MUESTRA DE CLCULOS Platos tericos: Donde: tr= Tiempo de retencin y w= Ancho de base del pico

. Patrn A (Pico Acetaminofen 275 nm):

Patrn A (Pico Acetaminofen 254 nm): Resolucin: Donde: tr1= Tiempo de retencin Acetaminofen, tr2= tiempo de retencin cafena w= correspondiente

Patrn A 275 nm: Patrn A 254 nm:

Tiempo de retencin neto o relativo: Donde: tr=tiempo de retencin, tm= tiempo muerto

Patrn A (pico Acetaminofen 275 nm ): Patrn A (pico Acetaminofen 254 nm ):

ANALISIS CUANTITATIVO Solucin estndar interno: 6 mcg Solucin de Cafena: Peso 0,0126 99% Pureza

Solucin de Acetaminofen: Peso 0,0125

Soluciones curva de calibracin:

Concentracin de Acetaminofen en Punto A:

Concentracin de Cafena en Punto A:

Concentracin de patrn interno en Punto A:

Punto

A B

Volumen tomado de S.M de Acetaminofen mL 3 2,5

Concentracin De Acetaminofen Final mcg/mL 150 125

Volumen tomado de S.M. de cafena mL 3 2,5

Concentracin final de Cafena mcg/ mL 19,5 16.25

Concentracin de Estndar primario mcg/mL 0,6 0,6

C 2 100 2 13 0,6 D 1,5 75 1,5 9,75 0,6 E 1 50 1 6,5 0,6 Tabla1. Datos de concentracin para curva de calibracin de cafena y Acetaminofen. RESULTADOS Tiempo de rea Concentracin rea Retencin Acetaminofen Acetaminofen Patrn (min) (mm2) (mcg/ml) Interno rea Ac/rea PI

0,7 1841,02051 150 3.656 0,503618614 0,696 2275,96167 125 5826,6958 0,390609318 0,699 891,56439 100 2834,50098 0,314540159 0,698 1085,18689 75 4062,9187 0,267095399 0,695 876,41034 50 4975,82432 0,176133698 Tabla 2. Resultados derivados del cromatograma para la curva de calibracin de Acetaminofen, mtodo de patrn interno.

0.6 0.5 Area Acetaminofen/Area PI 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -50 0 50 100 150 -0.1 Concentracion Acetaminofen (ug/ml) 200 y = 0.0031x + 0.019 R = 0.9824 Calibracion Acetaminofen

Grafica 1. Curva de calibracin para Acetaminofen, mtodo de patrn interno Tiempo de rea Cafena Retencin (mm2) (min) 1,111 1,107 1,107 1,108 918,13684 1239,69568 524,62006 535,83478 Concentracin rea rea (mcg/ml) Patrn Caf/rea PI Interno (mm2) 19,5 3.656 0,25116005 16,25 5826,6958 0,212761353 13 2834,50098 0,185083746 9,75 4062,9187 0,131884199

1,104 479,69385 6,5 4975,82432 0,096404901 Tabla 3. . Resultados derivados de los cromatogramas para la curva de calibracin de cafena, mtodo de patrn interno.

0.3 0.25

Area Cafeina/Area PI

0.2 0.15

y = 0.012x + 0.0193 R = 0.992

Calibracion Cafeina 0.1 0.05 0

-5

10 mcg/mL

15

20

25

Grafica 2. Curva de calibracin para cafena, mtodo de patrn interno

MUESTRA DE CALCULO DE LA CONCENTRACION DE FARMACOS EN AL MUESTRA C--Anlisis- TEORICO ACETAMINOFEN

Peso Tableta: 0,7042 g =704,2 mg Cantidad declarada de Acetaminofen: 500 mg Peso Tomado de Acetaminofen: 12,5 mg Peso muestra: 0,0176 g = 17,60 mg - Exacto

Concentracin Terica De Acetaminofen

EXPERIMENTAL ACETAMINOFEN

Muestra problema C: rea Acetaminofen: 514.16016 rea P. I.: 1333.30017 Acetaminofen/A. Patrn I.: 0, 3856297 INTERPOLANDO EN LA GRAFICA 1. Concentracin Acetaminofen:

Cantidad De Acetaminofen:

Cantidad total de activo en tableta:

Porcentaje (592,168 mg /500 mg) x 100 = 118,43%

CONCENTRACIN TEORICA DE CAFENA Peso Tableta 704,2 mg Peso Cafena en Tableta 65 mg Peso Tomado de la Tableta 17,60 mg Peso Tomado de Cafena 2,28 mg Concentracin Cafena 18,24 mcg/mL Tabla 3. Resumen de los clculos tericos para cafena. CONCENTRACIN EXPERIMENTAL DE CAFENA rea Cafena 210,94897 rea PI 1333.30017 rea Caf/rea PI 0,158215 Concentracin Cafena 11,57 mcg/mL Tabla 3. Resumen de los clculos experimentales para cafena. 3

Devolvindose en la Dilucin Concentracin de Cafena 11,57 mcg/mL Masa Cafena en 17,06 mg 1,44 mg Masa en Tableta 59,69 mg Porcentaje de Cafena 91,84 % Tabla 4. Resumen de los resultados obtenidos para la valoracin de cafena de manera experimental.

PATRON EXTERNO: Clculos y resultados: Para realizar la curva de calibracin, se utilizaron diferentes concentraciones de los estndares, para ello se realizaron las diluciones correspondientes: Muestra de clculo para la concentracin del estndar de acetaminofn: Peso: 12.6 mg Pureza 99%

Muestra ml para la segunda dilucin F 3 G 2.5 H 2 I 1.5 J 1 Tabla N1: concentracin de las muestras de estndar para acetaminofn.

concentracin

Muestra de clculo para la concentracin del estndar de cafena: Peso: 12.6 mg Pureza 99%

Muestra F G

ml para la tercera dilucin 3 2.5

concentracin

H 2 I 1.5 J 1 Tabla N2: concentracin de las muestras de estndar para cafena. Con las concentraciones reportadas anteriormente, se trabajo para hacer el anlisis pro medio de HPLC, arrojando los siguientes resultados: Muestra F = 150g/ml acetaminofen y 19.5 g/ml cafena

Cromatograma N 1 : muestra F Muestra G = 125g/ml acetaminofen y 16.25 g/ml cafena

Cromatograma N2: muestra G

Muestra H = 100g/ml acetaminofen y 13 g/ml cafena

Cromatograma N 3: muestra H Muestra I= 75g/ml acetaminofen y 9075 g/ml cafena

Cromatograma N4: muestra I Muestra J= 50g/ml acetaminofen y 6.5 g/ml cafeina

Cromatograma N 5 : muestra J Con los datos arrojados por el software para HPLC, se obtiene el area para los picos tanto de acetaminofen como de cafena, con ello se puede hacer la curva de calibracin para acetaminofen y tambin para cafena. rea Acetaminofen Concentracin (mm2) Acetaminofen (ug/ml) F 1982,7487 150 G 2410,9519 125 H 1742,86169 100 I 1172,70032 75 J 1147,71582 50 0 0 Tabla N3: datos para realizar la curva de calibracin para el acetaminofen Muestra

Curva de calibracin acetaminofn

3000 2500 Area Acetaminofen 2000 1500 Linear (Series1) 1000 500 0 0 50 100 150 200 Concentracion Acetaminofen (ug/ml) y = 16.327x R = 0.8652

Grfica 1: curva de calibracin para el acetaminofen Concentracin rea Cafena Cafena Muestra (mm2) (ug/ml) F 1033,59949 19,5 G 1257,69946 16,25 H 879,6806 13 I 628,96246 9,75 J 631,86249 6,5 0 0 Tabla N4: datos para realizar la curva de calibracin para la cafena

curva de calibracin para cafeina

1400 1200 Area Cafeina 1000 800 600 400 200 0 0 5 10 15 20 25 Concentracion Cafeina (ug/ml) y = 65.502x R = 0.8518 Linear (Series1)

Grafica 2: curva de calibracin para cafena Tratamiento de la muestra problema: Para analizar el contenido de una tableta de Dolex Forte, que contiene acetaminofen y cafena, se utilizaron los datos de MP4: Peso de la tableta: 693.5 mg Cantidad de tableta utilizada: 17.4 mg ( 12.5mg acetaminofn)

Cromatograma N 6: muestra problema 4. frmaco Acetaminofen cafena rea (mm2) 541.56 239.56

Para hallar la concentracin de acetaminofn en la tableta se despeja la ecuacin resultante de las curvas de calibracin:

Y= 16.327X X= Y/16.327 X= 541.56/16.327 X= 33,17 g/ml de acetaminofn

Para hallar la concentracin de cafena en la tableta se despeja la ecuacin resultante de las curvas de calibracin:

Y= 65,502X

X= Y/65,502 X= 239.56/65.502 X= 3,66 g/ml de cafena Muestra de clculo cantidad de acetaminofn en la tableta:

de acetaminofen en la tableta

165.4 mg Cantidad de cafena = 0,4575 mg

de acetaminofen en la tableta

Cantidad de cafena en la tableta= 18.23 mg Porcentaje de cafena en la tableta = 3.65% CALCULO DE LOS PARAMETROS CROMATOGRAFICOS: Platos tericos (N)

tr= Tiempo de retencin w= Ancho de base del pico Acetaminofen:

muestra problema G H I J F promedio N

Tiempo de Retencin (min) ancho del pico 0,717 0,699 0,695 0,695 0,695 0,695

N 0,044 0,0639 0,0735 0,0741 0,0737 0,0731 8497,338843 3829,152064 2861,178213 2815,030934 2845,6705 2892,576367 3956,824487

Cafena

muestra F G H I J problema promedio N

Tiempo de Retencin (min) ancho del pico 1,104 1,112 1,105 1,105 1,106 1

N 0,078 0,0689 0,0782 0,0788 0,0783 0,0507 6410,60355 8335,297575 6389,413989 6292,483702 6384,644318 15896,11319 8284,759388

Tiempo de retencin ajustado: tr-tm=t 0.717-0,57= 0,147

tr=tiempo de retencin tm= tiempo muerto Acetaminofen : Tiempo de Retencin (min) tiempo muerto 0,717 0,699 0,695 0,695 0,695 0,695

muestra F G H I J problema Cafena:

0,57 0,472 0,473 0,486 0,483 0,472

tiempo de retencin ajustado 0,147 0,227 0,222 0,209 0,212 0,223

muestra F G H I J problema

Tiempo de Retencin (min) tiempo muerto 1,104 1,112 1,105 1,105 1,106 1

0,57 0,472 0,473 0,486 0,483 0,472

tiempo de retencin ajustado 0,534 0,64 0,632 0,619 0,623 0,658

Resolucin:

tr1= Tiempo de retencin acetaminofn tr2= tiempo de retencin cafena w= correspondiente

Retencin relativa: Rr= t2/t1 Rr= 1,104/0,717 Tiempo de Retencin Tiempo de Retencin (min)cafena (min)acetaminofen retencin relativa 1,104 0,717 1,112 0,699 1,105 0,695 1,105 0,695 1,106 0,695 1 0,695 promedio

muestra F G H I J problema promedio

1,539748954 1,590844063 1,589928058 1,589928058 1,591366906 1,625899281 1,587952553

ANALISIS DE RESULTADOS En el desarrollo de la practica se encontraron varios inconvenientes que no nos permiten obtener certeza y confianza con en los resultados obtenidos, nicamente la determinacin de la curva de calibracin fue la ms confiable, an as esta falla en algunos puntos ya que el R 2 no dice que no es completamente lineal, se desconocen cules son dichos puntos pero no es conveniente quitar datos ni puntos, lo ms apropiado seria para este caso tener la posibilidad de desarrollar replicas -mnimo 3- para as poder comparar y escoger la ms apropiada, la que presente menos desviacin o hacer un promedio de los resultados de dichas replicas. Por otro lado si la cantidad de puntos fuera mayor tambin es posible realizar un tratamiento estadstico para corregir los valores que se desvan y obtener una mejor curva de calibracin, pero por falta de tiempo no es posible desarrollar ninguno de estos mtodos. Los problemas que se observaron fueron experimentales y no de mtodo, an siendo este tan sencillo, el primer inconveniente fue la fase mvil, solucin que estuvo mal preparada, pero esto se soluciono y se realizo la cromatografa, se obtuvieron los cromatogramas de de todas las muestras, pero en las muestras problemas no se observan los picos del patrn primario, tal vez porque no se agregaron a la solucin que se llevo al cromatograma o porque la concentracin no fue la apropiada, ya que se observan pequeos pico en los tiempos de retencin propios del patrn interno, acido benzoico. Con lo cual no es posible determinar la relacin rea de analito/rea de patrn interno y tampoco interpolar para hallar la concentracin de dichas muestras. Entonces dicho objetivo de la prctica no se cumplira. Con la intencin de comprender mejor la informacin que podramos obtener de una cromatografa de HPLC y continuar con el tratamiento de datos, tomamos una muestra problema preparada en otro grupo, pues es similar en la preparacin de todas las, aunque claro las condiciones diferirn, pero la intencin es comprender y tratar de obtener conclusiones para aprender. De esta manera se interpolo en las graficas, hallando las concentraciones de cada activo y la masa en la tableta, se observa que la muestra problema tiene concentraciones de ambos activos que entran en el rango de la curva de calibracin, pero para el Acetaminofen la concentracin es mucho mayor ( ) a la esperada tericamente (100 mcg/mL), por lo cual se obtiene un porcentaje final mayor (118,43 %) al especificado por la farmacopea la cual especifica que no debe ser mayo al 110 %, entonces se podra asegurar que el activo Acetaminofen no cumple. Por otro lado la cafena tiene una concentracin en el rango, 11,57 mcg/mL y mediante el tratamiento matemtico se obtiene un porcentaje igual a 91,84 % que se encuentra en el intervalo que sugiere la farmacopea que esta debe ser no menos del 90 % y no ms del 110 %, entonces podramos asegurar que se encuentra en el rango y cumple la norma que aconseja la farmacopea. Solo se desarrollo el anlisis cuantitativo por medio de la integracin automtica, utilizando las reas, los mtodos manuales de integracin no se utilizaron. Sus tiempos de salida dependen del nmero de interacciones, debidas a la afinidad con las fases La cromatografa que se hizo fue de fase reversa en la cual la polaridad de la fase mvil es mucho mayor a la de fase estacionaria, esta ultima era una columna rellena con el material tipo L1 macropartculas de octidecilsilano, slice poroso de baja polaridad con lo cual se puede evidenciar una mejor separacin, ya que se facilitan los procesos de absorcin y desorcion fundamentos de la cromatografa. Se desarrolla la deteccin a 275 nm como sugerencia de la farmacopea aunque se tambin se desarrolla a 254 nm para evidenciar los cambios en los

parmetros cromatograficos los cuales cambian con las condiciones operativas. Se observa que el nmero de platos tericos disminuyen con la disminucin de la longitud de onda igualmente la resolucin. Para el el anlisis de las tabletas de acetaminofn y cafena, por el mtodo externo, se debieron trabajar muestras de patrn estndar para cada frmaco, para realizar las curvas de calibracin y as posteriormente determinar el contenido de acetaminofn y cafena de una muestra problema. Al analizar las curvas de calibracin obtenidas se observa que no se obtuvo la linealizacin esperada, esto se refleja en los resultados del R2 (0,865 para acetaminofn y 0,85 para cafena). Con estos resultados obtenidos, se puede inducir que la prctica realizada pudo haber tenido errores experimentales, por ejemplo el peso inadecuado de los compuestos, o diluciones mal realizadas. Segn los datos obtenidos mediante la curva de calibracin, para la muestra 4 las cantidades calculadas de acetaminofn y cafena en la tableta no cumplen con las especificaciones de la farmacopea, segn las cuales la cantidad de acetaminofn y cafena deben estar entre no menos de 90% y no mas de 110%. Las cantidades encontradas segn el anlisis fueron de 33,08% de acetaminofn y 3,65% de cafena. Estos resultados estn muy por debajo de lo esperado, pro una parte se puede decir, que las tabletas no cumplen con la especificacin requerida, pero tambin hay que tener en cuenta los posibles errores experimentales cometidos por las personas que prepararon esta muestra. Al realizar el clculo del nmero de platos tericos para los dos frmacos se observo que para la cafena este fue mayor (8285 frente a 3957 del acetaminofn). Este resultado es de esperarse debido a las caractersticas estructurales de los dos frmacos, acetaminofn es mas polar que cafena, y debido a que esta cromatografa es en fase reversa, se espera que el compuesto menos polar sea mas retenido que el mas polar, as lo demuestran los cromatogramas, ya que acetaminofn eluye primero que cafena. Mientras mas tiempo este un analito en contacto con la fase mvil y la fase estacionaria, mayores sern los equilibrios que se presentan de intercambio entre la fose mvil y la fase estacionaria para un determinado analito y al ser la cafena menos polar podr ser mas retenida por la fase estacionaria que tambin es de carcter apolar. Respecto a la resolucin de los cromatogramas se puede decir que fue adecuada ya que permiti satisfactoriamente la elucin de los dos compuestos en un tiempo de retencin ptimo. Todas las muestras fueron analizadas mediante un equipo de cromatografa lquida de alta resolucin que utiliza inyeccin automtica, el detectores de fotodiodos (permite el analsis UV a diferentes longitudes de onda) y sistema de bombeo reciproco.. la fase estacionaria es slice porosa C18.

CONCLUSIONES Se cuantifico mediante patrn interno y externo las concentraciones de cafena y Acetaminofen en un producto terminado, pero este clculos es supuesto y no es posible comparar los resultados debido a inconvenientes en la preparacin de las muestras, solo se ejemplifica el tratamiento correcto de la informacin derivada de un cromatograma. Se desarrollo la cuantificacin por integracin automtica solamente, aunque claro se conocen los otros mtodos como la triangulacin y mediante el rea media del pico, no se desarrollaron los clculos por lo problemas experimentales de la practica. En el mtodo que incluye patrn externo se disminuyen los errores asociados a la inyeccin, por lo cual la precisin y exactitud de este mtodo es mayor. La tableta analizada (mp4) no cumple con la cantidad requerida segn las especificaciones de la farmacopea.Segn los parmetros farmacocinticos analizados, as como mediante la observacin de los cromatogramas, se ve que el acetaminofen es el compuesto que eluye primero debido a su ms alta polaridad, teniendo en cuenta que se trabajo en fase reversa, as el nmero de paltos tericos y el tiempo de retencin para la cafena es mayor.

BIBLIOGRAFIA 1) REMINGTON. Farmacia, Edicin 20, Editorial mdica Panamericana, Tomo 1. p.p: 686, 691 2) Douglas A. Skoog, Stanley R. Crouch, F. James Holler, Principios de Analisis Instrumental, Cengage Learning Editores, p. 823

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FARMACIA Practica de HPLC Sol ngel Solano 124876 William Orozco Toro 124931 OBJETIVOS Cuantificar los principios activos en una tableta de Dolex forte, cafena y Acetaminofen , mediante el uso de la cromatografa de HPLC. Determinar los parmetros cromatograficos Platos tericos, resolucin - mediante el anlisis de los cromatogramas y de esta manera inferir sobre la eficiencia y y sensibilidad del equipo.

Caracteristicas de la cromatografia: HPLC TIPO Reversa: La fase movil tiene una alta polaridad. Fase Mvil Agua:Metanol: Acido acetico -69:28:3Fase Estacionaria Octadecilsilano unido qumicamente a slice porosa macropartculas cermica s, de 3 m a 10 m de dimetro, o una varilla silcea porosa Velocidad de 2 mL/min Flujo Volumen de 10 mcL Inyeccin Tiempos de 0.3 acetaminofen retencin teorico 0.5 cafena 1.0 Acido benzoico Longitud de 275 aconsejado por la farmacopea Onda de deteccin CARACTERISTICAS DE LAS SUSTANCIAS ACETAMINOFEN: Es un frmaco con propiedades analgsicas, sin propiedades antiinflamatorias clnicamente significativas. Acta inhibiendo la sntesis de prostaglandinas, mediadores celulares responsables de la aparicin del dolor. Adems, tiene efectos antipirticos. Se presenta habitualmente en forma de cpsulas, comprimidos, supositorios o gotas de administracin ora Nombre IUPAC: N-(4 hidroxifenil)etanamida

Peso molecular: 151,17 g/mol Frmula qumica: C8H9NO2 Solubilidad 1: 1,4 g/100mL agua 20C. Soluble en etanol, Metanol, dimetilformamida. Punto de fusin: 169 C Caractersticas: polvo blanco cristalino inodoro Figura N1 Estructura Acetaminofen

CAFENA: Es un alcaloide del grupo de las xantinas, slido cristalino, blanco y de sabor amargo, que acta como una droga psicoactiva y estimulante. La cafena, es un estimulante metablico y del sistema nervioso central, y es usada tanto recreacionalmente como mdicamente para reducir la fatiga fsica y restaurar el estado de alerta mental en los casos que exista una inusual debilidad o aletargamiento. Nombre IUPAC: 1,3,7-trimetil- 1H-purina- 2,6(3H,7H)-diona 1,3,7-trimetilxantina Peso molecular: 194,19 g/mol Frmula qumica: C8H10N4O2 Solubilidad 1: 2,17 g/100mL agua 25C y 67 g/100 mL a 100 C Punto de fusin: 226,85 C Caractersticas: agujas blancas o polvo sin olor.