Validacin del mtodo analtico para el control de la calidad y estudio de estabilidad de ketotifeno colirio 0,025 %

ARTCULOS ORIGINALES

Validacin del mtodo analtico para el control de la calidad y estudio de estabilidad de ketotifeno colirio 0,025 %

Validation of analytical method to quality control and the stability study of 0.025 % eyedrops Ketotiphen
Yenilen Troche Concepcin I ; Jacqueline Aylema Romero DazII ; Caridad M. Garca Pea III ; Martha Botet Garca I ; Marisleydi Begu David IV
I Licenciada en Ciencias Farmacuticas. Empresa Farmacutica "Julio Trigo". La Habana, Cuba. II Licenciada en Bioqumica. Investigadora Aspirante. Centro de Investigacin y Desarrollo de Medicamentos IIIMster en Tecnologa y Control de Medicamentos. Investigadora Agregada. CIDEM. La Habana, Cuba. IV Tcnico en Tecnologa de la Salud. CIDEM. La Habana, Cuba.

(CIDEM). La Habana, Cuba.

RESUMEN El colirio de ketotifeno se indica para aliviar los signos y sntomas de las conjuntivitis alrgicas, por ser este un potente antihistamnico H1 que muestra cierta capacidad para inhibir la liberacin de histamina y otros mediadores en mastocitos. En este trabajo se desarroll y valid un mtodo analtico por cromatografa lquida de alta resolucin, para el control de la calidad y los estudios de estabilidad del ketotifeno colirio 0,025 %. El mtodo se bas en la separacin del principio activo a travs una columna cromatogrfica Lichrosorb RP-18 (5 m) (250 x 4 mm), con deteccin ultravioleta a 296 nm, para lo cual se emple una fase mvil compuesta por una mezcla desgasificada de metanol:buffer fosfato (75:25; pH 8,5) y se le aadi 1 mL de isopropanol por cada 1 000 mL de la mezcla anterior, con una velocidad de flujo de 1,2 mL/min. El mtodo analtico result lineal, preciso, especfico y exacto en el intervalo de concentraciones estudiadas. Palabras clave: Cromatografa lquida de alta resolucin, mtodos, ketotifeno, validacin. ABSTRACT The Ketotiphen eyedrop is prescribed to relief the signs and symptoms of allergic conjunctivitis due to its potent H1 antihistaminic effect showing some ability to inhibit the histamine release and other mediators in cases of mastocytosis. The aim of present paper was to develop and validate an analytical method for the high-performance liquid chromatography, to quality control and the stability studies of 0.025 % eyedrop Ketotiphen. Method was based on active principle separation by means of a Lichrosorb RP-18 (5 m) (250 x 4 mm), with UV detection to 296 nm using a mobile phase including a non-gasified mixture of methanol:bufferphosphate (75:25; pH 8.5) adding 1 mL of Isopropanol by each 1 000 mL of the previous mixture at a 1.2 mL/min flow velocity. The analytical method was linear, accurate, specific and exact during the study concentrations. Key words: High-performance liquid chromatography, methods, Ketotiphen, validation.

INTRODUCCIN
El ketotifeno es un potente antihistamnico H1 que muestra cierta capacidad para inhibir la liberacin de

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histamina y otros mediadores en mastocitos. Se cree que acta inhibiendo la liberacin de mediadores qumicos producidos por los leucocitos y los mastocitos sensibilizados. 1,2 El desarrollo de tcnicas o mtodos analticos novedosos o la adecuacin de algunos ya reportados es un problema cotidiano. Siempre que esto suceda se exige como parte integral del estudio, la validacin del mtodo en cuestin. La validacin proporciona un alto grado de confianza y seguridad del proceso productivo o del mtodo analtico as como tambin en la calidad de los resultados. 3,4 Los parmetros analticos evaluados en la validacin del mtodo analtico, fueron exactitud, precisin, especificidad, robustez y linealidad.4-6 El objetivo del presente trabajo fue el desarrollo y la validacin de un mtodo analtico para la determinacin del principio activo en el colirio de ketotifeno 0,05 %, por cromatografa lquida de alta resolucin (CLAR).

MTODOS
La sustancia de referencia qumica de ketotifeno fumarato fue suministrada por el grupo de sustancias de referencia del Centro de Investigacin y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM, La Habana, Cuba), el cual fue analizado por el mtodo cromatogrfico establecido para realizar el control de la calidad de la materia prima, con una pureza de 99,8 %. El producto terminado en forma de colirio, fue elaborado en la Empresa Farmacutica "Julio Trigo", identificado como el lote 7001, fabricado en diciembre de 2007, con fecha de vencimiento diciembre de 2009, el cual cumpli con las especificaciones de calidad establecidas para el control de la calidad de los colirios. Todos los reactivos utilizados fueron de grado HPLC. En el ensayo se emple un cromatgrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 296 nm, un inyector con un loop de 20 L e integrador (SHIMADZU CR 8 A). La separacin se realiz isocrticamente empleando una columna Lichrosorb RP-18 (5 m) (250 x 4 mm) y un flujo de 1,2 mL/min. La fase mvil ptima, consisti en una mezcla desgasificada de solucin A y acetonitrilo en una proporcin de 80:20.4,5 La solucin A se prepar empleando metanol:buffer fosfato, en una proporcin de 75:25, ajustando pH a 8,5; una vez preparada esta solucin se le aadi 1 mL de isopropanol por cada 1 000 mL de la mezcla anterior de solucin amortiguadora fosfato de potasio monobsico 0,025 Molar a pH= 4,6. La solucin de referencia se obtuvo disolviendo ketotifeno fumarato, sustancia de referencia, en 20 mL de fase mvil; se aplic ultrasonido durante 10 min hasta disolucin y se complet hasta un volumen de 100 mL con metanol, a una concentracin de 40 g/mL. En la preparacin de la solucin de ensayo para la valoracin, se disolvi una alcuota de la muestra del colirio en metanol hasta un volumen de 10 mL, a una concentracin de 40 g/mL Validacin del mtodo analtico La validacin fue realizada segn la categora I (USP 30) y la Regulacin 41-2007 del Centro para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos (CECMED), para la validacin de mtodos de anlisis; se evaluron los parmetros que a continuacin se describen: 3,6 Linealidad Para el anlisis de la linealidad se realiz el modelo de 3 determinaciones para 5 concentraciones diferentes: 60, 80, 100,120 y 140 %. Se determin la ecuacin de la recta, el coeficiente de correlacin, la prueba de significacin estadstica de significacin de la pendiente Sb rel (%), los coeficiente de variacin de los factores de respuesta, ensayo de proporcionalidad. Exactitud Para el anlisis de exactitud se realiz el modelo de 3 rplicas para 3 concentraciones diferentes: 80, 100, 120 %; se determin el % de recuperacin, la desviacin estndar y el coeficiente de variacin. Se aplic adems el ensayo de Gochran con vistas a comprobar si la variacin de la concentracin produca diferencias significativas en los resultados y la prueba t de Student para determinar diferencias significativas entre la recuperacin media y el 100 %. Precisin

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Para el estudio de la precisin se aplic el modelo de repetibilidad con 6 rplicas. Con ellas se determinaron los valores medios, la desviacin estndar y el coeficiente de variacin. De igual manera para el ensayo de la precisin intermedia se utilizaron 3 valores de concentracin que correspondieron al 80, 100 y 120 % para 2 analistas y 3 das diferentes. Se aplic la prueba de Fisher y de la t de Student para determinar si existan diferencias significativas entre los resultados al variar las condiciones de anlisis. Especificidad Para el estudio de especificidad se analizaron: la sustancia de referencia de ketotifeno fumarato, el placebo, las muestras del producto terminado (colirio) y muestras sometidas a condiciones drsticas como: hidrlisis cida (con cido clorhdrico 5 N), hidrlisis bsica (con hidrxido de sodio 5 N), oxidacin (con perxido de hidrgeno) y exposicin a la luz durante 7 das. Criterio de aceptacin: No se deban obtenerse seales del placebo y de los productos de degradacin en la zona de elusin del principio activo. Las reas bajo las curvas del patrn y del ketotifeno en el producto terminado deban ser similares.

RESULTADOS
La figura muestra los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del mtodo. Se observa en el cromatograma correspondiente a la muestra placebo (A) que no se obtuvo ninguna seal en la zona de inters, al ser comparado con la seal obtenida para la sustancia de referencia (B) y de la muestra de ketotifeno en el colirio (C), lo cual indica que los excipientes o sustancias auxiliares de la formulacin no interfieren en la determinacin del principio activo. En cuanto a las muestras sometidas a condiciones drsticas de oxidacin, hidrlisis cida, hidrlisis bsica y la muestra sometida a la luz que se observan en los cromatogramas (D, E, F y G), la aparicin de picos secundarios es atribuible a un posible producto de degradacin, el cual no interfiere en la determinacin del principio activo. En la tabla 1 se reportan los resultados de los estudios de la linealidad del sistema, el coeficiente de regresin lineal fue de 0,9987 y el coeficiente de variacin del factor de respuesta result igual a 1,50 %. Los resultados del estudio de precisin del mtodo aparecen reportados en la tabla 2. En el estudio de repetibilidad realizado, la media obtenida fue de 100,44 % y el coeficiente de variacin fue de 0,20 %, mientras que los valores de F calculadas y los valores de t calculadas fueron menores que los valores tabulados, para un 95 % de confianza, para cada uno de los niveles estudiados. Tabla 2. Resultados del estudio de la precisin intermedia del mtodo analtico Niveles Analista 1 (%) Da 1 80,9 80 % 80,5 80,6 100,5 100 % 101,0 100,5 120,1 120 % 120,0 119,5 Parmetros Prueba de Fisher por analistas (Ftab (8/8; 0,05) = 3,44) Prueba de Fisher por das (Ftab (5/5; 0,05)= 5,05) 1/2 3,86 1,22 5,01 Da 2 80,7 80,6 80,6 100,3 100,2 100,4 121,0 121,0 120,5 Da 3 80,8 80,6 80,8 100,7 100,8 100,3 120,6 120,6 120,7 Da 1 80,6 80,6 80,7 100,8 100,8 100,6 121,1 120,8 120,5 Resultados 1,05 1,28 2,90 2/3 3,50 2,39 1,25 1/3 4,34 4,76 3,99 Fcalc= Ftab Fcalc= Ftab Analista 2 (%) Da 2 80,9 80,8 80,9 100,3 100,6 100,4 120,5 120,6 120,5 Da 3 80,6 80,7 80,7 100,3 100,9 100,1 120,3 120,2 121,0 Lmites

Anlisis estadstico

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Prueba t de Student por analistas (ttab (16; 0,05)=2,12) Pueba t de Student por das (ttab (10; 0,05)= 2,22) 1/2 0,15 2,17 1,45

0,58 0,04 1,03 2/3 0,85 0,55 0,93 1/3 1,05 1,10 1,28 tcalc= ttab tcalc= ttab

tcal: t calculada; Fcal: F calculada; ttab: t tabulada; Fcal: F tabulada; %: Los datos corresponden al porcentaje de principio activo en la formulacin. En la tabla 3, aparece reportado los resultados del estudio de exactitud. La recuperacin media fue de 100,23 % y el valor de t calculada (2,05) y de G calculada (0,412) fueron menores que los valores tabulados, para un 95 % de confianza, t tabulada 2,306 y G tabulada 0,797.

DISCUSIN
Los resultados del estudio de especificidad del mtodo, que se muestran en la figura, demuestran la especificidad del mtodo al no presentarse interferencias de picos adicionales en la zona de elucin del producto principal, ya que los productos de degradacin y los excipientes de la formulacin presentan tiempos de retenciones diferentes al principio activo, todos inferiores al tiempo de retencin del ketotifeno. Este estudio permite concluir que el mtodo cromatogrfico result ser especfico pues permite cuantificar el principio activo despus de la degradacin de este en muestras de medicamento sin interferencias de excipientes y/o producto de degradacin. 4 Los resultados del estudio de linealidad muestran coeficientes de regresin y de determinacin superiores a los exigidos, 0,99 y 0,98 respectivamente; se demostr con el valor del coeficiente de correlacin obtenido, cercano a la unidad, la existencia de correlacin con una probabilidad elevada, as como el grado de relacin entre las variables concentracin y respuesta detectada por el equipo empleado. Tambin el coeficiente de variacin de los factores de respuesta y la desviacin estndar relativa de la pendiente fueron inferiores al normado como mximo para estos indicadores: 5 y 2 %, respectivamente, ambos son considerados estimadores puntuales que permiten caracterizar la variabilidad. El valor obtenido del (CVf) permiti demostrar que existe variabilidad en la relacin respuesta y concentracin para cada nivel evaluado. El intervalo de confianza del intercepto incluye al cero, lo que permite excluir la significacin del error del intercepto. Se demostr con estos resultados la linealidad del mtodo propuesto. En el estudio de la repetibilidad realizado a una misma muestra, por el mismo analista, el mismo da, a travs de 6 rplicas, se alcanz un coeficiente de variacin adecuado (0,20 %), lo que demostr la buena precisin del mtodo, observndose una variabilidad de los resultados dentro de los lmites establecidos para los mtodos cromatogrficos: CV 2,0 %.6 Los valores que se obtienen en el estudio de precisin intermedia, de las pruebas de Fischer y t de Student, para el estudio de la precisin intermedia demostraron que no existan diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por los analistas en diferentes das para una probabilidad de 0,05 %, ya que el valor de F calculada es menor que la F tabulada, este resultado permite establecer que las precisiones son similares. Al realizar la prueba de t de Student el valor calculado result menor que el tabulado, para una probabilidad de 0,05, lo cual demostr que no existan diferencias significativas entre las medias alcanzadas, con un nivel de significacin de un 5 %. Los valores de porcentaje de recobrado estuvieron dentro de los lmites establecidos para los mtodos cromatogrficos (98-102 %) y los valores del coeficiente de variacin para cada uno de los valores de concentracin estudiados resultaron ser menor que el 2 %.4 En la influencia del factor concentracin sobre la variabilidad de los resultados de la exactitud al aplicar la prueba de Cochran, se obtuvo que G calculada fue menor que G tabulada para una probabilidad de 0,05, k= 3 y n= 3; por lo tanto, las varianzas de las concentraciones empleadas son equivalentes, lo cual indica que la concentracin no influye en la variabilidad de estos. Al realizar la prueba de significacin entre la recuperacin media y el 100,0 % de recuperacin, con un coeficiente de variacin de 0,35 %, se obtuvo una t calculada menor que t tabulada. 6 Los resultados demostraron la capacidad del mtodo para dar resultados cercanos al valor verdadero, observndose una buena exactitud.

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El mtodo analtico validado por CLAR, para la cuantificacin del principio activo del colirio de ketotifeno 0,025 % para el control de la calidad y el estudio de estabilidad result ser lineal, preciso, exacto, robusto y especfico en el intervalo de concentraciones establecido del 60 al 140 %.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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