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Por Miguel Angel Olvera Novoa Carlos A. Martnez Palacios Elizabeth Real de Len Documento preparado para el Proyecto GCP/RLA/102/ITA Apoyo a las Actividades Regionales de Acuicultura para Amrica Latina y el Caribe (AQUILA II)
PREPARACION DEL DOCUMENTO Este documento fue realizado como parte de las actividades del Proyecto FAO/Italia GCP/RLA/102/ITA Apoyo a las Actividades Regionales de Acuicultura para Amrica Latina y el Caribe (AQUILA), cuyo objetivo principal es ayudar a los pases miembros para que incrementen la produccin de alimento por medio de la acuicultura, bajo la consideracin de que fomentando la capacitacin, la investigacin y el intercambio de informacin, se fortalecer el crecimiento de la actividad de acuerdo a las caractersticas de cada pas. E1 trabajo comprende una recopilacin de los mtodos ms comunes de anlisis qumicos para evaluar la calidad de los ingredientes alimenticios y las dietas preparadas, con el propsito de hacerlos disponibles a la mayora de los tcnicos y personal involucrado en la alimentacin de peces y crustceos. Se sealan adems algunas recomendaciones para el manejo de las muestras para una buena representatividad de los resultados obtenidos. Las tcnicas seleccionadas se presentan divididas en tres grupos, las incluidas dentro de los anlisis proximales, un captulo de anlisis especiales que comprende tcnicas para la determinacin ms precisa de algunos nutrientes importantes como son por ejemplo, minerales, carbohidratos y protena verdadera, y un tercer apartado con los mtodos analticos para algunos de los txicos y antinutrientes ms
AGRADECIMIENTOS Los autores desean expresar su agradecimiento al Dr. Albert Tacon por su apoyo e impulso a las actividades sobre nutricin de organismos acuticos, as como tambin a las autoridades regionales del proyecto AQUILA.
Las denominaciones empleadas en este documento y la forma que aparecen presentados los datos, no implican de parte de la Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y Alimentacin, juicio alguno sobre la condicin jurdica de pases, territorios, ciudades o zonas o de sus autoridades, ni respecto de la delimitacin de sus fronteras o lmites. De la misma manera, el mencionar nombres o marcas de fbrica o distintos productos, no implican recomendacin alguna por parte de la organizacin para su uso. ORGANIZACION DE LAS NACIONES UNIDAS PARA LA AGRICULTURA Y LA ALIMENTACION MEXICO, D.F. MAYO 1993
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CONTENIDO
1. INTRODUCCION 2. PREPARACION DE LA MUESTRA PARA ANALISIS 2.1. Preparacin de la muestra 3. ANALISIS PROXIMALES 3.1. Humedad 3.2. Protena cruda. 3.3. Lpidos crudos 3.4. Fibra cruda 3.5. Ceniza 3.6. Extracto libre de nitrgeno (ELN)
3.7. Correcciones 4. ANALISIS ESPECIALES 4.1. Determinacin de fibra por detergente acido. 4.2. Determinacin de fibra por detergente neutro. 4.3. Ceniza insoluble en cido clorhdrico 4.4. Carbohidratos totales disponibles (Clegg-Anthrone). 4.5. Nitrgeno proteico y no proteico. 4.6. Determinacin de protenas por el mtodo de Lowry. 4.7. Determinacin de urea 4.8. Acido rico. 4.9. Ceniza soluble e insoluble en cido. 4.10. Determinacin de calcio en el alimento. 4.11. Determinacin de fsforo 4.12. Determinacin de cloruro de sodio 4.13. Determinacin de potasio 4.14. Cuantificacin de xido de cromo en heces y alimentos 4.15. Mtodo de Carpenter para la determinacin de lisina disponible 4.16. Anlisis de melazas 5. ANTIMETABOLITOS Y TOXINAS EN ALIMENTOS 5.1. Actividad uresica enharina de Soya 5.2. Gosipol libre en harina de semilla de algodn 5.3. Determinacin de tioglucsidos 5.4. Anlisis de aflatoxinas 5.5. Mtodo colorimtrico para la determinacin de mimosina 5.6. Mtodo colorimtrico para la determinacin de canavanina 5.7. Determinacin de cido cianhdrico 5.8. Taninos en plantas y forrajes
5.9. Mtodo simple para la determinacin de cido ftico 5.10. Determinacin de saponinas en vegetales y alimentos 6. REFERENCIAS Anexo 1. Clases de alimento por composicin y uso Anexo 2. Limites recomendados para algunas substancias indeseables Anexo 3. Algunos Factores Antinutricionales Identificados
INDICE DE FIGURAS
1 Determinacin de humedad en ingredientes alimenticios 2 Determinacin de protena cruda (mtodo kjeldahl) 3 Determinacin de protena cruda (mtodo MAFF) 4 Determinacin de lpidos por Soxhlet 5 Determinacin de fibra cruda 6 Determinacin de ceniza en alimentos 7 Determinacin de fibra por detergente cido 8 Determinacin de fibra por detergente neutro. 9 Ceniza insoluble en cido clorhdrico (mtodo A) 10 Ceniza insoluble en cido clorhdrico (mtodo B) 11 Determinacin de carbohidratos totales disponibles 12 Determinacin de nitrgeno proteico y no proteico. 13 Determinacin de protena por el mtodo de Lowry 14 Determinacin de urea en ingredientes alimenticios 15 Determinacin de cido Urico en gallinaza y alimentos. 16 Determinacin de ceniza soluble e insoluble en cido. 17 Determinacin de calcio en el alimento. 18 Determinacin de fsforo en ingredientes alimenticios 19 Determinacin de cloruro de sodio en harina de pescado y alimentos 20 Determinacin de potasio en ingredientes alimenticios
21 Cuantificacin de xido de cromo en heces y alimentos 22 Determinacin de lisina disponible en ingredientes alimenticios 23 Determinacin de azcares en melazas 24 Determinacin de actividad uresica en harina de soya 25 Determinacin de gosipol libre en harina de semilla de algodn 26 Determinacin de Tioglucsidos en ingredientes alimenticios 27 Determinacin de aflatoxinas en alimentos 28 Mtodo colorimtrico para la determinacin de mimosina 29 Mtodo colorimtrico para la determinacin de canavanina 30 Determinacin de cido cianhdrico en ingredientes alimenticios 31 Determinacin de taninos en plantas y forrajes 32 Mtodo simple para la determinacin de cido ftico 33 Determinacin de saponinas en vegetales y alimentos
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1. INTRODUCCION
El desarrollo de la acuacultura en sistemas semi intensivos e intensivos ha forzado el desarrollo de patrones de alimentacin cada vez ms eficientes, basados en los requerimientos nutricionales de cada una de las especies a cultivar. Para que el animal presente un crecimiento adecuado en el menor tiempo y ms bajo costo posibles, el alimento suministrado debe poseer caractersticas nutricionales ptimas, por lo cual en la industria de alimentacin de peces, como en las dems especies animales, la elaboracin, los ingredientes y el almacenamiento de los alimentos procesados, deben de estar sometidos a estrictos controles de calidad. En la acuacultura semi-intensiva e intensiva, la calidad del alimento est considerada como uno de los factores de mayor influencia en el xito de un cultivo, ya que los costos del alimento y la alimentacin, representan por lo general entre el 50 y 70% de los costos de operacin en un sistema de este tipo. La calidad de los alimentos va a depender en primer trmino de la calidad de los ingredientes utilizados en la preparacin del alimento balanceado, as como tambin del tipo de procesamiento a que se sometan antes y durante la elaboracin del alimento. Adicionalmente, el cuidado que se tenga para almacenar tanto ingredientes como alimento terminado, influir notablemente en sus propiedades nutritivas. Los alimentos balanceados son preparados con base en los requerimientos nutricionales de cada especie y an cuando la dieta se formula para satisfacerlos, no siempre contiene los niveles de nutrientes calculados una vez preparado, debido a que el proceso usado en su elaboracin puede alterar significativamente su valor nutricional; por ejemplo, el calor puede daar algunos nutrientes y/o puede hacerlos ms disponibles eliminando los txicos termolbiles, mientras que por otro lado la molienda puede afectar la digestibilidad de protenas y carbohidratos (Harris, 1980). La calidad del alimento tambin se modifica despus de pasar cierto tiempo en el almacn, donde adems de sufrir cambios en el valor nutricional, se pueden presentar alterciones en otras caractersticas como son el color, la textura, el sabor y el olor. Por otra parte existe el grave riesgo de contaminarse con los desechos de roedores, insectos y micoorganismos que aceleran an ms su deterioro (Limborg, 1979; Chow et al., 1980; Smith and Moss, 1985). Teniendo en consideracin todos estos factores, resalta la importancia de tener un control de calidad de los ingredientes alimenticios y del producto terminado, con el fin de asegurar que la dieta posea los niveles nutricionales mnimos requeridos, ya que nos proporciona la composicin exacta del material y el nivel de sustancias txicas normalmente presentes. Este control se inicia con el anlisis de los ingredientes con que se elaborar el alimento y finaliza con la certificacin de los niveles de nutrientes en el alimento preparado, as como su adecuado almacenaje (Frazer, 1967; Harris, 1980). Adicionalmente, es claro que solo es posible formular una dieta completa, si se conoce con precisin al menos la composicin proximal de los ingredientes con que se elaborar, sin embargo, Tacon (1979) recomienda que el valor nutricional de un material usado en la formulacin de alimentos, debe evaluarse con base en: a. b. c. d. e. f. g. Su contenido de Nitrgeno proteico y no proteico. La composicin de aceites y cidos grasos. El contenido de fibra cruda y carbohidratos solubles Su contenido de minerales y vitaminas. La presencia de microbios. La presencia de compuestos orgnicos txicos. La variabilidad de la composicin qumica.
De manera ideal cualquier ingrediente debera pasar por los puntos de control sealados, sin embargo, si por limitaciones econmicas o de equipo no es posible, se debe entonces procurar cubrir al menos aquellos anlisis que garanticen una calidad mnima deseable y una seguridad de que los animales no presentarn reacciones adversas al alimento. An cuando el control de calidad es un tema que merece tratarse exhaustivamente, este manual est enfocado particularmente a los mtodos bsicos de anlisis qumicos necesarios para una adecuada evaluacin de ingredientes y dietas elaboradas, con el objeto de ponerlos a la disposicin de la mayora de acuacultores y personas interesadas en este tipo de evaluaciones que posean conocimientos bsicos de qumica. Los mtodos propuestos han sido recopilados de diferentes fuentes y la mayora son considerados como estndares de norma. Con fines prcticos los anlisis se han agrupado en tres secciones; en la primera se incluyen los mtodos considerados dentro del anlisis proximal, para determinar el contenido de humedad, protena cruda, lpidos crudos, fibra cruda, ceniza y extracto libre de nitrgeno; este anlisis permite conocer los niveles porcentuales de cada nutriente en el material pero no indica nada acerca de la calidad de los nutrientes, para lo cual se requieren otros anlisis complementarios, algunos de los cuales se incluyen en este manual en la segunda seccin donde se consideran como anlisis especiales. En un tercer apartado se incluyen las tcnicas ms sencillas para la deteccin de algunos de los txicos y antinutrientes ms comunes, ya que su presencia puede afectar negativamente la eficiencia de utilizacin de los alimentos, e inclusive, ser causa de mortalidad. Consideramos que este captulo es particularmente importante cuando se incluye en los alimentos subproductos agroindustriales como harina de soya, algodn, o nuevas fuentes proteicas, particularmente de origen vegetal. Antes de realizar alguna tcnica analtica, es importante considerar las siguientes recomendaciones: a. Asegurarse de que cuenta con los reactivos y equipo necesarios para efectuar la determinacin deseada, ya que una vez iniciado un anlisis, por lo general no es posible suspenderlo temporalmente en tanto se consiguen los faltantes. b. Efecte cada anlisis por TRIPLICADO. Es ms exacto trabajar con valores promedio que con un slo dato; si los resultados entre las rplicas varan notablemente, es preferible repetir todo el anlisis. c. Pese la muestra con la mayor aproximacin posible. Tres o cuatro decimales nos dan una mayor exactitud en el clculo. Siempre utilice una balanza analtica. d. Despus de pasar la muestra al recipiente donde se realizar el anlisis, pese nuevamente el contenedor a fin de ajustar el peso final. La exactitud en el peso es fundamental para obtener un buen resultado, ya que la mayor parte de las tcnicas son gravimtricas. e. Nunca modifique el tamao de muestra, los tiempos en las diferentes etapas o el tipo de reactivos, a menos de que se hagan pruebas comparativas que garanticen la precisin de los resultados. Recuerde que los anlisis normalmente se basan en mtodos estndar aceptados o exigidos por las autoridades reguladoras. f. Utilice siempre los equipos y accesorios de seguridad requeridos, como son campanas de extraccin, mscaras y batas. g. Recuerde que estar manejando substancias txicas o peligrosas para el organismo, por ello extreme las precauciones requeridas segn el caso y no omita ninguna.
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e. Se recomienda un examen fsico macro y microscpico para detectar la presencia de materiales contaminantes. f. Mezcle la muestra perfectamente y divdala en dos partes iguales. De ser necesario haga un molido preliminar para facilitar esta operacin. Almacene una de las partes en un frasco hermtico, limpio y seco; la otra parte ser usada en los anlisis y su tamao deber ser adecuado para la totalidad de las pruebas requeridas. g. Al menos que el mtodo de anlisis indique lo contrario, los materiales sern molidos de inmediato y pasados por una malla de 1 mm2; mezcle perfectamente la muestra tamizada y almacnela en un recipiente hermtico. Antes de tomar material para cada anlisis mzclese nuevamente. h. Al menos que se seale lo contrario, las muestras hmedas debern secarse para su molido y tamizado, siguiendo las indicaciones del punto anterior. i. Las muestras lquidas y semilquidas debern conservarse en frascos tapados y mezclarse perfectamente antes de su anlisis. j. Los materiales debern conservarse en refrigeracin o a temperaturas que eviten cambios en su composicin. Muestras para anlisis de vitaminas u otras substancias sensibles a la luz se colocarn en recipientes de vidrio color mbar.
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3. ANALISIS PROXIMALES.
Los anlisis comprendidos dentro de este grupo, tambin conocido como anlisis proximales Weende, se aplican en primer lugar a los materiales que se usarn para formular una dieta como fuente de protena o de energa y a los alimentos terminados, como un control para verificar que cumplan con las especificaciones o requerimientos establecidos durante la formulacin. Estos anlisis nos indicarn el contenido de humedad, protena cruda (nitrgeno total), fibra cruda, lpidos crudos, ceniza y extracto libre de nitrgeno en la muestra. Una descripcin ms amplia de estos anlisis se puede encontrar en Osborne y Voogt (1978), MAFF (1982) y AOAC (1984).
3.1. Humedad.
Durante el balanceo de la racin, es fundamental conocer el contenido de agua en cada uno de los elementos que la compondrn; as mismo, es necesario vigilar la humedad en el alimento preparado, ya que niveles superiores al 8% favorecen la presencia de insectos y arriba del 14%, existe el riesgo de contaminacin por hongos y bacterias (Cockerell et al., 1971). El mtodo se basa en el secado de una muestra en un horno y su determinacin por diferencia de peso entre el material seco y humedo. Aparatos Horno de secado. Desecadores. Procedimiento 1. 2. 3. 4. Pese alrededor de 510 g de la muestra previamente molida. Coloque la muestra en un horno a 105 por un mn imo de 12 h. C Deje enfriar la muestra en un desecador. Pese nuevamente cuidando de que el material no este expuesto al medio ambiente.
Clculos Contenido de humedad (%) = 100(((B-A) - (C-A))/(B-A)) Donde: A = Peso de la charolilla seca y limpia (g) B = Peso de la charolilla + muestra hmeda (g) C = Peso de la charolilla + muestra seca (g)
Solucin de hidrxido de sodio al 40%; disolver 400 g de hidrxido de sodio en agua y diluir a 1,000 ml. Solucin de sulfato de sodio al 4%. Solucin indicadora de cido brico; agregue 5 ml de una solucin con 0.1% de rojo de metilo y 0.2% de verde de bromocresol a un litro de solucin saturada de cido brico. Solucin estndar de cido clorhdrico 0.1N. Materiales y Equipo Unidad de digestin y destilacin Kjeldahl. Matraces Kjeldahl de 500 ml. Matraces Erlenmayer de 250 ml. Perlas de ebullicin. Procedimiento 1. Pese con precisin de miligramos 1g de muestra y colquelo en el matraz Kjeldahl; agrguele 10g de sulfato de potasio, 0.7g de xido de mercurio y 20 ml de cido sulfrico concentrado. 2. Coloque el matraz en el digestor en un ngulo inclinado y caliente a ebullicin hasta que la solucin se vea clara, contine calentando por media hora ms. Si se produce mucha espuma, adicinele un poco de parafina. 3. Deje enfriar; durante el enfriamiento adicione poco a poco alrededor de 90 ml de agua destilada y desionizada. Ya fro agregue 25 ml de solucin de sulfato de sodio y mezcle. 4. Agregue una perla de ebullicin y 80 ml de la solucin de hidrxido de sodio al 40% manteniendo inclinado el matraz. Se formarn dos capas. 5. Conecte rpidamente el matraz a la unidad de destilacin, caliente y colecte 50 ml del destilado conteniendo el amonio en 50 ml de solucin indicadora. 6. Al terminar de destilar, remueva el matraz receptor, enjuague la punta del condensador y titule con la solucin estndar de cido clorhdrico. Clculos: A = Acido clorhdrico usado en la titulacin (ml) B = Normalidad del cido estndar C = Peso de la muestra (g) Nitrgeno en la muestra (%) = 100[((A B)/C) 0.014] Protena cruda (%) = Nitrgeno en la muestra * 6.25
FIGURA 2 Determinacin de protena cruda por el mtodo Kjeldahl. b) Mtodo estndar MAFF (1982) para la determinacin de protenas en alimentos y sus ingredientes.
Reactivos: Oxido de mercurio. Sulfato de potasio o sulfato de sodio anhidro. Sacarosa. Zinc granulado. Granulado de piedra pomex lavada con cido sulfrico y quemada. Acido sulfrico concentrado (d = 1.84 g/ml). Solucin de hidrxido de sodio al 40 %. Solucin saturada de sulfato de sodio. Solucin de tiosulfato de sodio; 8g de Na2S2O35H2O en 100ml. Solucin de hidrxido de sodio 0.1N. Solucin de hidrxido de sodio 0.25N. Solucin de cido sulfrico 0.1N. Solucin indicadora de rojo de metilo; disuelva 0.3 g de rojo de metilo en 100 ml de etanol (9596 % V/V). Solucin indicadora rojo de metilo-azul de metileno; (a) disuelva 0.2g de rojo de metilo en 100ml de etanol (9596 % V/V) y (b) disuelva 0.1g de azul de metileno en 100ml de etanol (9596 % V/V), mezcle un volumen de (a) con uno de (b). Materiales y Equipo Unidad de digestin y destilacin Kjeldahl. Matraces Kjeldahl. Procedimiento 1. Pese 1g de muestra con aproximacin de miligramos y psela a un matraz Kjeldahl; adicione 10g de sulfato de potasio o sulfato de sodio, 0.6 0.7g de xido de mercurio, 25 ml de cido sulfrico y unos pocos granos de piedra pomex. 2. Caliente el matraz moderadamente al principio, agitando ocasionalmente hasta que la materia este carbonizada y las burbujas hayan desaparecido, luego aumente la temperatura y permita que se establezca una ebullicin suave. Evite que las paredes del matraz se sobrecalienten para que no se le peguen partculas orgnicas. 3. Cuando la solucin se vea clara y sin color, contine la ebullicin por 2 horas ms y luego permita que se enfre. Si despus de la digestin y del enfriamiento se cristaliza la solucin repita el anlisis; si sigue ocurriendo la cristalizacin repita el anlisis usando una mayor cantidad de cido sulfrico. 4. Adicione con cuidado al matraz 250350ml de agua destilada, mezclando el contenido al mismo tiempo; deje enfriar y agrguele unas lentejas de Zinc. 5. Transfiera 25 ml de solucin de cido sulfrico 0.1 0.5N al matraz de colecta del aparato de destilacin, de acuerdo con el valor esperado de Nitrgeno en la muestra, as como unas cuantas gotas de indicador de rojo de metilo. 6. Tomando precauciones para evitar prdida de amonio, adicione cuidadosamente a la muestra 100 ml de solucin de hidrxido de sodio y luego 10 ml de solucin de sulfato de sodio o 25 ml de solucin de tiosulfato de sodio. Mezcle bien y conecte inmediatamente al aparato de destilacin. 7. Caliente el matraz de tal manera que se destilen alrededor de 150 ml del lquido en 30 min. Al finalizar, mida con papel indicador el pH del destilado resultante y si es alcalino contine con la destilacin, la cual se suspender cuando el pH aparezca neutro. Durante este proceso agite ocasionalmente el contenido del matraz. Si el destilado se torna alcalino, la determinacin deber ser abandonada y el anlisis repetido con los ajustes apropiados.
8. En el matraz de colecta titule el exceso de cido sulfrico con hidrxido de sodio 0.1 0.25N, de acuerdo con la normalidad del cido empleado, al punto final del indicador de rojo de metilo o rojo de metilo-azul de metileno. 9. Corra un blanco de reactivos usando 1g de sacarosa en lugar de la muestra, para usarlo en el clculo de los resultados. Clculos a. Determine el H2SO4 consumido. 1 ml de cido 1.4mg de Nitrgeno. b. Calcule el porcentaje de Nitrgeno en la muestra y convirtalo a porcentaje de protena multiplicando el resultado por 6.25. c. Si se sospecha de la presencia de Nitrgeno amoniacal o nitratos en la muestra, debern ser evaluados para restarse del Nitrgeno total. Exceptuando los alimentos para rumiantes, se deber evaluar el contenido de Nitrgeno no proteico y tambin substraerse del Nitrgeno total.
del peso despus de evaporar el solvente. Reactivos, Materiales y Equipo - Eter de petrleo, punto de ebullicin 4060 C. Aparato de extraccin Soxhlet. Horno de laboratorio ajustado a 105 C. Desecador. Dedales de extraccin. Procedimiento 1. Saque del horno los matraces de extraccin sin tocarlos con los dedos, enfrelos en un desecador y pselos con aproximacin de miligramos. 2. Pese en un dedal de extraccin manejado con pinzas, de 3 a 5g de la muestra seca con aproximacin de miligramos y colquelo en la unidad de extraccin. Conecte al extractor el matraz con ter de petrleo a 2/3 del volumen total. 4. Lleve a ebullicin y ajuste el calentamiento de tal manera que se obtengan alrededor de 10 reflujos por hora. La duracin de la extraccin depender de la cantidad de lpidos en la muestra; para materiales muy grasosos ser de 6 horas. 5. Al trmino, evapore el ter por destilacin o con rotovapor. Coloque el matraz en el horno durante hora y media para eliminar el ter. Enfre los matraces en un desecador y pselos con aproximacin de miligramos. La muestra desengrasada puede usarse para la determinacin de fibra cruda. Clculos A = Peso del matraz limpio y seco (g) B = Peso del matraz con grasa (g) C = Peso de la muestra (g) Contenido de lpidos crudos (%) = 100((B - A)/C)
Este mtodo permite determinar el contenido de fibra en la muestra, despus de ser digerida con soluciones de cido sulfrico e hidrxido de sodio y calcinado el residuo. La diferencia de pesos despus de la calcinacin nos indica la cantidad de fibra presente. Reactivos Solucin de cido sulfrico 0.255N. Solucin de hidrxido de sodio 0.313N, libre de carbonato de sodio. Antiespumante (ej. alcohol octil o silicona). Alcohol etlico al 95% (V/V). Eter de petrleo. Solucin de cido clorhdrico al 1% (V/V). Materiales y equipo. Matraz de bola fondo plano, 600 ml, cuello esmerilado. Unidad de condensacin para el matraz. Matraz Kitazato de un litro. Embudo Buchner. Crisol de filtracin. Conos de hule. Papel filtro Whatman No. 541. Pizeta de 500 ml. Desecador. Horno de laboratorio. Mufla. Mtodo 1. Pese con aproximacin de miligramos de 2 a 3 gramos de la muestra desengrasada y seca. Colquela en el matraz y adicione 200ml de la solucin de cido sulfrico en ebullicin. 3. Coloque el condensador y lleve a ebullicin en un minuto; de ser necesario adicinele antiespumante. Djelo hervir exactamente por 30 min, manteniendo constante el volumen con agua destilada y moviendo peridicamente el matraz para remover las partculas adheridas a las paredes. 4. Instale el embudo Buchner con el papel filtro y precalintelo con agua hirviendo. Simultneamente y al trmino del tiempo de ebullicin, retire el matraz, djelo reposar por un minuto y filtre cuidadosamente usando succin; la filtracin se debe realizar en menos de 10 min. Lave el papel filtro con agua hirviendo. 5. Transfiera el residuo al matraz con ayuda de una pizeta conteniendo 200ml de solucin de NaOH en ebullicin y deje hervir por 30 min como en paso 2. 6. Precaliente el crisol de filtracin con agua hirviendo y filtre cuidadosamente despus de dejar reposar el hidrolizado por 1 min. 7. Lave el residuo con agua hirviendo, con la solucin de HCI y nuevamente con agua hirviendo, para terminar con tres lavados con ter de petrleo. Coloque el crisol en el horno a 105 por 12 horas y C enfre en desecador. 8. Pese rpidamente los crisoles con el residuo (no los manipule) y colquelos en la mufla a 550 por C 3 horas, djelos enfriar en un desecador y pselos nuevamente. Clculos A = Peso del crisol con el residuo seco (g)
B = Peso del crisol con la ceniza (g) C = Peso de la muestra (g) Contenido de fibra cruda (%)= 100((A - B)/C) Recomendaciones Uno de los problemas ms frecuentes durante la evaluacin de la fibra cruda es la oclusin de los filtros, por lo que en algunos casos se recomienda sustituir el papel (paso 4 del mtodo) por una pieza de tela de algodn. Para evitar la saturacin del crisol de filtracin (paso 6) colquelo ligeramente inclinado y agregue muy lentamente el material a filtrar, de manera que gradualmente se vaya cubriendo la superficie filtrante. Con el uso los crisoles de filtracin tienden a taparse. Para su limpieza calcnelos a 500 y hgales pasar C agua en sentido inverso. Cuando se han tapado con partculas minerales, prepare una solucin que contenga 20% KOH, 5% de Na3PO4 y 0.5% de EDTA sal sdica, calintela y hgala pasar por el crisol en sentido inverso. Este tratamiento erosiona al filtro de vidrio.
3.5. Ceniza
El mtodo aqu presentado se emplea para determinar el contenido de ceniza en los alimentos o sus ingredientes mediante la calcinacin. Se considera como el contenido de minerales totales o material inorgnico en la muestra. Materiales y equipo. Crisoles de porcelana. Mufla. Desecador. Procedimiento 1. En un crisol de porcelana que previamente se calcin y se llevo a peso constante, coloque de 2.5 a 5g de muestra seca. 2. Coloque el crisol en una mufla y calcnelo a 550C por 12 horas, deje enfriar y pselo a un desecador. 3. Cuidadosamente pese nuevamente el crisol conteniendo la ceniza. Clculos A = Peso del crisol con muestra (g) B = Peso del crisol con ceniza (g) C = Peso de la muestra (g) Contenido de ceniza (%)= 100((A - B)/C)
Extracto Libre de Nitrgeno (%) = 100-(A+B+C+D+E) Donde: A = Contenido de humedad (%) B = Contenido de protena cruda (%) C = Contenido de lpidos crudos (%) D = Contenido de fibra cruda (%) E = Contenido de ceniza (%)
3.7. Correcciones
Debido a que los anlisis normalmente se hacen con muestras preparadas para tal fin, es necesario realizar ciertas correcciones en los resultados para que reflejen el contenido real de nutrientes en el material en las condiciones en que se usar. a) Humedad Si los anlisis se efectuaron en base seca (BS), esto es material deshidratado, es necesario corregir el resultado para expresarlo en base hmeda (BH), tal como se encuentra en el alimento o material para su elaboracin, mediante la siguiente expresin: A = Contenido de nutriente (%/BS) B = Contenido de humedad de el material (%) Contenido de nutriente (%/BH) = (A ((100 - B)/100)) b) Lpidos Cuando se usa material desengrasado, por ejemplo en el anlisis de fibra cruda, se aplica una expresin similar a fin de obtener un valor representativo de la muestra: A = Contenido de fibra (desengrasada, %) B = Contenido de lpidos en el material (%) Contenido de fibra ajustado (%) = (A ((100 - B)/100))
Producido por: Departamento de Pesca Ttulo: Manual de tecnicas para laboratorio de nutricion de peces y crustaceos... Ms informacin
4. ANALISIS ESPECIALES
Entre estas tcnicas se incluye algunos mtodos aplicables a la determinacin de la calidad de los ingredientes y los productos terminados, con base en su contenido de micronutrientes, tales como fibra digerible, minerales, vitaminas, actividad enzimtica, etc.; as mismo, se presenta el mtodo ms ampliamente utilizado para la cuantificacin de xido de cromo durante la evaluacin de la digestibilidad de las dietas.
Acetona grado reactivo. Sulfito de sodio anhdro. Se usa nicamente en anlisis de subproductos animales. Materiales y Equipo Equipo de reflujo. Cualquier equipo estndar adecuado para el anlisis de fibra. Crisoles de filtracin en vidrio. Use crisoles de tipo alto, con porosidad gruesa y placa de filtracin de 40mm de dimetro con capacidad para 40 50 ml de lquido. Cuando los crisoles se obstruyen despus de un uso continuo se prepara una solucin limpiadora de 20% KOH, 5% de Na3PO4 y 0.5% de EDTA de sodio que se hace pasar caliente en en sentidi opuesto a travs del crisol. Se debe de evitar el uso continuo de la solucin pues tiende a erosionar el vidrio. Procedimiento 1. Pese aproximadamente 1 g de muestra molida para pasar el tamiz de 1 mm y depostela en un matraz de fondo redondo para iniciar el reflujo. 2. Agregue en orden 100 ml de detergente neutro a temperatura ambiente y 2 ml de amilasa por muestra. 3. Caliente para que la solucin hierva en 5 a 10 minutos; en el momento de iniciar la ebullicin reduzca la temperatura para evitar la formacin de espuma. Ajuste la temperatura para que la solucin hierva suavemente y mantenga en reflujo por 60 minutos a partir del instante en que empieza a hervir. 4. Agite el matraz para suspender y decante la muestra en un crisol previamente pesado y preparado para succin al vaco. Use poco vaco al principio incrementndolo a medida que lo vaya requiriendo. Pase toda la muestra al crisol utilizando un mnimo de agua caliente (80 para el lavado del matraz. Elimine el va co, afloje con cuidado la capa de muestra en el fondo del crisol sin C) removerla y agregue agua caliente, repitiendo el lavado varias veces. Finalmente lave dos veces con acetona sin remover la muestra del filtro y seque con vaco. 5. Seque los crisoles a 105 durante 12 h y pselos en caliente ( esta operacin no debe durar ms de 30 seg). Si no se puede C pesar de inmediato, enfre los crisoles en un desecador que contenga como desecante pentxido de fsforo (P2O5). 6. El residuo de fibra recuperado se registra en trminos de paredes celulares. 7. Calcule el contenido celular (material soluble) substrayendo este valor de 100. NOTA: En el caso de granos y subproductos de molinos es posible que se forme un material gelatinoso derivado de los almidones y la protena, el cual obstruye el filtro e impide el lavado. Para mejorar la filtracin haga pasar aire en sentido inverso en el crisol. As mismo al evite que la muestra se adhiera al fondo del matraz durante el inicio del calentamiento hasta la ebullicin, calentando rpidamente con agitacin constante. Clculos a. Paredes celulares (%) en base seca o como se ofrece. 100(((peso del crisol + paredes celulares) - (peso del crisol))/peso de la muestra. b. El porciento del contenido celular se calcula substrayendo de 100 el % de paredes celulares. % contenido celular = 100 - % paredes celulares. Van Soest, P.J. and R.H. Wine, 1967, J. Assoc. Official Anal. Chem., 50:50.
75 mm de dimetro con 20 25 mm de alto). Mtodo A Calcine la muestra siguiendo el mtodo de determinacin de ceniza. Transfiera el residuo a un vaso de precipitado de 250 400 ml usando 75 ml de cido clorhdrico 3N y evapore a sequedad, contine calentando durante una hora ms para deshidratar cualquier slice presente. Enfre y agregue 75 ml de solucin de HCI 3N y caliente a ebullicin suavemente por 15 minutos. Filtre la solucin en caliente a travs de un papel filtro libre de ceniza y lave el residuo con agua caliente hasta que el filtrado deje de ser cido. Seque el papel filtro conteniendo el residuo y calcine a 550700 en un crisol de platino prepesado, enfre en un desecador y C posteriormente pese.
FIGURA 9 Determinacin de ceniza insoluble en cido clorhdrico. Mtodo A. Mtodo B Pese alrededor de 5 g de muestra con una aproximacin de 0.001 g y transfirala a un vaso de precipitado de 250 400 ml. Adicione 25 ml de agua destilada y 25 ml de solucin de cido clorhdrico 3N. Mezcle con cuidado y espere hasta que ya no se liberen gases. Agregue otros 50 ml de cido clorhdrico y espere hasta que cese la liberacin de gases y coloque el vaso en un bao mara a ebullicin durante 30 minutos, con el fin de hidrolizar los almidones presentes. Filtre la solucin cuando todava este caliente con papel filtro libre
de cenizas, posteriormente lave el filtro con 50 ml de agua tibia hasta que el filtrado deje de ser cido (ver nota). Coloque el papel filtro conteniendo el residuo en un crisol de platino previamente pesado, seque y calcine la muestra a 550 700 Transfiera las cen izas a C. un vaso de precipitado usando 75 ml de cido clorhdrico 3N y contine el anlisis como en el mtodo anterior a partir de la etapa en la que se calienta la muestra suavemente por 15 minutos. NOTA: Si se hace difcil filtrar, repita el anlisis reemplazando los 50 ml de cido clorhdrico 3N con 50 ml de la solucin A de cido tricloroactico y enjuague el filtro con una solucin tibia de la solucin B de cido tricloroactico. Clculos Calcule el peso de residuo y exprese el resultado como porciento (%) de la muestra.
Reactivos Solucin de cido perclrico al 52 %. 279ml de cido perclorico (grado especfico 1.70) en 100 ml de agua destilada; deje enfriar antes de usar. Solucin de cido sulfrico. 760ml de H2SO4 (grado especfico 1.84) en 330ml de agua destilada; deje enfriar antes de usar. Reactivo Anthrone. Prepare suficiente reactivo Anthrone preparando una solucin de cido sulfrico al 0.1 % con el fin de usarla el mismo da. Solucin estndar de glucosa. Disuelva 100mg de glucosa en 100ml de agua. Solucin estndar de glucosa diluida. Diluya 10ml del estndar de glucosa a 100 ml de agua destilada (1ml = 0.1mg de glucosa). Materiales y Equipo Espectrofotmetro. Papel filtro Wathman no. 542 o Schleicher y Schill no. 150. Procedimiento Extraccin: 1. Pese con aproximacin de 0.001g 1.0g de muestra seca 2.5g de muestra hmeda conteniendo aproximadamente de 60 a 300 mg de carbohidratos totales disponibles. 2. Transfiera cuantitativamente a una probeta graduada de 100 ml con tapn. 3. Adicione 10 ml de agua y agite con una varilla de vidrio para dispersar la muestra. 4. Adicione 13 ml de la solucin de cido perclrico. Agite constantemente con la varilla de vidrio durante 20 minutos. 5. Enjuague la varilla con agua destilada y lleve el volumen a 100 ml. Mezcle y filtre a un matraz volumtrico de 250 ml. 6. Enjuague la probeta graduada con agua destilada y adicione al matraz volumtrico. Afore el matraz con agua destilada y agite. Determinacin: 1. Diluya 10 ml del extracto a 100 ml con agua destilada. Con una pipeta pase a un tubo de ensaye 1 ml del filtrado diluido. 2. Tome con la pipeta dos muestras de 1 ml de agua destilada que servirn como blancos por duplicado y coloque cada uno de ellos en un tubo de ensaye. 3. Tome dos blancos duplicados de 1 ml usando la solucin de glucosa diluida. 4. Agregue rpidamente a todos los tubos 5ml de reactivo de anthrone recin preparado. Tape los tubos y mezcle vigorosamente. Colquelos en un bao mara y caliente durante 12 minutos. 5. Enfre rpidamente a temperatura ambiente. Transfiera la solucin a celdas para espectrofotmetro de 1 cm. El color verde es estable slo por 2 horas. 8. Lea la absorvancia a 630 nm contra el blanco. Clculos Carbohidratos totales disponibles (% de glucosa) = (25 b)/(a W) Donde W = Peso en g de la muestra. a = Absorvancia del estndar diluido1. b = Absorvancia de la muestra diluida.
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El grfico es una lnea recta n el rango de 0 0.15 mg de glucosa (manual) 0.0 1.5 mg de glucosa (automtico).
cobre mezclando perfectamente bien y deje enfriar. Filtre usando vaco. Lave el matraz y el precipitado con 50 ml de agua destilada fra. Para evaluar el nitrgeno proteico analice el residuo por medio de la marcha de nitrgeno total de kjeldahl. El nitrgeno no proteico se analiza por medio de la misma tcnica a partir del lquido filtrado. Los resultados respectivos de los slidos y lquidos por medio de kjeldahl ofrecern directamente los datos de nitrgeno proteico (NP) y no proteico (NNP) respectivamente.
Procedimiento 1. A 0.1 ml de muestra o sol. estndar, adicinele 0.1 ml de sol. NaOH 2N. Caliente a 100 durante 10 min a bao mara hirviendo C para hidrolizar la muestra. 2. Deje enfriar a temperatura ambiente y agrguele 1 ml del reactivo de formacin de complejo recin preparado y deje reposar a temperatura ambiente por 10 min. 3. Adicione 0.1 ml de reactivo de Foln, agite con un mezclador de vrtice y deje reposar a temperatura ambiente durante 3060 min (no exceda este tiempo). 4. Lea la absorvancia a 750 nm si la concentracin de la protena fuera menor a 500 g/ml, 550 nm si fuese entre 100 y 2000 g/ml. 5. Trace una curva estndar de absorvancia como funcin de concentracin inicial de protena y sela para determinar el contenido de protena en la muestra. NOTA a. Si la muestra se encuentra como precipitado, disulvalo en NaOH 2N e hidrolice como en el paso 1. Use alcuotas de 0.2 ml del hidrolizado para el paso 2. b. Todas las clulas u otras muestras complejas pueden requerir un pretratamiento como el descrito por Burton (1984) para DNA. c. Mezcle rpidamente en cuanto el reactivo de Foln sea adicionado; esto es importante para obtener una adecuada reproductibilidad. d. Se requiere un grupo de estndares para cada ensayo, preferentemente por triplicado o duplicado.
Adicione 5 ml de la solucin Carrez I, seguido por 5 ml de la solucin Carrez II, mezclando perfectamente bien entre las adiciones. Afore con agua destilada y mezcle bien. Filtre una parte con un papel filtro seco en un vaso de precipitado de 250 ml limpio y seco. Determinacin Transfiera 10 ml del filtrado a un tubo de ensaye con tapn esmerilado, adicione 10 ml de la solucin 4-DMAB, mezcle y deje reposar por 15 min. Mida la absorvancia de la solucin a 435 nm en una celda de 10 mm, contra una solucin de referencia preparada con los reactivos. Curva de Calibracin Diluya 5, 10, 20, 30 y 40 ml de solucin de urea a 100 ml de agua. Transfiera 10 ml de cada solucin a tubos de ensaye con tapn esmerilado y adicione 10 ml de la solucin 4-DMAB a cada uno. Mezcle y deje reposar por 15 minutos, mida la absorvancia como se seal anteriormente contra una solucin de referencia preparada con 10 ml de solucin 4-DMAB y 10 ml de agua, haga una grfica relacionando las absorvancias con la cantidad de urea presente. Expresin de Resultados Determine la cantidad de urea en la muestra por referencia con la curva de calibracin elaborada. Exprese los resultados como por ciento de la muestra. % Urea 0.4665 = % N urea. NOTA: Si la muestra est muy coloreada, la cantidad de carbn activado deber ser incrementada arriba de 5 g. La solucin final despus del filtrado deber ser incolora.
FIGURA 14
con agua destilada y mezcle bien. Mida la absorvancia de la solucin a 294 nm en celdas de slice de 10 mm comparada contra una solucin preparada mezclando 5 ml de solucin de tiosulfato de sodio con 40 ml de solucin buffer de succinato aforada a 200 ml con agua destilada. Determine la cantidad de cido rico mediante una curva de calibracin. Curva de Calibracin: En una serie de tubos de centrfuga de 50 ml de capacidad transfiera con una pipeta 2, 4, 6, 8, 10 y 12 ml de solucin estndar de cido rico (equivalentes a una cantidad similar de cido rico en mg) y llvelos a 20 ml con la solucin de formaldehdo etlico. Adicione a cada tubo 10 ml de reactivo de Benedict y Hitchcock, mezcle bien y djelo reposar en la oscuridad por una hora. Contine el mtodo como en la determinacin a partir del centrifugado. Mida la absorvancia de la solucin y trace la curva de calibracin graficando absorvancia (y) contra la cantidad correspondiente de cido rico en mg (x). Expresin de Resultados El contenido de N del cido rico como % de la muestra est dado por la frmula: % N = A/(6 W) Donde A = mg de cido rico (en la alicuota del extracto de la muestra) determinado por la medicin fotomtrica. W = peso de la muestra en g.
Este mtodo proporciona una estimacin de la disponibilidad de minerales en base a su digestibilidad en cido. Reactivos, Materiales y Equipo Acido clorhdrico (12.5 % v/v) Papel filtro libre de ceniza Crisoles de porcelana Procedimiento Use el residuo obtenido de la determinacin de ceniza. Caliente 25 ml de cido clorhdrico con cuidado para evitar salpicar y filtre en el papel y enjuague con agua caliente hasta que quede libre del cido. Coloque el papel filtro y el residuo en un crisol de porcelana prepesado seco y colquelo en la mufla a 600 durante 2 horas o hasta que quede libre de carbn. C Clculos Ceniza insoluble (%) = 100(Peso de la ceniza tratada con cido/Peso de la muestra)
La evaluacin de calcio en la dieta reviste una gran importancia ya que un desbalance con el fsforo u otros minerales generar un bajo crecimiento. Reactivos Acido clorhdrico (1 3 %) Acido ntrico 70% Hidrxido de amonio (1:1 v/v) Indicador de rojo de metilo (1 g en 200 ml de etanol) Solucin de oxalato de amonio 4.2 % Acido sulfrico 98 % Solucin estndar de permanganato de potasio 0.05N Materiales y Equipo crisoles de porcelana matraces volumtricos de 250 ml vasos de precipitado de 250 ml Papel filtro para anlisis cuantitativos libre de cenizas Procedimiento Calcine en crisol de porcelana 2.5g de muestra finamente molida. Adicione 40ml de HCI y unas gotas de HNO3 al residuo, caliente el crisol hasta ebullicin, enfre y transfiera a un matraz volumtrico de 250ml, afore y mezcle. Pase a un vaso de precipitado 100ml de sol. para cereales o alimentos con cereales 25ml para alimentos con minerales. Diluya a 100ml y adicione 2 gotas de rojo de metilo. Adicione NH4OH gota a gota hasta que vire a pardo anaranjado, luego adicione 2 gotas de HCl para dar un color rosa. Diluya con 50ml de agua, hierva y adicione con agitacin 10ml de sol 4.2% de oxalato de amonio. Ajuste el pH con cido para regresar al color rosa si es necesario. Dje reposar, filtre y lave el precipitado con la solucin de NH4OH (1.5%). Coloque el papel filtro con el precipitado en un vaso, adicione una mezcla de 125ml de agua y 5ml de H2SO4, caliente a 70 y titule con la solucin de permanganato y calcu le: C Ca (%)= 0.1((ml Sol. Permanganato/Peso de la Muestra) (Alicuota usada en ml/250)
origen vegetal puede estar formando parte de fitatos, por lo cual su disponibilidad puede estar limitada, por lo que se recomienda una determinacin de cido ftico previa al uso de tales materiales. Reactivos Reactivo de Molibdato. Disuelva 40 g de molibdato de amonio 4.H2O en 400 ml de agua caliente y enfre. Disuelva 2 g de metavanadato de amonio en 250 ml de agua caliente, enfre y adicione 450 ml de cido perclrico al 70%. Gradualmente adicione la sol. de molibdato a la sol. de vanadato con agitacin y diluya a 2 1. Estndar de Fsforo. Prepare una solucin stock disolviendo 8.788 g de Ortofosfato dihidrgeno potasio en agua y llvelo a 1 1. Prepare la solucin de trabajo diluyendo la sol. stock 1 en 20 (Conc. de trabajo 0.1 mg P//ml). Materiales y Equipo Espectrofotmetro para leer a 400 nm Matraces graduados de 100 ml Procedimiento 1. Pase una alicuota como en la determinacin de Ca a un matraz de 100 ml y adicione 20 ml del reactivo de molibdovanato. Aforelo, mezcle y deje reposar por 10 min. 2. Transfiera alicuotas del estndar de trabajo conteniendo 0.5, 0.8, 1.0 y 1.5 mg de P en matraces de 100 ml y trtelos como al anterior. 3. Lea la muestra a 400 nm ajustando el estndar de 0.5 mg a 100% de transmisin. 4. Determine mg de fsforo en la muestra usando una curva estndar.
2. Adicione 20 ml de Acido Ntrico concentrado y 10 ml de la solucin de Permanganato de Potasio y mezcle. Caliente continuamente la mezcla hasta que el lquido se aclare y desaparezca los vapores nitrosos, enfre. 3. Adicione 10 ml de Solucin de Urea y deje reposar por 10 min. 4. Adicione 10 ml de acetona y 5 ml de indicador frrico y titule el exceso de nitrato de plata con la solucin de Tiocianato hasta el punto final rojo-caf. Clculos Calcule resultados como NaCl %NaCI= (15.00 - ml 0.1N NH4CNS 0.585)/g de muestra
Crisoles de Slice. Fotmetro de flama Mufla Procedimiento 1. Seque 2 g de muestra en un crisol de slice a 100 para elimin ar la humedad. Adicione unas cuantas gotas de aceite de oliva y C caliente sobre la flama hasta que deje de producir flama. 2. Calcine a 500 en la mufla por 24 h, enfre y adicione 2 ml de HCI co ncentrado para disolver el residuo. C 3. Llvelo a 100 ml con agua destilada, tome 1 ml de la solucin y haga una nueva dilucin a 100 ml con agua destilada. 4. Ajuste el fotmetro de flama para que de una lectura de 100 con el estndar de 10 ppm y lea la solucin muestra. 5. Si la lectura no se encuentra entre 50 y 100 haga una dilucin al momento para dar una lectura apropiada.
El xido de cromo es el marcador ms ampliamente utilizado durante la evaluacin de la digestibilidad en dietas experimentales para peces. El mtodo aqu presentado es una modificacin del propuesto por Furukawa y Tsukahara, a fin de manejar micromuestras durante la determinacin del contenido de xido de cromo en dietas y heces. Reactivos Acido ntrico concentrado, gr. Acido perclrico, g.r. Materiales y equipo Espectrofotmetro Digestor kjeldahl para tubos de 100 ml Matraces kjeldahl de 100 ml Matraces volumtricos de 25 ml Procedimiento Muela finamente el alimento y las heces, a las cuales se les habr eliminado previamente escamas y cualquier otra materia extraa; mantngalos a sequedad. Pese con precisin de 0.0001g de 50 a 100mg de muestra, colquela en un matraz kjeldahl de 100 ml y pese nuevamente la charolilla para ajustar peso de la muestra. Adicione 5ml de HNO3 y ponga a digerir en ebullicin suave por un mnimo de 30 min hasta que desaparezcan los vapores amarillentos. En caso de que disminuya notablemente la cantidad de lquido y contine habiendo vapores nitrosos, adicione otros 5ml de cido ntrico y siga digiriendo. Al trmino la solucin debe ser clara, de color verdoso y no debe desprender vapores ocres. Deje enfriar. Ya fra la solucin, agregar cuidadosamente resbalando por las paredes del matraz 3ml de cido perclrico. Realizar la adicin dentro de una campana de extraccin y con mucho cuidado, ya que en caso de una digestin incompleta se puede presentar una reaccin explosiva. Coloque nuevamente el matraz en el digestor y contine la ebullicin hasta que la solucin vire de verde a amarillo limn; apague el digestor y deje enfriar. Ya fro se debe formar un anillo rojizo en el borde del lquido; en caso de no formarse o si el lquido se torna verde nuevamente, volver a digerir hasta que el cambio sea permanente. Pase el lquido fro a un matraz volumtrico de 25 ml, enjuagando el matraz kjeldahl varias veces con agua destilada y afore. Ajuste a O el espectrofotmetro con un blanco de reactivos y leer a 350 mm. El blanco se prepara simultneo a la muestras usando solamente los cidos y agua destilada. Clculos a) Calcule la cantidad de xido de cromo (mg) presente en la muestra: X = ((Y - 0.0032)/0.2089)/4 Donde Y = absorvancia 0.0032 y 0.2089 son constantes b) Calcule el % de xido de cromo en la muestra: O.C.% = 100(X/A) Donde X = peso del xido de cromo A = peso de la muestra
Solucin de fenoftalena, 500 mg/l de alcohol etlico al 60%. Solucin de hidrxido de sodio al 12%. Se usa para incrementar el pH a 8.5 durante la reaccin del MCC. Debe almacenarse en frasco de plstico. Tener a la mano un gotero con HCI 1M para corregir cualquier exceso. Buffer de bicarbonato de sodio - carbonato, pH 8.5. Disuelva 19.5g de NaHCO3 y 1g de Na2CO3 en 250 ml de agua destilada; ajuste el pH si es necesario. Almacenar en un frasco bien lleno y bien cerrado para evitar prdida de CO2 Acido clorhdrico concentrado Materiales y Equipo Tamiz de 0.5 mm Matraces de fondo redondo Matraz volumtrico de 250 ml Bao mara Rotoevaporador Aparato de reflujo Papel filtro Whatman 541 Tubos de ensaye con tapn Perlas de vidrio Espectrofotmetro Procedimiento Muela la muestra para que pase el tamiz de 0.5 mm. La cantidad de muestra a utilizar deber contener alrededor de 12mg de lisina disponible, lo que equivale a 0.3 2g de la muestra. Pasela a un matraz de fondo redondo. Agregue 23 perlas de vidrio y 10ml de NaHCO3, agitar suavemente para que la muestra no se adhiera a las paredes. Adicione 15 ml de FDNB y agite suavemente durante 2 horas. No permita que la muestra se quede en las paredes. Evapore el etanol pero no el agua; en un bao de agua hirviendo el matraz debe perder aproximadamente 12.5g. Enfre y adicione 30ml de HCI 8.1M para neutralizar al NaHCO3. Sumando el agua presente, se tendr un volumen de 40ml y una concentracin de cido de 6M. Reflujar suavemente durante 16 horas. Desconecte el matraz y lave el refrigerante con un poco de agua. Filtre en caliente a un matraz volumtrico de 250 ml. Enjuague el matraz y el filtro varias veces con agua destilada y colecte en el matraz volumtrico; afore en fro con agua destilada. En ocasiones se forma un precipitado de dinitrofenol que se puede extraer con pipeta una vez precipitado, o se elimina con el ter. Colocar 2 ml del filtrado en dos tubos con tapn, etiquetndolos A y B. Agregar al tubo B 5 ml de ter y agita. Extraiga el ter (capa superior) con una pipeta automtica. Coloque el tubo en un bao a 90 hasta que se elimine todo el ter y enfre. C Agregue una gota de fenoftalena al tubo, adicione gota a gota la solucin de NaOH hasta que aparezca un ligero color rosado; aada 2ml de buffer de carbonato y agregue dentro de una campana 0.5 ml de metilcloroformato. Tapar el tubo y agitar vigorosamente, liberando la presin con cuidado. Despus de 5 10 min, adicione gota a gota 0.75 ml de HCI concentrado agitando para evitar la formacin de espuma. Se extrae cuatro veces la solucin con ter como se describi anteriormente. Elimine el ter residual en bao mara, enfre y lleve el volumen 10 ml con agua destilada. Durante las pausas de las manipulaciones del tubo B, extraiga tres veces con ter el tubo A; elimine el ter residual y lleve a 10 ml con HCl. Lea la absorvancia de ambos tubos a 435 nm en el espectrofotmetro contra agua destilada. La lectura del tubo menos la del tubo B (blanco) es la absorvancia atribuible al DNP - lisina. Absorvancia del estndar DPN - Lisina Coloque 2 ml de DNP-L diluido en dos tubos A y B siguiendo el procedimiento ya indicado-Practicar hasta que se tenga confianza en las manipulaciones. La absorvancia neta se usar para calcular las muestras problema. El blanco B tiene generalmente una absorvancia de 0.01; si el valor es mucho mayor revisar el procedimiento, especialmente el frasco de servicio, el pH del buffer de carbonato, la longitud de onda a que se est leyendo y el ter libre de perxidos. Precauciones con alimentos de origen vegetal. En alimentos de origen vegetal en ocasiones no se logra una hidrlisis total a las 16 horas y como un tiempo ms largo se descompone el DNP-L, debe hacerse una segunda digestin con materiales desconocidos. Para lograr esto, despus de la digestin se filtra, se lava y se procesa el filtrado como se seal. El residuo se coloca en un matraz de fondo redondo con HCI 6 M y algunas perlas de vidrio (se pueden juntar los residuos de las rplicas); el volumen del cido clorhdrico debe ser menor a 30 ml. Se deja en reflujo por 16 horas, se filtra en caliente y se lleva a 100 ml segn el procedimiento ya descrito. Si el resultado es muy pequeo se elimina, o de lo contrario, se hacen las correcciones necesarias para el material. Para determinar la prdida de DNP-L se debe calcular un factor de correccin, el cual vara con el material. Para su clculo, consultar a: Makade, M.L. y Liener, I.E., 1969. Anal. Biochem., 27:271. Clculos C = (Ws Au V 100 100)/Wu As a (cp)
Donde C= g de lisina/16g de N Ws= Peso del estndar expresado como mg de Lis en 2 ml; 0.1 s se prepara como se indica. Wu= Peso de la muestra en mg As= Absorcin neta del estndar Au= Absorcin neta del desconocido V= Volumen del hidrolizado filtrado. Se recomienda 250 ml (menos por la segunda digestin). a= Alcuota del filtrado. Se recomiendan 2 ml. CP= Protena cruda, 6.25 g N/100g material. Para expresar el resultado como g lisina/Kg de PC, cambiar un 100 por 10 en la frmula. NOTA: El material de vidrio puede tomar un tinte amarillento debido al dinitrofenol. Los hidrolizados y soluciones de DNP-Lisina deben protegerse de la luz especialmente a pH alcalino.
ml de la solucin stock. Vace a un matraz volumtrico de 200 ml y neutralice con una solucin de NaOH al 20%, usando fenoftalena como indicador, lleve a volumen y mezcle. Acido Clorhdrico concentrado (Sp.g 1.18). Acido Clorhdrico (0.5N). Hidrxido de Sodio, Solucin 20%. Indicador de Fenoftalena (1% en etanol). Indicador de azul de metileno (1% en agua). Materiales y Equipo Calentador elctrico Matraces erlenmayer de 500 ml Procedimiento Disuelva 8g de melaza y llvela a 500ml con agua destilada (filtre). Hidrolice 100 ml del filtrado con 5ml de HCI (Sp. g 1.18) y deje reposar por 24 h. Neutralice con NaOH al 20% usando fenoftalena como indicador y diluya a 200 ml. Estandarizacin de la Solucin Soxhlet: Mida 10ml de la solucin Soxhlet (a) y (b) con una pipeta volumtrica y vace a un matraz erlenmayer, mezcle y agregue 30ml de agua. Adicione con una bureta un volumen de estndar de trabajo casi suficiente para reducir el Cobre en la solucin Soxhlet. Llvelo a ebullicin y djelo hervir por 2 min., adicione 4 gotas de azul de metileno y rpidamente complete la titulacin mientras est hirviendo, hasta que se obtenga un color naranja brillante. Repita varias veces y determine el volumen de solucin requerido para reducir completamente 20 ml de solucin Soxhlet. Titulacin de Muestra: Primero realice una titulacin aproximada; pase a un matraz 10ml de las soluciones (a) y (b), adicione alcuotas de 10ml de la solucin muestra. Aada 40 ml de agua y llvelo a ebullicin. Si persiste el color azul, titule con una solucin estndar de trabajo y calcule el contenido aproximado de azcar en la muestra. Para determinar con precisin el contenido de azcar, pase a un matraz 10 ml de las soluciones Soxhlet (a) y (b); adicione una alcuota de la solucin muestra. El volumen de muestra usado depender del contenido de azcar en la muestra. Adicione agua como se indica en la tabla, mezcle y hierva. Durante la ebullicin, agregue estndar de trabajo con una bureta hasta que la titulacin sea casi completa. Aada azul de metileno y complete la titulacin.
Calcule el % de azcar (como invertida) = (F - M) I 100/w Donde: F= Volumen de estndar necesario para reducir 20 ml de Solucin Soxhlet. M= Volumen de solucin estndar de azcar requerido para completar la titulacin I= Peso de la azcar invertida en 1 ml de Standard de trabajo. W= Peso de la muestra en la alcuota usada.
Producido por: Departamento de Pesca Ttulo: Manual de tecnicas para laboratorio de nutricion de peces y crustaceos... Ms informacin
5.1. Mtodo Rpido Potenciomtrico para Medir Actividad Uresica en Harina de Soya
Este mtodo determina la ureasa residual en harina de soya y sus derivados de acuerdo al mtodo Caskey-Knapp (1944) modificado por AACC (1969) y Qum. Leticia Comar (Nutrimentos del Sureste, Mrida, Yucatn, Mxico). El resultado esta dado en unidades de pH proporcionales a la actividad uresica. Los valores aceptables oscilan entre 0.05 y 0.5; valores menores indican sobrecocimiento y mayores falta de cocimiento. Reactivos Solucin bufer de fosfatos 0.05M. Disuelva 3.403g de fosfato de potasio monobsico g.r. (KH2PO4) en 100ml de agua destilada recin hervida. Disuelva 4.355g de fosfato de potasio dibsico g.r. (K2HPO4) en 100ml de agua destilada. Combine ambas soluciones, adicione 10ml de indicador rojo de fenol al 0.1% y afore a 1000ml con agua destilada. Ajuste el pH a 7.0 con un cido o base fuerte antes de usarse. En refrigeracin tiene una vida til de 90 das. Solucin bufer de urea. Disuelva 15g de urea g.r. en 500ml de sol. bufer de fosfatos. Ajuste el pH a 7.0 como en el caso anterior. Indicador rojo de fenol al 0.1%. Disuelva 0.1g de rojo fenol en 15ml de sol. de hidrxido de sodio 0.02N y afore a 100ml. Materiales y Equipo Bao mara con agitacin, precisin 0.5 C. Medidor de pH con electrodo de vidrio y calomel adecuado para medir muestras de 5ml, precisin de 0.02 unidades de pH y compensacin de temperatura. Tubos de ensaye, 20 150mm con tapn de hule Vasos de precipitado de 10ml Procedimiento 1. Pese 0.2g de harina de soya finamente molida (sin sobrecalentar) por duplicado y colocar en tubos de ensaye (A y B); adicione al tubo A 10ml de la solucin bufer de urea. Tape, agite e incube en bao mara por 30 min a 30 0.5 C. 2. Despus de 5 min, adicione al tubo B 10ml de sol. bufer de fosfatos, tape, agite y coloque en el bao mara. 3. Agitar cada uno de los tubos cada 5 minutos (seis agitaciones en 30 min). 4. Retire el tubo A del bao mara, decante el sobrenadante en un vaso de pp de 10ml y mida el pH dentro de un perodo menor a 3 min. Repita el procedimiento con el tubo B 5 minutos despus del A. 5. Calcule el ndice de actividad uresica como unidades de pH resultantes de la diferencia de las lecturas del tubo A menos el tubo B y determine la calidad de la muestra segn la tabla de ejemplo incluida: IAU= pH tubo A (muestra + bufer urea) - pH tubo B (muestra + bufer fosfatos)
Grado de cocimiento Cruda Subcocida Cocido adecuado Cocido adecuado Unidades de pH 1.9 0.80 0.30 0.08 pH tubo A 8.80 7.60 7.10 6.98 pH tubo B 6.90 6.80 6.80 6.90 Color Rojo Rosa Rosa Rosa tenue
Sobrecocida
0.03
6.93
6.90
Ambar
Matraces erlenmayer de 250 ml Matraces Volumtricos de 25 y 250 ml Bao mara Procedimiento Muela la muestra para que pase la malla de 1 mm, cuidando de no sobrecalentarla. Tome aproximadamente 1 g de la muestra y agrguele 25 ml de acetona pura. Agite por unos minutos, filtre y divida el filtrado en dos. A una porcin, adicinele una lenteja de Hidrxido de Sodio y caliente en bao mara por unos minutos. Un extracto ligeramente amarillo que no cambia de color con el Hidrxido indica que la harina no ha sido tratada, proceda con el mtodo 1. Si se obtiene un color rojo-anaranjado profundo, indica la presencia de dianilinogosispol y requiere del mtodo 2. Mtodo 1 Pese 0.51 g de muestra, dependiendo de la cantidad de gosipol esperada, en un matraz erlenmayer y adicione 2 3 perlas de vidrio. Agregue 50 ml de solucin de acetona acuosa, tape el matraz y agite por una hora. Filtre, deseche los primeros mililitros de filtrado y luego tome dos alcuotas iguales (210 ml, dependiendo del contenido de gosipol esperado) y pselas a matraces volumtricos de 25 ml. Diluya una de las alcuotas, afore a volumen con alcohol isoproplico acuoso (solucin a), mientras la otra alcuota (solucin b). Adicinele 2 ml de anilina purificada, caliente en bao mara (90100 por 30 min. junto con un blanco conteniendo 2 ml de anilin a y C) un volumen de solucin acuosa de acetona igual a la alcuota. Retire la solucin b y el blanco, adicione suficiente alcohol isoproplico acuoso para efectuar solucin homognea, y enfra a temperatura ambiente en un bao con agua. Afore con alcohol isoproplico acuoso. Lea las muestras a una absorvancia de 400 nm en el espectrofotmetro. Ajuste el instrumento a 0 absorvancia con alcohol isoproplico acuoso y determine la absorvancia de la solucin (a) y el blanco de reactivo. Si el blanco est abajo de 0.022 de absorvancia contine con el anlisis, de lo contrario repita el anlisis usando anilina recin destilada. Determine la absorvancia de la solucin (b) con el blanco de reactivo ajuste a 0 absorvancia. Calcule la absorvancia corregida de la alcuota: absorvancia de la solucin (b) menos absorvancia de la solucin (a). Determine los mg de gosipol libre presentes en la solucin de la muestra usando la curva de calibracin. Mtodo 2. Pese 1 g de muestra en un matraz erlenmayer, agregue 50 ml de acetona acuosa, agite y filtre como el anterior. Agregue alcuotas duplicadas del filtrado (de 2 a 5 ml, dependiendo de la cantidad esperada de gosipol libre) a matraces volumtricos de 25 ml. Afore una de las alcuotas (solucin a) con el alcohol isoproplico acuoso y djelo reposar 30 minutos antes de leerlo en el espectrofotmetro. Afore la otra alcuota (solucin b) como en el procedimiento (1), determine las absorvancias de las soluciones a y b como el procedimiento anterior y calcule el contenido aparente de gosipol de ambas soluciones usando la curva de calibracin. Preparacin de la Curva de Calibracin. Tome alcuotas duplicadas de 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 y 10 ml de estndar de gosipol 0.02 mg/ml y colquelas en matraces volumtricos de 25 ml. Diluya una serie (solucin A) aforando con alcohol isoproplico acuoso y determine la absorvancia como en el anterior. A la otra serie (solucin b) adicinele 2 ml de anilina purificada y proceda como anteriormente. Prepare un blanco de reactivos usando 2 ml de anilina y 10 ml de acetona acuosa, calentada junto con el estndar. Determine absorvancias como en el procedimiento (1) y calcule la densidad ptica corregida para cada solucin estndar: Absorvancia Corregida = (Abs. solucin b - Abs. solucin a) Trace la curva estndar, graficando absorvancia corregida contra concentracin de gosipol en 25 ml. Calule % de gosipol libre en harinas normales. Gosipol libre % = 5G/WV Donde: G= Lectura en la Grfica W= Peso de la muestra V= Volumen de la alcuota usada. Para harinas qumicamente tratadas. Gosipol libre % = 5(B - A)/WV Donde: A = mg Gosipol libre aparente en alcuota (a) B= mg Gosipol libre aparente en alcuota (b)
Gel de slica G (Merck) Estndares Cualitativos. Permiten distinguir marcas de aflatoxina de otras manchas fluorescentes que puedan estar presentes. Se puede usar con este propsito harina de cacahuate conteniendo aflatoxina B obtenible en el Inst. de Productos Tropicales de Londres. Materiales y Equipo Placas para cromatografa de capa fina 20 20 cm. Lmparas UV pico de emisin a 365 Botellas de boca ancha de 250 ml Micropipetas Agitador Rotoevaporador Procedimiento 1. Pese 10 mg del material en un frasco de boca ancha y mzclelo con 10 ml de agua (si se usa material con alto nivel de grasa, ser necesaria una extraccin previa con soxhlet). Adicione 100 ml de cloroformo y agite por 30 min. 2. Filtre el extracto a travs de la celita, tome 20 ml del filtrado y llvelo a 25 ml (solucin a). Tome otros 20 ml del filtrado y concntrelos a 5 ml (solucin b). 3. Prepare placas de cromatografa agitando 100 g de gel de slica G con 220 ml de agua por 20 min y aplicando la mezcla a las placas con el aparato apropiado, con un grosor de 509. Djela reposar por 1 hora y seque a 100 C. 4. Coloque gotas de 10 y 20 l de solucin b y 15 y 10l de solucin a en la placa, junto con una gota de estndar cualitativo, en una lnea a 2 cm del fondo de la placa y al menos a 2 cm de cada lado. Realice la aplicacin bajo luz tenue. 5. Revele la placa en ter etlico a una altura de 12 cm, djela secar en luz tenue y luego vulvala a revelar en mezcla de cloroformo/metanol hasta una altura de 10 cm desde la lnea basal. 6. Examine la placa en un cuarto obscuro a 30 cm de la fuente de UV. La presencia de una mancha azul fluorescente a Rf 0.50.55 indica aflatoxina B (asegrese de que la mancha del estndar se encuentre tambin en ese rango). la presencia de una segunda mancha a Rf 0.45 0.5 indica aflatoxina G. La toxicidad de una muestra puede ser clasificada en trminos de aflatoxinas B y G de acuerdo con la tabla siguiente:
afore con agua. El pH deber ser entre 1.5 y 2.5. Lea en el Colormetro y calcule la cantidad de mimosina en una curva de calibracin. Curva de Calibracin: Disuelva 0.1046 g de mimosina pura en HCl 0.1N y afore a 100 ml con el cido. La solucin contiene 0.1% de mimosina. Coloque 1 ml de solucin de mimosina en un matraz volumtrico de 100 ml y adicione 10 ml de HCl 0.1N y 4 ml de la solucin de cloruro frrico al 0.5% y afore con agua. Lea la intensidad del color en el Colormetro (espectro 535 nm). Use agua destilada como referencia y repita el procedimiento usando 2,3,4 y 5 ml de solucin de mimosina. Se obtiene una lnea al graficar la lectura del Colormetro contra la concentracin.
1. Ponga en un tubo de ensaye una muestra de 1 ml de extracto de la muestra, conteniendo 00.25 mg de canavanina, se le adicionan 0.5 ml de buffer fosfato y 0.5 ml de reactivo de acuoprusiato. Maneje de la misma manera blancos conteniendo 0.2, 0.5, 0.8, y 1 ml de solucin madre diluida y llevados a 1 ml con agua, as como tambin un blanco de reactivos con 1 ml de agua, tratados con el fosfato y acuoprusiato. 2. Mezcle vigorosamente y guarde los tubos en un gabinete obscuro; se desarrollar una coloracin rojiza en presencia de canavanina. 3. Despus de 2 horas lea en un colormetro o espectrofotmetro. En este ltimo, ajuste a una longitud de onda de 520 nm y el blanco a una densidad ptica de cero. Puede usar cubetas del espectrofotmetro para desarrollar el color; si usa cubetas de ms de 2 ml, puede adicionarles hasta 10 ml de agua despus de las 2 horas de incubacin para desarrollo del color. Clculos Se grafica la densidad ptica de cada estndar contra su cantidad correspondiente de canavanina y el contenido de canavanina de las muestras se calcula a partir de la curva.
El cido cianhdrico se encuentra de manera natural en diferentes materiales como son la semilla de lino, harina de yuca y algunas semillas de leguminosas. Este mtodo permite determinar el cido libre o en forma de glucsido, para lo cual, la muestra se suspende en agua, se libera el cido mediante enzimas y se separa por destilacin para colectarse en una solucin de nitrato de plata acidificada. Reactivos Antiespumante (Silicona) Acido ntrico (d= 1.42g/ml) Solucin de amonio: Prepare diluyendo un volumen de hidrxido de amonio (d=0.88 g/ml) en dos volmenes de agua. Sulfato frrico amoniacal, solucin saturada Suspensin de almendras dulces. Triture 20 almendras dulces blanqueadas en 100 ml de agua a 3740 Asegrese de que no C. existe cido cianhdrico en 10 ml de la suspensin usando papel de picrato de sodio o corriendo un blanco testigo como se describe ms adelante Solucin de acetato de sodio, neutral a la fenoftalena: 10g de acetato de sodio anhidro en 100 ml de agua destilada. Solucin 0.02N de tiocianato de amonio Solucin 0.02N de nitrato de plata. Materiales y Equipo Estufa regulada a 3738 C Aparato para destilacin de vapor Matraz de fondo plano de 1000 ml con tapn esmerilado Bao de aceite Bureta graduada a 0.05 ml Procedimiento Pese con exactitud de 0.005g aproximadamente 20g de la muestra preparada, colquela en un matraz de fondo plano de 1000 ml, adicione 50 ml de agua y 10 ml de suspensin de almendras dulces. Tape el matraz y pngalo en la estufa durante 16 horas a 3738C. Enfre a temperatura ambiente, adicione 80 ml de agua, 10 ml de solucin de acetato de sodio y una gota de antiespumante. Conecte el matraz al aparato de destilacin y colquelo en el bao de aceite previamente ajustado a una temperatura ligeramente superior a 100 destile 200300 ml de lquido pasando una cor riente de vapor a travs del matraz y calentando suavemente el bao C; de vapor. Colecte el destilado en un matraz erlenmayer protegido de la luz conteniendo exactamente 50ml de solucin de nitrato de plata 0.02N y 1ml de cido ntrico. Asegrese de que la extensin del condensador est sumergida en la solucin de nitrato de plata. Transfiera el contenido del matraz erlenmayer a un matraz aforado de 500 ml y llvelo al volumen con agua, mezcle y filtre. Remueva 250 ml del filtrado, adicione aproximadamente 1 ml de sulfato frrico amoniacal y titule el exceso de nitrato de plata con la solucin de tiocianato de amonio. Si se desea, se puede correr un blanco siguiendo el mismo procedimiento con 10ml de suspensin de almendras dulces omitiendo la muestra. Expresin de resultados Si el blanco indica que la solucin de nitrato de plata ha sido consumida, reste su valor del volumen consumido por la destilacin de la muestra. 1 ml de 0.02N AgNO3 0.54mg de HCN. Exprese el resultado como porcentaje de la muestra. NOTA: Si la muestra (ej. frijoles) contiene una elevada cantidad de azufre, se formar un precipitado negro de sulfato de plata, el cual se filtra junto con el depsito de cianuro de plata. La formacin de este precipitado consume solucin de nitrato de plata y su efecto debe ser eliminado para el clculo de contenido de HCN, para lo cual, trate el depsito sobre el papel filtro con 50ml de amonaco a fin de disolver el cianuro de plata. Lave el residuo en amonaco diluido y determine su contenido de plata. Convierta el valor a ml de solucin 0.02N de solucin de nitrato de plata y rsteselo al volumen de solucin de nitrato de plata consumida por el destilado de la muestra.
5.9. Mtodo Simple para la Determinacin de Acido Ftico (Wheeler y Ferrel, 1971).
El cido ftico se puede encontrar en algunas semillas como ajonjol, trigo, arroz, avena, sorgo, cebada, etc. Su presencia puede provocar deficiencias de fsforo en monogstricos por ligar y formar fitatos indigeribles que hacen indisponible ese elemento; afecta tambin la disponibilidad de calcio, magnesio o el fierro con los que forma el complejo fitina. Reactivos Solucin de cido tricloroactico (ATA) al 3% Solucin concentrada de FeCl3 Solucin de sulfato de sodio al 3% en ATA Solucin 1.5N de hidrxido de sodio Solucin 3.2N de HNO3 Solucin 1.5M de KSCN Solucin FeCl3 - ATA que contenga 2 mg de Fe2 en sol 3% ATA Materiales y equipo
Matraz erlenmayer de 125 ml Tubos cnicos para centrfuga Matraz volumtrico de 100 ml Bao mara Agitador mecnico Espectrofotmetro Centrfuga de laboratorio Embudos Papel filtro Whatman 2 Procedimiento 1. Coloque en un matraz erlemayer de 125 ml una muestra finamente molida (40 mallas), estimada para contener de 5 a 50 mg de fitato-P. Extraiga durante 30 min con 50 ml de solucin al 3% de ATA bajo agitacin constante. 2. Centrifuge la suspensin y transfiera una alcuota de 10 ml del sobrenadante a un tubo de centrfuga cnico. Agrguele 4 ml de la solucin de FeCl3 preparada para contener 2 mg de Fe2 soplando rpidamente la pipeta. 3. Caliente durante 45 min el tubo con la muestra en un bao mara a 90100 Si el sobrenadante no est claro despus de 30 C. min adicione 1 2 gotas de la sol. al 3% de sulfato de sodio en ATA y contine con el calentamiento. Centrifuge por 1015 min y decante con cuidado el sobrenadante. Lave dos veces el precipitado con 2025 ml de solucin de ATA al 3% dispersndolo bien y calentndolo en agua a ebullicin por 510 min y centrifuge. Finalmente repita una vez el lavado con agua. 4. Disperse el precipitado en un poco de agua destilada, adicione 3 ml de la solucin 1.5N de NaOH y mezcle. Lleve el volumen a aproximadamente 30 ml con agua destilada y caliente en agua a ebullicin durante 30 minutos. Filtre en caliente (cuantitativamente) con un papel de retencin moderada (Whatman 2 SyS 597). 5. Lave el precipitado con 6070 ml de agua destilada caliente y deseche el filtrado. Si se desea hacer determinacin de fsforo se puede usar el filtrado. Disuelva el precipitado en el papel con 40 ml de la solucin 3.2N de HNO3 pasndolo a un matraz volumtrico de 100 ml. Lave varias veces el papel con agua destilada colectndola en el matraz. Enfre la muestra a temperatura ambiente y afore con agua destilada. 6. Transfiera una alcuota de 5 ml a un matraz volumtrico de 100 ml y diluya a aproximadamente 70 ml. Agregue 20 ml de la solucin 1.5M de KSCN y afore con agua destilada. Lea de inmediato (dentro de un lapso de 1 min) en el espectrofotmetro a 480 nm. 7. Corra un blanco de reactivos con cada muestra. Calcule el contenido de fierro a partir de un estndar de Fe(NO3)3 corrido al mismo tiempo o mediante una curva estndar preparada con anterioridad. Clculos Calcule el fitato-P a partir de los resultados de fierro, asumiendo una tasa molecular de 4:6 fierro:fsforo
conocida de metanol (alrededor de 1 ml). Cromatografa cualitativa en capa fina Coloque puntos del extracto sobre una placa de gel de slica y revlelos con una solucin n-butanol-etanol-amonaco concentrado (3.5:1:2.5). Se pueden aplicar tres diferentes mtodos para identificar las manchas de saponina: (1) asperson con cido acticoanisaldeido; (2) tratamiento con nitrato de plata seguido de hidrxido de sodio y (3) tratamiento con una suspensin de eritrocitos en buffer isotnico. Para mayores detalles consulte a Fenwick y Oakenfull (1981). Cromatografa cuantitativa en capa fina Coloque series de puntos con volmenes conocidos del extracto y de una solucin estndar de saponina sobre las placas de cromatografa. Los puntos deben ser colocados de tal manera que cada punto de extracto vaya al lado de los de estndar de saponina. Revele las placas de la misma manera que en el apartado anterior y las manchas deben ser visualizadas mediante la asperson de una solucin de cido sulfrico en metanol, seguida de calentamiento a 110 por 30 min. Mida la intensidad de las manchas de saponi na C por medio de un densitmetro y calcule las reas de los picos en el graficador con un planmetro. los resultados son expresados como la relacin (R) de las reas de los picos de la muestra desconocida con respecto a la del estndar. Se ha determinado que la concentracin de saponina en la muestra (en g) es proporcional al cuadrado de las reas relativas (R2). Grafique R2 contra el volumen de la gota de extracto metanlico colocada en la placa. La pendiente de la lnea (calculada por el mtodo de cuadrados mnimos), divido entre la pendiente de una lnea obtenida de una curva patrn, dar la concentracin de la saponina en el extracto y de esa manera, el contenido de saponina en la muestra. El mtodo puede tener un error experimental acumulado de 20%.
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6. REFERENCIAS
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2. Pasturas; plantas y forrajes verdes 3. Ensilados 4. Alimentos energticos 5. Alimentos proteicos 6. Suplementos minerales 7. Suplementos vitamnicos 8. Aditivos
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Anexo 2. Limites recomendados para algunas substancias indeseables en los ingredientes alimenticios.
SUBSTANCIA Arsnico MATERIAL - Todos los ingredientes excepto: Alimentos elaborados con pasto, alfalfa o trbol secos Pulpa o melaza de remolacha Fosfatos y subproductos de pescado y otros animales marinos Fluoruros - Todos los ingredientes excepto: Materiales de origen animal Fosfatos Plomo - Todos los ingredientes excepto: Harina de pasto, alfalfa o trbol Fosfatos Levaduras Mercurio - Todos los ingredientes excepto: Subproductos de pescado y otros animales marinos Nitritos Aflatoxina B1 Ricino (Ricinus communis) - Harina de pescado - Todos los ingredientes - Todos los ingredientes Contenido mximo (12% de humedad; mg/kg) 2 4 4 10 150 500 2000 10 40 30 5 0.1 0.5 60 (como nitrito de sodio) 0.05 10 (como vainas de la planta) Crotalaria spp Gosipol libre Acido cianhdrico - Todos los materiales sin moler - Todos los ingredientes excepto: Harina o pasta de algodn - Todos los ingredientes excepto: Semilla de lino Harina o pasta de lino Productos de yuca y pasta de almendra Aceite voltil de mostaza - Todos los ingredientes excepto: Harina o pasta de colsa 100 20 1200 50 250 350 100 100 4000 (como isotiocianato)
Semillas y frutos conteniendo alcaloides, glucsidos u otras substancias txicas separadas o en combinacin, incluyendo: Lolium temulentum Lolium remotum Datura stramonium
3000
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Fitohemaglutininas
Forma complejos indigeribles entre protenas, fsforo, calcio, zinc, cobre, magnesio, etc., provocando deficiencia de minerales. No se inactivan con calor
Ciangenos
Toxicidad por cianuro El cocimiento destruye las enzimas liberadoras del txico y volatiliza el HCN
Harina de yuca y sorgo Antagonistas de vitaminas Anti Vitamina E Anti Vitamina B12, D, A Micotoxinas Aflatoxinas Soya, frijoles, alfalfa Soya Oleaginosas incluyendo: Cacahuate, colsa, soya, girasol, algodn Leguminosas incluyendo: Frijoles, chcharos Cereales y sus subproductos Aminocidos libres: Mimosina Canavanina Leguminosas incluyendo: Leucaena Canavalia, Sesbania (Sesbania spp.) Txicos a niveles elevados; inhibicin del crecimiento. Estables al calor Reducen la disponibilidad biolgica de las vitaminas. Se inactivan por calor Elevada toxicidad. Producidas por el moho (Azpergilus spp.) bajo condiciones inadecuadas de almacenamiento: alta humedad y temperatura. Se presenta tambin en alimentos terminados