CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION

Componentes de un Cromatgrafo

Suministro de Solvente

Procesador de Muestras

Columna

Detector

Procesador de Datos

Ubicacin
GASES

Complementariedad Diferentes
I.C.-H.P.L.C.

alternativas

L.C.-G.P.C.
50 500
10.000 2 MILLONES

RANGO UTIL EN PESO MOLECULAR

qumicas No destructiva Mltiples alternativas de deteccin Identificacin de compuestos (estndar de referencia)

Mecanismo de funcionamiento

QUE ES UN CROMATOGRAMA

IDENTIFICANDO Y CUANTIFICANDO COMPUESTOS

Isocratic and Gradient Operation

HPLC Scale (Analytical, Preparative, and Process)

Terminologa

V0 V1 V2
RETENCION, K = SELECTIVIDAD

V2 - V0
=

V1 - V0 V0
K2 K1

= 16

V1 - V0

PLATOS N =

V1 W1

Retencin o factor de capacidad (K) Selectividad o factor de separacin ( ) Nmero de platos tericos (N) La combinacin de las anteriores = Resolucin

Resolucin
R=

(W2 + W1)

tR2 tR1

Se debe modificar cuando se presenta el fenmeno de cola, variando: Tiempo de retencin Eficiencia Selectividad
0.25 N 1/2

R=

( )(
-1

)(

K 1 + K

)
Retencin o factor de capacidad (K) Selectividad o factor de separacin ( ) Nmero de platos tericos (N)

Afectan la Resolucin

VELOCIDAD LINEAL CM/SEG

0.1 0.8 0.5 4.0 1.0 7.5 FLUJOS

0.6 3.0 5.8

4.6 DIAMETROS EN mm. 4.0 2.0

Tecnologa de empaque Calidad de la Slice usada La carcaza:

Dimetro interno

0.15

0.75

1.5

CAMBIOS EN VELOCIDAD LINEAL AL INCREMENTAR EL FLUJO EN COLUMNAS DE DIAMETRO DIFERENTE

La viscosidad del solvente Temperatura

TIPOS DE SEPARACION CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

BAJA POLARIDAD

ALTA A MEDIA

Fase Normal

F. Estacionaria Polar F. Mvil No Polar F. Estacionaria No Polar F. Mvil Polar pH Fuerza Inica

F. ESTACIONARIA

Fase Reversa

F. MVIL

POLARIDAD DE SUSTANCIAS

Intercambio Inico

BAJA A MEDIA

BAJA POLARIDAD

Permeacin por Gel (polmeros) Filtracin en gel Par Inico Cromatogrfico P.I.C.
Recordar generalidades

FASE MOVIL
MEZCLA DE DOS O MAS SOLVENTES QUE INTERACTUA CON LA MUESTRA Y CON LA COLUMNA

Agua obtenida por Osmosis inversa

Solventes Orgnicos Polares y Apolares grado HPLC (No deben poseer particulas mayores a 0.45 micras) Control de pH
Buffers Aminas Acidos

Modificadores Orgnicos

MECANISMO DE PURIFICACION DE AGUA

DESTILACION DESMINERALIZACION OSMOSIS INVERSA

Recomendaciones con la Fase Mvil en HPLC

Filtrar a travs de una membrana (0.22-0.5) micras Desgasificar (para eliminar los gases disueltos) Vaco Calentamiento Ultrasonido Combinaciones Evitar Incompatibilidad Qumica

Variables determinantes

Partculas slidas Gases disueltos Buffers Impurezas que absorben al U.V. Estabilizantes / antioxidantes Costo y disponibilidad Toxicidad Viscosidad Volatilidad Inflamabilidad Compatibilidad Qumica

Indice de polaridad Fuerzas de dispersin Momento dipolar: Atraccin de Grupos Funcionales Puentes de Hidrgeno:
Donante o receptor de protones

Grupo de Solvente: Lo que resulta determinante en la Selectividad.

COMO SELECCIONAR LA MEJOR COLUMNA PARA OBTENER LOS RESULTADOS DESEADOS

http://www.varianinc.com/image/vimage/docs/cor p/press/imglibrary/shared/high-res/pursuit.jpg

TABLA DE ESCALA CROMATOGRAFICA

Scale Analytical Semi-prep Chromatographic Objectives Just Data (compound ID and concentration) Data and a small amount of purified compound (< 0.5 gram) Larger amounts of purified compound (> 0.5 gram) Manufacturing quantities (gram to kilograms)

Prep Process (Industrial)

Diseos de Columnas para HPLC

SEPARACION CROMATOGRAFICA
El poder de separacin en HPLC se debe a 2 factores: Separacin mecnica y separacin qumica

CARCAZA

PARAMETROS SELECCIN DE COLUMNA S CONTINUACION..

DIAMETRO INTERNO LONGITUD MATERIAL DE LA PARED TIPO DE DISEO

FASE ESTACIONARIA

BASE DE SILICE (pH 2.0-7.5) MATERIAL POLIMERICO (pH 0 14)

FORMA DE LA PARTICULA

IRREGULAR (baja eficiencia y aplicaciones en separaciones preparativas) ESFERICA (1-20 micras, separacin eficiente, poca capacidad de carga, til para separaciones reproducibles)

Uso de Precolumnas
Evitan la retencin irreversible de contaminantes en la columna Pueden aumentar la vida. Algunas logran mejorar la resolucin de la separacin Pueden usarse como estrategia de limpieza de muestra.

PRECOLUMNAS

PARA AUMENTAR LA VIDA DE LAS COLUMNAS SE DEBEN UTILIZAR PRECOLUMNAS LAS CUALES SON DEL MISMO MATERIAL DE LAS COLUMNAS Y RETENDRAN LOS CONTAMINATES QUE SE RETENGAN EN LAS COLUMNAS EL SITIO MAS FRECUENTE EN EL QUE SE COLOCAN SON ENTRE EL INYECTOR Y LA COLUMNA

EN ALGUNAS OCACIONES SE COLOCA ENTRE LA BOMBA Y EL INYECTOR

Preparacin de Muestras

Filtracin Fsica (0,45 micras) Filtracin Qumica

Extraccin con Solventes Cartuchos Sep Pak

OH H
+

Control de pH Control de Temperatura

Degradacin Evaporacin

Variables determinantes

Que compuesto nos interesa cuantificar

Estabilidad Peso molecular

En que matriz A que nivel de concentracin

Es determinante no solo para la preparacin, sino para la deteccin.

PREPARACION DE MUESTRAS
DISOLVER SOMETER A ULTRASONIDO FILTRAR EN 0.45 MICRAS (DURAPORE) INYECTAR

Detectors for HPLC

UV/Vis absorbance (UV/Vis)

Rapid scanning photodiode array

Fluorescence (FL) Refractive index (RI) Electrochemical (ECD) Conductivity Mass spectrometry (MS) Others: FT-IR, Light Scattering, etc.

Post-column or precolumn derivatizations are useful to enhance detection

Ejemplos
Anlisis de cremas y productos semislidos Determinacin de principios activos formulados en aceite Investigacin en extractos vegetales Cuantificacin de Sustancias en material biolgico Cuantificacin de aditivos en polmeros

Ejemplos

Concentracin de trazas
Comn en determinaciones de contaminantes ambientales

Cuantificacin de vitaminas en bases de premezclas Determinacin de Azcares en muestras de caa de azcar o caf

CUANTIFICACION
ESTANDARD EXTERNO ESTANDARD INTERNO ADICION DE ESTANDARES

HPLC APLICACIONES
ANTIBIOTICOS ANALGESICOS VITAMINAS ANTIHISTAMINICOS HORMONAS ANTIBACTERIANOS CATIONES ANIONES AZUCARES METALES PROTEINAS AMINOACIDOS TOXINAS ESTEROIDES TINTAS POLIMEROS ANALISIS BIOQUIMICOS

ESPECTRO U.V. PIRIDOXAL PRODUCTO DE INTERACCION

Y SU

CROMATOGRAMA DE PIRIDOXAL Y SU PRODUCTO DE INTERACCION

Huang, T., et al. (2001). J. Agric. Food Chem. 49: 1559-1563