Praktikum 3.

Potensial Aksi Gabungan pada Nervus Sciatic/Iskiadikus Katak

BBS1-FL-Pr3

Pada percobaan ini, akan dilakukan pengukuran potensial aksi gabungan (CAPs) dari nervus
iskiadikus katak yang terisolasi (sudah diambil dari katak), untuk mengambarkan sifat fisiologis
dasar impuls saraf.

Compound Action Potentials in the Frog Sciatic Nerve
Background
The fundamental unit of the nervous system is the neuron. Neurons and other excitable
cells produce action potentials when they receive electrical or chemical stimulation. The action
potential occurs as a large-scale depolarization when positive ions such as sodium rapidly enter
the neuron via specialized membrane channel proteins.
Action potentials are all-or-none events. Once an action potential begins, it propagates
down the length of the axon. When the action potential reaches the end of the axon, a
neurotransmitter is typically released into the synapse.
After an action potential occurs, the neuron must repolarize. During this time, called the
refractory period, the neuron is incapable of producing another action potential.
Measuring action potentials from single neurons requires highly specialized equipment.
In this lab, you will record compound action potentials (CAPs) from the isolated frog sciatic
nerve. CAPs represent the summed action potentials of the multitude of neurons that comprise a
nerve.
___________________________________________________________________________
Percobaan yang dilakukan :

Percobaan 1: Menentukan voltase ambang (threshold voltage) dan amplitudo maksimal CAP
Percobaan 2: Menentukan periode refraktori
Percobaan 3: Menentukan kecepatan konduksi saraf

Bahan yang dibutuhkan :
- Frog (Rana pipiens or Xenopus laevis)
- Forceps
- Dissection needle (jarum diseksi)
- Ringers solution katak(Table 1)
- Scalpel (pisau)
- Glass hook / fine blunt probe (batang kaca dengan pengait di ujungnya)
- Dissection tray (nampan)
- Petri dish (piring petri )
- Scissors (gunting)
- Fine thread (benang )
- Filter paper (kertas filter)
- Aluminum foil (sebaiknya ada)
- Pasteur pipette (pipet)


Double-pithing procedure (Cara pembuatan hewan spinal) :
1) pegang katak dengan tangan kiri, tundukkan kepalanya (lipat ke
arah ventral) di antara jari tengah dan telunjuk.
2) Gunakan jarum diseksi, tentukan daerah cekung (depression) di
dasar tengkorak; ini adalah foramen magnum.

3) Tusukkan (masukkan) jarum diseksi ke foramen magnum dan
tekan ke arah kranial untuk merusak otak katak.
4) Kemudian tarik jarum sebagian dan arahkan ke kaudal menuju
kolumna spinalis untuk merusak spinal cord. Kaki katak pada mulanya
akan tegang , dan kemudian menjadi flaksid (lumpuh) dan tidak
berespon (tidak menarik kakinya bila dipijit denga forsep).
Kondisi hewan yang sudah mengalami kerusakan pada spinal cord ini disebut juga
sebagai spinal animal.
5) Selanjutnya adalah melepaskan nervus sciatic dari katak.

Prosedur diseksi nervus :

1) Lepaskan kulit katak mulai dari abdomen dan kaki. Yaitu dengan menggunting kulit di
sekitar abdomen, dan tarik kulit ke arah bawah sehingga lepas.
2) Letakkan katak di nampan , jaga kelembaban preparat dengan meneteskan larutan Ringer
pada katak.
Gambar 1.
Pembuatan hewan
spinal (spinal
animal)
3) Jepit dan gunting urostil dan organ viseral abdomen hingga lepas. Akan terlihat pleksus
saraf seperti gambar 2. Hati hati ! jangan merusak pleksus saraf.

4) Secara diseksi tumpul (gunakan kaca pengait), lepaskan
nervus sciatic dari fascia dan jaringan lain.
5) Gunting nervus dari spinal cord, dan runut (reflect) sepanjang
serat saraf hingga ke kaki .
6) Ikat sepotong benang pada ujung yang sudah bebas, agar
dapat dipegang dengan hati-hati (handled gently !).

7) Dengan kaca pengait dan forseps lanjutkan pemisahan nervus
dari jaringan lain.
8) Lepaskan (gunting) nervus dari muskulus gastrocnemius.

9) Letakkan nervus di piring petri yang berisi larutan Ringer,
(dapat disimpan di lemari pendingin) .


Table 1: Recipe for frog Ringers solution.
Solute NaCl KCl CaCl
2
NaHCO
3

g/liter of
solution
6.5 0.14 0.12 0.2

Alat dan bahan yang digunakan :
- Sistem komputer
- PowerLab
- Software Scope
- Nerve Bath dan kabel-kabel, kabel tembaga halus, aluminum foil.
- Larutan Ringer
- Nervus sciatic, kertas filter
- Forceps, pipet.


Sacral
vertebra
Urostyle
Sciati c nerve
Semi -membranosus
Gastrocnemius
Gl uteus
Nerve branches
forming sci ati c
nerve
Gambar 2. Lokasi
nervus sciatic pada
katak
Cara Kerja :
Persiapan dan kalibrasi peralatan:
1) Sambungkan penjepit merah dan hitam yang terdapat
pada elektroda stimulator ke dua jenjang logam yang terletak
di sisi berlawanan pada nerve bath (gambar 1). Jarak kedua
elektroda 0,5 cm.

2) Sambungkan kabel merah (positif) BNC connector
elektroda stimulator ke output analog positif (+) di PowerLab.
Dan kabel hitam (negatif) output analog negatif (gambar 6).

3) Sambungkan lead (sadapan) merah dan hitam dari
elektroda perekam pertama ke dua jenjang logam pada nerve
bath (gambar 2). Hubungkan 8-pin DIN connector ke Pod
port Input 1 pada PowerLab (gambar 6).

4) Ulangi langkah 3 untuk elektroda perekam kedua.
Tapi tempatkan penjepit aligatornya lebih jauh dari elektroda
stimulator (gambar 3). Hubungkan pod ke Pod port Input 2
pada PowerLab (gambar 6).

5) Teteskan larutan Ringer ke dalam kolom penampung
di dalam Nerve Bath. Larutan tidak boleh sampai menyentuh
jenjang/jajaran logam. Note: OVERFILLING Nerve Bath
akan menyebabkan timbulnya hubungan pendek (short
circuit) pada percobaan.

6) Gunting sepotong kertas filter dan letakkan di atas
jajaran logam pada nerve bath (gambar 4) sehingga
menyentuh kedua elektroda stimulator dan kedua pasang
elektroda perekam. Basahi sedikit kertas tersebut dan pasang
penutup nerve bath. Ini bertujuan untuk melakukan tes
koneksi.

7) Sebelum menghidupkan the PowerLab pastikan ia
sudah terhubungkan ke komputer.
8) Jalankan program Scope pada komputer, dan buka file CAP Set Scope.
9) Pada Scope Application window, pilih menu Macro dan pilih test Connection.
Sekarang Scope akan merekam data selama 1 detik secara otomatis. Rangkaian stimulus
akan direkam secara serial (gambar 5). Bila tidak tampak, periksalah apakah penjepit
Gambar 4. Nerve Bath yang
sudah disiapkan untuk tes
koneksi, dengan kertas filter
dan larutan Ringer
Gambar 3. Posisi elektroda
perekam kedua pada Nerve
Bath.

Gambar 1. Posisi elektroda
stimulator pada nerve bath
Gambar 2. Posisi elektroda
perekam pertama pada Nerve
Bath.
terpasang dan kertas filter cukup lembab dan meliputi semua elektroda aktif pada the
Nerve Bath. Bila koneksi sudah berhasil, eksperimen dapat dimulai.
10) Ambil nervus dari larutan Ringer dengan cara menjepit pada kedua sisi benang. Note:
jangan menjepit nervus secara langsung (DO NOT GRASP THE NERVE WITH
FORCEPS! ) Hal itu akan merusak nervus.
11) Secara lembut (Gently) letakkan nervus pada sepotong kertas tisue atau filter, untuk
menyerap kelebihan larutan Ringer.
12) Pindahkan kertas filter dari Nerve Bath. Letakkan nervus melintang di atas jenjang,
pastikan ia mengenai semua koneksi (elektroda) aktif (gambar 6). Bila nervus terlalu
pendek, sedapat mungkin sesuaikan posisi elektroda perekam . Tutup kembali nerve bath.

Gambar 5. Scope Zoom window memperlihatkan
artifak/gambaran stimulus pada saat Test Connection macro.

Gambar 6. Diagram Nerve Bath dan PowerLab yang sudah
terpasang secara lengkap. Pastikan nervus melintang pada
semua pasangan elektroda.
Cara Melakukan Percobaan

Percobaan 1: Menentukan voltase ambang (threshold voltage) dan amplitudo maksimal CAP.

Pada percobaan ini serangkaian stimulus akan diberikan pada nervus, yang setiap kali akan
ditingkatkan amplitudonya. Dengan perekaman ini, voltase ambang pada nervus akan dapat
dianalisa, demikian juga voltase yang dibutuhkan untuk menimbulkan amplitudo maksimal CAP
.
1. Pada Scope window, pilih Macro: Threshold Voltage.
2. Scope akan menstimulasi secara otomatis dan merekam 40 rekaman (pages) data.
3. Setiap page data menunjukkan hasil dari voltase stimulus yang berbeda.
4. Amplitudo CAP dapat diukur dengan cara : pada data di CAP1 (Channel 1) gunakan
Waveform cursor untuk menentukan besar amplitudo. Nilai yang didapat oleh cursor
akan tampak di bagian kanan atas Scope Application window.
5. Ulangi hal tersebut pada semua pages. Dan catat hasilnya pada tabel 1 (pada Laporan
Praktikum).
6. Perhatikan pada level (nilai) stimulus berapa CAP terlihat pertama sekali. Juga tentukan
amplitudo maksimal CAP.



Percobaan 2: Menentukan periode refraktori

Percobaan ini dapat dilakukan setelah seluruh analisis pada Percobaan 1 selesai (tabel 1).
Pada percobaan ini PowerLab akan menstimulasi nervus dengan rangkaian stimulus. Dimana
pada setiap blok data, interval antar stimulus akan dikurangi. Cara ini untuk mendapatkan
periode refraktori relatif dan absolut dari nervus.

1) Dari hasil yang didapat pada tabel 1, tentukan voltase stimulus minimum yang
dibutuhkan untuk dapat membangkitkan CAP maksimal pada nervus.
Tuliskan hasilnya di sini : __________ mV
2) Pada Scope application window, pilih Macro: Refractory __mV. Note: terdapat empat
versi Refractory macro. Setiap versi menggunakan voltase stimulus yang berbeda. Pilih
voltase yang nilainya paling mendekati intensitas stimulus yang tertulis pada
langkah 1 di atas.
3) Scope akan merekam 15 rangkaian data (pages). Selama setiap page, dua stimulus akan
dipaparkan pada nervus. Dimana interval antara kedua stimulus tersebut akan semakin
berkurang pada page berikutnya.
4) Isilah tabel 2 pada Laporan Praktikum, dan lakukan analisis .
Menentukan Periode Rafrakter :

- Pilih rekaman CAPs di CAP1 pada setiap page data yang didapat dari percobaan 2.
- Buka Zoom window dan lakukan penilaian dengan menggunakan Waveform Cursor.
Catat setiap amplitudo CAP kedua ke dalam tabel 2.
- Interval stimulus yang digunakan dalam percobaan ini direkam secara berurutan
sebagaimana yang tertera dalam tabel 2. Tentukan pada interval stimulus manakah
pertama sekali terjadinya penurunan amplitudo CAP kedua. Ini adalah periode rafraktori
relatif.
- Dan tentukan pada interval stimulus yang mana CAP kedua sama sekali tidak tampak. Ini
merupakan periode refrakter absolut. Catat kedua hasil yang didapat ke dalam tabel 1.



Gambar 7. Scope Zoom window memperlihatkan dua pulses
untuk menentukan periode refraktori.

Percobaan 3: Menentukan kecepatan konduksi saraf

Dalam percobaan ini akan dihitung kecepatan CAP ketika merambat/berjalan di sepanjang
nervus.
1. Gunakan penggaris untuk mengukur jarak antara kedua lead hitam (negatif) elektroda
perekam. Catat hasilnya pada tabel 3 (pada Laporan Praktikum).
2. Pada Scope window, pilih Macro:Conduction Velocity
3. Scope akan merekam page data di dua channels selama 10 milliseconds.
4. Gunakan data yang didapat untuk mengisi tabel 3. Ikuti petunjuk analisis sebagaimana di
bawah ini.
5. Setelah semua perekaman dibuat, kembalikan nervus ke dalam larutan Ringer dingin dan
kembalikan kepada instruktur.
Menghitung kecepatan konduksi ( conduction velocity)
- Dari data percobaan 3, pilih kedua channels yang merekam CAP.
- Pada Zoom window, gunakan Marker dan Waveform cursor untuk menentukan interval
waktu yang dibutuhkan CAP untuk berjalan di antara kedua elektroda perekam (gambar
8).
- Letakkan marker pada puncak CAP pertama. Kemudian pindahkan waveform cursor ke
puncak CAP kedua. Baca nilai time pada Cursor yang tampak di Scope
application window. Catat nilai ini di tabel 3.
- Buatlah perhitungan dengan memasukkan nilai-nilai yang didapat kedalam rumus berikut
ini :

Conduction velocity (m/sec) =
distance between electrodes (cm)
time interval between CAPs (ms)
|
\

|
.
|
-
100 cm
1 m
|
\

|
.
|
-
1000 ms
1 sec
|
\

|
.
|

Gambar 8. Scope Zoom window memperlihatkan
prosedur analisis untuk menghitung kecepatan konduksi.
Informasi waveform Cursor tampak pada area di bawah
menu bar.
Laporan Hasil Praktikum

Nama : Tanda Tangan : ............................................
NIM :
Grup :
Tanggal praktikum : Tanda tangan Instruktur: .....................................
___________________________________________________________________________
Tugas rumah (homework) sebelum praktikum :
(Jawablah pertanyaan berikut ini pada tempat yang tersedia. Anda harus sudah menuliskan
jawabannya sebelum praktikum dimulai, instruktur akan memeriksa apakah tugas rumah ini
sudah selesai)

1) Apa perbedaan CAP dengan potensial aksi tunggal ?



2) Apa yang menyebabkan terjadinya periode refrakter relatif ?



3) Potensial aksi disebut sebagai respon yang all or none , mengapa nervus sciatic katak
memperlihatkan respon berjenjang (graded response) ?



4) Jelaskan dengan singkat peristiwa seluler yang terjadi sewaktu periode refrakter. Petunjuk :
berkaitan dengan proses repolarisasi
Hasil :
Tabel 1. Amplitudo CAP terhadap amplitudo stimulus
Amplitudo Stimulus
(mV)
Amplitudo CAP
(mV)
Amplitudo Stimulus
(mV) Amplitudo CAP (mV)
20 220
30 230
40 240
50 250
60 260
70 270
80 280
90 290
100 300
110 310
120 320
130 330
140 340
150 350
160 360
170 370
180 380
190 390
200 400
210 410
Threshold stimulus mV

voltage:
Maximum CAP
amplitude: mV


Tabel 2. Amplitudo CAP versus interval stimulus

Interval Stimulus (ms) Amplitude CAP kedua
4
3.5
3.0
2.5
2.0
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.0
Relative refractory
period:
ms
Absolute refractory
period:
ms





Tabel 3. Perhitungan kecepatan konduksi

Distance between recording electrodes: Cm
Time interval between CAP1 and CAP2: Ms
Conduction velocity m/s


Menentukan voltase ambang (threshold voltage)
Pada tempat di bawah ini, gambarlah kurve scatter plot yang menggambarkan hubungan
amplitudo CAP versus voltage stimulus, dengan menggunakan data dari tabel 1 (contoh seperti
gambar di bawah ini)


Grafik 1. Amplitudo CAP vs.Intensitas Stimulus
Amplitudo CAP maksimum
Apa yang dimaksud dengan amplitudo CAP maksimal ? berapakah voltase stimulus minimum
yang dibutuhkan untuk membangkitkan respon maksimal ?

Amplitudo maksimal CAP : ________ mV.

Voltase minimum untuk mendapatkan CAP maksimal CAP: ______________ mV.
Penentuan periode refraktori
Pada tempat di bawah ini, gambarkan kurve scatter plot yang menggambarkan hubungan
amplitudo CAP vs. interval stimulus . Gunakan data dari tabel 2. Paa grafik, tentukan periode
refrakter absolut dan relatif (seperti contoh di bawah ini)




-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 100 200 300 400 500
C
A
P

a
m
p
l
i
t
u
d
e

(
m
V
)

Stimulus Intensity (mV)
CAP amplitude vs. stimulus intensity



Grafik 2. Hubungan amplitudo CAP vs. pulse interval. CAP diukur setelah stimulus kedua.

Menghitung kecepatan konduksi
Tentukan kecepatan konduksi yang dihitung dari data pada tabel 3.
Kecepatan konduksi : ____________ m/sec.

Kesimpulan :
Jawablah pertanyaan berikut ini secara lengkap, sebagai sebuah paragraf.

1) Bagaimana pengertian respon all or none ? Apakah anda melihat respon ini pada data di
atas ? Jelaskan hasil yang didapat.





2) Jelaskan perbedaan antara periode refrakter relatif dan absolut.

0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
C
A
P

a
m
p
l
i
t
u
d
e

(
m
V
)

Pulse interval (ms)
CAP amplitude vs. pulse interval
Relative Refractory
Absolute Refractory Period


3) Jelaskan mekanisme seluler yang menyebabkan adanya periode refrakter.





4) Pada percobaan ini, telah dilakukan penilaian efek peningkatan intensitas stimulus terhadap
nervus. Bentuk stimulus yang bagaimana lagi yang dapat mempengaruhi kecenderungan/
tendensi nervus dalam membangkitkan CAP ?



5) Berdasarkan perhitungan kecepatan konduksi CAP, berapa lamakah waktu yang
dibutuhkan CAP untuk berjalan di sepanjang nervus bila panjangnya adalah 10 cm ?