Practica N12

DETERMINACION DEL NMERO DE MICROORGANISMOS

INTRODUCCION

Para trabajar con un microorganismo en condiciones definidas en el laboratorio es necesario primero proceder a su aislamiento, es decir a separarlo del resto de las poblaciones con las que coexiste en la naturaleza. El crecimiento de una poblacin o cultivo bacterianos se puede expresar en funcin de: Aumento del nmero de clulas aumento de masa del cultivo

Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre s en cultivos que estn en crecimiento balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporcin por unidad de tiempo).

Cuantificacin de microorganismos: Recuento de viables: Se utiliza una tcnica similar al aislamiento en placa: diluciones seriadas y siembra en placas (30-300 bacterias/placa). Recuento de totales. Medida del nmero de clulas: - Directo mediante microscopio (cmaras de recuento de Newbaver). - Contador electrnico de partculas (contador de Coulter) Medida de la masa celular. - Turbidimetra (densidad ptica). Se utiliza un colormetro (Repasar la ley de Lamber- Beer: A= bC, o log Ii/It = k*C). Es el mtodo ms utilizado. - Peso seco Medida de la masa celular Mtodos Directos: En estos mtodos se requieren preparaciones limpias, sin partculas extraas.

1) Determinacin del peso hmedo: se tara un tubo de centrfuga; se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante; se determina el peso del sedimento. - Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya cuanta depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc. 2) Determinacin del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105C, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo. - Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias. 3) Determinacin del nitrgeno total: tcnica de micro-Kjeldahl. 4) Determinacin de un componente caracterstico: peptidoglucano, ADN, ARN, protenas, ATP, clorofilas en organismos fotosintticos, etc.

Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros mtodos ms fciles dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.

Mtodos Indirectos: 1) Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxgeno (QO2) y consumo de carbnico (QCO2), determinados por el respirmetro de Warburg. Produccin de cidos. 2) Mtodos turbidimtricos (pticos). Son muy usados en la prctica cotidiana del laboratorio. La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano. Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo.

a) Espectrofotmetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiologa o Bioqumica. Mide la densidad ptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a travs de la suspensin). Por supuesto, hay que

realizar una curva estndar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema; La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamao de la partcula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la tcnica aumenta pues a longitudes de onda () cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana slo es vlida para >107cls/ml. b) Nefelmetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est situado en ngulo recto respecto de la direccin de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparacin. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro. Mtodos Directos: 1) Cmara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduacin en superficie y unas medidas muy concretas: excavacin con 0.02 mm de profundidad; rea de 1 mm2, dividida en un retculo de 25 cuadrados grandes; cada cuadrado grande est subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeos. O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeos). La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el nmero de clulas en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el nmero n de clulas observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentracin celular es fcil de establecer: n x 25 x 50 x 1000 = concentracin en clulas/ml.

- Ventajas: es un mtodo muy rpido. - Inconvenientes: slo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 cls./ml). Por debajo de este valor el nmero de clulas vistas en el campo del microscopio es muy pequeo y poco significativo estadsticamente. En bacterias mviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua. 2) Contadores electrnicos de partculas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensin microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente elctrica. Cada vez que por un orificio (30 m dimetro) pasa una partcula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrnico, que detecta el nmero y el tamao de las partculas que van pasando. (El tamao detectado es funcin de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partcula). Hay que usar suspensiones absolutamente libres de partculas extraas (las pequeas seran contabilizadas errneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar el orificio del aparato).

 Mtodos Indirectos

1) Recuento de viables en placa: Los mtodos de recuento de nmero de clulas que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre clulas vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las clulas vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una clula se define como viable cuando, colocada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El mtodo habitual de lograr esto es sembrar pequeas alcuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio slido (con agar). Cada clula viable dar origen a una colonia visible despus del tiempo adecuado de incubacin. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de alcuota utilizado, es fcil deducir el nmero de clulas viables en la suspensin original. Precauciones: para minimizar los errores estadsticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cada dilucin; hay que usar pipetas nuevas en cada dilucin; contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias. Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de ms de un individuo (y esto es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o ms clulas), el recuento se refiere no a clulas viables reales sino a unidades formadoras de colonia (UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mnimo, a una bacteria, pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembra en placa infravalora el nmero real de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o ms individuos que estaban juntos al ser sembrados en la placa. 2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estriles (con un dimetro de poro que retiene las bacterias pero permite el trnsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las clulas retenidas. Dichas colonias se cuentan, deducindose la concentracin original de viables en funcin del volumen de suspensin que se hizo pasar por el filtro.

MARCO TEORICO
El anlisis de los alimentos y piensos para determinar la existencia, tipo y numero de microorganismos es bsico para la microbiologa de alimentos. Sin embargo ninguno de los mtodos utilizados habitualmente permite determinar el nmero exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento. Son cuatro los mtodos bsicos utilizados para investigar el numero total de microorganismos: 1.- Recuento en placa (SPC) para la determinacin del numero de clulas viables (entre las que se encuentran el mtodo de la placa vertida, el de superficie y el de goteo). 2.- Mtodo del numero mas probable (MPN) de grmenes como calculo estadstico del numero de clulas viables. 3.- Tcnicas de reduccin de colorantes para el clculo del nmero de clulas viables con capacidad reductora. 4.- Recuento microscpico directo (DMC) tanto para clulas viables como para las no viables. El recuento en placa es el mtodo mas utilizado para la determinacin del numero de clulas viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento. Los recuentos totales deben hacerse en funcion de uno de los siguientes factores: - Mtodo de muestreo utilizado - Distribucin de los microorganismos en la muestra - Naturaleza de la microflora del alimento - Naturaleza del alimento - Antecedentes del alimento - Adecuacion nutricional del medio de cultivo - Temperatura y medio de incubacin - ph, aw, potencial de oxido reduccin del medio - Tipo de diluyente utilizado - Numero relativo de microorganismos en la muestra

PROCESO EXPERIMENTAL
CUANTIFICACIN DE MICROORGANISMOS POR EL METODO DE RECUENTO EN PLACA. FUNDAMENTO El recuento en placa es el mtodo ms utilizado y ms recomendado por la Comisin Internacional sobre especificaciones Microbiolgicas en los alimentos (ICMSF). El procedimiento se basa en la cuantificacin de la poblacin microbiana presente en los alimentos slidos o lquidos, sembrando en profundidad o en superficie. La mayora de los alimentos no son estriles, sino que contienen una poblacin microbiana, que vara ampliamente en nmero,dependiendo del alimento. Es por esto que al alimento se le realizan diluciones para su cuantificacin, ya que si se sembraran los alimentos sin diluir, presentaran un recuento tan alto que sera imposible realizar su conteo. Para eso se utilizan las diluciones logartmicas en base 10 (10-1, 10-2, 10-3, 10-4), las cuales se pueden relacionar con el recuento de microorganismos multiplicando por el factor de dilucin, que es el inverso de la dilucin. La dilucin inicial siempre ser 1:10 (10+90; 25+225; 50+450; 100+900), la cantidad de muestra va a depender del tipo de alimento y de los parmetros que existan, pero lo importante que se guarde la relacin: 1+9 o sea 1 parte de alimento y 9 partes de diluyente. RESULTADOS Contar el nmero de colonias existentes en cada placa, seleccionar la placa que contenga entre 30 y 300 colonias para la realizacin de los clculos. El resultado se expresa como microorganismos por ml de agua. Hay que tener en cuenta las diluciones!.

TECNICA DEL NMERO MS PROBABLE (NMP) FUNDAMENTO Esta tcnica sirve para estimar la poblacin de microorganismos viables en una muestra de alimento. En contraste con el recuento estndar en placa, el NMP es un mtodo indirecto y solo da recuentos estimados de la poblacin microbiana; es menos preciso que el recuento en placa cuando se trata de alimentos que contienen altas poblaciones microbianas, pero mas eficaz en poblaciones bajas porque permite el anlisis de muestras de tamao mas significativo. Se usa principalmente para la determinacin de coliformes, pero variando el medio de cultivo tambin se puede utilizar para la cuantificacin de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, etc. La metodologa de la tcnica se basa en la siembra de volmenes secuenciales de base 10 (10, 1, 0.1, 0.01 mL) de la muestra pura o 1 mL de la diluciones decimales. El

nmero de diluciones depender del grado de contaminacin del alimento y/o de los estndares microbiolgicos establecidos para ese producto: La relacin muestra pura o diluida debe ser de 1mL para 10 mL de medio de cultivo. Existen diferentes del NMP para coliformes, dependiendo del medio de cultivo utilizado: el norteamericano emplea el caldo laurel sulfato triptosa, seguida de la confirmacin de los tubos positivos en caldo lactosa bilis verde brillante o siembra por estra en EMB; el britnico solo utiliza caldo Mac-konkey; un tercer mtodo emplea el caldo lactosa bilis verde brillante y confirman con agar cristal violeta rojo neutro bilis lactosa. La utilizacin del mtodo depender del tratamiento a que ha sido sometido el alimento. RESULTADOS E INTERPRETACIN. Los resultados se expresan como NMP = No. de bacteria/ g mL de alimento; hay veces dependiendo del alimentos se expresa como NMP = No. de bacterias / 100mL. Los resultados de un anlisis de NMP, est directamente relacionados con la frecuencia con que se presentan una serie de resultados positivos, que son los mas probables que ocurran cuando un nmero dado de organismos estn presentes en una muestra de alimentos. En caso de realizar ms diluciones que las que posea la tabla empleada, se puede usar la siguiente frmula para hallar el NMP por g mL: (NMP de la tabla x Factor de dilucin intermedio de la lectura)/ 100 = Bact/g mL

CONCLUSIONES

- La determinacin de bacterias coliformes totales, pueden estar presentes tanto en los alimentos como en los sistemas de agua potable, ya que estos microorganismos se pueden transmitir a travs de diferentes vas. - Los coliformes totales as mismo nos ayudan a determinar si los productos alimenticios y el agua son actos para el debido consumo. - Podemos concluir con respecto a los objetivos antes relacionados que la determinacin de bacterias coliformes fecales y totales, pueden estar presentes tanto en los alimentos como en los sistemas de agua potable, ya que estos microorganismos se pueden transmitir a travs de las heces fecales . - La mayora de los enterococos, estreptococos y dems grupos o gneros microbianos son algunos patgenos y no patgenos, de estos se pueden preparar fermentaciones, que mediante un largo proceso, llegan a ser elaboradas en productos comestibles, garantizando al consumidor la mayor seguridad al consumir ese producto fermentado.

ANEXOS

METODOS PARA DETERMINAR MICROORGANISMOS VIABLES

METODOS POR PLACAS