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UNIVERSIDADE DE SO PAULO Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz Departamento de Cincias Biolgicas

ROTEIRO DE AULAS PRTICAS BIOQUMICA

PROF. DR. DANIEL SHERER DE MOURA PROFA. DRA. HELAINE CARRER PROF. DR.LUIZ ANTONIO GALLO PROF. DR. LUIZ CARLOS BASSO PROF. DR. MURILO MELO

Piracicaba - SP 2012

2 SUMARIO ASSUNTO Normas para redao do relatrio de aulas prticas de Bioqumica Colorimetria e Espectrofotometria Determinao de Aucares Redutores Cromatografia em Papel de Filtro Determinao de Protenas (reao do biureto) Determinao da Constante de Michaelis (Km) e da Velocidade mxima (Vm) de uma Enzima. Reao de Hill (Fotlise da gua) Redutase de Nitrato em Plantas Listas de Exerccios 30 34 37 40 03 04 10 21 27 pg

3 NORMAS PARA REDAO DO RELATRIO DE AULAS PRTICAS DE BIOQUMICA LCB 208 (OPCIONAL) A forma para se redigir o relatrio deve ser respeitada, uma vez que a avaliao do mesmo feita de acordo com esta orientao. Assim todo relatrio devera conter os seguintes itens: CAPA Devera ter: Nome da ESALQ. Depto de Cincias Biolgicas Relatrio de aulas prticas de Bioqumica Ttulo da aula (numero da aula) Nome e nmero dos alunos Data (d/m/a) OBJETIVOS INTRODUO Comentrio da aula, incluindo comparativamente os fundamentos qumicos da metodologia empregada REVISO DE LITERATURA Aspectos tericos e informativos do assunto da aula pratica encontrados na literatura MATERIAL E MTODOS (PROCEDIMENTOS) Descrever os procedimentos executados em aula, inclusive as modificaes propostas pelo professor RESULTADOS E DISCUSSO Colocar em tabelas os resultados obtidos, grficos, etc. As reta padro somente sero aceitas se forem feitas em papel milimetrado. Comentar os resultados comparando-os com os da literatura CONCLUSO Comentar quais as concluses da aula pratica. Ser claro e objetivo nas concluses. Algumas poucas linhas so suficientes. Esclarecer se os objetivos propostos foram atingidos ou no. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

4 Aula Pratica N 1 : COLORIMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA 1. OBJETIVOS Dosagens de espcies qumicas mediante a absoro de luz. 2. FUNDAMENTOS A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento analtico atravs do qual se determina a concentrao de espcies qumicas mediante a absoro de energia radiante (luz). A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatria, caracterizada pelos diversos comprimentos de onda (, expressos em m ou nm) e que apresenta a propriedade de interagir com a matria, sendo que parte de sua energia absorvida por eltrons da eletrosfera dos tomos constituintes das molculas. Uma soluo quando iluminada por luz branca, apresenta uma cor que resultante da absoro relativa dos vrios comprimentos de onda que a compem. Esta absoro, em cada comprimento de onda, depende da natureza da substncia, de usa concentrao e da espessura da mesma que atravessada pela luz. Figura 1: Espectro de radiao eletromagntica, com destaque para a regio do visvel.

5 Tabela 1 Comprimento de onda aproximado das cores Cor Comprimento deCor onda (nm) Ultraviolet <400 Amarelo a Violeta 400-450 Alaranjado Azul 450-500 Vermelho Verde 500-570 Infravermelho Comprimento de onda (nm) 570-590 590-620 620-760 >760

Figura 2: O espectro de radiao eletromagntico e sua comparao com objetos

A Lei de Lambert-Beer: A lei diz que a absorbncia proporcional concentrao da espcie qumica absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relao linear entre absorbncia ou densidade tica e concentrao, e de uma relao logartmica entre transmitncia e concentrao.

b Io I

c= concentrao da espcie qumica absorvente b= espessura atravessada pelo feixe luminoso Io= intensidade de luz incidente I= intensidade de luz emergente (transmitida) I < Io Io Ab = D.O. = K.b.c = log I (absorbncia ou densidade tica)

A = - log T = - log I / Io = log Io / I A Transmitncia ou Transmisso (T%), corresponde a: I Io I T = 100 Io 100 T

I como, Io

T
=

100

Io , temos que : I

100 = T

Io portanto, log I logo, = log

100 T

Ab = log 100 - log T

Ab = 2 log T Fotocolormetro: Figura 3 : Esquema de um fotocolorimetro (espectrofotmetro)

3. MATERIAL E MTODOS 3.1. Equipamentos e Vidrarias - Espectrofotmetro com cubetas - Pipetas de 5 mL graduadas - Estante com tubos de ensaio 3.2. Reagentes - Alaranjado de Metila: Concentrao: ______ - Azul de Bromofenol : Concentrao: ______ 3.3. Procedimento: A. Coleta de dados para a construo do espectro de absoro do Alaranjado de Metila ou do Azul de Bromofenol (um composto para cada grupo). Usando gua destilada como referncia, efetuar as leituras de Absorbncia (ou D.O.) do Alaranjado de Metila ( nos seguintes comprimentos de onda: 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 550, 600, 650 e 700 nm) e o Azul de Bromofenol (nos seguintes comprimentos de onda: 400, 440, 490, 520, 540, 565, 580, 590, 620, 660 e 700 nm) Figura 4 Exemplo de espectro de absoro de uma amostra

Preencher os dados da tabela 1 abaixo, de acordo com o corante escolhido pelo grupo: CORANTE: ALARANJADO DE METILA Leitura Absorbnc (nM) T(%) ia 400 420 44 460 480 500 520 550 600 650 700 CORANTE: AZUL DE BROMOFENOL (nM) 400 440 490 520 540 565 580 590 620 660 700 Utilizando os dados da tabela acima preparar um grfico ( x = comprimento de onda nm )e (y = leitura em absorbncia), encontrando qual o comprimento de onde refere-se ao pico de absoro do corante usado em aula. Abs

Leitura T (%)

Absorbnci a

Qual o comprimento de onda correspondente ao pico de absoro do seu corante? ____________nm B. Demonstrao da Lei de Lambert-Beer: Preparar 6 tubos de ensaio (enumerados de 0 a 5) conforme o quadro que se segue (Tabela 2); o tubo no 6 estar contendo soluo do corante com concentrao desconhecida, a qual dever ser determinada atravs da Lei de Lambert-Beer. Tabela 2: TUBO GUA CORANTE* CONCENTRAO TRANSMITNCIA ABSORBNCIA (Abs ou D.O.) OBTIDA (g/mL) (T%)** (mL) (No) (mL) 0 5 0 1 4 1 2 3 2 3 2 3 4 1 4 5 0 5 6 5 mL Encontrar no grfico * Alaranjado de Metila ou Azul de Bromofenol ** Leituras efetuadas no comprimento de onda que corresponde ao pico de absoro do composto ( max).

4. RESULTADOS A SEREM APRESENTADOS NO RELATRIO: 4.1. Tabela de leitura do corante completando os valores de absorbncia atravs de tabela ou clculo. 4.2. Construir um grfico da Absorbncia (Abs) em funo do comprimento de onda () e determinar o pico de absoro (max) do composto estudado. 4.3. Completar a tabela 2 calculando as concentraes do corante nos diversos tubos 4.4. Construir um segundo grfico apresentando as variaes de Densidade tica (D.O.) ou Absorbncia (Abs) em funo da concentrao da espcie qumica absorvente e um terceiro grfico apresentando as variaes de Transmitncia em funo da concentrao. 4.5. Apresentar o valor da concentrao do corante no tubo 6 mediante interpolao da leitura de Transmitancia (T x concentrao) e Absorbncia (Abs x concentrao)no grfico. Abs Transmitncia

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Concentrao

Concentrao

5. ANLISES DOS RESULTADOS E CONCLUSES Discutir os resultados e listar as concluses obtidas durante os experimentos realizados em classe. 6. BIBLIOGRAFIA Listar as referncias bibliogrficas utilizadas para preparar o relatrio. Fundamentos de Bioqumica Experimental - Jose Raul Cisternas, Jose Varga e Osmar Monte. Ed. Atheneu 1999, 276 pg. Mtodos de Laboratrio em Bioqumica Adelar Bracht e Emy Luiza IshiiIwamoto. Ed. Manole, 2003 439 pg.

11 Aula Pratica N 2 : DETERMINAO DE AUCARES REDUTORES (MTODO DE SOMOGY & NELSON) 1. OBJETIVO Quantificar o teor de lactose em amostra de leite pelo mtodo de SomogyNelson. 2. INTRODUO O Leite: O leite uma combinao de diversos elementos slidos em gua. Os elementos slidos representam aproximadamente 12 a 13% do leite e a gua, aproximadamente 87%. Os principais elementos slidos do leite so lipdios (gordura), carboidratos, protenas, sais minerais e vitaminas. Esses elementos, suas distribuies e interaes so determinantes para a estrutura, propriedades funcionais e aptido do leite para processamento. As micelas de casena e os glbulos de gordura so responsveis pela maior parte das caractersticas fsicas (estrutura e cor) encontradas nos produtos lcteos. Os termos slidos totais (ST) ou extrato seco total (EST) englobam todos os componentes do leite exceto a gua. Por slidos no gordurosos (SNG) ou extrato seco desengordurado (ESD) compreendem-se todos os elementos do leite, menos a gua e a gordura. Os componentes do leite permanecem em equilbrio, de modo que a relao entre eles muito estvel. O conhecimento dessa estabilidade a base para os testes que so realizados com o objetivo de apontar a ocorrncia de problemas que alteram a composio do leite. Uma reduo substancial da concentrao de lactose ou dos slidos totais poderia levantar suspeitas de adio fraudulenta de gua, aps a ordenha. Nesse caso, ocorrem alteraes das propriedades fsicas do leite, facilmente detectveis em laboratrio. A composio do leite pode variar de acordo com o estgio de lactao: no colostro, o contedo de protena maior e o de lactose encontra-se reduzido. Outros fatores que podem interferir na composio do leite so: raa das vacas, alimentao (plano de nutrio e forma fsica da rao), temperatura ambiente, manejo e intervalo entre as ordenhas, produo de leite e infeco da glndula mamria. O leite o alimento mais completo de que se pode dispor, devendo ser tomado pelas crianas, jovens e adultos. Para que se tenha boa sade e crescimento normal indispensvel tomar leite todos os dias, nas seguintes quantidades: - Crianas ...................................................... 3 a 4 copos por dia - Adultos ........................................................ 2 a 3 copos por dia - Senhoras em gestao ou amamentao........ 4 a 6 copos por dia O leite faz bem sade porque: - Ajuda o crescimento; - Contribui para a formao dos ossos, msculos e dentes fortes; - Regula o sistema nervoso; - Aumenta a resistncia s doenas infecciosas; - Desperta o apetite; - Facilita a digesto; - Ajuda a pessoa a se conservar alegre e disposta para o trabalho. O leite, embora traga todos esses benefcios, poder tambm causar muito mal se no tiver o necessrio cuidado com ele durante a ordenha, no transporte e na sua conservao posterior: na usina de beneficiamento, nas fbricas, no comrcio e na distribuio. Definio do leite H diversas definies do leite, cada uma delas feita por um ou mais estudiosos do assunto e considerando o leite sob determinado ponto de vista.

12 Para o nosso caso vamos considerar apenas uma definio, isto , sob o ponto de vista higinico: Leite o produto ntegro da ordenha total e sem interrupo, de uma fmea leiteira sadia, bem alimentada, descansada, devendo ser ordenhado e acondicionado em condies higinicas e sem conter colostro. Colostro O colostro o leite produzido nos primeiros dias aps o parto. Tem composio diferente do leite normal e no deve ser usado na alimentao humana, e nem no fabrico de produtos de laticnios, principalmente de queijos. No entanto, no pode deixar de ser dado aos bezerros recm-nascidos, pois sua composio especial protege a sade do animal e um bom laxativo. Caractesrsticas organolpticas Entende-se por caractersticas organolpticas do leite o que se pode perceber pela viso, olfato e paladar. Com estes trs sentidos pode-se observar o aspecto, a cor, o cheiro e o sabor do leite. O leite bom tem: Aspecto: lquido, homogneo (bem misturado), limpo (no contm substncias estranhas). Geralmente forma uma camada de gordura na superfcie quando deixado em repouso. Cor: cor branca, meio amarelada. Odor: suave, levemente cido, e lembra mais ou menos o animal que o produziu. Sabor: levemente adocicado e agradvel. COMPOSIO DO LEITE DE DIFERENTES ESPCIES
Espcies Densidade gua Minerais Protenas Gordura Lactose Extrato seco Sais

Mulher 0,18 gua 11,20 Cabra 0,56 Ovelha 0,98 Jumenta 0,50 Bfala 0,79 Vaca 0,65

1.031

88,12 88,80

1,90 2,70 3,70 6,52 1,70 4,00 3,50

4,50 2,50 4,20 6,86 1,55 7,98 3,80

5,30 5,50 4,00 5,23 5,80 5,18 4,80

11,88

1.031 0,50 1.032 1.038 1.033 1.034 1.030

87,54 80,41 90,45 82,05 87,25

2,46 19,59 9,55 17,95 12,75

O leite, em condies normais, tem em mdia os seguintes componentes: - gua........................................................... 87,25% - Extrato seco (ou slidos).............................. 12,75% O extrato seco constitudo dos seguintes elementos: - Gordura.......................................................... 3,80% - Protenas........................................................ 3,50% - Lactose (acar).............................................. 4,80% - Sais Minerais................................................... 0,65% A composio do leite pode variar de acordo com os seguintes fatores: a) Raa b) Perodo de lactao c) Alimentao

13 d) Sade e) Perodo de cio f) Idade g) Caractersticas individuais h) Clima i) Espao entre as ordenhas j) Estao do ano Descrio dos componentes gua: o componente que existe no leite em maior quantidade, onde se encontram dissolvidos, suspensos ou emulsionados os demais componentes. A gua comum igual a gua do leite em todos os sentidos. Isto , praticamente provado quando se dissolve leite em p na gua e se obtm o leite lquido com algumas modificaes pequenas nos slidos. GORDURA : o componente que d ao leite cor amarelada. A gordura um dos componentes mais ricos do leite. A matria gorda do leite forma uma emulso relativamente estvel, constituda por glbulos de pequenos dimetros, bem distribudos, que 1 milmetro cbico de leite contm 1 a 5 milhes de glbulos. Os glbulos so cobertos por uma membrana protetora. A batedura do creme resultante do desnate do leite, rompe a membrana protetora e permite a unio dos glbulos para formar a manteiga . Cada glbulo envolvido por uma camada formada por um componente da gordura denominado fosfolipdio. Essa camada forma uma membrana que impede a unio de todos os glbulos. Desse modo, a gordura do leite mantida na forma de suspenso. A maior parte da gordura do leite constituda de triglicerdios, que so formados por cidos graxos ligados ao glicerol. A gordura do leite est presente em forma de pequenos glbulos em suspenso na gua. A frao de gordura do leite serve de veculo para as vitaminas lipossolveis (A, D, E, K), colesterol e outras substncias solveis em gordura, como os carotenides (provitamina A), que do ao leite sua cor amarelo creme. A concentrao de gordura no leite varia geralmente entre 3,5 e 5,3%, em razo de diferenas entre raas, estgio da lactao e de acordo com a alimentao dos animais. A gordura pode ser retirada do leite por processo natural, retirando-se a nata que sobe superfcie quando o leite fica em repouso, isto porque mais leve que os outros componentes do leite, ou pelo processo do desnate, atravs de mquina denominada desnatadeira. o que se chama de desnate do leite. A gordura se separa em forma de creme. Emprego industrial da gordura: a) Fabricao de manteiga; b) Fabricao de creme de mesa; c) Fabricao de queijo; d) Fabricao de creme chantity; e) Fabricao de sorvetes, etc... PROTENAS As protenas representam entre 3% e 4% dos slidos encontrados no leite. A porcentagem de protena varia, dentre outros fatores, com a raa e proporcional quantidade de gordura presente no leite. Isso significa que quanto maior a percentagem de gordura no leite, maior ser a de protena. Existem vrios tipos de protena no leite. A principal delas a casena, que apresenta alta qualidade nutricional e muito importante na fabricao dos queijos. A casena produzida pelas clulas secretoras da glndula mamria e encontra-se organizada na forma de micelas, que so agrupamentos de vrias molculas de casena junto com clcio, fsforo e outros sais. Cerca de 95% da

14 casena total do leite est nessa forma. As micelas de casena junto com os glbulos de gordura so responsveis por grande parte das propriedades relativas consistncia e cor dos produtos lcteos. A casena no facilmente alterada pelo calor, permanecendo bastante estvel quando o leite pasteurizado. Entretanto, quando ocorrem mudanas na acidez do leite, h rompimento da estrutura das micelas, o que faz a casena precipitar e formar cogulos. A gordura e a casena tm importncia fundamental para a manufatura de vrios derivados lcteos, sendo que representam a maior concentrao de elementos slidos dos queijos. As protenas do ao leite a cor esbranquiada opaca. fcil de se conhecer as protenas do leite, pois so elas as principais formadoras de massa branca quando o leite coagula, e manipulado para fabricar queijos. As protenas do leite so formadas de: - Casena (maior parte); - Albumina e globulina. A casena formada por uma soluo coloidal constituindo-se na maior parte de matria azotada do leite. um dos componentes mais teis do leite. Obtm-se a casena propriamente dita: pela precipitao natural do leite, fermentao ltica e pela coagulao com auxlio de coalhos (enzima) e cidos-fermento ltico, etc... A importncia industrial da casena est na: fabricao de queijos, casena propriamente dita e leite em p associado a outros componentes do leite. A albumina, denominada tambm de lacto-albumina, solvel na gua, no se coagula pelo coalho, mas pelo calor e pelos cidos. Quando se fabrica queijos, a albumina sai junto com o soro. Este soro aproveitado para fazer ainda outro queijo, a Ricota, obtido pelo aquecimento do soro e adio de cido ltico, fermento ltico ou ainda soro cido a 90D. As protenas existentes no leite apresentam-se nas seguintes percentagens mdias: 3,0%, lacto-albumina 0,5%. Estas percentagens so muito mais fixas que as referentes a gordura. CARBOIDRATOS O principal carboidrato do leite a lactose. produzida pelas clulas epiteliais da glndula mamria e a principal fonte de energia dos recm nascidos. Alm da lactose, podem ser encontrados no leite outros carboidratos, como a glicose e a galactose, mas em pequenas quantidades. A lactose compreende aproximadamente 52% dos slidos totais do leite desnatado e 70% dos slidos encontrados no soro do leite. Controla o volume de leite produzido, atraindo a gua do sangue para equilibrar a presso osmtica na glndula mamria. A quantidade de gua do leite e, conseqentemente, o volume de leite produzido pela vaca, depende da quantidade de lactose secretada na glndula mamria. A concentrao de lactose no leite de aproximadamente 5% (4,7 a 5,2%). um dos elementos mais estveis do leite, isto , menos sujeito a variaes. A lactose o acar do leite, sendo praticamente o nico que nele existe e se apresenta no leite de todos os mamferos. Portanto, a responsvel pelo gosto adocicado do leite. Industrialmente, porm, a fermentao da lactose, por ao microbiana, ocupa lugar de maior destaque. Um nmero elevado de microrganismos transforma a lactose em cido ltico. Uma molcula de lactose transforma-se em 4 molculas de cido ltico. No leite a acidificao natural um fato de observao corrente. Em muitos casos a fermentao da lactose com a acidificao do leite um fenmeno devidamente controlado e dirigido, aproveitado na indstria de laticnios para obteno de diversos produtos derivados do leite: iogurte, leite acidfilo, queijos, requeijes, cido ltico, casenas e etc...

15 Emprego industrial da lactose: a) preparo de leite maternizados; b) preparo de produtos farmacuticos; c) em laboratrios de microbiologia meios de cultura; d) na fabricao de queijos (como componente natural do leite).

SAIS MINERAIS E VITAMINAS O leite uma fonte excelente da maioria dos sais minerais necessrios para o desenvolvimento dos indivduos jovens. O clcio e o fsforo do leite apresentam alta disponibilidade, em parte porque se encontram associados casena. Por isso, o leite a melhor fonte de clcio para o crescimento do esqueleto dos indivduos jovens e para a manuteno da integridade dos ossos dos adultos. O contedo de ferro baixo. O leite uma importante fonte de vitaminas, algumas se associam com a gordura (A, D, E e K), enquanto outras se associam com a parte aquosa. Dentre as ltimas, esto as do complexo B e a vitamina C. Mais de dez vitaminas diferentes do complexo B so encontradas no leite. Entretanto, com exceo da vitamina B2 (riboflavina), as outras so encontradas em quantidades pequenas. As vitaminas do complexo B so produzidas no estmago composto (rmen) dos animais. O leite uma fonte importante de vitamina C (cido ascrbico), mas esta rapidamente oxidada na presena de cobre em um produto biologicamente inativo. Sais minerais: no leite existem principalmente fosfatos, citratos, carbonato de sdio, clcio, potssio e magnsio. A ao fisiolgica dos diferentes sais do leite importante, principalmente do fosfato de clcio, na formao de ossos e dentes. Da a necessidade de se alimentar as crianas com maior quantidade de leite. Vitaminas: o leite constitui uma larga fonte para fornecimento de vitaminas necessrias ao organismo. So encontradas no leite as seguintes vitaminas: a) Vitamina A A vitamina A relativamente abundante no leite, estritamente associada gordura, mas o seu teor muito varivel, tendo como funo bsica a alimentao verde fornecida ao gado (pastagem); b) Complexo B Vitamina B1 existe no leite em propores variveis, cerca de 750 miligramas por litro, os quais 75% das necessidades humanas desta vitamina. Vitamina B2, riboflavina, desempenha papel importante nas fermentaes, na produo dos aromas caractersticos na manteiga pela formao de diacetil, est presente no leite numa proporo em torno de 1 mg por litro, quantidade que cobre boa parte das necessidades humanas. Vitamina B4 desempenha ao co-fermento na fermentao ltica. Vitaminas B6 e B12 so outros componentes do complexo B presentes regularmente no leite, em quantidades que exercem um papel fisiolgico importante. c) Vitamina C O leite constitui a fonte mais rica de vitamina C de origem animal, encontra-se nele na proporo de 10 a 20 mg por litro. As necessidades humanas so de 50 a 70 mg por dia.

16 d) Vitamina D O leite, de modo geral, no muito rico nesta vitamina, pois contm apenas 1 a 2 miligramas por litro. Considera-se que as necessidades alimentares so de umas 10 miligramas. A irradiao do leite pelos raios ultravioleta aumenta extraordinariamente o seu teor de vitamina D, at 1.000 a 2.000 vezes. e) Vitamina E Se encontra associada gordura do leite, mas em quantidade insuficiente para atender as necessidades humanas de 1 mg diariamente f) Vitamina K Tem sido encontrada em quantidades variveis, mas comum estar presente no leite. Assim, pode-se afirmar que o leite normal conta com todos os elementos vitamnicos necessrios a uma boa nutrio. Uma dieta exclusivamente lctea pode assegurar perfeito desenvolvimento aos mamferos por perodos relativamente longos. Tipos de Leite: Leites caseinosos - leite em que a quantidade de casena muito superior s quantidades de albumina e globulina (vaca, cabra e ovelha); Leites albuminosos leite em que a proporo entre a albumina e globulina quase igual casena (mulher, asna e gua); Classificao do Leite - Categorias de leite animal comercializado Leite tipo A Ordenha de leite mecnica Leite in natura, retirado pela ordenha mecnica e vai direto para um tanque, onde aquecido at 70-75 graus Celsius e depois resfriado. Esse processo denomina-se pasteurizao, em seguida vai para a mquina embaladora. Quanto a composio, a diferena entre o A e o B bem pequena. Os dois so praticamente integrais. O tipo A tem mais gordura e menos protena que o tipo B. O leite tipo A dura mais que o tipo B por ter uma quantidade menor de bactrias. Leite tipo B As vacas permanecem em estbulos, o que ajuda na manuteno das condies de higiene. Assim como no leite tipo A, a ordenha deve ser mecnica. O local de armazenamento mais sofisticado do que o tipo C. Permite uma refrigerao a temperaturas mais baixas, entre 3,5 a 4 graus centigrados. A mecanizao contribui para a excelncia na extrao do leite tipo B. Em verdade a diferena, est na quantidade de gordura e protenas constantes no leite tipo B. Leite tipo C A ordenha pode ser manual ou mecnica e as vacas ficam soltas no pasto. O leite armazenado em abrigos rsticos, mas refrigerados, antes de seguir para a usina onde ser embalado. Apresenta um teor de gordura de aproximadamente 3%. As usinas utilizam o restante para produzir manteiga, queijo e derivados. Variedades de leite

De vaca, ou bovino largamente utilizado na alimentao humana, e rico em vitamina A e clcio. De bfala, muito apreciado e mais gorduroso que o leite bovino. De cabra, muito comum no Nordeste brasileiro, sendo o tipo de leite mais consumido no mundo.

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De camela, muito apreciado entre os bedunos, povo nmade do norte de frica. De gua, consumida na sia Central, utilizada na fabricao da bebida Kumis.

Tabela 2. Composio mdia (%) do leite de diferentes raas de bovinos leiteiros.


Raa Ayrshire Pardo Suio Guernsey Holands Jersey Gordura 3,90 3,30 3,60 3,40 4,40 Protena 3,40 3,00 3,20 3,20 3,60 Lactose 4,81 5,08 4,96 4,87 5,00 Cinzas 0,68 0,72 0,74 0,68 0,70 Slidos* 8,89 8,80 8,90 8,75 9,30

* Slidos desengordurados Fonte : HARRIS & BACHMAN, 1988.

Leite humano Designa-se por leite materno o leite produzido pelas mulher e que utilizado para alimentar os bebes. O leite materno a primeira e principal fonte de nutrio dos recm-nascidos at que se tornem aptos a comer e digerir os alimentos slidos.

Tem caractersticas variadas dependendo da idade gestacional do recmnascido e cronolgica do recm- nascido e da durao da amamentao em si. produzido pela me de um recm-nascido prematuro ou no, possui grande quantidade de imunoglobulinas (=anticorpos). Nos primeiros dias de idade o leite tem caractersticas bem diferentes, contendo pouca gordura e mais imunoglobulinas, o chamado colostro. Entre os humanos, bastante comum que a me tenha pouco leite logo aps o parto, principalmente se for seu primeiro filho. A "descida" do leite pode demorar at uns quatro dias e conhecida como apojadura.

FUNDAMENTO DO MTODO Qumica do leite Aucares redutores: Os acares redutores possuem grupos aldedos e cetonas livres na cadeia e so chamados redutores por atuarem como agentes redutores, isto ,que sofrem oxidao (doam eltrons). Acares no redutores (como a sacarose) possuem esses grupamentos interligados e tornam-se redutores a partir do momento em que sofrem hidrlise(quebra). Lactose (Galactose -1,4 glucose) um tipo de glicdio. o acar presente no leite e seus derivados. Os acares so formados por unidades chamadas sacardeos. A lactose formada por duas dessas unidades, a glicose e a galactose, sendo, portanto, um dissacardeo. O leite humano contm de 6-8% de lactose e o de vaca, de 4-6%. Esta hidrolisada pela ao da lactase, uma beta-galactosidase sendo considerada portanto como um beta-galactosdeo. fracamente doce. A levedura no a fermenta, mas pode ser adaptada para faz-lo. Lactobacilos a transformam-na em cido ltico. A Lactose o hidrato de carbono mais importante no leite da maioria de espcie. biossintetizado na glndula mamaria. As concentraes no leite variam fortemente com a espcie. A Lactose o primeiro e nico hidrato de carbono que o filhote de mamfero (seres humanos inclusive)

18 consome em quantidades significativas. O leite de Bovdeos contem 45 a 50 gramas de lactose por o litro. Industrialmente, a lactose produzida do leite de Bovdeos somente, ou a partir dos derivados do leite tais como o soro do queijo ou do filtrado da ultrafiltrao. A Lactose conhecida tambm como o acar de leite. Na maior parte dos mamferos, a enzima responsvel pela sua hidrlise (a lactase) s sintetizada durante o perodo de aleitamento. Na ausncia de lactase, a lactose no pode ser digerida, tornando-se por isso uma fonte de alimento abundante para a flora intestinal (que ento comea a crescer descontroladamente), e originando por isso nuseas e vmitos, assim como diarria (por afetar a osmolaridade do intestino delgado). No entanto, desde a domesticao do gado, algumas populaes humanas desenvolveram a capacidade de continuarem a sintetizar a lactase durante toda a vida. Origem: Wikipdia, a enciclopdia livre.

O nome qumico oficial da lactose, como encontrado freqentemente em manuais tais como o Pharmacopoeia, : 4-O--D-galactopyranosyl, D-glucopyranose /isomeros. No leite, a lactose se encontra em duas formas isomricas denominadas de e -lactose. As estruturas moleculares da - e da -lactose diferem na orientao de um hidrognio e em um grupo hidroxila no tomo de carbono 1 (na molcula da glicose). Ambos os ismeros mudam entre si continuamente. Este fenmeno chamado mutarrotao. A velocidade da mutarrotao determinada por fatores tais como a temperatura, a concentrao, e o pH da soluo. As solues de Lactose procuram o estado do equilbrio entre as formas e . Na temperatura ambiente, o equilbrio resulta em uma relao de 40% -lactose e 60% de -lactose aproximadamente. O fato de que dois isomeros da lactose existem e que diferem na estrutura molecular tem efeitos profundos em vrias propriedades da lactose, tais como suas propriedades no estado slido,na morfologia dos cristais e na solubilidade. A Lactose um dos excipientes mais extensamente usados na indstria farmacutica. H muitas razes para esta

19 popularidade, por que a lactose inerte, relativamente barata, no txica e a lactose tem uma longa histria de ser aplicada em milhares de formulaes bem sucedidas mundialmente. Estas formulaes bem sucedidas incluem inalantes, tabletes, cpsulas e saquinhos secos do p (Sachets). A lactose, dissacardio redutor, reduz o on cprico do reativo de SOMOGYI a xido cuproso, em meio alcalino e a quente. Em seguida, o xido cuproso reage com o anion arseno-molibdato do reativo de NELSON produzindo um composto de colorao azul (xidos de molibdnio, Mo2O3, com max = 540 nm). Dentro de certos limites, a intensidade da colorao azul diretamente proporcional quantidade de lactose na amostra. Antes da reao quantitativa, a amostra de leite deve ser desproteinizada e clarificada, mediante precipitao de interferentes com Ba(OH)2 e ZnSO4. 3. MATERIAL E MTODOS 3.1. Equipamentos e vidrarias - Espectrofotmetro - Centrfuga de mesa - Banho-maria (ebulio) - Balo volumtrico de 100 mL - Estante com 8 tubos de ensaio e 2 tubos de centrfuga - Pipetas 3.2. Reagentes - Hidrxido de brio 0,3N - Sulfato de zinco 5% - Reativo de Somogyi: dissolver 28 gramas de fosfato monocido de sdio e 40 gramas de tartarato duplo de sdio e potssio em 700 ml de gua. Adicionar 100 ml de NaOH 1N. Gotejar, sob agitao constante, 80 ml de CuSO4.5H2O a 10%. Adicionar 180 gramas de sulfato de sdio anidro e completar a 1 litro. Deixar em repouso por 2 dias e filtrar. Guardar em frasco escuro a cerca de 37oC. Filtrar antes do uso. - Reativo de Nelson: dissolver 25 gramas de molibdato de amnio em 450 ml de gua destilada. Cuidadosamente, adicionar 26 ml de cido sulfrico concentrado. Adicionar 3 gramas de arseniato dibsico de sdio dissolvido em 25 ml de gua. Manter em repouso em frasco escuro durante 2 dias antes de uso. - Padro de lactose: dissolver 0,100 gramas de lactose pura em um litro de gua. Esta soluo conter 100 g/ml. 33. Reta Padro a) Tomar 6 tubos de ensaio e numer-los de 0 a 5. Adicionar 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1.0 mL da soluo padro de lactose contendo (100 microgramas/mL = 100 g/mL) e completar o volume a 1.0 mL com gua destilada. b) Acrescentar em cada tubo 1.0 mL do REATIVO DE SOMOGYI e agitar. Deixar em banho-maria fervente por 10 minutos. Esfriar em gua corrente. c) Adicionar 1.0 ml do REATIVO DE NELSON e agitar. Completar o volume a 10 mL, adicionando 7 ml de gua destilada. d) Fazer leitura em espectrofotmetro em 540 nm. Preencher a tabela abaixo:
TUBO GUA (No) (ml) Lacto se (mL) Conc. Obtida (g/mL ) Reat. Somog y (mL) Banho Reat. Maria Nelso (min) n (mL) Compl. Transmit Absor Vol. (10 . b. mL) (T%) Absorb.

20 0 1 2 3 4 5 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 10 10 10 10 10 10 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 7 7 7 7 7 7 mL mL mL mL mL mL 0

3.4. Preparo das amostras de leite Cada grupo receber 2 amostras de leite: uma armazenada em geladeira e outra mantida temperatura ambiente. a) Transferir 1 mL (com pipeta volumtrica) da amostra de leite para balo volumtrico de 100 mL e completar o volume com gua destilada. Agitar bem. b) Transferir 1 mL (com pipeta volumtrica) da soluo diluda de leite para tubo de centrfuga. Efetuar a remoo dos interferentes pela adio de 1,0 mL de ZnS04 a 5% (agitar) e acrescentar 1,0 mL de hidrxido de brio 0,3N. Agitar. Completar a 10 mL adicionado 7 mL de gua destilada. Agitar. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos (3.000 rpm). 3.5. Determinao do teor de lactose no leite Determinar os teores de lactose nas duas amostras de leite, preparando as amostras como segue na tabela abaixo:
TUBO Volum Reat. e Somogy (mL) (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 Banho Maria ( min. ) 10 10 Reat. Nelso n (mL) 1.0 1.0 Completa Transmit Absor r Vol.(10 . b. mL) (T%) 7 mL 7 mL Absor b. Concentra o.(g/ 100 mL = %)

Leite Ambient e Leite Geladeir a

4. RESULTADOS 4.1. Construir um grfico com as concentraes de lactose na abscissa (g de lactose por tubo) e as leituras de Absorbncia dos padres (tendo subtrado o valor da leitura da prova em branco, ou seja do tubo no 0), na ordenada. 4.2. Determinar os teores de lactose nas duas amostras de leite utilizando os dados de Absorbncia, fazendo-se a interpolao na reta padro obtida no item acima. Colocar no grfico os resultados de concentrao de lactose encontrados. 4.3. Expressar os resultados em g/100 mL de leite (%), observar que a amostra de leite analisada foi diluda 1:100. 4.4 Fazer os clculos escritos no espao abaixo:

21

5. DISCUSSO DOS RESULTADOS a. Discutir os resultados obtidos de acordo com a concentrao de lactose encontrada nas amostras de leite mantidas em temperatura ambiente e refrigerada. Os resultados obtidos foram os esperados?

b. Qual ou quais as razes para que os resultados da concentrao de lactose no leite mantido na temperatura ambiente e refrigerada no serem iguais? Como a temperatura afeta a qualidade do leite? 6. BIBLIOGRAFIA USADA Listar as bibliografias utilizadas para preparar o relatrio (opcional). Fundamentos de Bioqumica Experimental - Jose Raul Cisternas, Jose Varga e Osmar Monte. Ed. Atheneu 1999, 276 pg. Mtodos de Laboratrio em Bioqumica Adelar Bracht e Emy Luiza IshiiIwamoto. Ed. Manole, 2003 439 pg. Ivo M. Demiate; G. Wosiacki; Cristina Czelusniak e Alessandro Nogueira. Determinao de aucares redutores e totais em alimentos: comparao entre mtodo colorimetrico e titulometrico. Soil Science 8(1) p. 65-78, 2002. Roberto N. Silva; Valdirene, N.Monteiro; Joana D.X. Alcanfor; Elaine M. Assis; Eduardo R. Asquieri Comparao de mtodos para determinao de aucares redutores e totais em mel. Cienc. Tec. Alim. 23(3) p. 337-341, 2003. Elisa M. Isejima; Jose A.B. Costa; Daniel I.S. Junior Mtodo de determinao de aucares redutores aplicvel no sistema de pagamento de cana de acar. Pesq. Agropec. Brasil. V. 37 (5) p.729-734, 2002. Questionrio: 1 Qual foi a finalidade deste trabalho pratico? 2 Cite algumas aplicaes da metodologia empregada neste trabalho pratico.

3 Indique atravs de clculos como foram preparadas as solues:

22 Aula Pratica N 3 : CROMATOGRAFIA EM PAPEL DE FILTRO Introduo: Cromatografia. A cromatografia um processo de separao de anlise qualitativa, atravs do qual permite separar constituintes de uma mistura devido sua distribuio por duas fases uma estacionria (fixa) e outra mvel. O mtodo que utiliza diversas tcnicas que tem como objetivo principal a separao de substncias de uma mistura, com fins analticos ou preparativos, muito utilizado em laboratrios industriais, de pesquisa e de ensino. Todas as tcnicas cromatogrficas utilizam uma fase estacionria e uma fase mvel. A fase estacionria formada de um material escolhido para reter de forma diferenciada os componentes da amostra que se deseja separar. A fase mvel o material que se desloca pela fase estacionria, arrastando os componentes da amostra. Aps transitar pela fase estacionria, por um percurso de distncia adequadamente escolhida, os componentes da amostra se separam e so assinalados pelo sistema detector na seqncia: do primeiro componente menos retido, ao ltimo componente mais retido pela fase estacionria. A escolha do processo a usar depende do tipo de equilbrio estabelecido entre as fases estacionria e mvel e a mistura que se quer separar. Sendo o mais importante o equilbrio entre a fase estacionria e a mistura. Esta separao resulta das diferenas de velocidade dos componentes arrastados pela fase mvel devido s diferentes interaes com a fase estacionria. Os principais mtodos cromatogrficos so: cromatografia em papel (CP), cromatografia de camada delgada (CCD), cromatografia gasosa (CG) e cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). CROMATOGRAFIA EM PAPEL: A cromatografia em papel (CP) uma das tcnicas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realizao, porm a que apresenta as maiores restries para sua utilizao em termos analticos. Neste tipo de cromatografia, uma amostra lquida flui por uma tira de papel adsorvente disposto verticalmente. O papel composto por molculas de celulose que possuem uma forte afinidade pela gua presente na mistura de solvente, mas muito pouca afinidade pela fase orgnica, atuando como suporte inerte contendo a fase estacionria aquosa (polar). A medida que o solvente contendo o soluto flui atravs do papel, uma partio deste composto ocorre entre a fase mvel orgnica (pouco polar) e a fase estacionria aquosa. Desta forma, parte do soluto deixa o papel e entra na fase mvel. Quando a fase mvel alcana uma seo do papel que no contm soluto, o fenmeno de partio ocorre novamente, s que agora o soluto transferido da fase mvel para a fase estacionria. Com o fluxo contnuo de solvente, o efeito desta partio entre a fases mvel e estacionria possibilita a transferncia do soluto do seu ponto de aplicao no papel, para um outro ponto localizado a alguma distncia do local de aplicao no sentido do fluxo de solvente. CAMADA DELGADA Na cromatografia em camada delgada (TLC), a fase estacionria uma camada fina formada por um slido granulado (slica, alumina, poliamida, etc.) depositado sobre uma placa de vidro, alumnio ou outro suporte inerte. Pequenas gotas de soluo das amostras a serem analisadas so aplicadas em um ponto prximo ao extremo inferior da placa. Deixa-se a placa secar e, ento se coloca a mesma em um recipiente contendo a fase mvel (solvente ou mistura de solventes). A polaridade do solvente dever ser de acordo com a substncia que se deseja separar. Como somente a base da placa fica submersa, o solvente comea a molhar a fase estacionria e sob por capilaridade. Deixa-se secar a placa aps o

23 deslocamento da fase mvel sobre ela. A revelao da placa feita com a aplicao de um reativo que de cor s substncias de interesse. CROMATOGRAFIA GASOSA A cromatografia gasosa (CG) uma tcnica com poder de resoluo excelente, possibilitando a anlise de vrias substncias em uma mesma amostra. Dependendo do tipo de substncia a ser analisada e do detector empregado, consegue-se detectar cerca de 10-12 g do composto por mL de soluo. Essa sensibilidade permite que pequenas quantidades de amostra possam ser analisadas. A fase estacionria da cromatografia gasosa um material, lquido ou slido, que propicia a separao da mistura atravs de processos fsicos e qumicos. A fase estacionria lquida um lquido pouco voltil que recobre um suporte slido, separando as substancias presentes na amostra atravs das diferenas de solubilidade e volatilidade. Como fase mvel utilizado um gs, denominado gs de arraste, que transporta a amostra atravs da coluna de separao at o detector, onde os compostos separados so detectados. Os gases mais utilizados so o hlio (He), hidrognio (H), nitrognio (N) e argnio (Ar). Como o He de difcil obteno e alto custo pouco utilizado no Brasil. A pureza do gs de arraste interfere no resultado, acusando impurezas na ordem de partes por milho (ppm) ou partes por bilho (ppb). As colunas cromatogrficas utilizadas podem ser de nquel, ao inox ou de vidro. De acordo com o aparelho, as colunas variam de formato, mas na maioria das vezes elas so espirais. O comprimento e o dimetro da coluna a ser usada ir depender do material a ser analisado. As colunas recheadas analticas possuem dimetro interno (d.i.) de cerca de 1,0 a 4,0 mm e comprimento de 1,0 a 3,0 m, enquanto que as colunas recheadas preparativas apresentam d.i. de 5,0 a 100,0 mm, possibilitando a injeo de maior volume de amostra. J, as colunas capilares tm d.i. variando de 0,15 a 0,75 mm e comprimento de 10,0 a 100,0 m, sendo as mais utilizadas as de slica fundida, pois esta altamente inerte e flexvel. Os detectores so dispositivos que transformam as variaes na composio do gs de arraste em sinais eltricos. Existe diferentes tipos de detectores: 1) detector de condutividade trmica (DCT), usado para compostos orgnicos, inorgnicos, derivados de petrleo etc. Os DCT possuem dois ou quatro filamentos de platina (Pt), tungstnio (W), nquel (Ni) ou Pt - W, os quais so aquecidos por corrente eltrica. Conforme o gs passa pelos filamentos h transferncia de calor e, o tempo da passagem do gs, juntamente com a condutividade trmica so registrados, efetuando-se assim, a anlise. Esta anlise feita comparando-se o gs de arraste puro (que passa por um conjunto de filamentos) com o gs de arraste com a amostra (que passa por outro conjunto de filamentos). 2) detector de ionizao de chama (DIC), utilizados apenas para compostos orgnicos com baixa sensibilidade para formaldedo e cido frmico, consiste de um campo eltrico (200 - 300 v) e uma chama onde a amostra queimada. A combusto resulta em radicais livres que so ionizados pelo campo eltrico, aumentando a corrente nos eletrodos. 3) detector de captura de eltrons (DCE), usado principalmente na deteco de pesticidas e drogas. Neste detector h uma fonte de radiao beta em corrente constante. O gs de arraste passa com uma amostra onde h substituio de um eltron por um on negativo, o que diminui a corrente eltrica. O gs de arraste com a amostra comparado com o gs de arraste puro (corrente de fundo), que quanto maior seu valor maior a sensibilidade do detector. A diminuio do valor da corrente de fundo sinal de impureza, vazamento da fonte, sujeira ou coluna mal condicionada. O gs de arraste usado o N2 livre de H2 e O2, isto , gs N2 ultrapuro. 5) detector fotomtrico de chama (DFC) apresenta alta estabilidade para compostos sulfurados e fosforados. H uma combusto no campo eltrico com emisso de luz de diversos comprimentos de ondas. Filtros eliminam as radiaes desnecessrias, selecionando as de interesse, em especial as que tenham enxofre (S) e fsforo (P). O gs de arraste o N2 e da chama o H2 com ar ultrapuro e seco.A pureza dos reagentes deve ser na ordem de partes por trilho (ppt).

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CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE ou HPLC) se desenvolveu muito nos ltimos anos, recebendo o nome de cromatografia lquida por que a sua fase mvel um solvente. Os componentes de um cromatgrafo lquido so: bomba, coluna cromatogrfica, detector e o registrador. um mtodo utilizado para separao de espcies inicas ou macromolculas e compostos termolbeis. A fase mvel da CLAE deve ser um solvente que respeite algumas caractersticas impostas por esse mtodo analtico. A principal caracterstica que a fase mvel dissolva a amostra sem qualquer interao qumica entre ambas. Esta fase deve ter alto grau de pureza ou ser de fcil purificao, para que se possam fazer anlises de alta sensibilidade, pois as impurezas podem interferir na deteco do analito por ultravioleta (UV). A fase mvel deve ser compatvel com o detector empregado e, tambm possuir polaridade adequada para permitir uma separao conveniente dos componentes da amostra. Embora existam vrios solventes, trs deles so mais utilizados: gua, metanol e acetonitrila. Como fase estacionria utilizam-se slidos ou semirgidos, cujas partculas porosas esfricas ou irregulares apresentam diferentes dimetros e suportam presso at 350 bar. A coluna cromatogrfica feita de um material inerte que resiste a todas as presses em que ela vai ser usada. A capacidade da coluna determinada pelo comprimento, dimetro e pelo material de recheio. As colunas geralmente utilizadas so: octadecil (C18, RP18, ODS), octil (C8, RP8), CN (cianopropil) e NH2 (amina). Quanto aos detectores, no existe um que apresente todas as propriedades para que ele seja ideal para CLAE. No so versteis, ou universais, mas existem detectores que apresentam ampla faixa de aplicaes. A sensibilidade de um detector determinada a partir da relao entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gera este sinal. A linearidade a faixa linear do sistema, onde o sinal do detector diretamente proporcional concentrao do soluto. Os detectores mais usadas na CLAE so os fotomtricos, baseados na absorbncia no ultra violeta e no visvel. Os detectores de fluorescncia, utilizados como mtodo de deteco especfica, so sensveis para substncias que fluorescem. Este tipo de detector pode detectar quantidades de ordem picograma. Tambm so utilizados detectores por ndice de refrao, os quais acompanham continuamente a diferena no ndice de refrao entre a fase mvel pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra. A resposta deste detector moderada, geralmente de ordem micrograma. Tcnicas cromatogrficas: A- Cromatografia de adsoro Nesta a fase estacionria slida e a fase mvel pode ser lquida ou gasosa. Esta baseia-se nas diferentes afinidades adsorventes da superfcie da fase estacionria pelas molculas da substncia a separar. B- Cromatografia de partio Nesta fase a fase estacionria lquida. Este processo baseado na diferente solubilidade dos componentes da mistura nas duas fases lquidas. Cromatografia em camada fina (plana) (TLC): a reteno das substncias deve-se adsoro sofrida na superfcie da fase estacionria, colocada sobre um dos lados de uma placa de vidro ou metal.

25 Cromatografia em coluna: utiliza-se uma coluna de vidro aberta na parte superior e munida de uma torneira na extremidade inferior, por onde sai o lquido (eludo). Dentro da coluna encontra-se a fase estacionria constituda por um enchimento slido no caso da cromatografia de adsoro, ou por uma fase lquida no caso da cromatografia de partio. A fase mvel lquida em ambos os casos. Cromatografia em papel (plana): a reteno das substncias devida partio das duas fases lquidas, uma mvel e outra estacionria, sendo esta constituda pelo lquido absorvido no papel. Encontra-se bastante divulgada devido sua facilidade experimental e ao seu baixo custo. Este o tipo que ser utilizado na aula prtica. Usualmente, trabalha-se com papel Whatmann, com a devida especificao (nmero 4 por exemplo). Para efeito de facilidade vamos enumerar alguns termos de uso corrente: a) Cromatografia - consta de papel devidamente tratado, ou seja, cortando de acordo com as dimenses da cmara onde ser colocado, no qual fizemos manchas de solues padres ou de solues problemas. b) Cmaras cromatogrficas so os recipientes, hermeticamente fechados, onde os cromatogramas so desenvolvidos; c) Linha bsica - a linha traada, geralmente a trs centmetros do bordo inferior do papel, sobre o qual distribumos as manchas de solutos. Alguns cuidados que devem ser tomados: a) antes de ser iniciar o processo cromatogrfico, a cmara, contendo a mistura de solvente, j deve estar saturada de seus vapores, b) o solvente no deve correr at o bordo superior do papel (cuidado com o nmero de horas de processamento) e nem tampouco uma pequena distncia. De preferncia at uns 2 a 3 cm do bordo superior. Os tipos de cmara cromatogrfica variam de tamanho e forma, desde as mais bem trabalhadas, at a um simples tubo de ensaio ou proveta. As modalidades de cromatografia em papel so as mais variadas possveis. Temos cromatografia ascendente e descendente, mono e bidimensional, vertical e horizontal. Mais orientaes a respeito sero fornecidas pelo professor durante a aula. Clculo de Rf ( Fator de Reteno) Imaginemos o seguinte diagrama

limite at onde o solvente atingiu sentido em que o cromatograma foi desenvolvido a c a b c d linha bsica b c d x

26 Chama-se de Rf a relao existente entre a distncia percorrida pelo soluto (at o centro da mancha), pela distncia total percorrida pelo solvente. Assim: Rfa = a/x Rfb = b/x Rfc = c/x Rfd= d/x

Os valores de Rf fornecem uma orientao quanto distribuio dos solventes ao longo do papel. Teoria sobre Rf (equao de Martin e Synge) Chama-se de Rf a relao: Al Al + a As onde: a = coeficiente de partio As = rea ocupada pelo soluto na fase estacionria Al = rea ocupada pelo soluto na fase mvel Solventes usados em cromatografia: De acordo com as substncias a serem cromatografadas, utilizamos solvente os mais diversos Fenol - gua (80: 20) Usado para cromatografia de aminocidos. Pode-se inclusive adicionar 40 mg de 8-hidroxiquinolina de 1 ml de NH4OH concentrado por 100 ml de solvente. Butanol: H2O (4: 1: 1) Tambm empregado na cromatografia de aminocidos, acares etc. Benzol: butanol: Piridina: H2O (5: 3: 3: 1) Existem basicamente trs modos de revelao a) Pelo uso da luz ultra-violeta: empregado quando os compostos possuem ncleo que revelam o comprim,ento de onda ao nvel do U.V; b) Uso de reagentes: comumente utiliza-se para acares e imerso na seguinte soluo: 1 ml de anilina + 1g de difenilamina + 100 ml de acetona + 10 ml de H2PO4 a 85%. Para aminocidos pulveriza-se o papel com soluo de ninhidrina a 0,3% em lcool (usado nesta aula) Para cidos orgnicos pulveriza-se o papel com a seguinte soluo: 1g de xilose + 3 ml de gua + 1 ml de anilina + 100 ml de lcool metlico; c) Detectores especiais PARTE PRTICA 1) Preparao do papel de filtro Examinar a cmara cromatogrfica e planejar as dimenses do papel. Tome muito cuidado para no tocar o mesmo com os dedos, visto que h contaminao com aminocidos da mo. Cada grupo montar um cromatograma. 2) Padres de aminocidos: arginina, cido glutmico. leucina e prolina Preparar padres de aminocidos 0,01 M e guard-los no congelador. Cada grupo receber trs padres diferentes com a finalidade de comparar estas trs manchas com as produzidas pela amostra problema (esta ser fornecida pelo professor).

27 Montagem do cromatograma Traar numa linha bsica a 3 cm da base do papel e deixar 2 cm de bordadura Distribuir as solues a serem analisadas no papel dentro nos pontos marcados Em seguida fazer manchas de rea aproximada de 0,5 cm2 utilizando um volume de 40-50 microlitros usando micropipetas. Secar as manchas conforme instrues dadas pelo professor Adaptar o cromatograma cmara tomando sempre o cuidado de no toc-lo com os dedos.
Front

Mistura

aa1

aa2

aa3 3 cm

aa 4

Deixar o cromatograma correndo at que o solvente atinja uns 2 ou 3 cm abaixo do bordo superior do papel Em seguida retire-o e deixe secar. Aps a secagem pulverizar ninidrina a 0,3% em soluo alcolica. Levar o cromatograma estufa temperatura de 60 - 65oC at aparecimento de manchas coloridas Determinao do Rf: Marcar o limite at onde o solvente atingiu (front). Medir a distncia da linha bsica at o front(x) , marcar o centro das manchas A, B, C e D. Verificar as distncias d A, d B, d C, e d D, que vo desde a linha bsica at o centro de A, B, C e D. Calcular os Rfs dA Rfa = Rfb = x RESULTADOS E DISCUSSO dB x

1. Escrever quais os aminocidos estudados em classe e a colorao deles na reao com ninidrina 2. Apresentar Rf dos aminocidos utilizados no experimento 3. Qual aminocido apresentou maior Rf e porque? 4. Qual aminocido apresentou menor Rf e porque? 5. Os aminocidos apresentaram colorao diferente? Porque? 6. Quais aminocidos esto presente na mistura? 7. Quais as aplicaes da metodologia da cromatografia? BIBLIOGRAFIA NOES BSICAS DE CROMATOGRAFIA Terezinha Bonanho Peres Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Proteo Ambiental-Instituto Biolgico , So Paulo, v.64, n.2, p.227-229, jul./dez., 2002 COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Introduo a mtodos cromatogrficos. 6. Ed. Campinas: Editora UNICAMP,1995.

28 CIOLA, R. Introduo cromatografia em fase gasosa. So Paulo:Edgard Blcher, 1973. CIOLA R. Fundamentos da cromatografia a lquido de alto desempenho HPLC. 1. Ed. So Paulo: Edgard Blcher,1998.

29 Aula Pratica N 4 : DETERMINAO DO TEOR DE PROTENAS NO LEITE (PELA REAO DO BIURETO) 1. FUNDAMENTO DA METODOLOGIA As protenas podem ser dosadas em diversos materiais biolgicos por vrias metodologias. A reao do Biureto, que utilizada para a caracterizao de protenas, pode ser empregada para a quantificao das mesmas mediante a colorimetria. O fundamento da metodologia se baseia no fato de que as protenas formam um complexo com o on cprico (Cu++) em meio alcalino, e tal complexo apresenta um pico de absoro a 540 nm. A reao positiva para peptdios constitudos de no mnimo de trs aminocidos. Tal complexao tambm ocorre com o biureto (H2N-CO-NH-CO-NH2), da o nome da reao. (Figura 1)

Figura 1: Complexo de cor violeta (prpura) 2. MATERIAL E MTODOS: Equipamentos e Vidrarias: ESPECTROFOTMETRO (540 nm) Estante com 7 tubos de ensaio 1 pipeta graduada de 5 mL 2 pipetas graduadas de 10 mL Reagentes: Reagente do Biureto Pesar 1.5 g de CuSO4.5H2O e 6g de tartarato duplo de sdio e potssio, dissolv-los em gua destilada completando o volume a aproximadamente 500 ml. Juntar, sob agitao, 300 mL de NaOH 10% e completar a 1 litro. Padro de Casena (5 mg/mL) dissolver 2,5g de casena em 500 mL de NaOH 0,1 N 3. PROCEDIMENTO ANALTICO 1. Transferir 1 ml de leite (pipeta volumtrica) para tubo de ensaio e completar o volume com 9 ml de gua destilada (esta soluo corresponde ao leite diludo 1:10). Agitar bem.

30 2. Em 7 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 6, pipetar os componentes conforme o quadro abaixo. 3. Aps a adio do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em repouso por 30 minutos. A colorao prpura formada indicativo da presena de protenas. 4. Fazer leitura de Transmitncia a 540 nm em espectrotofmetro e converter em Absorbncia com auxlio de tabela (Ab = 2 - log T). 5. Com os dados obtidos dos tubos 0 a 5, fazer um grfico em papel milimetrado contendo no eixo Y os valores de Absorbncia ou Leitura e no eixo X as concentraes de casena expressas em mg/tubo. 6. Interpolar o valor de leitura da amostra de leite diludo e calcular a concentrao de casena no leite expressando o valor em mg/100 mL de leite.
TUBO (NO) GUA DESTIL. CASENA (6 mg/mL) CASENA (mg/tubo ) REATIVO BIURETO Transmit ABSORB. ncia 540 nm (%) ABSORB. 540 nm

0 1 2 3 4 5
6

4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5

1 mL (1:10)

leite

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

diludo x

5 5 5 5 5 5
5

4. RESULTADOS E DISCUSSO: 1. Completar tabela 2. Grfico com os valores de absorbncia (y) e concentrao (x) 3. Determinar o valor da concentrao de casena no leite atravs do grfico e dar o resultado em mg/100mL de leite 4. Discutir o valor encontrado em relao ao valor nutricional do leite. 5. O qu ocorre com a casena do leite quando o valor de pH fica abaixo de 6.5?
ABSORB. (540 nm)

Concentrao (mg/tubo)

6. BIBLIOGRAFIA AOAC. Association of Official Analytical Chemists. Official methods of analysis of AOAC International. 16th ed. Gaitheersburg, 1997. Cap. 39, p. 6-7. BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein dye binding. Analytical Biochem., v. 72, p. 248-254, 1976.

31

LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bactiophage t4. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970. RAGHUNATH, M.R.; SANKAR, T.V.; AMMU, K.; DEVADASAN, K. Biochemical and nutritional changes in fish proteins during drying. J. Sci. Food Agric., v. 67, n. 2, p. 197-204, 1995. BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA Livros textos 1- VOET & VOET - Biochemistry - John Wiley and Sons, New York. 1995. 2- VOET, VOET & PRATT Fundamentos de Bioqumica Artmed Editora, So Paulo. 2000. 3- CAMPBELL - Biochemistry - Harcourt Brace College Publishers, New York. 1994. 4- CAMPBELL Bioqumica Artmed Editora, 3a ed., So Paulo. 1999. 5- LEHNINGER, NELSON & COX - Principles of Biochemistry - 2a ed. Worth Publishers, New York. 1993. 6- LEHNINGER Princpios de Bioqumica - Editora Sarvier, So Paulo. 1985. 7- RAWN - Biochemistry - Neil Patterson Publishers - Burlington, North Carolina 8- ANDERSON & BEARDALL - Molecular Activities of Plant Cells- Black Well Scientific publications, Oxford. 9- WHITE, HANDLER & SMITH - Bioqumica: Aspectos Gerais - Editora Guanabarana Koogan, Rio de Janeiro. 10- SMITH, HILL, LEHMAN, LEFKOWITZ, HANDLER & WHITE - Bioqumica Mamferos - Guanabara - Koogan, Rio de Janeiro. 11- STRYER - Bioqumica - 4a ed. Editora Revert, Madrid. 1995. 12- CONN & STUMPF - Introduo Bioqumica - Editora Edgard Blucher - So Paulo. 13- CORREIA - Bioqumica Animal - Editora Fundao Calouste Gulbenkian. 14- VIEIRA, GUAZZINELLI & MARES-GUIA - Bioqumica Celular - Ed. Ateneu, So Paulo.

32 Aula Pratica N 5 : DETERMINAES DA CONSTANTE DE MICHAELIS (Km) E DA VELOCIDADE MXIMA (Vm) PARA A INVERTASE DE LEVEDURA 1. OBJETIVOS Determinar os parmetros Km e Vm da enzima invertase utilizando a sacarose como substrato, mediante o estudo cintico da reao. 2. FUNDAMENTOS As reaes qumicas conduzidas pelos organismos vivos so, na sua grande maioria, catalisadas enzimaticamente, tornando a velocidade das mesmas compatveis com as exigncias metablicas. A enzima escolhida para este estudo justamente a invertase da levedura que catalisa a hidrlise da sacarose para produzir glicose e frutose: C12H22O11 + H2O sacarose gua C6H12O6 + C6H12O6 glicose frutose

Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (g) de acar redutor formado, por um clculo estequiomtrico simples, pode-se determinar a quantidade correspondente (g) sacarose hidrolisada. Podemos determinar a afinidade de determinada enzima pelo substrato da reao que catalisa utilizando um valor KM, que a concentrao de substrato necessria para se atingir metade da velocidade mxima da reao catalisada pela enzima em questo. Um modelo da reao onde a enzima interage com o substrato est fornecido abaixo: E+S ES E+P

onde E a enzima, S o substrato, ES o complexo enzima-substrato e P o produto da reao. Observe que a enzima devolvida ao meio na mesma proporo em que foi utilizada na reao esquerda. Michaelis e Menten, com essas consideraes, desenvolveram a expresso de velocidade para uma reao catalisada enzimaticamente e desta forma puderam descrever o comportamento de diversas enzimas. V = Vmx * [S] KM + [S] onde [S] a concentrao do substrato e Vmx a velocidade mxima da reao, em mol (de produto formado) por unidade de tempo. Assim a levedura (Saccharomyces cerevisiae), por intermdio da "invertase" hidrolisa a sacarose resultando numa mistura equimolecular de glicose e frutose, acares esses que so absorvidos pela clula. A membrana plasmtica impermevel sacarose, e a levedura acaba excretando a invertase (sendo, pois, uma exoenzima) para a hidrlise ocorrer fora da clula de levedura.

33 Figura 2: Saccharomyces cerevisiae

Figura 3. Imagem de levedura (Saccharomyces cerevisiae) da University of Kent Biosciences. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/2004/bossie/mfyg.html Figura 4: Hidrlise da sacarose catalisada pela invertase. Tanto a glicose quanto a frutose so acares redutores.

No presente experimento a invertase ser obtida de levedura de panificao (fermento Fleischmann) e adicionada sacarose (acar no redutor), cuja hidrlise resulta na formao de acares redutores (glicose e frutose) que sero estimados pela reao de Somogyi-Nelson. Para tal se colocar a enzima frente diferentes concentraes de substrato (sacarose), resultando em diferentes velocidades de reao enzimtica, permitindo, mediante um tratamento matemtico adequado, determinar graficamente os valores de Km e Vm para a reao enzimtica da levedura. 3. MATERIAL

34 3.1. Equipamentos e Vidrarias - Espectrofotmetro - Estante com 8 tubos de ensaio (por grupo) - 2 pipetas graduadas de 2 mL (por grupo) - 1 pipeta graduada de 1 mL (por grupo) - 1 pipeta volumtrica de 1 mL (por grupo) - Centrfuga e banho-Maria para dosagem de acares redutores 3.2. Reagente - 4 g de fermento prensado tipo Fleischmann - Reagente de Somogyi - Reagente de Nelson - Padro de acar redutor (100 ug de glicose por 2,5 mL) - Substrato (sacarose 12,5 mM = 4,27 g/L) 4. PROCEDIMENTO 4.1. Extrao da enzima Transferir 4 g de fermento de panificao para tubo de centrfuga, adicionar 20 mL de gua destilada e deixar em estufa a 37oC por 30 minutos agitando casualmente. Centrifugar a 1.000 x g por 15 minutos recolhendo o sobrenadante que contm a enzima invertase. Fazer uma diluio de 1:100 ou 1:200 (a critrio do professor). 4.2. Ensaio enzimtico Em 8 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 7, pipetar os volumes (em mL) das solues conforme indica o quadro que se segue: TUBO (NO) 0 1 2 3 4 5 6 7 SACAROSE 12,5 mM 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,0 2,5 mL de padro GUA 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 0,0 0,5 contendo 100 ug INVERTASE DILUDA 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,0 de glicose

Incubar os tubos (exceto o tubo no 7) a 37oC, por 15 minutos, para que a invertase catalise a hidrlise da sacarose, resultando na formao de glicose e frutose (acares redutores), os quais podem ser determinados pela reao de Somogyi-Nelson. 4.3. Reao para dosagem de acares redutores. To logo termine o perodo de incubao acrescentar 1 mL do reativo de Somogy (a reao enzimtica paralisada pela desnaturao da invertase, quer pela ao do Cu++ ou pela alcalinidade do reagente). Ferver os tubos em banho-maria por 10 minutos, resfri-los e juntar 1 mL do reativo de Nelson. Agitar, completar o volume a 10 mL (adicionando 5,5 mL de gua destilada), agitar novamente a fazer leitura a 530 nm.

35 5. ANLISES DOS RESULTADOS E DISCUSSO Coletar os dados, organizando-os conforme o quadro que se segue. Tabela 1: Determinao de (S) e (V) e 1/(S) e 1/(V) para a invertase TUBO T% D.O. [S]* V** 1 1 D.O. (NO) 530 nm 530 nm 530 nm [S] V 0 0 mM 1 2 mM 2 4 mM 3 6 mM 4 8 mM 5 10 mM 6 7 * [S] = concentrao de substrato (sacarose) no meio de reao enzimtica expressa em milimolaridade mM. ** V = velocidade de reao enzimtica expressa em g (micrograma) de glicose (acar redutor) formado por hora. PARA O RELATRIO: 1. Preencher a Tabela 1 2. Transformar as leituras de densidade tica em quantidades de acar redutor 3. Calcular as velocidades de reao (V) para cada tubo. Com os dados construir os grficos V em funo de [S] e 1/V em funo de 1/[S]. 4. Determinar analiticamente os valores de Km e Vmx e discutir os seus significados bioqumicos.

5. Explique o que ocorre nos tubos 0 e 6 comparando os resultados obtidos no experimento.

BIBLIOGRAFIA ADELAR BRACHT E EMY LUIZA ISHII-IWAMOTO Mtodos de Laboratrio em Bioqumica, Ed. Manole 1 Ed. 2003 AVRON, M., "Mechanism of photoinduced electron transport in isolated chloroplasts", in D.R. Sanadi (ed.), Current Topics of Bioenergetics, 12, Academic Press, New York, 1967, p.1. HAGEMAN, R.H. & D. FLESHER. Nitrate reductase activity in corn seedling as effected by light and nitrate content of nutrient media. Plant Physiology, 35: 700-708 (1960). HEWITT, E.J. Physiological and Biochemical factors which control the assimilation of inorganic nitrogen supplies by plants. In "Nitrogen Nutrition of the Plant", E.A. Kirkby (ed.), Un. Leeds, 1970. p.78-103.

36 JACOBS, M.B. The Chemical Analysis of Foods and Food Products. Van Nostrand, New York, 1958, 970 p. LITWACK, G. Experimental Biochemistry - A Laboratory Manual. Wiley & Sons, Inc., New York, 1960, 313p. John

MARTELLI, H.L. & PANEK, A.D. Bioqumica Experimental. Ao Livro Tcnico, Rio de Janeiro, 1968, 112p. VILLELA, G.G.; BACILA, M. e TASTALDI, H. Tcnicas e Experimentos de Bioqumica. Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1972, 522 p. WHARTON, D.C. & Mc CARTY, R.E. Experiments and Methods Biochemistry. McMillan Publishing Co, Inc., New York, 1972, 350p. in

37 Aula Pratica N 6 : REAO DE HILL (FOTLISE DA GUA) 1. OBJETIVOS Avaliar a habilidade metablica do cloroplasto de promover a fotlise da gua, o primeiro passo na sequncia de reaes da fotossntese. 2. FUNDAMENTOS O processo fotossinttico, que ocorre no interior do cloroplasto, compreende 2 etapas: a) Fase luminosa: dependente de luz, ocorrendo a fotlise da gua acoplada com as produes de NADPH+H+ (fotorreduo) e de ATP (fotofosforilao), conforme a equao abaixo. luz NADP+ + ADP + Pi + H20 NADPH + H+ + ATP +02 cloroplastos

b) Fase escura: no depende de luz e corresponde reduo do CO2 ao nvel de carboidrato s expensas do NADPH+H+ e ATP. escuro NADPH + H+ + ATP + CO2 NADP+ + ADP + Pi + C(H20) cloroplastos

Hill, em 1937, tentando desvendar o processo fotossinttico empregando cloroplastos isolados de espinafre, pretendia a reduo do C02 ao nvel de carboidrato. Por dificuldades tcnicas, limitadas pela poca, no conseguiu o seu intento, mas chegou a demonstrar a habilidade de cloroplastos isolados de reduzir outros compostos em um processo acoplado fotlise da gua com evoluo de 0 : 2 luz +3 + H 0 +2 + 2H+ + 02 2Fe 2 2Fe cloroplastos Assim a produo fotoqumica de oxignio exige a presena de um aceptor de H+ e/ou eltrons, que necessariamente no precida ser o CO2. No presente experimento ser utilizado como aceptor de eltrons (reagente de Hill) um indicador de xido-reduo, o 2,6-diclorofenolindofenol, que na forma oxidada azul (com max ao redor de 540 nm) e na forma reduzida incolor, o que permite o acompanhamento da reao fotoqumica mediada por cloroplastos isolados de espinafre.

38 3. MATERIAL 3.1. Equipamentos e Vidrarias Tubos de ensaio (4 por grupo) Centrfuga de mesa com tubos (10 ml) Banho de glo Almofariz com pistilo (1 para cada grupo) Lmpada de 100 W (2) Folha de alumnio Banho maria (100oC)

3.2. Reagentes - Sacarose 0,35M - Tampo fosfato 0,05 M (pH = 6,5) contendo sacarose 0,35 M - 2,6-diclorofenol indofenol (16 mg/100 ml) - cido ascrbico (cristais) 4. PROCEDIMENTO 4.1. Extrao dos Cloroplastos a) Picar 5 g de folhas de espinafre e homogeneizar em almofariz usando areia lavada como abrasivo e 10 ml de sacarose 0,35 M (adicionados aos poucos) como extrator. b) Filtrar o homogeneizado em gase, ou algodo. c) Centrifugar por 2 minutos a 200 x g, (1300 rpm) desprezar o precipitado e centrifugar novamente o sobrenadante por 7 minutos a 1000 xg. (3000 rpm) d) Ressuspender os cloroplastos lavados em 10 ml de tampo fosfato 0,05 M (pH= 6,5) contendo sacarose 0,35 M. Manter em banho de gelo at o momento do uso. 4.2. Ensaio Preparar 4 tubos de colormetro conforme o quadro que se segue: SUSPENS O CLOROPLA STO (mL) TAMPO FOSFATO (mL)

TUBOS

2,6-DCF (mL)

OBSERVAES

2 3

1,5 3 (+ c.ascrbico ) 1,5 3 1,5 3

0,5

ajustar o zerodo aparelho

0,5 0,5

ler imediatamente ler imediatamente e cobrir com folha de Alumnio

1,5 (ferver 3)

0,5

Os tubos 2, 3 e 4 so expostos luz de lmpada (100 W) durante 1 minuto (o tubo n 3 protegido da luz) e faz-se a leitura de absorbncia (D.0) repetindo a operao 4 vezes.

39 5. ANLISES DOS RESULTADOS Anotar as leituras obtidas e fazer um grfico Discutir os resultados: a) Qual a funo do cido ascrbico?

b) Qual a funo do 2,6 DCF?

c) Descreva o observado nos tubos 2, 3 e 4 durante as leituras.

d) Quais tubos ocorre fotossntese? Porque?

e) Quais tubos no ocorre a fotossntese? Porque?

BIBLIOGRAFIA: ADELAR BRACHT E EMY LUIZA ISHII-IWAMOTO Mtodos de Laboratrio em Bioqumica, Ed. Manole 1 Ed. 2003 AVRON, M., "Mechanism of photoinduced electron transport in isolated chloroplasts", in D.R. Sanadi (ed.), Current Topics of Bioenergetics, 12, Academic Press, New York, 1967, p.1. HAGEMAN, R.H. & D. FLESHER. Nitrate reductase activity in corn seedling as effected by light and nitrate content of nutrient media. Plant Physiology, 35: 700-708 (1960). HEWITT, E.J. Physiological and Biochemical factors wich control the assimilation of inorganic nitrogen supplies by plants. In "Nitrogen Nutrition of the Plant", E.A. Kirkby (ed.), Un. Leeds, 1970. p.78-103. JACOBS, M.B. The Chemical Analysis of Foods and Food Products. Van Nostrand, New York, 1958, 970 p. LITWACK, G. Experimental Biochemistry - A Laboratory Manual. Wiley & Sons, Inc., New York, 1960, 313p. John

MARTELLI, H.L. & PANEK, A.D. Bioqumica Experimental. Ao Livro Tcnico, Rio de Janeiro, 1968, 112p. VILLELA, G.G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Tcnicas e Experimentos de Bioqumica. Koogan, Rio de Janeiro, 1973, 552p. WHARTON, D.C. & Mc CARTY, R.E. Experiments and Methods Biochemistry. McMillan Publishing Co, Inc., New York, 1972, 350p. in

40 Aula Pratica N 7 : ANALISE DA REDUTASE DE NITRATO EM PLANTAS 1. OBJETIVOS Verificar a habilidade de tecidos vegetais de reduzir o nitrato, o primeiro passo na utilizao metablica dessa forma nitrogenada, avaliando-se ainda o efeito da luminosidade. 2. FUNDAMENTOS O nitrato (NO3-) a forma nitrogenada mais abundante no solo e as plantas desenvolveram mecanismos bioqumicos para a sua utilizao. Para tal o NO3- reduzido a NO2- pela enzima "redutase de nitrato"e a seguir o NO2- transformado em amnia (NH3) pela "redutase de nitrito. A amnia posteriormente assimilada resultando nos compostos orgnicos nitrogenados. A redutase de NO3 estimulada pela luz e h indcios de que a atividade da mesma esteja relacionada com a capacidade de certas plantas em acumular mais protenas, o que tem sugerido o melhoramento gentico monitorado pela medida da atividade enzimtica. Tambm tem sido utilizada na avaliao da nutrio nitrogenada em diversas culturas. NO3- + NADH + H+ (nitrato) (redutase) NO 2 - + (nitrito) NAD+ + H O 2

A atividade da enzima pode ser estimada pela quantidade de N02formada que colorimtricamente dosada mediante reao com sulfanilamida e -naftilenodiamino, gerando um complexo colorido (diazo composto) com max em 540 nm. 3. MATERIAL 3.1. Equipamentos e Vidrarias Espectrofotmetro Banho-Maria (37oC) Perfurador (0,5 cm de dimetro) Pinas Estante com tubos de ensaio (8 tubos por grupo) 5 pipetas graduadas de 5 ml (por grupo)

3.2. Reagentes Sulfanilamida 1% em HCl 12 N -naftilenodiamino 0,05% Padro de NaNO2 10 M Substrato tamponado (KNO3 200 mM em tampo fosfato 50 mM pH= 7.4)

41 4. PROCEDIMENTO a) Pesar 100 mg de discos foliares (0,5 cm de dimetro), de folhas iluminadas e de folhas mantidas ao abrigo da luz, transferindo para tubos de ensaio. b) Incubar com 5 mL de substrato tamponado a 37oC por 1 hora, mantendo os tubos ao abrigo da luz (envoltos em folhas de alumnio). c) Paralizar a reao enzimtica pela adio de sulfanilamida 1% em HCl 2N e a seguir adicionar 1 ml de -neftilenodiamino 0,05%. d) Agitar, aguardar 5 minutos para a reao cromognica, remover os discos por filtrao e efetuar a leitura em fotocolormetro com filtro no 54. e) Paralelamente fazer reta padro fazendo-se reao conforme a tabela que se segue:
TUBO NO H2O DEST. NaNO2 10 M SULFANI LAMIDA Abs NAFTILEN LEITURA t Abs O DIAMINO % 540 nm 540nm 540 nm

0 1 2 3 4 5 6 7

5 mL 4 mL 3 mL 2 mL 1 mL 0 mL 5 mL folha Escuro 5 mL folha Claro

1 mL 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL 0 0

1 1 1 1 1 1 1

mL mL mL mL mL mL mL

1 1 1 1 1 1 1

ml ml ml ml ml mL mL

1 mL

1 mL

5. RESULTADOS e DISCUSSO Com os dados obtidos estabelecer a reta padro (leituras na ordenada contra concentraes de N02- na abscissa) e mediante interpolao na reta calcular as atividades de Redutase de Nitrato, expressando os valores em moles de nitrato reduzido por hora por g de tecido foliar fresco (moles. g-1 . h -1). Discutir os resultados: 1. Porque a diferena encontrada entre os resultados das folhas mantidas no claro em relao as folhas mantidas no escuro? 2. Qual a importncia da luz no processo de reduo do Nitrato?

REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS ADELAR BRACHT E EMY LUIZA ISHII-IWAMOTO Mtodos de Laboratrio em Bioqumica, Ed. Manole 1 Ed. 2003 AVRON, M., "Mechanism of photoinduced electron transport in isolated chloroplasts", in D.R. Sanadi (ed.), Current Topics of Bioenergetics, 12, Academic Press, New York, 1967, p.1. HAGEMAN, R.H. & D. FLESHER. Nitrate reductase activity in corn seedling as effected by light and nitrate content of nutrient media. Plant Physiology,

42 35: 700-708 (1960). HEWITT, E.J. Physiological and Biochemical factors wich control the assimilation of inorganic nitrogen supplies by plants. In "Nitrogen Nutrition of the Plant", E.A. Kirkby (ed.), Un. Leeds, 1970. p.78-103. JACOBS, M.B. The Chemical Analysis of Foods and Food Products. Van Nostrand, New York, 1958, 970 p. LITWACK, G. Experimental Biochemistry - A Laboratory Manual. Wiley & Sons, Inc., New York, 1960, 313p. John

MARTELLI, H.L. & PANEK, A.D. Bioqumica Experimental. Ao Livro Tcnico, Rio de Janeiro, 1968, 112p. VILLELA, G.G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Tcnicas e Experimentos de Bioqumica. Koogan, Rio de Janeiro, 1973, 552p. WHARTON, D.C. & Mc CARTY, R.E. Experiments and Methods Biochemistry. McMillan Publishing Co, Inc., New York, 1972, 350p. in

43 QUESTIONRIO 1 ASSUNTO: CARBODRATOS E LIPIDEOS 1.Defina ligao hemicetal demonstrando um exemplo atravs de uma cetose e uma aldose (ciclo hexose). 2.Escreva a frmula cclica (projeo) (hexoses). Considere as posies D,L, e dos principais monossacarideos

3.A molcula de D-- glicose difere em que de uma molcula de D- -glucose? 4.Explique resumidamente: (1) Como se faz a numerao da cadeia de um monossacardeo; (2) Diferencie posio D,L,(+) e (), 5.Escreva as frmulas de: sacarose, maltose, lactose e celobiose. 6.O que so ligaes glicosdicas dos tipos a ( 1,4) e a ( 1,4)? 7.Diferencie os polissacarideos amido, glicognio e celulose quanto s ligaes glicosdicas. Esquematize as trs macromolculas e fale de suas funes. 8.Como se dividem os polissacarideos? D exemplos. 9.O que so dextranas, frutanas e hemicelulose? 10.O que so N-glicosideos, o-metlicos, acares-alcois e amino-acares 111. Citar as funes dos lipdeos nos seres vivos. 12.Qual a importncia do ndice de saponificao e ndice de iodo (em relao ao peso molecular e grau de insaturao) nos cidos graxos , gorduras e leos. 13.Escreva a relao entre ponto de fuso e solubilidade quanto ao peso molecular, estrutura e grau de insaturao de lipdeos. 14.O que ocorre na rancificao oxidativa? Qual o papel dos antioxidantes? Cite exemplos. 15.Citar as caractersticas necessrias para que uma molcula funcione como sabo ou detergente. 16.Quais os componentes estruturais de uma cera e o tipo de ligao entre elas? 17.Que so cidos graxos saturados, insaturados e poliinsaturados?. D exemplos. 18.Quais as funes dos triglicerdeos? Que tipo de ligao existe? 19.Qual a funo dos fosfolipideos? Escreva um exemplo, dando sua importncia. 20.Testosterona e Progesterona pertencem a que classe de lipideos? Porque?

44

QUESTIONARIO 2 1.Escreva as classificaes dos aminocidos de acordo com a cadeia lateral. 2. Cite dois exemplos de cada classe 3 Escrever a reao entre dois aminoacido, identificando a ligao peptidica. 4. Explicar o que significa ponto isoeltrico de um aminocido. 5 . Citar a carga de um aminocido abaixo e acima de seu ponto isoeletrico. 6. Representar a ligao peptidica.. 7 O que vem a ser a estrutura primaria, secundaria, terciria e quaternria de uma protena? 8. Citar os tipos de ligao responsveis pelas estruturas secundaria e terciria da protena 9. O que vem a ser desnaturao de uma protena, e que agentes causam esta desnaturao? 10. Definir protena simples e conjugada. De exemplos. 11.O que vem a ser velocidade de uma reao enzimtica? 12. Qual a explicao de Michaelis Mentem para o modo de ao de uma enzima? 13. Qual o conceito desitio ativo? 14.Escreva graficamente a comparao entre as energias de ligao de uma reao catalisada e uma reao no catalisada. 15.Que vem a ser inibidor competitivo e no competitivo? 16.O que uma enzima alosterica? 17. Qual o efeito da temperatura em uma reao enzimtica? 18.Qual o efeito do pH em uma reao enzimtica? 19.Q que cofator enzimtico? 20.O que so coenzimas ? de exemplo QUESTIONARIO 3 1) Escreva graficamente a comparao entre as energias de ativao de uma reao catalisada e de uma reao no catalisada. 2) Qual o conceito de sitio ativo? 3) Qual o significado da constante de Michaelis e Menten? 4) O que gliclise? 5) Localizao celular da gliclise. 6) Qual a relao entre insulina e gliclise? 7)A frutose pode ser utilizada na gliclise? 8) A aldolase apresenta K-equilibrio 9 x 104. Porm na clula a reao se desloca no sentido da degradao da frutose. Por qu? 9)Qual o efeito da adrenalina sobre a gliclise? 10) Explicar o balano de ATP no processo da gliclise. 11) Qual a relao entre abate de animais e descanso? 12)0 que significa formao de ATP a nvel de substrato?

45 13)0 que gluconeognese? 14) Qual a importncia da gluconeogenese? 15) Como pode ser utilizada a fermentao alcolica para a produo de glicerol? 16) Mecanismo de formao do glicerol. 17) Quais as diferenas entre gliclise e fermentao alcolica? 18) Destacar a importncia da nicotinamida (vit. do complexo B) na gliclise. 19) Qual a importncia do ciclo das pentoses? 20) Localizao celular do ciclo das pentoses. 21) No que consiste o ciclo das pentoses? 22) Comparar gliclise com ciclo das pentoses. 23)Destacar a importncia de elementos minerais no ciclo das pentoses. 24)Como voc pode determinar, na prtica, se um tecido est realizando gliclise ou ciclo das pentoses? 25) Porque h necessidade do ciclo de Krebs para a oxidao do acetil-CoA? 26) Quais os produtos do ciclo de Krebs? 27) Quais so as enzimas regulatrias do ciclo de Krebs? 28) Qual o significado do ciclo de Krebs? 29) Quais os inibidores do ciclo? 30) Que significa cadeia respiratria? 31) Qual a produo de ATP atravs da oxidao total de uma molcula de glicose? 32) Quais os venenos respiratrios? 33) Que composto o ltimo aceptor de eletrons na cadeia respiratria? 34) Qual a diferena entre ATP e GTP ?

QUESTIONARIO RESPIRATORIA)

(GLICLISE,

CICLO

DE

KREBS

CADEIA

1. O que vem a ser gliclise? 2. Em que regio da clula se processa a gliclise e qual a sua finalidade? 3. O que vem a ser balano de coenzimas e por que ele nulo em anaerobiose? 4. Quais os substratos e os produtos do metabolismo anaerbico dos carboidratos? 5. Qual o rendimento energtico obtido por uma clula muscular ao degradar anaerobicamente a glicose? Por que este rendimento superior quando se utiliza glicognio como substrato? Dados: ATP ADP + Pi; (AG=-8.000 cal/mol) C6H1206 2C3H603 (AG=-47 .000cal/mol) 6. O que vem a ser malte e qual a sua funo na produo de etanol a partir de cereais?

46 7. Qual a vantagem do abate de animais descansados luz do metabolismo anaerbico nas clulas musculares? 8. Em que se fundamenta a conservao de alimentos (coalhadas, iogurtes, ensilagem, picles, etc.) ao se propiciar a fermentao ltica? 9. Quais as funes do Ciclo de Krebs? Onde ele se processa? 1O.Quais as funes da Cadeira Respiratria? Onde ela se processa e por que a mesma est acoplada ao Ciclo de Krebs? 11 Qual a diferena entre veneno respiratrio e desacoplador da fosforilao oxidativa? 12.Qual a diferena entre fosforilao oxidativa e fosforilao ao nvel de substrato? Qual a mais significativa em condies de aerobiose, por que? 13. Qual o rendimento energtico obtido por uma clula ao oxidar completamente a molcula de glicose? Quantos ATPs so produzidos pela fosforilao oxidativa e quantos pela fosforilao ao nvel de substrato? Dados: C6H1206 C02 + H2O ; ( G=-686.000 cal/moI)

14.Quantos ATPs so produzidos pela combusto biolgica completa do acetilCoA, piruvato, lactato e etanol? 15.Qual a vantagem da membrana interna da mitocndria se apresentar enrugada? 16.Como se explica a ao txica do flor acetato (principio txico de algumas plantas) sobre o Ciclo de Krebs? 17.Como se explica a ao txica do cianeto na Cadeia Respiratria?

QUESTIONRIO 5: VIA PENTOSE FOSFATO, METABOLISMO DOS TRIGLICERIDIOS, METABOLISMO DEGRADAT1VO DAS PROTEINAS E AMINOCIDOS E EXCREO DO NITROGNIO. 1. Cite duas diferenas e duas semelhanas entre gliclise e via pentose fosfato. 2. Quais as finalidades da via pentose fosfato e em que regio da clula ela opera? 3. Comparando-se as glndulas mamrias e o msculo esqueltico em quais desses tecidos predomina a via pentose fosfato? Justifique. idem para os tecidos vegetais jovens e maduros. 4. Qual a importncia energtica quantitativa e qualitativa dos triglicerdios de nossa dieta? 5. O que resulta da beta-oxidao dos cidos graxos? Onde ela se processa e quais os destinos dos seus produtos? 6. Quantos ATPs seriam obtidos por uma clula ao oxidar completamente o triglicerdio abaixo estruturado? CH2- O - CO - (CH2)13- CH3 CH-O-CO-(CH2)14-CH3 CH2- O-CO - (CH2)
14

- CH3

7. Como a clula efetua a dessaturao dos cidos graxos? Como ela est relacionada com a aclimatao de certas plantas em ambientes mais frio? 8. Por que as protenas devem estar presentes em nossa dieta? Podem elas, e como, atender a demanda energtica de nosso organismo? 9. O que vem a ser aminocido essencial? Cite 3 deles para o homem.

47 10. 0 que vem a ser balano ntrogenado? Por que ele nulo em animais adultos e negativo quando de uma dieta deficiente em aminocidos essenciais? 11. O que vem a ser reao de transaminao? Cite uma delas e comente a sua importncia. Idem para reao de descarboxilao de aminocido. 12. Quais as formas nitrogenadas de excreo utilizadas pelos organismos animais? Que propriedades de solubilidade e toxidez apresentam? 13. Por que a uria a forma nitrogenada de excreo mais adequada para os mamferos? Idem quanto ao cido rico para as aves. 14. Por que animais com habilidade metablica para excreo de uria ou cido rico voltam a excretar nitrognio amoniacal quando em ambiente com grande disponibilidade de gua? QUESTIONRIO 6 : INTEGRAO DO METABOLISMO, METABLICA, FOTOSSINTESE E CICLO DO NITROGNIO 1.Quais parte 2.Com que eficincia e glicosdicas carboidratos, peptdicas lipdios e so as etapas (fases) pelas da aprisionada na a energia de das ligaes dos seus fase hidrlise os quais passam REGULAO

polissacardios, clula? steres, alimentos? destinos?

triglicerdios e protenas para atender demanda de energia (ATP) por

3.Quais so os 3 compostos chaves do metabolismo degradativo dos protenas? Quais 4.Esquematize a formao de triglicerdio a partir de carboidrato. 5. Esquematize a formao dos cidos glutmico, asprtico e alanina a partir de uria e acar de melao no rumen bovino. Porque a uria tem que ser fornecida juntamente com uma forma facilmente metabolizvel de acar? 6.O que vem a ser aminoacido glicognico? Cite 3 deles. Qual a importncia deste fato para o metabolismo animal? 7. O que vem a ser corpos cetnicos e como so formados em nosso organismo? Em que condies fisiolgicas tais compostos se mostram com contedos mais elevados na urina e no sangue? 8.Podem os triglicerdios ser convertidos em acar no organismo animal? Por que? 9.O que vem a ser Ciclo do Glioxilato? Em que organismos ocorre e qual a sua funo bioqumica? Porque tal ciclo particularmente ativo durante a germinao de sementes oleaginosas? 10.0 que vem a ser Efeito Pasteur e como ele explicado bioqumicamente? 11.Por que uma adubao nitrogenada excessiva por acarretar o acamamento em certas culturas? 12.Como o excesso de amnia pode comprometer o metabolismo das clulas nervosas (crebro) levando ao coma cerebral? Como a intoxicao com etanol leva ao mesmo quadro clnico? 13.Porque o diabtico bebe mais gua que o indivduo saudvel? 14.Quais os eventos que dependem e quais os que no dependem da luz

48 quanto formao de glicose por uma planta fotossintetizadora? 15.Por que as luzes de comprimentos de onde de 450 e 650 nm so mais eficientes para a realizao de fotossntese pelas plantas superiores? 16.Quais as funes dos carotenides no processo fotossinttico conduzido pelas plantas? 17.Como se explicam a essencialidade do Cl, Mn e Mg para o processo fotossinttico? 1 8.Como so estruturados os sistemas de pigmentos para a captao da energia radiante para a conduo da fotossntese? 19.Qual a funo da gua no processo fotossnttico? 20. 0 que fica demonstrado quando se observa a reduo do 2,6diclorofenolindofenol por cloroplastos iluminados (reao de Hill)? 21. 0 que vem a ser foto-reduo do NADP + e fotofosforilao do ADP? 22. Qual o primeiro composto formado pela assimilao do CO2 mediante a via C-3 de fixao? Idem para a via C-4. Quais as enzimas envolvidas nesta etapa e suas afinidades para com o CO2? 23.Que adaptaes ocorreram nas crassulceas que lhes permitem a Me sobrevivncia em ambientes quentes e ridos? 24.0 que vem a ser fotorrespirao? Qual o seu substrato e porque pouco intensa nas plantas C-4? Qual a importncia da luz e do 02 neste processo? 25.Cite 4 diferenas entre plantas C-3 e C-4 (exceto foto-respirao). 26.Por que as plantas C-4 so menos exigentes em nitrognio quando comparadas com as C-3? 27.Porque as plantas C-4 fazem fotossntese com boa eficincia mesmo em temperaturas mais elevadas? 28. Porque a fotossntese nas plantas C-4 no atinge a saturao mesmo com grande intensidade luminosa? 29.0 que vem a ser ponto de compensao e por que menor para as plantas C-4? 30.Porque o nitrato a forma nitrogenada mais abundante no solo? Existiria alguma vantagem para as plantas? 31 .Como os herbicidas que bloqueiam o transporte de eltrons no processo fotossinttico matam a planta? 32.0 que vem a ser reduo do nitrato? Quais as participaes do ferro e molibdnio neste processo? 33.0 que vem a ser fixao do nitrognio? Quais as modalidades de fixao do N ? 34. 0 que vem a ser assimilao da amnia e quais a vias metablcas envolvidas? 35. 0que vem a ser nitrificao e qual a importncia agronmica para essa transformao?

49 36.0 que vem a ser desnitrificao? Que organismo est envolvido e com que objetivo tal processo conduzido? 37.Como que os herbicidas que bloqueiam o transporte de eltrons na fase luminosa da fotossntese (2,4-DNP e DCMU) matam a planta?

50 Tabela de Converso T% em A x 1.000 00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 01 02 03 04 05 06 07 08 09 2.097 2.046 1.721 1.538 1.409 1.310 1.229 1.161 1.102 1.004 0.963 3.00026992.5232.3982.3012.2222.155 2.0001.9591.9211.8861.854 1.6991.6781.6581.6381.620 1.5231.5091.4951.4811.469 1.3981.3871.3771.3871.357 1.3011.2921.2841.2761.268 1.2221.2151.2081.2011.194 1.1551.1491.1431.1371.131

1.8241.7961.7701.745 1.6021.5851.5691.553 1.4581.4441.4321.420 1.3471.3371.3281.319 1.2601.2521.2441.237 1.1871.1801.1741.167 1.1251.1191.1141.108 1.0131.009

1.0971.0921.0861.0811.0761.0711.0661.0601.056 1.048 1.0411.0361.0321.0271.0221.018 1.0000.9960.9910.9870.983

1.051

0.9790.9750.9710.967

11 959 955 951 947

943 939 938 932 928 924

12 921 917 914 910 907 903 900 896 893 889 13 886 883 879 876 873 870 866 863 860 857 14 854 851 848 845 842 839 836 833 830 827 804 801 799 15 824 821 818 815 812 810 807 17 770 767 764 762 759 757

16 796 793 790 788 785 783 780 777 775 772 764 752 750 747 18 745 745 742 738 735 733 730 728 726 724 19 721 719 717 714 712 710 708 706 703 701 20 699 697 695 693 690 688 686 684 682 680 21 678 676 674 672 670 688 666 664 22 658 656 654 652 650 648 646 644 662 642 660 640 604

23 638 636 635 633 631 629 627 625 623 622 24 620 618 616 614 613 611 609 607 606 25 602 600 599 597 595 503 592 590 588 587 26 585 583 582 580 578 577 575 573 572 570 27 569 567 565 28 553 551 550 29 538 564 562 561 559 558 556 548 547 545 544 542 554 541 539

536 535 533 532 530 529 527 528 524 506 504 503 502 500 499 498 495 484 483

30 523 521 520 519 517 516 514 513 511 510 31 509 507 32 495 493 492 491 489 488 487 485

33 481 480 479 478 476 475 474 472 471 470 34 469 467 468 465 463 462 461 460 458 457 35 456 36 444 37 432 455 453 452 451 450 442 441 449 447 446 445 440 439 438 437 435 334 433

431 429 428 427 426 425 424 423 421

51 38 420 39 409 40 398 41 387 42 377 43 367 44 357 45 347 46 337 47 328 48 319 49 310 50 301 51 292 52 284 53 278 54 268 55 250 56 252 57 244 58 237 59 229 60 222 61 215 62 208 63 201 64 194 65 187 66 180 67 174 68 167 69 161 70 155 71 149 72 143 73 137 74 131 75 125 76 119 77 114 78 108 79 102 419 418 417 416 415 413 412 411 410 408 407 406 405 403 402 401 400 399 397 396 395 386 385 366 365 356 355 346 345 394 393 391 390 389 388 384 383 382 381 380 379 378 364 363 362 361 360 359 358 354 353 352 351 350 344 343 342 341 349 348 340 339 338 322 321 320 304 303 302 294 293

376 375 374 373 372 371 370 369 368

336 335 334 333 333 332 331 330 329 327 328 326 325 324 323 309 308 307 306 305 305 318 317 316 315 314 313 312 312 311 300 299 298 298 297 296 295

292 291 290 289 288 287 287 286 285 283 282 281 281 280 279 278 277 277 275 274 273 272 272 271 270 289 268 267 266 265 264 264 263 262 261 260 259 258 257 257 256 255 254 253 253 251 250 249 249 248 247 246 246 245 243 243 242 241 240 240 239 238 237 236 235 234 234 233 232 231 231 230 228 228 227 226 225 225 224 223 223 221 220 220 219 218 218 217 216 215 214 213 213 212 211 210 210 209 208 207 206 206 205 204 203 203 202 202 200 199 199 198 197 197 196 195 194 193 192 192 191 190 190 189 188 188 186 186 185 184 184 183 182 182 181 180 179 178 178 177 177 176 175 175 173 173 172 171 171 170 169 169 168 167 166 166 165 154 164 164 163 162 162 161 160 159 159 158 157 157 156 156 154 153 152 152 151 151 150 149 144 144 143 148 148 147 146 146 145 136 135 135 134

142 141 141 140 140 139 138 138 137 134 133 133 132 132 130 130 129 128 128 127 127 126 126 124 124 123 123 122 121 121 120 120 119 118 117 117 116 116 115 115 114 113 112 112 111 111 110 110 109 109 107 107 106 106 105 105 104 103 103 102 101 101 100 100 099 099 098 097

52 80 097 81 092 82 086 83 081 84 076 85 071 86 066 87 060 88 056 89 051 90 046 91 041 92 036 93 032 94 027 95 022 96 018 97 013 98 009 99 004 096 096 095 095 084 094 094 093 093 092

091 090 090 089 089 088 088 087 087 086 085 085 084 083 083 082 081 080 080 079 079 078 078 077 077 076 075 075 074 074 073 073 072 072 071 070 070 069 069 068 068 067 065 064 064 055 055 050 050 045 040 045 040 054 049 044 063 067 066 061 063 062 062 061

060 059 059 058 058 057 057 057 056 054 053 053 052 052 051 049 044 034 048 043 048 043 047 047 046 042 042 041

040 039 039 038 038 037 037 034 033 033 032 032 030 030 029 029 028 028 027

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026 026 025 025 025 024 024 023 023 022 021 021 020 020 020 019 019 018 017 017 016 016 015 015 015 014 014 013 012 012 011 011 011 010 010 009 008 007 007 007 007 006 006 005 005 004 003 003 003 002 002 001 001 000