BIOCHIMIE II (Biochimie-Biologie molculaire) Travaux dirigs de Biologie Molculaire (Fvrier 2008) Pr Yves MOREL
QUESTION N 1 (1 point) La coupure de l'ADN gnomique par l'enzyme de restriction Taq 1 donne en autre un fragment de 600bp englobant un gne A. Par la mthode de Southern une seule bande est rvle. Quelle quantit d'ADN reprsente cette bande si 10 g a t dpos ? A 20 ng B 20 pg C 0,2 pg D 5 pg E 2 pg QUESTION N2 (1 point) Le gnome humain contient des squences rptes et uniques. Parmi les squences suivantes, lesquelles sont considres comme uniques ? A squence crant un RFLP (restriction fragment length polymorphism) B squence Alu C squence transcrite par la RNA polymrase de type I D squence codant pour un ARN 5S E squence transcrite par la RNA polymrase de type II
QUESTION N3 A la suite d'une prise de sang sur anticoagulant, l'extraction de l'ADN se fait partir A - du srum B - des plaquettes C - des leucocytes D - du plasma E - des globules rouges
La figure ci-dessous reprsente schmatiquement un gne eucaryote. Rpondez aux 4 questions suivantes.
QUESTION N 4 O se trouve le site d'initiation, ATG ? QUESTION N 5 O se trouve le site de polyadnylation ? QUESTION N 6 O se trouve le site d'initiation de la transcription ? QUESTION N 7 O se trouve le codon stop ? QUESTION N 8 Dans le muscle, l'expression du gne ci-dessus (figure avant la question 6) diffre de celle observ dans les autres tissus, l'ARN messager est constitu des exons 2-3-4-5 et 6. On en dduit : A l'existence d'un promoteur diffrent dans le muscle B l'existence d'une modification post transcriptionnelle: une dition C l'obtention d'une protine de taille diffrente D la prsence d'un codon stop dans l'exon 2. 5' 3' 1 2 3 4 5 6 1'' 2' 3' 4' C E D A B 5' 2 QUESTION N 9 L'ADN mitochondrial : A est transmis surtout par le pre B code pour toutes les protines mitochondriales C est circulaire D n'a pas d'intron E les mutations de cet ADN se traduisent cliniquement surtout par des atteintes musculaires et encphaliques QUESTION N10 Parmi les molcules suivantes, lesquelles sont utilises pour marquer radioactivement l'extrmit 5' d'un oligonuclotide ? A T7 DNA polymrase B o- 32 P-dATP C - 32 P-dATP D - 32 P-ATP E T4 polynuclotide-kinase
QUESTION N11 (1 point) Pour marquer radioactivement une sonde d'ADN par la mthode de multi-amorage au hasard "multi- random priming", on utilise A T4 polynuclotide-kinase B o- 32 P-dCTP C o- 32 P-CTP D - 32 P-CTP E Fragment de klenow
QUESTION N 12 (2 points) Pour mettre en vidence de longs remaniements de l'ADN gnomique, la mthode de Southern est frquemment utilise. Parmi les propositions suivantes, quelles en sont les tapes par ordre chronologique ? 1- Lavage selon des conditions de stringence lies la nature de la sonde 2- Transfert sur une feuille de nylon 3- Migration sur un gel d'agarose 4- Autoradiographie 5- Dnaturation de l'ADN de sujets normaux et de patients 6- Hybridation avec une sonde marque au 32 P 7- Digestion par une enzyme de restriction 8- Extraction de l'ADN de sujets normaux et de patients
A 8 - 5 - 7 - 3 - 2 - 6 - 1 - 4 B 8 - 7 - 5 - 3 - 2 - 6 - 1 - 4 C 8 - 7 - 3 - 6 - 2 - 1 - 5 - 4 D 8 - 7 - 3 - 6 - 2 - 5 - 1 - 4 E 8 - 7 - 3 - 5 - 2 - 6 - 1 4 QUESTION N 13 La mthode de Southern est couramment utilise pour tudier un gne de 3000 bp comme celui codant pour la 21-hydroxylase, enzyme uniquement surrnalienne.
A - L'ADN des sujets est extrait des leucocytes, digr par un enzyme de restriction, spar par lectrophorse et transfr sur une feuille de nylon aprs dnaturation par la soude. B - Le gne tudi reprsente un millionnime du gnome haploide humain. C - Le gne tudi reprsente un 1/100000ime du gnome haploide humain. D - On utilise une sonde marque au 32 P provenant d'une librairie d'ADNc de leucocytes. E - Cette mthode ne permet pas de mettre en vidence une dltion de 8 paires de base. 3 QUESTION N14 Aprs avoir digr l'ADN d'un sujet par l'enzyme de restriction Eco RI, le gne ci-dessous est tudi par la mthode de Southern. Ce gne est reprsent schmatiquement: les rectangles noirs reprsentent les exons, les flches les sites de restriction de l'enzyme Eco RI, le nombre en kilobases (kb) entre deux flches correspond la distance entre deux sites de restriction.
Une seule combinaison ci-dessous correspond l'ensemble des fragments s'hybridant avec une sonde rprsentant tout l'ADN complmentaire de ce gne :
QUESTION N15 Si le sujet tudi ci-dessus tait homozygote pour une dltion de l'exon 3 qui n'abolit pas de site Eco RI, on dtecterait par rapport au rsultat de la question prcdente :
A - aucun changement B - un fragment suprieur 4,5kb avec absence des fragments 4,5 kb et 3 kb C - un fragment suprieur 4,5kb avec absence du fragment 4,5 kb D - un fragment infrieur 4,5kb avec absence des fragments 4,5 kb et 3 kb E - un fragment infrieur 4,5kb avec absence du fragment 4,5 kb
QUESTION N16 (2 points) A l'aide des deux squences ci-dessous, il est possible de voir qu'il existe un intron. Squence d'une partie d'un gne : 1 6 11 16 21 81 86 91 5' AGGCA GCACA AGGTG GGGAC TGTCC.......CCA TAGCAG GAGA GCCTC 3'
Squence de l'ADN complmentaire qui correspond cette partie du gne :
5' AGGCA GCACA AGGAG AGCCTC 3' Par quels nuclotides commence et finit cet intron?
A - 11.......84 B - 14.......87 C - 12.......85 D - 13.......86 E - 22.......86
QUESTION N17 Pour isoler l'ADN complmentaire de la proopiomlanocortine, on utilise:
A - une banque gnomique B - une banque d'ADN complmentaire hpatique C - une banque d'ADN complmentaire hypothalamique D - une banque d'ADN complmentaire de leucocytes E - une banque d'ADN complmentaire d'anthypophyse 5' 3' 2,6 kb 1,5kb 3,5kb 4,5kb 1 2 4 3 3kb 1kb 4 QUESTION N 18 (2 points) Un fragment Bgl II-Xba I d'ADN humain reprsentant un gne a t isol partir d'une librairie gnomique. Pour en faire la carte de restriction et le squenage, on veut le sous cloner dans un plasmide de 3 kb. Le site de clonage comprend plusieurs sites uniques d'enzymes de restriction dont la localisation de 5' vers 3' est la suivante: Eco RI - Bam HI - Xba I - Sac I - Hind III. On rappelle les sites de reconnaissance et de coupure des enzymes suivants : Site Bam HI 5' G + G A T C C 3' Site Bgl II 5' A + G A T C T 3' 3' C C T A G | G 5' 3' T C T A G | A 5'
Site Eco RI 5' G + A A T T C 3' Site Xba I 5' T + C T A G A 3' 3' C T T A A | G 5' 3' A G A T C | T 5'
A le sous-clonage est impossible B le sous-clonage ncessite la coupure du plasmide par Eco RI C le sous-clonage ncessite la coupure du plasmide par Eco RI et Xba I D le sous-clonage ncessite la coupure du plasmide par Bam HI et Xba I E le sous-clonage ncessite la coupure du plasmide par Xba I QUESTION N 19 (3 points) Les rsultats obtenus aprs digestion de ce plasmide recombinant avec diverses enzymes de restriction sont les suivants : - avec Xba I : un fragment de 10 kb - avec Eco RI : un fragment de 10 kb - avec Sac I : deux fragments de 4 kb et de 6 kb On en dduit : A le fragment gnomique insr est de 3 kb B le fragment gnomique insr est de 7 kb C le fragment gnomique insr contient 2 sites Sac I D le fragment gnomique insr contient 1 site Sac I E le fragment gnomique insr peut tre rcupr par une digestion simultane Eco RI et Xba I
QUESTION N20 (2 points) On utilise la mthode de PCR pour dterminer si un sujet est porteur d'une mutation d'un gne responsable d'une maladie gntique. Voici la liste des produits et de mthodes pouvant tre utiliss 1- Taq polymrase 2- l'enzyme de restriction Taq I 3- ADN gnomique 4- dnaturation -hybridation des amorces- extension (25 cycles) 5- hybridation des amorces-dnaturation de l'ADN gnomique- extension (25 cycles) 6- dsoxynuclotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 7- didsoxynuclotides (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) Parmi les propositions suivantes, laquelle permettra d'amplifier ce fragment ? A on met dans le mme tube (3 + 1 + 7) puis on ralise 4 B on met dans le mme tube (3 + 1 + 6) puis on ralise 5 C on met dans le mme tube (3 + 2 + 7) puis on ralise 4 D on met dans le mme tube (3 + 2 + 7) puis on ralise 5 E aucune solution juste QUESTION N21 Parmi les molcules suivantes, lesquelles sont utilises pour amplifier un fragment d'ADN humain par la mthode de PCR ? A - l'ADN humain B - oligonuclotides servant d'amorces C - l'enzyme de restriction Taq I D - des ribonuclotides E - la Taq polymrase 5 QUESTION N22 Les produits de PCR amplifis donnent sur un gel d'agarose un profil qui diffre selon la concentration en MgCl 2 utilise:
[1], concentration en MgCl 2 utilise pour obtenir le profil 1, [2].....pour le profil 2, [3] ...... D'aprs les trois profils, vous pouvez dduire que
A - [1] < [2] < [3] B - [2] < [1] < [3] C - [3] < [2] < [1] D - [2] < [3] < [1] E - [1] < [3] < [2]
QUESTION N23 Les produits de PCR amplifis donnent sur un gel d'agarose un profil qui diffre selon la temprature utilise:
T1, temprature utilise pour obtenir le profil 1, T2.....pour le profil 2, T3 ...... D'aprs les trois profils, vous pouvez dduire que
A - T1 < T2 < T3 B - T2 < T1 < T3 C - T3 < T2 < T1 D - T2 < T3 < T1 E - T2 = T3 < T1 QUESTION N24
Pour trouver les meilleures conditions d'amplification spcifique d'un fragment d'ADN de 500 bp par la mthode de PCR, on fait varier un seul paramtre, la temprature. De quelle temprature s'agit-il? A - de la temprature de dnaturation de l'ADN B - de la temprature d'extension des amorces C - des tempratures de dnaturation et d'hybridation des amorces D - de la temprature d'hybridation des amorces E - des tempratures de dnaturation et d'extension des amorces
Cette figure reprsente le gne d'une protine enzymatique qui prsente un peptide signal. O commence la squence nuclotidique qui code pour ce peptide signal (utilisez la nomenclature donne en cours) ?
QUESTION N 26 (3 points)
On ralise un Western blot pour tudier l'expression de ce gne dans le foie et le muscle. Deux anticorps sont utiliss: l'anticorps monoclonal 1 est dirig contre l'pitope cod par l'exon 5 qui contient la squence du site actif; l'anticorps monoclonal 2 est dirig contre l'pitope cod par l'exon 3. Ces deux anticorps sont des anticorps de souris. A noter qu'on observe la mme activit enzymatique dans les deux tissus, mais avec une rgulation diffrente. Le transcrit primaire du gne ci-dessus est identique dans les deux tissus. Ci dessous, la liste de diffrentes tapes exprimentales permettant d'tudier une protine (des tapes intermdiaires peuvent ne pas tre cites).
1- Autoradiographie 2 - Transfert sur une membrane de nylon ou nitrocellulose 3 - Incubation avec un anticorps anti-anticorps de souris marqu l'iode radio-actif 4 - Biopsie du tissu 5 - Gel-filtration 6 - Electrophorse en utilisant un gel SDS-acrylamide avec mercaptothanol. 7 - Incubation avec soit l'anticorps 1 soit avec l'anticorps 2 8- Lavage
Dans quel ordre, se droule la ralisation de ce Western blot ?
muscle foie muscle foie Les rsultats ci-dessus du Western blot et les renseignements donns ci-dessus permettent d'en dduire
A les deux protines ont la mme taille B chacun des deux protines peut avoir plusieurs sous-units de taille diffrente C chacun des deux protines peut avoir plusieurs sous-units de taille identique D les deux protines sont codes par des gnes diffrents E les deux protines sont des isoenzymes
QUESTION N 28 (2 points) Quel est le mcanisme responsable des profils nots sur le western blot ? A promoteur diffrent B pissage alternatif de l'exon 5 dans le muscle C pissage alternatif de l'exon 3 dans le muscle D pissage alternatif de l'exon 5 dans le foie E pissage alternatif de l'exon 3 dans le foie
ENONCE CORRESPONDANT AUX QUESTIONS (29 34) La squence suivante est celle d'un exon avec ses bordures introniques. La partie codante reprsente 300bp : 5 ' AGTACCTTGATGGCATGACTAGTACCCGGGCTAATCGATCCC
Ile Gln Gln Arg Leu Gln Glu Glu Leu Asp His Glu Leu GATCATTCCCCAG [ ATT CAG CAG CGA CTG CAG GAG GAG CTA GAC CAC GAA CTG
Gly Pro Gly Ala Ser Ser Ser Arg...............//................ Thr Arg Pro Ser Se GGC CCT GGT GCC TCC AGC TCC CGG ...............//................ACA CGG CCC AGC AG ]
GTGACTCCCGAGGGTTGGGGAGTCATTCGATGGCATAGCT 3'
QUESTION N 29 (3 points) Quelles sont parmi les amorces suivantes les deux qui vous demanderez synthtiser pour amplifier par la mthode de PCR cet exon ? A 5' TCGATACGGTAGCTTACTGA 3' B 5' AGTCATTCGATGGCATAGCT 3' C 5' AGCTATGCCATCGAATGACT 3' D 5' TCATGGAACTACCGTACTGA 3' E 5' AGTACCTTGATGGCATGACT 3'
QUESTION N 30 (2 points) Quelle est la longueur du fragment amplifi ? A 355 bp B 395 bp C 375 bp D 300 bp E aucune Anticorps 1 Anticorps 2 25 ? 15 ? 8 QUESTION N 31 (1 point) Une mutation C T apparait dans le troisime codon Glutamine (Leu-Gln-Glu). Nous rappelons que les sites de reconnaissance des enzymes de restriction, Eco RI et Pst I, sont les suivants: 5' G + AATT C 3' site Eco RI 5' C TGCA + G 3' site Pst I 3' C TTAA | G 5' 3' G | ACGT C 5'
Quel est le retentissement de cette mutation ? A changement d'acide amin B pas de retentissement C dcalage du cadre de lecture D apparition d'un codon stop E aucune
QUESTION N 32
Le profil lectrophortique de l'ADN correctement digr d'un malade homozygote pour cette mutation montrera par rapport celui de l'ADN control
A aucune diffrence B apparition d'une bande supplmentaire plus grande C apparition d'une bande supplmentaire plus petite D disparition d'une bande sans autre changement E disparition de deux bandes avec apparition d'une bande plus grande
QUESTION N 33 Pour mettre en vidence cette mutation, plusieurs tapes sont proposes
1- Amplification d'un fragment d'ADN entourant cette mutation 2- Coloration au bromure d'thidium du gel d'agarose 3- Digestion par l'enzyme Eco RI 4- Digestion par l'enzyme Pst I 5- Digestion par les enzymes Eco RI et Pst I 6- Migration sur un gel d'agarose 7- Photographie du gel color 8- Extraction de l'ADN d'un sujet normal et du sujet suspect d'avoir cette mutation
QUESTION N 34 (1 point) Chez un malade htrozygote pour cette mutation (c'est--dire ayant cette mutation sur un seul de ses deux chromosomes), quel est le profil lectrophortique obtenu aprs amplification de ce fragment et coupure par l'enzyme de restriction dont le site est modifi par cette mutation (on admet qu' il est unique dans ce fragment) ? A 1 bande B 2 bandes C 3 bandes D 4 bandes E :5 bandes 9 Enonc correspondant au Gne de la Dystrophine Les dltions du gne de la dystrophine sont responsables de deux maladies musculaires, l'une trs svre appele Myopathie de Duchenne, l'autre moins grave appele "Maladie de Becker". A la fin du fascicule, vous avez la squence des exons 44 51 du gne de la dystrophine et leurs bordures introniques. Le reste des introns de taille trs grande est marqu par des pointills (-----------). Sous les parties exoniques se trouvent la squence des acides amins. La jonction intron-exon n'est pas signale et peut se trouver 1 ou 2 bp du codon indiqu. De mme la fin d'un exon peut correspondre un codon incomplet. Une mini- dystrophine dpourvue de la squence protique code par les exons 44 51 reste un peu fonctionnelle. La numrotation correspond aux nuclotides.
QUESTION N35 (2 points) Parmi les dltions suivantes, quelles sont celles responsables de la Maladie de Duchenne (myopathie svre) A dltion de l'exon 44 B dltion de l'exon 45 C dltion de l'exon 46 D dltion de l'exon 47 E dltion de l'exon 48 QUESTION N36 (2 points) Parmi les dltions suivantes, quelles sont celles responsables de la Maladie de Becker (myopathie moins grave) A dltion de l'exon 49 B dltion de l'exon 50 C dltion de l'exon 51 D dltions englobant les exons 47 et 48 E dltions englobant les exons 48 et 49 QUESTION N 37 (2 points) Parmi les dltions suivantes, quelles sont celles responsables de la Maladie de Duchenne (myopathie grave) A dltions englobant les exons 45, 46 et 47 B dltions englobant les exons 46, 47 et 48 C dltions englobant les exons 46, 47, 48, 49 et 50 D dltions englobant les exons 47, 48, 49 et 50 E dltions englobant les exons 48, 49, 50 et 51
QUESTION N 38 (2 points) Pour tudier l'exon 51 du gne de la dystrophine, un fragment de 340 bp (voir question suivante) est amplifi par la mthode de PCR. Quelles sont parmi les amorces suivantes de 20 bp les deux que vous demanderiez synthtiser pour amplifier ce fragment ?
A 5' AAAATGATAAAAGTTGGCAG 3' B 5' AAATTGGCTCTTTAGCTTGT 3' C 5' GACGGTTGAAAATAGTAAAA 3' D 5' ACAAGCTAAAGAGCCAATTT 3' E 5' CTGCCAACTTTTATCATTTT 3'
QUESTION N 39 (1 point, 1 seule rponse juste) Par quels nuclotides commence et se termine le fragment prcdent amplifi ?
A 1791 et 2110 B 1811 et 2130 C 1791 et 2130 D 1811 et 2110 E 1791 et 2130 10 Sites de restriction pour les questions 40 et 41
BstN I: 5' CC + TGG 3' Mbo I: 5' + GATC 3' Mse I: 5' T + TAA 3' Afl II: 5' C + TTAAG 3'
QUESTION N 40 (1 point)
La mutation du nuclotide 2021 en T situ dans l'exon 51 du gne de la dystrophine ?
A ne modifie pas la fonction de la dystrophine B cre un site de restriction C entrane un dcalage de lecture D change un acide amin un autre diffrent E donne une protine tronque
QUESTION N 41 (1 point) La mutation du nuclotide 2030 en T situ dans l'exon 51 du gne de la dystrophine ?
A ne modifie pas la fonction de la dystrophine B cre un site de restriction C entrane un dcalage de lecture D change un acide amin un autre diffrent E donne une protine tronque
Squence des exons 44 51 du gne de la dystrophine et des bordures introniques
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12 Problme sur FGFR2
La squence ci-dessous correspond une partie du gne du rcepteur de type 2 de FGF (fibroblaste growth factor). Elle commence dans un exon et se termine dans un autre exon. Sous les parties exoniques, la squence protique correspond la troisime boucle Immunoglobuline-like de la partie extra-cellulaire de ce rcepteur. La suite 3 du gne code pour le passage transmembranaire et la partie cytoplasmique qui contient deux domaines tyrosine-kinases. Ala : GCU GCA GCC GCG
QUESTION N 42 (2 points) Lexamen de ces squences nuclotidique et protiques permet de dire que :
A il existe 3 introns B les sites accepteurs sont les plus frquemment rencontrs chez les gnes humains C il existe la possibit de pont disulfure intra-chane dans cette 3me boucle D la dltion de lexon (contenant les nuclotides 250-350) donnerait une protine tronque E il existe 3 sites potentiels de N-glycosylation
Le changement du nuclotide 328 G en A est responsable chez un nouveau-n dun syndrome malformatif trs important des os de crne et de la face. Plusieurs hypothses ont t mises pour expliquer la gravit de cette mutation . QUESTION N 43 (3 points)
La premire est la cration dun site Accepteur. Dans ce cas
A le rcepteur FGF de type 2 est plus court de 17 acides amins B le rcepteur FGF est tronqu du domaine transmembranaire et des domaines tyrosine-kinases C il existe un dcalage de lecture D lARNm mature de FGFR de type 2 est plus court que lARNm normal E aucune des propositions ci-dessus nest juste 13 QUESTION N 44 (3 points) La seconde est la cration dun site Donneur. Dans ce cas
A le rcepteur FGF de type 2 est plus court de 17 acides amins B le rcepteur FGF est tronqu du domaine transmembranaire et des domaines tyrosine-kinases C il existe un dcalage de lecture D lARNm mature de FGFR de type 2 est plus court que lARNm normal E aucune des propositions ci-dessus nest juste
QUESTION N 45 (1 point) En considrant que le patient est homozygote pour cette mutation, on ralise une RT-PCR partir
A dADN extrait de muscle B dADN extrait de fibroblaste C dADN extrait de surrnale D dADN extrait dos E aucune des propositions ci-dessus nest juste
QUESTION N 46 (2 points) En considrant que le patient est homozygote pour cette mutation, on ralise une RT, puis une PCR en prenant comme amorces des oligonuclotides compris entre 100 - 120 et 500 - 520. Parmi les oligonuclotides suivants, lesquels sont utiliss ?
A G T C T G G G G A A G C T G T A A T C T C B G A G A T T A C A G C T T C C C C A G A C C C T C T A A T G T C G A A G G G G T C T G D C T T G A G G T A G G G C A G C C C G T C E G A C G G G C T G C C C T A C C T C A A G
Items de rponse pour les 3 questions suivantes Ci-dessous 5 squences potentielles obtenues aprs le squenage du produit de PCR (seulement une partie de la squence du produit de PCR est montre, la partie souligne est la plus intressante pour rpondre la question) ?
A TATACGTGCTTGGCGGGTAATTCTATTGG B TATACGTGCTTGGCAGGTAATTCTATTGG C GTTCTCAAGGTAATTCTATTGGGATATCC D TATACGTGCTTGGCAGCGCCTGGAAGAGAAAA E GTTCTCAAGCGCCTGGAAGAGAAAAGGAG
QUESTION N 47 (2 points, 1 seule rponse juste)
Si la mutation cre un site accepteur, quelle est la bonne squence ?
QUESTION N 48 (2 points, 1 seule rponse juste)
Si la mutation cre un site donneur, quelle est la bonne squence ?
QUESTION N 49 (2 points, 1 seule rponse juste)
Prenons une troisime hypothse, lexon, qui porte la mutation, est limin par exon skipping , quelle est la bonne squence ? 14 Squence de la PROINSULINE ci-dessous et premires questions du problme sur lINSULINE
15
QUESTION N50 (1 point) Pour isoler ce gne humain, une sonde d'ADN complmentaire de l'insuline a t obtenue partir
A d'une banque gnomique B d'une banque d'ADN complmentaire hpatique C d'une banque d'ADN complmentaire d'hypophyse D d'une banque d'ADN complmentaire de pancras E aucune rponse bonne QUESTION N 51 (4 points) L'ARN messager mature de l'insuline sans compter l'extrmit 3' polyA est peu prs long de ?
A 333 paires de bases B 350 paires de bases C 423 paires de bases D 465 paires de bases E 490 paires de bases 16
QUESTION N 52 (1 point) Combien d'introns contient le gne de l'insuline ? A 1 B 2 C 3 D 4 E aucune rponse juste 17 Problme sur lINSULINE (suite) : voir squence du gne sur fascicule part QUESTION N 53 (2 points) Combien d'acides amins contient le peptide signal de l'insuline? A 15 B 24 C 33 D 41 E 45 QUESTION N 54 (2 points) Chez un patient homozygote pour la mutation du nuclotide G en T appele R65L du gne de l'insuline, on ralise partir du plasma un western blot en utilisant un anticorps polyclonal de lapin reconnaissant les deux chanes de l'insuline ? Ci dessous se trouve la liste de diffrentes tapes exprimentales permettant d'tudier l'expression de ce gne mut de l'insuline (des tapes intermdiaires peuvent ne pas tre cites ou tre inutiles dans cette exprience). 1 - Lavage 2 - Incubation avec un anticorps anti-anticorps de souris li un enzyme 3 - Prise de sang 4 - Transfert sur une membrane de nylon ou nitrocellulose 5 - Incubation avec un anticorps anti-anticorps de lapin li un enzyme 6 - Electrophorse en utilisant un gel SDS-acrylamide avec mercaptothanol. 7 - Incubation avec l'anticorps polyclonal dirig contre l'insuline ? 8- Raction enzymatique avec formation d'un produit mesurable
Dans quel ordre, se droule la ralisation de ce Western blot ? A 3 - 7 - 6 - 4 - 2 - 8 - 1 B 3 - 6 - 4 - 7 - 5 - 1 - 8 C 3 - 7 - 6 - 4 - 2 - 8 - 1 D 3 - 6 - 4 - 7 - 2 - 8 - 1 E 3 - 7 - 6 - 4 - 5 - 8 - 1
Ci-dessus se trouvent 5 profils de Western blot. En tenant compte de deux renseignements supplmentaires : - la bande accompagne d'une astrisque (*) correspond la proinsuline - on considre que la proinsuline est absente dans le sang d'un individu normal Rpondez aux questions suivantes QUESTION N55 (1 point) Quelle est environ la taille de la proinsuline ? A 258 paires de bases B 86000 daltons C 10214 daltons D 8,6 kilodaltons E 86 kilopaires de base QUESTION N56 (2 points) Quel est le profil de Western blot qui correspond un homme normal ?
X kD Marqueurs A B C D E * 0, 5X kD 18 QUESTION N57 (2 points) Quel est le profil du Western blot qui correspond l'individu homozygote pour la mutation R65L ?
QUESTION N 58 (3 points) Pour tudier cette mutation chez les parents et d'autres membres de la famille, un fragment d'environ 250 bp est amplifi par la mthode de PCR. Une des deux amorces se trouve proche du site accepteur de l'intron qui prcde l'exon qui porte cette mutation. Quelles sont parmi les amorces suivantes de 20 bp les deux que vous demanderiez synthtiser pour amplifier ce fragment qui contient la mutation ?
A 5' TGCTCTGCGCGGCACGTCCT 3' B 5' ACGCAGCCTGCAGGCAGCCC 3' C 5' GAACCAGCCCTGCTGTGCCG 3' D 5' CTTGGTCGGGACGACACGGC 3' E 5' CGGCACAGCAGGGCTGGTTC 3'
QUESTION N 59 (1 point) Nous rappelons que les sites de reconnaissance des enzymes de restriction, Eco RI et Hind III, sont les suivants: 5' G + AATT C 3' site Eco RI 5' A + AGCT T 3' site Hind III 3' C TTAA | G 5' 3' T TCGA | A 5' Chez un htrozygote pour cette mutation (un seul de ses deux chromosomes porte cette mutation), aprs amplification de ce fragment d'ADN que faites-vous pour mettre en vidence cette mutation R65L du gne de l'insuline ? Cochez les tapes utilises.
A coloration par le bleu de coomassie B digestion par l'enzyme Eco RI C digestion par l'enzyme Hind III D lectrophorse en utilisant un gel d'agarose E lectrophorse en utilisant un gel SDS-polyacrylamide
QUESTION N 60 (2 points) Quel profil obtient-on (rsultat 5 bp prs) ?
A 1 bande de 256 bp B 2 bandes de 174bp et 82 bp C 2 bandes de 154 bp et 102 bp D 3 bandes de 256 bp, 154 bp et 102 bp E 3 bandes de 256 bp, 174 bp et 82 bp
Biochimie II /Biologie Molculaire 1 re session Mai 2004 (extraits) : Rcepteur aux andrognes
Les lsions du gne du rcepteur aux andrognes sont responsables du syndrome dinsensibilit aux andrognes. Il sagit dune maladie gntique transmission rcessive lie au chromosome X. Seuls les individus 46,XY sont atteints. Il existe deux formes cliniques : lune complte donnant un phnotype fminin, lautre incomplte donnant une ambigut des organes gnitaux externes. A la fin du fascicule, vous avez deux squences contenant les rgions codantes du rcepteur aux andrognes (squence 1 et squence 2). La squence 1 reprsente la squence partielle de l'ADN complmentaire du rcepteur aux andrognes (il manque les extrmits 5' et 3'). Elle contient des astrisques qui correspondent des acides amins trs conservs parmi le rcepteur aux andrognes de nombreuses espces. Lacide amin 667 correspond au premier acide amin de lhlice o H1 du domaine qui en contient 12. Lacide amin qui termine la 12 me hlice o est S900. Les exons sont nomms en lettre. QUESTION N 61 (3 points)
A la squence 1 peut tre obtenue aprs lextraction de lADN dun individu B la squence 2 provient dune banque dADN gnomique C le rcepteur aux andrognes contient 919 acides amins daprs ces deux squences D ces deux squences contiennent plusieurs zones rptes 19 E les acides amins marqus par un astrisque appartiennent au domaine liant les andrognes QUESTION N62 (2 points) Le rcepteur aux andrognes A est un rcepteur membranaire B se lie lADN sous forme dhtrodimre C a son domaine liant les andrognes qui stend de lexon D lexon H D lie un coactivateur en labsence de ligand E recrute des histones-dactylases en prsence de ligand
QUESTION N 63 (1 point) Deux ARN messagers du rcepteur aux andrognes sont dtects par la mthode de Northern en utilisant comme sonde lADN complmentaire du gne du rcepteur aux andrognes. Lun prdominant a une taille de 10 kb, lautre une taille de 7 kb. Pour raliser ce Northern, plusieurs tapes sont utilises. Parmi celles listes ci-dessous, lesquelles ont servi la ralisation de ce Northern.
A Extraction de l'ADN de la prostate ou de fibroblaste de peau gnitale B Digestion de lARN par des enzymes de restriction C Aprs sparation de lARNm par lectrophorse, transfert sur une feuille de nylon D Avant le transfert, dnaturation de lARNm par la soude E Amplification par RT-PCR QUESTION N64 (1 point)
Comme la diffrence de taille entre les 2 ARN messagers de 10 kb et 7 kb du rcepteur aux andrognes ne sont pas secondaire un pissage alternatif, elle pourrait tre due (aidez-vous des longueurs des squences 1 et 2)
A une initiation diffrente de la traduction B une initiation diffrente de la transcription C la prsence de deux sites de la polyadnylation D la prsence de deux codons stop E Aucune des rponses prcdentes n'est juste
Enonc pour les questions 65 71
En hybridant avec lADN complmentaire du rcepteur aux andrognes une banque dADN gnomique, plusieurs clones ont t isols. La carte de restriction de lun de ces clones est dessine sur la figure ci- dessous. Le fragment Sma I-Kpn I (2601-4000) reprsente le fragment de la squence 2 allant du nuclotide 169 au nuclotide 1568. Le Northern prcdent est hybrid par 3 fragments distincts du clone ci-dessous. Les fragments Sma I-Kpn I (2601-4000) et Sma I-Sma I (1401-2600) donnent un signal dhybridation avec deux bandes, lune de 10 kb et lautre de 7 kb. Avec le fragment Xba I-Nsi I, il ny a pas de bandes lautoradiographie. Il nexiste quun seul site dinitiation de la transcription.
Pour dterminer avec prcision le site dinitiation de la transcription, on ralise une exprience utilisant la protection la nuclase S1. Elle se droule en 3 tapes : i) hybridation en phase liquide de fragments dADN complmentaire du brin 5-3 du clone (figure la question 26) aux ARN totaux extraits de tissus prostatiques; ii) coupure par la nuclase S1; N s i
I E c o
R I S m a
I X b a
I K p n
I S m a
I E c o
R I B s t
N I Clone provenant dune banque gnomique hybridpar lADNc du rcepteur aux andrognes Les chiffres correspondent la position du nuclotide prcdant la coupure par l enzyme de restriction. Le nombre 0 par la coupure par Xha I est arbitraire. 0 2 6 0 0 4 0 0 0 1 4 0 0 7 5 0 1 6 0 0 pb 3 5 20 iii) lectrophorse et autoradiographie. Le rsultat est sur la figure ci-dessous.
QUESTION N 65 (1 point) Les trois sondes (1, 2 et 3) utilises respectivement dans les expriences dposes sur les lignes 1, 2 et 3 ont t marques en 5'
A par la Taq polymrase B par la rserve transcriptase C par la T4 polynuclotide-kinase D en utilisant de l'ATP marqu en par le 32 P E en utilisant de l'ATP marqu en o par le 32 P
QUESTION N 66 (3 points) On peut en dduire que le gne du rcepteur aux andrognes
A a son site dinitiation de la transcription situ ~80 pb de son site dinitiation de la traduction B a 9 introns C a son site dinitiation de la transcription situ ~1110 pb de son site dinitiation de la traduction D a une rgion non codante en 5 denviron 1310 pb (5UTR) E a une rgion non codante en 5 denviron 1510 pb (5UTR)
QUESTION N 67 (3 points) On peut en dduire daprs tous les renseignements dj obtenus depuis le dbut que
A les squences 1 et 2 ne contiennent pas le site dinitiation de la transcription B linsertion de la queue polyA peut se faire sur le nuclotide 3120 de la squence 1 C la transcription peut sarrter au nuclotide 4343 de la squence 2 D le fragment en amont du site Nsi I nest pas transcrit E la partie 3 non codante est de taille variable
QUESTION N 68 (2 points)
Pour connatre la squence gnomique de la partie 5 en amont (upstream) de la squence 2, on utilise lors du squencage du clone gnomique ci-dessus une amorce correspondant la squence souligne A1 dans la squence 2. Loligonuclotide utilis sera :
A 5' CGCCTGTTGAACTCTTCTGAGC 3' B 5' GCGGACAACTTGAGAAGACTCG 3' C 5' GCTCAGTTGAAAATAGTAGGCG 3' D 5' GCTCAGAAGAGTTCAACAGGCG 3' E 5' CGAGTCTTCTCAAGTTGTCCGC 3' 1 2 3 0, 2 kpb 1, 2 kpb 1, 4 kpb Autoradiographieaprs protection la nuclase S1 Sonde 1 : Nsi I-Bst N I (750-1600) Sonde 2 : Sma I-Sma I (1400-2600) Sonde 3 : Sma I-Kpn I (2601-4000) 21
QUESTION N 69 (2 points) Une dltion de lexon B du gne du rcepteur aux andrognes, englobant les bordures introniques, est responsable dune forme complte dinsensibilit aux andrognes. Cette dltion
A donne une protine tronque c'est--dire de taille infrieure la protine normale B donne une protine liant les andrognes, mais ne liant pas lADN C donne une protine dtectable par western blot avec un anticorps monoclonal dirig contre un pitope correspond aux acides amins 800 850 du rcepteur aux andrognes D donne une protine capable in vitro de stimuler lactivit dun gne reporter (lucifrase) ayant dans sa rgion promotrice plusieurs ARE E sera dtectable en tudiant lARNm par RT-PCR
QUESTION N 70 (3 points) Avant l'utilisation de la biologie molculaire permettant le squenage du gne du rcepteur aux andrognes, ltude de la liaison des andrognes sur des fibroblastes en culture provenant dune biopsie de peau gnitale dun patient suspect dinsensibilit complte aux andrognes tait un outil diagnostique en permettant d'valuer le KD et le nombre de rcepteurs. Parmi les mutations suivantes qui sont toutes responsables dune insensibilit complte aux andrognes, lesquelles abolissent totalement la liaison des andrognes ces fibroblastes. A mutation C784Y (TGTTAT) B mutation dans lintron B (ou 2) changeant le nuclotide 2 A en C produisant un exon skipping de lexon C C mutation R607X (CGATGA) D mutation H874C (CATCGT) E mutation C619S (TGTTCT)
QUESTION N 71 (3 points) Un patient, porteur de la mutation Q60X (CAGTAG) du gne du rcepteur aux andrognes a une forme partielle dinsensibilit aux andrognes. Ltude de la liaison des andrognes sur des fibroblastes en culture de ce patient montre une liaison diminue mais relle aux rcepteurs. Le western blot fait partir des extraits cellulaires (1 et 3 : fibroblastes du sujet normal ; 2 et 4 : fibroblastes du patient ayant la mutation Q60X) est hybrid par deux anticorps monoclonaux diffrents; lun (anticorps A) reconnat lextrmit N-terminale de la protine, lautre (anticorps B) reconnat le domaine de liaison des andrognes (figure ci-dessous).
On peut en conclure que cette mutation
A donne une protine tronque de son domaine de liaison lADN B ne donne aucune protine C donne une protine tronque ne contenant pas les 200 premiers acides amins D entrane lutilisation dun nouveau site dinitiation de la traduction permettant la synthse dune protine commenant par la mthionine 189 E donne un ARN messager mature plus court ~ 108 kDa ~ 78 kDa We ste rn blot Anticorps A Anticorps B 1 2 3 4 22 Facult de Mdecine et de Pharmacie de FES 1re anne - mai 2004 (1 re session) EPREUVE DE BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE Pr Yves MOREL
dure de lpreuve : 90 minutes IMPORTANT : vous devez vrifier que votre livret contient 20 questions : QUESTIONS N 1 20 En rponse chaque question vous pouvez noircir une cinq cases sur la grille
QUESTION N 1 (1 point) Le gnome humain contient des squences rptes et uniques. Parmi les squences suivantes, lesquelles sont considres comme uniques ?
A squence crant un RFLP (restriction fragment length polymorphism) B squence Alu C squence transcrite par la RNA polymrase de type I D squence codant pour un SNP E squence transcrite par la DNA polymrase de type II
QUESTION N 2 (1 point) Parmi les domaines suivants, lesquels se retrouvent dans une protine nuclaire qui module la transcription.
A domaine 7 passages transmembranaires B domaine leucine zipper C domaine du peptide signal D domaine 2 doigts de zinc E homodomaine
QUESTION N 3 (1 point) Un coactivateur
A se lie une squence HRE B permet de tranformer leuchromatine en htrochromatine C a une activit histone dactylase D peut se lier au domaine de liaison contenant 12 hlices o E agit comme un mdiateur pour augmenter la transcription dun gne
QUESTION N 4 (1 point)
La protine HP1 (heterochromatine protein 1)
A se lie des coactivateurs B permet de tranformer leuchromatine en htrochromatine C favorise le recrutement dune histone dacetylase pour inactiver lhistone adjacent D se lie au rsidu lysyl 9 dans lhistone H3 E inhibe directement la RNA polymrase DNA dpendante de type II
23 Enonc pour les Questions n 5 et 6 Pour liminer le gne AMH dans les cellules de Sertoli au moment de la pubert chez la souris, il faut obtenir un ensemble de croisements entre des souris normales et transgniques comme le montre la figure ci-dessous. La recombinaison homologue a lieu dans les cellules ES. Les cellules ES sont incorpores dans un blastocyte. La souris obtenue correspond la souris 1 de larbre ci-dessous. La souris 4 est homozygote par linvalidation conditionnelle du gne AMH (il sera appel gne AMH*). La souris 8 a le matriel gntique permettant tout moment dinvalider compltement le gne AMH.
QUESTION N 5 (2 points) La souris 1 a t obtenue aprs recombinaison homologue avec un vecteur recombinant. Ce vecteur recombinant avant son introduction dans les cellules ES contient
A une partie de la squence gnomique de lAMH B un gne NEO qui a t introduit dans un exon du gne AMH en provoquant un dcalage de lecture C un des exons codant pour un domaine essentiel de la fonction anti-mullerienne qui est entour par des sites CRE D le gne Thymidine kinase pour obtenir une slection positive E au moins trois sites Lox P
QUESTION N 6 (2 points) Daprs larbre gnalogique, on peut dire
A la souris 8 est homozygote pour le gne AMH* et htrozygote pour le gne CRE- LBDantistrogne B au moins une de deux souris 6 et 7 est htrozygote pour le gne CRE-LBDantistrogne et le gne AMH* C la souris 5 contient dans son ADN un gne CRE-LBDantistrogne pouvant sil est transcrit donner une protine fusion CRE-domaine de liaison aux strognes mut capable de lier seulement un anti-strogne comme le Tamoxifne D la souris 5 contient dans son ADN le gne CRE-LBDantistrogne sous le contrle dun promoteur spcifique de cellules cardiaques E la souris nest quhtrozygote pour le gne CRE-LBDantistrogne
QUESTION N 7 (1 point) Ltiquettage dune protine Y
A se ralise avant la synthse de la protine Y B permet de purifier les molcules qui interagissent avec cette protine Y C ncessite pour des tudes in vivo le transfert dun vecteur dexpression pouvant produire une protine de fusion comme la green fluorescent protein + protine Y D ncessite la connaissance de la fonction de la protine Y E permet la purification de la protine Y par une chromatographie daffinit 1 2 4 3 5 6 7 8 24 Enonc pour les Questions suivantes : Le dficit en 17|-hydroxystrode dhydrognase Le dficit en 17|-hydroxystrode dhydrognase (17|-HSD), maladie transmission autosomique rcessive, est responsable chez le sujet 46,XY dune ambigut sexuelle due labsence de synthse de testostrone par les cellules de Leydig du testicule. Il est trs frquent dans la bande de Gaza. Lenzyme responsable na jamais pu tre purifi mme partiellement partir du tissu testiculaire.
Avant la dcouverte du gne 17|-HSD de type 3 responsable de cette maladie, deux gnes ont t isols. - Le gne 17|-HSD de type 1 catalysant les ractions 2 et 4. - Le gne 17|-HSD de type 2 catalysant la raction 3. Les ADNc de ces 2 gnes nhybrident pas les ARNm dorigine testiculaire qui sont dposs sur un northern blot.
QUESTION N 8 (1 point) Parmi les propositions suivantes, quelles sont les tapes qui diffrent entre la mthode de Northern et la mthode de Southern ?
A Lavage aprs hybridation selon des conditions de stringence lies la nature de la sonde B Transfert sur une feuille de nylon C Dnaturation par la soude du gel dlctrophorse avant le transfert sur la feuille de nylon D Hybridation avec une sonde marque au 32 P E Digestion par une enzyme de restriction
QUESTION N 9 (2 points) Des auteurs ont isol lADNc responsable du dficit en 17|-HSD partir dune banque dADNc de testicule construite dans un vecteur dexpression. Pour dcouvrir le bon clone, ils ont recherch les clones dADNc qui synthtisent de la 3 H-testostrone. Parmi les outils suivants, lesquels ont t utiliss lors de cette exprience ?
A 3 H-oestradiol comme substrat B 3 H-A4-androstnedione comme substrat C lADNc du gne 17|HSD de type 2 comme sonde D des anticorps anti-17|HSD de type 2 comme sonde E des anticorps anti-17|HSD de type 3 comme sonde O O OH HO O OH 1 1 Testostrone A4-androstnedione stradiol strone 2 2 3 3 4 4 HO O 5 5 6 6 O O OH HO O OH 1 1 Testostrone A4-androstnedione stradiol strone 2 2 3 3 4 4 HO O 5 5 6 6 25 QUESTION N 10 (3 points) A la fin du fascicule, vous avez deux squences 5'3' correspondant soit cet ADN complmentaire soit une partie du gne 17|-HSD de type 3. Les triangles sont situs au dessus du dbut dun exon. La numrotation utilise dans ces deux squences est totalement indpendante. La squence correspondante lADN complmentaire est complte. Lenzyme code par le gne 17|-HSD de type 3 ne catalyse quune seule raction, la conversion de la A4-Androstnedione en testostrone. La seule bande dtectable par ces squences sur lautoradiographie dun Northern reprsentatif dun nombre important de tissus correspond celle du testicule. On peut dire que
A lADNc du gne 17|-HSD de type 3 correspond la squence 2 B la squence 2 contient toute la squence du gne 17|-HSD de type 3 C la bande dtecte lors du Northern est suprieure 1,1 kDA D un exon est constitu uniquement dune squence non codante (UTR) E lADNc du gne 17|-HSD de type 3 correspond la squence 1
QUESTION N11 (2 points) La squence 1 A contient un site de polyadnylation B comprend les exons 3, 4 et 5 C comprend la squence complte de deux introns D montre que lintron 5 commence au nuclotide 501 E reprsente le 0,32 millionime du gnome haplode humain
QUESTION N12 (1 point) La mutation R80Q est la plus frquente du dficit en 17|-HSD car elle atteint la population de la bande de Gaza o une trs forte consanguinit existe. Cette mutation A est situe dans lexon 2 B change le nuclotide 146 en A (numrotation de la squence 1) C change le nuclotide 147 en A (numrotation de la squence 1) D change le nuclotide 148 en A (numrotation de la squence 1) E aurait pu crer un site donneur
QUESTION N13 (1 point) Le dpistage de cette mutation R80Q peut tre faite large chelle dans la population de la bande de Gaza. Plusieurs mthodes peuvent tre utilises, mais elles ncessitent toutes au pralable une extraction de lADN chez chaque individu et une amplification par PCR du fragment de 970 bp de la squence 1. Voici la liste des produits et de mthodes pouvant tre utiliss 1- Taq polymrase 2- l'enzyme de restriction Taq I 3- ADN gnomique 4- ARN 5- dnaturation -hybridation des amorces- extension (25 cycles) 6- hybridation des amorces-dnaturation de l'ADN gnomique- extension (25 cycles) 7- dsoxynuclotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 8- didsoxynuclotides (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) Parmi les propositions suivantes, laquelle permettra d'amplifier ce fragment ?
A on met dans le mme tube (4 + 2 + 7) puis on ralise 6 B on met dans le mme tube (3 + 1 + 8) puis on ralise 5 C on met dans le mme tube (4 + 1 + 7) puis on ralise 5 D on met dans le mme tube (3 + 2 + 7) puis on ralise 6 E on met dans le mme tube (3 + 1 + 7) puis on ralise 5
26 QUESTION N14 (2 points) Si la mthode de coupure par les enzymes de restriction est utilise, quels sont les items justes
A coupure du fragment de 970 bp par lenzyme Alu I B un sujet normal a trois bandes : 606 bp, 219 bp, 145 bp C un sujet htrozygote pour la mutation a quatre bandes : 825 bp, 606 bp, 219 bp, 145 bp D un sujet homozygote pour la mutation a deux bandes : 825 bp, 145 bp E un sujet htrozygote pour la mutation a quatre bandes : 751 bp, 606 bp, 219 bp, 145 bp
QUESTION N15 (2 points) Si la mthode de dot-blot est utilise, quels sont les items justes. Les squences des sondes correspondent aux squences 5-3 donnes la fin du polycop.
A les sondes utilises peuvent tre des oligonuclotides denviron 20 nuclotides marqus grce une T4-polynuclotidekinase en utilisant de [o 32 P]ATP B lune des sondes a comme squence (dbut T138) 5TTATTAGCCGGACGCTGGAA 3 C lune des sondes a comme squence (dbut T138) 5TTATTAGCCGAACGCTGGAA 3 D lune des sondes a comme squence (dbut T138) 5TTATTAGCCAGACGCTGGAA 3 E Deux sondes marques hybrident en mme temps la mme feuille de nylon
QUESTION N16 (1 point) La mutation changeant le nuclotide 189 (squence 1) en T
A est situe dans lintron 3 B scrit IVS4+4A>T C scrit IVS3-4A>T D se trouve dans le site accepteur de lintron 3 E est une mutation stop
Enonc pour les Questions 17, 18, 19 et 20 Aprs gonadectomie, lARN dun patient homozygote pour cette mutation changeant le nuclotide 189 (squence 1) en T est extrait du tissu gonadique. Le Northern (figure droite) est hybrid par lADNc du gne 17|-HSD de type 3. LARN est amplifi par RT-PCR en utilisant deux amorces, lune situe dans lexon 1 (amorce 1) et lautre dans lexon 5 (amorce 2). Llectrophorse des produits obtenus montre lexistence de 2 bandes. Le squenage de 5 l de la raction de RT-PCR est fait en utilisant plusieurs amorces. On nobtient une squence lisible sur toute sa longueur quavec une amorce se trouvant dans lexon 4. On retrouve en particulier cette squence (le brin dADN ci-dessous est le mme que ceux des squences 1 et 2 situes la fin du fascicule) : 5 GAAAGCGTACTCGTTCGAGAGCGGACTACAGGGAGGAGTGTGAA 3
QUESTION N17 (3 points) Cette squence 5 GAAAGCGTACTCGTTCGAGAGCGGACTACAGGGAGGAGTGTGAA 3
A ne correspond qu lexon 4 B correspond la jonction entre lexon 4 et 5 C correspond la jonction entre lexon 3 et 4 D correspond la jonction entre lexon 3 et 5 E correspond la jonction entre lexon 2 et 4 27 QUESTION N18 (3 points)
On peut dire que
A les fragments dposes dans les puits (normal et mut) de la figure ci-dessus droite sont des fragments dADN B les bandes visibles sur llectrophorse des produits de RT-PCR ont t colores par le bleue de coomassie C la squence ci-dessus a pu tre obtenue en utilisant lamorce dduite de la squence 461-480 (squence 1) : 5 CCTGCAAGTTTTTCTTTAAT 3 D la squence ci-dessus a pu tre obtenue en utilisant lamorce dduite de la squence 411-430 (squence 1) : 5 TGCTTGTATAATCTTCACAC 3 E la squence ci-dessus a pu tre obtenue en utilisant lamorce dduite de la squence 461-480 (squence 1) : 5 ATTAAAGAAAAACTTGCAGG 3
QUESTION N19 (2 points)
En vous aidant du profil du Northern blot ci-dessus, des rponses aux questions 17 et 18 et en considrant que lune des bandes de lARN mut correspond lexon skipping des exons 3 et 4, ltude du retentissement de la mutation changeant le nuclotide 189 (squence 1) en T ltat homozygote (voir le profil mut du Northern blot ci-dessus et) permet de dire que
A lARNm rsultant dun pissage normal du gne 17|-HSD de type 3 nest pas visible sur le Northern (profil mut) B la bande qui a la taille la plus grande correspond un ARNm sans lexon 4 C la bande qui a la taille la plus petite correspond un ARNm sans les exons 3 et 4 D lARN ayant la plus grande taille na pas darrt prmatur de la traduction E lARN ayant la plus petite taille correspond lexon 4
QUESTION N20 (2 points)
La protine rsultant de lexon skipping des exons 3 et 4
A est une protine dau moins de 240 acides amins B peut tre visualise par la mthode de Southern C sera dtecte par un anticorps monoclonal anti-17|-HSD de type 3 dirig contre la partie C- terminal de la protine D ne sera pas dtecte par un anticorps monoclonal anti-17|-HSD de type 3 dirig contre les acides amins 80 140 E est une protine trs courte de 82 AA (mthionine 1 incluse)
28 Facult de Mdecine et de Pharmacie de FES 1re anne - mai 2005 (1 re session) EPREUVE DE BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE Pr Yves MOREL dure de lpreuve : 90 minutes IMPORTANT : vous devez vrifier que votre livret contient 20 questions : QUESTIONS N 1 20 En rponse chaque question vous pouvez noircir une cinq cases sur la grille
QUESTION N 1 (1 point)
Un microsatellite spcifique dune rgion de notre gnome
A est bialllique B est une squence rpte variable dun individu lautre C doit tre amplifi avec des amorces contenant en 3 au moins 2 3 copies du motif rpt D peut tre une squence Alu E peut tre un SNP
QUESTION N 2 (1 point)
Un SNP single nuclotide polymorphism A est bialllique B est un microsatellite C concerne un polymorphisme suprieur 1% de la population D est assez rare (environ 500 000 dans notre gnome haplode) E est une squence unique
QUESTION N 3 (1 point)
Un domaine leucine-zipper A contient une hlice o avec beaucoup dacides amins chane latrale basique B est constitu de 3 hlices o C contient ube rptition de rsidus leucyl D permet la constitution de dimres grce aux chanes latrales charges de rsidus leucyl E indique que la protine est un coactivateur
QUESTION N 4 (1 point)
Un gne domestique house keeping gene
A na pas de bote TATA B sexprime spcifiquement dans un tissu C est une squence unique D est un pseudogne par duplication E possde dans la rgion rgulatrice une squence GC hypermthyle 29 QUESTION N 5 (1 point) Le code gntique
A est chevauchant B est dgnr C est constitu de 64 codons codant 20 acides amins D est spcifique despce E permet de protger lindividu en ayant par exemple 6 codons pour les acides amins les plus frquemment rencontrs dans les protines
QUESTION N 6 (1 point) A propos des polymrases,
A lARN polymrase ADN dpendante de type III permet la transcription des tRNA B lARN polymrase ADN dpendante de type I permet la transcription des ARN ribosomaux C lADN polymrase ADN dpendante de type II permet la transcription des squences gniques uniques D la Taq polymrase est une ADN polymrase thermosensible E la Transcriptase inverse est une ARN polymrase
QUESTION N 7 (1 point) A propos de la transgense,
A le gne NEO permet dinvalider le gne lors de la transgense conditionnelle B le gne NEO permet la slection positive suelement des cellules ayant eu une recombinaison homologue C le gne TK (thymidine-kinase) permet la phosphorylation de la nomycine D un des sites Lox P doit tre dans un exon pour une invalidation conditionnelle de ce gne E la slection des cellules ES ayant eu une recombinaison homolgue ncessite dabord une slection positive suivie dune slection ngative.
Enonc pour les questions suivantes
Tous les nonces des questions suivantes peuvent servir rpondre aux questions 8 20 A la fin du fascicule se trouvent deux squences :
1- la squence du gne de la 21-hydroxylase, CYP21 et de son pseudogne CYP21P (distribue en cours). La squence complte correspond celle du gne fonctionnel, CYP21. Pour le pseudogne CYP21P, seulement les nuclotides diffrents sont nots. Dans les deux squences, un trait signale la dltion dun nuclotide. Les flches verticales indiquent les dbuts de la transcription. Entre le dbut de la transcription et le dbut de la traduction, il nexiste pas dintron.
2- la squence de lextrmit 3 de lADN complmentaire sans la queue polyA du gne de la 21- hydroxylase.
Ce gne code pour une enzyme, le cytochrome P450c21, exclusivement surrnalien, qui catalyse une 21- hydroxylation. Cette raction est irrversible. Le dficit en 21-hydroxylase, maladie transmission autosomique rcessive, est responsable dune hyperplasie congnitale des surrnales. La forme la plus grave entrane une dhydratation svre du nouveau-n par un syndrome de perte de sel. Durant la vie ftale, le nouveau-n 46 XX prsente une virilisation des organes gnitaux externes mais a des organes gnitaux internes normaux. 30 QUESTION N 8 (3 points) On peut dire que
A la fin de la transcription du gne CYP21 peut tre dtermine B le gne CYP21 contient 10 exons C le gne CYP21 contient un exon sans squence codante D le dbut de la transcription se trouve un endroit attendu si lon regarde la squence du gne CYP21 E le dernier nuclotide transcrit est le nuclotide 2706 (squence 1)
QUESTION N 9 (3 points)
Le pseudogne CYP21P
A est un rtroposon B contient dans la partie codante 2 insertions de nuclotides qui entranent un dcalage de lecture avec formation dun codon stop C contient une dltion qui entrane un dcalage de lecture avec formation dun codon stop D contient une mutation ponctuelle qui cre un codon stop E contient une insertion qui entrane un codon stop dans le mme exon
QUESTION N 10 (3 points)( une seule rponse juste)
En vous aidant des deux squences, quelle serait la taille ( 5pb prs) de lADNc correspondant lARNm le plus transcrit
A 1491 pb B 2179 pb C 2207 pb D 2251 pb E 2360 pb
QUESTION N 11 (2 points)
La protine SF1, rcepteur nuclaire orphelin, et lACTH, peptide, rgulent lexpression du gne CYP21. On peut dire que
A SF1 contient plusieurs passages transmembranaires B ACTH est synthtis par lhypophyse sous forme dun prcurseur nomm la POMC C ACTH se lie un rcepteur membranaire sept passages transmembranaires qui a pour second messager le systme tyrosine-kinase D SF1 doit lier un lment de rponse appel enhancer E Pour stimuler la transcription, le domaine 12 hlices o de SF1 change de conformation pour recruter des histones dactylases 31 QUESTION N 12 (2 points) Le premier ADNc dcouvert concernant le gne CYP21 a t isol chez le bovin. Cet ADNc bovin a t utilis pour isoler lADNc humain du gne CYP21. Comme lhomologie de squence entre lADNc bovin et humain est diffrente, la sonde dADNc CYP21 bovine hybride avec des conditions diffrentes dhybridation les banques bovines et humaines dADNc. On peut dire que
A cest une banque humaine dADNc de foie qui a permis disoler lADNc CYP21 humain B la temprature dhybridation de la banque humaine a t suprieure celle utilise pour la banque bovine C la concentration en sel lors de lhybridration de la banque humaine a t suprieure celle utilise pour la banque bovine D cette sonde contient des introns E lADNc humain isol, dont la squence est la fin de ce fascicule, contient les exons 8, 9, 10 et 11 du gne CYP21
QUESTION N 13 (2 points) Pour dterminer le dbut de la transcription, deux mthodes sont possibles. Si on utilise la mthode par la protection la nuclase S1, lesquelles des phrases suivantes sont justes ?
A extraction de lARNm dans le tissu o sexprime le gne CYP21 B utilisation dune sonde marque situe en amont de la premire flche et allant jusquau nuclotide 150 C coupure par la RNase D migration des fragments protgs sur un gel de squence E utilisation dun e amorce complmentaire de la squence correspondante aux 7 premiers acides amins de la protine Cytochrome P450c21
QUESTION N 14 (2 points) Pour dterminer le dbut de la transcription, deux mthodes sont possibles. Si on utilise la RT-PCR, on prend une amorce dans la rgion du gne CYP21 o dbute la traduction. Lesquelles des phrases suivantes sont justes ?
A extraction de lARNm dans le tissue o sexprime le gene CYP21 B utilisation de lamorce 5 ATGCTGCTCCTGGGCCTGCT 3 C utilisation de lamorce 5 TACGACGAGGACCCGGACGA 3 D utilisation de lamorce 5 AGCAGGCCCAGGAGCAGCAT 3 E migration des fragments synthtiss sur un gel de squence
QUESTION N 15 (2 points)
Pour tudier la mutation Q318X, la plus frquente en Tunisie dans le dficit en 2&-hydroxylase, on utilise une amplification dun fragment dADN en utilisant des amorces trs spcifiques du gne. Cette mutation modifie lun des sites de restriction ci-dessous (appel site Q318X). Le fragment normal amplifi contient trois sites de restriction de lenzyme dont le site est modifi. Site Bam HI 5' G + GATCC 3' Site Bgl II 5' A + GATCT 3' Site Eco RI 5' CTGCA + G3' Site Xba I 5' T + CTAGA 3' On peut dire que
A cette mutation est localise dans lexon 7 B cette mutation entrane un dcalage de lecture et une protine tronque C le fragment amplifi normal aprs digestion donne 4 bandes D le fragment amplifi contenant la mutation ltat homozygote donne 5 bandes E le fragment amplifi contenant la mutation ltat htrozygote donne 5 bandes 32 QUESTION N 16 (2 points)
La dltion de lexon 3 ltat homozygote
A donne une ARNm plus court B nentrane pas de dcalage de lecture C donne une protine tronque de 108 acides amins D fait apparatre un codon stop dans lexon 5 E donne une protine reconnue par un anticorps monoclonal dirig vers lpitope reconnaissant les acides amins 110-130
Enonc commun pour les questions n 17 n20
Le nuclotide 655 C du gne CYP21 peut subir deux changements qui ont des consquences diffrentes. Un seul de ces changements modifie un site de restriction (site Alu : AGCT). 1 - Le changement de C en A ne modifie pas la maturation du transcrit primaire et lactivit 21- hydroxylase. 2 - En revanche, le changement de C en G ltat homozygote donne un dficit en 21-hydroxylase trs svre. QUESTION N17 (1 point) Le changement de C en A
A peut tre mis en vidence en amplifiant par PCR un fragment le contenant et en digrant le fragment amplifi par une enzyme de restriction B est un RFLP C est un polymorphisme appel SNP : single nucleotide polymorphism D peut tre mis en vidence en amplifiant par PCR un fragment le contenant et en faisant un dot blot E se trouve dans lintron 3 du gne CYP21
QUESTION N18 (3 points) Le changement de C en G
A fait disparatre le site Alu I (AGCT) B fait apparatre une mutation dltre qui scrit IVS2-13C>G C entranerait un dcalage du cadre de lecture si le site accepteur quil cre est utilis D donnerait une protine de 498 acides amins si le site accepteur quil cre est utilis E donnerait une protine tronque si le site accepteur quil cre est utilis
33 QUESTION N19 (2 points) En fait des expriences in vitro montrent que le site accepteur potentiel cre par ce changement du nuclotide 655 C en G nest pas reconnu. Le caractre dltre sexplique par des anomalies dpissage qui ne sont pas celle prvue. Ceci a t dmontr grce ltude de la corticosurrnale dune patiente homozygote pour cette mutation qui a subi une surrnalectomie bilatrale parce quelle ne prenait pas son traitement. A partir de ce tissu surrnalien, une protection de lARN total par la nuclase S1 a t ralise (rsultat figure ci-dessous : WT normal ; C>G homozygote pour la mutation). La sonde utilise commence en 5 au milieu de lintron 2 du gne CYP21 et se termine en 3 au milieu de lexon 3. Elle est marque par la mthode multi-amorcage au hasard . Lorigine des flches en pointill montre la fin de la protection de lARN en 5 (nuclotide en gras). Chaque fragment protg est numrot. La squence dADN situe sous la figure est la copie de lune des deux qui se trouvent la fin du fascicule.
A propos de cette protection la nuclase S1, A le marquage de la sonde a t effectu grce une polynuclotide-kinase B la sonde gnomique va shybrider avec lARNm mature soit normal soit mut C la nuclase S1 dgrade lADN ou lARN monobrin D cest une mthode plus sensible que la RT-PCR pour tudier lARNm E limage ci-dessus est une autoradiographie dun gel dacrylamide utilis pour le squenage
QUESTION N 20 (3 points)
LARN du patient homozygote pour la mutation C>G a t amplifi par la raction de RT-PCR et sous clon. Plusieurs clones ont t dtects par la mme sonde utilise pour la protection la nuclase S1. Le squenage de ces clones est fait avec une amorce situe au dbut de lexon 3 avant la dltion de 8bp prsente dans le pseudogne. Les bandes 1 et 2 correspondent aux fragments protgs de la figure incluse dans la question prcdente. On peut dire que
A lamorce utilise pour le squencage est 5AAGAACTACCCGGACCTGTCCTTG 3 B le squencage de lADNc correspondant lpissage dduite de la bande 1 permet de dire que lARNm mature sera 5CCACUUACCUUUCCCACCCU 3 C le squencage de lADNc correspondant lpissage dduite de la bande 2 permet de dire que le lARNm mature sera 5CCACUUACCUCCCCCACCUCCU 3 D la protine traduite partir de lARNm obtenu daprs lpissage dduite de la bande 1 est tronque E la protine traduite partir de lARNm obtenu daprs lpissage dduite de la bande 2 est tronque
5 CATCAGTTCCCACCCTCCAGCCCCCACCTCCTCCTGCAGACAAG 3 G W T
C > G Sens de la migration 1 2 3 5 CATCAGTTCCCACCCTCCAGCCCCCACCTCCTCCTGCAGACAAG 3 G W T
C > G Sens de la migration 5 CATCAGTTCCCACCCTCCAGCCCCCACCTCCTCCTGCAGACAAG 3 G W T
C > G Sens de la migration 1 2 3 34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
TATA Facteurs trans Facteurs de transcription de base ARN polymerase II Promoteur (~100 pb 500 pb) Rgion transcrite
Rgions rgulatrices
enhancer Signal de polyadenylation Exon
Exon
Exon
Intron
stop
ATG
Intron
AATAA 47
agccctccag gacaggctgc atcagaagag gccatcaagc aggtctgttc caagggcctt 60 tgcgtcaggt gggctcagga ttccagggtg gctggacccc aggccccagc tctgcagcag 120 ggaggacgtg gctgggctcg tgaagcatgt gggggtgagc ccaggggccc caaggcaggg 180 cacctggcct tcagcctgcc tcagccctgc ctgtctccca gatcactgtc cttctgcc 238 atggccctgtggatgcgcctcctgcccctgctggcgctgctggcc 283 M A L W M R L L P L L A L L A ctctggggacctgacccagccgcagcctttgtgaaccaacacctg 328 L W G P D P A A A F V N Q H L tgcggctcacacctggtggaagctctctacctagtgtgcggggaa 373 C G S H L V E A L Y L V C G E cgaggcttcttctacacacccaagacccgccgggaggcagaggac 418 R G F F Y T P K T R R E A E D ctgcagg gtgag ccaactgccc attgctgccc ctggccgccc ccagccaccc 470 L Q V cctgctcctg gcgctcccac ccagcatggg cagaaggggg caggaggctg ccacccagca 530 gggggtcagg tgcacttttt taaaaagaag ttctcttggt cacgtcctaa aagtgaccag 590 ctccctgtgg cccagtcaga atctcagcct gaggacggtg ttggcttcgg cagccccgag 650 atacatcaga gggtgggcac gctcctccct ccactcgccc ctcaaacaaa tgccccgcag 710 cccatttctc caccctcatt tgatgaccgc agattcaagt gttttgttaa gtaaagtcct 770 gggtgacctg gggtcacagg gtgccccacg ctgcctgcct ctgggcgaac accccatcac 830 gcccggagga gggcgtggct gcctgcctga gtgggccaga cccctgtcgc caggcctcac 890 ggcagctcca tagtcaggag atggggaaga tgctggggac aggccctggg gagaagtact 950 gggatcacct gttcaggctc ccactgtgac gctgccccgg ggcgggggaa ggaggtggga 1010 catgtgggcg ttggggcctg taggtccaca cccagtgtgg gtgaccctcc ctctaacctg 1070 ggtccagccc ggctggagat gggtgggagt gcgacctagg gctggcgggc aggcgggcac 1130 tgtgtctccc tgactgtgtc ctcctgtgtc cctctgcctc gccgctgttc cggaacctgc 1190 tctgcgcggc acgtcctggc ag 1202 tggggcaggtggagctgggcgggggccctggtgcaggcagcctgcag 1259 G Q V E L G G G P G A G S L Q cccttggccctggaggggtccctgcagaagcgtggcattgtggaacaatgctgtaccagcatctgc 1325 P L A L E G S L Q K R G I V E Q C C T S I C tccctctaccagctggagaactactgcaactagac gcagcccgca ggcagcccca 1380 48 S L Y Q L E N Y C N * cacccgccgc ctcctgcacc gagagagatg gaataaagcc cttgaaccag ccctgctgtg 1440 ccgtctgtgt gtcttggggg ccctg
Figure : Squence du gne de linsuline humaine
Quel tissu ? cDNA Pour isoler ce gne humain, une sonde d'ADN complmentaire de l'insuline a t obtenue partir
A d'une banque gnomique B d'une banque d'ADN complmentaire hpatique C d'une banque d'ADN complmentaire d'hypophyse D d'une banque d'ADN complmentaire de pancras E aucune rponse bonne
Taille (bases) ARNm mature ? L'ARN messager mature de l'insuline sans compter l'extrmit 3' polyA est peu prs long de ?
A 333 paires de bases B 350 paires de bases C 423 paires de bases D 465 paires de bases E 490 paires de bases Taille (bases) ARNm codante ?
Combien dintron contient le gne de linsuline ?
Quelle environ la taille (pb) de la proinsuline ?
Quelle la taille (acides amins) de la proinsuline ?
Combien d'acides amins contient le peptide signal de l'insuline? A 15 B 24 C 33 D 41 E 45
Chez un patient homozygote pour la mutation du nuclotide G en T appele R65L du gne de l'insuline, on ralise partir du plasma un western blot en utilisant un anticorps polyclonal de lapin reconnaissant les deux chanes de l'insuline ? Ci dessous se trouve la liste de diffrentes tapes exprimentales permettant d'tudier l'expression de ce gne mut de l'insuline (des tapes intermdiaires peuvent ne pas tre cites ou tre inutiles dans cette exprience). 1 - Lavage 2 - Incubation avec un anticorps anti-anticorps de souris li un enzyme 3 - Prise de sang 4 - Transfert sur une membrane de nylon ou nitrocellulose 5 - Incubation avec un anticorps anti-anticorps de lapin li un enzyme 6 - Electrophorse en utilisant un gel SDS-acrylamide avec mercaptothanol. 7 - Incubation avec l'anticorps polyclonal dirig contre l'insuline ? 8- Raction enzymatique avec formation d'un produit mesurable
49 Dans quel ordre, se droule la ralisation de ce Western blot ? A 3 - 7 - 6 - 4 - 2 - 8 - 1 B 3 - 6 - 4 - 7 - 5 - 1 - 8 C 3 - 7 - 6 - 4 - 2 - 8 - 1 D 3 - 6 - 4 - 7 - 2 - 8 - 1 E 3 - 7 - 6 - 4 - 5 - 8 1
Ci-dessus se trouvent 5 profils de Western blot.
En tenant compte de deux renseignements supplmentaires : - la bande accompagne d'une astrisque (*) correspond la proinsuline - on considre que la proinsuline est absente dans le sang d'un individu normal Rpondez aux questions suivantes
Quel est le profil de Western blot qui correspond un homme normal ?
QUESTION N57 (2 points) Quel est le profil du Western blot qui correspond l'individu homozygote pour la mutation R65L ?
QUESTION N 58 (3 points) Pour tudier cette mutation chez les parents et d'autres membres de la famille, un fragment d'environ 250 bp est amplifi par la mthode de PCR. Une des deux amorces se trouve proche du site accepteur de l'intron qui prcde l'exon qui porte cette mutation. Quelles sont parmi les amorces suivantes de 20 bp les deux que vous demanderiez synthtiser pour amplifier ce fragment qui contient la mutation ?
A 5' TGCTCTGCGCGGCACGTCCT 3' B 5' ACGCAGCCTGCAGGCAGCCC 3' C 5' GAACCAGCCCTGCTGTGCCG 3' D 5' CTTGGTCGGGACGACACGGC 3' E 5' CGGCACAGCAGGGCTGGTTC 3'
QUESTION N 59 (1 point) Nous rappelons que les sites de reconnaissance des enzymes de restriction, Eco RI et Hind III, sont les suivants: 5' G + AATT C 3' site Eco RI 5' A + AGCT T 3' site Hind III 3' C TTAA | G 5' 3' T TCGA | A 5' Chez un htrozygote pour cette mutation (un seul de ses deux chromosomes porte cette mutation), aprs amplification de ce fragment d'ADN que faites-vous pour mettre en vidence cette mutation R65L du gne de l'insuline ? Cochez les tapes utilises.
A coloration par le bleu de coomassie B digestion par l'enzyme Eco RI C digestion par l'enzyme Hind III D lectrophorse en utilisant un gel d'agarose X kD Marqueurs A B C D E * 0, 5X kD 50 E lectrophorse en utilisant un gel SDS-polyacrylamide
QUESTION N 60 (2 points) Quel profil obtient-on (rsultat 5 bp prs) ?
A 1 bande de 256 bp B 2 bandes de 174bp et 82 bp C 2 bandes de 154 bp et 102 bp D 3 bandes de 256 bp, 154 bp et 102 bp E 3 bandes de 256 bp, 174 bp et 82 bp
) أ (ةيضايرلا مولعلا كلسم) ةيسنرف رايخ (2 3 L'utilisation d'une calculatrice non programmable est autorisée Partie I: Restitution des connaissances (5 points)