PRCTICA DE LABORATORIO N 15 AISLAMIENTO Y CUANTIFICACION DEL GLUCGENO HEPTICO OBJETIVO Determinar y cuantificar los niveles de glucgeno heptico de los

pollos durante los estados de ayuno y con dieta balanceada (normal). MARCO TEORICO

El glucgeno es la forma principal de almacenaje de carbohidratos en los animales, se encuentra en proporcin mayor en el hgado (hasta 6%) y en el msculo, donde rara vez excede de 1%. Sin embargo, debido a su masa mayor, el msculo almacena tres a cuatro veces la cantidad de glucgeno que tiene el hgado como reserva. Al igual que el almidn, es un polmero ramificado de alfaglucosa . el glucgeno es un polisacrido de la D-glucosa con enlaces alfa 1-4, sin embargo, est ms ramificado, y su molcula es ms reducida que la amilopectina; las ramificaciones aparecen cada 8 a 12 residuos de glucosa. El glucgeno puede aislarse de los tejidos animales digirindolos con disoluciones calientes de KOH en las que los enlaces no reductores alfa 1-4 y alfa 1-6 son estables. (5)
El peso molecular del glucgeno varia ampliamente segn el grado de ramificacin, y el tamao global. En promedio se encuentra entre 2 y 5 millones. FUNDAMENTO El tejido heptico en presencia de una hidrlisis alcalina destruye a las protenas y el glucgeno queda intacto. El glucgeno es precipitado por su baja solubilidad con el alcohol, luego se resuspende el glucgeno y se cuantifica expresado en mg de glucosa por gramo de tejido heptico (previa hidrlisis cida con cido sulfrico). El cido Sulfrico del reactivo Antrona hidroliza al glucgeno en unidades de glucosa, la cual es convertida en hidroximetil furfural por el mismo cido y reacciona con antrona para dar un compuesto coloreado.

Reactivo de antrona en acido sulfrico

MATERIALES Tubos de ensayo, pipetas, centrifuga, fotocolormetro Hgado de dos pollos(uno de pollo con alimentacin normal y otro sometido a ayuno durante 24 horas) Solucin de hidrxido de Potasio (KOH) 30% Alcohol Etlico (CH3CH2 OH) 95 % Estandar de Glucosa 5 mg /100mL Reactivo Antrona 0.2% en cido Sulfrico (H2SO4 ) concentrado

PROCEDIMIENTO Se toman dos pollos, uno en ayunas y otro en estado normal de alimentacin. Se les sacrifica, y se le extrae el hgado rpidamente y se coloca en bao de hielo. Separar y pesar 0.5 a 1.0 g de cada hgado picar finamente, trasvasar a un homogenizador con 4 mL de solucin de hidrxido de potasio al 30%, y llevar a Bao de agua hirviente hasta hidrlisis de los tejidos durante 30 minutos Enfriar a chorro de agua fra y agregar 7 mL de etanol absoluto refrigerado para precipitar Centrifugar a 3,000 r.p.m. por 10 minutos Decantar el sobrenadante y disolver el residuo (glucgeno) con 100 ml de agua destilada

Un pollo en ayunas y un pollo comido

Disponer 6 tubos de ensayo y proceder de acuerdo al siguiente cuadro 1 blanco 2 ayunas 3 alimenta 4 estndar Glucgeno ais (ml) 0.50 0.50 Patrn de glucosa (ml) 0.50 Agua destilada (ml) 2.00 1.50 1.50 1.50 Rect, antrona (ml) 4.00 4.00 4.00 4.00

5 estndar 1.00 1.50 4.00

6 estndar 1.50 1.50 4.00

El reactivo de antrona debe aadirse rpidamente, de tal manera que el chorro caiga en el centro del tubo. Mezclar rpidamente, colocar los tubos en bao de agua hirviendo durante 10 minutos, enfriar y Leer la absorbancia a 620 nm en el fotocolormetro. Realizar los clculos correspondientes.

Calculos. Determnanos las concentraciones de glucosa en los tubos estndar Sabemos que un decilitro es 1dl= 100ml

5mg existen 100ml Entonces X 0.5ml

X=0.025mg de glucosa el estndar 4 5mg existen 100ml Entonces X 1.0ml

X=0.050mg de glucosa el estndar 5 5mg existen 100ml Entonces X 1.5ml

X=0.075mg de glucosa el estndar 6

Leer la absorbancia a 620 nm en el fotocolormetro

Tubos de muestra Pollo en ayunas Pollo que comi Estndar 4 Estndar 5 Estndar 6

absorvancias 0.2514 0.2696 0.3630 0.3740 0.3999

Sabemos que se usara el estndar 4 porque contiene la misma concentracin que el tubo de los pollos en estudio Glucosa mg/dl = Abs. Desconocido * 5mg/dl Abs. Estndar

g = P*F seria

=0.4485*5.0mg/dl = 0.4440

:101mg/dl

contraciones absorbancia 0,03462 0,2514 0,03713 0,2696 0,025 0,363 0,05 0,374 0,075 0,3999

Absorbancias Vs concentraciones de glucosa mg/ml

0.405 0.4 0.395 0.39 0.385 0.38 0.375 0.37 0.365 0.36 0.355 0 0.02 0.04 0.06 0.08 y = 0.738x + 0.3421 Series1 Linear (Series1)

CUESTIONARIO 1. Calcule de la concentracin de glucgeno en cada uno de las experiencias (hgado del pollo con alimentacin normal y en ayunas) y exprselos en mg de glucosa / g de tejido heptico.

2. Comprelos los valores obtenidos con los valores normales que indica en la referencia (Indique: el ttulo, autor, edicin, captulo y pgina). 3. Mediante que reaccin qumica se puede diferenciar el almidn de glucgeno. Escriba las estructuras qumica del almidn y del glucgeno. 4. Que funcin cumple el glucgeno en el organismo 5. KOH 30% en la experiencia.