24 de septiembre

Hemoparsitos

2008
Prctica IV

Las Hemoparasitosis constituyen enfermedades ampliamente distribuidas en toda Amrica, al igual que sus vectores, causando efectos negativos en la salud de los rebaos animales y sobre la produccin y rentabilidad de los sistemas de produccin animal establecidos en las diferentes regiones del continente. Igualmente, la Tripanosomiasis en humanos (Mal de Chagas) ocasiona importantes problemas de salud en la poblacin humana americana.

[HEMOPARSITOS] 24 de septiembre de 2008

Hemoparsitos
Prctica No. 4
Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Facultad de Estudios Superiores Zaragoza. Av. Guelatao 66, Col. Ejrcito de Oriente, 09230, Iztapalapa. Mxico D.F. Laboratorio de Microbiologa L-121 Prez Prez Jos Manuel, Equipo 1, Grupo 1701

Introduccin:

as Hemoparasitosis constituyen enfermedades ampliamente distribuidas en toda Amrica, al igual que sus vectores, causando efectos negativos en la salud de los rebaos animales y sobre la produccin y rentabilidad de los sistemas de produccin animal establecidos en las diferentes regiones del continente. Igualmente, la Trypanosomiasis en humanos (Mal de Chagas) ocasiona importantes problemas de salud en la poblacin humana americana. Dentro de la gama de Hemoparsitos y sus agentes vectores descritos en el continente tenemos a especies exoglobulares pertenecientes al Gnero Trypanosoma (T. vivax, T. evansi, T. theileri, entre otros, en animales) y T. cruzi, T. rangeli, en humanos, y endoglobulares como el Anaplasma marginale, especies del Gnero Babesia (B. bigemina, B. bovis, B. argentina, B. caballi, B. equi) en animales y del Gnero Ehrlichia spp. (E. canis, E. platys) tanto en animales como en humanos. Encontrando igualmente una amplia distribucin de especies vectoriales dentro de los insectos (Tabnidos, Stomxydos, Hipeltidos, Triatominos, etc.), arcnidos (Garrapatas, caros, etc.), y la posibilidad de transmisin mecnica por parte del mismo humano al aplicar tratamientos, as como una gran diversidad de especies animales reservorios de estos hemoparsitos, lo cual conduce a concluir la verdadera importancia de estas enfermedades parasitarias por la alta diversidad de especies parsitas y vectores presentes, y por su extensa distribucin zoogreogrfica, en una regin del mundo dotada de ingentes y variados recursos pecuarios, constituidos no solo por las especies domsticas tradicionales, sino tambin por especies autctonas como los camlidos suramericanos, tambin sujetos a la explotacin para la obtencin de alimentos (carne, leche) y otros subproductos (lana, cuero) contribuyendo a mejorar la calidad de vida de los habitantes de las zonas rurales y montaosas de los pases donde existen.

Por otra parte, los ecosistemas donde se cran los animales de inters pecuario en Amrica, y sobre todo en Amrica Latina, varan grandemente, predominando las regiones tropicales hmedas con elevada precipitacin pluvial anual, y de trpicos secos con pocas prolongadas de sequa, aunque existen tambin reas importantes de clima fro como son las de la Cadena de Los Andes. En estos ambientes, los animales en produccin se encuentran adversamente afectados por los diversos climas (exceso de calor, de fro), por la pobre calidad nutritiva de las pasturas y por la alta incidencia de las parasitosis, y dentro de ellas, las producidas por los hemoparsitos, adems de otras enfermedades de origen bacteriano y viral. En consecuencia, no es raro que la produccin, productividad y rentabilidad de los sistemas de produccin pecuarios de la regin latinoamericana, se mantenga consistentemente baja, y por lo tanto, merma la disponibilidad de productos y subproductos de origen animal para la cada vez ms numerosa poblacin humana, as como los consiguientes ingresos por concepto de la produccin y mercado de esos productos. Es por ello que no nos sorprende observar que los indicadores de produccin son similares a los reportados por la FAO en 1985, en donde indicaban que el Amrica Latina exista el 27%, 16% y 10% de la poblacin mundial de bovinos de carne, de leche y ovinos, y de todas maneras la produccin de carne y leche de estos animales no representaban sino el 17.4%, 7.4% y 4.8%, respectivamente, de la produccin mundial. Indicndose que las hemoparasitosis representan la tercera entidad nosolgica de importancia econmica en Amrica, especialmente en el ganado bovino, de all la relevancia de su estudio y el desarrollo de investigaciones que coadyuven a su control, y uno de los aspectos indispensables para ello, es el obtener un diagnstico certero y efectivo. De lo anteriormente expuesto se desprende, parte de la justificacin e importancia de este Curso Internacional que se ofrece a los investigadores, a los veterinarios y profesionales de otras especialidades relacionadas a la produccin animal y a de la salud pblica, a los fines de actualizar sus conocimientos

[HEMOPARSITOS] 24 de septiembre de 2008

sobre las tcnicas de diagnstico desarrolladas en el mundo para el estudio de estas enfermedades hemoparasitarias. Los protozoarios parsitos sanguneos posibles de observar en frotis sanguineos son Plasmodium y Trypanosoma. Las especies de aschelmintos sanguneas son las Filarias, como Onchocerca volvulus. Trypanosoma se puede diagnosticar por cultivo en sangre y pruebas serolgicas.

Mtodo:
1.- Sangre
a) Tcnica de gota gruesa
Se pincho un dedo e inmediatamente se tomo una muestra de sangre y se procedi a realizar el siguiente procedimiento. Esquema A:

Diferentes tipos de frotes sanguineos. 1. Observacin de sangre en fresco.

Aunque el examen microscpico de sangre fresca no es una tcnica rutinaria, es muy til en la deteccin de Plasmodium, Trypanosoma y microfilarias, los cuales pueden ser reconocidos por sus caractersticas de movilidad en sangre fresca. Se coloca una pequea gota de sangre en un portaobjetos cubierto con un cubreobjetos. Enseguida se observa al microscopio a baja amplificacin, pudiendo observarse un movimiento como circular de las microfilarias, y uno ondulatorio de los tripanosomas.
Sobre un portaobjetos limpio se coloca una gota de sangre y se extiende, con una de las aristas de un portaobjetos formando un cuadro de aprox 1.5 cm se deja secar.

El siguiente paso es el lacado o lisado de los eritrocitos en agua destilada durante 810 minutos se seca y se tie se observa.

2. Frote Sanguneo Delgado.

Se observ al microscopio en seco dbil y seco fuerte e inmersin

Los frotes delgados de sangre se desarrollan en la misma forma que los frotes hechos para estudios de hematologa. Este tipo de preparaciones son utilizadas para la identificacin de Plasmodium, Trypanosoma y microfilarias. Es esencial que la pelcula de sangre que quede en el portaobjetos, sea verdaderamente delgada. La ventaja del frote delgado es que preserva la estructura del parasito con un mnimo de distorsin.

Esquema A:

b) Tcnica frotis fino en sangre.

Para las preparaciones fijas se realizo el siguiente procedimiento. Esquema B

3. Frote sanguneo grueso

El frote grueso es preferido con respecto al delgado, para el diagnstico de Plasmodium, ya que revela al parsito ms rpidamente, debido a que permite examinar de 10 a 50 veces mayor cantidad de sangre, que en un frotis delgado. Este tipo de frotis es ms efectivo en los casos de infecciones nuevas o crnicas por Plasmodium, cuando los parsitos no son abundantes.

Se deposita una gota de sangre en uno de los extremos del portaobjetos, y con el borde de otro porta se realiza la extensin de la sangre.

Se mueve rpido este segundo porta el cual debe de formar un ngulo de aprox. 30 grados. Se deja secar, se tie y se observa al microscopio en 10X, 40X, 100X aumentos.

Objetivos:
Que el alumno aprenda a realizar tcnicas hematolgicas para determinar los parsitos presentes en sangre. El alumno aprender a realizar tcnicas inmunolgicas para determinar parsitos presentes en sangre.

Esquema B:

[HEMOPARSITOS] 24 de septiembre de 2008

Las tcnicas de tincin de Wright y Giemsa fueron anteriormente descritas en la prctica no. 3 Mtodos de recoleccin y tincin de parsitos

Resultados:
En esta prctica no se encontraron parsitos en sangre de sapo ni en humana en frotis delgado ni en gota gruesa. Aunque en el frotis delgado de sapo se encontr gran cantidad de neutrfilos y la serie blanca, muy granulados. Cabe sealar que en el sapo estaba infestado de microfilarias en varios rganos como pulmn e intestino. Figura 2. Frotis fino teido en Giemsa en emersin 100x, donde se puede observar claramente en el centro un Neutrfilos granulado.

Laminillas Prctica No. 3

Figura 3. Frotis en gota gruesa teido en Giemsa 100x, en el cual no se observan filarias ni otros parsitos..

Laminillas Prctica no. 4

A B

A B C
Figura 1. Muestra de sangre de sapo teido con Wright en frotis delgado. En A se encuentra en seco dbil 10X; B en seco fuerte 40x y en inmersin 100x, donde se puede observar claramente un los glbulos rojos nucleados caractersticas de los anfibios y otras especies.

Figura 4. Muestra de tincin en Giemsa de frotis fino de sangre humana. En A glbulos rojos en seco dbil, B seco

[HEMOPARSITOS] 24 de septiembre de 2008

fuerte 40x, y en C inmersin 100x. En dicha muestra no se observaron parsitos.

Referencias:
PARASITOLOGA MEDICA. Jorge Tay Zavala, Ramon Lara Aguilera et.al. 5a edicin. Editorial Mendez editores. Mxico 1995. Biagi Francisco. Enfermedades parasitarias. Editorial el Manual Moderno. 3ra ed. Mxico, 2004. Romero Cabello Ral. Microbiologa y Parasitologa Humana. Bases etiolgicas de las enfermedades infecciosas y parasitarias. Editorial Panamericana. 3ra ed. Mxico, 2007. Botero D. Parasitosis Humana. 3.ed. Corporaciones para Investigaciones Biologicas, Colombia. 1998. P. 424-428

Anlisis de resultados:
La prueba confirmativa para diagnstico de parsitos sanguneos es efectuada mediante el examen de preparaciones de frotis sanguneos. para buscar su presencia. En la figura 1, Una muestra de sangre de sapo, teida bajo Wright muestra la serie roja en diferentes oculares, el cual muestra que los glbulos rojos del sapo tiene ncleo a diferencia de las humanas, B y C. Comparado con la figura 4C En la figura 2, se muestra de sangre de sapo teida bajo Giemsa en inmersin que el frotis presentaba la serie blanca en mayor concentracin de lo normal, esto posiblemente debido a que el sapo se encontraba infestado con larvas en pulmn y en otros rganos y al igual que en lo seres humanos la serie blanca como los neutrfilos se encargan de las defensas del husped hacia los microorganismos como los parsitos. Tambin en esta figura se muestra que se encuentra granulado, lo cual significa que hay presencia de una infeccin. Esto tambin se constata ya que el sapo se encontraba enfermo del hgado por el color que presentaba y que adems se encontraron con ectoparsitos. En la figura 3 se puede observar un frotis en gota gruesa, teida bajo Giemsa, en la cual a pesar de tener mayor cantidad de capas de tejido hemtico no se encontraron con parsitos. En la figura 5 slo se hace referencia a las tinciones bajo Giemsa de frotis fino de tejido humano, en seco dbil, fuerte e inmersin 4C, en ste se observa neutrofilo en la parte inferior derecha. Conclusiones: Con base en las observaciones se realizaron las tcnicas hematologicas para determinar parsitos presentes en sangre, aunque no se encontrara de los distintos tipos de frotis finos y en gota gruesa. Sin embargo, debe considerarse que los parsitos pueden estar presentes en la sangre perifrica en nmero muy pequeo. La presencia de un solo parsito en un frotis es significativa y debe identificarse la especie, enseguida. Se requiere un examen muy cuidadoso de los frotis sanguneos antes de reportar el estudio como negativo para parsitos. Por tal motivo es necesario adquirir experiencia para un examen acertado de frotis sanguneos, en el diagnstico de parsitos. Con frecuencia las plaquetas sobre los eritrocitos pueden ser confundidas errneamente como parsitos, por lo que cualquier cosa sospechosa debe confirmarse.

Anexo: Cuestionario IV
CUESTIONARIO
1. Cules son los protozoarios hemticos ms comunes en Mxico?

Leishmania mexicana (daan a los leucocitos) Tripanosoma cruzi (Hepatomegalia) Plasmodim sp (requiere de hemoglobina y Glucosa 6-P para su ciclo vital) Toxoplasma gondii (Taquizoito se desarrolla en la sangre) 2.- En que casos se debe utilizar la tcnica de gota gruesa? Para obtener material para el diagnostico de protozoarios presentes en la sangre. Para un examen rpido y con pocos parsitos en la sangre circulante. De esta fuente se hace el diagnostico rutinario de paludismo, tripanosomiasis africana, la mayor parte de las filariasis, con menos frecuencia la enfermedad de Chagas y, raramente, kala-azar y toxoplasmosis. En una infeccin en particular los parsitos no estn presentes en alta concentracin. Para el diagnostico de: Plasmodium. Leishmanias. Tripanosomas. Toxoplasma.

[HEMOPARSITOS] 24 de septiembre de 2008

Doble difusin: Consiste en poner en una serie de pozos los posibles anticuerpos contra un antgeno determinado. Al difundirse el antgeno y anticuerpo, forman al encontrarse especficamente una banda de precipitado. Contrainmunoelectroforesis: Llamada tambin electroinmuno-difusin, la cual consiste en hacer reaccionar antgeno y anticuerpo en un gel sometido a campo elctrico. Inmunoelectroforesis: Esta prueba es una combinacin de mtodos fisioqumicos e inmunoqumicos, el material a investigar (antgeno) inicialmente es sometido a una separacin por electroforesis y posteriormente se enfrenta al antgeno fraccionado con el suero (anticuerpo) a examinar, de tal manera que los antgenos y anticuerpos se difunden en un medio apropiado (gel) el uno hacia el otro para evidenciar la formacin de bandas de precipitacin al encontrarse. Anticuerpos fluorescentes (Mtodo indirecto): En el cual un suero desconocido (anticuerpo) se pone en contacto con antgenos conocidos, luego se aade antigamaglobulina marcada con fluorescencia y posteriormente se observa en microscopio de fluorescencia. Esta prueba ha sido modificada para obtener un antgeno soluble adherido a una base de acetato de celulosa y su lectura se realiza en un fluormetro. Anlisis Inmunoenzimtico: Es una prueba creada en esta dcada, consiste en ligar a un tubo o placa de poliestireno el antgeno el cual se pone en contacto con suero (anticuerpo), posteriormente se nace contactar esta unin (antgeno-anticuerpo) con antiglobulina marcada con enzima y luego esta enzima se hace reaccionar sobre un substrete dando una reaccin de color. Intradermorreaccin: Es una prueba consistente en la aplicacin intradrmica de un antgeno determinado y la posterior reaccin celular por la presencia de anticuerpos especficos.

3. En qu caso debe utilizarse la tcnica de extensin de sangre? Se usa despues de haber confirmado por gota gruesa la presencia de parsitos hematfagos o presentes en sangre, por ejemplo: para ver las caractersticas morfolgicas del parsito que causa el paludismo, la etapa de desarrollo en que se encuentra y la especie de de Plasmodium que se trata, as como para poder calcular el nmero de eritrocitos parasitados por trofozoitos y esquizontes. 4. En qu hemoparsitos se puede utilizar la tcnica de ELISA? A: Entamoeba histolytica, Leihsmania mexicana, Leishmania brasiliensis, L. donovari, Tripanosoma cruzi, T. gambiense, Toxoplasma gondii.

5. Qu otras tcnicas inmunolgicas se pueden utilizar en el diagnstico de hemoflagelados parsitos del hombre? Las pruebas ms importantes en el diagnstico inmunolgico de enfermedades parasitarias son las siguientes: Precipitacin: Esta reaccin se realiza cuando un antgeno soluble reacciona con su anticuerpo y forma un precipitado. Aglutinacin: Es una prueba en donde el antgeno celular o particulado se halla en suspensin, este antgeno aglutina con su anticuerpo especfico. FIoculacin: Esta prueba es una variante de la precipitacin pero la reaccin se manifiesta por formacin de grumos. Hemaglutinacin indirecta: Con algunos antgenos parasitarios se sensibilizan glbulos rojos, como resultado estos glbulos rojos sensibilizados son aglutinados por anticuerpos especficos. Fijacin de complemento: Se realiza cuando un antgeno se pone en contacto con un anticuerpo especfico en presencia de complemento.