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Mtodos de determinao dos teores de amido e pectina em alimentos para animais (Determination methods of starch and pectin levels in animal feeds)
Gleidson Giordano Pinto de Carvalho1, Francisco den de Paiva Fernandes2, Aureliano Jos Vieira Pires3 1 Mestrando em Zootecnia, UFV, Viosa MG Brasil. Bolsista do CNPq.
gleidsongiordano@yahoo.com.br
2 3

fernandesfep@yahoo.com.br aureliano@uesb.br

Mestrando em Zootecnia, UFV, Viosa MG Brasil. Bolsista da FAPEMIG. Departamento de Tecnologia Rural e Animal, UESB, Itapetinga BA Brasil.

Resumo A separao dos carboidratos no fibrosos (CNF) em fraes nutricionalmente mais relevantes, por meio de anlises de seus componentes, tais como cidos orgnicos, mono e oligossacardeos, amido e fibra solvel contribuem para avanos na formulao de dietas. A pectina, embora seja um carboidrato associado parede celular, no covalentemente unida s pores lignificadas e completamente digerida no rmen (90 a 100%). Com a importncia destes compostos na alimentao de ruminantes, esta reviso tem por objetivo descrever alguns mtodos de avaliao de amido e pectina em alimentos para animais. Palavras-chave: carboidratos, digestibilidade, mtodos de determinao Introduo

Abstract The separation of non fiber carbohydrates (NFC) in nutritionally more relevant fractions, by analysis of its components, such as organic acids, mono and oligosaccharides, starch and soluble fiber contribute to advances in diet formulation. Pectin, although an cellular wall associated carbohydrate, is not covalent linked to lignified portions and is completely digested in the rumen (90 and 100%). With the importance of these components in ruminant feeding, this revision has the objective of describe some starch and pectin evaluation methods in animal feeds. Key words: carbohydrates, digestibility, determination methods

Dos componentes dos CNF, o amido talvez seja o mais importante, sendo o principal componente energtico dos gros de cereais e razes utilizados na alimentao de ruminantes, devido as suas caractersticas como fonte de reserva, este apresenta uma disponibilidade energtica superior dos carboidratos estruturais (Zeoula & Neto, 2001). Os carboidratos estruturais incluem aqueles encontrados normalmente constituindo a parede celular, representados principalmente pela pectina, hemicelulose e celulose, que so
Pinto de Carvalho , Gleidson Giordano; de Paiva Fernandes, Francisco den ; Vieira Pires, Aureliano Jos.1 Mtodos de determinao dos teores de amido e pectina em alimentos para animais. Revista Electrnica de Veterinaria REDVET , ISSN 1695-7504, Vol. VII, n 01, Enero/2006, Veterinaria.org Comunidad Virtual Veterinaria.org - Veterinaria Organizacin S.L. Espaa. Mensual. Disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet y ms especificamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n010106.html
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normalmente os mais importantes na determinao da qualidade nutritiva das forragens (Van Soest, 1994). As substncias pcticas so polissacardeos cidos de elevado peso molecular, constitudas por unidades de cido D-galacturnico e ocorrem praticamente em todas as plantas superiores, nas quais se encontram, principalmente, sob a forma de protopectina na lamela mdia e membrana celular. Nos frutos, encontram-se nos espaos intercelulares, sendo constitudas por unidades de cido Dgalacturnico, estando presente em grande quantidade nos frutos verdes na forma de protopectina (Wosiack, 1971 citado por Pimenta et al., 2004). Diferenas na estrutura, degradabilidade, local de utilizao e influncia sobre a fermentao ruminal entre os diversos cereais que podem ser utilizados como fonte de amido, influenciam diretamente a performance dos animais e desperta o interesse por parte dos pesquisadores em determinar relaes ideais entre os teores de amido das diversas fontes e os demais nutrientes da dieta. De acordo com o CNCPS, os carboidratos podem ser fracionados em componentes A (acares solveis e cidos orgnicos, com rpida degradao ruminal), B1 (amido e pectina, com degradao intermediria), B2 (correspondente fibra potencialmente degradvel, com taxa de degradao mais lenta) e C, que apresenta caractersticas de indigestibilidade. Neste sentido esta reviso tem como objetivo descrever alguns mtodos de determinao de amido e pectina em alimentos para animais. Reviso de Literatura A falta de mtodos ou problemas com ensaios para carboidratos individuais tornam impraticvel a medida individual de CNF e a soma dos componentes (Hall, 2001). Geralmente, o contedo de CNF dos alimentos calculado baseado nas porcentagens de nutrientes subtrados de 100% de matria seca (MS): CNF% = 100% - (PB% + FDN% + EE% + Cinzas%) Ou CNF% = 100% - [PB% + (FDN% - PBFDN%) + EE% + Cinzas%] Onde: PB= protena bruta, EE=extrato etreo, FDN=fibra em detergente neutro e PBFDN= protena bruta insolvel em detergente neutro. Segundo Hall (2001), embora a primeira equao seja mais comumente usada, a segunda equao preferida, porque ela corrige a FDN para protena bruta (PBFDN) e evita que se subtraia a PBFDN duas vezes (como parte de PB e da PBFDN). Efetivamente, a frao CNF incluem quaisquer carboidratos solveis em detergente neutro.

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A frao de carboidratos dos alimentos mais prontamente digestvel carece ainda de um sistema satisfatrio de classificao, embora eles representem a principal fonte de energia produzida pelos componentes dos alimentos. Na prtica, as fraes de carboidratos so definidas pelos mtodos qumicos ou enzimticos usados para sua anlise. Sua partio confia nas diferenas de solubilidade e especificidade enzimtica. Dessa forma, essencial que o procedimento seja suficientemente especfico para realizar a separao desejada para descrever as fraes nutricionalmente relevantes (Figura 1), uma vez que, possuem caractersticas nutricionais diferentes (Figura 2).

Segundo Hall et al. (1999) um ponto negativo na utilizao das equaes anteriores, mesmos aps as correes para a PB da FDN ou para a incluso de NNP das dietas, a incluso de uma grande variedade de carboidratos com solubilidades, taxas de degradao, caractersticas de fermentao ruminal e capacidade de utilizao, ao nvel de intestino delgado muito diferente.

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Hall et al. (1999) desenvolveram um sistema para partio de CSDN em cido orgnico, acar, amido e fraes fibrosas solveis. O sistema usa uma extrao com 80% de etanol para separar acares e cidos orgnicos de baixo peso molecular dos polissacardeos (amido e fibra solvel). Os acares so medidos diretamente no extrato de etanol e o amido no resduo insolvel em etanol. Os cidos orgnicos e as fibras solveis em detergente neutro (CSDN), que so as duas fraes mais diversas, em termos de composio, so calculadas por diferena. Os clculos para cidos orgnicos e fibra solvel em detergente neutro so: AO = (Matria orgnica da amostra - PB) - (MOIE - PBIE) - EE - Acares; CSDN= (MOIE PBIE) - (MORDN PBRDN) AIE Onde: AO = cido orgnicos; PB= protena bruta, EE= extrato etreo, PBIE= protena bruta insolvel em etanol a 80%, MOIE= matria orgnica insolvel em etanol a 80%, PBRDN= protena bruta insolvel no resduo de detergente neutro, MORDN= matria orgnica no resduo de detergente neutro (FDN) e MO= matria orgnica, AIE=amido insolvel em etanol a 80%.

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A maioria das anlises de amido, so enzimticas, confiando na especificidade enzimtica para separar o amido de outros carboidratos contendo glicose. Os passos seguidos na avaliao de amido so normalmente a gelatinizao, a hidrolise e a medio dos produtos finais. Os elementos crticos para uma acurada avaliao do amido so: 1) uma completa gelatinizao do amido 2) especificidade das enzimas 3) completa hidrolise do amido a glicose 4) medies especificas da glicose produzida a partir do amido hidrolisado 5) minimizao das interferncias (Hall, 2003). A gelatinizao envolve a dissoluo das pontes de hidrognio entre e dentro das molculas de amido, permitindo a hidratao e a hidrolise enzimtica da molcula. Antes da gelatinizao o amido nos gros processados cristalino. As pores lineares da molcula so ligadas entre si por pontes de hidrognio, resultando em uma excluso da gua e resistncia atividade enzimtica, dessa forma essa estrutura cristalina deve ser rompida para que se consiga uma completa hidrolise enzimtica do amido em um intervalo de tempo razovel. O processo de gelatinizao tipicamente realizado com aquecimento com gua quente (90 a 100.C), ou, alternativamente, com o uso de uma base (hidrxido de potssio) seguida por uma neutralizao. Sendo que uma incompleta gelatinizao pode levar a uma incompleta hidrolise do amido glicose.
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A hidrolise enzimtica de somente ligaes lineares alfa 1-4 e ramificaes alfa 1-6, presentes no amido o elemento que torna o mtodo especfico para o amido e alfaglucanos, excluindo outros carboidratos que contenham glicose da anlise. A amilase termoestvel, a qual pode ser adicionada durante o processo de gelatinizao e uma amiloglicosidase so comumente usadas, cuidados devem ser tomados para garantirem condies timas de atuao enzimtica (pH e temperatura). Desde que o amido estimado como a glicose liberada pela hidrolise enzimtica, essa deve ser completa ou o amido ser subestimado. A presena de outras enzimas tais como invertase (hidrolisa sacarose), ou celulase as quais liberam glicose por meio da hidrolise de substratos no amilceos podem superestimar a quantidade de amido. As medies dos produtos de hidrolise do amido devem ser realizadas com anlises especificas para glicose, tais como a avaliao da glicose oxidase-peroxidase. O contedo de amido calculado como o contedo de glicose vezes 0,9 o que permite a subtrao do peso de uma molcula de gua (18g/mol) para cada molcula de glicose (180g/mol), sendo que, esse fator considera a remoo de uma molcula de gua durante as ligaes covalentes das molculas de glicose para formar o amido. A glicose deve ser usada como padro para a avaliao do produto final da hidrolise, o uso do amido no recomendado, devido a este confiar na completa recuperao do amido (amido medido/amido existente) alm de presumir similar recuperao para todas as fontes. De acordo com Hall, (2003) ao conduzir-se a anlise em uma amostra de amido purificado como controle, isso permite a avaliao da enzima, das condies de avaliao e da eficcia da tcnica. Algumas substncias podem interferir, aumentando ou diminuindo a medio do amido estimado. O mtodo de medio de produtos finais usa ambos glicose ou acares redutores, e determina quais substncias podem interferir na anlise. Algumas preparaes comercias de enzimas (amiloglicosidase), especialmente as utilizadas para a anlise de fibra diettica, contm glicose e no devem ser utilizadas para a anlise de amido. Mesmo substncias que no so carboidratos, mas, que absorvem o mesmo comprimento de onda no colormetro, podem indevidamente alterar os valores de amido. A interferncia de carboidratos de baixo peso molecular pode ser reduzida ou eliminada pelo pr-extrao do material com soluo 80% etanol: gua (v/v), antes da anlise de amido. Alternativamente a glicose livre pode ser medida em uma amostra de branco no tratada com enzima e esse valor ser posteriormente subtrado da amostra hidrolisada. A pureza da enzima pode ser testada analisando-se amostras de sacarose, celobiose ou celulose com o mtodo de amido, sendo que quantidades apreciveis de glicose no devero ser produzidas. A extenso na qual substncias podem interferir na anlise de amido dependente do tipo de amostra analisada. Amostras de gros maduros e silagem provavelmente tero poucos carboidratos remanescentes interferindo com a analise de amido. O procedimento para avaliao de amido por meio da deteco dos produtos finais da hidrolise, deve ser realizado no mesmo dia para minimizar a degradao dos produtos pela atividade microbiana. Em relao as pectinas, so considerados carboidratos associados com a parede celular mas no covalentemente unida s pores lignificadas e so digeridas completamente no
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rmen (90 a 100 %). As concentraes de pectina so altas em polpa ctrica, polpa de beterraba, casca de soja, e em leguminosas, mas geralmente baixa em gramneas (Allen e Knowlton, 1995; citados por Hall, 2001). Normalmente, o coeficiente de digestibilidade aparente da FDA menor do que o coeficiente da digestibilidade da FDN. Isso pode ser observado nos trabalhos conduzidos por Rodrigues et al. (1997) e Resende et al. (2001), porm em experimento realizado por Melo et al. (2003) os autores observam-se valores de digestibilidade da FDA superiores aos da FDN, fato este que tambm observado por Andrade et al. (2002), quando da substituio da silagem de sorgo por palma forrageira. Isso, provavelmente, deve-se ao procedimento metodolgico utilizado para determinao das fibras em detergente neutro e detergente cido, pois as mesmas so comumente determinadas em amostras separadas (comum), e no na mesma amostra (seqencial), como descrito por Van Soest (1967). Portanto, quando da determinao da FDA do alimento pelo mtodo comum, estaria sendo incorporada, alm da celulose e da lignina, a pectina presente na palma forrageira. Essa substncia pouco solvel em detergente cido, uma vez que faz parte da parede celular; porm, solvel em detergente neutro e altamente digestvel pelos microrganismos do rmen. Este comportamento foi verificado quando da composio de FDN e FDA determinados pelos mtodos comum e seqencial, cuja diferena resultou em 4,6% na MS, ou 23,3% a menos do total de FDA, que, presume-se, seja relativo ao teor de pectina. Diante do exposto, sugere-se que, quando da anlise dos teores de fibra da palma forrageira ou outro alimento material com elevada concentrao de pectina, deve-se adotar a metodologia descrita por Van Soest (1967). Mtodos de determinao de amido e pectina Amido Este mtodo que ser abordado posteriormente foi descrito por Carvalho et al. (2002) e, segundo os autores se aplica principalmente a farinha de trigo, mandioca ou amostras que contenham alto teor de amido. Princpio O amido no apresenta reao redutora. Uma hidrlise energtica em meio fortemente cido produz exclusivamente glicose, que determinada pelo mtodo de Lane-Eynon. Baseia-se na reduo de um volume conhecido de um reagente de cobre alcalino (Fehling) a xido cuproso. O ponto final indicado pelo azul de metileno, que reduzido sua forma leuco por um pequeno excesso de acar redutor. Material e Equipamentos 1. Autoclave. 2. Chapa eltrica com regulagem at 150C. 3. Papel de filtro qualitativo.
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4. Papel tornassol. 5. Vidraria comum de laboratrio. Reagentes e Solues 1. 2. 3. 4. 5. cido clordrico concentrado (HCl) P.A. Soluo de hidrxido de sdio (NaOH) a 10%. Sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) P.A. Tartarato duplo de sdio e potssio (KNaC4H4O6.4H2O) P.A. Soluo de acetato de zinco (CH3COO)2Zn.2H2O) A 30% ou sulfato de zinco (ZnSO4.7H2O) A 30%. 6. Soluo de azul de metileno a 1%. 7. Soluo de Fehling tituladas: Preparo: Soluo A pesar 34,639g de sulfato de cobre - CuSO4.5H2O e transferir para um balo volumtrico de 1000mL. Completar o volume com gua destilada. Soluo B pesar 173g de tartarato duplo de sdio e potssio (sal de Rochelle) e 125g de NaOH. Transferir para um balo volumtrico de 1000mL e completar o volume com gua destilada. Titulao: Colocar numa bureta a soluo padro de glicose. Transferir com pipeta volumtrica 10mL de soluo de Fehling A e 10mL de soluo de Fehling B para balo de titulao Fehling. Adicionar 40mL de gua destilada, juntamente com algumas prolas de ebulio, aquecendo at a ebulio. Gotejar a soluo padro, sem agitao, at quase o final da titulao. Mantendo a ebulio, adicionar uma gota de azul de metileno a 1% e completar a titulao at descoramento do indicador. O final da titulao ser em torno de 10mL de glicose. Clculo do ttulo da soluo Fehling: FC = ml gastos de glicose x 0,5 100 O tempo de titulao no deve ultrapassar 3 minutos. 8. Soluo de ferrocianeto de potssio (K4Fe(CN)6.3H2O) a 15%. 1. Soluo padro de glicose pesar 0,500g de glicose pura (seca em estufa vcuo regulada a 70C, durante 1h) e diluir a 100mL em balo volumtrico. Procedimento 2. Pesar 2g de amostra com preciso de 0,0001g. 3. Com o auxlio de 200mL de gua, transferir a amostra para um Erlenmeyer de 500mL. 4. Adicionar 1mL de NaOH a 10% e colocar em autoclave a 121C por 1h. Deixar esfriar. 5. Adicionar 10mL de HCl concentrado e aquecer novamente em autoclave (1atm) por 30 minutos. Esfriar novamente, neutralizar a soluo com NaOH 40%. Adicionar ao balo 5mL de cada antiinterferente e transferir para balo volumtrico de 500mL. 6. Completar o volume com gua destilada. Agitar e deixar sedimentar.
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7. Filtrar em papel de filtro seco. Receber o filtrado em um frasco Erlenmeyer seco. 8. Transferir a soluo filtrada para uma bureta de 25mL. 9. Transferir para um balo de titulao de Fehling de 250mL com auxlio de pipetas, 10mL de cada uma das solues de Fehling e algumas prolas de ebulio. Adicionar 40mL de gua destilada. 10. Aquecer at a ebulio. Adicionar gota a gota a soluo da bureta at que fique levemente azulada. 11. Mantendo a ebulio, adicionar uma gota da soluo de azul de metileno a 1% e continuar a titulao at a descolorao do indicador (no fundo do frasco deve ficar um resduo vermelho). Titular no menor tempo possvel aps a adio do azul de metileno. Clculos Amido (%) = FC/2 x 500 x 100 x 0,9 VxP Onde: FC = ttulo da soluo de Fehling. V = n de ml da soluo da amostra gasto na titulao. P = peso da amostra em g. (a) Quando a amostra s contm amido, multiplicar o resultado por 0,90, que o fator de transformao de glicose em amido. (b) Se a amostra contm sacarose, o clculo ser: % amido = (acares totais sacarose) x 0,90 (C) Se a amostra contm sacarose e glicose o clculo ser: % amido = [acares totais (sacarose + glicose)] x 0,90 Mtodos para pectina 1) O procedimento que ser abordado foi descrito por Bucher (1984) citado por Van Soest (1991). Este mtodo foi melhorado com respeito a especificidade para o cido galacturnico sobre o cido glucornico. O procedimento no mensura arabinanas que pode est associada com a pectina. Reagentes Os reagentes incluem o cido sulfrico concentrado, soluo de hidrxido de sdio (0.5% NaOH, p/p) e o reagente metahidroxidifenil (0.15% m-fenilfenol, p/v em 0.5% NaOH, p/p).
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Procedimento Alquotas (0,5mL) da soluo da amostra contendo 5 a 20 ug de cido urnico por alquota so pipetados dentro de tubos de teste (15 x 25 mm) em quaduplicata e os tubos so colocados em um banho de gelo por no mnimo 10 minutos. O cido sulfrico concentrado (3mL) em temperatura ambiente pipetado dentro de cada tubo e os tubos so imediatamente devolvidos ao banho de gelo por no mnimo 5 minutos. Os tubos so ento misturados atravs de vontexing e colocados em banho-maria, com agitao, a 80C por exatamente 8 minutos. Os tubos so removidos e esfriados em temperatura ambiente. O reagente metahidroxidifenil (50ul) adicinado a um par de tubos e a soluo de hidrxido de sdio (50ul) adicionada a um segundo par de tubos para o controle. Todos os tubos so vortexed por 10 segundos e mantidos em temperatura ambiente por poucos minutos para assegurar completa formao de cor e permitir a dissipao de bolhas. As absorvncias so lidas em 520 nm em um espectrofotmetro dentro de 1 hora de mistura (a cronometragem importante). As amostras so corrigidas por leituras do branco. A concentrao de galacturona calculada por referncia a uma curva do cido galacturnico padro que segue a lei de Lambert-Beer at 35 ug/ml da soluo da amostra (17,5 ug/alquota). Uma partida de padres de solues de cido galacturnico analisada com cada partida de amostras. 2) Este segundo mtodo que ser abordado foi proposto por Carvalho et al. (2002). De acordo com os autores esta tcnica se aplica em resduos de frutas, gelias e produtos afins. Princpio Baseia-se na neutralizao das cargas dos resduos de cido galacturnico livre pelos ons clcio, provocando a geleificao da pectina e sua precipitao. Material e Equipamentos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Balana analtica (preciso 0,0001g). Banho-maria. Cpsulas de alumnio. Dessecador (com slica). Erlenmeyer de 500ml. Estufa. Papel de filtro Whatmann n.4. Vidraria comum de laboratrio.

Reagentes e Solues 1. Soluo de cido actico (H3C6H5O2.H2O) 1 N: 58g em 1000ml de gua destilada. 2. Soluo de cloreto de clcio (CaCl2) 2 N: 220g em 1000ml de gua destilada recentemente fervida e resfriada. 3. Soluo de hidrxido de sdio(NaOH) 1 N: 40g de NaOH em 1000ml de gua destilada recentemente fervida e resfriada. 4. Soluo de nitrato de prata (AgNO2) a 1%.
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Procedimento A 1 dia 1. Pipetar 100ml de amostra ou pesar quantidade conveniente (50g de goiaba ou 100g de laranja) em um Becker de 800ml. Juntar cerca de 400 ml de gua destilada. 2. Ferver lentamente durante 1 h, recolocando a gua perdida por evaporao. Deixar esfriar o contedo do Becker. 3. Agitar bem e filtrar para um Erlenmeyer de 500ml usando papel de filtro (ou algodo). 4. Verter para um balo volumtrico de 500ml e completar o volume. Pipetar alquotas de 100ml em Becker de 500ml. 5. Adicionar 300ml de gua destilada e 10 ml de hidrxido de sdio 1 N, agitando continuamente. 6. Deixar em repouso durante a noite. B 2 dia 1. Adicionar 50ml de soluo de cido actico 1N. 2. Esperar 5 minutos. 3. Adicionar, tambm sob agitao, 50ml de soluo de cloreto de clcio 2N. 4. Levar fervura por 1 minuto. 5. Deixar em repouso por 1 h, no mnimo. 6. Filtrar em papel de filtro (seco e previamente tarado em cpsula de alumnio). Lavar com gua destilada bem quente at remover todo o cloreto livre (testar com nitrato de prata). Transferir o resduo do filtro para a cpsula de alumnio previamente tarada, evaporar em banho-maria at secura. 7. Deixar em estufa a 100C por 3 h ou 40C durante a noite. 8. Deixar esfriar em dessecador e pesar. Clculo O teor de pectina calculado pela frmula: gramas de pectato de clcio %=g de pectato de clcio x 100 (volume ou peso da amostra) Referncias ANDRADE, D. K. B., FERREIRA, M.A., VERS, A.S.C. et al. Digestibilidade e absoro aparentes em vacas da raa Holandesa alimentadas com palma forrageira (Opuntia ficusindica Mill) em substituio silagem de sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench). Revista Brasileira Zootecnia, v. 31, n.5, p. 2088-2097, 2002. CARVALHO, H.H., JOMG, E.V., BELL, R.M. et al. Alimentos: mtodos fsicos e qumicos de analyses. 1.ed. Porto alegre: Universidade/UFRGS, 2002. 180p. HALL, M. B. Challenges with nonfiber carbohydrate methods. Journal of Animal Science. v.81, p. 32263232, 2003.
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Trabajo recibido el 11/11/2005, n de referencia 010604_REDVET. Enviado por su autor principal, miembro de la Comunidad Virtual Veterinaria.org . Publicado em Revista Electrnica de Veterinaria REDVET, ISSN 1695-7504 el 01/01/06. Veterinaria.org - Comunidad Virtual Veterinaria.org - Veterinaria Organizacin S.L.Se autoriza la difusin y reenvo de esta publicacin electrnica en su totalidad o parcialmente, siempre que se cite y REDVET la fuente, enlace con Veterinaria.org http://www.veterinaria.org/ http://www.veterinaria.org/revistas/redvet y cumplan los requisitos indicados en Copyright 1996-2006

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