4. Effet de la concentration denzyme Lorsque [enzyme] << [substrat], la vitesse de la raction est directement proportionnelle la concentration de lenzyme.

. La vitesse de raction augmente lorsque [enzyme] augmente. Ceci est vraie pour nimporte quel catalyseur.

Vitesse de raction

[Enzyme]

128

3.6 Cintique enzymatique

Les enzymes dtiennent leur slectivit et capacit acclrer la vitesse dune raction de la formation dun complexe enzymesubstrat: E+S ES E+P G=
(sans enzyme)

o E= enzyme, S= substrat, ES = complexe enzyme-substrat et P est le produit de la raction La formation du complexe ES donne lieu un tat de transition pour la raction ayant une barrire nergtique dactivation (G) abaisse; la raction a donc moins besoin d'un apport externe d'nergie pour se drouler.

=G
(avec enzyme)

Graction nest pas affecte par lenzyme

(Daprs Tinoco, Sauer, Wang & Puglisi, Physical Chemistry: Principles & Applications In Biological Sciences, 4e d., 2002) 129

La 1re tape critique dans une raction avec catalyse enzymatique est la formation du complexe ES. Puisque cest le complexe ES qui est le ractif dans ltape de conversion du substrat en produit, sa concentration dtermine la vitesse de raction. La vitesse de raction est maximale lorsque toutes les molcules denzyme sont complexes au substrat. Cette situation correspond des concentrations leves de substrat, o lenzyme est soit disant sature avec le substrat. Pour une concentration fixe de lenzyme, un graphique de la vitesse initiale de raction (Vo) en fonction de la concentration initial du substrat [S] exhibe une courbe typique dune cintique de saturation, o un plateau est observ [S] leves lorsque V= vitesse maximale (Vmax).

Vo

Vitesse de raction approche Vmax

Vo [S]
130

3.6.1 Raction un substrat: cintique de Michaelis-Menten

Le modle cintique est bas sur la formation du complexe ES selon les tapes suivantes: k1 k3 (1) E + S ES E + P k2 On cherche une expression qui relie la vitesse de raction aux concentrations du substrat et de lenzyme et aux vitesses des tapes individuelles; le point de dpart tant que la vitesse de raction est gale (2) au produit de [ES] et la constante de vitesse k3: V=k3[ES] Les vitesses de formation et de dcomposition du complexe ES sont donnes par: vitesse de formation de ES = k1[E][S] (3) (4) vitesse de dcomposition de ES = (k2 + k3)[ES] Sous conditions dtat stable: k1[E][S] = (k2 + k3)[ES] Par rarrangement de lqn 5, on obtient: [E S] = [E][S] (k 2 + k 3 )/k1 (5) (6)
131

Lquation prcdente peut tre simplifie en dfinissant une nouvelle constante, Km, qui est la constante de Michaelis: (7) k + k3 Km = 2 k1 En substituant lexpression pour Km dans lqn 6, on obtient:

[E S] =
De plus,

[E][S] Km

(8)

[S] [S]totale, si [E] << [S] [E] = [E]totale [ES] [ES]=([E]totale [ES])[S]/Km

(9) (10)

Donc,

Par rarrangement de lqn 10, on obtient [E S] = [E]totale

[S] (11) [S] + K m

132

En substituant cette expression pour [ES] dans lquation 2, on obtient:

V = k 3 [E]totale

[S] [S] + K m

(12)

La vitesse maximale, Vmax, est atteinte lorsque tout les sites enzymatiques sont saturs de substrat, cest dire, lorsque [S] >> Km et donc (13) [S]/([S] + Km) tend vers 1. Il sensuit que Vmax = k3[E]totale La substitution de lqn 13 dans lqn 12 donne lquation de MichaelisMenten: [S] (14) V =V
max

[S] + K m

Lquation de Michaelis-Menten dcrit la courbe cintique de Vo-[S]: - Pour des concentrations faibles de substrat, lorsque [S] << Km, V = [S]Vmax/Km et la vitesse est directement proportionnelle la concentration de substrat. - Pour des concentrations leves de substrat, lorsque [S] >>Km, V = Vmax et la vitesse est indpendante de la concentration de substrat. - La signification de la constante Km est vidente. Lorsque [S] = Km, V = Vmax/2. Km est la concentration de substrat ncessaire pour que 133 l'enzyme atteigne (1/2) Vmax.

Mthodes graphiques pour la dtermination de Km et Vmax

Il y a deux rgions dutilit analytique dans la courbe cintique de - [S] < 0.1Km (pour la quantification du substrat) Vo-[S]: - [S] > 10Km (pour la quantification denzyme) Dans le dveloppement dun essais enzymatique, il est important de connatre la valeur de Km de lenzyme et dajuster la valeur de Vmax afin que lessais est accompli dans le minimum de temps requis pour une prcision donne. Il y a quatre mthodes graphiques pour tablir les valeurs de Km et Vmax dans des conditions exprimentales donnes: Lineweaver-Burk, EadieHofstee, Hanes et Cornish-Bowden-Eisenthal. Les quatre mthodes ncessitent des donnes exprimentales pour la vitesse initiale de la raction en fonction de la concentration initiale du substrat pour une concentration fixe denzyme.
134

Donnes cintique
0.6 0.5
Vo (A340nm/min)

0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

0 1 2 3 4 [S] mmol/L 5 6 7
135

1. Mthode de Lineweaver-Burk
Le rciproque de lquation de Michaelis-Menten est trs utile pour lanalyse des donnes de cintique:

1 K m + [ S] = Vo Vmax [S]

qu'on peut aussi crire

1 Km [S ] = + Vo Vmax [S] Vmax [S]

et qui se simplifie en

1 1 1 K = + m Vo Vmax Vmax [S]

L'avantage de cette transformation mathmatique est qu'elle permet de tracer un graphique 1/Vo vs 1/[S] dont la courbe est en fait une droite pour les enzymes obissant la relation Michalienne entre vitesse de raction et concentration du substrat.
136

Y = (1.125510.08398) + (3.795170.06135) * X

14 12 10
Km/Vmax

1/Vo

8 6 4 2
Km = 3.37 mmol/L Vmax = 0.89 units dabsorption/min 1/Vmax

0 -0.5 0.0 -1/Km

0.5

1.0

1.5 2.0 1/[S]

2.5

3.0

3.5
137

2. Mthode de Eadie-Hofstee
V = Vmax [S] [S] + K m
V [S] + VK m = Vmax [S]

quation de Michaelis-Menten

V [S] VK m + = Vmax [S] [S]

V = Vmax

VK m [S]

Un graphique de V en fonction de V/[S] donne une droite.

138

Y = (0.908510.03984) + (-3.460410.22103)*X
1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 Vo 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.00 0.05 0.10 0.15 Vo/[S]
139

Vmax

Km = 3.46 mmol/L Vmax = 0.91 units dabsorption/min

-Km

0.20

0.25

0.30

3. Mthode de Hanes
V = Vmax [S] [S] + K m
V ([S] + K m ) = Vmax [S]

quation de Michaelis-Menten

K m + [S] [S] = Vmax V

[S] K m [ S] = + V Vmax Vmax

Un graphique de [S]/V en fonction de [S] donne une droite.

140

Y = (3.742110.11868) + (1.134450.03865)*X
12 11 10 9 [S]/Vo 8 7 6 5 4 0

1/Vmax

Km = 3.30 mmol/L Vmax = 0.88 units dabsorption/min Km/Vmax

1 2 3 4 [S] 5 6 7

141

4. Mthode de Cornish-Bowden-Eisenthal
V = Vmax [S] [S] + K m
Vmax [S] = V [S] + VK m

quation de Michaelis-Menten

Vmax =

VK m +V [S]

Chaque paire de coordonnes (V, [S])] donne des valeurs uniques dordonn lorigine (V) et de pente (V/[S]) dans un graphique de Vmax en fonction de Km. Pour chaque coordonne (V, [S])], les valeurs dordonne lorigine et de pente dfinissent une droite unique et les droites se croiseront un point identique correspondant au Vmax et Km de lenzyme.
142

1.6 1.4 1.2 1.0 Vmax 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 1 2 3 Km
143

Faire la moyenne des diffrents points de croisement

3.7 Inhibiteurs enzymatiques

Des inhibiteurs enzymatiques sont des espces qui sont capables de diminuer l'activit enzymatique. Les inhibiteurs enzymatiques interagissent gnralement avec lenzyme elle-mme, formant ainsi un complexe enzyme-inhibiteur (EI). Dans certains cas, le mcanisme dinhibition implique une raction avec le substrat. Linhibition enzymatique peut tre: - rversible (activit spcifique et les paramtres de Michaelis-Menten sont affects) - irrversible (la concentration denzyme active est diminue) Linhibition de ractions par des produits de la raction catalyse (ou dune raction subsquente) - mcanisme de rgulation/ feedback pour le mtabolisme cellulaire. Inhibition slective dune enzyme par des substances chimiques - la base 144 de la pharmacologie et de la chimiothrapie.

Quantification dinhibiteurs- partir de mesures de lactivit enzymatique (lchantillon dinhibiteur ne contenant pas denzyme).
V

Des standards contenant une quantit fixe denzyme, une concentration sature de substrat et des concentrations variables dinhibiteur sont prpars. Des courbes de lactivit enzymatique vs. [I] sont ralises partir des standards.

Courbes types pour des inhibiteurs (a) rversible et (b) irrversible.

(Daprs Mikkelsen & Cortn, Bioanalytical Chemistry, 2004)

145

3.7.1 Inhibiteur comptitif

Il y une comptition entre linhibiteur et le substrat pour le site actif de lenzyme. Linhibiteur se lie rversiblement lenzyme mais nest pas converti en produit. k1 k2 E + S ES E + P k-1
E + I k3 k-3 EI P

Linhibiteur bloque le site actif de lenzyme, empchant la liaison du substrat. Son efficacit est dcrit par la constante dinhibition, Ki (constante de dissociation du complexe EI) = k-3/k3. Pour une simple raction un substrat, leffet de linhibiteur comptitif sur la vitesse initiale de la raction est donn par:

Vo =

Vmax 1 + (K m /[S]) (1 + [I] / K i )

146

Linhibiteur peut tre dplac des concentrations leves du substrat. Les inhibiteurs comptitifs nont pas deffet sur le Vmax de lenzyme, mais changent le Km. Le Km augmente par un facteur de (1+[I]Ki). Linhibition comptitive des enzymes est une stratgie souvent adopte dans le dveloppement de mdicaments et antibiotiques (ex. les sulfonamides comptition avec le acide p-aminobenzoque, un facteur de croissance essentiel pour plusieurs types de bactrie).

Graphique Lineweaver-Burk pour un inhibiteur comptitif

(Daprs Mikkelsen & Cortn, Bioanalytical Chemistry, 2004)

147

3.7.2 Inhibiteur non comptitif

Ce type dinhibiteur ne ressemble gnralement pas au substrat naturel. Linhibiteur se lie lenzyme un site autre que le site actif, causant ainsi un changement rversible dans la structure tertiaire de lenzyme qui interfre la vitesse de conversion du substrat en produit. Linhibiteur peut interagir avec lenzyme libre ou avec le complexe ES. Dans ce type dinhibition, la quantit denzyme active semble diminuer lorsque [I] augmente; Vmax de la raction diminue:

Vo =

Vmax (1 + [I] / K i ) (1 + K m /[S])

o Vmax,app = Vmax/{1+[I]/Ki}
148

Graphique Lineweaver-Burk pour un inhibiteur non comptitif

(Daprs Mikkelsen & Cortn, Bioanalytical Chemistry, 2004)

149

3.7.3 Inhibiteur incomptitif

Les inhibiteurs incomptitifs se lient au complexe ES, rduisant ainsi la vitesse de formation du produit. Il y a une diminution du Km et du Vmax de la raction enzymatique. Une approximation de ce comportement est donne par la relation:

Vo =

Vmax (K m /[S]) + ([I] / K i ) + 1

Le modle prdit un changement quivalent du Km et du Vmax, rsultant en des droites de pentes identiques dans le graphique de Lineweaver-Burk.
150

Graphique Lineweaver-Burk pour un inhibiteur incomptitif

= {1+[I]/Ki}/Vmax

= -{1+[I]/Ki}/Km
(Daprs Mikkelsen & Cortn, Bioanalytical Chemistry, 2004)

151

3.8 Activateurs enzymatiques

Les activateurs sont des espces qui augmentent lactivit enzymatique sans tre eux-mmes impliqus dans la raction catalyse par lenzyme. Ces espces peuvent tre ncessaire lactivit catalytique de lenzyme, tels que des groupements prosthtiques ou cofacteurs, ou ils peuvent augmenter lactivit spcifique dune enzyme qui est dj active (ex. ions inorganiques). une concentration sature et constante du substrat, des concentrations croissantes de lactivateur augmentent la vitesse initial de raction; une vitesse limitante est atteinte des concentrations leves dactivateur.
152

Dans certains cas, telle que lactivation par un groupe prosthtique, la squence suivante de ractions peut servir comme modle pour une description cintique:
A + Einactive Eactive

S + Eactive

SEactive

Eactive + P

Des squences parallles de ractions doivent tre considres si lenzyme est catalytiquement active en absence de lactivateur. lexception des groupes prosthtiques ou co-facteurs, les activateurs ne sont pas gnralement spcifiques et plusieurs espces peuvent avoir le mme effet dactivation sur une enzyme (ex. lamylase est activ par une varit danions, incluant le Cl-).

153