DETERMINAO DA ATIVIDADE PROTEOLTICA EM DETERGENTES EM P - UMA AULA PRTICA DE ENZIMOLOGIA (The proteolitic activity in usual powder detergents a practical

l class of enzymology)
AUTORES - Maria Teresa Pedrosa Silva Clerici1, Armindo Antonio Alves2, Roberval Serafim da Silva3 AFILIAO - 1 Ps- doutoranda do DTA-FEA-Unicamp-Campinas- SP 2 - Professor de Bioqumica da UNIARARAS - Araras - SP. 3 - Tcnico especializado - PUC-Campinas -SP. Endereo para correspondncia : mtclerici@uol.com.br

Abstract The goal of this work is to present a practical class that assesses the protease activity using usual powder detergent as an enzymatic matrix. This practical class allow the discussion of basic concepts in enzymology like enzyme activity, specific substrate, substract, suitable temperature and pH for the maximal enzyme activity. It is possible, also to argue about the advantages of using enzymes in usual products and how to prevent their undesired effects.

Resumo O objetivo deste trabalho propor um roteiro de aula prtica de enzimologia para medir a atividade proteoltica usando como matriz enzimtica detergente em p de uso comum. Este roteiro permite a discusso sobre noes bsicas de enzimologia como atividade enzimtica, substrato especfico e temperatura e pH adequados para a atividade tima. Cabe ainda discutir as vantagens de se utilizar enzimas em produtos industrializados de uso comum e tambm os cuidadso necessrios para se previnirem seus efeitos indesejveis. Introduo Neste trabalho , propomos um roteiro de aula prtica para medir a atividade das enzimas proteolticas presentes em detergente em p de uso comum, usando casena como substrato. Utilizamos esta aula na disciplina de Biotecnologia nos cursos das Instituies onde trabalhamos. Este roteiro tambm pode ser utilizado em disciplinas de Bioqumica Bsica e outras disciplinas afins, porque para conceitos bsicos de enzimologia como atividade enzimtica, substrato especfico, temperatura e pH adequados para se atingia a

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atividade tima. Serve ainda para discutir o uso de enzimas em produtos industrializados de uso comum, o encapsulamento de enzimas e ainda os cuidados necessrios para se minimizar os efeitos adversos de seu uso indevido, como a dermatite de contacto. Fundamentao Terica Os principais tipos de enzimas utilizadas na indstria de detergentes incluem: a) amilases, degradam amido e outros carboidratos; b) proteases, degradam ligaes peptdicas; c) lipases, degradam lipdeos; d) celulases, degradam celulose (1). Os sabes em p em sua maioria so adicionados de enzimas que vo degradar a matria orgnica, de acordo com sua afinidade pelo substrato, presente nas manchas das roupas. Os detergentes modernos apresentam um espectro de ao e de utilizao bastante amplo, havendo, conseqentemente, necessidade de especializao das formulaes. A principal vantagem da formulao de detergentes que contenha enzimas a substituio de produtos custicos, cidos e solventes txicos, que agridem o meio ambiente e que provocam o desgaste de materiais e de instrumentos. O uso diversificado das enzimas devese sua caracterstica de atuar como biocatalisadores especializados. As enzimas adicionadas s formulaes de detergentes de uso hospitalar, domstico e industrial agem digerindo e dissolvendo resduos orgnicos (sangue, fezes, urina, vmitos, manchas diversas), higienizando as partes externas e internas de instrumentos cirrgicos, desobstruindo canais com resduos e coagulados, eliminando resduos fecais dos canais e superfcies dos fibroscpios e removendo contaminantes da rouparia hospitalar (2). Ao analisar rtulos das caixas de sabo em p foi verificado que existe uma ausncia de informaes necessrias para o uso de enzimas pelo consumidor , que so: a) a maioria das caixas s traz a informao: contm enzimas, sem descrever

quais enzimas contem e com qual atividade b) o rtulo no informa as condies necessrias para manipulao do sabo em

p, pois deve-se fazer uso de luvas, para evitar dermatites de contato c) o fato de lavar a roupa diretamente na mquina, sem deixar o tempo de

molho, pode levar a desnaturao da enzima e, portanto, sem ao da enzima na mancha. d) Como muitas mquinas de lavar possuem temperaturas que variam da

temperatura ambiente at 90.C, a temperatura tima de atividade enzimtica deve ser recomendada.

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e)

Faz-se necessrio esclarecer como deve ser feito o tratamento de uma

dermatite provocada por ao das enzimas presentes no sabo, ou seja quais os recursos necessrios para paralizar a atividade das enzimas durante contato com olhos, mucosas etc. f) Uma roupa lavada manualmente pode provocar dermatites na pessoa que

lava a roupa e caso esta roupa no seja passada a ferro (para desnaturar enzimas residuais) pode provocar reaes alrgicas no usurio da roupa, fato que se agrava quando o usurio for um beb ou criana, um paciente acamado etc. g) O processo de enxague da roupa deve garantir que toda a enzima foi

desnaturada, pois o habito de passar a roupa vem sendo abandonado a medida que se aumenta o uso de tecidos sintticos. Portanto sabes em p contendo enzimas, no devem ser usados para lavagem manual de roupas, fato comum em pases subdesenvolvidos, onde ainda existe as profisses de empregada domstica e da lavadeira, e nem sempre existe a mquina de lavar roupa. As proteases utilizadas em sabes em p, toleram pH entre 9 e 13, so

termoestveis e so normalmente serina-proteases secretadas por Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis (3). As proteases hidrolizam protenas em peptdeos e aminocidos solveis, desta forma possvel evitar a mancha da roupa devido a desnaturao e oxidao de protenas firmemente aderidas ao tecido. No trabalho realizado por Mitidieri et al (4) analisado a atividade enzimtica em sabo em p: as enzimas amilases, proteases e lipases foram avaliadas e houve uma grande variao de atividade enzimtica em marcas distintas de sabo em p, mostrando a ausncia de regulamentao.

Objetivo da aula Visando mostrar a atividade da protease em sabes em p numa aula prtica, foi feita uma adaptao do mtodo descrito por Mitidieri et al (2). Materiais a) Reagentes casena 2% (m/v) tampo tris-HCL, pH 8,0

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0,8 mL de cido tricloroactico 20% soluo de detergente a 2% fita indicadora de pH

b) Vidrarias pipetas de 1, 2 e 10mL graduadas tubos de ensaios de 10mL banho-maria a 50.C centrfuga espectrofotmetro a 400nm banho de gelo para resfriamento

Mtodos: a) Preparar os tubos de ensaios conforme o esquema descrito na Tabela 1. b) Resfriar em banho de gelo at precipitar toda casena. c) Centrifugar a 2500rpm, 5min d) Fazer a leitura em espectrofotmetro a 400nm, utilizando-se do tubo 1 como branco Tabela 1: Esquema do experimento para determinar atividade proteoltica do sabo em p Reagentes Sol. detergente Tampo Tris Sol. casena Incubao (50.C) Sol. De TCA Tubo 1 1ml 1mL 1mL O min 8mL Tubo 2 1mL 2mL 1mL 5min 8mL Tubo 3 1mL 2mL 1mL 15min 8mL Tubo 4 1mL 2mL 1mL 30min 8mL Tubo 5 1mL 2mL 1mL 45min 8mL

Sugesto para apresntao de resultados e discusso a) Elaborar uma tabela com os resultados obtidos, conforme modelo descrito na tabela 2. Tabela 2. Avaliao da atividade da protease em funo da absorbncia e do tempo de contato com o substrato protico. Tempo (minutos) Absorbncia (400nm) 0 5 15 30 45

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b) Fazer um grfico de tempo x absorbncia. c) Discutir a eficcia do uso da protease em sabes em p.

Sugestes para relatrio e novas aulas prticas Cada grupo de alunos pode realizar as anlises com amostras diferentes de detergentes em p podendo ser feito um estudo comparativo. Avaliar o rtulo do sabo em p analisado, utilizando os conhecimentos de enzimologia e propor modificaes no rtulo.

Concluso Devemos enfatizar que esta aula prtica deve levar o aluno a entender o papel das enzimas proteases no processo de lavagem de roupas, que para ter seu efeito timo precisa de temperatura e pH adequados. Pode-se ainda discutir o encapsulamento das enzimas que permite a manuteno da atividade enzimtica mesmo quando o produto armazenado em condies que inviabilizariam as enzimas isoladas.

Referncias bibliogrficas 1. BON, E.P.S. A tecnologia enzimtica no Brasil. ENZITEC 95, Vol. 1: 9-14,1995. 2. GODFREY, T. Industrial Enzimology. Stockton Press, New York. 1996, 609 p. 3. WISEMAN, A. Manual de Biotecnologa de los Enzimas. Ed. Acribia. Zaragoza. 1985,444p. 4. MITIDIERI, S.; MARTINELLI, A. H. S., CAMASSOLA, S.; MENGUER, P. K.; SCBRANCK, A. & VAINSTEIN, M. H. Detergentes biolgicos biodegradveis: avaliao das formulaes do mercado. Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 26-p. 56-60, maio/junho, 2002.

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