PLATAFORMA DE CITOMETRIA DE FLUXO NCLEO DE ANLISE E SORTING INSTITUTO OSWALDO CRUZ FIOCRUZ

APOSTILA DE INSTRUES PARA AQUISIO DE AMOSTRAS EM CITMETRO DE FLUXO FACSCALIBUR

Elaborado por

LVARO LUIZ BERTHO Raquel Ferraz Amanda Torrentes

agosto de 2012

AQUISIO DE AMOSTRAS Nota: Ligar sempre o citmetro antes do computador. A pgina inicial do Macintosh abrir, exibindo cones e os menus no topo da pgina; Clicar na ma no canto superior esquerdo; Selecionar o programa Cell Quest; abrir a pgina inicial do programa com todos os menus para o Setting (Fig. 1); clicar em Acquire (seta vermelha) (Fig. 1);

Figura 1

Figura 1

e em seguida em Connect to Cytomete (seta) (fig. 2).

Figura 2

Ao conectar o computador ao citmetro aparecer o menu de aquisio Acquisition Contro (Fig.3);

Figura 3 Neste menu, voc pode Iniciar a aquisio (Acquire); Reiniciar a aquisio (Restart); Salvar a aquisio (Save); ou Abortar a Aquisio (Abort). Nota: Para aquisies ininterruptas mantenha o item Setup acionado (seta vermelha, Fig. 3)

Para definir a quantidade de eventos a serem adquiridos, parmetros e as resolues de aquisio, clicar em Acquire (Fig. 1 - seta) mais uma vez; clicar em Acquisition and Storage (Fig. 2); aparecer o menu exibido na Fig. 4.

Figura 4

Neste menu se podem escolher os critrios para salvar e exibir os eventos da amostra. Em Acquisition Gate (Fig. 4) se definem quais eventos sero salvos, desta forma, na prpria aquisio se determina se sero aceitos ou rejeitados eventos que componham uma determinada populao. Estes eventos podem compor uma populao no dot plot de morfologia ou mesmo uma populao fenotipada, por exemplo rejeitar as clulas CD4+. Desta forma, no arquivo haver todos os eventos, exceto as CD4+. Em geral deixa-se este item como mostrado na figura, pois melhor ter todas as populaes celulares no arquivo adquirido e exclu-las apenas na anlise. No item Collection Criteria se define apenas que a aquisio ser encerrada quando o nmero de eventos determinado pelo usurio for alcanado, seja de eventos totais ou de eventos de uma regio. Em Storage Gate os eventos que passam no Gate de aquisio (Acquisition Gate) e no Storage Gate sero salvos no arquivo. aconselhvel deixar tambm como exibido no menu default. No item Resolution se deve selecionar o valor 256. Em Parameters Saved se determinam quais parmetros sero salvos, como mostrado na Fig. 5. Nota: Devem ser selecionados sempre FSC, SSC (morfologia) e as cores das fluorescncias usadas no experimento que est sendo adquirido.

Figura 5

Clicar mais uma vez em Acquire (Fig. 1) e em seguida em Parameter Description (Fig. 2); O Menu exibido na Fig. 6 aparecer, onde se determinam o nome e o destino dos arquivos a serem salvos; Para selecionar a pasta onde os arquivos sero salvos deve-se clicar em Folder e em seguida na pasta desejada, se a lista de pastas no aparecer clique em Desktop direita e em seguida na pasta. Aps selecionar a pasta na lista clique no boto longo abaixo da lista Select XXX. Em seguida clique em File, aparecer o Menu exibido na Fig. 7, onde deve-se escolher o nome dos arquivos em Custom Prefix. Nota: No esquea de anotar o nome do arquivo no seu caderno de protocolos para saber as marcaes de cada file para anlise.

Figura 6

No mesmo Menu, se escolhe em File Name Prefix (Fig. 7 seta) a opo Sample ID. Em File Name Suffix manter como na Figura 7 em File Count. Se for mantida esta configurao, todos os arquivos tero o mesmo nome e sero numerados em ordem crescente a partir do nmero 1, automaticamente. gura 6

Figura 7

Ainda no Menu Parameter Description (Fig. 6) se repete no item Sample ID o nome dado aos arquivos (Fig 7 - Custom Prefix) e se coloca o nome dos eixos dos grficos gerados. Por exemplo: P1-FSC; P2-SSC; P3-FL1; P4-FL2; P5-FL3. Podese ainda escolher outros nomes para os eixos, como por exemplo, as molculas reconhecidas pelos anticorpos: antiCD3-FITC, no se colocaria FL1 como nome do eixo P1, mas sim CD3. A desvantagem em experimentos grandes que nem sempre o FITC est conjugado s ao CD3. Geralmente h outros anticorpos conjugados ao mesmo fluorocromo e melhor simplesmente colocar a fluorescncia mesmo (FITC) e na anlise alterar o eixo de cada grfico para o anticorpo pertinente. O Menu da Fig. 6 no tem OK, deve-se fech-lo no quadrado superior esquerdo. De volta ao Menu principal exibido na Fig. 1, clicar em Cytometer e em seguida em Detectors/Amps (Fig. 8, seta).

Figura 8 O Menu exibido na Fig. 9 aparecer e onde fazemos o ajuste dos Ganhos (Amp Gain) e Voltagens (Voltage) nos PMTs. Nota: importante que estes ajustes sejam feitos corretamente durante a aquisio j que no podero ser alterados na anlise off-line.

Figura 9

Nota: Perda de populaes na aquisio O padro morfolgico ideal ajustado deve conter todos os eventos de interesse, pois eventos excludos nesta etapa no sero salvos e, logo, no sero analisados quanto fluorescncia. Notar que em C os linfcitos foram perdidos e isso no deve acontecer. Em D mostrado o perfil ideal de aquisio da populao, sem excesso de debris ou perda de populaes celulares. Nota: Definindo a regio de debris e clulas vivas Ao passar no citmetro amostras com padro morfolgico desconhecido, que no se sabe ao certo qual a regio de debris e as regies de clulas viveis, deve-se fazer marcao com iodeto de propdio (PI) (10-50 ug/ml - PI, altamente txico). Os debris marcaro principalmente em vermelho (FL3) e as clulas viveis sero PI negativas por manterem a integridade de membrana. Nota: Excluindo os debris na aquisio Aps definir a populao de debris, h duas formas de exclu-los: a) baixar a voltagem de FSC at que a populao de debris seja excluda do dot plot de morfologia e, consequentemente, haja pouca marcao de debris com PI no histograma em FL3 ou; b) aumentar o Threshold de FSC at que a populao de debris deixe de ser visualizada no dot plot e no histograma de FL3. O Threshold deve ser acessado clicando em Cytometer (Fig. 1) e em seguida no item Threshold (Fig. 8). O default de cada um dos itens o valor de 52, deve-se ajustar o para valor desejado como indicado acima.

Exemplo: Em A a voltagem de FL1 est muito baixa e em B muito alta. Em C a voltagem est ideal e ser mais fcil fazer a compensao em uma etapa posterior.
O Default do item Mode aparece em linear para todos os parmetros e ao adquirir amostras de clulas de mamferos o Mode de FSC e SSC deve ser mantido em linear. As fluorescncias, no entanto, devem ser alteradas para Log, exceto em

anlises de DNA. Neste Menu ainda se pode ligar o segundo laser do citmetro em Four Color (635 nm HeNe laser vermelho) se houver anticorpos conjugados a fluorocromos excitados neste compimento de onda. Se forem usados protocolos de duas, trs e quatro cores, deve-se abrir o Menu de compensao (Fig. 10); Clicar em Cytometer (Fig. 1), aparecer o Menu da Fig. 8; Clicar em Compensation (Fig. 10).

Figura 10

Exemplo: Em A e D se observa sinal em FL-1, apesar de haver apenas marcao com PE, o que significa que h vazamento da fluorescncia laranja

para o canal do verde. Este vazamento deve ser compensado aumentando o valor da subtrao FL1 FL2. Se este valor for muito alto, haver hipercompensao (overcompensation), como mostrado em B e E. O perfil correto de ajuste de FL1 mostrado em C e F. A compensao feita no Menu Compensation (Fig. 10): Nota: Para facilitar a escolha dos parmetros a serem compensados na aquisio, vamos nomear a coluna da esquerda como canal que recebe a interferncia de cor e a coluna da extrema direita cor que est interferindo (Fig. 11). canal recebe a interf. cor que est interferindo

FL1-Height

Figura 11 Desta forma, se colocarmos um tubo apenas com FITC e o dot plot estiver como ilustrado abaixo, devemos proceder da seguinte forma: canal que recebe o vazamento, no caso FL2 (pois s tem FITC, que fluoresce em FL1) menos a cor que est vazando, que s pode ser FITC (FL-1). O parmetro a ser alterado o FL2 - X.X% FL1. O nmero a ser colocado em X.X deve deixar a populao falsa duplo positiva como simples positiva para FL1. Nota: Se as amostras forem muito heterogneas, p. ex. clulas de indivduos normais e infectados, deve-se fazer um ajuste do citmetro que enquadre corretamente a morfologia e marcao de todas as amostras. Entretanto, se esta condio ideal no for possvel, pode-se fazer o ajuste das amostras normais (experimentais e controles) e salvar os arquivos. Em seguida, fazer o ajuste para infectados e salvar. Na anlise no se pode juntar (fazer overlay (sobreposio) nos histogramas) de arquivos de normais e infectados, mas as estatsticas de cada grupo (normal ou infectado) ser vlida uma vez que os controles obedecem ao mesmo ajuste do grupo. melhor fazer desta forma do que fazer um ajuste nico para ambos grupos e no ter um setting ideal para nenhum deles.

Figura 12

Voltar ao Menu principal (Fig. 1) e selecionar o item Plots; escolher o item dot plot, aparecer o Menu exibido na Fig. 12. Em Plot Source selecionar o item Acquisition e em seguida aparecero as opes nos itens X parameter e Y parameter que foram selecionadas no menu Parameters Save na Fig. 5. Escolher os eixos desejados, p. ex. FSC x SSC, FSC x FL3, FL1 x FL2, etc... Normalmente o primeiro dot plot o de morfologia (FSC x SSC). Voc pode optar por exibir no dot plo todos os eventos como mostrado na Fig.12 , ou apenas os eventos que lhe interessarem em uma regio. s fazer uma regio e escolher no item Gate a regio definida. Mesmo que voc tenha selecionado no item Acquisition & Storage (Fig. 4) para salvar 10.000 eventos totais. Nesta configurao todos os eventos estaro sendo salvos, como voc determinou, mesmo que nesse dot plot s apaream os eventos na regio que voc escolheu visualizar na Fig. 12.

Repetir este processo para cada dot plot que desejar abrir. Por exemplo, se voc fez marcao com FITC, PE e Cychrome deve abrir os dot plots FL-1xFL-2, FL1 x FL-3 e FL-2 x FL-3, alm do dot plot de morfologia. Para abrir os histogramas retorne ao Menu principal exibido na Fig. 1 e clique de novo em Plots, selecione agora histogram. Aparecer uma janela semelhante mostrada na fig. 11 com as mesmas instrues para abrir os histogramas. No caso do exemplo da marcao acima se devem abrir trs histogramas, de FL-1, FL-2 e FL-3.

Neste ponto j possvel colocar as primeiras amostras para ajustar o aparelho, sempre com o item setup exibido na Fig. 3 selecionado. Desta forma nenhum arquivo ser salvo durante o processo de ajuste. Quando o ajuste do citmetro estiver satisfatrio em termos de morfologia, voltagens e sem vazamentos, deve-se clicar no item setup (Fig. 3). O menu exibido na Fig. 13 aparecer e s clicar em Acquire para que o aparelho faa a aquisio dos eventos determinados pelo usurio. A aquisio ir parar quando o nmero de eventos pr-determinado for alcanado e o prximo arquivo mudar automaticamente para o prximo nmero em ordem crescente.

Figura 12