Proteomica

disciplina che studia

lespressione delle proteine le interazioni tra proteine la struttura delle proteine

Espressione delle proteine

METODI DI ANALISI Elettroforesi su gel Tecniche immunologiche
Western blot Analisi in situ ELISA

Elettroforesi su gel
SDS PAGE

Elettroforesi su gel
bidimensionale

Focalizzazione isoelettrica 2D SDS PAGE

Fonti di errore del 2D SDS PAGE nella quantizzazione delle proteine:

Estrazione non stechiometrica delle proteine dai vari costituenti cellulari Mancata migrazione delle proteine nel gel di focalizzazione Risposta non lineare del colorante di rivelazione
Sono poco rappresentate le proteine con alta carica e bassa concentrazione oppure quelle sequestrate in organelli o membrane Le proteine molto grandi migrano male in SDS, quelle molto piccole possono uscire dal gel

Strategie per evidenziare anche le proteine meno abbondanti:

tagging delle proteine meno abbondanti con biotina-avidina (es. proteine di membrana) eliminazione delle proteine pi abbondanti mediante cromatografia per affinit

Database di gel 2D

DIGE differential in gel electrophoresis

http://ca.expasy.org/melanie

Identificazione delle proteine

Spettrometria di massa
MALDI-TOF-MS
(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight-Mass Spectrometer)

tripsina H P A

H PAGCC V AD

FLF C C V A D KE

L F F

Tecniche immunologiche struttura e produzione di anticorpi

Anticorpi policlonali

Tecniche immunologiche Produzione di anticorpi monoclonali

Tecniche immunologiche

WESTERN BLOT
Gel di poliacrilamide colorato con coomassie Filtro dopo reazione antigene-anticorpo e successiva rivelazione

ELISA con antigene adsorbito sulla piastra

Immunoistochimica

Marcatura immunitaria con oro (microscopia elettronica)

MICROARRAY DI PROTEINE

Network delle interazioni tra proteine nel lievito

ESI STONO DI VERSE METODI CHE PER SELEZI ONARE LI GANDI DI UNA PROTEI NA DI I NTERESSE:

?
?

TRAPPI NG -> MASS SPEC.

- DOPPI O I BRI DO:

- PHAGE DI SPLAY - FRET

Doppio ibrido

LI BRERI E DI cDNA SU FAGO ( PHAGE DI SPLAY)

MOD I FI CAZI ON E D EL CAP SI D E FAGI CO

PRODOTTI DI c DNA

c DNA

GENE PROTEINA CAPSIDI CA

CLONAGGI O

BATTERI OFAGO

BATTERI OFAGO RI COMBI NANTE

- PHAGE DI SPLAY: ?

LI BRERI A ?

SELEZI ONE PER AFFI NI TA

SEQUENZA GENE RI COMBI NANTE

bait
LI BRERI A DI FAGI RI COMBI NANTI ( 10 8-109 PLACCHE)

?
I DENTI TA DEL PEPTI DE ESPOSTO

POTENZI ALI LI GANDI DELLA PROTEI NA BERSAGLI O DELLA SELEZI ONE

FRET (Fluorescent Risonance Energy Transfer)