Lecciones de Biología Celular y Molecular Hugo Gonzáles

Figueroa

METODOS DE ESTUDIO DE LA BIOLOGIA CELULAR y MOLECULAR

Tamaño y biología
Tamaños de células, virus, y otras cosas pequeñas

La biología es un área muy rica visualmente. Sin embargo muchas de las estructuras y
eventos biológicos más interesantes son más pequeños de lo que el ojo humano puede
ver sin ayuda. En realidad el ojo humano tiene una resolución de cerca de 100 µm. En el
cuadro de abajo note que de todas las estructuras listadas, solamente la célula vegetal
está escasamente dentro de nuestra resolución

Desde hace unos 25 años el perfeccionamiento de varios métodos ha facilitado un

conocimiento mejor de la estructura y función de los componentes del sistema celular.

Métodos de preparación de células y tejidos para observar estructura, actividad

fisiológica, comportamiento y ultraestructura.

Estos métodos requieren de aparatos que prolonguen el poder de resolución del ojo
humano a magnitudes muy pequeñas.

El poder de resolución de todo aparato óptico es la capacidad de resolver dos puntos

situados uno cerca de otro. Todo aparato óptico tiene una distancia mínima de resolución,
que se denomina límite de resolución.

Dimensiones que pueden ser discriminadas por:

• ojo humano: de 100 metros a 0,1 milímetro

• microscopio óptico: de 0,1 mm a 0,25µm (micras)
• microscopio electrónico: de10 µm a 0,1 nm (manómetro)

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La microscopía óptica utiliza como fuente de poder la luz visible (natural o artificial).

El microscopio óptico
tiene un limite
resolución de cerca de
200 nm (0.2 µm ).
Este limite se debe a
la longitud de onda de
la luz (0.4-0.7 µm ).
Las células
observadas bajo el
microscopio óptico
pueden estar vivas o
fijadas y teñidas.

Imagen cortesía de WebPath

(wwwmedlib.med.utah.edu/WebPath/webpath.html)

La microscopía electrónica utiliza como fuente de poder el flujo de electrones en vacío.

El Microscopio Electrónico de Transmisión(MET)

El microscopio electrónico de
transmisión (MET) tiene un
límite de resolución de cerca
de 2 nm. Esto es debido a
limitaciones del lente usado
para enfocar electrones hacia
la muestra. Un MET mira a
replicas de células muertas ,
después de haber sido
fijadas y teñidas con iones
de metales pesados. Los
electrones son dispersados Imagen cortesía de WebPath
cuando pasan a trabes de (www-
una fina sección del med.utah.edu/WebPath/webpath.html)
espécimen, y luego
detectados y proyectados
hacia una imagen sobre una
pantalla fluorescente.

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El Microscopio Electrónico de Barrido (MEB)

El microscopio electrónico
de barrido (MEB) también
tiene un límite de 2nm. Al
igual que el MET, el MEB
permite mirar a células
muertas, después de haber
sido fijadas y teñidas con
iones de metales pesados.
Con esta técnica los
electrones son reflectados
sobre la superficie del
espécimen.

Imagen cortesía de WebPath

(wwwmedlib.med.utah.edu/WebP
ath/webpath.html)

Para ambos microscopios son indispensables:

I. Un sistema de condensación para iluminar el objeto.

II. Lentes del objetivo que proyectan la imagen agrandada del objeto sobre el plano
de la primera imagen (en el microscopio electrónico se emplean lentes
magnéticas).
III. Lentes de proyección que proyectan el plano de la imagen sobre el plano de la
segunda imagen.

En el microscopio óptico las lentes de proyección pueden ser la combinación de un ocular

y el ojo humano o la lente de una cámara, en cambio en el microscopio electrónico las
lentes de proyección sólo pueden combinarse con una cámara. La observación directa de
la muestra se hace a través de una pantalla fluorescente.

En la práctica los microscopios ópticos tienen lentes que permiten obtener una gran
apertura, alta resolución y disminución de las aberraciones cromáticas.

El poder de resolución en los microscopios compuestos resulta de las amplificaciones

obtenidas con las lentes del objetivo y las lentes de proyección. Las amplificaciones de
utilidad máxima de ambos microscopios están limitadas por la difracción y alcanzan
valores de 200 000X para el electrónico y 2000X para el óptico.

En la microscopía óptica la luz es desviada por medio de materiales de diferentes índices

de refracción, y es posible enfocar cambiando la distancia entre el objetivo y el objeto.

La microscopía confocal examina un punto de difracción limitada de luz, casi siempre

generada por un rayo láser, a través de la muestra. La luz emitida, reflejada o trasmitida
de la muestra pasa por un objetivo de apertura muy fina. Por esta apertura pasa sólo la
luz del plano focal de la muestra. Debido a que el plano focal es muy estrecho, el
microscopio genera secciones ópticas de la muestra, casi siempre se forman muchas

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capas de la muestra lo que permite observarla en tres dimensiones. La ventaja de la

microscopía confocal radica en la capacidad de discriminar sólo la muestra que se
encuentra en el plano focal, porque elimina la iluminación que está fuera de este plano.
En la microscopía confocal se utiliza colorantes fluorescentes.

La microsocopía electrónica, un haz de electrones es desviado por lentes magnéticas

cuya fuerza de campo magnético y su longitud focal pueden cambiarse continuamente
alterando la corriente eléctrica en la bobina del magneto.

El contraste: para que un objeto sea visible debe ser diferente del medio que lo rodea. La
diferencia de intensidad entre la imagen de un objeto y la del medio que la rodea se
denomina contraste.

Técnicas de contraste más utilizadas:

• Tinción: usando colorantes que son absorbidos de manera diferencial por las
diferentes estructuras biológicas, la absorción de la luz variará cuando incida sobre el
colorante y la intensidad de la imagen variará entre las diversas partes.

• Fluorescencia: con la fluorescencia el objeto se hace luminoso. Al iluminarse el

objeto con luz de longitud e onda de 365 nm, el material de estudio podrá ser visto por
su luz fluorescente que emite. Las proteínas, ácidos nucleicos son débilmente
fluorescente, pero es posible observarlos en placas fotográficas, cuando se han
acoplado a grupos fluorescentes (anticuerpos fluorescentes).

• Cambio de fase de la onda de luz: permite obtener un contraste natural, sin

necesidad de usar colorantes para observar una estructura biológica.

• Luz polarizada: permite observar regiones asimétricas dentro de estructuras

moleculares.

• Luz ultravioleta: permite mostrar un contraste sin ninguna tinción especial, debido a
los coeficientes de absorción de los componentes celulares como ácidos nucleicos y
proteínas.

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MICROSCOPIO OPTICO: PARTES y FORMACION DE LA IMAGEN

(Tomadas de: Darnell J., Lodish H & Baltimore D. 1990. Molecular Cell Biology. 2da.
Edición. Scientific American Books. New York)

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MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION (Tomado de: Darnell J., Lodish H &

Baltimore D. 1990. Molecular Cell Biology. 2da. Edición. Scientific American Books.
New York)

ULTRAMICROTOMO y GRILLA (Preparación de muestras para microscopía

electrónica de transmisión)

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(Tomado de: Darnell J., Lodish H & Baltimore D. 1990. Molecular Cell Biology. 2da.
Edición. Scientific American Books. New York)

Métodos de separación de células en sus partes

Citometría de flujo

Este método sirve para identificar las células a partir de una mezcla de células. Un
instrumento llamado separador de células activadas por fluorescencia (FACS) puede
seleccionar células simples de un grupo de muchas células. Las células una vez teñidas
con colorantes fluorescentes son unidas a un anticuerpo específico para una molécula de
superficie de membrana. En el FACS, un flujo de células pasa por una fuente de laser y la
correcta longitud de onda de la luz causa que las células que contienen el complejo
anticuerpo-fluorcromo, emitan fluorescencia.

 El FACS puede separar una célula que muestra un marcador específico de superficie
de cientos que no lo tienen, entonces las células seleccionadas pueden crecer en
cultivos in vitro.
 El FACS puede medir el contenido y la determinación de la forma y tamaño del ADN y
ARN de la célula. En estudios de ciclo celular puede diferenciar muy bien los núcleos
inerfásicos de G0, G1 S y G2

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Fraccionamiento celular

Las técnicas de fraccionamiento permiten romper células enteras de una forma

controlada. Las diferentes partículas se separan posteriormente para su ulterior análisis
estructural o funcional.

Esto se consigue centrifugando a alta velocidad las células rotas en soluciones especiales
de densidad conocida. De esta forma, se puede obtener preparaciones relativamente
puras de núcleos, mitocondrias, retículo endoplasmático (microsomas), entre otros
subcomponentes celulares.

ULTRACENTRIFUGA y POBLACIONES DE ORGANELAS OBTENIDAS POR

FRACCIONAMIENTO CELULAR

(Tomado de: Darnell J., Lodish H & Baltimore D. 1990. Molecular Cell Biology. 2da.
Edición. Scientific American Books. New York)

Cultivo de células y tejidos

Las células pueden crecer en medios artificiales, lo cual ha facilitado el conocimiento de

sus características estructurales y funcionales:

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• Los medios químicos definidos permiten identificar factores de crecimiento

específicos.
• Las líneas celulares se mantienen indefinidamente: Por ejemplo células de humanos
con alguna enfermedad que le causa la muerte, pueden ser mantenidas en estos
sistemas de cultivo.

La uniformidad de la línea celular puede incrementarse por la clonación. Un clon es

una población de células derivadas de una sola célula antecesora.

Uno de los usos más importantes de la clonación ha sido el aislamiento de líneas

celulares mutantes con defectos en genes específicos

Ejemplos:
Línea celular Tipo celular y origen

HeLa células epiteliales (humana)

SP 2 célula plasmática (ratón)
3T3 fibroblasto (ratón)

• Las células pueden fusionarse para formar células híbridas o heterocariones: este es
un método específico para asignar genes a cromosomas específicos.

Cromatografía y electroforesis

Técnicas que permiten separar macromoléculas de preferencia proteínas y ácidos

nucleicos.

La cromatografía es uno de los métodos más usados para el fraccionamiento de

proteínas. Hay diversas formas de cromatografía:
 Cromatografía en papel
 Cromatografía en capa fina
 Cromatografía en columna:
• Columna de intercambio ionico
• Columna de filtración-gel
• Columnas de afinidad

La electroforesis permite separar proteínas en función a las cargas eléctricas positivas y

negativas de estas moléculas biológicas. Esta técnica permite separar mezclas de
proteínas. El tamaño y la composición de los aminoácidos de una proteína son
determinados con relativa facilidad usando la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.

La electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional permite separar más de 1000

proteínas en un simple gel.

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TECNICAS DE CROMATOGRAFIA y ELECTROFORESIS PARA SEPARAR

MOLECULAS BIOLOGICAS

(Tomadas de Alberts et al., 1986)

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Ingeniería genética

La ingeniería genética es una técnica que consiste en la introducción de genes en el

genoma de un individuo que carece de ellos.

Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de "cortar" el ADN en
puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un
segmento de ADN extraño a un ADN receptor. Por ejemplo, la integración de un ADN
vírico en un ADN celular.

La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que

destacan:

• la tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un

fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.

• La secuenciación del ADN: Técnica que permite saber el orden o secuencia de

los nucleótidos que forman parte de un gen.

• la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar

el número de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una
mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite
para un determinado estudio.

• las aplicaciones de la ingeniería genética: Son numerosas las aplicaciones

prácticas y comerciales de la ingeniería genética.

Se abre un campo que nos ofrece además la posibilidad de utilizar plantas y animales
transgénicos así como microorganismos modificados genéticamente para producir
fármacos u otros productos de utilidad para el hombre,entre los que se pueden citar: la
insulina humana, la hormona del crecimiento,interferones, la obtención de nuevas
vacunas o la clonación de animales. Una puerta abierta que no nos debe hacer olvidar el
impacto perjudicial que un uso inadecuado podría provocar en el ser humano y en el
propio planeta.

La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la

Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo

Tecnología del ADN recombinante

Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que
llevará además el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las
células de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podrá
"expresar" la información de dichos genes. (De una manera muy simple podemos decir
que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo
es el gen que regula la fabricación de insulina, lo que haríamos al ponérselo a una
bacteria es "obligar" a ésta a que fabrique la insulina. Por lo tanto en la tecnología del
ADN recombinante podemos diferenciar cuatro etapas básicas:

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Corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización

de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción que pueden considerarse
como las "tijeras moleculares". Estas enzimas se aislaron en bacterias y se identifican con
distintos nombres, siendo lo característico de ellas estos dos principios:
Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta
en ese punto cada una de las cadenas de ADN.
Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a
otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción.
En los siguientes dibujos puede verse como actuarían estas enzimas.

En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción. Se

aprecia la actuación en ambas hebras.

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En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de

restricción.
Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes pegajosos
por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie
diferente.

Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción,

se pueden separar por tamaños, es decir, según el número de pares de nucleótidos que
llevan, mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos trozos. Según
Ifragmentado en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades
que hay que confirmar.

En el proceso de la electroforesis se prepara una mezcla de fragmentos de ADN y se

ponen en distintas soluciones. Los fragmentos se desplazan en relación inversa con su
tamaño, los fragmentos más pequeños se mueven rápidamente, mientras que los grandes
lo hacen muy lentamente.

Inserción de fragmentos

Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para
autorreplicarse Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en
vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en
las células hospedadoras. dentro de las células hospedadoras.
Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. de
introducirlos en las células hospedadoras.

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• Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del
cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que
tienen su propio origen de replicación.

En esta secuencia de dibujos se

puede ver como se realiza la inserción
de un gen en un plásmido.
En la figura a tenemos un gen(color
rojo) que interesa insertar en un
plásmido (color turquesa)

Figura a

En la figura b, vemos como una

enzima de restricción ha cortado el
gen y el plásmido, quedando unos
bordes cohesivos o pegajosos.

Figura b

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La unión del ADN que contiene el

gen que se desea clonar con el
vector de clonación, se realiza por
medio de otras enzimas,
denominadas ADN-ligasas, que
unen ambos trozos de ADN. El
resultado es una molécula de ADN
recombinante, ya que contiene
fragmentos de ADN de distinta
procedencia.
Figura c

• Bacteriófagos. El proceso es similar, se trata de insertar el gen deseado en un

fragmento de ADN vírico (figura d) Posteriormente se ensamblarán las distintas
partes del virus (figura e). Así quedará el virus completo(figura f). En el siguiente
paso se insertará este ADN por el proceso de la TRANSDUCCIÓN.

figura f
figura e
figura d

Cósmidos . Son plasmidos que contienen el fragmento de ADN deseado que posee un
borde cohesivo procedente del genoma del fago lambda (extremo cos)y se empaqueta en
el interior de un fago. Se construye el cósmido uniendo los tres elementos ginicos, y el
resultado final es poder introducir en la célula receptora fragmentos largos de ADN.

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Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes
denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector
de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y
genes de bioluminiscencia.

• Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que

contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al
antibiótico del gen marcador.

• Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se

quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le
incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea
cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

Métodos de introducción del vector. El siguiente paso será introducir el vector de

clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que
ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto.
Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente.
En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:
• Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se
consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y
químicos.

• La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las

introduce en su interior y las incorpora a su genoma. En las siguiente animación
puede verse el proceso.

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• Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora

mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus.
En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1
corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva
un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2,
corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de
contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta
su ADN al interior de la célula bacteriana.

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Muchos usos comunes de la tecnología del ADN recombinante incluye los siguientes
pasos:

1. Producción de una biblioteca del ADN: conjunto completo de todo el ADN de un

organismo en particular, generalmente clonado en plásmidos usando enzimas
de restricción. Se usan dos tipos de ADN recombinante:
 Clones genómicos: contienen un fragmento del ADN genómico.
 Clones de ADN complementario (cADN), contiene un fragmento
del ADN complementario copiado de un ARNm.
En ambos casos se dejan "extremos de unión "de hebras únicas a cada lado
del corte.
2. Identificación del gen seleccionado: se pueden identificar mediante diversas
técnicas
3. Producción de copias del gen seleccionado: pueden producirse en bacterias a
partir de la biblioteca del ADN cuando se cultivan las bacterias con el gen
seleccionado.
4. Inserción y regulación del gen en mecanismos específicos.

Los usos de los genes clonados incluyen:

 La producción de grandes cantidades de proteínas específicas

 La síntesis de vacunas
 El diagnóstico de enfermedades genéticas
 La modificación del ADN en organismos intactos que pueden ser bacterias,
plantas o animales
 La modificación del ADN de las células de órganos específicos en seres
humanos para corregir defectos genéticos.

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