INSTRUCCIONES

TECRA
SALMONELLA INMUNOENSAYO VISUAL
PARA LA DETECCION DE SALMONELLA SPP. EN ALIMENTOS Y MUESTRAS RELACIONADAS
USESE SOLAMENTE PARA EL DIAGNOSTICO IN VITRO

Estas instrucciones deben seguirse cuidadosamente; la falta de ellas puede conducir a resultados inexactos.

Nueva version mayo de 2005 Instrucciones revisadas Seccion 3: materiales requeridos Seccion 5: metodos de enriquecimiento Seccion 8: desarrollo del inmunoensayo Seccion 10: problemas- guia de solucion

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TABLA DE CONTENIDOS
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. INTRODUCCION..3 PRINCIPIO DE LA PRUEBA.4 MATERIALES REQUERIDOS..5 INSTRUCCIONES GENERALES.6 METODOS DE ENRIQUECIMIENTO.7 PREPARACION DE MEDIOS PARA ENRIQUECIMIENTO..17 PREPARACION DE REACTIVOS PARA INMUNOENSAYO21 DESARROLLO DEL INMUNOENSAYO.22 BIBLIOGRAFIA.27 GUIA DE SOLUCION DE PROBLEMAS.28

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1.

INTRODUCCIN

TECRA INMUNOENSAYO SALMONELLA VISUAL (VIA) ES UNA PRUEBA DE INVESTIGACIN RPIDA Y ESPECFICA PARA LA DETECCIN IN VITRO DE SALMONELLA SPP. EN ALIMENTO, MUESTRAS DE ALIMENTO-RELACIONADAS CON EL AMBIENTE. DESPUS DEL ENRIQUECIMIENTO, POR LO MENOS 1 CFU DE SALMONELLA PUEDE SER DETECTADA EN 25 GRAMOS DE LA MUESTRA. LOS PRESUNTOS POSITIVOS SE DEBEN CONFIRMAR POR MTODOS ESTNDARES (VASE LA SECCIN 8, EL PASO 11 DE ESTAS INSTRUCCIONES). ESTO ES ESPECIALMENTE IMPORTANTE EN SITUACIONES TALES COMO LAS BITACORAS DEL PRODUCTO.

LA IMPORTANCIA DE LA SALMONELLA
LA SALMONELLA CONTINA SIENDO UNO DE LOS MICROORGANISMOS MS EXTENSAMENTE REPORTADOS EN ALIMENTOS EN EL MUNDO. LAS SALMONELLAS SE DISTRIBUYEN EXTENSAMENTE EN LA NATURALEZA Y PUEDEN SER AISLADAS DE UNA AMPLIA GAMA DE ALIMENTOS, ALIMENTOS PARA GANADO Y EN MUESTRAS AMBIENTALES. EL TECRA SALMONELLA VA, UTILIZA LOS ANTICUERPOS QUE RECONOCEN TODOS LOS TIPOS DE LAS SALMONELLAS PROBADAS HASTA AHORA. EN UN ESTUDIO, SOBRE 300 MUESTRAS DE UNA VARIEDAD AMPLIA DE FUENTES (QUE REPRESENTAN 152 SEROTYPES) FUERON PROBADAS Y DETECTADAS. OTROS ESTUDIOS HAN DEMOSTRADO QUE LA TECNICA DE TECRA SALMONELLA VA: ES POR LO MENOS TAN SENSIBLE COMO LAS TCNICAS ESTNDARES DE CULTIVO NO TIENE VIRTUALMENTE NINGUNA REACTIVIDAD CON OTROS TIPOS DE ENTEROBACTERIAS AOAC METODOS OFICIALES LOS METODOS OFICIALES AOAC HAN DETERMINADO Y APROBADO LOS MTODOS SIGUIENTES INCLUIDO TECRA SALMONELLA VIA SITUACIN APROBADO SITUACIN METODO AOAC METODO OFICIAL 989.14 SALMONELLA EN ALIMENTOS INMUNOENSAYO COLORIMETRICO POLICLONAL METODO DE INVESTIGACION CON CALDO DE CISTINA SELENITA Y CALDO DE TETRATIONATO (TECRA SALMONELLA VIA) METODO AOAC METODO OFICIAL 998.09 SALMONELLA EN ALIMENTOS ENZIMA COLORIMETRICO POLICLONAL INMUNOENSAYO INVESTIGACION METODO CON RAPPAPORT-VASSILIADIS [R 10] CALDO Y CALDO DE TETRATIONATO (TECRA SALMONELLA VIA)

APROBADO

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2.

El PRINCIPIO DE LA PRUEBA

LA PRUEBA DE TECRA SALMONELLA VA ES UN ANLISIS DE ENLACE ENZIMATICO DE IMMUNOENSAYO (ELISA) REALIZADO EN UNA CONFIGURACIN DE SANDWICH (VASE EL CUADRO 1).

CUADRO 1: PRUEBA ELISA PARA DETECTAR SALMONELLA

1.- ALTA ACEPTACION EN LA CAPTURA DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS PARA SALMONELLA SON ABSORBIDAS EN LA SUPERFICIE DEL POZO

2. SI LOS ANTGENOS DE LA SALMONELLA ESTN PRESENTES EN LA MUESTRA, ESTOS SON CAPTURADOS POR LOS ANTICUERPOS. EL RESTO DE LOS MATERIALES EN LA MUESTRA SE LAVAN.

3. EL SANDWICH ES COMPLEMENTADO POR LA ADICIN DE UNA ENZIMA-MARCADA CON ANTICUERPOS (CONJUGADO) ESPECIFICO PARA SALMONELLA

4. LA PRESENCIA DE SALMONELLA SE INDICA CUANDO EL CONJUGADO CONVIERTE EL SUBSTRATO A UN COLOR VERDE. ALTERNATIVAMENTE, NO HAY SALMONELLA, NO HAY COLOR VERDE

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3.3.1

MATERIALES REQUERIDOS
MATERIALES SUMINISTRADOS POR TECRA

REACTIVOS
NUMERO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. MATERIALES LAVADO DEL CONCENTRADO CONTROL POSITIVO DILUYENTE DEL CONTROL (CONTROL NEGATIVO) CONJUGADO DILUYENTE DEL CONJUGADO SUBSTRATO DILUYENTE DEL SUBSTRATO SOLUCION DE PARO POZOS REVESTIDOS POR ANTICUERPOS EN BOLSA RESELLABLE SOPORTE DE SEGURIDAD PARA POZOS MANUAL DE INSTRUCCIONES HOJA DE IDENTIFICACION DE LA MUESTRA POR NUMERO O LETRA TARJETA DE COLOR 1

3.2

MATERIALES REQUERIDOS PARA EL ENRIQUECIMIENTO DE LA MUESTRA

MEDIOS (SECCION 6) HOMOGENIZADOR O MEZCLADOR BOLSAS PARA HOMOGENIZAR INCUBADORA: 35-37C Y/O 41-43C PIPETAS SEROLOGICAS (1 ml)

3.3

MATERIALES REQUERIDOS PARA EL INMUNOENSAYO

INCUBADORA 35- 37C PIPETAS SEROLOGICAS (1ml) BOTELLA PLASTICA DE 500 ml (PICETA) PIPETAS PARA DISPENSAR DE 20l A 200l PUNTAS PARA PIPETOR CINTA PARAFILM BAO MARIA O EQUIVALENTE (100C) TUBOS TECRA O TUBOS EQUIVALENTES PARA CALOR

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3.4

ALGUNOS MATERIALES DISPONIBLES DE TECRA

DESCRIPCION
TECRA ENVIROSWAB AGUA PEPTONADA BUFERADA AGUA PEPTONADA BUFERADA IMBENTIN SUPPLEMENTO IMBENTIN SUPPLEMENTO IMBENTIN SUPPLEMENTO CALDO LACTOSADO CALDO M CALDO RAPPAPORT-VASSILIADIS [R10] CALDO BASE TETRATIONATO SOLUCION YODO/YODURADO CALDO SOYA TRIPTONA

CATALOGO DEL PRODUCTO

ENVSWB25 BPWMED500 BPWMED2000 IMBSUP50 IMBSUP1000 IMBSUP2000 TLBMED500 TMBMED500 RVRMED500 TTB (B) MED500 IISSUP250 TSBMED500

CANTIDAD
25 HISOPOS 500 gr 2 kg 50ml 1Lt 2Lt 500g 500g 500g 500g 250ml 500g

4.

INSTRUCCIONES GENERALES

TODOS LOS REACTIVOS SE DEBEN PREPARAR CUIDADOSAMENTE. LA FECHA DE LA RECONSTITUCIN SE DEBE ESCRIBIR EN LA ETIQUETA EXTERIOR DE LA CAJA. EL KIT SE DEBE UTILIZAR EN EL PLAZO DE 2 MESES DE LA RECONSTITUCIN TODOS LOS COMPONENTES SE DEBEN REFRIGERAR (2-8C) CUANDO NO SEAN UTILIZADOS. NO CONGELE. LOS COMPONENTES DE TECRA SALMONELLA VA ESTAN DISEADOS PARA SU USO COMO UNIDAD INTEGRAL. LOS POZOS DEL CONTROL POSITIVO [2], DEL CONJUGADOL [4] Y CELDAS REVESTIDAS CON ANTICUERPOS [9] QUE LLEVAN EL MISMO NMERO DE LOTE. EL CONTROL POSITIVO [2] (UN ESTNDAR INTERNO CALIBRADO) Y EL CONTROL NEGATIVO DEBEN SER APLICADOS CADA VEZ QUE SE REALIZA EL ANLISIS. HAY DOS SISTEMAS DE CONJUGADO *4+ Y DILUYENTE CONJUGADO *5+ RECONSTITUYA UN CONJUGADO INICIALMENTE Y EL OTRO EN LA CANTIDAD QUE SEA NECESARIO [4] SE DEBE UTILIZAR EN EL PLAZO DE UN MES DESPUS DE SER RECONSTITUIDO. LOS POZOS NO UTILIZADOS SE DEBEN ALMACENAR SIEMPRE EN LA BOLSA PROPORCIONADA Y RESELLAR.

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5.

MTODOS DE ENRIQUECIMIENTO:

ES POSIBLE QUE LOS ORGANISMOS VIABLES, PATGENOS ESTN PRESENTES AL UTILIZAR LAS MUESTRAS CONTAMINADAS. POR LO TANTO, LAS PRCTICAS ESTNDARES DE SEGURIDAD DEL LABORATORIO PARA EL MANEJO DE TALES ORGANISMOS DEBEN SER SEGUIDAS. ES IMPORTANTE ASEGURARSE DE QUE TODOS LOS CALDOS DE ENRIQUECIMIENTO SEAN PRE-CALENTADOS A LA TEMPERATURA DE INCUBACIN, ESPECIFICADA EN EL PROTOCOLO, PARTICULARMENTE CUANDO LAS MUESTRAS SON ANALIZADAS. PARA ASEGURAR LA CORRECTA MEZCLA DE LA MUESTRA EN LOS MEDIOS, HOMOGENICE O MEZCLE EN LA FORMA APROPIADA. ANTES DE UTILIZAR TECRASALMONELLA VIATM DEBE REALIZARSE UN PRE-ENRIQUECIMIENTO DEL ENRIQUECIMIENTO FINAL PARA ASEGURARSE DE QUE CUALQUIER SALMONELLA SPP. EN LA MUESTRA SE MULTIPLICAR A LOS NIVELES PERCEPTIBLES. EL PROTOCOLO QUE SE UTILIZAR DEPENDE DE UN NMERO DE FACTORES.

5.1

ELIGIENDO UN MTODO DE PRE-ENRIQUECIMIENTO

LOS CALDOS DE PRE-ENRIQUECIMIENTO USADOS EN ESTUDIOS DE VALIDACIN DE AOAC SON RECOMENDADOS POR LA FDA Y EL MANUAL ANALTICO BACTERIOLGICO. PARA LA MAYORA DE LOS TIPOS DE ALIMENTOS, EL CALDO LACTOSADO ES EL MEDIO RECOMENDADO PARA EL PRE-ENRIQUECIMIENTO. PARA OTROS, NO-AOAC, APROB OTRO TIPO DE PROCEDIMIENTOS, EL AGUA DE PEPTONA BUFERADA SE PUEDE UTILIZAR PARA EL PREENRIQUECIMIENTO. TODOS LOS PROTOCOLOS DE ENRIQUECIMIENTO RECOMENDADOS (VASE LA SECCIN 5.2) REQUIEREN UN PASO DE PRE-ENRIQUECIMIENTO PARA RE-VIVIR A LAS SALMONELLAS SPP DAADAS. E INCREMENTAR EL NUMERO DE CLULAS. LA OPCIN DEL MTODO DEL PRE-ENRIQUECIMIENTO ES MUY IMPORTANTE, Y DEPENDE DE LAS MUESTRAS QUE SE PROBARN. PARA ALGUNOS ALIMENTOS EN ESPECFICO LOS MEDIOS DE PRE-ENRIQUECIMIENTO SON ALTAMENTE RECOMENDADOS Y SE DEBEN UTILIZAR PREFERENTEMENTE A OTROS MEDIOS QUE SE NOMINEN EN EL PROTOCOLO DEL MTODO.

CARNE, ALIMENTOS CON CARNE, Y SUB PRODUCTOS DE LA CARNE.

AGREGUE HASTA 2.25ml DE IMBENTIN AUTOCLAVEADO O DE TRITN X-100 COMO ENRIQUECIMIENTO A 25g. DE MUESTRA MEDIO DE PRE-

LECHE EN POLVO
UTILICE 225 ml DE MEDIO AGUA VERDE BRILLANTE (BGW) EN 25g. DE MUESTRA

HUEVOS, HUEVO LIQUIDO, HUEVOS DUROS

UTILICE 225 ml DE CALDO DE TRIPTONA DE SOYA (TSB) EN 25g DE MUESTRA

COCO
UTILICE 225 ml. DE CALDO DE LACTOSA (LB) CON 2.25ml. DE IMBENTIN O TRITON X-100 EN 25g DE MUESTRA

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PRODUCTOS SECOS
UTILICE 225 ml TSB EN 25g DE MUESTRA. (NOTA: PARA ACTIVAR LOS PRODUCTOS SECOS UTILICE CALDO DE LAURIL TRIPTOSA (LTB) PUEDE SER SUBSTITUIDO POR CISTINA SELENITO (CS) EN EL PROTOCOLO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO)

DULCES (INCLUIDOS CHOCOLATE Y COCOA)

UTILICE 225 ml DE LECHE DESCREMADA CON 0.45ml DE SOLUCION VERDE BRILLANTE (BGDS) EN 25g DE MUESTRA

CONGELADOS Y MEZCLAS
UTILICE 225ml CALDO NUTRIENTE (NB) EN 25g DE MUESTRA

TODAS LAS ESPECIES, CANELA, OREGANO

1:100 DE MUESTRA EN TSB

CLAVO (ESPECIA)
1:1000 DE MUESTRA EN TSB

ESPECIES
UTILICE 225 ml TSB EN 25g DE MUESTRA

CEBOLLA Y AJO
ADICIONAR SULFITO DE POTASIO EN TSB Y PROPORCIONAR UNA CONCENTRACION FINAL DE 0.5%. UTILICE 225ml MBPW EN 25g DE MUESTRA.

CULTIVOS INICIADORES PARA FERMENTAR ALIMENTOS

UTILICE 225ml MBPW EN 25g DE MUESTRA

5.2. PARA ELEGIR UN PROTOCOLO SELECTIVO DE ENRIQUECIMIENTO REFIERA A LA TABLA 1 PARA DETERMINAR EL PROTOCOLO MS CONVENIENTE PARA SU LABORATORIO.
CADA PROTOCOLO DE ENRIQUECIMIENTO TIENE PROCEDIMIENTOS SEPARADOS PARA EL ANLISIS DE LAS MUESTRAS DEPENDIENTES EN LA CARGA MICROBIANA. LOS ALIMENTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA TALES COMO POLVOS DE LECHE, CACAO, HARINA DE SOJA, CHOCOLATE, HARINA, HUEVO EN POLVO Y ALMIDONES REQUIEREN UN PASO SELECTIVO MS CORTO QUE EL ENRIQUECIMIENTO EN LOS ALIMENTOS CON ALTAS CARGAS MICROBIANAS TALES COMO CARNES, PESCADOS, AVES DE CORRAL, COMIDA CON CARNE Y SUBPRODUCTOS CRUDOS DE LA CARNE.

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TABLA 1 SELECION DEL PROTOCOLO DE ENRIQUECIMIENTO

PROTOCOLOS DESTACADOS
APROBACIONES ENRIQUECIMIENTO ESTNDAR AUSTRALIANO ISO 6579* SELECTIVO SIMPLE SELECTIVO TOXICOBAJO PERMITE LA PREPARACIN DE MEDIOS POR ADELANTADO INCUBACION TEMPERATURAS REQUERIDAS 35-37C 41-43C METODO APLICABLE PARA HISOPOS

PROTOCOLO

NOMBRE
AOAC
+

1 2 3 5 6 7

RV(R10)/TT RV(R10) TT TT/SC RV/MSCORSC RV/MSC ENVIROSWAB METODO

+ AOAC aprobacion para todos los alimentos. # El mtodo deque usa los caldos selectivos recomendados en el estndar australiano AS1766.2.5 continuando con enriquecimientos en el caldo M * validado contra ISO 6579.

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PROTOCOLO 1 RV [R10] / TT-AOAC APROBACION METODO (998.09) OPCION 1 PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA
PRE-ENRIQUECIMIENTO ADICIONAR 25g DE MUESTRA 225ml. LB INCUBAR A 35-37C DE 18 A 22 HRS.

REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 1 ml.PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 0.1ml PARA PRE- ENRIQUECIMIENTO EN 9 ml. DE CALDO TT PRE-CALENTADO EN 9.9 ml. DE CALDO RV PRE CALENTADO INCUBAR A 41-43C POR 6-8 HORAS.

REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE TT EN 10ml.DE TRANSFERIR 1ml. DE RV [R10] EN 10ml CALDO M PRE- CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 16-20 HRS

REALIZAR ELISA

PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA ALTA ALIMENTOS CRUDOS

PRE-ENRIQUECIMIENTO ADICIONAR 25g. DE MUESTRA A 225ml. LB INCUBAR A 35-37C DE 18-22 HORAS

REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 1 ml.PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 0.1 ml PARA PRE- ENRIQUECIMIENTO EN 9 ml. DE CALDO TT PRE-CALENTADO EN 9.9 ml. DE CALDO RV[R10] PRE CALENTADO INCUBAR A 41-43C POR 16-20 HORAS.

REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE TT EN 10ml.DE TRANSFERIR 1ml. DE RV [R10] EN 10ml. CALDO M PRE- CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 6-8 HRS REALIZAR ELISA

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PROTOCOLO 2 RV [R10] / TT-AOAC APROBACION METODO (998.09) OPCION 2 PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA
PRE-ENRIQUECIMIENTO ADICIONAR 25g DE MUESTRA 225ml. LB INCUBAR A 35-37C DE 18 A 22 HRS.

REALIZAR UN ENRIQUECIMIENTO SELECTIVOS TRANSFERIR 0.1 ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 9.9 ml. DE CALDO RV [R10] PRE-CALENTADO INCUBAR A 41-43C POR 6-8 HORAS.

REALIZAR UN POST-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml. DE RV [R10] EN 10ml. DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 16-20 HRS

REALIZAR ELISA

PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA ALTA ALIMENTOS CRUDOS

PRE-ENRIQUECIMIENTO ADICIONAR 25g. DE MUESTRA A 225ml. LB INCUBAR A 35-37C DE 18-22 HORAS

REALIZAR UN ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO TRANSFERIR 0.1ml PARA PRE- ENRIQUECIMIENTO EN 9.9 ml. DE CALDO RV[R10] PRE CALENTADO INCUBAR A 41-43C POR 16-20 HORAS.

REALIZAR UN POST-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml. DE RV [R10] EN 10ml. DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 6-8 HRS REALIZAR ELISA

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PROTOCOLO 3 TT-AOAC APROBACION METODO (998.09) OPCION 3 PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA
PRE-ENRIQUECIMIENTO ADICIONAR 25g DE MUESTRA 225ml. LB INCUBAR A 35-37C DE 18 A 22 HRS.

REALIZAR UN ENRIQUECIMIENTO SELECTIVOS TRANSFERIR 1ml PARA PRE- ENRIQUECIMIENTO EN 9 ml. DE CALDO TT PRE CALENTADO INCUBAR A 41-43C POR 6-8 HORAS.

REALIZAR UN POST-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml. DE TT EN 10ml. DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 16-20 HRS

REALIZAR ELISA

PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA ALTA ALIMENTOS CRUDOS

PRE-ENRIQUECIMIENTO ADICIONAR 25g. DE MUESTRA A 225ml. LB INCUBAR A 35-37C DE 18-22 HORAS

REALIZAR UN ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 9 ml. DE CALDO TT PRE CALENTADO INCUBAR A 41-43C POR 16-20 HORAS.

REALIZAR UN POST-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml. DE TT EN 10ml. DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 6-8 HRS

REALIZAR ELISA DISTRIBUCIONES BIOTECNOLOGICAS S.A. DE C.V. TELS. (55) 55-60-25-58 53-63-82-41 53-73-60-96 12

PROTOCOLO 4 TT/SC-AOAC APROBACION METODO (998.14) PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA

PRE-ENRIQUECIMIENTO ADICIONAR 25g DE MUESTRA 225ml. LB INCUBAR A 35-37C DE 18 A 22 HRS.

REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 1 ml.PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 9 ml. DE CALDO TT PRE-CALENTADO EN 9ml. DE CALDO SC PRE-CALENTADO INCUBAR A 41-43C POR 6-8 HORAS.

REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE TT EN 10ml.DE TRANSFERIR 1ml. DE SC EN 10ml. CALDO M PRE-CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 16-20 HRS

REALIZAR ELISA

PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA ALTA ALIMENTOS CRUDOS

PRE-ENRIQUECIMIENTO ADICIONAR 25g. DE MUESTRA A 225ml. LB INCUBAR A 35-37C DE 18-22 HORAS

REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 1 ml.PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE- ENRIQUECIMIENTO EN 9 ml. DE CALDO TT PRE-CALENTADO EN 9ml. DE CALDO SC PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C POR 16-20 HORAS.

REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE TT EN 10mlDE TRANSFERIR 1ml. DE SC EN 10ml. CALDO M PRE-CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 6-8 HRS REALIZAR ELISA

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PROTOCOLO 5 RV/MSC O SC- VALIDADO ATRAVES DE NF ISO 6579 PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA
PRE-ENRIQUECIMIENTO MUESTRA SECA OTROS PRODUCTOS ADICIONAR 25g DE MUESTRA A 50 ml BPW. ADICIONAR 25g DE MUESTRA A 225 ml INCUBAR A 20-25C POR 2 HORAS. BPW. INCUBAR A 35-37C POR 18-22 HRS. ADICIONAR 175 ml BPW. INCUBAR A 35-37C POR 16-20 HRS

DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 0.1ml PARA PRE ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 10ml DE RV PRE-CALENTADO EN 10ml DE MSC PRE-CALENTADO O INCUBAR A 41-43C DE 6-8 HORAS TRANSFERIR 10ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 100ml DE MSC PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 6-8 HRS.

REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE RV EN 9ml.DE CALDO M TRANSFERIR 1ml. DE MSC O SC EN 9ml. PRE-CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 16-20 HRS

REALIZAR ELISA

PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA ALTA ALIMENTOS CRUDOS

PRE-ENRIQUECIMIENTO ADICIONAR 25g. DE MUESTRA A 225ml. BPW INCUBAR A 35-37C DE 18-22 HORAS REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 0.1mlPARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 10ml DE RV PRE-CALENTADO EN 10ml DE MSC PRE-CALENTADO O INCUBAR A 41-43C DE 16-20 HORAS TRANSFERIR 10ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 100ml DE SC PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 16-20 HRS.

REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE RV EN 9ml.DE CALDO M TRANSFERIR 1ml. DE MSC O SC EN 9ml. PRE-CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 6-8 HRS REALIZAR ELISA DISTRIBUCIONES BIOTECNOLOGICAS S.A. DE C.V. TELS. (55) 55-60-25-58 53-63-82-41 53-73-60-96 14

PROTOCOLO 6 METODO RV/MSC PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA

PRE-ENRIQUECIMIENTO ALIMENTOS DESHIDRATADOS TODOS LOS DEMAS ALIMENTOS ADICIONAR 25g DE MUESTRA A 50 ml BPW. ADICIONAR 25g DE MUESTRA A 225 ml BPW INCUBAR A 20-25C POR 2 HORAS. INCUBAR A 35-37C POR 18-22 HRS. ADICIONAR 175 ml BPW. INCUBAR A 35-37C POR 16-20 HRS

DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 0.1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 9.9ml DE RV PRE-CALENTADO EN 9ml DE MSC PRE-CALENTADO INCUBAR A 41-43C DE 6-8 HORAS INCUBAR A 35-37C DE 6-8 HRS

REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE RV EN 9ml.DE CALDO M TRANSFERIR 1ml. DE MSC EN 9ml. PRE-CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 16-20 HRS

REALIZAR ELISA

PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA ALTA - ALIMENTOS CRUDOS

PRE-ENRIQUECIMIENTO ADICIONAR 25g. DE MUESTRA A 225ml. BPW INCUBAR A 35-37C DE 18-22 HORAS REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 0.1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 9.9ml DE RV PRE-CALENTADO EN 9ml DE MSC PRE-CALENTADO INCUBAR A 41-43C DE 16-20 HORAS INCUBAR A 35-37C DE 16-20 HRS

REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE RV EN 9ml. TRANSFERIR 1ml DE MSC EN 9ml. DE CALDO M PRE-CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 6-8 HRS

REALIZAR ELISA

DISTRIBUCIONES BIOTECNOLOGICAS S.A. DE C.V. TELS. (55) 55-60-25-58

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PROTOCOLO 7 HISOPOS PARA MEDIO AMBIENTE

PRE-ENRIQUECIMIENTO HISOPADO REQUERIDO TECRA ENVIROSWAB ADICIONAR 20ml BPW AL TUBO DEL HISOPO INCUBAR A 35-37C DE 18-22 HRS

REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 0.1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 9.9ml DE RV PRE-CALENTADO EN 9ml DE MSC PRE-CALENTADO INCUBAR A 41-43C DE 16-24 HORAS INCUBAR A 35-37C DE 16-24 HRS

REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE RV EN 9ml.DE TRANSFERIR 1ml. DE MSC EN 9ml CALDO M PRE-CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37C DE 6-8 HRS

REALIZAR ELISA NOTA: LOS LABORATORIOS UTILIZAN HISOPOS DISTINTOS A LOS DE TECRA ENVIROSWAB PARA VALIDAR EL USO DE MEDIOS ADECUADOS PARA CADA TIPO DE MUESTRA

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6.

PREPARACION DE MEDIOS PARA ENRIQUECIMIENTO

SE SUGIERE UTILIZAR MEDIOS DE LA MARCA TECRA DE 3M (VER SECCION 3.4)

PRECAUCION: CUANDO SE SIGAN LOS PROCEDIMIENTOS DE AOAC, TENGA PARTICULAR CUIDADO, EN LA PREPARACION, DE DOS DE LOS MEDIOS SELECTIVOS: 1. CALDO SELENITO CISTINA.- DEBE SER PREPARADO Y UTILIZADO INMEDIATAMENTE CON PRIORIDAD EN SU USO. 2. AGENTES SELECTIVOS YODO-YODURADO Y VERDE BRILLANTE, DEBERA SER ADICIONADO A LA PREPARACION DEL CALDO DE TETATRIONATO BASE Y DAR UN USO PRIORITARIO.
EL AJUSTE CORRECTO DEL pH DE LOS MEDIOS PREPARADOS Y LA VERIFICACION DEL pH PARA LA ESTERILIZACION ES MUY IMPORTANTE, SI SE NECESITA AJUSTARLO, UTILICE ACIDO CLORHIDRICO (HCL 1M) O HIDROXIDO DE SODIO: (NaOH 1M). 6.1 AGUA PEPTONADA BUFERADA (BPW) TECRA CATALOGO: BPWMED500 o BPWMED2000 AGAR DE PEPTONA CLORURO DE SODIO FOSFATO DISODICO (SODIO FOSFATO DIBASICO) [Na2HPO4 ] FOSFATO POTASICO (FOSFATO DICIDO DE POTASIO) [KH2PO4] 10.0g. 5.0g. 3.5g. 1.5g.

DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1 LT. DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR TOTALMENTE. DISPENSAR Y ESTERILIZAR POR AUTOCLAVE A 121C POR 15 min. pH FINAL 7.0- 7.4 A 25C. 6.2 VERDE BRILLANTE SOLUCION AL 1% (BGDS) VERDE BRILLANTE (ACUOSO) AGUA PURIFICADA DISOLVER INGREDIENTES Y MEZCLAR TOTALMENTE. 6.3 VERDE BRILLANTE AGUA (BGW) ADICIONAR 2ml DE BGDS A I L DE AGUA PURIFICADA Y MEZCLAR. DISPENSAR Y ESTERILIZAR POR AUTOCLAVE A 121C POR 15 min. pH FINAL 6.8-7.2 A 25C. 6.4 IMBENTIN TECRA CATALOGO: IMBSUP 50, IMBSUP1000 o IMBSUP2000 COLOCAR EN VAPOR 100 ml DE IMBENTIN SUPLEMENTO EN UNA BOTELLA VERTICAL, CON TAPA AFLOJADA LIGERAMENTE EN BAO MARIA o AUTOCLAVE A 121 C DURANTE 15 min. REMOVER LA BOTELLA DEL BAO MARIA O DE LA AUTOCLAVE Y PERMITIR ENFRIAR A TEMPERATURA AMBIENTE (20-25 C) DISTRIBUCIONES BIOTECNOLOGICAS S.A. DE C.V. TELS. (55) 55-60-25-58 53-63-82-41 53-73-60-96 17 0.1g 10.0ml

NOTA: EL IMBENTIN SE UTILIZARA EN DOS ETAPAS DESPUS DE APLICAR VAPOR. UNA VEZ QUE HA LLEGADO A TEMPERATURA AMBIENTE, CERRAR LA TAPA FUERTEMENTE Y SUAVEMENTE INVERTIR LA BOTELLA VARIAS VECES PARA MEZCLAR EL CONTENIDO. ETIQUETAR LA BOTELLA CON LA FECHA QUE FUE TRATADO EL IMBENTIN. USAR DENTRO DE LOS SIGUIENTES SEIS MESES DE TRATAMIENTO. ALMACNAR POR ENCIMA DE 10 C. 6.5 CALDO DE LACTOSA (LB) TECRA CATALOGO: TLBMED500 AGAR DE PEPTONA EXTRACTO DE RES EN POLVO PEPTONA DE CARNE LACTOSA 5.0g. 2.5g. 0.5g. 5.0g.

DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1Lt DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR TOTALMENTE DISPENSE LOS VOLUMENES REQUERIDOS Y ESTERILICE POR AUTOCLAVE A 121C POR 15 min. pH FINAL 6.7-7.1 25C 6.6 CALDO LAURIL TRIPTOSA (LTB) TRIPTOSA LACTOSA CLORURO DE SODIO FOSFATO DIPOTASICO (FOSFATO MONOACIDO DE POTASIO) [K2HPO4] FOSFATO POTASICO (FOSFATO DICIDO DE POTASIO) [KH2PO4] LAURIL SULFATO DE SODIO 20.0g 5.0g 5.0g 2.75g 2.75g 0.1g

DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1Lt DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR TOTALMENTE DISPENSE LOS VOLUMENES REQUERIDOS Y ESTERILICE POR AUTOCLAVE A 121C POR 15 min. pH FINAL 6.6-7.0 25C 6.7 L-CISTINA SOLUCION L-CISTINA HIDROXIDO DE SODIO 0.1g 15.0ml

DISOLVER L-CISTINA EN EL HIDROXIDO DE SODIO Y DILUIR EN 100ml CON AGUA PURIFICADA NO UTILIZAR AUTOCLAVE. 6.8 CALDO MANITOL CISTINA SELENITO (MSC) TRYPTONA MANITOL SELENITO DE SODIO (NaHSeO3) FOSFATO DISODICO (Na2HPO4) SOLUCION DE L-CISTINA 5.0g 4.0g 4.0g 10.0g 10.0ml.

DISOLVER LOS INGREDIENTES, EXCEPTO LA CISTINA, EN 1 Lt. DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR VIGOROSAMENTE. DOSIFICAR LOS VOLUMENES REQUERIDOS DENTRO DE CONTENEDORES ESTERILES Y CALENTAR EN BAO MARIA, O VAPOR POR 10 min. NO UTILIZAR AUTOCLAVE, ENFRIAR Y ADICIONAR LA SOLUCION DE L-CISTINA EN CANTIDAD DE 0.1 ml. EN 10ml. UTILICE EL MISMO DIA DE PREPARACION DISTRIBUCIONES BIOTECNOLOGICAS S.A. DE C.V. TELS. (55) 55-60-25-58 53-63-82-41 53-73-60-96 18

6.9

CALDO M PEPTONA CASEINA EXTRACTO DE LEVADURA D-MANNOSE CITRATO DE SODIO CLORURO DE SODIO FOSFATO DIPOTASICO (K2HPO4) CLORURO DE MANGANESO SULFATO DE MAGNESIO SULFATO FERROSO POLISORBATO 80 (TWEEN 80) 12.5g 5.0g 2.0g 5.0g 5.0g 5.0g 0.14g 0.8g 0.04g 0.75g

DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1 Lt DE AGUA PURIFICADA. HOMOGENEIZAR Y CALIENTAR PARA DISOLVER COMPLETAMENTE. DISPENSAR EN ALCUOTAS DE 10 ml. EN TUBOS DE ENSAYO Y ESTERILIZAR POR AUTOCLAVE A 121 C DURANTE 15 min. PH FINAL, 6.8-7.2 A 25 C. 6.10 LECHE BAJA EN GRASA (LECHE DESCREMADA EN POLVO RECONSTITUIDA) LA LECHE DESCREMADA UHT, SE SABE QUE ES LIBRE DE SALMONELLA Y CONSERVADORES, ES ACEPTABLE PARA SU USO. AGREGAR 100g DE LECHE EN POLVO DESCREMADA EN 1 Lt DE AGUA PURIFICADA. HOMOGENIZAR PARA DISOLVER COMPLETAMENTE. DISPENSAR Y ESTERILIZAR POR AUTOCLAVE A 121 C DURANTE 15 min. PH FINAL, 6.8-7.2 A 25 C. 6.11 CALDO NUTRIENTE (NB) EXTRACTO DE CARNE PEPTONA 3.0g 5.0g

DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1LT DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR VIGOROSAMENTE, DISPENSE LOS VOLUMENES REQUERIDOS Y ESTERILICE POR AUTOCLAVE A 121C POR 15 min. pH FINAL 6.6 - 7.0 A 25C 6.12 CALDO RAPPAPORT-VASSILIADIS (RV) PEPTONA DE SOYA CLORURO DE SODIO FOSFATO POTASICO (FOSFATO DICIDO DE POTASIO) [KH2PO4] CLORURO DE MAGNESIO (MgCl2.6H2O) MALAQUITA VERDE 5.0g 8.0g 1.6g 40.0g 0.04g

DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1 Lt DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR VIGOROSAMENTE. DISPENSE LOS VOLUMENES REQUERIDOS Y ESTERILICE POR AUTOCLAVE A 115C POR 15 min. pH FINAL 5.0 5.4 A 25C

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6.13 CALDO RAPPAPORT- VASSILIADIS R10 (RV[R10]) CODIGO TECRA: RVRMED500 PEPTONA CASEINA CLORURO DE MAGNESIO (ANHIDRO) CLORURO DE SODIO FOSFATO POTASICO OXALATO DE MALAQUITA VERDE 4.54g 13.4g 7.2g 1.45g 0.36g

DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1 Lt DE AGUA PUIFICADA. CALIENTE PARA DISOLVER. DISPENSE EN CONTENEDORES APROPIADOS Y USAR AUTOCLAVE POR 15 min. A 115C. pH FINAL 4.9-5.3 A 25C 6.14 CALDO SELENITO CISTINA (SC) TRIPTONA LACTOSA FOSFATO DISODICO (Na2HPO4) SELENITO DE SODIO (NAHSeO3) L-CISTINA 5.0g 4.0g 10.0g 4.0g 0.01g

DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1 Lt DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR VIGOROSAMENTE. DISPENSE LOS VOLUMENES REQUERIDOS EN TUBOS ESTERILES CALENTAR POR 10 min. EN VAPOR CONTINUO. NO UTILICE AUTOCLAVE. pH FINAL 6.5-6.9 A 25C. UTILICE EL MISMO DIA DE PREPARACION. 6.15 CALDO TETRATIONATO (TT) EL CALDO DE TERATIONATO ESTA PREPARADO COMO UN MEDIO BASE AL CUAL SE LE ADICIONA UNA SOLUCION YODO YODURADO Y UTILICE INMEDIATAMENTE. CALDO BASE
PRODUCTO TECRA TTB (B) MED 500

PEPTONA DE CARNE SALES BILIARES CARBONATO DE CALCIO TIOSULFATO DE SODIO

5.0g 1.0g 10.0g 30.0g

DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1 Lt DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR VIGOROSAMENTE. CALENTAR CON FRECUENTE AGITACION Y HERVIR POR 1 min. HASTA DISOLVER COMPLETAMENTE EL POLVO. ENFRIAR POR DEBAJO DE LOS 40C. SOLUCION YODO-YODURO YODO YODURO DE POTASIO AGUA PURIFICADA 6.0g 5.0g 20.0 ml

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COMPLEMENTO DEL MEDIO A UN Lt. DE CALDO BASE ADICIONAR 20 ml. DE SOLUCION DE YODO-YODURADO. MEZCLAR Y DISPENSAR EN CANTIDADES DE 10 ml. EN TUBOS ESTRILES. NO CALENTAR DEPUES DE ADICIONAR LA SOLUCION DE YODO. EL COMPLEMENTO DEL MEDIO PUEDE SER UTILIZADO EN EL DIA DE PREPARACION. SI EL VERDE BRILLANTE (SUMINISTRADO POR SEPARADO) SE VA A ADICIONAR, AADIR 10 ml. DE 0,1 % BGDS A 1 Lt DEL MEDIO. pH FINAL, 7,8-8.2 A 25C. 6.16 CALDO DE SOYA TRIPTONA (TSB)
PRODUCTO TECRA TSBMED500

PEPTONA DE CASEINA PEPTONA DE SOYA CLORURO DE SODIO FOSFATO DIPOTASICO (K2HPO4) GLUCOSA

17.0g 3.0g 5.0g 2.5g 2.5g

DISOLVE LOS INGREDIENTES EN 1 Lt DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR VIGOROSAMENTE. DISPENSE LOS VOLUMENES REQUERIDOS Y ESTERILICE POR AUTOCLAVE A 121C POR 15 min. pH FINAL 7.1-7.5 A 25C

7.

PREPARACIN DE REACTIVO PARA INMUNOENSAYO

ANTES DE UTILIZAR EL TECRA SALMONELLA VIA, LA PREPARACION DE LOS REACTIVOS ES NECESARIA. ATENCION: EVITAR LA CONTAMINACIN CRUZADA DE REACTIVOS. ASEGRESE DE QUE LOS TAPONES DE LAS BOTELLAS DE LOS REACTIVOS NO SEAN INADVERTIDAMENTE CAMBIADAS. SOLUCION DE LAVADO DILUIR EL CONCENTRADO DE LAVADO [1] A 2Lt CON AGUA DESTILADA O DEIONIZADA. PARA EL LAVADO DE POZOS, SE RECOMIENDA UNA BOTELLA DE PLSTICO CON BOQUILLA AMPLIA. ALMACENAR LA SOLUCIN DE LAVADO A 4 C CUANDO NO EST EN USO. ASEGRESE DE QUE LOS RECIPIENTES UTILIZADOS PARA ALMACENAR LA SOLUCIN DE LAVADO SE LIMPIEN MINUCIOSAMENTE CADA VEZ QUE SE UTILICEN. DONDE LA CONTAMINACIN MICROBIANA POR AGUA ES UN PROBLEMA, EL USO DE AGUA ESTERIL ES RECOMENDADA CONTROL POSITIVO EN UN SOLO PASO, TRANSFERIR 3 ml. DEL DILUENTE DE CONTROL [3] AL VIAL DE CONTROL POSITIVO [2]. REEMPLAZAR EL TAPN ROJO, ATORNILLAR FIRMEMENTE Y A CONTINUACIN HOMOGENIZAR. CONTROL NEGATIVO EL DILUYENTE DE CONTROL [3] RESTANTE, TRAS LA RECONSTITUCIN DEL CONTROL POSITIVO [2] SE UTILIZA COMO CONTROL NEGATIVO.

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CONJUGADO DOS CONJUGADOS: CONJUGADO [4] Y CONJUGADO DILUYENTE [5] SON PROPORCIONADOS. RECONSTITUIR INICIALMENTE SLO UN CONJGADO. AADIR TODOS LOS CONTENIDOS DEL VIAL DE DILUYENTE CONJUGADO [5] AL VIAL CONJUGADO [4]. REEMPLACE EL TAPN ROJO Y TAPON ROSCA. PERMITIR AL CONJUGADO [4] DISOLVERSE COMPLETAMENTE A TEMPERATURA AMBIENTE.

NO AGITAR EL CONTENIDO DEL VIAL CONJUGADO ENRGICAMENTE. REGISTRAR LA FECHA DE RECONSTITUCIN EN LA ETIQUETA DE LA BOTELLA. DESCARTAR EL CONJUGADO RECONSTITUIDO DESPUES DE 1 MES.
SUSTRATO AGREGAR EL DILUYENTE DE SUSTRATO [7] EN EL SUSTRATO [6]. ASEGRESE DE QUE EL CONTENIDO SE HA DISUELTO COMPLETAMENTE. EL SUSTRATO RECONSTITUIDO APARECER INCOLORO A COLOR VERDE PLIDO. SOLUCIN PARO LA SOLUCIN DE PARO [8] EST LISTA PARA USAR.

8.

REALIZAR EL INMUNOENSAYO

GARANTIZAR QUE TODOS LOS KITS DE LOS COMPONENTES ESTEN A TEMPERATURA AMBIENTE (20-25 C) ANTES DE UTILIZAR.

PASO 1: MUESTRA TRATAMIENTO TRMICO

ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO SIMPLE TRANSFERIR 1 ml. DE LA MUESTRA DE CALDO M EN UN TUBO ETIQUETADO. REALIZAR TRATAMIENTO TRMICO COMO SE INDICA A CONTINUACIN. OTRO ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 0,5 ml. DE CADA UNO DE LOS DOS TUBOS DE CALDO M PARA MUESTRA EN UN TUBO ETIQUETADO. REALIZAR UN TRATAMIENTO TRMICO COMO EL QUE SE DESCRIBE A CONTINUACIN. TRATAMIENTO TRMICO CALENTAR EL CALDO DE M DURANTE 15 min. EN UN BAO DE AGUA HIRVIENDO. ALTERNADAMENTE, COLOCAR TUBOS EN VAPOR EN UN AUTOCLAVE (100 C) DURANTE 15 min. (NO COLOCAR LOS TUBOS BAJO PRESIN.) ENFRIAR LOS TUBOS CON CALDO M A TEMPERATURA AMBIENTE.

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PRECAUCION:
ENFRIE LOS TUBOS RESTANTES DE CALDO M A TEMPERATURA AMBIENTE, AS COMO LOS TUBOS DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO. ESTOS TUBOS PUEDEN UTILIZARSE PARA CONFIRMACIN DE MUESTRAS POSITIVAS DE ELISA MEDIANTE MTODOS DE PLACAS ESTNDAR.

PASO 2:

PREPARAR LOS POZOS DE MUESTRA

ABRIR LA BOLSA Y TOMAR EL NMERO REQUERIDO DE POZOS DE LA BOLSA SELLADA, TOMAR UN POZO PARA CADA MUESTRA, UNO PARA EL CONTROL POSITIVO Y OTRO PARA EL CONTROL NEGATIVO. PRESIONE LOS POZOS FIRMEMENTE EN SU SITIO EN EL SOPORTE PROPORCIONADO. REEMPLAZAR POZOS NO UTILIZADOS EN LA BOLSA DE PAPEL DE ALUMINIO Y CIERRE.

PASO 3:

ADICIN DE MUESTRAS

UTILIZAR UNA PIPETA NUEVA PARA CADA MUESTRA, TRANSFERIR 200L DE ALICUOTAS, CONTROLES Y MUESTRAS DENTRO DE LOS POZOS INDIVIDUALES, RECORDANDO LA POSICIN DE CADA UNA DE LAS MUESTRAS EN LA HOJA DE REGISTRO PROPORCIONADA. CUBRIR LOS POZOS CON PELCULA DE PLSTICO PARAFILM E INCUBAR DURANTE 30 min. A 35-37 C.

PASO 4:

PRIMER LAVADO

UN LAVADO MINUCIOSO DE LOS POZOS ES UN PASO CRTICO Y ESENCIAL PARA UNA CLARA INTERPRETACIN DE RESULTADOS. VACIADO DE LOS POZOS PARA GARANTIZAR QUE LOS POZOS NO SE DESPRENDIERON DURANTE EL LAVADO, EMPUJELOS FIRMEMENTE EN EL CONTENEDOR (SOPORTE DE POZOS). INVERTIR RPIDAMENTE EL CONTENEDOR (SOPORTE DE POZOS), VACIAR SU CONTENIDO EN UN RECIPIENTE DE RESIDUOS. ELIMINAR EL LQUIDO RESIDUAL GOLPEANDO EL CONTENEDOR (SOPORTE DE POZOS) FIRMEMENTE VARIAS VECES CARA ABAJO EN UNA PILA GRUESA DE TOALLAS DE PAPEL ABSORBENTE. ESTO ES IMPORTANTE PARA LA ELIMINACIN EFECTIVA DE RESIDUOS DE LA MUESTRA. RELLENAR LOS POZOS CON SOLUCION DE LAVADO UTILIZAR UNA BOTELLA CON BOQUILLA (PICETA) APLICAR UN FUERTE FLUJO DE SOLUCIN DE LAVADO, RELLENAR COMPLETAMENTE CADA POZO, TENIENDO CUIDADO DE NO ATRAPAR BURBUJAS DE AIRE EN LA PARTE INFERIOR DE LOS POZOS.

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NOTA:
LAVAR Y VACIAR COMPLETAMENTE LOS POZOS UN TOTAL DE TRES (3) VECES DESCRITAS ANTERIORMENTE. UTILIZAR APLICADORAS DE LAVADO AUTOMATICO PARA ELISA. PUEDEN USARSE EN LUGAR DE LAVADO MANUAL. SIN EMBARGO, PARA RESULTADOS SATISFACTORIOS ES ESENCIAL QUE LOS LAVADOS ESTEN ADECUADOS PARA USARSE CON TECRA VIA.

PASO 5:

ADICIONAR EL CONJUGADO

Step 5: Adding the Conjugate

ASEGRESE DE QUE LOS POZOS ESTN VACOS ANTES DE CONTINUAR. AADIR 200L DE CONJUGADO [4] A CADA POZO. CUBRIR EL CONTENEDOR (SOPORTE DE POZOS) CON PELCULA DE PLSTICO PARAFILM E INCUBAR DURANTE 30 min. A 35-37 C.

PASO 6:

SEGUNDO LAVADO

VACIAR LOS POZOS Y LAVAR VIGOROSAMENTE UN TOTAL DE CUATRO (4) VECES (NO TRES) MEDIANTE LA SECUENCIA DESCRITA ANTERIORMENTE EN EL PASO 4.

PASO 7:

ADICION DEL SUSTRATO

ASEGRESE DE QUE LOS POZOS ESTN VACOS ANTES DE CONTINUAR. AADIR 200L DE SUSTRATO [6] A CADA POZO. INCUBAR A 20-25 C (TEMPERATURA AMBIENTE). NO INCUBAR LOS POZOS JUNTO AL AIRE ACONDICIONADO O EN OTROS LUGARES DONDE LA TEMPERATURA PUEDE VARIAR EL RANGO ACEPTABLE. UN DESARROLLO DE COLOR TIENDE A CONCENTRARSE ALREDEDOR DE LOS LADOS DE LOS POZOS. AGITE SUAVEMENTE EL CONTENEDOR PARA DISTRIBUIR EL COLOR UNIFORMEMENTE ANTES DE LEER EL RESULTADO. INCUBAR DURANTE 10 MINUTOS Y A CONTINUACIN LEER LOS RESULTADOS.

PASO: 8

LECTURA DE RESULTADOS

RESULTADOS PUEDEN LEERSE VISUALMENTE MEDIANTE LA CARTA DE COLORES PROPORCIONADA O CON UN LECTOR DE PLACA.

USO DE LA CARTA DE COLORES: NOTA:

ANTES DE CONTINUAR, ASEGRESE DE QUE EST UTILIZANDO LA TARJETA DE COLOR 1. COLOQUE EL CONTENEDOR (SOPORTE DE POZOS) SOBRE UN FONDO BLANCO, A CONTINUACIN, COMPARAR CADA UNO DE LOS POZOS CON LA TARJETA DE COLOR.

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DESPUES DE 10 MINUTOS, SI EL COLOR DEL POZO CONTROL POSITIVO [2] ES EQUIVALENTE AL PANEL 4 EN LA TARJETA DE COLOR, ENTONCES, CONTINUAR CON LOS PASOS 9 Y 10. CONTINUAR LA INCUBACIN DEL SUSTRATO SLO SI EL CONTROL POSITIVO [2] HA ALCANZADO UNA ABSORBENCIA EQUIVALENTE AL PANEL 4 Y CONTINE CON LOS PASOS 9 Y 10. SI LA ABSORBENCIA NO HA LLEGADO A UN COLOR EQUIVALENTE AL PANEL 4 DESPUS DE 30 MINUTOS, EL RESULTADO DE LA PRUEBA NO PUEDE SER UTILIZADA. CONSULTE LA GUA DE SOLUCIN DE PROBLEMAS ANTES DE REPETIR LA PRUEBA.

UTILIZANDO UNA PLACA DE LECTURA

LA ABSORBENCIA DE LAS MUESTRAS SE PUEDE LEER EN 414 + 10NM UTILIZANDO UNA PLACA DE LECTURA. LA LONGITUD DE ONDA DUAL DE LOS LECTORES DEBERAN SER BORRADOS CONTRA EL AIRE Y EL SEGUNDO, LONGITUD DE ONDA "DE REFERENCIA" DEBERA ESTABLECERSE EN 490 + 10NM. EL INSTRUMENTO DE LONGITUD DE ONDA SOLO DEBE CUBRIR UN POZO QUE CONTENGA 200L DE SUSTRATO O AGUA, O EN EL POZO DEL CONTROL NEGATIVO INMEDIATAMENTE DESPUS DE LA ADICIN DEL SUSTRATO AL POZO. DESPUS DE 10 MINUTOS, SI EL COLOR DEL POZO DEL CONTROL POSITIVO [2] TIENE UNA LECTURA DE POR LO MENOS 1.0, PROCEDER CON LOS PASOS 9 Y 10. CONTINUAR LA INCUBACIN DE SUSTRATO SLO HASTA EL CONTROL POSITIVO [2] SI HA ALCANZADO UN ABSORBENCIA DE 1.0, CONTINE CON LOS PASOS 9 Y 10. SI LA ABSORBENCIA NO HA LLEGADO A 1.0 DESPUS DE 30 MINUTOS, NO SE PUEDE UTILIZAR EL RESULTADO DE LA PRUEBA. CONSULTE LA GUA DE SOLUCIN DE PROBLEMAS ANTES DE REPETIR LA PRUEBA.

PASO 9:

AGREGAR LA SOLUCIN DE PARO

LA ADICIN DE LA SOLUCIN DE PARO [8] ES OPCIONAL, PERO DEBE AADIRSE SI NO SE PUEDE LEER UNA PLACA INMEDIATAMENTE. LA SOLUCIN DE PARO [8] ALENTARA LA VELOCIDAD DE REACCIN, SIN EMBARGO, LOS RESULTADOS SE DEBEN LEER DENTRO DE 30 MINUTOS DE SU ADICIN AADIR 20L DE SOLUCIN DE PARO[8] A CADA POZO. TOQUE EN LOS LADOS DEL CONTENEDOR (SOPORTE DE POZOS) SUAVEMENTE PARA MEZCLAR EL CONTENIDO Y A CONTINUACIN, LEER EL RESULTADO EN UN PLAZO DE 30 MINUTOS.

PASO 10:

INTERPRETACION DE RESULTADOS

UTILICE LA CARTA DE COLORES

PARA QUE LA PRUEBA SEA VLIDA: EL CONTROL POSITIVO DEBE SER AL MENOS TAN OSCURO COMO PANEL DE 4 EN LA TARJETA DE COLOR Y EL CONTROL NEGATIVO DEBE ESTAR DENTRO DEL INTERVALO NEGATIVO EN LA TARJETA DE COLOR. DISTRIBUCIONES BIOTECNOLOGICAS S.A. DE C.V. TELS. (55) 55-60-25-58 53-63-82-41 53-73-60-96 25

SI NO SE CUMPLEN ESTOS CRITERIOS NO PUEDEN UTILIZARSE LOS RESULTADOS. CONSULTE A LA GUA DE SOLUCIN DE PROBLEMAS ANTES DE REPETIR LA PRUEBA. UNA MUESTRA SE CONSIDERAR NEGATIVA CUANDO LA PRUEBA ES VLIDA Y EL POZO DE EJEMPLO TIENE UN COLOR DENTRO DEL RANGO NEGATIVO EN LA TARJETA DE COLOR. UNA MUESTRA SE CONSIDERARA POSITIVA CUANDO LA PRUEBA ES VLIDA Y EL COLOR EN EL POZO DE LA MUESTRA ES MAYOR O IGUAL AL PANEL 3 EN LA TARJETA DE COLOR.

UTILIZANDO UN LECTOR DE PLACA

PARA QUE LA PRUEBA SEA VLIDA: EL CONTROL POSITIVO DEBE HABER ALCANZADO UN ABSORBENCIA DE POR LO MENOS 1.0 Y EL CONTROL NEGATIVO DEBE TENER UN ABSORBENCIA DE MENOS DE 0,2. SI NO SE CUMPLEN ESTOS CRITERIOS NO PUEDEN UTILIZARSE LOS RESULTADOS. CONSULTE A LA GUA DE SOLUCIN DE PROBLEMAS ANTES DE REPETIR LA PRUEBA. UNA MUESTRA SE CONSIDERAR NEGATIVA CUANDO LA PRUEBA ES VLIDA Y EL POZO DE EJEMPLO TIENE UNA LECTURA MENOR DE 0,3. UNA MUESTRA SE CONSIDERA POSITIVA CUANDO LA PRUEBA ES VLIDA Y EL POZO DE EJEMPLO TIENE UNA LECTURA SUPERIOR O IGUAL A 0,3.

PASO 11:

CONFIRMANDO MUESTRAS POSITIVAS

CONFIRMACION DE MUESTRAS POSITIVAS POR EL METODO TECRA SALMONELLA VIA, ESTE DEBE SER CONFIRMADO MEDIANTE UNA ASADA EN CALDO M Y ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO (SI PROCEDE?) EN MEDIOS DE IDENTIFICACIN ESTNDAR Y MEDIANTE LA REALIZACIN DE LAS PRUEBAS SEROLGICAS Y BIOQUMICAS ESTNDAR. ESTO ES ESPECIALMENTE IMPORTANTE EN SITUACIONES TALES COMO PRODUCTOS DEVUELTOS.

PASO 12:

ELIMINACIN

CUANDO LA PRUEBA SE COMPLETE, AUTOCLAVEAR LOS POZOS A 121 C POR AL MENOS 30 MINUTOS O INCINERAR COMO RESIDUOS ESPECIALES. OTROS COMPONENTES DEL KIT Y LOS POZOS, PUEDEN SER ENVIADOS PARA EL RECICLAJE O ELIMINADOS DE CONFORMIDAD CON LOS REQUERIMIENTOS REGULATORIOS LOCALES

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9.

BIBLIOGRAFIA

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10.

GUIA DE SOLUCION DE PROBLEMAS

PROBLEMA CONTROL POSITIVO [2] EL POZO NO ALCANZA UN ABSORBENCIA DE 1.0 EN 30 MINUTOS

CAUSA DEL PROBLEMA 1. SUSTRATO RECONSTITUIDO [6] NO PERMITIR LLEGAR A TEMPERATURA AMBIENTE ANTES DE ADICIN. 2. SE HA EXCEDIDO LA FECHA DE USO 3. KIT ALMACENADOS A TEMPERATURA ELEVADA O POR DEBAJO DEL PUNTO DE CONGELACIN CONTROL NEGATIVO [3] LOS POZOS 1. INADECUADO LAVADO DE DAN UN MAYOR NDICE DE POZOS. ABSORBENCIA 0,2 Y/O FALSOS POSITIVOS 2. CONTAMINACIN CRUZADA CON CONTROL POSITIVO [2]. 3. EL AGUA UTILIZADA PARA LA PREPARACIN DE LAVADO TIENE UNA ALTA CARGA MICROBIANA. 4. LA PLACA ESTUVO DEMASIADO TIEMPO SIN LEER (PASO 7). 1. CONTAMINACION CON EL CONJUGADO [4]

SUSTRATO RECONSTITUIDO [6] ES VERDE OBSCURO

TODOS LOS VERDES

POZOS

APARECEN 1. CONTAMINACION POR PIPETA 2. INADECUADO LAVADO DE POZOS

NO HAY DESARROLLO DE COLOR EN 1. CONJUGADO DILUYENTE [5] POZO DE CONTROL POSITIVO [2] UTILIZADO EN LUGAR DE CONJUGADO RECONSTITUIDO [4].

ACCION 1.- GARANTIZAR EL SUFICIENTE TIEMPO PERMITIDO PARA QUE LOS COMPONENTES DEL KIT ALCANCEN TEMPERATURA AMBIENTE. 2.- COMPRUEBE FECHA DE USO DEL KIT Y FECHA DE RECONSTITUCINDEL CONJUGADO. 3.- EL KIT SE DEBE ALMACENAR ENTRE 2 - 8 C CUANDO NO EST EN USO. 1.- CONSULTE LA SECCIN 8 (PASO 4). 2.- DEBE UTILIZARSE UNA PUNTA NUEVA PARA PIPETA PARA CADA MUESTRA. 3.- UTILICE AGUA ESTRIL PARA LAVADO. 4.- LEER DESPUS DE 10 MINUTOS. SLO EXTENDER LA INCUBACIN DEL SUSTRATO HASTA EL PC IGUAL A PANEL 4 O UN ABSORBENCIA DE 1.0. 1.- NO UTILICE LA MISMA PUNTA DE LA PIPETA O DISPENSADOR DE CONJUGADO Y EL SUSTRATO. PREPARAR NUEVO SUSTRATO PARA SU USO. 1.- LIMPIAR LAS PIPETAS CON REGULARIDAD 2.- REFERIR A LA SECCION 8 (PASO 4) 3.- GARANTIZAR QUE LA SOLUCIN DE LAVADO SE RECONSTITUY CORRECTAMENTE Y ALMACENE DE 2 - 8 C. GARANTIZAR LA NO UTILIZACION DEL VIAL CONJUGADO DILUENTE [5] YDEL CONJUGADO RECONSTITUIDO ESTN AISLADOS.

2. EL CONTROL NEGATIVO [3] UTILIZADO EN LUGAR DE CONTROL 2.- COMPRUEBE QUE SE HAYA POSITIVO [2]. UTILIZADO EL REACTIVO CORRECTO.

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RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO DE ELISA

ADICIONAR MUESTRAS (30 min, 35-37C) LAVAR 3 VECES ADICIONAR CONJUGADO (30 min, 35-37C) LAVAR 4 VECES ADICIONAR SUSTRATO (MINIMO 10 min, 20-25C) LEER RESULTADOS
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