Aspectos celulares e moleculares da inflamao

Danilo Mesquita Jr., Jlio A. Pereira Arajo

Reumatologistas

Tnia Tieko Takao Catelan, Alexandre Wagner Silva de Souza, Neusa Pereira da Silva, Luis Eduardo C. Andrade
Reumatologistas

Wilson de Melo Cruvinel

Prof. Assistente de Imunologia dos cursos de Biomedicina e Medicina, Diretor do Departamento de Biomedicina da PUC-Gois

Numerao de pginas na revista impressa: 66 81 Introduo A primeira defesa do organismo a um dano tecidual a resposta inflamatria. A inflamao um processo biolgico complexo que envolve componentes vasculares, celulares e uma diversidade de substncias solveis, apresentando como sinais clnicos caractersticos rubor, calor, edema, dor e prejuzo funcional. A finalidade do processo inflamatrio remover o estmulo lesivo e iniciar a recuperao tecidual local. Durante a inflamao vrios sistemas bioqumicos, como o sistema do complemento e da coagulao, so ativados auxiliando no estabelecimento, evoluo e resoluo do processo. Adicionalmente, vrias substncias solveis de meia vida curta so liberadas, exercem sua ao e so degradadas no stio inflamatrio. Em geral, o sucesso na remoo do estmulo lesivo leva concluso do processo e trmino da resposta aguda, ensejando o processo de reparo tecidual completo. Nesse processo predominam elementos da resposta imune inata, mas podem participar tambm linfcitos, plasmcitos e anticorpos. Na inflamao crnica, em geral ocasionada por persistncia do estmulo nxico, o processo inflamatrio se mantm e sofre alteraes qualitativas, caracterizadas por mudana progressiva nos elementos celulares e solveis que infiltram o tecido. Ocorre maior envolvimento da imunidade adquirida, de clulas imunocompetentes, macrfagos e fibroblastos. Aumentam as probabilidades de que a reconstituio no seja completa. A resposta inflamatria aguda evolui a partir de uma fase vascular que tem incio imediatamente aps o dano e envolve basicamente a microcirculao. Em condies basais apenas uma frao dos capilares que compem a rede tecidual esto prvios, entretanto aps uma agresso ocorre vasodilatao local e recrutamento da maioria dos capilares da rede, seguida de aumento da permeabilidade capilar. O aumento imediato da perfuso tecidual e da permeabilidade mediado por aminas vasoativas, histamina e serotonina, que so liberadas por mastcitos e moncitos minutos aps a agresso. Inicialmente, saem do leito capilar eletrlitos e pequenas molculas, constituindo o transudato posteriormente saem tambm molculas maiores como albumina e fibrinognio, constituindo um exsudato. A sada de protenas para o espao extravascular acompanhada de sada de gua, levando marginalizao dos leuccitos, que

passam a circular junto ao endotlio. Concomitantemente, o endotlio local tornase ativado e os endotelicitos passam a expressar molculas de superfcie que colaboram para a maior aderncia dos leuccitos e eventual migrao destes para os tecidos. Saem tambm para o espao extravascular e so ativados componentes do sistema do complemento, do sistema gerador de cininas e do sistema da coagulao. Macrfagos residentes no tecido lesado liberam citocinas inflamatrias como IL-1, TNF-a e quimiocinas. A migrao de clulas circulantes para os tecidos, denominada diapedese, direcionada pela presena de um gradiente de substncias quimiotticas no stio inflamatrio. No tecido, as clulas buscam remover o patgeno por meio de sua capacidade fagocitria, permitindo o reparo da leso. Na inflamao aguda as principais clulas so os neutrfilos e os macrfagos. A permanncia do agente lesivo leva cronificao do processo inflamatrio, sendo observada concomitncia de destruio e reparo tecidual. Na inflamao crnica o tecido apresenta caracteristicamente um infiltrado constitudo por clulas mononucleares (moncitos, macrfagos e linfcitos), sinais de angiognese e fibrose (Quadro 1). Os estmulos persistentes que induzem a cronificao do processo inflamatrio podem ser de diversas naturezas, tais como bactrias intracelulares como Mycobacterium tuberculosis, substncias qumicas como a slica, e mesmo agentes fsicos, como a radiao ultravioleta e traumas repetitivos. Nas doenas ditas autoimunes, como a artrite reumatide, no se conhece a causa da cronificao do processo inflamatrio.

Migrao dos leuccitos: molculas de adeso Em condies normais de fluxo sangneo, as clulas se concentram no centro do vaso onde h menos resistncia com a parede vascular e a velocidade do fluxo maior. Quando h dilatao do vaso a velocidade do fluxo sangneo diminui, a quantidade de clulas aumenta e as clulas colidem mais freqentemente com as clulas endoteliais ativadas que expressam molculas de superfcie capazes de ligar aos leuccitos. De modo geral, as clulas endoteliais so adaptadas a expressar altos nveis de molculas de adeso da famlia das inas (ina E e ina P), molcula 1 de adeso intercelular (ICAM-1) e molcula 1 de adeso da clula vascular (VCAM-1). A expresso dessas molculas resultado do processo de ativao do endotlio que ocorre em condies de leso tecidual, na presena de subprodutos de microrganismos (e.g., lipopolissacride - LPS) ou mediante contato com fatores provenientes da resposta inflamatria como componentes das

cascatas do complemento, coagulao, citocinas (IL-1, TNF-a) e mediadores como a histamina e o leucotrieno B4. As integrinas so protenas heterodimricas, compostas por uma cadeia a e uma cadeia b, localizadas na superfcie celular, mediadoras da adeso entre leuccitos e clulas endoteliais, bem como entre leuccitos e as protenas da matriz extracelular. A ligao da integrina a seu ligante primordial para que ocorra a migrao dos leuccitos para os tecidos e a afinidade dessa ligao regulada por diversos estmulos. As integrinas expressam uma cadeia b conservada (b1 ou CD29 e b2 ou CD18) associada a uma cadeia a varivel. As combinaes das diferentes cadeias a e b produzem dmeros com distintas propriedades de ligao e que se expressam em diferentes tipos celulares. As integrinas leucocitrias interagem por meio de adeso forte s molculas de adeso intercelular (ICAMs), presentes no endotlio ativado. Estas ltimas por sua vez so caracterizadas por domnios extracelulares relacionados famlia das imunoglobulinas e induzidas no endotlio ativado (ICAM-1, VCAM-1), no endotlio em repouso (ICAM-2) e nos leuccitos ativados (PECAM). Na Figura 1a esto esquematizadas algumas molculas de adeso e os respectivos ligantes. A dinmica de produo das molculas de adeso varia de minutos a horas. Algumas molculas encontram-se no citosol sobre a membrana de vesculas secretrias intracitoplasmticas (corpos de Weibel-Palade) que rapidamente se fundem membrana plasmtica quando a clula estimulada como no caso da ina P. Outras molculas, como a ina E, ICAM-1 e VCAM-1, demandam estimulao de horas para sua sntese. Tomando como exemplo um neutrfilo, o primeiro contato das clulas com o endotlio ativado mediado pela interao das inas P e E no endotlio mucina presente na superfcie do granulcito. Concomitantemente, a ina L de expresso constitutiva nos neutrfilos liga-se ao conjunto de mucinas na superfcie do endotlio. Essas ligaes so de dissociao rpida, fazendo com que os neutrfilos rolem na parede do vaso impelidos pelo fluxo sangneo (Figura 1b). O contato das clulas com a parede endotelial aumenta a exposio dos leuccitos aos fatores quimiotticos presentes no endotlio ativado ou s quimiocinas que se difundem no sangue a partir do tecido lesado. Deste modo ocorre estmulo adicional que promove a movimentao celular intermediado por mediadores, de baixo peso molecular, quimicamente atraentes para os leuccitos. Entre os fatores quimiotticos destacam-se fragmentos de fibrina, colgeno, fatores solveis plaquetrios, mediadores dos mastcitos, subprodutos do complemento (C5a, C3a e C4a), resduos do metabolismo bacteriano como os peptdeos n-formilados, entre outros. So tambm importantes as quimiocinas, grupo de citocinas secretadas por diferentes tipos celulares e responsveis por direcionar as clulas para o foco inflamatrio.

Figura 1 - Migrao dos leuccitos para o stio inflamatrio. Os macrfagos, estimulados pelos indutores da resposta inflamatria produzem citocinas como TNF e IL-1, as quais ativam as clulas endoteliais das vnulas a expressarem inas, ligantes para integrinas e quimiocitocinas. As inas mediam a adeso fraca dos neutrfilos, as integrinas, a adeso forte e as quimiocinas ativam e estimulam a migrao dos neutrfilos para o foco inflamatrio. Os moncitos e linfcitos T ativados usam os mesmos mecanismos para migrar para os locais de infeco.

A ativao mediada pelas quimiocinas induz alteraes nas configuraes das integrinas sobre a superfcie dos leuccitos permitindo a ligao aos ligantes expressos no endotlio e gerando interaes estveis e prolongadas que imobilizam os neutrfilos e promovem sua aderncia parede do vaso. Conseqentemente ocorre a migrao das clulas aderidas para o tecido adjacente a partir de movimentos ativos, direcionada pelo gradiente crescente de produtos quimiotticos e facilitada pela interao das integrinas aos componentes da matriz extracelular como a fibrina e a fibronectina. A etapa de extravasamento e migrao leucocitria dependente da ao das quimiocinas como, por exemplo, IL-8 e MCP-1, que so produzidas nos locais de infeco e se ligam aos proteoglicanos na matriz extracelular e em molculas similares na superfcie das clulas endoteliais. A IL-8 liberada por macrfagos ativados e atrai neutrfilos que so estimulados a penetrar no tecido inflamado, ao passo que MCP-1 recruta moncitos, clulas T, NK e clulas dendrticas mais tardiamente. Uma vez no foco inflamatrio, os macrfagos e neutrfilos reconhecem o elemento indutor do processo inflamatrio e, no caso de serem microrganismos, realizam fagocitose e so ativados para posterior destruio dos patgenos englobados. Mediadores da resposta inflamatria Os mediadores da resposta inflamatria so variados e derivam tanto de precursores plasmticos quanto de clulas, incluindo produtos de clivagem de precursores, produtos de cascatas de ativao, substncias pr-formadas, radicais livres de oxignio, xido ntrico e derivados do cido araquidnico (Quadros 2 e 3). A histamina exerce os seus efeitos fisiolgicos mediante interao com trs diferentes tipos de receptores da clula-alvo, H1, H2 e H3. H1 promove a contrao da musculatura lisa de vrios rgos e aumento da permeabilidade dos capilares venosos (drogas genericamente conhecidas como anti-histamnicas bloqueiam estes receptores). H2 aumenta a secreo de cido gstrico e de muco nas vias areas e H3 afeta principalmente a sntese de histamina e sua liberao por mastcitos e basfilos. A bradicinina faz parte da famlia de peptdeos gerados no plasma por ao de enzimas em substratos chamados cininognios. Os receptores B2 so constitutivos e medeiam o aumento da permeabilidade e do fluxo sangneo, broncoconstrio e estimulao de receptores algsicos. Os receptores B1 so pouco expressos na maioria dos tecidos em condies normais, mas so rapidamente induzidos em condies patolgicas por vrios estmulos pr-inflamatrios, como as citocinas IL1, IFN-g e TNF-a. Outro grupo de molculas importantes no processo inflamatrio so os neuropeptdios, substncia P, neurocinina A, VIP (vasoactive intestinal peptide), CGRP (calcitonin gene-related peptide), somatostanina e encefalinas. A substncia P e o CGRP tm efeitos pr-inflamatrios e so responsveis pela inflamao neurognica. A substncia P e as neurocininas atuam nos receptores NK1, aumentando o fluxo sangneo e a permeabilidade vascular, e em receptores NK2, induzindo broncoconstrio.

Os mediadores lipdicos derivados do cido araquidnico so produzidos como conseqncia da ativao de fosfolipases que clivam os fosfolpides constituintes da membrana celular, gerando as prostaglandinas, leucotrienos e PAF (platelet activating factor). As prostaglandinas tm funes inflamatrias, induzindo febre, hiperalgesia e vasodilatao. Ademais contribuem para contrao ou relaxamento da musculatura lisa e potencializao de edema. Tambm atuam em processos fisiolgicos como na manuteno da integridade do epitlio das mucosas, manuteno da funo renal, reproduo (sobrevivncia do feto, implante de ovo, contrao do tero durante o parto) e do crescimento e da morte celular. A inflamao fornece sinais que so fundamentais para que os linfcitos sejam ativados iniciando a resposta imune especfica e formando assim um elo de ligao entre a imunidade inata e adquirida. Quimiocinas As quimiocinas constituem uma grande famlia de citocinas estruturalmente homlogas, responsveis pela movimentao dos leuccitos, incluindo sua migrao para locais de inflamao tecidual, a partir do sangue. So pequenos polipeptdios de 8 a 12 kDa que contm duas pontes dissulfeto internas. Cerca de 50 quimiocinas diferentes j foram identificadas, sendo classificadas em famlias com base no nmero e localizao dos resduos de cistena N-terminais. As duas principais famlias so a das quimiocinas CC, nas quais resduos de cistena so adjacentes, e a famlia CXC, na qual esses resduos so separados por um aminocido, como, por exemplo, a IL-8. As quimiocinas podem ser constitutivas ou induzidas. As constitutivas so produzidas normalmente em vrios tecidos e recrutam leuccitos, principalmente

linfcitos, para esses tecidos na ausncia de inflamao. As quimiocinas induzidas (ou inflamatrias) so produzidas por vrias clulas em resposta a estmulos inflamatrios e recrutam leuccitos para locais de inflamao. Os receptores das quimiocinas so receptores acoplados a protena G com sete domnios transmembrana presentes na superfcie celular. J foram identificados 11 receptores diferentes para quimiocinas CC (CCR1 a CCR11) e 7 para quimiocinas CXC (CXCR1 a CXCR7). Os receptores de quimiocinas podem ser especficos para determinadas quimiocinas (e.g., CCR9, CXCR6), mas, comumente, um mesmo receptor pode ligar vrias quimiocinas do mesmo grupo. Aes biolgicas das quimiocinas Inicialmente estudadas devido ao seu importante papel nos processos inflamatrios, sabe-se atualmente que as quimiocinas desempenham papel crucial na movimentao das clulas mononucleares pelo corpo e sua migrao para os tecidos, contribuindo na resposta imune adaptativa e/ou na patognese de vrias doenas. Os receptores de quimiocinas so expressos em leuccitos, clulas dendrticas e clulas de Langerhans. A maior variedade de receptores observada em linfcitos T e sua expresso pode definir subtipos de linfcitos T. A ligao entre quimiocinas e receptores inicia uma complexa cascata de sinalizao que gera respostas quimiotticas, degranulao, liberao de espcies reativas e alterao na afinidade das integrinas presentes na superfcie celular. Alm das funes como agente quimiottico de leuccitos, os estudos com as quimiocinas e seus receptores esto revelando outros importantes papis para estas molculas. Alguns receptores de quimiocinas, entre eles o CCR5, so os principais co-receptores para certas cepas do vrus da imunodeficincia humana (HIV). Tm sido identificados polimorfismos em genes que codificam as quimiocinas, o que poderia interferir na sua funo. Por exemplo, a deleo de 32 nucleotdeos na variante polimrfica CCR532 torna os seus portadores resistentes infeco pelo HIV. Algumas quimiocinas esto envolvidas na angiognese por seu efeito quimiottico sobre clulas endoteliais, enquanto outras exercem um efeito antiangiognico. Acredita-se que as quimiocinas tambm desempenhem papel importante na hematopoiese. Quimiocinas tm sido relacionadas ao desenvolvimento de metstases tumorais e, contraditoriamente, inibio do crescimento de clulas tumorais, bem como a infeces e doenas auto-imunes, como a artrite reumatide e a esclerose mltipla. Nveis elevados de CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1a, CCL4/MIP-1b, CCL5/RANTES e CXCL10/IP-10 tm sido encontrados no sistema nervoso central de pacientes com esclerose mltipla e em modelos experimentais desta doena. Em um trabalho recente, pacientes com esclerose mltipla ativa apresentaram nveis elevados de CXCL10/IP-10 no lquor, enquanto os nveis de CCL2/MCP-1 foram significativamente menores quando comparados a controles assintomticos. Nveis elevados de IL-8 tm sido relatados em vrias condies inflamatrias sistmicas como a sarcoidose e a sepse. Nveis teciduais aumentados de IL-8 e anticorpos sricos contra esta quimiocina parecem estar elevados na colite ulcerativa em atividade. Foi observada elevada expresso de quimiocinas em bipsias de glndulas salivares menores de pacientes com sndrome de Sjgren. Neutrfilos Os granulcitos neutrfilos, ou clulas polimorfonucleares, so as clulas circulantes mais abundantes do sistema imune e atuam nas fases precoces da resposta inflamatria. Durante um processo inflamatrio os neutrfilos so uma das primeiras clulas a deixar a vasculatura e migrar para o tecido, atrados por quimiocinas e mediadores inflamatrios como IL-8 e INF-g liberados pelas clulas

endoteliais ativadas, macrfagos e mastcitos, e pelos produtos C3a e C5a do complemento. A migrao orientada pelo gradiente de concentrao de mediadores (mecanismo denominado quimiotaxia) que so reconhecidos por receptores de superfcie dos neutrfilos. Esta interao favorece o deslocamento dos neutrfilos pela matriz extracelular e sua rpida chegada ao stio inflamatrio. Durante a fase aguda da inflamao, principalmente em casos de infeco bacteriana, alm do rpido recrutamento de neutrfilos para o stio inflamatrio h tambm grande aumento na sua produo. Os neutrfilos podem alcanar o stio inflamatrio em cerca de uma hora aps a leso tecidual e so os principais componentes do pus (o que d sua caracterstica branco-amarelada). A capacidade fagocitria dos neutrfilos estimulada por receptores Toll-like, que reconhecem padres moleculares associados com patgenos (PAMPs) presentes na superfcie dos microrganismos, receptores para opsoninas, receptores para Fc de IgG e receptores para C3b. O microrganismo ou partcula estranha fagocitada mantido dentro de um vacolo denominado fagossomo que se funde com uma vescula denominada lisossomo, rica em enzimas proteolticas e oxidativas que conferem aos fagcitos sua capacidade microbicida. A fuso do fagossomo com o lisossomo resulta no fagolisossomo onde se d a destruio do microrganismo. O chamado sistema de oxidase dos fagcitos composto por mltiplas subunidades enzimticas, muitas das quais presentes na membrana fagolisossomal de fagcitos ativados e sua funo reduzir o oxignio molecular a intermedirios reativos do oxignio, que so bastante txicos para bactrias. A deficincia em componentes desse sistema de membrana ocasiona deficincia grave na capacidade de destruio de determinadas bactrias pelos fagcitos, sendo responsvel por uma importante imunodeficincia primria denominada doena granulomatosa crnica. Outra via de ao neutroflica mediada por grnulos secretados no meio extracelular, pelo processo de degranulao. Existem trs classes de grnulos liberados por estas clulas: 1. Grnulos primrios: tambm conhecidos como grnulos azurfilos, contm mediadores importantes no combate bacteriano geral, como a mieloperoxidase, defensinas, elastase neutroflica, protena de aumento da permeabilidade bacteriana e as catepsinas G 2. Grnulos secundrios: apresentam componentes secretados especificamente por neutrfilos, sendo a lactoferrina o principal exemplo 3. Grnulos tercirios: as principais protenas secretadas so as catepsinas e as gelatinases. Alm da liberao de fatores antimicrobianos no meio extracelular, estudos recentes mostram que os neutrfilos podem gerar fibras extracelulares, tambm chamadas de armadilhas extracelulares neutroflicas (NETs). As NETs so formadas por componentes dos grnulos e componentes nucleares que desarmam (anulam fatores de virulncia) e destroem bactrias extracelulares (Figura 2). Diversos estudos indicam que as NETs esto presentes em grande quantidade em stios inflamatrios e, alm de atuarem ativamente sobre os microrganismos, servem tambm como uma barreira fsica que impede sua disseminao.

Figura 2 - Imagem de microscopia eletrnica, mostrando as NETs atuando sobre bactrias e cortes ultrafinos, mostrando neutrfilos liberando as NETs ao seu redor (Volker Brinkmann et al., 2004). Macrfagos So clulas teciduais originadas de uma populao especfica de clulas sangneas denominadas moncitos. Os moncitos e os macrfagos so clulas fagocticas eficientes, capazes de engolfar e ingerir patgenos e debris celulares. Fazem parte do repertrio de defesa da imunidade inata, mas atuam tambm como indutores da reposta adaptativa, pois aps a fagocitose podem processar e apresentar antgenos via molculas de MHC, estimulando assim a resposta mediada por clulas T. Os moncitos sangneos, assim como os neutrfilos, podem ser recrutados para stios inflamatrios. Aps migrar do meio intravascular para o tecido eles se diferenciam em macrfagos, sendo atrados por mediadores inflamatrios pelo mecanismo de quimiotaxia. Ao contrrio dos neutrfilos, que possuem meia vida curta, os macrfagos podem permanecer no tecido por meses a anos, atuando como verdadeiras sentinelas desses locais. Na vigncia de invaso microbiana ou dano tecidual sero, juntamente com as clulas dendrdicas e os linfcitos T gd, uma das primeiras categorias de clulas a reconhecer e apresentar o antgeno s clulas da resposta imune adaptativa. Outra funo importante exercida pelos macrfagos a remoo de debris necrticos. A remoo de resduos celulares fundamental para manuteno da homeostasia na inflamao crnica, pois o primeiro estgio da inflamao dominado por granulcitos neutrfilos, muitos dos quais so ingeridos por macrfagos quando mortos ou envelhecidos. Este mecanismo de fagocitose dependente da expresso da molcula CD31 (PECAM-1). O processo de remoo de restos necrticos realizado pelos chamados macrfagos da limpeza , que iro se localizar em regies estratgicas, como pulmo, fgado, tecido neural, osso, bao e tecido conjuntivo. Nestes locais os macrfagos vo atuar ativamente na defesa e manuteno da homeostase local. Os macrfagos so clulas capazes de exercer funes diversas. Alm de participarem dos mecanismos de limpeza, atuam ativamente como clulas apresentadoras de antgenos durante um processo inflamatrio. Tambm potencializam as repostas de clulas T e B via expresso de molculas coestimulatrias e liberao de citocinas pr-inflamatrias, tais como IL -1, IL-6, IL-

12 e TNF-a, bem como outras citocinas e quimiocinas importantes (Figura 3). Os macrfagos possuem uma maquinaria de digesto intracelular muito potente, mediada tanto pelos intermedirios reativos do oxignio, como pelos intermedirios reativos do nitrognio. Os intermedirios reativos do nitrognio tm como principal representante o xido ntrico (NO), que produzido por ao da enzima chamada sintetase do xido ntrico indutvel. Esta enzima no encontrada em macrfagos em repouso, mas pode ser induzida aps ativao via receptores Toll-like em repostas a produtos bacterianos, especialmente na presena de INF-g. No fagolisossomo o NO pode se combinar com o perxido de hidrognio ou com o nion superxido, gerando radicais altamente reativos, como o peroxinitrito, importantes para morte microbiana no fagossomo (Figura 4).

Figura 3 - Caractersticas gerais dos macrfagos na resposta inflamatria com nfase para a fagocitose, ativao celular, com conseqente produo dos mediadores inflamatrios, apresentao de antgenos e estimulao do reparo tecidual. Entretanto, alguns microrganismos, como o Mycobacterium tuberculosis, so resistentes a esses mtodos de digesto e permanecem vivos nos fagossomas de macrfagos por muito tempo. Numa tentativa de controlar o processo infeccioso, essas clulas se tornam grandes e multinucleadas (clulas gigantes). Juntamente com os linfcitos e fibroblastos que se acumulam ao seu redor, as clulas multinucleadas formam os granulomas, que nada mais so que uma alternativa do organismo para impedir a disseminao do microrganismo. Os danos teciduais causados por um processo inflamatrio normalmente so mediados pelas aes do sistema imune contra um determinando imungeno e os produtos antimicrobicidas liberados por macrfagos e neutrfilos. Entretanto, esses danos normalmente so limitados em extenso e durao e so reparados aps eliminao do estmulo causal. Os macrfagos teciduais ativados, alm da ao pr-inflamatria em determinado momento da reposta, tambm atuam tardiamente nos mecanismos de limpeza e reparo tecidual, produzindo citocinas e fatores de crescimento que levam proliferao de fibroblastos, sntese de colgeno (mediada pela ao do TGF-b e do fator de crescimento derivado de plaquetas), formao de novos vasos

e substituio do tecido lesado por tecido conjuntivo (fibrose).

Figura 4 - Papel dos macrfagos na inflamao: aumento da produo de intermedirios reativos de oxignio e nitrognio pela interao com linfcitos Th1 e NKT, tanto mediada por citocinas quanto por molculas de superfcie (CD40 CD40L). Eosinfilos Os granulcitos eosinfilos so clulas importantes no combate a infeces no geral, sendo sua ao antiparasitria (helmintos) uma das mais potentes e eficazes do organismo. So tambm importantes mediadores nas reaes alrgicas e asma. Os eosinfilos se desenvolvem e maturam na medula ssea. Eles produzem e armazenam muitos grnulos proticos secundrios antes de sair da medula. Aps a maturao, os eosinfilos circulam pela corrente sangnea em pequenas quantidades, podendo ser encontrados em maiores nmeros nas regies de mucosas, como do trato gastrointestinal, respiratrio e geniturinrio. Durante a inflamao seu nmero pode aumentar na corrente sangnea e eles podem ento ter acesso aos stios inflamatrios ou stios de infeco por helmintos em reposta ao de quimiocinas, como CCL11 (eotaxina-1), CCL24 (eotaxina-2), CCL5 (RANTES) e leucotrienos (LT). Nesses stios infecciosos e/ou inflamatrios eles so ativados por citocinas Th2 (IL-5, GM-CSF e IL-3) que iro aumentar seu potencial efetor. Uma vez ativados, os eosinfilos induzem ativamente inflamao e combatem a infeco por parasitas. A produo e liberao do contedo dos grnulos catinicos eosinoflicos um dos mecanismos importantes neste processo, denominado de degranulao. Esses grnulos so liberados aps ligao cruzada do receptor para poro Fc da IgE (FceRI) com a IgE ligada ao antgeno alvo. Seu contedo possui grande potencial citotxico sobre parasitas, mas pode tambm causar leso e morte tecidual. A protena bsica principal (PBP), peroxidase eosinoflica (PE) e protena catinica eosinoflica (PCE) so os principais componentes dos grnulos liberados por estas clulas (Figura 5). A protena catinica eosinoflica uma

ribonuclease com propriedade antiviral. A PBP induz a degranulao de mastcitos e basfilos, e est envolvida tambm no remodelamento dos nervos perifricos. As protenas catinicas eosinoflicas criam poros na membrana da clula alvo, permitindo a entrada de outras molculas citotxicas dentro da clula, podendo apresentar aes diversas, tais como: a inibio da proliferao de clulas T, supresso da produo de anticorpos pelas clulas B, induo de degranulao de mastcitos e estmulo a fibroblastos para secreo de muco e glicosaminoglicanos. A peroxidase eosinoflica forma intermedirios reativos do oxignio e do nitrognio que iro promover o estresse oxidativo no alvo, causando morte celular por apoptose e necrose. Alm da ao dos grnulos eosinoflicos, outros mecanismos efetores merecem destaque, como a liberao de mediadores lipdicos prinflamatrios como os leucotrienos (LTC4, LTD4, LTE4) e as prostaglandinas (PGE2). Enzimas, como a elastase, e fatores de crescimento, como TGF-b, fator de crescimento derivado de plaquetas e fator de crescimento de vasos endoteliais, contribuem como mecanismos de remodelao tecidual. Os eosinfilos tambm produzem uma variedade de citocinas que iro contribuir para o processo inflamatrio, entre as quais se listam IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13 e TNF-a.

Figura 5 - Mecanismo de citotoxicidade celular dependente de anticorpo realizado por eosinfilos. Os grnulos eosinoflicos liberados aps ligao cruzada do receptor para poro Fc de IgE (FceRI) com a IgE ligada ao antgeno-alvo (helmintos) possuem grande potencial citotxico sobre os parasitas, mas podem tambm causar leso e morte tecidual. Mastcitos Os mastcitos so clulas mononucleares, teciduais, derivados de clulas progenitoras hematopoiticas CD34 positivas, da medula ssea. Os progenitores migram pela corrente sangnea para os tecidos perifricos e tm seu processo de diferenciao finalizado nos tecidos alvo, o que permite graus especficos de diferenciao de acordo com as caractersticas particulares dos microambientes (Kitamura et al., 1987 a, b). Os mastcitos esto estrategicamente localizados e so particularmente abundantes em reas de contato com substncias exgenas, como mucosas, serosas e pele, em associao a vasos sangneos e linfticos, dentro e prximos a nervos perifricos, e em certas espcies, dentro das cavidades pleural e peritoneal. Portanto, os mastcitos podem interagir com clulas e elementos de vrios tecidos, rgos e cavidades do corpo, onde desempenham um papel primordial nas reaes inflamatrias agudas (Soter et al., 1983). Vrios estmulos podem induzir os mastcitos a liberarem mediadores biologicamente ativos. Estes incluem: interao de antgenos especficos com receptores em sua superfcie produtos sintetizados durante a ativao do complemento substncias bsicas, incluindo algumas derivadas de leuccitos e venenos de animais certos neuropeptdeos e diversos agentes fsicos (trauma mecnico, calor e frio). Embora alguns desses agentes provoquem a liberao de mediadores pela destruio dos mastcitos, muitos causam a liberao dos mediadores por ativao celular e sem dano detectvel. Os mastcitos ativados liberam mediadores potentes capazes de aumentar a permeabilidade vascular e induzir a expresso de molculas de adeso, recrutando leuccitos circulantes, bem como macrfagos, e assim contribuindo para a fase precoce da inflamao. Os mediadores pr-formados incluem a histamina, serotonina, proteinases e

proteoglicanos e os neoformados mediadores lipdicos, como o fator ativador de plaquetas (PAF) e derivados do cido araquidnico, como os leucotrienos e as prostaglandinas. Os mastcitos tambm sintetizam uma srie de interleucinas e fatores de crescimento, como IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-14, IL16, fator de crescimento de fibroblastos, TNF-a (Tumor Necrosis Factor), GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor) e SCF (Stem Cell Factor).

Figura 6 - Ativao dos mastcitos a partir de interaes com microrganismos. Os microrganismos, como bactrias e parasitos ou seus produtos, interagem com receptores especficos na superfcie dos mastcitos, resultando em ativao, com conseqente liberao de mediadores. Um papel protetor importante desempenhado pelos mastcitos na resposta imune inata o combate s infeces bacterianas. Camundongos deficientes em mastcitos so menos eficientes em eliminar as infeces e so mais susceptveis morte por infeco bacteriana aguda do peritnio do que animais sem deficincia. O papel protetor nesse ambiente depende do influxo de neutrfilos para o peritnio mediado pelo TNF-a liberado pelos mastcitos. Os mastcitos possuem mltiplos mecanismos para detectar invases bacterianas, como receptores Toll-like (TLRs) 1, 2, 4 e 6 e receptores especficos, como o CD48 presentes na membrana celular, que ativam os mastcitos, levando liberao de mediadores. O receptor CD48 se liga ao Fim H, expresso nas bactrias Escherichia coli, levando morte da bactria. Alm disso, microrganismos podem ser opsonizados por produtos gerados pela ativao do sistema complemento como o C3a e C5a, tornando-se assim alvos preferenciais dos mastcitos. Como exemplo, temos a bactria Salmonella typhimurium e o parasita Schistosoma mansoni, que so opsonizados pelo iC3b e so reconhecidos pelo receptor CR3 expresso na membrana dos mastcitos. Mediadores solveis derivados de agentes infecciosos, como toxinas e constituintes da parede celular dos microrganismos, tais como os lipopolissacrides (LPS), tambm podem ativar os mastcitos, sendo que os efeitos desses produtos microbianos podem ser extremamente variveis, resultando em ativao e liberao de mediadores responsveis em promover a permeabilidade vascular, quimiotaxia (neutrfilos, basfilos), com conseqente eliminao do microrganismo (Figura 6). O exemplo clssico do envolvimento dos mastcitos est nas reaes alrgicas em que, conjuntamente com o seu equivalente circulante, o basfilo, podem rapidamente, ao contato com o alrgeno, desencadear o mecanismo de hipersensibilidade do tipo I por apresentarem o receptor de alta afinidade para a IgE (FceRI). Aps o estmulo, ocorre a degranulao e liberao de mediadores pr-formados, seguida posteriormente da liberao de mediadores neoformados. A liberao dos mediadores pelos mastcitos induz a migrao de clulas inflamatrias (neutrfilos e macrfagos), aumento da permeabilidade vascular, da secreo de muco, aumento da motilidade gastrointestinal e broncoconstrio, que constituem os sinais e sintomas de alergia e anafilaxia. A grande variabilidade do nmero de mastcitos em diversos stios anatmicos e as evidncias de sua degranulao tm sido observadas em um amplo espectro da resposta imune inata e adaptativa (incluindo a produo de citocinas com funo imuno-reguladora) bem como em grande nmero de patologias relacionadas s doenas. Alm das reaes de hipersensibilidade, os mastcitos tm participao tambm em processos neoplsicos, nas infeces parasitrias e bacterianas,

enfermidades fibrosantes, doenas auto-imunes e na inflamao da sinvia reumatide. A Figura 7 mostra, de maneira ilustrativa, a extraordinria complexidade dos mastcitos quando ativados, suas vias de transduo de sinal, seus mediadores bioqumicos e as conseqncias biolgicas do recrutamento dos mastcitos. Vrios estudos histolgicos tm relatado a presena de mastcitos na sinvia normal humana. Hiperplasia de mastcitos tem sido descrita na membrana sinovial reumatide, entretanto, a causa ainda no est bem estabelecida. Uma possibilidade um aumento do recrutamento de mastcitos e seus progenitores de outros tecidos para o local da junta inflamada, mediado pelo SCF (stem cell factor) e o TGFb1 (transforming growth factor b1), que so substncias quimiotticas. A presena do SCF na sinvia parece ter importante funo, tanto na ativao como no crescimento, diferenciao e sobrevida de mastcitos sinoviais. As funes efetoras dos mastcitos na sinvia sugerem sua participao em diversas vias inflamatrias da artrite, incluindo o recrutamento de leuccitos, ativao e hiperplasia de fibroblastos, angiognese e destruio da cartilagem e do osso (Nigrovic et al, 2005). Em sinovites crnicas, os mastcitos sintetizam mitgenos e citocinas que ativam os fibroblastos, atraem macrfagos e promovem a angiognese, levando a hiperplasia e formao de tecido inflamatrio altamente celular e invasivo (pannus). Os mastcitos tambm participam da destruio das juntas por induo dos fibroblastos e condrcitos a secretarem metaloproteinases de matriz e por promoo direta e indireta da diferenciao de osteoclastos. De fato, a participao de mastcitos com atividade quimiottica tem sido relatada em vrias condies clnicas auto-imunes, incluindo a artrite reumatide, sndrome de Sjgren, esclerose sistmica, doenas auto-imunes da tireide, urticria crnica, pnfigos e aterosclerose. Classificao da resposta inflamatria A resposta inflamatria em geral benfica ao organismo, resultando na eliminao de microrganismos por fagocitose, lise pelo sistema do complemento, diluio ou neutralizao de substncias irritantes ou txicas pelo extravasamento local de fluidos ricos em protenas, e pela limitao da leso inicial pela deposio de fibrina. Em algumas situaes, entretanto, esse processo pode ter conseqncias indesejveis como, por exemplo, nas reaes alrgicas e nas doenas auto-imunes. As reaes inflamatrias mediadas pelo sistema imune, tambm denominadas reaes de hipersensibilidade, so classificadas de acordo com o mecanismo desencadeador (Quadro 4). As reaes de hipersensibilidade imediata (tipo I) so caracterizadas pela presena de IgE e em geral desencadeadas por um antgeno externo (alrgeno). Podem se apresentar de forma sistmica, envolvendo mltiplos rgos, ou de modo mais restrito como na urticria e na rinite alrgica. A interao entre o alrgeno e a IgE pr-formada e pr-fixada a receptores de superfcie de mastcitos e basfilos resulta na liberao de mediadores como histamina e na sntese de mediadores lipdicos como os derivados do cido araquidnico. As rinites alrgicas, asma e reaes anafilticas so exemplos das reaes tipo I.

Figura 7 - Viso geral dos eventos associados ativao dos mastcitos. As

conseqncias biolgicas da ativao dos mastcitos variam conforme os subtipos dos mastcitos, estmulo ativador e tecidos adjacentes FGF: fator do crscimento de fibroblastos VEGF: fator de crescimento do endotlio vascular SCF: fator de clulatronco TGF-b: fator do crescimento transformador-b TNF-a: fator de necrose tumoral a IL: interleucina LT: leucotrieno PAF: fator ativador de plaquetas PG: prostaglandina MHC: complexo de histocompatibilidade principal GM-CSF: fator estimulador de colnias de granulcitos e macrfagos. As reaes do tipo II dependem da produo de anticorpos das classes IgG e IgM contra um dado antgeno. O fato de a resposta humoral causar dano em vez de proteo depende da natureza do antgeno e do isotipo da imunglobulina formada. Os mecanismos de dano associados com as reaes de tipo II incluem: 1) lise de clulas que apresentam o antgeno na sua superfcie por ativao do sistema complemento 2) destruio por clulas NK que apresentam receptores Fc para IgG e realizam citotoxicidade mediada por anticorpo e 3) liberao de enzimas lticas e citocinas por neutrfilos e macrfagos ativados pela ligao de receptores Fc para IgG. As reaes tipo III so causadas pela formao de imunocomplexos (IC) antgenoanticorpo, que se depositam nos tecidos e ativam o sistema complemento. Os anticorpos envolvidos precisam ser capazes de ativar complemento, o que inclui IgM, IgA e todas as subclasses de IgG exceto IgG4. Os IC circulantes podem se depositar em vasos, membrana basal de glomrulos e articulaes, levando ativao do complemento e resultando em inflamao tecidual, podendo ser traduzida por exantema, eritema nodoso, vasculite, nefrite, pneumonite e artrite. Esse tipo de reao de hipersensibilidade encontrado em vrias doenas autoimunes como lpus eritematoso sistmico e formas graves de artrite reumatide. As reaes do tipo IV, ou de hipersensibilidade tardia, so mediadas por linfcitos T, macrfagos e moncitos. Linfcitos T citotxicos (CD8) causam dano tecidual direto enquanto linfcitos T auxiliadores (CD4) secretam citocinas que ativam e recrutam T citotxicos, moncitos e macrfagos. Os macrfagos so os responsveis pela magnitude da leso tecidual e pela formao de granulomas caractersticos da persistncia do agente infeccioso ou corpo estranho. Exemplos clssicos de reao do tipo IV so a tuberculose e a hansenase em sua forma tuberculide. Vasculite de clulas gigantes e arterite de Takayasu tambm parecem decorrer de mecanismos relacionados a hipersensibilidade do tipo IV.

Terapia biolgica e inflamao Agentes biolgicos so compostos de origem biolgica, como anticorpos monoclonais e protenas recombinantes, desenhadas e modificadas de forma a interagir com molculas estratgicas na modulao da resposta inflamatria e imunolgica. So freqentemente empregados, com sucesso, para minimizar o processo inflamatrio em diferentes doenas auto-imunes. Os principais alvos dos anticorpos monoclonais e protenas recombinantes so citocinas pr-inflamatrias, receptores de membrana e componentes do sistema complemento. Agentes biolgicos contra IL1 O anakinra um anlogo recombinante no glicosilado do antagonista do receptor da IL-1 (IL-1Ra) humano. O IL-1Ra um antagonista competitivo do receptor da

citocina pr-inflamatria IL-1. O IL-1Ra fisiologicamente produzido em resposta produo de IL-1 e compete com a IL-1b pela ligao com os receptores da IL-1 do tipo I, inibindo seus efeitos biolgicos. O anakinra foi inicialmente estudado na artrite reumatide, em diversos ensaios clnicos, e teve sua aprovao pelo FDA (Food and Drug Administration), em 2001, para casos refratrios a uma ou mais drogas modificadoras de doena na artrite reumatide (DMARDs). Anakinra pode ser usado como monoterapia ou em associao com metotrexato. A meia-vida do anakinra bastante curta (5,9 horas), o que pode proporcionar menor perfil de efeitos colaterais, porm com menor eficcia em alguns pacientes. O verdadeiro papel do anakinra na artrite reumatide ainda est por ser estabelecido, principalmente aps o advento de outros agentes biolgicos. Todavia, novos estudos tm demonstrado bons resultados com seu uso em indivduos com doena de Still do adulto, na forma sistmica da artrite idioptica juvenil, em sndromes auto-inflamatrias (por exemplo, febre familiar do Mediterrneo, tumor necrosis factor receptor associated periodic syndrome TRAPS, sndrome de MuckleWells), na sndrome de Schnitzler, entre outras. O moderado efeito teraputico do anakinra surpreendeu os pesquisadores em vista do papel central da IL-1 na fisiopatologia da inflamao na artrite reumatide. Por esse motivo, outros agentes antagonistas dos efeitos da IL-1 esto em desenvolvimento, entre os quais se destacam o receptor solvel tipo I da IL-1 (sIL1R1), IL-1Trap (protena de fuso que se liga ao receptor tipo I da IL-1 e protena acessria do receptor da IL-1 inibindo-os) e o prainacasan, um inibidor sinttico da enzima conversora de interleucina (ICE) ou caspase-1, a enzima que libera a forma ativa de IL-1 e IL18 a partir de seus precursores. Agentes biolgicos contra TNFa Os agentes anti-TNFa so os principais medicamentos biolgicos utilizados na reumatologia na atualidade. Seus representantes so o etanercepte, o infliximabe e o adalimumabe. O etanercepte uma protena de fuso obtida pela ligao do receptor p75 do TNF frao Fc da IgG por tcnicas de biologia molecular. O etanercepte liga-se a molculas de TNFa circulantes, inibindo a ligao com seu receptor e evitando os efeitos biolgicos do TNFa e do TNFb (linfotoxina). O etanercepte no causa citotoxidade de clulas que expressam o TNFa. O infliximabe um anticorpo monoclonal anti-TNFa quimrico, ou seja, com uma poro de IgG1k humana e uma regio murina Fv, oriunda de anticorpos murinos neutralizadores de alta afinidade anti-TNFa humano. O infliximabe se liga tanto ao TNFa livre quanto ao TNFa ligado superfcie celular, induzindo a lise dessas clulas por citotoxidade mediada por anticorpos. Diferente do etanercepte, o infliximabe no se liga ao TNF-b. O adalimumabe um anticorpo monoclonal antiTNFa IgG1 recombinante totalmente humano que tem meia vida prolongada e necessita de administrao subcutnea menos freqente. Em tese, tem ao semelhante do infliximabe. Etanercepte, infliximabe e adalimumabe so agentes bastante estudados e aprovados no tratamento da artrite reumatide, artrite idioptica juvenil, espondilite anquilosante e da artrite psoritica. A associao desses agentes antiTNFa ao metotrexato se mostrou mais eficaz que a monoterapia em pacientes com artrite reumatide. No tratamento da doena de Crohn, o infliximabe e o adalimumabe tambm se mostraram eficazes em algumas situaes especficas. Uma segunda gerao de agentes anti-TNFa est em avaliao em diferentes estudos. Esses agentes incluem certolizumabe pegol (CDP870), lenercepte, pegsunercepte e onercepte. O certolizumabe pegol (CDP870) o fragmento da poro Fab de um anticorpo monoclonal anti-TNFa humanizado ligado ao polietilenoglicol, que vem sendo estudado em pacientes com artrite reumatide e doena de Crohn. Devido a sua meia vida longa, o certolizumabe pegol pode ser

administrado mensalmente por via subcutnea. O lenercepte uma protena recombinante de fuso que consiste de dois receptores p55 solveis do TNFa (domnio extracelular) ligados frao Fc da IgG1. Esse agente foi originalmente desenvolvido para o tratamento da artrite reumatide e da sepse. Entretanto, o lenercepte no foi superior ao metotrexato no tratamento de pacientes com artrite reumatide e no melhorou a evoluo na sepse. Na esclerose mltipla, o lenercepte aumentou a freqncia de reativaes. Esses resultados negativos desestimularam mais pesquisas para avaliar a eficcia desse agente anti-TNFa. O pegsunercepte formado pelo receptor I solvel p55 monomrico recombinante do TNFa (sTNFr1) ligado ao polietilenoglicol (PEGsTNFr1) para aumentar sua meia vida. Esse agente foi avaliado em pacientes com artrite reumatide e se mostrou superior ao placebo em estudos fase II. O CDP571 um anticorpo monoclonal humanizado anti-TNFa que foi avaliado em diversos ensaios clnicos em pacientes com doena de Crohn e apesar de bem tolerado, no se mostrou eficaz na induo de resposta ou na manuteno da remisso. Apesar de o CDP571 reduzir os nveis de PCR e de IL-6 em pacientes com artrite reumatide, os benefcios clnicos desse agente ainda no foram bem descritos. O onercepte o receptor solvel p55 recombinante do TNFa que vem sendo estudado no tratamento da psorase moderada a grave. Esse agente no se mostrou eficaz na terapia de induo da doena de Crohn. Agentes biolgicos contra IL6 A IL-6 uma citocina que atua em diferentes clulas, sendo encontrada em altos nveis em diversas doenas inflamatrias. A IL-6 estimula hepatcitos a produzirem protenas de fase aguda, como a protena C reativa, o fibrinognio, a protena amilide A, ao mesmo tempo em que diminui a produo de albumina. Recentemente, foi descrito que a IL-6 estimula a produo do peptdeo hepcedina que participa da patogenia de anemia associada a quadros inflamatrios. O tocilizumabe um anticorpo monoclonal humanizado contra o receptor solvel da IL-6 que inibe os efeitos pr-inflamatrios dessa citocina. Ensaios clnicos tm demonstrado a eficcia desse agente biolgico no tratamento da artrite reumatide, da artrite idioptica juvenil e na doena de Castleman. Agentes biolgicos contra fraes do complemento O eculizumabe um anticorpo monoclonal humanizado anti-C5 que se liga subunidade 2b da enzima C5 convertase e bloqueia a clivagem do C5, impedindo assim a gerao do componente pr-inflamatrio C5a e a formao do complexo de ataque de membrana C5b-C9. Esses efeitos resultam na inibio da resposta inflamatria exudativa e da lise celular. O eculizumabe comprovadamente eficaz no tratamento da hemoglobinria paroxstica noturna. O eculizumabe foi estudado em modelo experimental de sndrome antifosfolpide e demonstrou diminuio da freqncia de reabsoro fetal em ratas prenhas em relao ao grupo controle, sugerindo participao importante do sistema complemento na patogenia da perda gestacional na sndrome antifosfolpide. O pexelizumabe um anticorpo monoclonal humanizado de alta afinidade para o componente C5, inibindo tambm a clivagem deste pela C5 convertase. Esse agente biolgico vem sendo estudado em pacientes com infarto agudo do miocrdio, mas no demonstrou efeito sobre a reduo da rea do infarto em pacientes submetidos angioplastia primria e dados sobre seu efeito na reduo da mortalidade no infarto agudo do miocrdio so controversos.

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