CHRISTUS FACULDADE DO PIAU - CHRISFAPI DEPTO.

DE FISIOTERAPIA - BLOCO II DISCPLINA: MICROBIOLOGIA PROF: ETIELE ANDRADE

TCNICA DA COLORAO DE GRAN

Waleska, Kamayo Elizete, Thiago, Andr

Piripiri PI 31 de Agosto de 2012

- RESUMO Observar a colorao para determinar a qual grupo a bactria pertencia foi um objetivo nesse experimento. Atravs de produtos qumicos utilizados pode-se chegar colorao desejada para que fossem notadas as bactrias. Alguns erros foram encontrados, mas, esclarecidos com um estudo aprofundado na produo deste relatrio.

- INTRODUO Mtodo de colorao de bactrias desenvolvido pelo mdico

dinamarqus Hans Christian Joachim Gram, em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes, cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina bsica. Essa tcnica permite a separao de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gramnegativas baseando-se na composio da parede bacteriana, e permitindo determinar a morfologia e o tamanho das bactrias analisadas. O mtodo colorao de Gram, baseado na capacidade das paredes celulares bactrias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta durante um tratamento com etanol-ocetona enquanto que as paredes celulares de bactrias Gram-negativas no o fazem. A colorao de Gram um dos mais importantes mtodos de colorao utilizados em laboratrios de microbiologia sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterizao de amostras de bactrias. A tcnica tem importncia clnica uma vez que muitas das bactrias associadas a infeces prontamente observadas e caracterizadas como Grampositivas ou Gram-negativas em esfregaos de pus ou de fluidos orgnicos. Essa informao permite ao clnico monitorar a infeco at que dados de cultura estejam disponveis. possvel a analise de vrios esfregaos por lmina, o que facilita a comparao de espcimes clnicos. As lminas podem ser montadas permanentemente e preservadas como a documentao. O mtodo consiste no tratamento de uma amostra contendo bactrias, com um corante primrio, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactrias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idntica o corante primrio e o fixador, adquirindo uma colorao violeta, devido formao de um complexo cristal violeta-iodo, insolvel (iodopararrosanilina), em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgnico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a poro lipdica das membranas externas das bactrias Gram-negativas e o complexo violeta-iodo removido descolorando as clulas. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactrias Gram-positivas e provoca a contrao dos poros peptidoglicano tornando-as impermeveis ao solvente; o corante retido e as clulas permanecem coradas.

A etapa da descolorao critica, pois a exposio prolongada ao solvente ir provocar a remoo do cristal violeta dos dois tipos de bactrias podendo produzir resultados falsos. A reteno ou no do corante primrio, , portanto dependente das propriedades fsicas e qumicas das paredes celulares bacterianas, tais como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra tratada com um corante secundrio, a fucsina bsica. Ao microscpio, as clulas Gram-positivas aparecero coradas em violeta-escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Clulas de bactrias Gram-positivas, clulas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes fsicos ou qumicos, tendem a perder o cristal-violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as clulas coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" s so obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido.

- OBJETIVOS Aprender a realizar a colorao de Gram e compreender porque determinadas bactrias se comportam como Gram positivas ou Gram negativas.

- PARTE EXPERIMENTAL - Material material retirado da boca iogurte fermento Fleischmann (fermento biolgico) ou fungo Saccharomyces cerevisiae culturas bacterianas em caldo e em gar nutriente lminas de vidro ala de inoculao cotonetes reagentes para a colorao de Gram (violeta de genciana, lugol, lcool 95, fucsina ou safranina). recipiente para a colorao de Gram

- PROCEDIMENTO 1 - Preparo dos esfregaos Para material em meio lquido (iogurte, fermento em gua, cultura bacteriana em caldo). Com auxlio da ala de inoculao previamente esterilizada, colocar 2 - 3 alquotas da amostra em uma lmina de vidro. Espalhar bem sobre a superfcie da lmina, fazendo movimentos circulares. Deixar secar ao ar. Flambar a ala na chama do bico de gs antes de recoloc-la em seu lugar. Para material em meio slido (culturas bacterianas em placa) Com auxlio da ala de inoculao, previamente esterilizada, colocar uma gota de soluo salina na superfcie de uma lmina de vidro. Flambar a ala, deixar esfriar e coletar uma alquota da cultura bacteriana. Misturar na gota de soluo salina, fazendo uma suspenso homognea. Deixar secar ao ar. Flambar a ala na chama do bico de gs antes de recoloc-la em seu lugar. Para material retirado da boca Friccionar a superfcie da mucosa oral com um cotonete estril. Fazer um esfregao com o material coletado, na superfcie de uma lmina de vidro, com movimentos circulares. Deixar secar ao ar.

2 - Fixao dos Esfregaos Aps a secagem, fixar os esfregaos, passando as lminas cerca de 3 vezes sobre a chama do bico de gs. Deixar esfriar e corar. 3 - Colorao de Gram Colocar a lmina no recipiente para a colorao de Gram. Cobrir o esfregao com soluo de violeta de genciana. Aguardar 1 minuto e desprezar o corante no recipiente. Cobrir com lugol, aguardar 1 minuto, e desprezar o corante no recipiente.

 Inclinar a lmina, gotejar lcool etlico a 95% at que no haja desprendimento de corante. Lavar a lmina rapidamente em gua corrente. Cobrir com fucsina ou safranina. Aguardar 30 segundos e lavar a lmina. Secar com papel toalha sem esfregar a lmina. Observar ao microscpio em menor aumento e, a seguir, colocar 1 gota de leo mineral na lmina e focalizar com objetiva de imerso. Desenhar as bactrias observadas considerando o tipo de colorao (Gram + ou -), a forma e o arranjo das clulas. Aps o uso, a objetiva de imerso deve ser limpa com papel absorvente.

- RESULTADOS E CONCLUSES Aps o procedimento realizado, a lamina foi levada ao microscpio para a observao, onde notou-se uma cor rosa. Depois de ser observada atentamente por algumas vezes concluiu-se que as bactrias eram do tipo Gram-negativo. Conhecer sobre essa tcnica foi de grande importncia, pois incentivou mais ao estudo, viu-se que o com o descobrimento dessa tcnica tambm trouxe informaes at ento desconhecidas e que auxiliar no andamento do curso.

- REFERENCIAS * PERAZZOLO, Luciane M. Biologia Celular, UFSC. Disponvel em: www.liaaq.ufsc.br/aulas/Gram%20complemento.PDF