Universidad Complutense

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA II
GUIA DE PRCTICAS DE

MICROBIOLOGA e INMUNOLOGA
Segundo Curso 2010/2011
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INDICE
NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO ....................................................... 5 EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA..................................................................... 6 ELIMINACIN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO ....................................... 9 PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DEL MATERIAL ................................................. 10 OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS ................................................................. 14 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ................................................................... 22 TIPOS DE SIEMBRAS ................................................................................................ 26 CULTIVO DE ANAEROBIOS....................................................................................... 30 CONTROL MICROBIOLGICO AMBIENTAL............................................................... 32 ANTIBIOGRAMA POR DIFUSION EN AGAR ............................................................... 34 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE Candida albicans.......................................... 38 OBSERVACIN MICROSCPICA DE LOS MICROORGANISMOS DE LA MICROBIOTA ORAL ................................................................................................. 40 ANLISIS E IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS CULTIVABLES DE LA MICROBIOTA ORAL ........................................................................... 41 MEDIOS DE CULTIVO, COLORANTES Y REACTIVOS ............................................... 45 BIBLIOGRAFA .......................................................................................................... 48

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

- El acceso al laboratorio de prcticas slo se permite a los alumnos que estn realizando las prcticas. No se admiten visitas por razones de seguridad. - Los laboratorios de investigacin son de acceso restringido al personal del Departamento. - Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre que se est trabajando en el laboratorio. Durante el periodo de prcticas, la bata no debe utilizarse fuera del laboratorio. - Debe respetarse la prohibicin de beber, comer, masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca ningn objeto (bolgrafos...) o tocarse los ojos y nariz.. - En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningn momento ropa u objetos personales. - Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del material asignado, as como de los microscopios que haya usado. - Se deben usar los mecheros Bunsen con precaucin, no dejando material inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobar que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al abandonar el laboratorio. - Est prohibido pipetear con la boca. - Ante un vertido accidental de material microbiolgico debe informarse inmediatamente al profesor encargado del grupo. - No se debe forzar un tubo de vidrio o la apertura de un frasco sin tener protegidas las manos. - No se manejarn los autoclaves o el material recin esterilizado si no se dispone de guantes apropiados. - La eliminacin de residuos, material desechable y material reciclable se realizar siguiendo las pautas de la prctica 1, utilizando los contenedores dispuestos a tal efecto. - Se deben lavar las manos con jabn antisptico ante cualquier sospecha de contaminacin y siempre antes de marcharse del laboratorio.

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
Para trabajar en un laboratorio de Microbiologa se requieren unas tcnicas especficas y diferentes de las que se utilizan en otras disciplinas. Es imprescindible trabajar en condiciones aspticas: el material e instrumental que se va a utilizar, as como los medios de cultivo, deben ser sometidos a algn procedimiento de esterilizacin, eliminndose de ellos cualquier posible microorganismo. Para mantener las condiciones de esterilidad, debemos trabajar en campana de flujo laminar o en la proximidad de la llama de un mechero Bunsen. En el laboratorio, el trabajo con microorganismos suele realizarse utilizando cultivos axnicos o puros, es decir, que contienen organismos de una sola especie microbiana. La posibilidad de contaminacin est siempre presente porque los microorganismos se encuentran en todos los ambientes: en el aire, en el agua, en nuestra piel y, en general, en todo lo que tocamos. Para evitar las contaminaciones hemos de observar las siguientes normas: El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estriles. Los tubos o matraces deben ser tapados con algodn hidrfobo estril o cubiertos con un capuchn metlico, para impedir la entrada de microorganismos. Si se usan placas de Petri deben mantenerse tapadas mientras no se estn manipulando. Los instrumentos que van a entrar contacto con el medio de cultivo, con distintos recipientes o con microorganismos en estudio (asa siembra, pipetas, etc) deben previamente esterilizados. en los los de ser

uso:

Materiales empleados y forma de

Pipetas Pasteur: Son generalmente de vidrio y se utilizan para la transferencia de cultivos lquidos, diluciones de suero, etc con ayuda de un chupete de goma u otro sistema de aspiracin mecnica. Pueden utilizarse, con el extremo inferior cerrado, en sustitucin del hilo de siembra, cuando se 6

Instrumentos para siembra de microorganismos A: Asa de siembra B: Hilo de siembra C: Pipeta Pasteur D: Cayado

Asa e hilo de siembra: Antes de su utilizacin, se esterilizan sometindolos a la accin de la llama de un mechero hasta que el filamento quede incandescente. Luego se flamear la parte inferior del filamento. Una vez utilizados, deben flamearse de nuevo con el objeto de eliminar los microorganismos que quedan en ellos.

realizan siembras en el interior del agar (en profundidad). Para ello se sella previamente el extremo de la misma con la llama del mechero. Varillas de vidrio macizo acodadas (cayados): Sirven para distribuir los microorganismos de la muestra sobre la superficie del medio de cultivo contenido en una placa de Petri. Se utilizarn previamente esterilizadas, impregnndolas en alcohol y pasndolas posteriormente por la llama del mechero. Tambin, pueden hacerse usando una pipeta Pasteur, sellando el extremo de la misma y acodndola con la llama del mechero. Pipetas graduadas de vidrio o plstico: Se suministran ya estriles a los alumnos, dentro de estuches metlicos o bien empaquetadas de forma individual (envueltas en papel satinado o plstico para mantener su esterilidad), en cualquier caso deben abrirse cerca de la llama del mechero. La pipeta, si es de cristal, y por lo tanto reciclada, debe flamearse ligeramente antes de ser usada. Las pipetas llevan un algodn en la boquilla, que acta como filtro, para evitar la contaminacin y para impedir la llegada de lquido al sistema de succin. Dicho algodn debe permanecer en la boquilla durante el uso. Bajo ningn concepto se debe pipetear con la boca una muestra microbiolgica. Para pipetear suspensiones de microorganismos se utilizan chupetes o pipeteadores ms o menos sofisticados, como son las peras de goma provistas de vlvulas que permiten controlar la succin y el dispensado de los lquidos o los dispositivos semejantes a jeringas en los que se coloca la pipeta y que operan por medio de un mbolo o con ayuda de bombas elctricas.
Pipetas A: Pipeta automtica de 0,21 ml B: Pipeta automtica de 0,020,2 ml C: Pipeta de vidrio de 10 ml D: Pipeta de vidrio de 1 ml

A B C

D
Tubos de ensayo con cultivos problema y placas Petri: Se destapan cerca de la llama del mechero utilizando para ello slo los dedos que quedan libres en la mano que sostiene el asa de siembra. Se flamea la boca del tubo, se toma una pequea muestra del cultivo con asa de siembra estril, previamente atemperada, y tras flamear de nuevo la boca del tubo colocamos el tapn. Todo el proceso se realiza cerca de la llama. Si el medio es lquido, se debe agitar el tubo antes de tomar la muestra, porque los microorganismos tienden a sedimentar. En el caso de que el medio sea slido (tubos de agar inclinado y placas Petri), la muestra se obtendr rozando ligeramente con el asa la zona en la que se aprecia masa microbiana. Los tubos y las placas deben permanecer abiertos el menor tiempo posible con el fin de evitar contaminaciones. Medios de cultivo: Pueden ser lquidos, slidos y semislidos. Se distribuyen en matraces, tubos de ensayo y placas de Petri. Estas ltimas slo llevan medio slido. Su preparacin y esterilizacin se describe mas adelante. 7

La composicin de los medios, colorantes y reactivos utilizados en prcticas se describe en el anexo del final de la gua.

El asa se coge del mango como si fuera un lpiz.

La boca del tubo se flamea despus de abrir y antes de cerrar

El tapn se maneja con el meique de la mano derecha.

Toda la operacin se realiza cerca del mechero Bunsen

Manejo del asa de siembra durante una inoculacin.

ELIMINACIN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO

En Microbiologa es importante recordar la necesidad de una pulcra y esmerada limpieza del material, as mismo, es muy importante la recuperacin del material reciclable y la eliminacin del material desechable. Todos los objetos sucios o contaminados deben recogerse en recipientes adecuados, provistos de tapa. El material de vidrio, tubos, matraces y pipetas, se separa del resto del material recogindose en un contenedor vertical u horizontal lleno de una solucin desinfectante, como por ejemplo una solucin diluida de leja, en la que permanecer antes de su lavado durante 24 horas. Como los objetos contaminados contienen, con frecuencia, cantidades importantes de materia orgnica (procedente de los medios de cultivo) que protegen a los microorganismos de los agentes fsicos o qumicos utilizados en la descontaminacin de los mismos, no puede asegurarse la total destruccin de las formas vegetativas y mucho menos de las esporas. Por ello, se recomienda utilizar mayores concentraciones de desinfectante y tiempos ms largos de tratamiento que para la desinfeccin o la esterilizacin de material limpio. Generalmente se utiliza el autoclave para la descontaminacin de instrumentos, equipos y material que sean estables al calor, as como de material desechable. A tal objeto se coloca este material en recipientes adecuados y se introducen en el autoclave sometindolos a la accin del vapor de agua a 1 atmsfera de sobrepresin (121 C) en ciclos ms prolongados de lo habitual (1 hora en lugar de hacerlo durante 30 minutos). Una vez efectuado este tratamiento, se procede a su lavado para eliminar toda materia extraa, sumergiendo el material en agua caliente jabonosa o utilizando detergentes, mezcla crmica o cualquier otro procedimiento enrgico, tanto mecnico como qumico. Se aclara bien con abundante agua y se deja escurrir y secar a temperatura ambiente. En el caso de las pipetas, y antes de ser lavadas, debe extraerse con ayuda de un alambre o pinzas especiales, el trozo de algodn que tienen en la boquilla. Algunos de los objetos sucios y contaminados (portas, pipetas, etc), despus de lavados, se sumergen en una mezcla sulfocrmica donde se dejan 24 horas al cabo de las cuales se lavan con agua y se dejan escurrir. Los portas se secan con un pao de hilo limpio, procurando que no queden hilazas sobre la superficie. El material que contiene colorantes se trata, segn las condiciones del material, durante un tiempo variable con una solucin que puede ser de cido clorhdrico, ntrico o mezcla sulfocrmica. El resto del material (tubos de plstico, jeringas, etc) se trata con distintas soluciones desinfectantes como hipoclorito sdico, formol, etc, pero debe recordarse que se utilizan a concentraciones superiores a las utilizadas con otros fines.

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DEL MATERIAL

Introduccin: En Microbiologa se define esterilizacin como la destruccin o eliminacin total de todos los microorganismos vivos en un objeto o material, incluidas las endosporas bacterianas. La esterilidad es un estado absoluto, no hay grados de esterilidad. El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado: El material de vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc, se cierran con algodn graso o tapones metlicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos. Adems, cuando se usa algodn, ha de cubrirse ste con un papel impermeabilizado. En el caso de las pipetas, se les coloca en la boquilla un trocito de algodn que actuar como filtro, evitando la contaminacin del operario con los microorganismos de la muestra y que ste a su vez contamine la muestra. Una vez preparadas, se introducen en estuches o cajas metlicas, o bien se envuelven individualmente en papel satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de vidrio se esteriliza con calor seco, generalmente en un horno Pasteur. El material de plstico desechable ya se suministra estril y listo para su uso. Por ejemplo, las placas de Petri se introducen en bolsas de plstico selladas y se esterilizan con xido de etileno o radiaciones. Las soluciones y medios de cultivo lquidos se envasan en matraces o tubos y se esterilizan, generalmente, en autoclave. Existen varios mtodos para llevar a cabo el proceso de esterilizacin y la eleccin de uno determinado viene condicionado por el tipo de material que se quiere esterilizar. Objetivos: Conocer de la importancia de la esterilizacin y familiarizarse con el manejo de los procedimientos ms frecuentemente utilizados para llevarla a cabo. Material: Mechero Bunsen, horno Pasteur o estufa de aire caliente, autoclaves, equipos de filtracin y materiales a tratar. Tcnicas: El mtodo ms comnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor, entre otras razones porque es el ms econmico y el ms fcil de controlar. El calor utilizado en con este fin puede aplicarse en forma de calor seco o de calor hmedo. El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidacin y se requieren temperaturas muy elevadas. El calor hmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores, ya que la 10

presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrgeno responsables de la estructura terciaria de las protenas, haciendo que stas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad. La esterilizacin por calor seco puede hacerse por flameado o mediante estufas de aire caliente. I) Flameado: Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas, esptulas, etc. Consiste en someter directamente a la accin de la llama de un mechero Bunsen los utensilios que se vayan a esterilizar. Este mtodo es rpido y su eficacia es altsima, sin embargo no se puede aplicar a objetos termolbiles. II) Esterilizacin por aire caliente: Se lleva a cabo en estufas de aire caliente y consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se contaminen una vez esterilizados, en el interior de una estufa. Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio: pipetas, matraces, tubos, etc. u otros materiales termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy elevadas (160180C durante cerca de 2 horas). Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar lquidos (como medios de cultivo), ya que al llegar a los 100C comenzaran a hervir y continuaran hirviendo sin elevar su temperatura por encima del punto de ebullicin del agua a presin atmosfrica, y a esta temperatura las endosporas bacterianas pueden sobrevivir durante horas. Pero incluso en muestras en las que supisemos que no existen endosporas, esta metodologa puede implicar cambios en la concentracin de los componentes del medio, a causa de la fuerte evaporacin sufrida. El calor hmedo tambin se utiliza para la destruccin de los microorganismos siendo, como ya se ha comentado, a igual temperatura, mucho ms eficaz que el calor seco; con este tratamiento las enzimas se desnaturalizan rpidamente, al igual que las membranas celulares. Adems, el vapor de agua, especialmente si se genera a sobrepresin, es un eficaz transmisor de calor al interior de la clula microbiana. Se puede aplicar utilizando varios mtodos: ebullicin, vapor fluente y vapor saturado a presin: I) Ebullicin: El agua hirviendo (100C) tiene accin limitada, ya que aplicada durante 10 minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. Se podra utilizar el bao Mara o bao de agua hirviente (slo con fines de desinfeccin en el laboratorio), cuando no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros mtodos mejores, tanto para material (pinzas, tijeras, escalpelos, etc) como para medios de cultivo que no puedan esterilizarse en autoclave. II) Vapor fluente: Esta tcnica se emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo que no se puedan someter a una temperatura superior a 100C sin que pierdan alguna de sus propiedades, como leche, azcares, suero, etc. Se utiliza un autoclave a presin atmosfrica, con la espita abierta, donde nunca se superan los 100C, y se realiza el proceso durante tres das consecutivos, dejndose a temperatura ambiente en los intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100C) durante 30-45 11

minutos destruyndose en este proceso las formas vegetativas pero no las endosporas termorresistentes. Si stas se encuentran presentes en la muestra germinan despus del calentamiento y estas formas vegetativas sern destruidas en los siguientes ciclos. Este mtodo de esterilizacin se denomina tambin esterilizacin fraccionada o tindalizacin. III) Vapor saturado a presin: La esterilizacin por esta tcnica utiliza vapor de agua saturado que se somete a una atmsfera extra de presin sobre la presin atmosfrica normal, elevndose con ello el punto de ebullicin del agua de 100C a 121C y consiguindose la destruccin de todos los microorganismos (salvo los termfilos extremos) en un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta temperatura es tambin necesaria para la destruccin de las endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia trmica y que pueden sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100C durante horas. El vapor de agua difunde por smosis a travs de las membranas de las esporas, coagulando su protoplasma, fenmeno que se acenta si el vapor es saturado y a sobrepresin. Esta tcnica de esterilizacin requiere el uso del autoclave. El autoclave permite elevar la presin una o dos atmsferas sobre la presin atmosfrica, elevndose con ello la temperatura de ebullicin del agua que se encuentra en su interior. Consta de un recipiente metlico, generalmente de acero inoxidable, similar a una gran olla, en cuyo interior se introduce el material a esterilizar que se coloca sobre una rejilla o placa Autoclave de cuba horizontal agujereada. Despus de cerrar cuidadosamente la tapa, se conecta la fuente de calor y comienza a elevarse la temperatura en su interior. La salida continua del chorro de vapor a travs de la vlvula nos indica que el aire contenido en el interior del autoclave ha sido eliminado. La eliminacin de este aire es importante ya que la difusin del calor entre el vapor de agua y el aire es pobre, por lo que no se alcanzar la temperatura esperada a la presin elegida y no se conseguir la esterilizacin. La vlvula se cierra cuando slo sale vapor de agua y, a partir de ese momento, comienza a elevarse la presin hasta una atmsfera sobre la presin normal, elevndose como consecuencia la temperatura hasta 121C. Transcurridos 15-20 minutos, en estas condiciones, el material se ha esterilizado. Es el incremento de temperatura por encima de los 100C y no la presin la que destruye los microorganismos. Si se esterilizan volmenes grandes de lquidos, es necesario mantener el material en el autoclave durante perodos de tiempo ms prolongados, pues se tarda ms en alcanzar los 121C en el centro de un gran volumen. Una vez transcurrido el tiempo necesario, se apaga el autoclave y se deja descender la temperatura hasta que el indicador marque menos de 80C, que ser cuando la presin haya descendido hasta presin atmosfrica. Se abre ligeramente la espita para comprobar que no queda vapor a presin en el interior y ya se puede proceder a retirar todo el material esterilizado, dejndolo enfriar a temperatura ambiente. 12

El autoclave se utiliza para esterilizar medios de cultivo, instrumentos, ropas, soluciones, jeringas, etc que puedan soportar altas temperaturas y una atmsfera de sobrepresin. Para la esterilizacin de materiales lquidos sensibles al calor, como algunos medios de cultivo, soluciones de antibiticos, enzimas, vacunas, etc, o tambin para gases, se utiliza la filtracin. En la esterilizacin por calor se destruyen los microorganismos del medio, mientras que la filtracin los retira de una forma mecnica, en lugar de destruirlos. La filtracin es el paso de un lquido o gas a travs de un material filtrante, con poros lo suficientemente pequeos como para retener clulas microbianas. Los filtros que se utilizan en la actualidad son, generalmente, los denominados filtros de membrana y estn integrados por pequeas piezas de material sinttico, generalmente acetato de celulosa o policarbonato, que pueden tener poros con tamaos de 0,22 y 0,45 m, diseados para retener bacterias. La accin combinada de los poros, la trama del filtro y la naturaleza qumica del material utilizado retiene los microorganismos, pero no el fluido. Los fluidos que se van a filtrar pasan a travs de la membrana con la ayuda del vaco generado, por ejemplo, con una bomba de vaco. Tanto los filtros de membrana como los equipos de filtracin con los que stos se usan deben ser esterilizados por otros mtodos, generalmente el autoclave. Los virus y algunas bacterias de tamao muy pequeo como, por ejemplo, los micoplasmas, no son retenidos por los filtros habituales.

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OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS
Introduccin: La morfologa de los microorganismos puede examinarse de dos formas: observando microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando clulas muertas teidas con colorantes. El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas de sus caractersticas (morfologa, tamao, movimiento, etc). Sin embargo, las microorganismos vivos son casi incoloros y no se pueden visualizar fcilmente al microscopio ptico normal cuando se encuentran suspendidos en agua, de ah que se utilicen colorantes para incrementar su contraste con el entorno que los rodea y de esta forma hacerlos visibles. Los colorantes son compuestos aromticos solubles en agua (generalmente en forma de sales), que contienen un in orgnico coloreado y otro in inorgnico. Pueden dividirse en dos grupos: cidos y bsicos. El colorante es cido si la porcin coloreada tiene carga negativa, es decir, si tiene un anin coloreado, siendo en este caso repelido por estructuras de la clula que presenten la misma carga, como es el caso de la superficie bacteriana. El colorante se denomina bsico si la porcin coloreada es el catin, cargado positivamente y con afinidad por estructuras de la clula con carga negativa, como es la superficie celular. Las bacterias toman mejor los colorantes bsicos, como son el cristal violeta, el azul de metileno y la safranina. La eosina es un colorante de tipo cido, as como la nigrosina.

EXAMEN EN FRESCO Objetivo: Observar microorganismos vivos en el microscopio de campo claro. Estudiar su morfologa y agrupacin, apreciar las diferencias de tamao entre organismos procariticos y eucariticos y aprender a diferenciar el movimiento browniano de la movilidad de los microorganismos. Material: Asa de siembra, portaobjetos y cubreobjetos (o portaobjetos excavados), cultivos de microorganismos (Proteus mirabilis y Saccharomyces spp.) y microscopio. Tcnica: Para la observacin de microorganismos sin teir se pueden utilizar dos tipos de preparaciones: montaje hmedo y montaje en gota pendiente. En el primer caso, depositar una gota de la muestra tomada con asa de siembra previamente flameada, en un portaobjetos y colocar sobre la misma un cubreobjetos presionando suavemente. 14

En el segundo caso, depositar una gota de la muestra en el centro de un cubreobjetos limpio y colocarlo invertido sobre el pocillo de un portaobjetos excavado, de manera que la gota no se mueva ni tome

contacto con los lados o el fondo de la depresin. Utilizar el microscopio con el objetivo de 40 aumentos, disminuyendo la cantidad de luz incidente sobre la muestra con ayuda del diafragma o bajando el condensador. Un exceso de luz dificultar la observacin de los microorganismos, ya que poseen el mismo ndice de refraccin que el medio circundante (el vidrio del portaobjetos y el lquido en el que se encuentran suspendidos). Si se utiliza el objetivo de inmersin se debe colocar una gota de aceite de inmersin sobre el cubreobjetos. Para reducir la evaporacin de la muestra con el calor desprendido por el foco luminoso y que los microorganismos pierdan su movilidad, debe realizarse la operacin rpidamente o bien sellar los bordes del cubreobjetos con parafina. Observar la forma y el tamao de los microorganismos, comparando las levaduras (clulas eucariticas) con las bacterias (clulas procariticas). Describir su movilidad, diferenciando el movimiento browniano, debido a la colisin de los microorganismos con las molculas del lquido que los rodea, de la verdadera movilidad. La movilidad se manifiesta por el desplazamiento de los microorganismos a grandes distancias y en una direccin determinada, aunque a veces pueden apreciarse rotaciones o giros. Los desplazamientos cortos y sin sentido se deben al movimiento browniano.

TINCIN DE LOS MICROORGANISMOS Existen distintos tipos de tincin: 1.-Tincin simple: Aquella en la que slo se utiliza un colorante, que generalmente tie a los microorganismos. Este tipo de tincin se denomina directa. Si el colorante proporciona una coloracin al fondo, sin alterar el aspecto de las clulas, que permanecen sin teir, la tincin se denomina negativa. La tincin simple permite observar morfologa celular, tamao y agrupacin de los microorganismos. 2.-Tincin diferencial: Es aquella que emplea secuencialmente dos colorantes que permiten distinguir tipos de microorganismos en funcin de diferencias en su estructura y composicin qumica. La tincin de Gram y la cido-alcohol-resistente, basadas en las propiedades de la pared celular bacteriana, son las ms utilizadas.

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3.-Tincin estructural: Se utiliza para identificar y estudiar determinadas estructuras que pueden estar presentes en los microorganismos. En las tinciones estructurales se colorea nicamente una parte de la clula. Se utilizan este tipo de tinciones para poner en evidencia la presencia de cpsulas, endosporas, flagelos o inclusiones (almidn, polifosfato, etc.). Tcnica general: En la mayora de los casos, los pasos a seguir son los que se indican a continuacin: Tcnica de extensin de una muestra sobre portaobjetos.

Realizar una extensin con el asa de siembra esterilizada, para ello se toma una pequea gota de cada uno de los cultivos y se extiende en un portaobjetos limpio. Si el cultivo procede de un medio slido, se coloca una gota de agua en el portaobjetos y se mezcla con una pequea porcin de la muestra hasta formar una suspensin homognea, extendindola con el fin de obtener una fina pelcula. Posteriormente, se deja secar al aire o en la parte alta de la llama del mechero, pero no se debe eliminar el lquido calentando el portaobjetos a la llama porque pueden distorsionarse las clulas. Fijar la muestra. La fijacin tiene como finalidad coagular el protoplasma de las clulas y hacer que se adhieran al portaobjetos, siendo el calor el mtodo ms utilizado para la fijacin, aunque pueden utilizarse otros agentes, como el alcohol (metanol) u otros compuestos qumicos. La fijacin con calor se recomienda cuando se trabaja con muestras de un cultivo slido; en muestras obtenidas de un cultivo lquido es mejor hacer la fijacin con metanol ya que se retienen en el portaobjetos un mayor nmero de clulas. Es necesario que la extensin se haya secado antes de proceder a la fijacin, por ello se debe esperar hasta que el lquido de la misma se evapore. La fijacin por calor se lleva a cabo pasando varias veces la preparacin seca a travs de la llama de un mechero, con la extensin hacia arriba. El calor desnaturaliza las protenas y suele matar al microorganismo. Es importante no excederse en este proceso, para evitar que las bacterias se deformen o se rompan, siendo suficiente que el portaobjetos se note caliente sobre el dorso de la mano, pero no demasiado. Realizar la coloracin. Para ello es necesario cubrir la preparacin con abundante colorante y dejarlo actuar durante algn tiempo. Pasado ese tiempo, lavar con agua las preparaciones teidas para eliminar el exceso de colorante, dejando caer con suavidad el agua sobre un extremo del portaobjetos, que se mantendr inclinado durante este proceso. No se 16

Procedimiento general para realizar una tincin

debe dirigir el agua con demasiada fuerza sobre la preparacin para no arrastrar la muestra. Eliminar el exceso de agua del portaobjetos golpendolo ligeramente por el canto; este proceso debe realizarse con cuidado. Permitir que se seque la preparacin, bien utilizando un papel secante, sin frotar o bien dejndola secar al aire, aunque lleva ms tiempo. Examinar la preparacin al microscopio, con el objetivo de inmersin (100x), colocando, previamente, una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin.

TINCIN SIMPLE Objetivo: Estudiar las caractersticas de los microorganismos en cultivo, es decir, tamao, forma y agrupacin de las clulas. Material: Asa de siembra, portabojetos, cultivos bacterianos de microorganismos (Escherichia coli y Staphylococcus aureus), colorantes, microscopio y aceite de inmersin. Tcnica: Preparar extensiones de los distintos microorganismos, dejar secar al aire y proceder a su fijacin. Realizar la coloracin cubriendo la preparacin con abundante colorante y dejarlo actuar durante algn tiempo. Para la fuchsina fenicada bastan de 15 a 30 segundos, para el cristal violeta es suficiente de 30 a 45 segundos y para el azul de metileno de 3 a 5 minutos. Lavar con agua las preparaciones teidas y continuar con la tcnica tal y como se indica previamente. Examinar la preparacin al microscopio con el objetivo de inmersin. Observar la forma y disposicin de los microorganismos teidos con el colorante.

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TINCIN NEGATIVA Objetivo: Conocer la morfologa de los microorganismos, realizando una coloracin del fondo, sin que se coloreen las bacterias o las estructuras que se tratan de observar. Material: Asa de siembra, portaobjetos, cultivo bacteriano de microorganismos (Escherichia coli y Staphylococcus aureus), nigrosina al 10%, microscopio y aceite de inmersin. Tcnica: Depositar una gota de la suspensin de microorganismos, con el asa de siembra previamente esterilizada, sobre un portaobjetos Aadir una gota de solucin de nigrosina al 10%. Mezclar totalmente y dejar secar al aire. Hacer una extensin en otro portaobjetos mezclando una cierta cantidad de sarro dentario, extrado recientemente con un palillo estril, con una gota de solucin de nigrosina, hasta conseguir una suspensin homognea. A continuacin dejar secar al aire. Examinar las dos preparaciones con el objetivo de inmersin. Los microorganismos aparecern sin teir, en contraste con el fondo oscuro, pudindose apreciar su forma y agrupacin caractersticas. TINCIN DIFERENCIAL La tincin diferencial colorea selectivamente ciertos tipos de clulas, ya que los colorantes que se utilizan reaccionan de modo diferente con los distintos microorganismos, generalmente debido a diferencias en la estructura y/o composicin qumica de la pared celular de stos. Estas tcnicas son de gran inters en la identificacin y la clasificacin de las bacterias, y la ms utilizada es la tincin de Gram. Tincin de Gram: Es uno de los procedimientos de tincin ms tiles en la identificacin de microorganismos, ya que divide a stos en dos grandes grupos: Gram positivos y Gram negativos. En esta tcnica es necesario utilizar varias soluciones: 1.- Un primer colorante bsico, generalmente cristal violeta, que se aplica sobre la muestra y que reacciona con las clulas (cargadas negativamente), colorendolas. 2.- Un mordiente, que incrementa la afinidad entre el primer colorante y las clulas. Parece ser que el mordiente (solucin diluida de yodo) se combina con el colorante, para formar un compuesto insoluble coloreado en el interior de la clula. 18

3.- Un agente decolorante, como el etanol de 95% o la mezcla alcoholacetona (1:1), que son disolventes orgnicos capaces de eliminar el primer colorante de algunas bacterias, decolorndolas. 4.- Un colorante de contraste, igualmente de carcter bsico pero de distinto color que el primer colorante. Generalmente se suele utilizar la safranina, de color rosa, que contrasta con el color violeta del primer colorante, y que teir slo a las bacterias decoloradas en el paso anterior. Los organismos que resisten la decoloracin y retienen el complejo cristal violeta-yodo aparecern de color violeta oscuro al microscopio y se denominan Gram positivos. Aquellos que pierden el color inicial del cristal violeta tras la decoloracin, se clasifican como Gram negativos y toman el color rosa debido al segundo colorante, la safranina. Las diferencias qumicas en sus paredes celulares, son las que permiten o no la salida del complejo cristal violeta-yodo. Las bacterias Gram positivas tienen una pared celular gruesa, compuesta principalmente por peptidoglucano, mientras que en Gram negativas, aunque la pared est tambin constituida por pptidoglucano, es ms delgada y presenta adems una membrana externa con lipopolisacridos. Las paredes de las bacterias Gram positivas tratadas con alcohol sufren una deshidratacin y sus poros se contraen, dificultando la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las Gram negativas, el alcohol desorganiza la capa lipdica ms externa y lava el colorante de la delgada capa de peptidoglucano. La tincin de Gram es ms reproducible cuando se aplica a cultivos jvenes de bacterias, ya que las bacterias Gram positivas, en la fase estacionaria de crecimiento, pueden aparecer como Gram negativas. Objetivo: Aprender una tcnica de coloracin diferencial e interpretar los resultados obtenidos en la misma, distinguiendo bacterias Gram positivas y Gram negativas. Material: Asa de siembra, portaobjetos, cultivos bacterianos de microorganismos (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Neisseria spp.), colorantes, solucin de lugol, etanol de 95%, microscopio y aceite de inmersin. Tcnica: Preparar extensiones de los distintos microorganismos, que debern encontrase en fase exponencial de crecimiento. Dejar secar al aire y proceder posteriormente a la fijacin, siguiendo la tcnica ya descrita. Para la coloracin se seguir el siguiente protocolo (modificacin de Hucker): Teir durante un minuto con la solucin cristal violeta. Lavar el exceso de colorante con agua. 19

Cubrir la extensin con una solucin diluida de yodo (lugol), que actuar como mordiente, durante un minuto. Lavar con agua el exceso de lugol. Decolorar con etanol de 95%, cubriendo la preparacin y dejando actuar durante 30 segundos. Lavar con agua abundante para eliminar el resto del disolvente. Colorear con safranina durante un minuto (coloracin de contraste). Lavar con agua y dejar que la preparacin se seque. Examinar las preparaciones al microscopio, con aceite y usando el objetivo de inmersin. Las bacterias Gram positivas aparecern coloreadas de violeta, mientras que las Gram negativas se observan de color rosa. A B

Ejemplos de morfologa bacteriana al microscopio ptico A. Staphylococcus en tincin Gram B. Escherichia en tincin simple. C. Bacillus en tincin Gram. D. Bacillus en tincin negativa.

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
Introduccin: En la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axnicos o puros. Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene un slo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola clula; el crecimiento de sta origina, en medio slido, una masa de clulas fcilmente visible que recibe el nombre de colonia. Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin microbiana mixta, se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utiliz diluciones seriadas en medio lquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminacin, es decir, de microorganismos no deseados, dificult el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios slidos, complementados con agar, y las placas de Petri en Bacteriologa, permitiendo as la separacin fsica de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas. Objetivos: Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las tcnicas de aislamiento en placa de Petri. Obtener colonias separadas, utilizando uno o ms mtodos. Estudiar la morfologa de cada colonia. Material: Asa de siembra, cayado, placas de Petri con medio de cultivo slido y cultivo de microorganismos. Tcnicas: Existen distintas tcnicas que pueden ser usadas: a) Extensin en superficie con cayado: Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota 0,1 ml de una determinada dilucin del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que est completamente seco. Incubar la placa, en posicin invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 72 horas) segn el tipo de microorganismo. La posicin invertida evitar que el agua de condensacin se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtencin de colonias aisladas.

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Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado.

Serie de diluciones conocidas de la muestra

Cayado

Siembra por extensin en superficie para recuento.

b) Estra mltiple en superficie: Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no daar el agar. Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posicin invertida.

Carga (1 estra)

Primera diseminacin

Segunda diseminacin

(2 estra) Tcnica de aislamiento por estra en superficie

(3 estra)

ltima diseminacin

(4 estra)

Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado nmero de bacterias. c) Dilucin en masa: En una placa de Petri vaca se deposita un pequeo volumen conocido de muestra y a continuacin se aade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido 23

y atemperado aproximadamente a 45C. Se mezclan ambos por rotacin suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirn de forma homognea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar. Otra variacin de esta tcnica consiste en inocular el medio de cultivo, fundido y atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de la muestra. La homogeneizacin de la muestra y el medio de cultivo se realiza por rotacin del tubo entre las manos, antes de verterlo sobre la placa. En ambos casos, trs homogeneizacin, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique el medio y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posicin invertida). Aunque con esta tcnica se obtienen colonias aisladas, generalmente slo se utiliza para determinar el nmero de microorganismos viables en una muestra, cuando stos son anaerobios facultativos o microaerfilos.

Inculo calibrado

Medio fundido atemperado

Homogeneizar Siembra por dilucin en masa o inclusin en agar

Resultados: a) Extensin en superficie: Tras el perodo de incubacin se examinarn las placas. Las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se ha realizado de forma correcta. Podrn diferenciarse las colonias de acuerdo a su tamao, forma, color, textura, etc. Esta tcnica de siembra, adems de permitir que se distingan las colonias por su morfologa, permite el recuento de microorganismos viables. La expresin de este recuento se hace en unidades formadoras de colonias (UFC) ya que cada una procede de un slo microorganismo (o de un grupo de microorganismos, pues en algunos casos stos tienden a formar agregados). A partir de las colonias aisladas, los microorganismos pueden transferirse a otros medios de cultivo para su estudio. b) Por estra mltiple en superficie: Tras la incubacin, se observarn las colonias aisladas en alguna regin de la placa inoculada. Con esta tcnica se logra la separacin de los microorganismos que se encuentran en un cultivo mixto, o bien que proceden de muestras homogneas, pero en las que existe un elevado nmero. 24

En las zonas donde existen colonias aisladas se puede estudiar la morfologa colonial. c) Dilucin en masa: Aparecen las colonias distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que estn en la superficie tendrn distintas caractersticas, dependiendo del tipo microbiano, mientras que las colonias que se desarrollan en el interior, bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular, aunque los microorganismos que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las colonias que aparecen en la profundidad del agar son siempre biconvexas y no se diferencian unas de otras por su morfologa.

Aislamiento por estra en superficie

Aislamiento por dilucin en masa

Forma
Puntiforme Circular

Borde
Entero

Elevacin
Plana Elevada Convexa

Superficie
Lisa o rugosa Mate o brillante Seca o cremosa

Ondulado Rizoide Lobulado Irregular Filamentosa Filamentoso

Crateriforme Acuminada

Invasiva o superficial

Aspectos ms comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio slido.

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TIPOS DE SIEMBRAS
Objetivos: Aprender a inocular distintos medios de cultivo contenidos en tubo: caldo, agar inclinado y medio semislido sembrado en profundidad. Observar el crecimiento bacteriano en los distintos medios de cultivo. Observar el crecimiento de microorganismos en ausencia de oxgeno. Comprobar la movilidad de determinados microorganismos. Material: Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteur o pipetas graduadas, suspensin de microorganismos y tubos con medio de cultivo lquido, slido inclinado y semislido. Tcnica: a) En medio lquido con asa: Transferir aspticamente, con el asa de siembra, una pequea muestra de los microorganismos, desde el tubo que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estril. Sumergir el asa en el lquido y agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recin sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperatura ptima de crecimiento.

Muestra

Inoculacin

Incubacin

Inoculacin de un caldo de cultivo (ver tambin figura III, pg. 5).

b) En medio lquido con pipeta: Introducir aspticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduada en el medio lquido que contiene los microorganismos y, aspirando de forma adecuada, sacar una cantidad establecida de material que se transfiere al tubo con medio de cultivo estril. Incubar en estufa durante 24-48 horas a la temperatura ms adecuada. c) En medio slido (agar inclinado): Con el asa de siembra estril tomar los microorganismos de la muestra e inocular el tubo realizando un movimiento de zig-zag en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba por el rea inclinada. Incubar en estufa durante 28-48 horas a la temperatura ms adecuada. 26

Siembra en zig-zag en la superficie Asa de siembra

Muestra

Medio (agar inclinado)

Siembra en un tubo de agar inclinado

d) En medio semislido: La siembra en este tipo de medio, que contiene una proporcin menor de agar que los medios slidos y que se envasa en tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado, con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirndolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar la picadura. Una siembra con asa o con un cierto movimiento de vaivn podra originar un patrn de crecimiento que se interpretara errneamente como movilidad bacteriana. Incubar durante 24-48 horas a la temperatura ptima de crecimiento.

Puncin limpia

Filamento Inoculacin de un medio semislido por picadura con hilo de siembra. dedededsiembrafil amento

Muestra

Medio (agar semislido)

Resultados: a y b) En los cultivos lquidos no tiene lugar la formacin de colonias, por lo tanto se examinar la existencia de enturbiamiento ms o menos intenso, la formacin de una pelcula o velo sobre la superficie, la aparicin de sedimento 27

en el fondo del tubo, etc. La utilizacin de medios de cultivo lquidos permite la obtencin de una poblacin microbiana grande, con un elevado nmero de microorganismos, para ser utilizados posteriormente. c) En medio slido (agar inclinado) se observar el aspecto general del medio y la aparicin de crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Adems, se utiliza para almacenar cultivos durante cortos perodos de tiempo, a temperaturas de 4C. d) En medio semislido se podr comprobar si el microorganismo es o no mvil, ya que en el primer caso se observar que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura, detectndose turbidez. Por eso es tan importante que, cuando se inocula el medio de cultivo, no se distorsione el agar y se vuelva a sacar el hilo por el mismo sitio de inoculacin. Los microorganismos inmviles crecern nicamente a lo largo de la picadura. Este tipo de siembra en picadura sirve, tambin, como otro de mtodo de conservacin de microorganismos anaerobios facultativos.

Aspecto de cultivos en agar inclinado (A) y semislido (B) tras la incubacin.

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Prueba de movilidad en agar semislido. 1. Microorganismo mvil, 2. Microorganismo inmvil 3. Tubo control sin inocular

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CULTIVO DE ANAEROBIOS
Objetivo: Conseguir el crecimiento de microorganismos anaerobios, en ausencia de oxgeno, utilizando diversas tcnicas. Material: Asa de siembra, medios de cultivo (segn la tcnica utilizada), parafina estril, jarra de anaerobiosis y suspensin de Clostridium. Para comparar el tipo respiratorio, se emplearn tambin otros microorganismos que no sean anaerobios estrictos, como Escherichia coli y Micrococcus luteus. Tcnicas: a) Siembra en profundidad: En tubo con medio slido vertical o semislido: Se utilizan los medios V.L. (Viande et levures, Buttiaux et al.) o medio fluido de tioglicolato, que deben ser hervidos en un bao Mara durante 15 20 minutos, antes de ser inoculados, para eliminar el oxgeno disuelto. Sembrar los medios, una vez atemperados a 45-50C. Con el asa de siembra o con una pipeta Pasteur estril, con el extremo cerrado, se realiza un movimiento en espiral de arriba a abajo y de abajo a arriba, para distribuir la muestra homogneamente, sin agitar el tubo durante la siembra para evitar la entrada de aire. Con la misma finalidad, solidificar rpidamente el medio de cultivo sumergiendo el tubo en agua fra. Estos medios pueden utilizarse tambin para determinar el tipo respiratorio, como se describe en los resultados. Si el medio utilizado es lquido, agregar una capa de parafina estril para impedir la difusin del O2 al medio. Incubar en estufa durante 24-48 horas a la temperatura ms adecuada. En placa: Transferir 1 ml del inculo a una placa de Petri estril vaca y aadir el medio de cultivo fundido y atemperado a 45-50C, homogeneizando mediante giros repetidos de la placa, hasta que el inculo se haya distribuido uniformemente. Una vez solidificado el agar, aadir una segunda capa de medio de cultivo. b) Siembra en superficie: Estra mltiple: La siembra por estra en superficie tambin puede hacerse con microorganismos anaerobios, pero en este caso, las Jarra de anaerobiosis placas no se llevan a incubar directamente, sino que se introducen en una jarra especial en la que exista un ambiente libre de oxgeno, denominada jarra de anaerobiosis. Para crear un ambiente de anaerobiosis en el interior de estas jarras, se utiliza una preparacin comercial que elimina el O2 y desprende CO2. La 30

atmsfera va reducindose y, para verificar que el ambiente es anaerbico, se coloca dentro de la jarra una tira de papel impregnada en un indicador que vira de color en presencia de CO2. El indicador suele ser azul de metileno, que es de color azul cuando se expone al aire y se vuelve incoloro cuando est totalmente reducido. Incubar las placas dentro de la jarra de anaerobiosis durante 48 horas a la temperatura ms adecuada. Resultados: a) En medio slido vertical (V.L.) o semislido (tioglicolato) los microorganismos pueden crecer en la parte superior del medio si son aerobios estrictos, en la zona inferior del medio si son anaerobios estrictos, a lo largo de todo el medio, en el caso de anaerobios facultativos. Si se trata de microorganismos microaerfilos, aparecer crecimiento en una pequea zona intermedia, prxima a la superficie. Observar tambin el aspecto de las colonias y el desprendimiento de gas. En la siembra en placa en profundidad, se debe anotar si ha habido crecimiento de colonias en toda la masa del agar. b) Estra mltiple en superficie observar el crecimiento, teniendo en cuenta que la placa ha sido incubada en ambiente de anaerobiosis. En las zonas donde se hayan obtenido colonias aisladas estudiar su morfologa.

Comportamiento de los microorganismos en tubos VL: 1. Aerobios estrictos 2. Anaerobios estrictos 3. Anaerobios facultativos 4. Anaerobios aerotolerantes 5. Microaerfilos

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CONTROL MICROBIOLGICO AMBIENTAL

La tcnica de sedimentacin por gravedad permite determinar la carga microbiana de un ambiente problema. Este tipo de control es caracterstico de la evaluacin de la calidad microbiolgica de zonas estriles en la industria farmacutica y en estudios de la microbiota en ambientes naturales. Los microorganismos suspendidos en el polvo o aerosoles sedimementan sobre la superficie de un medio rico y no selectivo contenido en una placa Petri. Pasado el tiempo de toma de muestra ambiental, la placa debe mantenerse cerrada y se incubar en las condiciones que favorezcan el crecimiento del tipo de microorganismos que deseemos estudiar, normalmente a temperatura ambiente y en aerobiosis, pues estas son las condiciones que prefieren los microorganismos ambientales. Objetivo: Observar y caracterizar someramente, mediante observacin macroscpica y microscpica, la diversidad microbiana de un ambiente elegido por el alumno. Material: Asa de siembra, una placa de Petri con agar nutritivo, portaobjetos, colorantes para tincin simple y de Gram, solucin de azul de lactofenol, cinta adhesiva transparente, microscopio y aceite de inmersin. Tcnica: Llevar la placa cerrada, con cuidado de que no se abra durante el transporte, al ambiente cuya carga microbiolgica se desee evaluar. Retirar la tapa y dejar la placa abierta, durante 30 minutos, en un lugar representativo de dicho ambiente. Pasado este tiempo, cerrar la placa e incubarla a temperatura de 25-30C, teniendo cuidado de nuevo de que no se abra durante el transporte. La placa se incuba durante varios das. Resultados: Se observar la aparicin paulatina de diversos tipos de colonias. Aparecern en primer lugar colonias bacterianas y al cabo del tercer da de incubacin las caractersticas colonias algodonosas de los hongos filamentosos. Se anotarn las caractersticas mas importantes de las colonias y se realizar un estudio microscpico de cada una de ellas. Tras la tincin de Gram de las distintas colonias bacterianas que aparezcan en la placa, se observar todo tipo de microorganismos, con predominio de cocos y bacilos Gram positivos, frecuentemente dispuestos respectivamente en sarcinas y en cadenas. La observacin microscpica de hongos filamentosos se realizar mediante tincin con azul de lactofenol. Para ello, se pone una tira de cinta adhesiva sobre el micelio, con el fin de que hifas y esporas queden adheridas. Se aade una gota de azul de lactofenol en el centro y se adhiere al portaobjectos. El color azul facilita la visualizacin del micelio en fresco. 32

B
Morfologa de hongos al microscopio ptico. A. Levaduras (Saccharomyces) en tincin con cristal violeta. B. Penicillium Observacin en fresco. C. Mucor. Observacin en fresco. D. Aspergillus Observacin en fresco.

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ANTIBIOGRAMA POR DIFUSION EN AGAR

Objetivo: Se pretende evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibiticos de una bacteria de crecimiento rpido aislada en prcticas anteriores. El mtodo utilizado es el de difusin en agar o de Kirby-Bauer. Preparacin del inculo: La tcnica de antibiograma slo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello, previamente se proceder, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa. Material: Tubo con 10 ml de solucin salina y cultivo de la bacteria problema. Tcnica: Cultivar la bacteria aislada en un tubo de medio lquido apropiado (caldo nutritivo, infusin cerebro-corazn) o preparar una suspensin directa a partir del cultivo en placa usando el siguiente mtodo: Tomar de una colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de solucin salina frotando en la pared del tubo (Figura 11.1). Homogeneizar bien, y ajustar la densidad ptica con un patrn de turbidez n 0.5 de McFarland (0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M y 99,5 ml de cido sulfrico 0,36 M). Esto equivale aproximadamente a una densidad de 108 clulas/ml. Diluir si es necesario la suspensin o aadir ms inculo. Siembra y colocacin de los discos: Material: Placas con medio de cultivo MellerHinton, hisopo, pinzas y discos de 6 mm de dimetro impregnados con antibitico.

Preparacin de una Tcnica: suspensin Impregnar una torunda con la suspensin del inculo; escurrirla contra la pared del tubo y sembrar con ella toda la superficie de la placa, mediante estras cruzadas en varias direcciones. Antes de 15 minutos deben colocarse los discos de antibiticos. Con pinzas flameadas y fras (o con un aplicador automtico) se disponen los discos sobre las placas, de forma que disten unos 15 mm del borde de la placa y unos 30 mm entre s. En una placa de 9 cm caben 6 discos. Adherir cada disco al agar presionando ligeramente con las pinzas. A los 15 minutos se llevan a incubar, invertidas, a 35-37 C 34

Lectura: Se realiza a las 16-20 horas. Medir el dimetro de los halos con calibrador o regla graduada, considerando la zona que esta libre de crecimiento. En caso de bacteriostticos es aceptable un ligero velo dentro del halo. La presencia de colonias en el interior del halo indica contaminacin, cultivo mixto o aparicin de resistencia. Consultar el siguiente cuadro para interpretar el antibiograma. Teniendo en cuenta la especie bacteriana y el antibitico, decidir si la bacteria es sensible (S), resistente (R) o su sensibilidad no puede definirse con claridad (intermedio o indeterminado: I). ANTIMICROBIANO Carga del disco 10 U 28 26 19 16 18 10 1 g 10 g 10 13 28 19 18 16 18 13 14 13 15 14 14 11-12 14-16 13 17 29 20 26 17 22 17 18 21 21 23 18 27-46 19-25 11-12 29 47 20 17 26 13 Dimetro del halo (mm) Resistente Intermedio Sensible () ()

PENICILINAS: Penicilina G Staphylococcus Neisseria gonorrhoeae Listeria monocytogenes Enterococcus Streptococcus -hemolitico Streptococcus pneumoniae Oxacilina Staphylococcus Ampicilina Staphylococcus Listeria monocytogenes Streptococcus -hemoltico Enterococcus Haemophilus spp. Enterobacterias CEFALOSPORINAS: Cefazolina,cefalotina y cefuroxima Ceftriaxona Cefoperazona Cefotaxima, moxalactama Cefoxitina, cefotetn, cefepima

19-25 19-21 14-16 15-17 14-20 16-20 15-22 15-17

30 g 30 75 30 30 g g g g

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ANTIMICROBIANO

Carga del disco

AMINOGLUCSIDOS: Amicacina 30 g Estreptomicina 300 g Enterococcus (alto nivel de resistencia) Otras bacterias 10 g Gentamicina, tobramcina 10 g Kanamicina 30 g Netilmicina 30 g GLUCOPPTIDOS Vancomicina 30 g Enterococcus Otras bacterias Gram(+) MACRLIDOS Y LINCOSAMIDAS Eritromicina 15 g Streptococcus spp. Otras bacterias Gram(+) Clindamicina 2 g TETRACICLINAS: Doxiciclina 30 g Tetraciclina 30 g Haemophilus spp. Neisseria gonorrhoeae Streptococcus spp. Otras bacterias QUINOLONAS: Acido nalidxico 30 g Norfloxacina 10 g Ciprofloxacina 5 g Haemophilus spp. Neisseria gonorrhoeae Otras bacterias OTROS ANTIMICROBIANOS: Cloranfenicol 30 g Haemophilus spp. Streptococcus pneumoniae Streptococcus spp. Otras bacterias Nitrofurantona 300 g Rifampicina 5 g Trimetoprm/ 1,25/ /Sulfametoxazol 23,75 Streptococcus spp. g Otras bacterias

Dimetro del halo (mm) Resistente Intermedio Sensible () () 14 6 11 12 13 12 15-16 7-9 12-14 13-14 14-17 13-14 17 10 15 15 18 15

<9 9

10-11 10-11

12 12

15 13 14 12 25 30 18 14 13 12

15-20 14-22 15-20 13-15 26-28 31-37 19-22 15-18 14-18 13-16

21 23 21 16 29 38 23 19 19 17 21 36 21

15

16-20

25 20 17 12 14 16 15 10

26-28 18-20 13-17 15-16 17-19 16-18 11-15

29 21 21 17 17 20 19 16

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Antibiograma por difusin en agar: Respuesta de Staphylococcus aureus frente a cuatro diferentes antibiticos. Las lneas indican el dimetro del halo de inhibicin.

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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE Candida albicans

Objetivo: En esta prctica se plantea la deteccin de levaduras patgenas y la identificacin presuntiva de Candida albicans. La muestra utilizada proviene de un supuesto exudado, por ejemplo vaginal o farngeo, tomado con el fin de diagnosticar una posible candidosis. Material: Torunda con muestra de exudado. Tubo con agua destilada estril. Tubo con 0,5 ml de suero de caballo. Una placa de agar-sangre (ver Prctica 1). Una placa de agar glucosado de Sabouraud. Es un medio selectivo para hongos, debido a su pH cido (5,6). El efecto inhibitorio puede completarse por adicin de antibiticos antibacterianos, como tetraciclina o cloranfenicol.

Tcnica:
Siembra:

Se realiza con el hisopo segn el mtodo ya descrito (Prctica 1). Cuando se pretende aislar nicamente hongos se emplear el medio de Sabouraud; en caso contrario se utilizar agar-sangre. Lo mismo ocurre con la temperatura de incubacin: 25C para hongos, y 37C para levaduras y bacterias indistintamente.
Identificacin:

Las colonias de Candida albicans son blancas y cremosas, con olor a levadura. Pueden observarse en fresco (a 40x) o teidas por el mtodo de Gram (los hongos salen Gram-positivos, aunque no lo sea su pared) y a 100x.
Prueba de la filamentacin:

Resuspender una colonia aislada en 1 ml de agua destilada; tomar 2 3 gotas de esa suspensin y aadirlas al tubo con suero de caballo. Incubar a 37C durante 3 horas. Examinar una gota entre porta y cubre (a 40x) en busca de filamentos. Interpretacin: La morfologa celular permite asegurar que se trata de una levadura. La produccin de filamentos permite identificar presuntamente a Candida albicans (tambin los produce Candida stellatoidea). La identificacin puede 38

confirmarse mediante pruebas bioqumicas y de necesidades nutricionales (auxonograma).

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OBSERVACIN MICROSCPICA DE LOS MICROORGANISMOS DE LA MICROBIOTA ORAL

Introduccin: Muchos de los microorganismos de la biota no son cultivables. Sin embargo, se puede estudiar su morfologa y ciertas propiedades estructurales mediante observacin microscpica. Para ello, se puede recurrir a la tcnica de observacin en fresco o bien realizar tinciones. En el primer caso, se pueden observar propiedades del microorganismo vivo, como la movilidad, para lo cual requeriremos aumentar el contraste del microscopio de campo claro mediante sistemas pticos de contraste de fases, interferencial-diferencial, diafragmas de campo oscuro, etc. Los consorcios microbianos de la placa dental implican a comunidades ssiles, por lo que este anlisis no resulta informativo a no ser que estudiemos microorganismo planctnicos, por ejemplo, a partir de muestras de saliva. Para ello se puede realizar un montaje hmedo, consistente en depositar una gota de la muestra (5-10 l) tomada en un portaobjetos y colocar sobre la misma un cubreobjetos presionando suavemente. Si se utiliza el objetivo de inmersin se debe colocar una gota de aceite de inmersin sobre el cubreobjetos. La observacin debe hacerse rpidamente antes de que la muestra se evapore. De esta manera se puede observar la forma y el tamao de los microorganismos, comparando las levaduras (clulas eucariticas) con las bacterias (clulas procariticas), describir su movilidad, diferenciando el movimiento browniano, debido a la colisin de los microorganismos con las molculas del lquido que los rodea, de la verdadera movilidad. La movilidad se manifiesta por el desplazamiento de los microorganismos a grandes distancias y en una direccin determinada, aunque a veces pueden apreciarse rotaciones o giros. Los desplazamientos cortos y sin sentido se deben al movimiento browniano. Para observar los microorganismos ssiles es aconsejable realizar tinciones estructurales o morfolgicas por ello. La tincin de un consorcio microbiano complejo, como los existentes en las distintas zonas de la cavidad oral proporciona una aproximacin bsica al anlisis de su composicin y su complejidad. Toma de muestra: Se introduce el palillo estril en la cavidad oral y recoge muestra en las zonas en las zonas de anlisis: regiones expuestas de las piezas dentales, surco gingival, lengua, mucosas, etc. evitando el contacto con otras zonas de la boca. Extensin: El palillo utilizado se extiende sobre un medio de extensin (agua o colorante, segn la tcnica) en un portaobjetos con el fin de extender los microorganismos en un frotis para obtener una fina pelcula. La tincin puede realizarse segn diferentes mtodos, con el fin de observar diferentes caractersticas de los microorganismos. 40

ANLISIS E IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS CULTIVABLES DE LA MICROBIOTA ORAL

Introduccin: El fin de la prctica es observar y estudiar las bacterias cultivables que forman parte de la microbiota oral. Es importante tener en cuenta que para proceder a la identificacin debe partirse siempre de un cultivo puro, o por lo menos de una colonia aislada. Dada la diversidad que presentan los microorganismos, que hace que una cepa en concreto no presente exactamente las caractersticas que definen a la especie, hay que considerar en el proceso de identificacin la totalidad de los resultados coincidentes y no coincidentes, y valorar la importancia taxonmica de cada uno. Se ofrecen aqu mtodos sencillos para la identificacin de los microorganismos que pueden haber sido aislados. La identificacin completa puede requerir otras pruebas, descritas en los manuales de laboratorio de Microbiologa Clnica (ver Bibliografa). Toma de muestras, examen preliminar y cultivo:
Material:

Tcnica:

Palillos estriles. Placas de Agar-sangre.

Toma de muestra:

Se introduce el palillo en la boca y se frota en las zonas en las que suponemos mayor acumulacin de microorganismos: surco gingival, etc., evitando el contacto con la lengua y otras zonas de la boca. Siembra: Frotar el palillo sobre un segmento de la superficie de la placa, hacindolo girar a la vez para descargar toda la muestra (Figura 1.2.-1). Sembrar para aislamienyto por estra. Incubar las placas 24-48 h a 37C en aerobiosis y anaerobiosis.

Identificacin de Estreptococos orales: Examinar las placas de agar sangre incubadas en aerobiosis analizando la hemlisis. La -hemlisis (total) puede ser ms evidente donde se clav el asa en el agar. Puede manifestar la presencia de estreptococos del grupo Anginosus o bien S. pyogenes procedente de contaminacin de la muestra con mucosa farngea en caso de que exista una infeccin farngea aguda. Las colonias -hemolticas (hemlisis parcial) pueden corresponder a estreptococos orales de los grupos Salivarius, Mitis (incluido S. pneumoniae, tambin transitorio en faringe) y Mutans. Hgase una tincin de Gram a partir de los microorganismos aislados para averiguar si presentan aspecto de cocos Grampositivos lanceolados en parejas o cadenas quebradas; para proseguir su identificacin se resiembran algunas colonias en otra placa de agar sangre, reaislndolas mediante la tcnica de estra en superficie. Se puede colocar un 41

disco de optoquina para descartar una contaminacin de los -hemolticas con S. pneumoniae, as como un disco de bacitracina para descartar una contaminacin de -hemolticos con S. pyogenes, siendo ambas especies caractersticamente sensibles a estos compuestos respectivos, a diferencia de los estreptococos orales. A partir de estas colonias, se realiza la prueba de la catalasa, que debe resultar negativa PRUEBA DE LA CATALASA La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerbicos y anaerbicos facultativos, excluyendo los estreptococos. Tcnica En un portaobjetos se depositan una o dos gotas de agua oxigenada de 30 volmenes y se pone en contacto con ella una colonia de los microorganismos a estudiar con ayuda del asa de siembra. Es muy importante no arrastrar sangre del agar, que dara un falso resultado positivo. Interpretacin La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con desprendimiento de burbujas: la enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno molecular. El gnero Streptococcus es catalasa negativo, luego un resultado positivo descartara que el microorganismo ensayado fuera un estreptococo. Identificacin de actinomyces y otras actinobacterias orales: Actinomyces spp. Requieren CO2 para su crecimiento, mientras que otros gneros, como Propionibacterium y Bifidobacterium no requieren CO2. Las colonias de estas bacterias son irregulares y prominentes, con aspecto de araa o muela. Se comprobar mediante tincin de Gram que se trata de bacilos Gram positivos pleomrficos o corineformes. La prueba de la catalasa es til para distinguir entre gneros: Actinomyces es catalasa negativo, mientras que Corynebacterium y Propionibacterium son generalmente catalasa positivos. En el caso del gnero Bifidobacterium, la respuesta a catalasa depende de la especie. Para identificar el gnero Corynebacterium, representado en la biota oral en especial por la especie C. matruchotii, se puede recurrir a la tincin de corpsculos metacromticos, caracterstica de este gnero, mediante el mtodo de Alberts. La diferenciacin entre propionibacterias, bifidobacterias y Actinomyces puede ser difcil si no se dispone de paneles de identificacin con pruebas bioqumicas diseadas a tal efecto. La especie Rothia dentocariosa es un bacilo Gram positivo que se tie de manera no uniforme, sacaroltico pleomrfico, con formas cocoides, bacilares, corineformes, raramente ramificadas. Es aerobio y, por tanto, aparecer en las placas cultivadas en presencia de oxgeno. Por lo dems, es difcil de distinguir de especies relacionadas como Nocardia (microorganismos asacarolticos) y Actinomyces. 42

Identificacin de cocos gram negativos aerobios: Nos referiremos los pertenecientes al gnero Neisseria. Se caracterizan preliminarmente por su morfologa de cocos Gram-negativos en parejas, semejando granos de caf, y por dar positivas las pruebas de la catalasa y de la oxidasa. El aislamiento es comn en medio agar sangre, donde producen colonias no hemolticas de aspecto diverso segn la especie. Su caracterizacin se completara mediante pruebas bioqumicas. Los ensayos de oxidacin de azcares son difciles de realizar, y se recomienda el empleo de alguno de los mtodos comercialmente disponibles. Gemella es un coco Gram positivo emparentado con los estreptococos que se puede confundir con las neisserias puesto que tiene idntica morfologa y se decolora dando lugar a una falsa lectura del Gram. Se distingue de Neisseria por ser -hemoltico y por dar negativas las pruebas de la oxidasa y la catalasa. Prueba de la Oxidasa: Se trazan rayas con el asa cargada de bacterias sobre tiras de papel impregnadas en solucin acuosa al 1 por 100 de tetrametil-pfeniln-diamina. En caso positivo el papel cambia de color pasando a azul oscuro o negro

Identificacin de gram negativos anaerobios: Estos microorganismos son muy comunes en la cavidad oral, aunque su cultivo y aislamiento resulta tedioso, puesto que crecen mal in vitro. Su aislamiento implica comnmente el uso de medios enriquecidos en hemina, vitamina K, menadiona, piruvato y cistena. La incubacin debe realizarse en atmsfera anaerbica con 5-10% de CO2. La tincin Gram puede ser equvoca con algunos gneros. Dentro de los bacilos, los gneros Prevotella y Porphyromonas son representativos del Phylum Bacteroidetes, mostrando un aspecto habitualmente cocobacilar. Gracias a la produccin de porfirinas, sus colonias manifiestan una fluorescencia roja intensa si se les expone a radiacin ultravioleta (UV, =365 nm). En tiempos largos de incubacin las colonias se vuelven negras por la presencia de estos pigmentos. La aparicin de pigmentos es ms rpida en las especies P. intermedia y P. loeschii que en P. melaninogenica. Otras especies, como P. oralis, no producen pigmento. La hemlisis en el gnero Prevotella es muy variable: P. melaninogenica puede presentar hemlisis o , mientras que otras especies, como P. intermedia y P. loeschii suelen ser no hemolticas o bien producir una hemlisis . El gnero Tannerella, relacionado con Porphyromonas no es fcilmente cultivable por su requerimiento nutricional de cido N-acetil murmico. Las colonias de la especie Eikenella corrodens corroen el agar de manera caracterstica. Para su aislamiento se requiere una atmsfera del 10% de CO2. Es posible detectar colonias de Gram positivos anaerobios como los cocos Peptostreptococcus y, sobre todo, Veillonella, que son refractarios al Gram, apareciendo en tincin como Gram negativos. Veillonella aparece microscpicamente como masas de cocos muy pequeos, oxidasa negativos. Las especies V. atypica y V. parvula dan negativa la reaccin de la catalasa, 43

mientras que V. dispar es catalasa positivo. Peptostreptococcus suele responder mejor al Gram, apareciendo como positivo, agrupado en diversas formaciones: cadena, pares, ttradas o racimos. Son siempre catalasa negativos. Selenomonas es un Gram positivo refractario al Gram que aparece como falso Gram negativo. Es fcilmente reconocible al microscopio por su forma curva de media luna. Es catalasa y oxidasa negativo. Dialister tambin es un Gram positivo que aparece como negativo en tincin, de forma bacilar. Se conoce poco sobre su posibilidad de cultico y caracterizacin microbiolgica. Las Fusobacterias (Fusobacterium spp. y Leptotrichia buccalis) son de muy difcil cultivo o no cultivables. Todas ellas son, en cualquier caso catalasa y oxidasa negativos. Las fusobacterias tienen una caracterstica forma alargada y fina, como filamentos rectos de aspecto fusiforme, pero pueden ser pleomrficos, sobre todo las especies del gnero Fusobacterium. Leptotrichia, al contrario que Fusobacterium puede ser aerotolerante en subcultivo. Identificacin de bacilos gram negativos anaerobios facultativos: Las Gamma-Proteobacterias, el grupo ms conocido de este tipo de microorganismos, que incluye a las Enterobacterias, no est representado en la microbiota oral, salvo en ciertas situaciones patolgicas. Por tanto, no se investigan bacilos Gram negativos oxidasa negativos de manera rutinaria en el anlisis de la placa dental. La especie Actinobacillus actinomycetencomitans, asociada a la cavidad oral, dar lugar a colonias preferentemente en atmsferas enriquecidas en CO2. La morfologa colonial es caracterstica, con un abultamiento central en forma de estrella. Microscpicamente tiene el aspecto de formas cocoides y bacilares asociadas (aspecto de alfabeto Morse).

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ANEXO: MEDIOS DE CULTIVO, COLORANTES Y REACTIVOS

Agar movilidad: Extracto de carne Peptona Cloruro sdico Agar Agua destilada, c.s.p. 3 10 5 4 1000 g g g g ml

Disolver todos los componentes en el agua, a excepcin del agar, calentando suavemente y ajustar el pH a 7,3. Aadir el agar calentando de nuevo hasta ebullicin y distribuir en tubos a razn de unos 5 ml por tubo. Esterilizar a 121C durante 15 minutos y dejar solidificar en posicin vertical. Agar Meller-Hinton: Infusin de carne Peptona de casena Almidn soluble Agar Agua destilada, c.s.p. 300 g 17,5 g 1,5 g 17 g 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua, a excepcin del agar, y ajustar a pH 7,3. Aadir el agar y calentar hasta ebullicin para que se disuelva por completo. Esterilizar a 121C durante 15 minutos y una vez atemperado, dispensar en placas de Petri estriles a razn de unos 20 ml por placa, con el fin de obtener un espesor de 4 mm. Agar nutritivo: Peptona Extracto de carne Extracto de levadura NaCl Agar Agua destilada, c.s.p. 5 1 2 5 15 1000 g g g g g ml

Disolver los componentes por calentamiento, excepto el agar, y ajustar el pH a 7,1. Aadir el agar y llevar hasta ebullicin, repartiendo el medio en tubos de ensayo a razn de 15 a 20 ml por tubo Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Agar sangre: Utilizar una base de agar nutritivo o de otro medio ms rico, como el agar triptona soja, al que se aadir en condiciones aspticas, una vez esterilizado 45

en autoclave a 121C durante 15 minutos y atemperado a 45-50C, un 5% de sangre de caballo desfibrinada estril. Mezclar suavemente para evitar la formacin de burbujas y dispensar en placas de Petri. Agua de peptona: Peptona Cloruro sdico Agua destilada, c.s.p. 10 g 5g 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua calentando suavemente y ajustar el pH a 7,2. Dispensar en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Medio fluido de tioglicolato: L-cistina 0,5 g Cloruro sdico 2,5 g Glucosa monohidrato 5,5 g Extracto de levadura 5g Digerido pancretico de casena 15 g Tioglicolato sdico 0,5 g Solucin de resazurina sdica al 0,1% 1 ml Agar 0,75 g Agua destilada, c.s.p. 1000 ml Aadir el tioglicolato sdico o el cido tiogliclico a la solucin formada por el resto de los componentes, excepto la solucin de resazurina sdica que se aade despus de ajustar el pH a 7,10,2. Distribuir en tubos a razn de 15 ml y esterilizar a 121C durante 20 minutos. COLORANTES Y REACTIVOS Agua oxigenada: solucin al 3% en agua destilada. Azul de lactofenol cido lctico Fenol Azul de anilina Glicerol Agua destilada, c.s.p. 20 ml 20 g 005 g 40 ml 20 ml

Disolver el fenol en cido lctico, glicerol y agua, calentando suavemente. Luego agregar el azul de anilina (azul algodn, azul de Poirrier) Azul de metileno: solucin al 0,3%.en agua destilada. Cristal violeta oxalatado (modificacin de Hucker): Solucin A: Cristal violeta Etanol de 95% 46 10 g 100 ml

Solucin B: Oxalato amnico 1g Agua destilada, c.s.p. 1000 ml Mezclar 20 ml de la solucin A y 80 ml de la solucin B. Guardar durante 24 horas y filtrar a travs de papel de filtro. Etanol de 95% (vol/vol). Lugol (solucin yodo-yodurada): Yoduro potsico Yodo Agua destilada, c.s.p. 2g 1g 300 ml

Disolver el yoduro potsico en un poco de agua y agregar el yodo. Una vez disuelto, se agrega el agua restante. Guardar en frascos de color mbar. Nigrosina de Dorner: Nigrosina Agua destilada, c.s.p. 10 g 100 ml

Aadir la nigrosina al agua y mezclar en un matraz. Calentar en un bao de agua hirviendo durante 20-30 minutos. Ajustar el volumen final a 100 ml con agua Como la nigrosina puede contaminarse con microorganismos, aadir 0,5 ml de formol como conservador. Filtrar dos veces a travs de un papel de filtro doble. Safranina: Safranina O Etanol de 95% Agua destilada, c.s.p. 0,25 g 10 ml 100 ml

Disolver la safranina en el etanol y aadir entonces el agua destilada. Solucin salina: Cloruro sdico Agua destilada, c.s.p. 9g 1000 ml

Disolver el cloruro sdico en el agua por calentamiento suave y ajustar el pH a 6,6. Dispensar en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

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BIBLIOGRAFA
Beishir, L. Microbiology in practice. A self-instructional laboratory course. 5 Ed. Harper Collins Pub. Inc., 1991. Case, C.L. y T.R. Johnson. Laboratory experiments in Microbiology. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1984. Claus, GW. Understanding microbes: A laboratory textbook microbiology. 1 Ed. W.H. Freeman and Co. New York, 1989. for

Collins, C.H. y P.M. Lyne. Microbiological methods. Butterworth & Co.(Pub) Ltd, 1985. Daz, R., C. Gamazo e I. Lpez-Goi. Manual prctico de Microbiologa. 2 Ed. Masson, S.A. Barcelona, 1999. Baron, E.J., L.R. Peterson, y S.M. Finegold. Bailey and Sccotts diagnostic Microbiology. 10 Ed. The C.V. Mosby Company, 1998. Gerhardt, P., R.GE. Murray, W.A. Wood y N.R. Krieg Methods for general and molecular bacteriology. American Society for Microbiology, Washington, 1994. Koneman, E.W., S.D. Allen, W.M. Janda, P.C. Schreckenberger y W.C. Winn. Diagnstico microbiolgico. Texto y atlas en color. 5 Ed. Panamericana, 1999. Seeley, H.W., P.J. Vandemark y J.L. Lee. Microbes in action. A laboratory manual of Microbiology. 4 Ed. W.H. Freeman, New York, 1991.

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CALENDARIO DE PRCTICAS
Siembras de microorganismos aerobios y anaerobios en medios lquidos y slidos Lectura de siembras. Tincin y Siembra en Agar Sangre en aerobiosis y anaerobiosis de la muestra oral Observacin y Lectura tinciones de de gram de las Control ambiental colonias de Agar Sangre Observacin y tinciones de gram de las colonias de Agar Sangre Tipo respiratorio en Caldo Tioglicolato Control ambiental hongos Lectura del tipo respiratorio. Pruebas bioqumicas catalasa y oxidasa Siembra y aislamiento de Candida. Observacin en fresco Tincin negativa Tincin simple Tincin de Gram Prueba de filamentacin de C. albicans Tincin de Gram

LUNES

MARTES

MIRCOLES

Tincin de las colonias

Siembra del antibiograma por difusin JUEVES Lectura de los antibiogramas

Antifungigrama Lectura Tincin con azul de lactofenol

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