SECUENCIACIN

En la Unidad se realiza la secuenciacin automtica del DNA mediante electroforesis capilar y mediante el uso de la qumica BigDye Terminator v3.1 de Applied Biosystems. Todas las muestras son purificadas mediante precipitacin con el fin de eliminar el ruido de fondo y los terminadores sobrantes colaborando en la obtencin de unos resultados satisfactorios. Los cebadores utilizados para la reaccin de secuenciacin pueden ser universales o especficos. 1. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS La calidad de los datos obtenidos depende en gran medida de la pureza y correcta cuantificacin de las muestras de ADN proporcionadas. Se recomienda utilizar protocolos de extraccin, purificacin y cuantificacin fiables que permitan verificar la integridad y concentracin de la muestra.

Es muy importante que el usuario prepare siempre LAS MUESTRAS SIEMPRE DILUIDAS EN AGUA. Evitar el tampn TE y los buffers de elucin del ADN de los kits comerciales porque la presencia de EDTA en la muestra inhibe la reaccin de secuenciacin.

1.1. ADN clonado Pueden utilizarse cualquier protocolo de obtencin de ADN, pero todos tienen que producir un ADN libre de ARN, fenol, sales, etanol, EDTA, protenas, etc... Cada usuario puede elegir el protocolo que ms se adapte a sus necesidades pero funcionan mejor los que conllevan mtodos de purificacin con minicolumnas.

1.1.1. Purificacin mediante columnas.

Por lo general todos los kits comercializados que comprenden una etapa de purificacin en columna dan plsmidos de buena calidad para la secuenciacin (Quiagen, Roche, Eppendorf, Biorad, etc...), a excepcin de algunas slicas/resinas comerciales que dejan impurezas. Se recomienda centrifugar la columna dos veces despus del paso de lavado y a continuacin eluir el DNA con agua. Para asegurar la eliminacin del etanol presente en la solucin de lavado de la muestra.

1.1.2. Protocolos manuales.

- Los mtodos tipo "boiling" pueden dar buenos resultados si se realiza tratamiento posterior con fenol/cloroformo, cloroformo, precipitacin con isopropanol y lavados con etanol.

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- Los mtodos de "lisis alcalina" no son recomendable a no ser que vaya seguido de una purificacin posterior con un kit especfico o mediante precipitacin. - Si en la purificacin del DNA se ha utilizado algn solvente orgnico como fenol o cloroformo, el DNA debe purificarse al menos dos veces mediante precipitacin con etanol, para eliminar cualquier traza del solvente orgnico. - Si se utiliza etanol o isopropanol para precipitar el DNA, realizar la precipitacin utilizando acetato de amonio en lugar de acetato de sodio. Lavar el precipitado despus de la centrifugacin al menos una vez con etanol al 70%. Secar el precipitado el mximo posible y resuspender en agua. La presencia de trazas de etanol en el molde es una de las principales causas de fallo de la secuenciacin. En cualquier caso, el ADN siempre debe ser resuspendido en agua-miliQ estril. Evitar cualquier tampn que contenga EDTA pues ste interfiere en la reaccin de secuenciacin. 1.2. Productos de PCR La mezcla de PCR debe ser purificada (precipitacin, kits comerciales...) con objeto de eliminar subproductos, cebadores y dNTPs contaminantes que impidan la secuenciacin. La secuenciacin de fragmentos de pequeo tamao es algo problemtica por lo que se recomienda que los productos sean al menos de 150 pb. Los fragmentos ms pequeos se pueden comportar como primers y son difciles de purificar con buen rendimiento.

1.2.1. Purificacin mediante Columna.

Con cualquiera de los kits existentes en el mercado (Quiaquick, Quiagen, Millipore, Amersham, Roche, etc...). Este mtodo slo puede utilizarse si la banda de inters es producto nico de amplificacin y no una PCR mltiple, en tal caso la secuenciacin ser fallida

1.2.2. Precipitacin.
Existen varios protocolos: a) con acetato amonico slo si la concentracin total de cebadores en la PCR no es superior a 5 pmol; b) Tambin se puede usar Etanol y acetato sdico, etc Aplicables todos solo si el producto de amplificacin es nico, aunque se puede realizar una precipitacin selectiva, pero no es recomendable.

1.2.3. Dilucin directa del producto de PCR.

Este mtodo implica diluir una alcuota del producto de PCR entre 5 y 10 veces en agua y emplearlo directamente en la secuenciacin automtica. Para ello, es necesario emplear bajas concentraciones de dNTPs y primers en la reaccin de PCR, de tal manera que, las concentraciones finales de los primers sean de 0,2 M o menos y las concentraciones de dNTPs sean de 100 M o menos. La principal desventaja de este mtodo es que se requiere una optimizacin individual de las condiciones para cada producto de PCR.

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1.2.4. Purificacin del producto de PCR de un gel de agarosa.

Cuando existan artefactos o ms de un producto de amplificacin, es necesario el aislamiento de la banda de inters mediante electroforesis en gel de agarosa Adems, permite la eliminacin de primers y dNTPs. Se trata de correr el producto de PCR en un gel de agarosa de bajo punto de fusin, cortar la banda correspondiente (procurar no contaminar la banda con oligos y cortar la menor cantidad de agarosa posible) y fundir la agarosa. Finalmente, extraer y purificar el DNA con sucesivos pasos de fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (25:24:1) y precipitacin con etanol y sales. Alternativamente, se puede emplear para la purificacin kits comerciales.

1.2.5. Purificacin enzimtica del producto de PCR.

Consiste en el tratamiento del producto de PCR con Exonucleasa I y SAP. Recomendado para productos pequeos de PCR. No puede aplicarse en el caso de productos de PCR contaminados con subproductos secundarios. El tratamiento con exonucleasa I degrada los primers de PCR residuales mientras que la SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) defosforila los dNTPs restantes. Tras la inactivacin por calor de ambas enzimas puede utilizarse el producto de PCR para secuenciacin automtica. 1.3. Lambda, Csmidos, BACs Recomendamos para la extraccin de ADN maxipreps obtenidas por gradiente en ClCs. Para cualquier consulta en relacin a este tema ponerse en contacto con la Unidad 2.CUANTIFICACIN DE LAS MUESTRAS Otro factor determinante en el xito de las reacciones de secuenciacin es la correcta cuantificacin del ADN. Si la cantidad de ADN presente en la muestra es inferior a la necesaria, casi con toda probabilidad la reaccin de secuenciacin fallar produciendo datos con baja seal, ruido de fondo, errores y ambigedades. Demasiado DNA molde tambin puede producir efectos similares. Se puede realizar mediante espectrofotometra a 260 nm. Puesto que la contaminacin del DNA molde con RNA o protenas pueden afectar negativamente a los resultados de la secuenciacin, hay que medir tambin la absorbancia de la muestra a 280 y 230 nm y comprobar las ratio A260/A280 y A260/A230. El DNA molde debe tener una ratio entre A260 y A280 nm de 1.8-2.0. Aun asi, debido al amplio margen de error de los espectrofotmetros, nosotros recomendamos realizar la cuantificacin mediante electroforesis en gel de agarosa con un control de concentracin conocida. De esta forma se comprueba tanto la cantidad como la calidad del ADN a secuenciar.

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3. CEBADORES DISPONIBLES El Servicio suministra los cebadores universales siguientes: T7 T3 Universal M13 forward -20 Reverso SP6 T25(A,G o C) 5-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 5-ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA-3 5-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 5-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3 5-GAT TTA GGT GAC ACT ATA G-3 5-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT T(A,G o C)-3

Adems de los cebadores descritos se puede utilizar cualquier cebador sintetizado por el usuario. Para un correcto diseo de cebadores que vayan a ser utilizados en secuenciacin, recomendamos lo siguiente: Los cebadores debern tener, al menos, 18 bases para asegurarnos que hibriden con el ADN a secuenciar y evitar hibridaciones secundarias en el vector o en el inserto. Deben tener una Tm entre 50 C-65 C. Se puede utilizar la siguiente formula para calcular la Tm . Tm=69.3+0.41x(%GC)-650/longitud del primer Debe evitarse la utilizacin de cebadores con secuencias que formen estructuras secundarias, especialmente en el extremo 3, o puedan hibridar formando dmeros intercatenarios. Para ello, evitar en lo posible la utilizacin de cebadores que tengan en su secuencia repeticiones de ms de 3 4 Gs Cs seguidas y % GC entre 40-50 %. No deben emplearse cebadores con errores, ni cebadores que hibriden en ms de un sitio en la secuencia o que puedan formar dmeros. Disear el primer al menos 50 bases upstream de la secuencia de inters. La secuencia inmediatamente posterior al primer o no se obtiene o puede ser bastante imprecisa. 3. PROGRAMAS El formato ABI es compatible con los visores habituales disponibles en las siguientes direcciones: - EditView en Mac: http://www.appliedbiosystems.com - Chromas en PC http://technelysium.com.au En la siguiente direccin web: http://www.appliedbiosystems.com/support/software /3100/conversion.cfm el usuario puede descargarse el programa de conversin de los ficheros AVI de PC a MAC.

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4. REPETICIONES 4.1. Secuencias fallidas Los procedimientos empleados en la Unidad se han diseado para minimizar la variabilidad y la frecuencia de secuencias fallidas. No obstante se pueden producir fallos debido a tres tipos de causas: a. Caractersticas de las muestras, bien del molde bien de los cebadores. b. Informacin insuficiente por parte del usuario. c. Error operativo del funcionamiento interno del servicio. Las secuencias fallidas se facturan cuando se estima que las causas de error son del tipo a o b. Las producidas por errores del tipo c se repiten. Si la repeticin vuelve a fallar se asumir que no se trataba de un error operativo. Para cualquier duda o consulta ponerse en contacto con la Unidad. Cuando las muestras enviadas sean repeticiones indicarlo en el Formulario de Solicitud que se adjunta con las muestras para hacer los cambios oportunos con el fin de conseguir un resultado satisfactorio. 4.2. Causas de error Las causas de error ms habituales que se asocian con el DNA de partida y que afectan, principalmente, a la calidad del mismo, son las siguientes: a. Para muestras en vectores de clonacin, son dos los factores ms importantes:

Las condiciones de crecimiento del cultivo. Los cultivos bacterianos para la purificacin de plsmidos deben obtenerse de colonias frescas crecidas en medios selectivos o de pequeos precultivos obtenidos de stocks de glicerol o de agar. La cepa bacteriana donde se propaga el molde puede afectar a su calidad. Se obtienen resultados fiables con DH1, DH5, DH10B, XL1-blue y C600. Las cepas MV1190, HB101 y JM101 no son recomendables puesto que contienen una gran cantidad de carbohidratos y poseen el locus endA con lo que producen relativamente grandes cantidades de nucleasa.

b. Caractersticas del ADN. Formacin de estructuras en la clonacin que impiden una correcta secuenciacin, clones o pcrs mltiples, poliT, presencia de microsatlites, etc En general, caractersticas del fragmento u organismo a secuenciar de las cuales no se tiene conocimiento hasta un primer paso de secuenciacin. Una vez conocidas tales caractersticas, se requieren uno o varios pasos de optimizacin para conseguir resultados ptimos. c. Cantidad insuficiente de DNA molde. Se recomienda cuantificar el DNA mediante electroforesis, empleando diluciones y comparando con marcadores de masa conocida y comprobar la concentracin. d. Calidad del molde. Aunque para su preparacin se hayan utilizado kits comerciales pueden permanecer impurezas que interfieran con la secuenciacin:

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Para productos de PCR las impurezas ms habituales son los fragmentos que copurifican con el molde como por ejemplo primer-dimers, que contienen sitios de unin para los cebadores de secuenciacin. Contaminacin por nucleasas: por ejemplo la DNasa causa un cambio de la forma del plsmido superenrollada a lineal lo que reduce gradualmente la intensidad de la seal y la longitud de la secuencia obtenida. Por lo tanto hay que evitar las cepas hospedadoras que produzcan nucleasas. Contaminacin por RNA: esto ocurre ms frecuentemente cuando los cultivos han crecido demasiado tiempo y el tampn de lisis es insuficiente para lisar todas las clulas. Las muestras contaminadas con RNA muestran un ruido de fondo alto. El tratamiento del DNA molde con RNasa (libre de DNasa) degradar el RNA con lo que se pueden mejorar los resultados de las secuenciacin. Por otro lado, la presencia de RNA falsea la cuantificacin del ADN. Contaminacin por sales: la presencia de sales inhibe la reaccin de secuenciacin (disminuye la procesividad de la polimerasa). Sin embargo el tipo de sal influye en la severidad del efecto: por ejemplo el cloruro de sodio o de potasio tiene un efecto mayor que la misma concentracin de acetato de sodio. Un concentracin de acetato de sodio mayor de 20mM inhibe severamente la reaccin de secuenciacin. Las causas ms comunes de contaminacin por sales son: la coprecipitacin de stas con el etanol en la precipitacin del DNA, sobre todo si esta se realiza a baja temperatura; una eliminacin insuficiente del sobrenadante; o un lavado con etanol 70% insuficiente. Por lo tanto la precipitacin del DNA molde y los lavados deben realizarse muy cuidadosamente y a temperatura ambiente. Contaminacin por etanol: se produce por la resuspensin del DNA molde tras la precipitacin sin que se haya secado suficientemente. La presencia de pequeas cantidades de etanol (5%) puede causar la terminacin prematura de las cadenas y por lo tanto la obtencin de secuencias cortas. Una contaminacin con etanol superior al 10% tiene como consecuencia normalmente el fallo total de la reaccin de secuenciacin. Contaminacin con fenol: algunos mtodos de preparacin de DNA plasmdico utilizan un paso de extraccin con fenol. La contaminacin con este reactivo tiene como resultado la degradacin severa de la secuencia resultante, especialmente en lecturas largas. Ms de un 1,4% de fenol en el DNA molde produce secuencias totalmente inutilizables.

e. Problemas con los cebadores especficos del molde. La muestra puede contener distintos sitios de unin, o el cebador no unirse al molde o cantidad insuficiente del cebador, error en el clculo de la Tm, DNA subclonado que arrastre polilinker y existan varios sitios diana para cebadores universales, etc 5. INFORMACIN ADICIONAL El Servicio pone a disposicin de los usuarios la asesoria cientfica-tcnica necesaria para ser usuarios de este Servicio. Tambin prestamos la asesora informtica necesaria, para realizar los anlisis relacionados con el ensamblaje, edicin, alineamiento, bsqueda de secuencias homlogas, relaciones filogenticas, deteccin de motivos, anlisis de uso de codones, comparacin de la secuencia problema con las publicadas en las bases de datos, etc...

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En caso de dudas sobre cualquier punto, pueden ponerse en contacto con la Unidad a travs de nuestro telfono o e-mail. 957 21 85 87 o genomica@uco.es 6. PROBLEMAS MS FRECUENTES DURANTE LA SECUENCIACIN A) No se produce reaccin o esta decae poco despus de comenzar

Posible causa No hay ADN o hay menos del necesario No hay cebador o la concentracin es inferior a la necesaria. El primer puede estar degradado El cebador no encuentra el sitio de hibridacin El ADN presenta contaminacin El cebador est mal diseado o la temperatura de melting no es la adecuada El sitio de unin del cebador en el vector se ha perdido o daado. Durante la clonacin pueden crearse artefactos con una delecin cerca del sitio de insercin del DNA a clonar o deleciones que eliminan la secuencia del primer del vector. En los productos de PCR puede que los amplificados no sean el producto de la amplificacin con los dos cebadores. Si el amplificado se genera a partir de uno de los dos primers slo se obtendr secuencia con ste. Este efecto se puede producir cuando se utilizan para secuenciar los mismos primer que se han utilizado en la amplificacin del DNA molde y alguno de ellos no funciona correctamente.

Posible solucin Aumentar la cantidad de ADN Aumentar la concentracin o cantidad de cebador, Cambiar la alcuota. Cambiar el cebador. Asegurarse del diseo Volver a preparar el ADN Redisear el cebador

Volver a clonar en el vector

Cambiar de cebador

B) Seal de baja intensidad. Unin dbil del cebador.

Posible causa Mala calidad del ADN ADN presenta estructura secundaria en el sitio de hibridacin del cebador La concentracin del ADN inferior a la necesaria Posible solucin Volver a purificar el ADN Cambiar de cebador Aumentar la concentracin

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El cebador utilizado en la secuenciacin no es el adecuado: - Estructura secundaria (afecta ms en extremo 3) - Tm del cebador demasiado baja (muy corto, poco contenido GC, etc)

Cambiar el cebador

C) El cromatograma es correcto pero presenta mucho ruido de fondo

Posible causa Existe un sitio secundario de unin del cebador que da lugar a picos extra La cantidad de ADN es insuficiente y la seal es demasiado baja El ADN presenta contaminacin1 La PCR no fue especifica y existen amplicones contaminantes en la muestra Cebador mal purificado2 o degradado Fragmento de PCR mal purificado

Posible solucin Intentar eliminar aadiendo DMSO en la secuenciacin o cambiar de cebador Aumentar la cantidad de ADN Purificar el ADN Cambiar de cebador Cambiar de cebador o purificar Eliminar los cebadores de la amplificacin

1. En la secuenciacin en capilares este problema (contaminacin del ADN) es an mayor al ser ms sensible. 2. Puede verse una secuencia sombra (N-1). El cebador est compuesto por cadenas completas (N), pero una proporcin de ellas contiene una base menos (N-1), esto da lugar a un cromatograma ilegible al tener picos superpuestos y desfasados.

D) El cromatograma presenta dos secuencias superpuestas

Posible causa Posible solucin El cebador tiene varias dianas Cambiar de cebador Primer drimer: Esto puede ocurrir cuando los primers empleados en la amplificacin forman Volver a purificar el producto de PCR dmeros y estn presentes en la reaccin de

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secuenciacin debido a una mala purificacin del producto. Cuando termina la secuencia de los dmeros la lectura es correcta. Cebador degenerado ADN subclonado existiendo dos sitios diana para el cebador universal utilizado1 Posible causa PCR inespecfica: diana del cebador en ambos extremos, es decir, amplicn inespecfico generado por un solo cebador Hay ms de un ADN molde en la muestra3

Cambiar de cebador Secuenciar con otro cebador Posible solucin Cambiar de cebador Repreparar el ADN

1. Comprobar, si se ha arrastrado polilinker durante la subclonacin porque esto implicara que el/los cebadores universales tienen sitio de hibridacin duplicado y no se pueden utilizar en la secuenciacin de esa muestra. Aseguraros de que partimos de una nica colonia o que no es PCR mltiple con amplificaciones secundarias inespecficas.

-Primer Drimer
Si el producto de PCR no est purificado o en la purificacin no se ha eliminado totalmente los restos de primer que no se utilizaron en la amplificacin, se pueden formar dimeros de primer que actan como molde en la reaccin de secuenciacin. Esto genera lecturas superpuestas. El rango o longitud de la superposicin depender del tamao del molde contaminante. - En el caso de productos de PCR: la mezcla de lecturas comienza desde el principio. Si a partir de las 20-60 pb de bases la mezcla desaparece es indicativo de primer drimer. - En el caso de un clon mltiple: la mezcla de lecturas comienza a partir de las 30-90 pb de bases, es decir, la lectura de ambas colonias coincide solo en el vector. Una vez comienza el inserto, si son distintos, se mezclan las lecturas. Ejemplo: La reaccin comienza de forma normal pero existe doble lectura a partir de un determinado punto (30-90 pb aprox.)

-Insercin/Delecin

La reaccin comienza de forma normal pero existe doble lectura a partir de un determinado punto (ms de 150 pb aprox.)

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Posible causa Regin heterocigtica para ese fragmento Mutaciones frame shift

Posible solucin Digestin para eliminarlo

E) La secuencia pierde bruscamente la seal y cae

Posible causa Efecto de una estructura secundaria (presencia de secuencias repetidas, palindromicas, etc) La cantidad entre el ADN y el cebador no es la equilibrada Formacin de estructuras en la clonacin que impiden una correcta secuenciacin Presencia de compuestos contaminantes en la muestra (EDTA, sales, etanol, fenol, etc.) ADN cortado, digerido a ese nivel o finalizacin de producto de pcr

Posible solucin Aadir DMSO, secuenciar la cadena complementaria, digerir el molde, subclonarlo y secuenciar los subclones o utilizar un kit alternativo para las reacciones de secuenciacin cmo el kit dGTP Big Dye de ABI. Respetar las concentraciones y cantidades indicadas en las tablas de entrega de muestras Realizar PCR sobre el clon (cebadores universales o propios) y mandar a secuenciar el amplicn resultante y no el clon No resuspender nunca el ADN en solucin que contenga EDTA

F) Presencia de picos saturados y fuera de escala en el cromatograma

Posible causa Demasiada cantidad de ADN

Posible solucin Reducir la cantidad de ADN ( segn figura en las tablas de entrega de muestras)

G) La secuencia es normal pero aparece un pico de forma repentina

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Posible causa Terminadores no incorporados (entre 0-180 pb)

Posible solucin Repetir la reaccin de secuenciacin

H) Aparicin de un pico anmalo con los colores correspondientes a todas las bases

Posible causa Burbuja producida por el capilar

Posible solucin Volver a analizar la muestra o repetir la reaccin de secuenciacin

I) Aparicin de picos muy abiertos con la consecuente prdida de resolucin

Posible causa Exceso de ADN (capilar) Presencia de sales o contaminantes en la muestra Problema del capilar

Posible solucin Respetar la cantidad y concentracin de ADN Volver a purificar la muestra Repetir la secuencia

J) Secuenciacin de regiones ricas en GCs, GAs

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Posible causa Formacin de dplex que alteran estabilidad del cebador

Posible solucin Usar temperaturas de secuenciacin ms bajas que la estndar

Posible causa

Composicin nucleotdica (Repeticiones dinucletidos GT, GC, GA.) Estructura secundaria, efecto de la alta Tm del tratamiento del ADN

Posible solucin Secuenciar cadena complementaria Repetir la secuenciacin con un kit alternativo (dGTP Big Dyes). Aadir DMSO en la secuenciacin Cambiar condiciones de PCR: aumentar la t de desnaturalizacin a 98, el n de ciclos de PCR o la cantidad de Taq; incluir un paso de predesnaturalizacin de 5 min Linearizar el vector y secuenciar productos tras subclonarlos

Cuando se secuencien organismos con un alto contenido GC indicarlo en las tablas que se adjuntan con la muestras a secuenciar 1. Las repeticiones de AG pueden ser problemticas pues la Taq produce una seal dbil de G despus de A cuando se utilizan terminadores marcados. En este caso conviene secuenciar la cadena complementaria.

K) Presencia de microsatlites

Posible causa Presencia Microsatlites: SSRs, VNTRs, en el caso de productos de PCR son ms problemticos que en productos clonados, sobre todo si son de elevada longitud. Se puede producir el deslizamiento de la polimerasa y no se puede obtener secuencia de esa regin. Repeticiones dinucletidos GC

Posible solucin Secuenciar a partir del plsmido no del producto de PCR y aadir DMSO en la reaccin de secuenciacin Crear delecciones seriadas en esas zonas y secuenciar Cambios ya recomendados

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L) Presencia de largos homopolmeros

Posible causa

Presencia de poliA/poliT1

Posible solucin Secuenciar cadena complementaria Empleando cebador degenerado del tipo T25(A, G C)2 si no se conoce la base siguiente a la regin poliA/poliT o los cebadores individuales especficos T25A, T25G T25C. La base 3 del cebador permite anclar este a la secuencia al final del homopolmero, mejorando los resultados obtenidos

1. La polimersa patina dando lugar a una lectura ilegible despus de la regin homopolimrica, aunque los datos de antes de esa regin sean de buena calidad. Este problema se puede producir en la reaccin de secuenciacin o en la de amplificacin, aunque en este ltimo caso no son aparentes cuando el fragmento se visualiza en un gel de agarosa. 2. Se denominan primer anclado: Son primers que se unen al homopolmero, tipo T25-(N) y que terminan en una base degenerada para obligar al oligo a pegarse en la posicin 3.

Posible causa

Posible solucin

Secuenciar cadena complementaria Homopolmero de Gs o Cs (causa deslizamiento de la polimerasa generndose una Usar un cebador ms interno que hibride 20-30 bases antes del homopolmero para forzar a la secuencia ilegible) polimerasa a pasar sobre l Realizar deleciones seriadas y secuenciarlas En los productos de PCRs pueden existir saltos, problemas que no existen en el material clonado Secuenciar el material clonado, adems del amplificado. Si es posible, es mejor verificar la especificidad de la secuencia a partir de otros clones

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M)Primer N-1

Secuencia sombra N-1

Posible causa Posible solucin El cebador est compuesto por cadenas completas (N), pero una proporcin de ellas contiene una base menos (N-1), esto da lugar a un cromatograma ilegible, en algunos casos, al tener picos superpuestos y desfasados. Puede Prepara una nueva alcuota del primer verse una secuencia sombra (N-1) de menor altura, donde cada pico sombra es igual que el pico siguiente de mas altura y/o intensidad de fluorescencia.

N) Solo terminadores

Posible causa Aparecen solo los terminadores debido a que la cantidad de ADN es insuficiente

Posible solucin Poner mas cantidad de ADN o de mejor calidad

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O) No inserto

Posible causa Inserto no clonado correctamente Falso positivo

Posible solucin Clonar de nuevo Seleccionar otra colonia

P)Heterocigosis (No fallo)

G C + T C

Heterozigoto: GT

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