apreciaza ca dupa o suita de 20 cicluri PCR, se ajunge la o rata de aplificare exponentiala a genei tinta, ADN primer, de 220 daca eficienta este de 100% pentru fiecare ciclu. Datorita excesului de tinta moleculara numarul ciclurilor repetabile este modificat ca eficienta dupa 25-30 cicluri. Modificarea eficientei este cauzata de posibilitatea cresterii enzimei ADN-polimerazei termostabila, care, in conditii optime se limiteaza la o rata de amplificari de 106, datorita excesului de tinta moleculara.

4.4. Metode fizice Tn clonare i ingineria genetica

Tehnica ADN-ului recombinant, cu variate procedee de lucru (grefa de nuclei heterostadiali sau heterospecifici, transferul cromozomilor la specii diferite, hibridizarea celulara) sau metoda PCR dau posibilitatea inducerii de noi functii celulare in genomul gazda, de a stabili diagnosticul clinic genetic a unor maladii, de identificare a unor mutatii, neomutatii sau a unor secvente noi de ADN in genomul celulei umane. Dar geneticienii, biochimistii si biofizicienii au diversificat si perfectat metodele de cercetare genetica, folosite in ingineria si clonarea genetica, elaborand metode fizice de lucru. Ca metode fizice de clonare mentionam: - Microinjectia cu ADN. Se injecteaza gena interesata, sau secventa de oligonucleotide, direct in genomul din nucleul celulei primitor. Metoda se aplica in vitro" pe celule sau linii celulare, dar si pentru a genera animale transgenice. Datorita considerentelor etice, metoda nu este acceptata si aplicata la om.

330

- Electroporatia (electrotransfectia) Principiul metodei este urmatorul: se formeaza pori hidrofili in membrana celulei tinta, sub actiunea unui camp electric. Prin acesti pori va penetra ADN provenit de la donator, in celula tinta (primitor). Metoda este eficienta cand se aplica unei populatii celulare care are un indice ridicat de proliferare celulara. c) - Bombardamentul cu particule ADN Este un transfer genie balistic. Bombardamentul consta din particule din aur acoperite cu ADN precipitat. Este forma de a transfera si a introduce gena in celula tinta. Metoda a fost elaborata de Yang si col., in 1990. Este aplicabila celulelor monocite, limfocite si in culturile de fibroblasti. Rezultate foarte bune au fost obtinute de Yang (1992) sj Cheng si col. (1993) la soared, sobolani, hamsteri, Rhesus. d) - Transfectia cu laser Celulele mamiferelor pot f\ transfectate cu gene de la donator folosindu-se un femtosecond pulse laser. Pentru reusita transfectiei genice arhitectura celulei nu trebuie sa se modifice. Reusita clonarii este de 100%.

331

CUPRINS

PREFATA.........................................................................................................7 CAPITOLUL 1.................................................................................................9 OBIECTUL DE STUDIU AL GENETICII UMANE..................................9 CAPITOLUL II..............................................................................................12 EREDITATEA LA OM.................................................................................12 l.SUPORTUL MOLECULAR AL EREDITATII............................................14 2. STRUCTURA MOLECULEI DE ACID DEZOXIRIBONUCLEIC (ADN)17 2.1. Unitatea de structura a moleculei de ADN......................................18 2.2. Structura primara a ADN.................................................................21 2.3. Structura secundara a ADN.............................................................25 2.4. Structura tertiara a ADN..................................................................28 3. FORMELE IZOMORFE DE ADN..........................................................................31 (FORME GEOMETRICE " DEADN).....................................................................31 4. ADN-UL NUCLEAR........................................................................................34 4.1. Denaturarea si valoarea Cot de renaturare a ADN-ului celular....38 5. HETEROGENITATEA ADN-ULUI DIN GENOMUL UMAN SI FUNCTIILE LUI ..........................................................................................41 5.1 Familii de ADN repetitiv...................................................................41 5.2. Tipuri de ADN inalt repetitiv............................................................44 5.3. Elemente genetic transpozabile........................................................52 Transpozonii............................................................................................52 5.4. Palindromul......................................................................................56 6. GENOMUL MITOCONDRIAL SAU EREDITATEA CITOPLASMATICA 57 6.1............................................................................................................C aracteristicile sifunctiile ereditatii citoplasmatice.................................59 6.2............................................................................................................Er editatea citoplasmatica sau matroclina..................................................60 6.3............................................................................................................M utatii in genomul mitocondrial si efecte induse......................................61 7.REPLICAREA ADN-ULUI......................................................................63 7.1. Principiul si mecanismul replicarii.................................................65
332

7.2. Metode de studiu....................................................................................66 7.3. Enzime si proteine implicate in replicarea ADN.....................................72

7.4.Mecanismul molecular de replicare a ADN-uhd......................................75 7.4.1.Etapele sintezei moleculei ADN......................................................75 7.4.2.Replicarea ADN si modelul aditiei primerilor.................................78 7.5.Etape in sinteza catenelor ,, de novo'' in replicarea ADN.........................79 7.6.Erori de replicare a ADN si repararea erorilor in genomul uman...........86 7.6.1 .Mecanisme de reparare a erorilor in structura ADN........................87 :APITOLUL HI...........................................................................................................92
VNATOMIA GENOMULUI UMAN......................................................................................92

:ROMOZOMII............................................................................................................92

1. ETAPE IN ANALIZA GENOMULUI UMAN....................................................................93 2. NUMARULCROMOZOMILORLAOM..............................................................................94 3. DLMENSIUNEA GENOMULUI UMAN ...........................................................................98 4. MORFOLOGIA CROMOZOMILOR.............................................................................. 101 5. ORGANIZATORII NUCLEOLARI................................................................................ 110 6. TELOMERELE...................................................................................................113 6.1. Replicarea si repararea telomerelor.....................................................116 6.2. Efectele secundare determinate de nerepararea telomerelor.................117 6.3. Rohd telomerelor..................................................................................118
7. STRUCTURA MOLECULARA A CROMOZOMILOR LA EUCARIOTE....................................119 7.1. Proteinele cromozomale.......................................................................120 7.1.1 Proteinele histonice........................................................................121 7.1.2. Proteinele non-histonice................................................................124

8. CONFIGURATIA ANATOMICA" A CROMOZOMILOR..................... 127

8.1. Arhitectiira supramolecidara sau anatomia " cromozomilor umani.. 128 8.1.1 -Nucleozomul- structura primara a cromozomului........................129 8.1.2 -Solenoidul- structura secundara a cromozomului.........................132 8.1.3 Bucla cromozomala ca structura tertiara........................................134 8.1.4 Structura cuaternara a cromozomilor.............................................136

9. STARILE FIZICE ALE CROMOZOMILOR............................................ 138 HETEROCROMATINA SI EUCROMATINA.............................................. 138

9.1. Heterocromatina (He)...........................................................................138 9.1.1 Heterocromatina constitutiva.........................................................140 333

9.1.2 Heterocromatina facultativa...........................................................141 9.1.2.1 Inactivarea cromozomului X..................................................142 9.1.2.1.1 Numarul cromozomii or X inactivati....................................146 9.1.2.2 Cromozomul Y in interfata celulara.......................................147 9.2. Regiuni dublu ,,minut" (DM) si regiuni marcate omogen......................147 9.2.1 Regiuni dublu minut" (DM).........................................................148 9.2.2 Regiuni marcate omogen (RMO)...................................................148 9.3. Eucromatina cromozomala...................................................................149

10. CROMOZOMII CELULARIB"............................................................................150 11. BENZILE CROMOZOMALE....................................................................................152

11.1. Factori implicati in formarea benzilor................................................152 11.2.Tipuri de benzi in cromozomii eucariotelor..........................................154 11.2.1.Benzile Q....................................................................................156 11.2.2.Benzile G....................................................................................157 11.2.3.Benzile C....................................................................................157 11.2.4.Benzile R (reverse).....................................................................158 11.2.5.Benzile'T (telomerice)................................................................159 11.2.6.Benzile NOR (organizatori nucleolari)........................................159 12. CROMOZOMII SI FAZELECICLULUI CELULAR..........................................................159 12.1. Cromozomii in interfaza ciclului celular..............................................160 12.1.1. Stadiul Gl...................................................................................161 12.1.2. StadiulS......................................................................................162 12.1.3. Stadiul G2..................................................................................163 12.2. Cromozomii mitotici............................................................................163 12.2.1.Profaza.......................................................................................165 12.2.2.Metafaza.....................................................................................165 12.2.3.Anafaza.......................................................................................165 12.2.3. Telofaza......................................................................................166

13. CARIOTIPUL UMAN NORMAL..........................................................166

13.1. Recomandarea analizei cariotipului la om..........................................168

14. REPLICAREACROMOZOMILORUMANI...........................................169 14.1. Experimentul Taylor...........................................................................169 14.2. Cromozomii se replica asincron.........................................................173

14.2.1. Asincronia inter-si intracromozomala........................................173

15. POLIMORFISMUL CROMOZOMILOR UMANI 175 16. MECANISMELE SI FACTORII IMPLICATI IN EVOLUTIA GENOMULUI UMAN . 176
334

16.1. Comparatie intre genomul uman si al pongidelor...............................176 16.2. Factori etiologici implicati in evolutia genomului uman.....................177 16.3. Mecanisme in evolutia cromozomilor.................................................178 16.4. Efectele remanierilor asupra structurii cromozomilor........................179 16.5. Ipoteze asupra mecanismelor evolutiei cromozomilor la om...............180 16.6. Relatii intre structura si remanierea cromozomilor.............................182 17. ARHITECTURA SI EVOLUTIA CROMOZOMILOR SEXUALI (GONOZOMII)........................................................................................... 182
17.1. Arhitectura cromozomului Y...............................................................183 17.2.Evolutia cromozomilor sexuali la om...................................................185 17.2.1. Supresia prin crossing- over.......................................................186 CAPITOLUL IV................................................................................................190 CONCEPTUL DE GENA.................................................................................190

l.STRUTURAGENELORLA EUCARIOTE................................................ 192

1.1.Structura genei din genomul eucariotelor..............................................193 1.1.1. Structura discontinua a genei sau gena in mozaic"......................193 1.1.2. Mecanisme in evolutia genelor cu structura discontinua...............197

2. CARACTERISTICILE GENEI IN RAPORT CU CROMOZOMII DIN GENOM...................................................................................................... 198

2. l.Locusul siformele alternative ale genei prezente pe cromozomi.............199 2.1.1. Polialelismul.................................................................................199 2.1.2. Liniaritatea genelor in cromozom..................................................203 2.1.2. Linkage genie sau inlantuirea genelor in cromozomi....................203 2.1.3. Crossing-over-ul...........................................................................207 2.1.4. Tipuri de gene in genomul eucariotelor........................................209

3.INSUSIRILESI FUNCTIILE GENELOR..................................................212 3.1. Variatii in expresia genelor..................................................................212 3.2. Functia heterocatalitica a genelor........................................................214 3.3. Activitatea genelor in raport cu perioadele ontogenetice......................215
CAPITOLUL V..................................................................................................218 SINTEZA $1 REGLAREA GENETICA A SINTEZEl PROTEINELOR... 218 1. ACIZII RIBONUCLEIC! (ARN)......................................................................220 /. /. ARN-ul mesager (ARNJ.........................................................................221 1.2. ARN-ul ribozomal (ARNr).....................................................................221 335

1.3. ARN-ul de transport (ARNJ...........................................................222 1.4. ARN-ul interference (i-ARN).........................................................223 2. PARTICIPAREA MOLECULELOR ARN LA SINTEZA PROTEINELOR 224 2.1. Fluxul informatiei genetice............................................................225 3. CODUL GENETIC..................................................................................229 3.1. Proprietatile codului genetic.........................................................230 4. CODAREA SI DECODAREA ARN-ULUI (SINTEZA PROTEINELOR)233 5. TRANSCRIPTONUL SI TRANSCRIEREA INFORMATIEI GENETICE IN STRUCTURA ARNM................................................................................234 6. TRANSCRIEREA TRANSCRIPTONULUI..............................................235 6.1. Etapele formarii ARNm..................................................................237 6.1.1. Initierea transcripjiei, elongafia i stoparea............................237 6.1.2.- Accesarea genomului si procesarea ARN - premesager.......239 6.1.2.1. Procesarea pre-ARNm.....................................................240 7. TRANSLATE SAU TRANSCRIEREA MESAJULUI GENETIC DIN ARNMM.....................................................................................................242 7.1. Sinteza deproteine..........................................................................242 7.1.1. La procariote............................................................................244 7.1.2. La eucariote..............................................................................246 8JR.OLUL PROTEINELOR NOU SINTETIZATE IN VIATA CELULEI......251 CAPITOLULVI............................................................................................252 RELATIILE INTERGENICE SI MEDIUL DE VIATA AL OMULUI252 1 .RELATIILE INTERGENICE...................................................................253 1.1. Relatii intre cupluri alelice.......................................................253 1.1.1. Relatiile de dominanta - recesivitate.......................................254 1.1.1.1 .Dificultatile si exceptiile de la legile dominantei si recesivitatii .......................................................................................................255 1.1.2.Gene(alele)cuefectletal............................................................258 1.1.3.Gene (alele) semiletale.Gena Rhesus la om............................258 1.2. Relatii (raporturi) intre genele nealelice.......................................259 1.2.1. Epistazia................................................................................260 2. RELATII GENA - CARACTER - MEDIU.........................................................263 2.1. Pleiotropia......................................................................................263 2.2. Raporturi de monohibridare si de dihibridare...............................266 2.2.1. Legile lui Mendel....................................................................267 336

2.2.2. Tipuri de trasnmitere mendeliana a caracterelor monofactoriale la

272 2.2.3. Transmiterea autozomal dominanta..............................................272 2.2.4. - Transmiterea autozomal recesiva...............................................276 2.2.5 - Transmiterea autozomal codominanta.........................................277 2.2.6.- Ereditatea legata de cromozomii sexuali......................................278 2.3. Ereditateapoligenica - multifactoriala. Ereditatea "cantitativa"...........283 2.3.1. Relatii genotip - mediu sau caractere poligenice multifactoriale.. 284 om

3. NOTIUNI DE CRONOGENETICA SI CRONOBIOLOGIE ASUPRA CARACTERELOR MULTIFACTORIALE.................................................................................287

3. 1 Cronogenetica si cronobiologia in activitatea genomului uman...........287 3.2 Stabilitatea genei sau ergon...................................................................289 3.3 Metode de analiza a caracterelor poligenice multifactoriale.................295 3.4 Heritabilitatea caracterelor multifactoriale...........................................301 3.5 Calcularea variatiei caracterelor poligenice..........................................301 CAPITOLUL VII...............................................................................................303 CARTOGRAFIEREA, INGINERIA GENETICA 1.....................................303 CLONAREA GENOMULUI UMAN...............................................................303 PRINCIPII.........................................................................................................303 1.TIPUL CONSTITUTIONAL GENETIC...........................................................................304 2. METODE DE ANALIZA A STRUCTURII ADN................................................................306 PRINCIPII..............................................................................................................306 3. METODE DE ANALIZA A GENELOR. CARTOGRAFIEREA GENOMULUI UMAN 309 3.1. Hibridizarea ADN-ului genomic...........................................................309 3.2. Cartografierea genelor prin secventierea ADN-ului genomic...............312 3.2.1. Cartografierea genetica.................................................................313 3.2.2. Polimorfismul de restrictie...........................................................320

4. NOTIUNI DE INGINERIE GENETICA 1 CLONARE.............................321

4.1. ADN-ul recombinant............................................................................325 Principiu.....................................................................................................325 4.2. Analiza functieie genei artificiale.........................................................327 4.3. Metoda PCR (polymerase chain reaction)............................................328 4.4. Metode fizice in clonare si ingineria genetica.......................................330

337

Bibliografle Selectiva
Adams R.P.L s.a (1986) - The Biochemistry of the Nucleic Acid, 1 Oth Edition, Chapmann and Hall, London, New York Alberts B, et all (1989) - Molecular Biology of the cell. Anderson S.G.E. (1998) - Genomic Sequence. Nature, 397, 176-180. Angelier N, et all (1996) - Does the Chaperone Heat Shock Protein hsp 70. Play a Role in the Control Development Process Int. J. Dev. Biol.40;521-529 Athanasiou A (1995) - Chronopsihologia - Med. Modern, vol U no 10. Athanasiou A(1998) - Tratat de psihologie medicala. Ed. Oscar Print, Bucuresti. Attardi G. et all.(1979) - The organisation of the genes in the human mitochondrial Genom and their mode of identification Acad. Press, New York, pg 443-469 Avery O.T. McLeod CM., Mc Carty, M.(1994) - studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumocaccal types. Baas F et all (1985) - The human thyroglobin gene a polymorphic marker localised distal to C - MYC on chromosome 8 band q 24. Hum. Genet. 69, 138-143. Batimore D.(1976) - Viruses Polymerases and Cancer Science, 192,632-636. Batimore D.(1985) - Retrovirus and Retrotranscription. The Role of Reverse Transcription in Shaping the Eukariotic Genome Cell, 40, 481-482.

338

 Benner S.E., Wahl G.M., Von-Hoff D.D. (1991) - Double minute chromosomes and homogeneously Staining regions in tumors taken directly from patients versus human tumor cell lines. Auth - Cancer. Drugs, 2, 11-25. Bernardi G.(1995) - Human Genome Organisation Curr. Opin. Genet. Develop. 5,315-322. Bertino J.R. et all (1982) - Gene amplification in a methotrexate -resistant human leukemia line K - 562. In Gene Amplification (Ed. R.T. Schimke). Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Bird A (1999) - DNA methylation de nova. Science, 286, 2287 -2288. Blasco M.A, Gasser S.M., Linger J (1999)- Telomeres and telomerase. Genes & Dev., 13,18;2353 - 2359. Boivin R. et all (1948) - L'acide desoxyribonucleique du noyan cellulaire, depositaire des caracteres hereditaires; arguments d'ordre analytique. C.R.A.C. Sc. 226, 1061-1063. Bouffer S.D. et all (2001) - Telomeric sequences, radiation sensitivity and genomic instability Int. J. Radiat. Bref. 77, 995 - 1005. Brewer G., Sing Ch.F. - Genetics . Britten R.J., Kohne D.E. (1968) - Repeated sequences in DNA. Science, 161,529-540. Britten R.M., Davidson E.H. (1968) - Redundanta informationala -Science, CLXV, 349. Burchner J. (1996) - Supervising the Fold; Functional Principles of Molecular Chaperones. The FASEB J; 10, 10-19. Burkholder G. (1988) - The analysis of Chromosome Organisation by Experimental Manipulation. Chromosome Structure and Function -Edited by J.P.Gustawson and R.Appels Plenum Press, New York. Carathers A. (1997) - DNA Damage, Mutation and Repair -Encyclopedia of Cancer - Acad. Press New York, 484 - 500. Cavazzana - Calva M. et all (2000) - Gene therapy of human severe combined immunodeficiencys, Science, 288, 669 - 672.

339

 Cech T.A. (1986) - RNA as an Enzyme - Sci. Amer. 255,(5), 64-75. Chamberlin M(1982)- Bacterial DNA - dependent RNA -Polymerase. Acad. Press the Enzymes. 15, 61- 108. Chargaff E, Davidson J (1955) - The Nucleic Acid Academic Press. Chargazz E.(1950) - Chemical Specificity of Nucleic Acids and Mechanism of their Enzymatic degradation. Experientia; 6, 201-209. Charlerbois R.L. (1976) - The Modern Science of Bacterial Genomics. ASM New, 62,(5), 255- 259. Cohen S.N. (1976) - Transposable Genetic. Elements and Plasmid Evolution. Nature, 263, 731 - 738. Cohen S.N., Shapiro J.A. (1980) - Transposable Genetic Cod for Proteine. Nature, 192, 1227 - 1232. Conrat E, Williams R.C. (1955) - Reconstruction of active tabaco mosaic virus from its protein and nucleic acid components. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Vol. 31 no.10. Counter CM. et all.(1992) - Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. EMBO Journal, 11, 5:1921 - 1929. Craciun T, Luana - Leonaro Jensen (2004) - Genetica si viitorul omenirii. Ed. Albatros, Buc. Crivell L.A. (1983) - Mitochondrial DNA. Sci. Amer. 248, (2), 7889. Darnell J.E. Jr. (1985) - RNA Sci Amer, 253,(4), 68-78. Dave - U.P. et all (2004) - Gene therapy insertional mutagenesis insights. Science. 303, 333. Dubinin N.P. (1966) - Genetica moleculara si actunea radiatiilor asupra ereditatii. Ed. Stiintifica, Buc. Davidson E.H. et all (1973) - General interspresion of repetitive with nonrepetitive sequence elements in the DNA of Xenopus. Jour. Moi. Biol. 77, 1-23.

340

 Deka N, et all (1986) - Repetitiv human DNA sequences, Properties of transposon - like human element Cold Spring Harbor Syanp. Quant. Biol. 51,471-477. Demongeot J., Besson J. (1996). The Genetic Code and Cyclic Codes - C.R. Acad. Sci. Paris, 319, 443- 451. Dennis W. Ross (2002) - Introduction to Molecular Medicine - Ed. Spinger, pg. 37; 42-45. Dib. C, et all (1996) - A comprehensive genetic map of the human genome based on 5.264 microsatellites. Nature, 380, 152-154. Dickerson R.E. (1983) - The DNA Helix and how it is read. Sci. Amer. 249, (6), 92-111. Dickerson R.E., et all (1982) - The Anatomy of A-,B-, and Z-DNA. Science, 216, 475 - 485. Doolittle W.F., Sapienza C(1980) - Selfish genes the phenotype paradigm and genome evolution. Nature, 284, 601-603. Earnshaw W.C.(1988) - Mitotic chromosome structure. Bio Essays. 9, 147- 150. Einstein A. (1968) - Jl. Significato della relativita. Torino. Fedoroff N.V. (1984) - Transposable Genetic Elements in Maise -Scientific American (June). Filatov L. et all (1998) - Chromosomal instability is correlated with telomere erosion and inactivation of G2 checkpoint function in human fibroblasts expressing human papillomavirus type 16E6 oncoprotein -Oncogene, 16.14, 1825- 1838. Filipski J. et all (1990) - Periodicity of DNA Folding in Hinger Order Chromatin Structure EMBOJ. 9,1319-1327. Franklin R.E., Gosling R.(1953) - Molecular configuration of sodium thymonucleate - Nature, 740 - 741. Friedberg E.C., Wagner R, Rodman H(2002) - Specialised DNA polymerases, cellular survival and the genesis of mutations Science, 296, 1627-1630. Galton F.(1889)- Natural inheritance. Mc Millan, London.
7/1.1

 Gedda L., Brenci G.(1971) - Chronology of the gene. Ann. Genet. Med. Ge, XX, 323. Gedda L., Brenci G.(1972) - II tempo biologica e la sua eredita. Scienzo & Tecnica, pg 169, Milano. Gedda L., Brenci G.(1980) - Cronogenetica l'eredita del tempo biologico - Edition Scientifiche e Tehnichs: Ed, Mondaroni S.P.A. Milano Gellert M (1981) - DNA Topoisomerases. Ann. Rev. Biochem. 50,879-910. Georgopoulus C (1993) - Role of the Major Shock Proteins as Molecular Chaperones. Ann. Rev. Cell. Biol; 9; 601-634. Gerbr S.A. (1986) - The Evolution of Eukaryotic Ribosomal DNA. Biosystems 19,247-258. Goldman M.A. (2004) - RNAi for research and therapy Genome Biology, 5, 342-. Goodman M, Tashian R.E. (1976) - Molecular Antropology, New York. Goodman M.F. et all (1993) - Biochemical Basis of DNA Replication Fidelity. Critical Rev. Biochem, Molec. Biol. 28(2), 83 - 126. Gray M.W.(1989) - Origin and Evolution of Mitochondrial DNA. Ann. Rev. Cell, Biol; 5,25-50. Green D.M. (1990) - Muller's rachet and the evolution of supernumerary chromosomes. Genome, 33, 818-824. Green M.M. (1969) - Mapping a Drosophila melanogaster "controlling element" by interallelic crossing-over. Genetics, 61, 423 - 428. Griffith F (1928) - The signifiance of pneumococcal types. Jour Hygiene. 27,113-159. Grossman L.I., Shoubridge E.A.(1996) - Mitochondrial Genetics and Human Diseases. Bio. Essays, 18(12),983-911, ICSU Press. Gudas L.J., Pardee A.B. (1978) - Model for the Regulation of E. Coli DNA Repair Functions. Proc Nat. Acad. Scu USA; 72, 2330 - 2334.

342

 Gupta S.L. et all(l 971) - Movement of the Ribosome along the Messenger Ribonucleic Acid during Protein Synthesis. Biochemistry, 10, 4410-4421. Hacein - Bey - Alinas et all (2003) - A serious adverse event after successful gene therapy for x-linked severe combined immunodeficiency. New Engl. J. Med. 348, 255 - 256. Hames B, Higgings S(1985) - Nucleic Acid Hybridization a Practical Approach I.R.L Press, Oxford. Hardman N. (1986) - Structure and Function of Repetitive DNA in Eucariotes - Biochem J. 234, 1-11. Hardy G.H. (1908) - Mendelian propositions in a mixed population. Science, 28, 49 - 50. Hedges R.W., Jacob A.E. (1974) - Trans position of ampicillin resistance from RP4 to other replicons. Molec. Gen. Genet 132, 31-40. Hershey A.D., Chase M (1952)- Independent functions of vival protein and nucleica acid in growth of bacteriophage - Jour. Gen. Physiol.36, 39-56 Herskowitz I.H. (1973) - Principles of Genetics. MC. Millan, New York. Heslop - Harrison J.S. et all (1988) - Chromatin and centromeric structures interphase nuclei. Kew Chromosome Conference III (Ed. P.E. Brandham), HMSO, London, 19, 209 - 217. Hopfield J.J. (1978) - PNAS, 75, 4334 Hoppfield J.J. (1977)- La recherche, 83, 989 Hull R, Covery S.N. (1996) - Retroelements, Propagation and Adaptation. Vims Genes 11 (2/3), 105 - 118. Hung - Shih J.(2004). Beyond Genome - Conference, San Francisco USA. Hung Shib J (2004) - Beyond Genome - Conference, San Francisco, USA.

343

 I.H.G.S.C. (International Human Genome Sequencing Consortium 2001) - Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860-921. Israil Anca Michaela (2000) - Biologie moleculara. Prezent si perspectiva. Isvoranu M, Cilievici Olga (1973) - Biologie Medicala - Litografia UMF Isvoranu M. (1993) - Genetica Umana - Ed. Didactiva si Pedagogica, Buc. Isvoranu M. ,Albu D.F1. (1998) - Genetica Umana - vol. I. Ed Info Medica - Buc Isvoranu M.(l 984) - Litografia UMF Isvoranu M.(1988) - Elemente de Biologie si Genetica Umana. Ed. Medicala, Buc. Jacob F (1970)- La logique du vivant Ed. Gillimord Jacob F, Brenner S, Cuzon F. (1963) - On the Regulation of DNA Replication in Bacteria Cold. Spring. Harb. Quant. Biol, 28;329. Jacob F, Monad J. (1961) - Genetic Regulatory Mechanism in the Synthesis of Proteins J.Mol.Biol. 1961,(3),318-356. Jarvik L.F. (1978) - Chronogenetics. Springfield III. II tempo e la vita, Torino. Jelinek W.R., Schmid C.W. (1982) - Repetitive sequences in eukariotic DNA and their expression Ann. Rev. Biochem. 51,813-844. Jones K, Myrray K. (1975) - A Procedure for Detection of Heterologons DNA Sequence in Lamdoid Phase in Situ Hybridation, J.Molec, Biol. 51,393-401. Jones R.N., Rees H (1982) - B- Chromosomes. Acad. Press New York. Jones S. (1993) - the Language of the Genes. Ed. Harper. Collins, Flamingo, London. Keats U. (1981) - Ed de Clark M.S. si Wall W.L. in Chromosomes. The complex code Ed. Chapman & Hall, pg. 189.
344

 Kornberg A (1960) - Biologic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid. Science;131,1503-1508. Kornberg A (1962) - Enzymatic Synthesis of DNA. New York, John Wiley and Sous. Inc. Kornberg A (1968) - The Synthesis of DNA. Scientific American of prints - W.H. Freeman and Co. Kornberg R.D. (1974) - Chromatin Structure; A Repeating Unit of Histones and DNA. Science; 184,868-871. Kornberg R.D., Klug A(1981) - The Nucleosome - Sci. Amer;9,122124. Laemmli U.K. et all (1977) - Metaphase-chromosome structure the role of nonhistone proteins Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. XLII , 351 -360. Lean S (1992) - Instinct, Enviroment, and Behaviour S.E.G. Cambrige, University Press. Lecomte de Noily P. (1969) - II tempo e la vita - Torino. Legeune J, Turpin R, Gautier M. (1959) - Le mongolisme premier exemple d'abberation autosomiene humaine. Aun. Genetique. Paris; 1, 41-49. Leib - Mosch Chr, Seifarth W (1996) - Evolution and Biological Significance of Human Retroelements. Virus Genes. 11(2/3), 133-145. Li W.H., Gu Z, Wand H, Nekrutenco A (2001) - Evolutionary Analyses on the Human Genome. Nature; 409, 847 - 849. Lindall T (1982) - DNA Repair Enzymes, Ann. Rev. Biochem. 51, 61-87. Lints F. (1981) - Genetique - Office Inter - national de Libraire 30, avemus Marnix 1050 Bruxelles. Lints F.A. (1978) Genetics and Ageing. Karger, Bassel. Lyon M. F. (1962) - Sex chromatin and gene action in the mammalion X - chromosome. Amer. J. Hum. Genet; 14, 135. Maitra V. et all (1982) - Initiation Factors in Protein Synthesis. Aun. Rev. Biochem; 51,869-900. 345

 Marmur J. et all (1963) - Denaturation and renaturation of DNA. Progr. Nucl Ac. Res.; 1,232-300. Marshall E (1999) - Genetherapy death prompts review of adenovirus vector - Science, 286, 2244-2245. Mathe G. (1979) - Cancer: des reponses a vos questions. Le Figaro, 23 febr., no2. Mc Clintock B. (1950) - The origin and behavior of mutable loci in maize. P.N.A.S. 36, 344 - 355. Mendel G. (1866) - Versuchen aber Pflanzen hybriden. Verh, naturf. Ver. Brunn; 4,3-44. Meselson M., Weigle J.J. (1961) - Chromosome breakage accompanying genetic recombination in bacteriophage. P.N.A.S.; 47, 857868. Messing J. et all (1981) - A system for Shotgun DNA sequencing -Nucleic Acid Res.; 9,309-321. Michael A, Goldman G.(2004) - RNAi for research and therapy. Genome Biology;5,342. Miles J.S., Wolf C.R. (1989) - Principles of DNA Cloving. Br. Med. J.;299, 1019-1022. Mirsky A.E., Ris H (1949) - Variable and constant components of chromosomes. Nature.; 163, 666 - 667. Noller H.P. (1984). Structure of Ribosomal RNA. Ann. Rev. Biochem; 153,119-162. Nomura M. et all (1984) - Regulation of the Synthesis of Ribosomal components - Science;53,75-117. Old R.W., Primrose S.B. (1980) - Priciples of Gene manipulation. An introduction to genetic engineering. Blacweil Scientific Publications, Oxford. Orgel L.E., Crick F.H.C. (1980) - Selfish DNA: the ultimate parasite. Nature; 284, 604-607. Osava S, Jukes Th. H. (1988) - Evolution of the Genetic Code as Affected by Anticodon Content. Trends in Genetics; 47,191-198. 346

 Otelea D. si col. (1995) - Aplicatii ale biologiei moleculare in taxonomie si epidemiologie. Bacteriol. Virusol. Parazitol. Epidemiologie;3-4, 171- 180. Pardridge W. (2004) - Beyond Genome Conference San Francisco. Pardue M.J., Gall, J.G. (1971) - Chromosome structure studied by nucleic acid hybridisation in cytological preparations. Chromosomes today;3,47-52. Pauling L.H.A et all (1949) - Sickle cell anemia: A molecular disease. Science, 110, 543- 548. Petrov D.A. (2001) - Evolution of Genome Size : New Approaces to an Old Problem. Trend Genet.; 17, 23-28. Polback J.R., Iver V.R. (2002) - Characterizing the phycal genome. Nat. Genet.; 32(suppl), 515-521. Protchard R.H. et all (1969) - Control of DNA Synthesis in Bacteria Microb. Growth. Symp. Soc. Microbial. Cambrige Univ. Press; 19,263-270. Pruss D, Hayes J.J., Wolffe A.P. (1995) - Nucleo - somal Anathomy where are the Histones ? Bioessays; 17, 161- 170. Rabson A.B., Babson A.S. (1983) - Recombinant DNA. Technology and Laborator Medicine. Arch. Pathol. Lab. Med.; 107, 505-509. Radman N (1975) - SOS Repair Hypothesis; Phenomenology of an inductible DNA Repair which is accomparied by Mutagenesis. Piemen Press New York. Ramakrishnan Y (1997) - Histone HI and Chromatin, higher -Order Structure- Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression; 7,215-230. Rees H., Jones R.H. (1977) - Cromosome Genetics Edward Arnold, London. Reinberg A. et all (1991) - Chronobiologie et Chronotherapeutique Ed. Flammarion, Paris. Rizki A., Lundblad V. (2001) - Defects in mismatch repair promote telomerase - Independent proliferation. Nalure; 7;41,713-716.
347

 Roberts R.J. (1981) - Restriction and Modification Enzymes and their Recognition sequences. Nucleic Acids. Res.; 9,275-296. Rosenthal N.(1995) - Fine Structure of a Gene - DNA Sequencing N.Engl. J. Med.;332,589-591. Rosenthal N.(1995)- DNA and the Genetic code N. Engl. J. Med; 331,39-41. Rownd R.H. (1996) - Plasmid Replication DNA Synthesis. Present and Futur. Ed. Jan Molinaux and Mosanichi Kogiyama. Plenum Publishing Corporation; 751-772. Saenger W. (1984) - Principles of Nucleic Acid Structure. Mit. Press, Cambridge, Mass. Sambrook J. et all.(1989) - Molecular Clonning. A Laboratory Manuam, Second Ed. Band 1-3 Cold Spring Harbour Laboratory, Press. San. Miguel P., Tikhonov A et all (1996) - Nested Retrotransposous in the Intergenic Regions of the Genome. Science;274, 765-768. Sanger F, Coulson A (1975) - A Rapid Method for Determining Sequences in DNA by Primed Synthesis with DNA Polymerase. J. Molec. Biol.;94, 441-448. Sanger F. (1981) - Determination of nucleotide sequences in DNA. Science; 214, 1205-1209. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. (1977) - DNA sequencing with chain termination inhibitors Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 74, 5463- 5464. Sapienza C. (1989) - Genom imprinting and dominance modification . Ann. N.Y. Acad. Sci, 564; 24-38. Schimke R.T. (1982) - Gene Amplification - Cold Spring Harbour Laboratory Press. New York. Seidel H.M. et all (1992) - Exons as Microgenes. Science; 257,14891490. Shapiro J.A. (1977) - Les genes santeurs. La Recherche; 81,784-787.

348

 Shapiro J.A. (1983) - Mobile Genetic Elements. Acad. Press New York, pg. 329-361. Sharps P.A. (1985) - On the Origin of RNA splicing and Introns. Cell; 42, 397-400. Sherman S.L. (1991) - Combining genetic and physical maps. Cytogenet. Cell. Genet.;58,l842-1843. Smith C.L. et all (1987) - Strategies for mapping and cloning macroregions of mammalion genomes. Methods Enzymol.; 151, 461-489. Sroffel M. (2004) - Beyond Genome - Conference San Francisco USA. Stachan T., Read A.P. (1999) - Human Molecular Genetics. 2nd Edition. Bios Scientific Publishes, Oxford. Stent G.S., Calender R (1978) - Molecular Genetics. A Introductory Narrative. Ed. Freeman, San Francisco. Stocking M. (1997) - The Human Genome Project and Molecular Anthopology. Genome. Res.;7,87 - 91. Stoffel Markus (2004) - Beyond Genome - San Francisco USA. Stryer L. (1991) - Biochemistry . W.H. Freeman and Company New York. Summer A.T., Chandlay A.C. (1993) - Chromosomes Today. Vol. 11, Chapman & Hall, London. Suzuki D.T. et all (1986) - An introduction to Genetic Analysis. Ed. W.H. Freeman and Company, New York. Swift H.M. (1950) - The desoxiribose nucleic acid content of animal nuclei. Physiol. Zool.;23,169-198. Tartof K.D. (1975) - Redundant genes - Ann. Rev. Gen.;9,335-385. Taylor J.H. et all (1957) - The Organisation and Duplication of Chromosomes as Revealed by autoradiographic studies using Tritium. Labeled Thymidine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA;43,122-128. Temin N. (1976) - Previous Hypothesis;The Establishment and Implications of RNA - directed DNA Synthesis. Science; 192, 1075-1080. 349

 Tham W.H., Zakian V.A. (2000) - Telomeric Tethers Nature; 403,34-35. The International Human Sequencing Cosortium (2001) - The Human Genome. Sequencing and Initial Analysis. Nature;409,860-921. Tjio J.H., Levan A. (1956) - The Chromosome Number of Man. Hereditas; 42,1-6. Travers A (1999) - The Location on the Linker Histone on the nucleosome - Trends Biochem. Sci.;24, 4-7. Uday Tirlapur Kussten Konig (2002)- Laser-transfection. Nature; 418,290-291. Vafa O, Sullivan K.F. (1997) - Chromatin Containing CENP-A and alpha - satellite DNA is a makor component of the inner kinetochore plate Curr. Biol.;7,897-900. Van Steensel B.,et all.(1998) - TRF2 protect human telomeres from end -to-end fusions Cell.;92, 401-413. Vandenberg S.G. (1968) - Progress in human behaviour genetics. Baltimore, John Hopkins. Venter J.C. et all (2001) - The sequence of the Human Genome. Science.;291,1304-1354. Walker F.M., Gaastra W (1983) - Tehniques in Molecular Biology. Croom Helm, London. Walker P.M.B. et all (1969) - Highly repetitive DNA in rodents, in Hand - book of molecular cytology. Ed. Lima de Faria, North - Holland, Amsterdam. Wang A.H.J et all (1979) - Molecular Structure of a Left - Handed Double Helical Fragment at Atomic Resolution. Nature; 282,680-686. Wang J.C. (1982) - DNA Topoisomerases Sci. Amer.; 247 (1), 94109. Wang J.C. (1987) - Recent Studies of DNA Topoisomerases. Biochem. Biophys.; 909,1-9. Watson J.D. (1976) - Molecular Biology of the Gene. 3rd Benjamin, Menlo Park.
350

 Watson J.D., Crick F.H.C. (1953a) - Molecular Structure of Nucleic Acid. A structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature; 171, 737-738. Watson J.D.,Crick F.H.C (1953b) - Genetic Implication of the Structure of Deoxyribonucleic Acid. Nature; 171,964-967. Weide H.J. et all (1991) - Biotechnology. Fischer Verlag, Stutgart. Weinberg W. (1908) - Uber den Nachweis der Vererbung bei Menschen. Jh. Ver. Vatel Naturk. Wurtt; 64,369-382. Whitfield L.S. et all (1995) - 41 Kilobases of analyzed sequence from the pseudo - autosomed sex - determining regions of the short arm of human y chromosome. Genomics; 27,306-311. Wilkins MHF et all (1953) - Molecular Structure of Deoxipentose Nucleic Acids. Nature, 738 - 740. Williamson R. (1993) - From genome mapping to gene therapy. Trends Bio. Technol. ; 11,159-161. Winkler H (1930) - Die Konversion der Gene . Ed. Gustav Fisher, Jena. Wlker G.C. (1985) - Inducible DNA Repair Systems. Ann. Rev. Biochem; 4,425-457. Young M.W. (1979) - Middle repetitiv DNA; a fluid component of the Drosophile genome. P.N.A.S.; 76,6274 - 6278. Zuckerkandl E, Pauling I (1962) - Molecular disease, evolution and genic heterogenerty, in Horizons in Biochemistry Academic Press, New York

351