Implementacin del Sistema para la validacin de los anlisis y mediciones de laboratorios en suelos y lodos.

IMPLEMENTACIN DEL SISTEMA PARA LA VALIDACIN DE LOS MTODOS DE ANLISIS Y MEDICIONES DE LABORATORIO EN SUELOS Y LODOS.

Universidad de Concepcin Facultad de de Agronoma Chilln. Erick Zagal1, Anglica Sadzawka R2

Elaborado con la participacin de la Comisin de Normalizacin y Acreditacin de la Sociedad Chilena de la Ciencia del Suelo, por encargo del Servicio Agrcola y Ganadero.

2007
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Universidad de Concepcin, Facultad de Agronoma, Chilln Miembro Comisin de Normalizacin y Acreditacin, Sociedad Chilena de la Ciencia del Suelo. 1

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INTRODUCCIN La validacin de mtodos es un procedimiento para establecer por medio de estudios de laboratorio una demostracin cientfica que un mtodo analtico tiene las caractersticas de desempeo que son adecuadas para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analticas pretendidas. Por lo tanto, es un componente esencial de las medidas que un laboratorio debe implementar para producir datos analticos fiables. Este documento est orientado a la validacin de los mtodos incluidos en el Protocolo de mtodos de anlisis para suelos y lodos , y cont con la asesora de la experta Anglica Sadzawka y la participacin de Erick Zagal, Mara Adriana Carrasco, Rolando Demanet, Hugo Flores, Renato Grez, Pedro Hernndez, Mara de Luz Mora, Alexander Reaman y Gisela Romeny todos integrantes de la Comisin de Normalizacin y Acreditacin (CNA), de la Sociedad Chilena de la Ciencia del Suelo, la que fue creada para desarrollar un Programa de Normalizacin de Tcnicas y de Acreditacin de Laboratorios para el anlisis de suelos y de tejidos vegetales. Los mtodos de anlisis incluidos en dicho documento fueron seleccionados principalmente de la EPA (United States Environmental Protection Agency), por lo tanto son mtodos oficiales. Pero, ello no garantiza que el funcionamiento sea satisfactorio en cualquier laboratorio que los use. Por lo tanto, siempre que un laboratorio monta un mtodo, debe validarlo bajo sus condiciones, porque cualquier cambio introducido puede afectar sus caractersticas. La ventaja de usar mtodos estndares, oficiales o normalizados, es que la validacin no requiere determinar la totalidad de los parmetros analticos bsicos, sino solamente una seleccin de ellos. Esta seleccin depender de las caractersticas del mtodo y del laboratorio, aunque el reconocimiento oficial de que un laboratorio est ejecutando en forma adecuada un mtodo puede requerir adems estudios interlaboratorios.

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TABLA DE CONTENIDO Pgina INTRODUCCIN .................................................................................................................... 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 TRMINOS Y DEFINICIONES ....................................................................................... 4 PRINCIPIOS BSICOS DE LA VALIDACIN DE MTODOS..................................... 8 CALIBRACIN ............................................................................................................... 9 LMITE DE DETECCIN Y LMITE DE CUANTIFICACIN ....................................... 13 EXACTITUD, SESGO ................................................................................................... 15 PRECISIN ................................................................................................................... 16 SENSIBILIDAD ............................................................................................................. 16 RANGO DE TRABAJO................................................................................................. 17 ESPECIFICIDAD........................................................................................................... 17

10 SELECTIVIDAD ............................................................................................................ 18 11 RECUPERACIN ......................................................................................................... 18 12 ROBUSTEZ................................................................................................................... 19 13 INTERFERENCIAS....................................................................................................... 21 14 APLICABILIDAD........................................................................................................... 21 15 ADECUACIN AL PROPSITO ................................................................................. 21 16 BIBLIOGRAFA............................................................................................................. 21

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TRMINOS Y DEFINICIONES

1.1 Anlisis: en el mbito qumico, implica someter a una muestra a un proceso analtico para conocer informacin sobre la misma (NCh 2725, 2002). 1.2 Calibracin: conjunto de operaciones que establecen, en condiciones especificadas, la relacin entre los valores de una magnitud indicados por un instrumento de medicin o por un sistema de medicin, o los valores representados por una medida materializada o por un material de referencia, y los valores correspondientes de esa magnitud materializados por patrones (NCh 2737, 2002). 1.3 Curva de calibracin (estndar): representacin grfica bidimensional que muestra la variacin de la seal analtica en funcin de la variacin de la concentracin de la solucin patrn (estndar) (NCh 2766, 2003). 1.4 Ensayo: una operacin tcnica que consiste en la determinacin de una o ms caractersticas o del comportamiento de un determinado producto, material, equipo, organismo, fenmeno fsico, proceso o servicio, de acuerdo a un procedimiento especificado (NCh 2725, 2002). 1.5 Error 1.5.1 error de una medida: resultado de una medicin menos un valor verdadero de un mensurando (NCh 2755/1, 2003).
Nota Considerando que un valor verdadero no se puede determinar, en la prctica se usa un valor verdadero convencional.

1.5.2

1.5.3

error aleatorio: resultado de una medicin menos la media de un nmero infinito de mediciones del mismo mensurando, efectuadas bajo condiciones de repetibilidad (NCh 2755/1, 2003). error sistemtico: media que resultara de un nmero infinito de mediciones del mismo mensurando efectuadas bajo condiciones de repetibilidad, menos un valor verdadero del mensurando ((NCh 2755/1, 2003).
Nota Para un instrumento de medida se utiliza el sesgo.

1.6 Especificidad Habilidad de evaluar inequvocamente el analito en presencia de componentes que se puede esperar que estn presentes. Tpicamente stos pueden incluir impurezas, productos de degradacin, la matriz, etc. 1.7 Exactitud: grado de concordancia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia aceptado (NCh 2755/1, 2003). Tambin se puede definir como la cercana entre el valor que es aceptado, ya sea como un valor convencional verdadero (material de referencia interno del laboratorio), o como un valor de
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referencia aceptado (material de referencia certificado) y el valor promedio obtenido al aplicar el procedimiento de anlisis un cierto nmero de veces. 1.8 Fortificar: accin de aadir un analito, sustancia, matriz qumica o un material de referencia certificado a una muestra en cualquier etapa de un anlisis qumico, para realzar la respuesta del sistema de medicin con un objetivo determinado (NCh 2755/1, 2003). 1.9 Incertidumbre de una medida: parmetro asociado al resultado de una medicin, que caracteriza la dispersin de los valores que podran razonablemente ser atribuidos al mensurando (NCh 2755/1, 2003). 1.10 Manual de calidad: documento que establece la poltica de calidad y describe el sistema de calidad de una organizacin (NCh-ISO 10013, 1994). 1.11 Material de referencia: material o sustancia en que uno o varios valores de la(s) propiedad(es) es(son) suficientemente homogneo(s) y bien definido(s) para permitir su uso para calibrar un aparato, evualar un mtodo de medicin o asignar valores a materiales (NCh 2737, 2002). 1.12 Material de referencia certificado (MRC): material de referencia, acompaado de un certificado, en que uno o varios valores de la(s) propiedad(es) est(n) certificado(s) por un procedimiento que establece su trazabilidad a una realizacin exacta de la unidad en que estn expresados los valores de la propiedad y para la cual cada valor certificado est acompaado de una incertidumbre a un nivel de confianza indicado (NCh 2737, 2002). 1.13 Medicin: conjunto de operaciones que tienen por finalidad determinar un valor de una magnitud (NCh 2755/1, 2003). 1.14 Mensurando: magnitud particular sujeta a medicin (NCh 2755/1, 2003). 1.15 Mtodo analtico: conjunto de operaciones especficas para caracterizar cuali y cuantitativamente a un analito (o familia) en una determinada muestra. Implica el empleo de una tcnica (instrumento) y supone la concrecin del proceso de medida qumica (NCh 2725, 2002). 1.16 Precisin: grado de concordancia entre resultados de ensayos independientes obtenidos bajo condiciones estipuladas (NCh 2755/1, 2003). 1.17 Procedimiento Normalizado de Trabajo (PNT): documento que describe detalladamente las instrucciones explcitas para llevar a cabo un procedimiento o mtodo segn los niveles de tolerancia impuestos para los resultados finales. 1.18 Repetibilidad
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1.18.1 repetibilidad: precisin bajo condiciones de repetibilidad (NCh 2766, 2003). 1.18.2 condiciones de repetibilidad: condiciones en que se obtienen resultados de ensayo independientes con el mismo mtodo sobre temes de ensayo idnticos en el mismo laboratorio por el mismo operador usando el mismo equipo dentro de intervalos cortos de tiempo (NCh 2766, 2003). 1.18.3 lmite de la repetibilidad: valor menor o igual al cual la diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo obtenidos bajo condiciones de repetabilidad se puede esperar que sea con una probabilidad de 95%. Se designa por el smbolo r (NCh 2766, 2003). 1.19 Reproducibilidad 1.19.1 reproducibilidad: precisin bajo condiciones de reproducibilidad (NCh 2766, 2003). 1.19.2 condiciones de reproducibilidad: condiciones en que se obtienen resultados de ensayo con el mismo mtodo sobre temes de ensayo idnticos en diferentes laboratorios con operadores usando equipos diferentes (NCh 2766, 2003). 1.19.3 lmite de la reproducibilidad: valor menor o igual al cual la diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo obtenidos bajo condiciones de reproducibilidad se puede esperar que sea con una probabilidad de 95%. Se designa por el smbolo R (NCh 2766, 2003). 1.20 Robustez: propiedad analtica de un proceso de medida qumica que describe su resistencia al cambio cuando se varan ligeramente las condiciones experimentales en las que se desarrolla (NCh 2755/1, 2003). 1.21 Selectividad: habilidad de un procedimiento analtico para diferenciar entre varios componentes de una mezcla. 1.22 Sesgo: desviacin consistente de los resultados analticos del valor de referencia aceptado causado por errores sistemticos en el procedimiento. 1.23 Tcnica: principio cientfico que se utiliza para extraer informacin analtica (NCh 2725, 2002). 1.24 Trazabilidad: propiedad del resultado de una medicin, o del valor de un patrn, tal que puede relacionarse con referencias establecidas, generalmente patrones nacionales o internacionales, a travs de una cadena ininterrumpida de comparaciones, todas ellas con incertidumbres determinadas (NCh 2755/1, 2003). 1.25 Trminos estadsticos 1.25.1 anlisis de regresin: se usa para predecir el valor de la variable dependiente (Y) basada en la variable independiente (X). 1.25.2 coeficiente de determinacin (R2): proporcin de la variacin total en la variable dependiente (Y) que est explicada por o se debe a la variacin en
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la variable independiente (X). El coeficiente de determinacin es el cuadrado del coeficiente de correlacin, y toma valores de 0 a 1. 1.25.3 coeficiente de variacin (CV): desviacin estndar de una poblacin de n resultados de una muestra dividida por la media de esa muestra. Frecuentemente se expresa en porcentaje.

CV (%) =

s 100 x

1.25.4 media aritmtica ( x ): valor promedio obtenido de n resultados de una muestra (NCh 2755/1, 2003).

x=

x
i =1

1.25.5 desviacin estndar de la muestra (s): estimacin de la desviacin estndar de una poblacin por medio de n resultados de una muestra (NCh 2755/1, 2003).

s=

(x
i=1

x )2

n 1

1.25.6 desviacin estndar de la media ( s x ): desviacin estndar de la media x de n valores tomados de una poblacin; se expresa por:

sx =

s n

Los trminos error estndar y error estndar de la media se han usado para describir la misma cantidad (NCh 2755/1, 2003).
1.26 Validacin de un mtodo analtico: Procedimiento para establecer por medio de estudios de laboratorio una demostracin cientfica que un mtodo analtico tiene las caractersticas de desempeo que son adecuadas para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analticas pretendidas.

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PRINCIPIOS BSICOS DE LA VALIDACIN DE MTODOS

La validacin de mtodos se considera diferente de las actividades que se realizan repetidamente, como el control de calidad interno o los ensayos de aptitud. La validacin de mtodos se lleva a cabo una vez, o a intervalos relativamente infrecuentes, durante la vida til de un mtodo. La validacin se aplica a un protocolo definido, denominado Procedimiento Normalizado de Trabajo (PNT) para determinar un analito especfico y el rango de concentraciones en un tipo de material de prueba particular utilizado para un propsito especfico. Los PNT son documentos que describen detalladamente las instrucciones explcitas para llevar a cabo un procedimiento o mtodo segn los niveles de tolerancia impuestos para los resultados finales. Ms an, el proceso completo desde la recepcin de la muestra hasta la entrega final del resultado analtico debe estar descrito en una serie continua de PNT. Los mtodos descritos en el documento Mtodos de anlisis de lodos y de suelos, pueden usarse como PNT a menos que el Jefe del Laboratorio considere que es necesario un mayor detalle en las instrucciones. La validacin de mtodos emplea un conjunto de pruebas que comprueban todas las hiptesis en las que se basa el mtodo analtico, y establecen y documentan las caractersticas de rendimiento de un mtodo, demostrando as si dicho mtodo es adecuado para un propsito analtico particular. Las caractersticas de rendimiento de los mtodos analticos son:

Calibracin Lmite de deteccin Lmite de cuantificacin Exactitud, sesgo Precisin Sensibilidad Rango de trabajo Especificidad Selectividad Recuperacin Robustez Interferencias Aplicabilidad Adecuacin al propsito.

Debido a que los Mtodos de anlisis de lodos y suelos se seleccionaron principalmente de publicaciones oficiales, un laboratorio con experiencia no requiere determinar todas las caractersticas indicadas para validarlos, sino solamente una seleccin de ellas. Sin embargo, en esta gua, se dar una resea de todas ellas ante la eventual necesidad de utilizarlas en otros mtodos.
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CALIBRACIN

3.1

Principio

La calibracin de instrumentos (incluyendo el ajuste) tambin se conoce como estandarizacin. As los trminos curva de calibracin y curva estndar se usan generalmente como sinnimos. En muchas tcnicas de medida se deben construir grficos de calibracin, que consisten simplemente en dibujar la respuesta del instrumento contra una serie de muestras que contienen concentraciones conocidas del analito (estndares). En la prctica, estos estndares generalmente son sustancias qumicas puras dispersas en una matriz semejante a la de las muestras a analizar. Por convencin, el grfico de calibracin siempre se dibuja con la concentracin de los estndares en el eje de las X (abscisa) y la lectura de la respuesta del instrumento en el eje de las Y (ordenada). La concentracin del analito en las muestras se obtiene por interpolacin, nunca por extrapolacin, de manera que debe elegirse un rango apropiado para los estndares. La condicin ideal es que la relacin seal/concentracin sea lineal en el rango de trabajo. Sin embargo, muchos mtodos son lineales slo a bajas concentraciones del analito y, en ocasiones incluso, la relacin seal/concentracin es curvilnea en todo el intervalo de concentraciones. En estos casos, deben usarse regresiones polinomiales, aunque muchos equipos modernos realizan la linearizacin de grficos no lineales en forma transparente pare el usuario. Algunas prcticas comunes para obtener los grficos de calibracin son: Los estndares se preparan en la misma composicin del extractante usado para las muestras, con el mismo factor de dilucin. Es la prctica ms usada. Los estndares se preparan en el extracto del blanco. Esta prctica es til cuando se analizan pocas muestras o cuando el extractante es inestable. Uso de la tcnica llamada adicin de estndares, que consiste en tomar alcuotas del extracto de la muestra, agregar diferentes cantidades de analito y diluir a un volumen final. Una alcuota se usa sin adicin de analito, obtenindose as la serie de estndares. Esta prctica se usa cuando se quiere evitar diferencias de matriz entre las muestras y los estndares.

3.2

Ajuste lineal

Una vez obtenidas las respuestas del instrumento a la serie de estndares de al menos seis puntos, se debe dibujar el grfico de calibracin, ya sea en el mismo equipo de medicin, si lo permite, o en el computador usando un programa que permita calcular la ecuacin y el coeficiente de determinacin. En una relacin lineal, la ecuacin de regresin toma la forma de: y = bx + a
con un coeficiente de determinacin R
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donde: y x b a

= = = =

lectura del instrumento concentracin del analito pendiente intercepto

Idealmente el intercepto a es cero, sin embargo, debido a interacciones, interferencias, ruido, contaminacin, etc., esto raramente ocurre. Por lo tanto, el intercepto a puede ser considerado como la seal del blanco. La pendiente b es una medida de la sensibilidad del procedimiento. Mientras mayor es la respuesta del instrumento a un cambio en la concentracin del analito, mayor es la sensibilidad del procedimiento. El coeficiente de determinacin R2, tambin llamado bondad de ajuste, tiene la ventaja sobre el coeficiente de correlacin (r) que, cuando se multiplica por 100, indica el porcentaje de variacin en y asociado con la variacin en x. En los grficos de calibracin, normalmente los valores de R2 son cercanos 1. Cuando son menores a, por ej., 0,99, es una advertencia de que la relacin no es lineal, o que debe repetirse o revisarse el procedimiento. Por otra parte, un valor de R2 alto no siempre significa linealidad, por lo tanto, siempre debera dibujarse el grfico de calibracin. Si el valor de R2 es alto (por ej. >0,99) pero la linealidad es dudosa al examen visual, se puede aplicar la siguiente prueba. Determinar para 2 o 3 de los puntos de calibracin ms altos la desviacin relativa de los valores medidos de y de los calculados de la lnea:
yi desviacin (%) = 1 100 bx + a i

Si las desviaciones son <5%, la curva puede ser aceptada como lineal. Si las desviaciones son >5%, el rango se disminuye dejando fuera las concentraciones ms altas. Repetir el clculo de la regresin lineal. Repetir el procedimiento hasta que las desviaciones sean <5%. En situaciones en que un grfico de calibracin es lineal en un intervalo de concentraciones y curvo en otro, es de gran importancia establecer claramente el intervalo que se puede considerar lineal. Una vez que se ha establecido el grfico de calibracin, su uso es simple: la concentracin xi del analito en la muestra i la entrega directamente el instrumento o se calcula del valor de yi medido segn la ecuacin: y -a x = i i b
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3.3

Ajuste polinomial

Cuando los valores no se ajustan a un modelo de regresin lineal, la aproximacin ms general es ensayar un polinomio del tipo: y = a + bx + cx2 + dx3 + .... El problema es cuntos trminos deben incluirse en la expresin polinmica y cmo calcular los valores de los coeficientes. En la prctica, es recomendable no usar ms all del ajuste cuadrtico y calcular los coeficientes usando los paquetes informticos disponibles. Para decidir el mejor ajuste del grfico de calibracin se recurre al anlisis de varianza (ANDEVA), que permite calcular el coeficiente de determinacin ajustado (R2) y hacer el anlisis de residuales. Una forma ms sencilla es hacer al grfico de calibracin, colocando solamente los puntos, luego insertar una lnea de tendencia lineal con la ecuacin y el coeficiente de determinacin. Si visualmente, los puntos en los extremos de la lnea de tendencia estn bajo la lnea y los puntos centrales estn sobre la lnea, es una indicacin clara de que el ajuste lineal no es el adecuado, aun cuando el valor de R2 sea > 0,99. A continuacin, se prueba el ajuste cuadrtico insertando una lnea de tendencia polinomial de orden 2 (cuadrtica) con su ecuacin y coeficiente de determinacin. Si la distribucin de puntos a lo largo de la nueva lnea no muestra una tendencia, significa que la relacin entre la concentracin del analito y la seal se ajusta mejor al modelo cuadrtico. La ecuacin de regresin cuadrtica tiene la forma: y = a + bx + cx2 Y, para calcular la concentracin del analito en las muestras, se usa la siguiente frmula:
b + b 2 4c(a - y i ) 2c

x = i
donde: xi a b c yi = = = = =

concentracin de analito en la muestra i intercepto coeficiente del trmino lineal coeficiente del trmino cuadrtico seal del instrumento para la muestra i

Es importante tener en cuenta que durante los clculos se trabaja con todas las cifras decimales y se redondean solamente al final. Para producir un mnimo sesgo, por convencin el redondeo se hace como sigue:
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Si el ltimo nmero es 4 o menor, dejar el nmero precedente. Si el ltimo nmero es 6 o mayor, aumentar el nmero precedente en 1. Si el ltimo nmero es 5 y el nmero precedente es par, este se deja. Si el ltimo nmero es 5 y el nmero precedente es impar, este se aumenta en 1.

Normalmente, la mayora de los programas de clculos computacionales, cuando el ltimo nmero es 5, aumentan el nmero precedente en 1. No hay objecin a esta prctica en la medida que no cause un sesgo importante.

3.4

Incertidumbre de la lnea de regresin

En el grfico de calibracin, generalmente los puntos de las respuestas del instrumento no caen exactamente en la lnea, debido a que hay errores aleatorios implicados. Estos se expresan en incertidumbres asociadas a los valores estimados de Y, al intercepto y a la pendiente. Las desviaciones de los valores de X no se consideran porque se asume que los estndares fueron muy bien preparados. La cuantificacin de las incertidumbres se realiza a travs de la desviacin estndar (tambin llamada error tpico), que la mayora de los programas computacionales de regresin entregan automticamente. As, se obtienen: sy = desviacin estndar residual de los valores estimados de y. sa = desviacin estndar del intercepto a sb = desviacin estndar de la pendiente

La incertidumbre es t.s, siendo t un valor estadstico que depende del nmero de datos y de la confianza requerida (usualmente 95%). Por lo tanto, los lmites de confianza de la ecuacin de regresin son: y estimado : intercepto : pendiente : t sy a t sa b t sb

La incertidumbre asociada a los valores estimados de y se transfiere a los valores de x de las muestras calculados con la ecuacin de regresin y puede ser expresada por la desviacin estndar de los valores calculados de x. Una aproximacin til para este clculo es:

s y s = x b De manera que el lmite de confianza de los resultados de las muestras, xm, puede calcularse como:
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y b

Para una confianza del 95% y un grfico de calibracin de 6 puntos, el valor de t segn tabla es de 2,78 para 4 grados de libertad (6 2). El lmite de confianza puede estrecharse aumentando el nmero de puntos del grfico de calibracin. El valor de sx as calculado puede ser slo aproximado porque se considera constante en el rango, lo cual generalmente no ocurre en la realidad, ya que es comn que las mediciones sean ms precisas en el centro del grfico de calibracin que en los extremos. Pero, en la prctica, tal estimacin del error generalmente es suficiente. Es importante considerar que cuando la determinacin del analito es parte de un procedimiento con varias etapas, el error debido a la lectura se agrega a los errores de las otras etapas, constituyendo el error total del procedimiento completo, que es la estimacin de confianza ms til cuando se informan los resultados. Este se obtiene del promedio y la desviacin estndar de varias repeticiones (>10) realizadas en muestras de control o de los grficos de control en los anlisis de rutina. En este caso, para un nivel de confianza del 95%, el resultado del anlisis de una muestra sin repeticiones se informa como: x 2s
donde: s = desviacin estndar del gran nmero de repeticiones.

LMITE DE DETECCIN Y LMITE DE CUANTIFICACIN

4.1

Blancos

Se pueden distinguir dos tipos de blancos: Blanco del mtodo completo Blanco del mtodo de medicin

Las seales de los blancos generalmente no son cero, incluso pueden ser negativas, lo cual puede ser debido a un error en el procedimiento o tambin a un efecto de la matriz de la solucin, lo cual a menudo es inevitable. Por conveniencia, algunos analistas ajustan a cero el instrumento con el blanco de medicin (estndar 0). Esto equivale a sustraer el valor del blanco de los valores de los estndares antes de graficar la curva de calibracin. Desde el punto de vista del control de calidad, esta prctica no debe realizarse. Para el ajuste del cero del instrumento debe preferirse el uso de agua pura o agua con cido en la misma concentracin de las muestras.
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En el proceso de validacin de mtodos deben realizarse al menos 10 determinaciones de los blancos (tanto de medicin como del mtodo completo) y luego calcular el promedio y la correspondiente desviacin estndar de cada tipo de blanco.

4.2

Lmite de deteccin

Para una apropiada validacin y seleccin de un procedimiento o mtodo analtico, es importante tener la informacin del menor lmite al cual el analito puede ser detectado o determinado con suficiente confianza. Para ello, se usan algunos conceptos como lmite de deteccin (que a menudo se confunde con sensibilidad) y lmite de deteccin del mtodo que se aplica al procedimiento completo, a diferencia del primero que se aplica a las mediciones como parte del mtodo. La definicin ms aceptable para lmite de deteccin (LD) es la concentracin de analito que da una seal igual al blanco ms 3 veces la desviacin estndar del blanco (sbl), calculada de al menos 10 determinaciones del blanco. Debido a que en el clculo de los resultados analticos se resta el valor del blanco, el LD puede escribirse como: LD = 3 x sbl Cuando se usa un grfico de calibracin no se requieren las repetidas determinaciones del blanco, ya que el valor del blanco junto con su desviacin estndar resultan directamente del anlisis de regresin.

4.3

Lmite de cuantificacin

Para algunos propsitos se usa lmite de determinacin o lmite de cuantificacin (LC) definido como dos veces el lmite de deteccin o en otras ocasiones como diez veces la desviacin estndar del blanco: LC = 2 x LD = 6 x sbl LC = 10 x sbl

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EXACTITUD, SESGO

Una de las principales caractersticas de un mtodo que se debe conocer es si el resultado refleja el valor verdadero para el analito o propiedad. Y, si no es as, si puede cuantificarse y posiblemente corregirse el sesgo. Para responder estas preguntas, se usan referencias externas, directa o indirectamente. El procedimiento directo consiste en realizar anlisis repetidos (n10) con el mtodo sobre una muestra de referencia (de preferencia certificada) con un contenido conocido de analito. Para los mtodos empricos, es decir, aquellos en que el resultado depende del mtodo, es poco probable encontrar muestras de referencia disponibles. En estos casos, pueden usarse los procedimientos siguientes: comparacin de los resultados del mtodo con aquellos de un mtodo de referencia, ambos aplicados en las mismas muestras disponer de muestras analizadas en otro laboratorio participacin en programas de intercomparacin de laboratorios. La exactitud de un resultado analtico puede ser sensible a variaciones en las condiciones (concentracin de analito, matriz, extracto, temperatura, etc.). Por lo tanto, si un mtodo se aplica a un amplio rango de materiales, debe validarse en distintas muestras de diferentes concentraciones de analito. Numricamente, la exactitud se expresa como:
exactitud (%) =
donde:
x

x 100

= =

media de los resultados obtenidos para la muestra de referencia valor verdadero dado para la muestra de referencia

El sesgo puede expresarse como un valor absoluto por: sesgo = x - o, como un valor relativo por:
sesgo (%) = x - 100

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PRECISIN

Los anlisis repetidos sobre una muestra de referencia permiten calcular, adems de la exactitud y el sesgo, la desviacin estndar de la media como una medida de la precisin. Numricamente, la precisin se expresa por el valor absoluto de la desviacin estndar o, ms universalmente, por la desviacin estndar relativa (RSD) o por el coeficiente de variacin (CV): RSD = CV (%) =
donde: s x

s x

s 100 x

= =

desviacin estndar de x media de los resultados obtenidos para la muestra de referencia

SENSIBILIDAD

La sensibilidad es una medida de la respuesta del instrumento o del mtodo completo a la concentracin del analito, es decir, es la pendiente del grfico de calibracin.

La sensibilidad para el analito en el extracto final de la muestra no necesariamente es igual a la sensibilidad para el analito en una solucin estndar simple. La sensibilidad puede no ser constante en todo el rango, generalmente disminuye a mayores concentraciones. En general, en cualquier punto del grfico de calibracin, la sensibilidad puede expresarse por: S=
donde: S y C

y C

= = =

sensibilidad cambio en la respuesta y debida a un C cambio en la concentracin de analito

Las dimensiones de S dependen de las dimensiones de y y C. En espectrofotometra de absorcin atmica, por ejemplo, S se expresa generalmente en unidades de absorbancia por mg/L.
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En los grficos de calibracin lineales, del tipo y = a + bx, la pendiente b es la sensibilidad.

RANGO DE TRABAJO

Para la mayora de los mtodos, el rango de trabajo se conoce de experiencias previas. Cuando se introduce un mtodo nuevo este rango debe determinarse, especialmente el lmite superior del rango, ya que el lmite inferior corresponde al lmite de deteccin ya discutido. Para determinar el rango de medicin puede aplicarse el procedimiento siguiente: Preparar una solucin estndar del analito en la matriz relevante (extractante) con una concentracin ms alta que la mayor esperada. Medir esta solucin y anotar la respuesta Diluir la solucin estndar 10x con la solucin matriz y medir nuevamente. Repetir la dilucin y medicin hasta que el instrumento no responda. Dibujar el grfico de calibracin de la respuesta versus la concentracin Estimar la parte til del grfico.

Si la dilucin 10x es demasiado alta para obtener un grfico adecuado, puede usarse por ej. 5x.

ESPECIFICIDAD

Un mtodo analtico es especfico cuando da una seal analtica exclusivamente para un componente particular pero no da seales para todos los otros componentes presentes en la muestra. En aquellos casos en que la matriz de la muestra es variable, se recomienda que la especificidad se establezca para los diferentes tipos de matriz en forma independiente. La especificidad puede verificarse de diferentes maneras, dependiendo del tipo de anlisis a realizar: Se prepara una solucin estndar del analito con una concentracin similar a la que se espera que tenga la solucin de la muestra y se comparan las mediciones en ambas soluciones. Se prepara una solucin estndar del analito con una concentracin similar a la que se espera que tenga la solucin de la muestra. Se fortifican ambas soluciones con una cantidad equivalente de la matriz y se comparan las mediciones de ambas soluciones.
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Se prepara una solucin estndar del analito con una concentracin similar a la que se espera que tenga la solucin de la muestra. Se fortifican ambas soluciones con una cantidad equivalente de analito y se comparan las mediciones de ambas soluciones.

Tambin pueden usarse soluciones, tanto de la muestra como del estndar, fortificadas con varias concentraciones de analito. Esto permite determinar el grado de interferencia, dependiendo de la concentracin del analito a determinar. Estos datos pueden obtenerse del estudio de linealidad del mtodo utilizando la adicin estndar.

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SELECTIVIDAD

Un mtodo es selectivo cuando produce resultados analticos correctos para varios componentes de una mezcla sin ninguna interaccin mutua de los componentes. En los informes de validacin, la selectividad y la especificidad generalmente se describen, no se expresan cuantitativamente.

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RECUPERACIN

La recuperacin se define como la fraccin del analito determinada despus de la adicin de una cantidad conocida de analito a la muestra. En la prctica, las muestras de control son las ms usadas para la adicin de analito en una concentracin generalmente equivalente al medio del rango de trabajo. Se analizan las muestras con y sin adicin de analito al menos 10 veces y se calculan las medias y las desviaciones estndares. Con estos datos se puede calcular la repetibilidad (repeticiones en la misma tanda) y la reproducibilidad dentro del laboratorio (repeticiones en distintas tandas). La recuperacin se calcula como:
x x Recuperacin (%) = + 100 x ag
donde:

xag

x+ x

= = =

media de los resultados de la muestra con adicin de analito media de los resultados de la muestra cantidad agregada de analito

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ROBUSTEZ

Un mtodo analtico es robusto si los resultados no son muy sensibles a las variaciones en las condiciones experimentales. Tales condiciones experimentales pueden ser: temperatura, duracin de la extraccin o agitacin, tcnica de agitacin, pH, pureza de los reactivos, contenido de humedad de la muestra, tamao de la muestra, etc. El mtodo ms conveniente para estimar la robustez es el denominado diseo factorial parcial de Youden y Steiner, el cual con slo 8 repeticiones se pueden variar y analizar 7 factores. La matriz del diseo es la siguiente:

Experimento

1 2 3 4 5 6 7 8

A + + + + -

B + + + + -

Factores C D E + + + + + + + + + + + +

F + + + +

G + + + + -

Resultados

Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8

Las 8 submuestras se analizan bsicamente segn el procedimiento de operacin del mtodo y las variaciones se indican por los signos + o que significan un nivel alto o bajo, la presencia o ausencia de un factor, u otras condiciones a investigar. El efecto absoluto (sesgo) de cada factor A a G se puede calcular como sigue: Efecto
donde: YA+ = YA- =

(absoluto) =

Y A + YA 4

suma de los resultados Yi donde el factor A tiene un signo + (Y1+Y2+Y3+Y4; n=4) suma de los resultados Yi donde el factor A tiene un signo (Y5+Y6+Y7+Y8; n=4)

La prueba de significancia del efecto puede hacerse de dos maneras: 1. Con la prueba de t usando los valores crticos de tabla para dos colas con n=4. Cuando se espera que el efecto acte en una sola direccin puede usarse la prueba para una cola. 2. Probando si el efecto excede la precisin del procedimiento original, es decir, si el efecto excede el ruido. Ms prctico y real sera en este caso usar sgc, desviacin
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estndar dentro del laboratorio tomada de los grficos de control. La desviacin estndar de la media de las mediciones puede asumirse como sgc/4 y la desviacin estndar de la diferencia entre las dos medias (desviacin estndar del efecto, sE) como sE = 2(sgc)2/4 = sgc/2. El efecto puede considerarse significativo si excede 2 veces la desviacin estndar del procedimiento, es decir, (2 x sgc/2). Por lo tanto, el efecto es significativo cuando: Efecto>1,4 x sgc
donde: sgc = desviacin estndar del procedimiento original tomada del grfico de control

No siempre es posible o deseable variar siete factores, pero el mtodo descrito no permite una reduccin de factores. Para estudiar slo tres factores se puede usar el siguiente diseo:

Experimento

1 2 3 4

Factores A B C + + + + + + -

Resultados

Y1 Y2 Y3 Y4

El efecto absoluto de los factores A, B y C puede calcularse como: Efecto

donde: YA+ = YA- =

(absoluto) =

YA + YA 2

suma de los resultados Yi donde el factor A tiene un signo + (Y1+Y3; n=2) suma de los resultados Yi donde el factor A tiene un signo (Y2+Y4; n=2)

La prueba de significancia del efecto puede hacerse en forma similar a la descrita para siete factores, con la diferencia que aqu el n=2.

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INTERFERENCIAS

Muchos mtodos analticos son susceptibles, en un mayor o menor grado, a interferencias de varios tipos. Una validacin adecuada debera considerar tales influencias. Idealmente, las interferencias deben cuantificarse como sesgo y corregirse, pero a menudo esto es prcticamente imposible.

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APLICABILIDAD

Cuando se propone un nuevo mtodo o cuando se debe escoger un mtodo para una determinacin, puede ser til una descripcin de la facilidad o dificultad de su aplicacin. Los problemas, en la mayora de los casos, se relacionan con la disponibilidad y mantencin de ciertos equipos y con los requerimientos de personal especializado. Si se conocen limitaciones de aplicabilidad del mtodo, deben mencionarse en el informe de validacin.

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ADECUACIN AL PROPSITO

La adecuacin al propsito es el grado en que el rendimiento de un mtodo se ajusta a los criterios acordados entre el analista y el usuario final de los datos, que describen las necesidades del usuario final. Por ejemplo, los errores en los datos no deben ser de una magnitud que aumente la probabilidad definida de tomar decisiones incorrectas a partir de ellos, pero no deben ser tan pequeos como para que las pruebas resulten ser un gasto intil para el usuario final.

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BIBLIOGRAFA

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