UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA GUIAS DE LABORATORIO DIAGNSTICO DE TUBERCULOSIS Y LEPRA Profesora Martha Murcia

Aranguren

INTRODUCCIN El gnero Mycobacterium est constituido por bacilos cido alcohol resistentes (baar), que se colorean con la coloracin de Ziehl Neelsen (Fig 1), aerobios estrictos, rectos o ligeramente curvos, miden de 1.0 - 10 m de largo por 0.2 - 0.6 m ancho, inmviles, no producen conidios, son catalasa positivo con pocas excepciones, como es el caso de algunas cepas de M. tuberculosis con alta resistencia a isoniazida. En general son bacterias de lento crecimiento (se desarrollan despus de 7 das de incubacin), su tiempo de generacin (G) vara para las diferentes especies, en micobacterias lentas crecedoras es de 12 a 54 horas, por lo cual las colonias en los cultivos aparecen varias semanas despus de su siembra. El tiempo de generacin de las micobacterias crecedoras rpidas es de 3 horas, visualizndose su desarrollo antes de 7 das. La tuberculosis (TB) es considerada como un problema de salud pblica a nivel mundial. De acuerdo a estimacin de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), en el ao 2009 se presentaron 9.400.000 casos nuevos de TB en el mundo para una incidencia mundial de 137 casos por 100.000 habitantes, de los cuales 1.000.000 correspondi a individuos infectados por el VIH; la prevalencia de la enfermedad fue de 14 millones y el nmero de muertes fue de 1.3 en pacientes VIH negativos y

380.000 en VIH positivos. Las regiones y pases del mundo que presentaron el mayor nmero de casos fueron: India, China, Sudfrica, Nigeria e Indonesia. El continente asitico proporcion el 55% de los casos, frica el 30%, Europa el 4%, Europa del este el 7% y el continente americano el 3%. La problemtica de la TB a nivel mundial se ha visto agravada por la aparicin cada vez ms frecuente de cepas resistentes a isoniazida y rifampicina, es decir multidrogorresistentes (MDR) y aun peor a la aparicin de cepas extremadamente resistentes (XDR) que corresponden a cepas que adems de ser MDR son resitentes a los medicamentosa ms efectivos de segunda lnea (cualquier fluoroquinolona y a uno de tres medicamentos inyectables Amikacina, Kanamicina o Capreomiccina). De acuerdo a la OMS en2008 se presentaron 440.000 casos MDR (390.000 - 502.000). A 2010 69 pases del mundo ya haban reportado al menos un caso de TB-MDR. En Colombia de acuerdo al Ministerio de la Proteccin Social para el ao 2008 se presentaron 11.342 casos nuevos, con una incidencia de 25,6 casos por 100.000 habitantes. De acuerdo al DANE la tasa de mortalidad por TB para el ao 2006 fue de 2.5/100.000 habitantes; es la cuarta causa de mortalidad por enfermedades transmisibles, lo que equivale al 10% (n = 13.581) de las muertes por estas patologas. De acuerdo a un estudio realizado por el Instituto Nacional de Salud 2004 -2005, la multidrogorresistecia (MDR), definida como resistencia a Isoniazida y Rifampicina, en pacientes no tratados fue de 2.38% (IC 95%: 1,58-3,57), mientras que en individuos previamente tratados fue 31,44% (IC 95%: 26,14-37,27). DIAGNSTICO DE LA TUBERCULOSIS Estudio bacteriolgico: El diagnstico de la tuberculosis (TB), depende de la demostracin del organismo causante en las secreciones o tejidos de individuos enfermos, sin embargo existen limitaciones para su deteccin.

El M. tuberculosis, est presente en nmero relativamente grande en paciente con tuberculosis pulmonar avanzada, pudindose detectar en el esputo, siendo difcil obtener muestras en pacientes con tuberculosis extrapulmonar y en nios quienes normalmente no pueden expectorar. Mediante el examen directo "Baciloscopia" se puede realizar el diagnstico de la TB pulmonar, con una especificidad cercana al 100% y con una sensibilidad que puede oscilar entre el 20% - 80%, dependiendo de la prevalencia de la tuberculosis en la regin en donde se realiza el mtodo. En la baciloscopia de esputo, la muestra debe recogerse en la maana al despertarse el paciente, ya que durante la noche se acumula gran cantidad de secrecin bronquial en el aparato respiratorio la cual sale con facilidad al empezar a toser el enfermo. La muestra debe provenir del sitio de la lesin, es decir del interior de los pulmones, por lo que no debe ser ni secrecin nasofarngea, ni saliva; debe ser recolectada en un recipiente desechable de boca ancha, preferiblemente transparente. Si es difcil recoger las muestras de esputo diariamente durante los 3 das, se debe recoger la primera muestra en el momento de la consulta, la segunda muestra al despertarse el segundo da y la tercera cuando el paciente entrega la segunda muestra. El mdico debe ordenar baciloscopia seriada de esputo a todo individuo sintomtico respiratorio es decir a todo paciente que tosa y expectore por ms de 15 das. La baciloscopia es el procedimiento de eleccin para el diagnstico, pero su sensibilidad es baja ya que deben existir entre 5.000 a 10.000 bacilos por mililitro de muestra, para que los bacilos cido alcohol resistentes (baar) puedan ser observados al microscopio. Si las muestras se concentran por centrifugacin se aumenta la sensibilidad del mtodo. Cuando las baciloscopias de esputo son

negativas se realiza el cultivo, tambin est indicado realizar un procedimiento invasivo que es la broncoscopia para la obtencin de lavado brocoalveolar y en algunos casos de biopsia bronquial o transbronquial, para examen histolgico y para cultivo. La baciloscopia debe ser seriada, con la primera muestra se detecta el 85% de los individuos tuberculosos, con la segunda muestra el 10%, y con la terceras muestra entre un 3 5%. El cultivo, por su mayor sensibilidad es el mtodo de eleccin para el diagnstico de las tuberculosis paucibacilar, ya sea TB-infantil o TB extrapulmonar. A pesar de las limitaciones y de su demora entre 4 y 8 semanas para su informe, es el mtodo disponible en nuestro medio. El cultivo se utiliza para confirmar el diagnstico hecho por baciloscopia; cuando las dos primeras muestras de baciloscopias son negativas, se debe cultivar la segunda muestra; toda muestra proveniente de pacientes VIH+; en pacientes sintomticos respiratorios contactos de pacientes con TB multidrogorresistente (TB-MDR). El cultivo tambin se debe usar en control de

tratamiento cuando el paciente haya sido diagnosticado mediante cultivo y en los casos en los que hubo fracaso al tratamiento. La lectura del cultivo debe hacerse de la siguiente forma: Lectura (-) Nmero de colonias (+) (++) (+++) Contaminado 1 a 20 colonias 20 100 colonias Ms de 100 colonias separadas Colonias confluentes Desarrollo de microorganismos no cido alcohol resistentes Interpretacin No se observan colonias

BACILOSCOPIA La baciloscopia es la bsqueda microscpica mediante la coloracin de Ziehl Neelsen (ZN) de bacilos cido alcohol resistentes (baar) a partir de cualquier espcimen clnico. Figura 1. Baciloscopia - Coloracin de Ziehl Neelsen

COLORACION DE ZIEHL NEELSEN (ZN) La coloracin de Ziehl Neelsen, se basa en la utilizacin de un colorante bsico (fucsina), el cual se mezcla con el mordiente (fenol), dando lugar a la fucsina fenicada, con la cual se cubre la preparacin, siendo sometida a calentamiento, hasta la emisin de vapores durante 10 minutos y, a la decoloracin por el alcohol cido. Como colorante de contraste utiliza el azul de metileno. La cido alcohol resistencia (AAR) de los microorganismos est dada por su

capacidad para formar complejos cido estables con los colorantes aril-metnicos como la fucsina, una vez formados estos complejos no pueden ser decolorados con el alcohol cido o con cidos minerales. Los colorantes usados son compuestos aninicos en soluciones fenoladas, los bacilos cido alcohol resistentes (baar) se vern rojos si se utiliza fucsina, violeta prpura si se utiliza cristal violeta y amarillo verdoso cuando se utiliza la coloracin fluorescente de auramina O. En el proceso de tincin, la fucsina penetra hasta el citoplasma formando complejos rRNA-colorante, e interacta qumicamente con los cidos miclicos presentes en

la pared de los micobacterias formando complejos cido miclico-colorante, los cuales impermeabilizan la pared e impiden la salida de la fucsina atrapada en dichos complejos en el citoplasma micobacteriano. Si se remueve la pared externa de las micobacterias con alcohol alcalino se perder su cido alcohol resistencia.

DIAGNSTICO DE TUBERCULOSIS EN NIOS Como los nios menores de 5 aos no tienen capacidad de expectorar y adems son paucibacilares el diagnstico de la tuberculosis peditrica es difcil, la muestra de eleccin es el aspirado gstrico en nmero de 3, muestra que reemplaza al esputo. La confirmacin bacteriolgica en los mejores casos llega a un 60% o 70%, quedando un 30% o un 40% sin confirmar. Cuando la bacteriologa es negativa se deben tener en cuenta para el diagnstico 4 criterios: criterio epidemiolgico (antecedentes de contacto con pacientes tuberculosos), clnico (presencia de un cuadro compatible con la enfermedad), tuberculnico (hallazgo de una prueba de tuberculina positiva PPD>10mm) y radiolgico (anormalidades en la radiografa de trax, descartadas otras causas de dichas anormalidades) SUSCEPTIBILIDAD ANTITUBERCULOSAS La resistencia es un fenmeno biolgico dado por la presencia de mutaciones o por seleccin, lo que le permite al microorganismo escapar de la accin de los medicamentos, sobrevivir y multiplicarse. La resistencia puede ser de 3 tipos: Resistencia Natural DE M. tuberculosis A LAS DROGAS

Este tipo de resistencia se presenta en cepas wild type (silvestres) que son naturalmente resistentes a una droga, sin haber estado nunca en contacto con ella. Resistencia Primaria Este tipo de resistencia se presenta en pacientes que no han recibido nunca terapia antituberculosa, pero que se han infectado con una cepa proveniente de un paciente que ha adquirido resistencia. Resistencia Adquirida Este tipo de resistencia es el producto de la seleccin de mutantes resistentes producidas por el medicamento como consecuencia de la aplicacin de una terapia inadecuada, ocasionada por tratamientos errneos o por falta de adherencia del paciente al tratamiento. En Colombia, el mtodo ms utilizado para establecer la sensibilidad o la resistencia de una cepa de Mycobacterium tuberculosis a las drogas antituberculosas, es el de las proporciones mltiples de Cannetti, Rist y Grosset, en su versin simplificada. Este mtodo emplea el medio de Lowenstein Jensen (LJ) con y sin drogas. El medio sin drogas (control) permite conocer el nmero total de la poblacin bacilar sembrada y el medio con drogas, permite determinar el nmero de mutantes resistentes. La cepa a estudiar debe tener buen crecimiento (mnimo 10 colonias) y por lo menos 30 das de desarrollo. Cuando el nmero de colonias en el cultivo es menor de 10, debe anotarse con qu nmero de colonias se hizo. Este mtodo, se basa en la concentracin crtica de cada droga, que corresponde a la cantidad precisa de cada frmaco que debe contener el medio que es capaz de inhibir una cepa silvestre. La Proporcin crtica o criterio de resistencia, es frmaco. la proporcin de mutantes resistentes, de una poblacin bacilar por encima de la cual la cepa es considerada resistente al Es decir si ms de 1% de la poblacin bacteriana crece a la concentracin crtica de la droga, la cepa se considera resistente, los resultados estn disponibles de 4 - 6 semanas.

El mtodo de las proporciones consiste en

calcular la proporcin de bacilos

resistentes presentes en una cepa. La razn entre el nmero de colonias en medio con medicamentos y el nmero de colonias en medio libre de medicamentos indica la proporcin de bacilos resistentes en la cepa. Concentracin crtica de drogas Medicamento Isoniazida Estreptomicina Rifampicina Etambutol Concentracin crtica ug/ml 0.2 4.0 40.0 2.0 1 1 1 1 Proporcin crtica %

Concentracin de las drogas en LJ antes de la coagulacin

Contar cuidadosamente las colonias en los tubos control en las series en que es posible hacerlo, se calcula la media del recuento en los dos tubos. En la misma serie que se contaron las colonias de los controles, se cuentan las colonias en los tubos con drogas, este dato indica el nmero de mutantes resistentes a cada uno de los frmacos analizados. Clculo de mutantes resistentes: el porcentaje de resistencia a cada medicamento se calcula mediante la siguiente frmula; Numero de colonias en el tubo con medicamento X 100 Numero de colonias en el tubo sin medicamento Comparando este porcentaje con la proporcin crtica establecida (1%) para cada frmaco, se determina si la cepa es sensible o resistente. Los tubos se leen a las 4 semanas (28 das) y a las 6 semanas (42 das). La lectura a los 28 das solo es definitiva para aquellos frmacos a los cuales la cepa ha sido resistente. La lectura

a los 42 das es la que da los resultados definitivos para los frmacos a los cuales la cepa problema es sensible. Los frmacos probados son: Rifampicina (R), Isoniazida (H), Estreptomicina (S) y Etambutol (E). ESQUEMA PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD Controles LJ sin droga

10-3 10-3

10-5 10-5

10-6 10-6

LJ con droga LJ-R LJ-H LJ-S LJ-E

10-3 10-5

10-3 10-5

10-3 10-5

10-3 10-5

DIAGNSTICO DE LEPRA La Organizacin Mundial de la Salud (OMS), en 1.980, en su Gua para la lucha antileprosa expres: Si hay un diagnstico que no pueda formularse sin tener la absoluta certeza, es el de la lepra. Si existe la ms mnima duda en el diagnstico, el enfermo debe mantenerse en observacin hasta que nuevos datos confirmen la enfermedad. Esto evitar el dao sicolgico, social y de otro tipo que podra causrsele innecesariamente en caso de diagnstico equivocado

EXAMEN CLNICO El diagnstico de la lepra se basa la historia clnica y en el examen clnico detallado y completo, en el cual debe observarse las caractersticas de la lesiones drmicas, su distribucin o simetra, las alteraciones neurolgicas, ya que se pierde primero la sensibilidad trmica y dolorosa, luego la tctil. La Baciloscopia para lepra se utiliza para la clasificacin bacteriolgica de los pacientes con lepra en: paucibacilares (ndice bacilar igual a 0) y multibacilares (ndice bacilar mayor a 0). En la Baciloscopia para lepra, se deben tomar 5 muestras como mnimo: moco nasal, linfa de oreja derecha, linfa de oreja izquierda, linfa de 2 lesiones si existen o linfa de codos, rodillas o falange proximal del dedo del corazn tanto derecho como izquierdo. Las 5 muestras tomadas se colocan en la misma lmina, se hacen las 5 baciloscopias y se saca el INDICE BACILAR, informando para ello el resultado de cada una de las 5 baciloscopias realizadas, anotando el nmero de cruces de cada sitio para poder obtener el ndice bacilar (I.B), el cual es igual a la suma de las cruces dividido por el nmero de sitios tomados. Este ndice cuando se toman 5 muestras puede oscilar entre 0.2 y 3 para los multibacilares y para los paucibacilares ser 0. Figura 2. Baciloscopia para Lepra

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Lectura: se emplea la misma escala utilizada en la baciloscopia para tuberculosis, leyendo cada una de las 5 baciloscopias.

CLCULO DEL NDICE BACILAR (IB) El ndice bacilar es el promedio de las cruces encontradas en cada una de las baciloscopias de las muestras ledas. Ej. Moco Linfa de lbulo izquierdo Linfa de lbulo derecho Linfa de lesin I Linfa lesin II IB= 3+2+2+1+1 5 En pacientes multibacilares el IB oscila de 0.2 a 3, cuando se utilizan 5 muestras. En los pacientes paucibacilares el IB ser igual a 0. IMPORTANCIA CLINICA La baciloscopia de esputo detecta los enfermos de tuberculosis pulmonar. los cuales se deben buscar entre todos los sintomticos respiratorios (SR), definidos como aquellos pacientes que presentan sintomatologa respiratoria con tos y expectoracin de ms de 15 das de evolucin, a quienes se les debe practicar baciloscopia seriada de esputo (3 muestras de esputo). Este procedimiento de laboratorio tiene importancia diagnstica ya que es el 1.8 +++ ++ ++ + +

examen esencial e insustituible para la deteccin de tuberculosis pulmonar; epidemiolgica ya que detecta los pacientes bacilferos que son los que representan riesgo para la comunidad; en el control del tratamiento, permitiendo seguir el curso de la enfermedad mediante una baciloscopia control mensual y en la evaluacin del programa control de tuberculosis en cada una de las regiones del pas.

La Baciloscopia para lepra se utiliza para la clasificacin bacteriolgica de los pacientes con lepra en: paucibacilares (ndice bacilar igual a 0) y multibacilares (ndice bacilar mayor a 0), este dato junto con la clnica y la histopatologa permitir ubicar a los enfermos en el grupo de lepra indeterminada, tuberculoide, dimorfa o lepromatosa; en el control del tratamiento a administrar; desde el punto de vista epidemiolgico ya que permite conocer si aumentan o disminuyen las fuentes de infeccin, previniendo la aparicin de nuevas fuentes como son las evoluciones de formas indeterminadas a formas lepromatosas; en la evaluacin del programa ya que cuantificando la proporcin de casos nuevos clasificados bacteriolgicamente, la proporcin de pacientes multibacilares sometidos a control bacteriolgico durante el tratamiento y la vigilancia, se puede determinar el funcionamiento del programa en una regin. Los pacientes multibacilares recibirn en su tratamiento 3 drogas: rifampicina, dapsona y clofacimina, durante 2 aos, se vigilarn durante 5 aos, se les practicar baciloscopia cada 3 meses tanto en el periodo de tratamiento como en el de vigilancia, se examinarn sus convivientes cada 6 meses. Los pacientes paucibacilares recibirn como tratamiento 2 drogas: rifampicina y dapsona, durante 6 meses, se les practicar baciloscopia al terminar el tratamiento y al final del perodo de vigilancia, se vigilarn durante 2 aos, se examinarn convivientes una vez al ao. OBJETIVOS: Realizar la coloracin de Ziehl Neelsen (ZN) a partir de muestras de esputo, para diagnstico de TB pulmonarRealizar la coloracin de Ziehl Neelsen (ZN) para clasificar al paciente leproso Leer, informar e interpretar las baciloscopias Determinar el ndice bacilar sus

Observar cultivos de M. tuberculosis, de Micobacterias No Tuberculosas (MNT) cromgenas y no cromgenas

MATERIALES: Extendidos de esputos fijados al calor Hipoclorito de sodio AL 2,5% Mecheros Colorantes de Ziehl Neelsen Lpiz de cera que no sea rojo . Lminas con 5 muestras para diagnstico de lepra Cultivos de M. tuberculosis Cultivos Micobacterias No Tuberculosas (MNT) cromgenas y no cromgenas

MTODOS: Baciloscopia de esputo Lo ideal es procesar las muestras en cmara de flujo laminar tipo IIB. Si no se posee cmara seguir los siguientes pasos. Colocar el papel peridico en la mesa de trabajo (rea contaminada) y rociar desinfectante. Marcar la lmina portaobjeto con el lpiz de cera de color diferente al rojo, utilizando para ello 1/3 parte de la lmina. Colocar el mechero entre la muestra y el operador. Destapar la muestra con el fin de seleccionar la partcula til (la partcula purulenta, con sangre), tomndola con el bajalenguas partido por mitad longitudinalmente y astillado en la punta. Tomar la lmina con los dedos ndice y pulgar en la parte correspondiente tercio de identificacin y comenzar a hacer el extendido. Extender la muestra de manera uniforme SIN LLEGAR HASTA LOS BORDES. Para lograr una pelcula homognea se debe colocar el palo en al

forma horizontal sobre la lmina corrindolo en forma de vaivn, se debe eliminar el sobrante con el mismo palo. descartar el palo en el desinfectante. Dejar secar el extendido a TA. Una vez seco el extendido fijarlo pasndolo rpidamente sobre la llama 3 veces. Colorear los extendidos utilizando la tincin de Ziehl Neelsen. Una vez hecho el extendido

Coloracin de ZN: a- Colocar las lminas a colorear en los soportes y cubrirlas fucsina fenicada de Ziehl Neelsen, previamente filtrada. b- Calentar suavemente con la llama, pasando lentamente el mechero por debajo hasta que se produzca emisin de vapores, evitando que hierva la fucsina. Cuando estos sean visibles contabilizar 10 minutos, dejar de calentar, calentando nuevamente cuando estos desaparezcan. Este procedimiento se repite hasta que se completen los 10 minutos teniendo cuidado de no dejar hervir el colorante y de reponerlo cuando sea necesario. Si ocurre evaporacin del colorante, agregar nuevamente fucsina. c- Dejar enfriar la lmina, descartar la fucsina, lavar con agua corriente. d- Decolorar con el alcohol cido al 3% (v/v) cubriendo la lmina durante 1 minuto y repitiendo el proceso hasta que sea necesario y no se produzca ms desprendimiento de colorante. e- Lavar con agua y cubrir con azul de metileno que es el colorante de contraste durante 2 minutos. f- Lavar suavemente con agua de chorro. Limpiar la parte posterior de la lmina para retirar residuos de colorante que puedan interferir con la lectura. Dejar secar la lmina a TA. g- Colocar una gota de aceite de inmersin, evitando que la punta del gotero entre en contacto directo con el extendido y observar al microscopio. totalmente con

LECTURA E INTERPRETACION: al enfocar la lmina con objetivo de inmersin (100X), los bacilos cido alcohol resistentes se vern rojos sobre un fondo azul. Se debe recorrer la lmina contando el nmero de baar que se observan en cada campo en superficie y en profundidad con ayuda del ajuste micromtrico y colocndo el nmero en cada cuadro de la cuadrcula de 100 cuadros, hasta completar los campos que sean necesarios, de acuerdo a la positividad encontrada, lo cual ser evidente con la lectura de los primeros campos. Recorrer la lmina en lnea recta de izquierda a derecha por el centro hasta el extremo. Baje o suba y regrese de derecha a izquierda.

Aceite de inmersin Luego se suma la cantidad de baar observados y se promedia por el nmero de campos microscpicos observados. Cuando la muestra contiene muy poquitos baar o no tiene ninguno, se deben observar los 100 campos, si la muestra contiene de 1 a 10 baar por campo solo ser necesario contar 50 campos y si la muestra contiene de 10 a 100 baar por campo solo ser suficiente observar 20 campos. Promedio Bacilos por campo Sumatoria baar en 100 campos 100 campos 1.82 = ++

Lectura 5 0 1 4 0 8 1 6 0 2 0 0 0 0 0 0 8 0 3 1 0 0 0 0 4 2 1 4 0 0 1 4 0 4 0 0 0 0 4 0 8 0 6 2 0 5 0 0 0 2 1 0 2 5 6 4 0 6 0 0 0 0 0 7 0 0 7 2 0 0 0 3 9 0 0 3 3 2 0 5 3 8 0 0 0 0 0 5 0 4 7 0 5 0 0 0 2 1 0 0

INFORME: Baciloscopia Negativa: No se observan baar por campo en 100 campos microscpicos observados. Baciloscopia +: Menos de un baar por campo en 100 campos microscpicos observados. Baciloscopia ++: 1 a 10 baar por campo en 50 campos microscpicos observados. Baciloscopia +++: ms de 10 baar por campo en 20 campos microscpicos observados BIBLIOGRAFIA Toman K. Cuntos bacilos hay en una muestra de esputo encontrada positiva en la baciloscopia In OPS/OMS, ed. Tuberculosis. Deteccin de casos y quimioterapia. Washington 1980. OPS/OMS:6-8

Garzn MC, Naranjo NO, Sierra C.R, Llerena C, Orjuela L. Bacteriologa de Mycobacterium tuberculosis y de micobacterias no tuberculosas. INS; 2001 Centers for Disease Control US. Department of Health and Human Services. Public Health Mycobacteriology . A Guide for the level III Laboratory 1985 Harry D Isemberg. Mycobacteriology in Clinical Microbiology Procedures. Handbook. Washington. ASM 1992 OMS/OPS. Manual de Bacteriologa de la tuberculosis. Tcnicas y procedimientos bsicos 1973. CAP 5:76 WHO. 2006. Diagnostics for tuberculosis. Global demand and market potential Ministerio de la Proteccin Social.2009. Gua de atencin integral de la Tuberculosis Pulmonar y Extrapulmonar D J, Deeks J, Kunst H, Gibson A y col. A systematic review of rapid diagnostic tests for the detection of tuberculosis infection. Health Technology Assessment 2007; Vol. 11: No. 3 WHO. Towards Universal access to diagnosis and treatment of multidrugresistant and extensively drug resistant tuberculosis by 2015. 2011.