Polinucletidos

Extremo 5
HOCH2 O
-

O N N N N H H N H

O P

O H O N H 2C O N O N H

O P

O O O H 2C O H 3C N N H O

Enlace fosfodister
-

Polinucletido
N

O P

H N N O N

O H 2C

O P

O O H O H2C O N N N N H N H

Extremo 3

OH

Formas de representacin de polinucletidos

5- CpApTpTpGpCpGpGpApApTpGpCpCp -3

5-CATTGCGGAATGCC-3 3-GTAACGCCTTACGG-5

5
-

H
-

O N O H N H N O CH2 O P O N O CH2 OOO N O CH2 O P OO-

O P

O O

N H N H N N

O H2C O

N N

O P

O H O N H2C O N N H

O H O H N H O O N N N H N N N H N N N H

O P

O O O H2C O H3C N

H N

O P H3C O CH2 O P H N N O H N H O O CH2 O P O O

OO-

Polinucletido en doble hlice

O P

H N N O N

N O

O H2C

OO-

O P

O O

H N H N N

O H2C O

N N

OO-

Propiedades de los polinucletidos, 1

1. Absorcin de luz UV a 260 nm Hipocromismo 120 % A260,

En el DNA doble hlice se da el fenmeno de hipocromismo:

el DNA desnaturalizado por el calor 110 absorbe un 20-30 % ms que el DNA nativo 100 T (C)

Propiedades de los polinucletidos, 2

2. Reaccin positiva de los polidesoxirribonucletidos a la difenilamina y al reactivo de Schiff

3. Reaccin positiva de los polirribonucletidos al orcinol

4. Reaccin con agentes intercalantes (acridinas)

5. Hidrlisis completa del RNA con lcali; el DNA es resistente a lcali.

Rotura qumica de polinucletidos

- Tratando un polinucletido (DNA) con dimetil sulfato (DMS) tiene lugar la metilacin de purinas; por calentamiento a pH neutro se rompe el enlace glicosdico y queda un sitio apurnico; el tratamiento ulterior con cido diludo rompe la cadena por el sitio apurnico.
- Tratando un polinucletido (DNA) con hidrazina se rompe el enlace glicosdico de las pirimidinas, quedando un sitio apirimidnico; el tratamiento ulterior con piperidina rompe la cadena por el sitio apirimidnico.

O P

H
-

O P

H N

O H 2C O N

N O

O H2C O N

O P

O O O H2C O N N N N H N H H
-

O P

O O H3C O H 2C O N N N N H N H H

O P

O O O H2C O H3C N N H O DMS

-

O P

O O O H 2C O H3C N N H O

O P

H N N O N

H
-

O P

H N N O N

H N N

O H2C O

N N

O H 2C O

O P

H
-

O P

H N

O H2C O N

N O

O H2C O N

O P

O O H 3C O H2C O N N N N H N H H
-

O P

O Sitio apurnico O H 2C O OH

O P

O O O H2C O H3C N N H pH bajo O

-

O P

O O O H 2C O H3C N N H O

Calentamiento
-

O P

H N N O N

H N N
-

O P

H N N O N

H N N

O H2C O

O H 2C O

O P

H
-

O P

H N

O H 2C O N

N O

O H 2C O N

O P

O Sitio apurnico
-

O P

O O-

O H 2C

OH O

O P

O O O H 2C O H3 C N N H O cido diludo
-

O P

OO O H 2C O H3 C N N H O

O P

H N N O N

H
-

O P

H N N O N

H N N

O H 2C O

N N

O H 2C O

Rotura enzimtica de polinucletidos

Endonucleasas: atacan enlaces fosfodister situados en el interior de una cadena polinucleotdica, y suelen ser especficas de cada cido nucleico: - Ribonucleasas - Desoxirribonucleasas Exonucleasas: atacan enlaces fosfodister situados en los extremos (3 o 5) de una cadena polinucleotdica, y suelen atacar indistintamente ambos tipos de cidos nucleicos: - Exonucleasa de bazo (rotura tipo b) - Exonucleasa de veneno de serpiente (rotura tipo a)

O P

O O O H2C O N N N N H H N H
-

O O O P O CH2 OOH O N N N N H H N H

O P

O H O N H2C O N O
-

H N

O O P O CH2 OOH O N

Rotura tipo a:
O

O P

O O O H2C O H3C N N H O
-

O H3C O P O CH2 O
-

N N

H O

Da lugar a una mezcla de 5-nucletidos

O P

H N N O N

H N O N
-

OH

H N N O N

H N N

O H2C O

O P O CH2 OOH

O P

O O O H 2C O N N N N H H N H O HOCH2 O N N

O N N H H N H

O P

O H O N H 2C O N O N H

O P O O-

H N

HOCH2 O O
-

Rotura tipo b: Da lugar a una mezcla de 3-nucletidos

O P

O O O H 2C O H3C N N H O

O P O OH 3C HOCH2 O O
-

O N N H O

O P

H N N O N

H N N HOCH2

O P O ON O N H N

H N N

O H 2C O

O
-

O P O O-

Endonucleasas:

DNAasa I: rotura completa, tipo a DNAasa II: rotura completa, tipo b RNAasa pancretica: rompe (b) enlaces Py-X RNAasa T-1: rompe (b) enlaces G-X
Endonucleasas de restriccin Exonucleasas: Exonucleasa de bazo: libera 3-nucletidos Exonucleasa de veneno de serpiente: libera 5-nucletidos

Endonucleasas de restriccin, 1:
1. Reconocen secuencias especficas, por lo general palindrmicas:

5- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3 3- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5

La secuencia reconocida en este caso es GAATTC

Endonucleasas de restriccin, 2:
2. Suelen romper el polinucletido dejando extremos cohesivos: 5- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3 3- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5

5- ATCGTTGCCTACAATTG 3- TAGCAACGGATGTTAACTTAA

AATTCCCAATAACCCTT -3 GGGTTATTGGGAA -5

Lo que permite la soldadura de fragmentos de DNA rotos por la misma endonucleasa de restriccin

Endonucleasas de restriccin, 3:
3. Al reconocer secuencias relativamente largas, cortan el DNA por un nmero muy limitado de sitios, lo que facilita la manipulacin experimental del mismo.

Algunas endonucleasas de restriccin: EcoRI ClaI HaeIII RsrII GAATTC ATCGAT GGCC CGGATCCG

Supongamos la secuencia reconocida por la endonucleasa de restriccin EcoRI, que es 5-GAATTC-3 En un DNA que contenga 30% de A, 30 % de T, 20 % de G y 20 % de C, la probabilidad de encontrar esta secuencia al azar sera de
0.2 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.2 = 0.000324 O lo que es lo mismo, aproximadamente una cada 3086 nucletidos

Separacin electrofortica de fragmentos de restriccin del DNA. Una vez separados, se tratan con bromuro de etidio (un agente intercalante) y se observan bajo luz UV.

Mtodo de Sanger para secuenciacin de polinucletidos

1. Sea un DNA que se desea secuenciar: 5 3 - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -

2. Disponemos de un oligonucletido complementario a la secuencia,TAGGCACG que se hibrida con el DNA cuya secuencia deseamos conocer, y que vale como cebador de la nueva sntesis. Este oligonucletido est marcado radioactivamente. 3 5 - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACG 3 5

3. La muestra se divide en cuatro partes, que contienen: A) Los cuatro desoxinuclesido trifosfatos, dATP, dGTP, dCTP, dTTP B) DNA polimerasa I (fragmento Klenow) y especficamente cada una, C) un didesoxinuclesido trifosfato, que al carecer de 3-OH interrumpe la sntesis de DNA all donde se incorpore. Muestra A Muestra B Muestra C Muestra D

dATP dGTP dCTP dTTP ddATP

dATP dGTP dCTP dTTP ddGTP

dATP dGTP dCTP dTTP ddCTP

dATP dGTP dCTP dTTP ddTTP

Sntesis en presencia de ddGTP

5 3 - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAG* 5 3 - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGG* - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTCG* - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTCGATG* - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCG*

3 4 12 15 21 26

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATCG*

Sntesis en presencia de ddATP

5 3 - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGA* 5 3 - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAA* - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCA* - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACA*

1 2 6 8 13 17

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTCGA*

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCA*

Sntesis en presencia de ddCTP

5 3 - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGC* 5 3 - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCAC*

5 7 11 16 20 25

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTC*

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGC*

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATC*

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATC*

Sntesis en presencia de ddTTP

5 3 - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACAT* 5 3 - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATT* - ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTCGAT*

9 10 14 19 24 31

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAAT*

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAAT*

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATCGAACGT*

G
60

C
A continuacin, las cuatro mezclas se someten a electroforesis en poliacrilamida-SDS. Este mtodo separa polinucletidos en funcin de su tamao, de forma que los ms cortos se desplazan ms rpidamente. Como el cebador est marcado radioactivamente, revelamos la plancha de electroforesis por autorradiografa.

50

40

30

20

10

Con esto leemos directamente la secuencia complementaria del polinucletido inicial: 5-AAGGCACATTCGATGCAATCGAATCGAACGTCCCAAAAGGATTCCGGGAAAATG-3